genetic suppression of polyglutamine toxicity in drosophila
DESCRIPTION
Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila. Parsa Kasemi- Esfarjani , et al ; Science 287, 1837 (2000). Visée de l’article. Introduction. Introduction. Chorée de Huntington : Agrégats de polyglutamine au niveau du SNC - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila
Parsa Kasemi-Esfarjani, et al ;Science 287, 1837 (2000)
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INTRODUCTIONVisée de l’article
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Introduction
• Chorée de Huntington : Agrégats de polyglutamine au niveau du SNC
• Utilisation de drosophiles présentant ce phénotype comme modèle de la maladie
• Criblage des gènes suppresseurs de ce phénotype
• Homologie des protéines entre la drosophile et l’humain
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DESCRIPTION DE LA MÉTHODEDescription et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln
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Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln
• Lignées comportant des polyCAG– 20 répétitions : lignée 20Q (normales)– 127 répétitions : lignée 127Q (augmentées)
• Après traduction des ARNm, obtention de polyglutamines de ces 2 types
• Utilisation de différents promoteurs pour induire l’expression génique spécifiquement dans les yeux
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Rappel : Mutagénèse par élément PPied P
w+
Site de clonage
Pied P
Origine de réplication
AmpiR
Plasmide avec Elément P
Transposase
Source de Transposase
A Pw-
Embryon de drosophile
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Élaboration préalable de 2 lignées transgéniques
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Lignée UAS-polyCAG
5’ 3’
Poly CAG Promoteur UAS HA
Figure : construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile
• Insertion d’un élément P contenant :– Promoteur UAS– Séquence polyCAG (20 ou 127 répétitions)– Séquence codant pour un épitope de
l’hémagglutinine (HA)
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Lignée GMR-Gal4
• Insertion d’un élément P contenant : – Promoteur GMR (expression au niveau des yeux)– Séquence GAL4 codant pour la protéine GAL4
5’ 3’
GAL 4 Promoteur GMR
Figure : Construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile
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Croisement des 2 lignées
• Croisement et 3 lignées 20Q et de 3 lignées 127Q par la GMR-GAL4 (fond génétique)
• Obtention de drosophiles exprimant les polyglutamines dans l’œil.
• Elles sont UAS-polyCAG et GMR-GAL4
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5’ 3’
Poly CAGPoly CAGUASUAS HAHA
5’ 3’
GAL 4GAL 4GMRGMR
Facteur de transcription spécifique de l’œil
Transcription de GAL4
Protéine Gal4
ARNm Gal4ARNm Gal4
Traduction de l’ARNm Gal4
Induction de la transcription
Induction de la transcription
Poly CAGPoly CAG HAHAARNm
Transcription
Traduction
Polyglutamine avec épitope HA
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Influence du fond génétique
• Sélection de plusieurs lignées – 3 lignées 20 Q– 3 lignées 127 Q
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RÉSULTATSElaboration des lignées transgéniques poly-Gln
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Phénotypes obtenus
• Lignées 20Q : [sauvage]• Lignées 127Q : [agrégation de polyglutamines]
Utilisation des lignées 127 Q pour trouver les gènes suppresseurs.
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DESCRIPTION DE LA MÉTHODECriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs
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Création des lignées transgéniques à testée
• 7000 éléments P différents (contenant 7000 séquences autosomales différentes)
• Mutagénèse utilisant ces éléments P : obtention de 7000 lignées transgéniques différentes.
• Croisement avec les lignées 127 Q
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RÉSULTATSCriblage et mise en évidence des gènes suppresseurs
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Lignées intéressantes
Sur les 7000 lignées croisées avec les drosophiles présentant la dégénérescence, on trouve :•29 lignées « Enhancer »•30 lignées « Suppresseur »
•On retient Deux lignées Suppresseurs : EU 3500 et EU 3220
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TECHNIQUES D’OBSERVATION
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Mise en évidence des différents phénotypes
• Aspect extérieur : microscopie optique, et MEB
• Immunohistologie et observation microscopique : DAPI et FITC
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Microscopie photonique
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Microscopie électronique à balayages
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FITC (Fluorescein isothiocyanate)
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DAPI (Di aminido phényl indol)
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Résultats
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Lignée EU3500
• Code pour HDJ1 (en 3’ de EU3500) : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain
• Domaine J en NH2 terminal (jonction)
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![Page 30: Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081603/56815137550346895dbf5015/html5/thumbnails/30.jpg)
Lignée EU3220
• Code pour DTPR2 (en 3’ de EU3220) : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2)
• Domaine J en COOH terminal
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![Page 32: Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081603/56815137550346895dbf5015/html5/thumbnails/32.jpg)
DISCUSSION
![Page 33: Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081603/56815137550346895dbf5015/html5/thumbnails/33.jpg)
Implication du domaine J
• Responsable la suppression• Domaine présent sur les HSP• Etudes complémentaires in vitro : domaine J
supprime les agrégations par fixation des protéines agrégées
• Ici dHdj1 ou dtpr2 se lieraient donc aux polyglutamines pour les empêcher de former des agrégats
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CONCLUSION
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Gènes suppresseurs déterminés
• Croisement de mouches présentant un phénotype à supprimer, par des mouches possédant chacune un élément P différent
• Détermination des descendants présentant un phénotype supprimé
• On peut déterminer quel gène est impliqué dans la suppression du phénotype mutant
![Page 36: Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081603/56815137550346895dbf5015/html5/thumbnails/36.jpg)
Vers un traitement?
• Agrégats de polyglutamine = gain de fonction• On ne peut pas insérer un gène pour le
traiter : thérapie génique impossible• On pourrait tenter de surexprimer un gène
pour supprimer le phénotype. Problème : pléiotropie
• Difficile
![Page 37: Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081603/56815137550346895dbf5015/html5/thumbnails/37.jpg)
THE END