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GENÉTICA E BIOTECNOLOGIA
CONTROLODAREPLICAÇÃO DE PLASMÍDEOS
Grupo 8
Trabalho elaborado por: Andrêa Gouvêa [email protected]
Ivânia PereiraLara Bolito
Magali Barbosa
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biotecnologia
conhecimento e isolamento de sequências de DNA
a aparência física e visual característica de um organismo, sendo o resultado da expressão génica.
A biotecnologia moderna (engenharia genética) envolve a modificação directa do DNA de forma a alterar ou introduzir características ao organismo vivo.
correspondem a genes responsáveis em conferir a característica desejada(fenótipo)
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isolamento dos genes
técnica
clonagem induzir num organismo vivo a amplificação da sequência de DNA em estudo, em sistemas que permitem uma fácil manipulação do referido fragmento
vectores de clonagem
plasmídeos
vírus
são utilizados
capacidade de se replicarem autonomamente e em paralelo com o genoma do hospedeiro
porquê? outros
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plasmídeos
O organismo escolhido para o estudo de plasmídeos: e. coli
ser procarionte (DNA circular)
fig.1 _ transmissão de plasmídeos entre bactérias
Moléculas de DNA circulares que podem passar de célula para célula.
organismo haplóide
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aplicações dos plasmídeos
• são usados rotineiramente para multiplicar(fazer muitas cópias de) ou expressar genes específicos
• a produção de grandes quantidades de proteínas
• purificação do DNA
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replicação de plasmídeos(rolling-circle replication)
1_
Passos:
Corte numa ligação específica na dupla cadeia circular por uma nuclease. Este corte produz duas extremidades quimicamente distintas: 3’ e 5’.
nuclease
degrada o DNA em cadeias simples
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3_
2_
O DNA é sintetizado pela adição de desoxinucleótidos na extremidade 3’ com a mudança simultânea da extremidade 5’.
À medida que a replicação prossegue a extremidade 3’ roda e aumenta o seu comprimento. Em simultâneo, uma cadeia complementar de DNA é sintetizada.Esta replicação é comum em etapas tardias de replicação da dupla cadeia.
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Síntese:
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controlo da replicação de plasmídeos
Para controlar a replicação de plasmídeos estuda-se…
NÃO uma… NÃO duas…
mas…
UMA POPULAÇÃO DE BACTÉRIAS!!!!!
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Supor que o volume da população cresce a uma taxa α. Assim,
VV α=&
)()( VPVPdTd
Pα=
PP P )( αα −=&
A massa total de plasmídeo irá mudar a uma taxa αP
então,
Considera-se uma população de bactérias que ocupa um volume V. Sendo P uma concentração de plasmídeos uniformemente distribuídanesse volume, logo
VP é a massa total de plasmídeos na população
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A replicação de plasmídeo só será estável se:
αP = α
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deduções matemáticas
Reacções químicas de expansão de volume
Considerando uma reacção química envolvendo três espécies químicas diferentes A, B e C:
→→+ µCBA k ''
k’’- constante de proporcionalidade da reacção de formação de C
µ - constante de proporcionalidade da reacção de degradação de C
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A expansão do volume é dada por:
VV α=&
sendo α a taxa de crescimento da população em estudo
Designando x, y e z como as respectivas massas de A, B e C, tem-se:
zxykz µ−= ''&
a variação da massa de C com o tempo depende de k’’ e µ, multiplicados pelas massas de A e B
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Uma vez que as concentrações são dadas por
VzC
VyB
VxA === ,,
obtém-se
CVBVAVkVCVC µ−=+ .''&&
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Definindo
Vkk ='' vem:
CkABCC µα −=+&
Aumentando o volume, diminui a constante k’’, modificando-se assim as constantes das reacções, obtém-se:
→→+ +αµCBA k
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Aproximação de Michaelis-Menton
A degradação de um composto C implica a acção de uma enzima , formando-se um complexo intermédio C, que se decompõe na enzima original e num novo produto X.
XEEC cc +→⇔+ C
Matematicamente:
C.C,C
C,CC
21
321
321
kCEkC
kkCEkE
kkCEk
c
cc
c
+−=
++−=
−−=
&
&
&
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Como a soma das duas primeiras equações referidas anteriormente é nula e a massa da enzima é conservada durante a reacção, vem que:
)0(cc EE =+ C
(a concentração inicial de C é nula)
Então,
CKCV
Cc
C
+−=& definindo
1
32
3
)()0(
kkk
k
EkV
C
CC
+=
=
A este processo dá-se o nome de aproximação de Michaelis–Menton.
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reacções de replicação
'1 MPP +→γ
1_ Os plasmídeos são copiados a uma velocidade γ1para um segmento de rRNA M’
2_ M’ passa a forma estável a uma velocidade γ2
reacções do controlo de replicação de plasmídeos
MM → 2' γ
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3_ M serve de padrão à síntese da proteína Q, à velocidade δ:
4_ Esta proteína regula a produção do plasmídeo P, por feedback,
à velocidade a:
QMM +→δ
PPQ a 2→+
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reacções de inibição
1_ Um segmento de P é copiado para uma molécula de controlo C à velocidade β
2_ A molécula C pode interagir com M’ de modo a inactivá-lo à velocidade b:
CPP +→β
XMC b→+ '
onde X é um composto genérico inactivo (irrelevante para este estudo)
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1_ Seguindo a reacção de Michaelis-Menton aplicada à reacção de plasmídeos
obtém-se:
2_ De modo semelhante, há uma enzima que degrada M:
reacções de degradação
XEEC CK
cC +→→←+ CC σ
XEEM MK
MMF +→→←+ σM
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Combinando todas as equações e reacções:
PaQP )( α−=&
CCK
VbMPC
C
C )'(+
++−= αβ&
')(' 21 MbCPM αγγ ++−=&
QaPMQ )( ασ +−=&
MMK
VMM
M
M
+
+−= αγ 2'&
Sendo assim… aQ=αP
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As variáveis de estado são:Resumindo…
P - concentração de plasmídeos controlada por Q a uma taxa α
C - concentração de um composto químico que reage com a enzimapara que ocorra a reacção a maior velocidade
M’- concentração do segmento de rRNA não estável
Q - concentração da proteína que é sintetizada a uma taxa σmuito pequena
M - concentração de um segmento de RNA estável
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simulação computacional
simulink
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análise de gráficosSituação de equilíbrio obtido através do simulink
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Fazendo um plot(tout,simout1) em matlab…
Variação da concentração de P ao longo da reacção:
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Variação da concentração de C ao longo da reacção
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Variação da concentração de M’ ao longo da reacção
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Variação da concentração de Q ao longo da reacção
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Variação da concentração de M ao longo da reacção
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Situação de caos obtido através do simulink
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conclusões
Só a situação de equilíbrio permite a replicação de plasmídeos.
dP/dt=0
Controlo de αP para que
P é constante
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FIM