gdlhub-gdl-s1-2013-hayyunoves-26696-13.bab-4

Ekstrak kulit buah manggis dapat menghambat jumlah sel hidup fibroblas pada

kultur sel fibroblas gingiva manusia.

BAB 4

METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Jenis penelitian

Penelitian merupakan penelitian semi-experimental laboratories..

Rancangan penelitian post test only controle group.

4.2 Sampel dan Besar Sampel

ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

SKRIPSI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KULIT ... Nove Surya Hayyu

Sampel penelitian berupa kultur sel fibroblas gingiva berdasarkan rumus

Lemeshow (Soekidjo, 2010):

n = 22(z1-/2+z1-)2

(1-2)2

n = 7

Keterangan :

n = jumlah sampel

= standar deviasi

z1-/2 = harga standar normal pada =0,05

z1- = power test

1-2 = beda rata-rata masing-masing kelompok

4.3 Variable Penelitian

Variabel bebas

Ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 200 g/ml, 300 g/ml, 400

g/ml, 500 g/ml, 600 g/ml, 700 g/ml, 800 g/ml

Variabel tergantung

Presentase jumlah sel fibroblas gingiva

4.4 Definisi Oprasional Penelitian

a. Ekstrak kulit buah manggis : ekstrak kulit buah manggis jenis Garcinia

mangostana dari daerah lombok yang di keringkan kemudian diekstrak

menggunakan evaporator.

b. Pengukuran jumlah sel fibroblas yang hidup menggunakan metode MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay,



merupakan uji enzimatik yang mengukur kemampuan sel hidup

berdasarkan aktivitas mitokondria dari kultur sel. Pengukuran

menggunakan alat spektofotometer yang menghasilkan data berupa angka

angka optical density. Angka optical density tersebut merupakan nilai dari

kepekatan warna pada kultur sel tersebut. Semakin pekat warna yang

dihasilkan, maka makin tinggi angka optical density.

c. Presentase jumlah sel fibroblas gingiva manusia yang hidup setelah

pengujian adalah presentase jumlah sel fibroblas gingiva yang hidup

setelah penetesan ekstrak kulit buah manggis yang dihitung dengan rumus.

Presentase sel hidup (Freshney, 2010)

% sel hidup = OD perlakuan-OD media x100%

OD control sel -OD media

Keterangan :

% sel hidup :persentase jumlah sel hisup setelah pengujian

OD perlakuan :nilai optical density fibroblas pada setiap sampel setelah

pengujian hasil pembacaan dengan Elisa Reader

OD media : nilai optical density fibroblas pada media control

OD Kontrol sel : nilai optical density fibroblas pada sel control

Hasil perhitungan dikatakan tidak toksik bila 60% sel hidup.

4.5 Waktu dan Lokasi Penelitian

a. Pembuatan Ekstrak kulit buah manggis dilakukan di Laboratorium

Farmasi Universitas Widya Mandala Surabaya



b. Pengujian ekstrak dengan MTT assay dengan menggunakan kultur sel

fibroblas manusia di lakukan di Tropical Disease Diagnostic Center

Kampus C Universitas Airlangga Surabaya pada tanggal 18-20 Juni 2012.

4.6 Alat dan Bahan

4.6.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam melakukan pembuatan Ekstrak kulit buah

manggis,yaitu:

a. Saringan

b. Labu glass

c. Timbangan

d. Rotary evaporation

e. Ayakan

f. Timbangan analitik

g. Bejana tertutup

h. Blender

i. Perkolator

j. Tabung Reaksi dan Rak

Alat yang digunakan dalam melakukan pengujian dengan MTT Assay,yaitu:

a. Centrifuge

b. Laminar flow

c. electrical balance

d. Microplate 96 sumuran

e. Botol ukur Roux



f. Inkubator 37C

g. 5% CO2

h. Multichannel pipet 25L

i. Ujung pipet steril

j. Vial 2 mL

k. Pipet steril 5 mL dan 10 Ml

l. Mikroskop mikro

m. Shaker

n. Elisa Reader

4.6.2 Bahan Penelitian

a. Kulit buah manggis

b. Ekstrak kulit buah manggis

c. Etanol 70%

d. Kultur sel : fibroblas gingiva manusia

e. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

f. Akuades steril

g. Media Eagles (DMEM / Dulbecco-Modified Eagle Medium)

h. Fetal bovine serum 10%

i. Phospat Buffer Saline (PBS)

j. Versene trypsine

k. DMSO (dimethyl sulfoxide) 50L

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Tahap Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis



1. Bahan kulit manggis (bagian dalam dan luar) dicuci bersih dan

dikeringkan selama beberapa hari tanpa terkena sinar matahari

2. Kulit manggis yang sudah kering dihaluskan dengan blender dan diayak

sehingga didapatkan serbuk

Gambar 4.1: Kulit manggis kering (kiri); kulit manggis yang telah diblender dan diayak

menjadi serbuk (kanan)

3. Serbuk dibasahi dengan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan penyari (etanol

70%)

4. Masa dipindahkan ke dalam perkolator sambil ditekan-tekan perlahan,

kemudian dituangi dengan cairan penyari sampai cairan mulai menetes

hingga di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari.

5. Perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam.

6. Setelah 24 jam, keran perkolator dibuka dan cairan dibiarkan menetes

dengan kecepatan 1 ml/menit.



Gambar 4.2: Keran perkolator dibuka dan cairan menetes

7. Kemudian ditambahkan cairan penyari berulang-ulang hingga didapatkan

200 mg perkolat.

8. Perkolat disuling/diuapkan hingga tidak meninggalkan sisa dengan

tekanan rendah pada suhu tidak lebih 50oC sampai mencapai konstan yang

dikehendaki.

Gambar 4.3: Perkolat disuling/diuapkan

9. Kemudian, 0,8 bagian perkolat dipisahkan dari perkolat I, kemudian

diuapkan hingga diperoleh 0,2 bagian



10. Setelah itu dicampur dengan perkolat I.

4.7.2 Tahap perlakuan pada ekstrak kulit buah manggis

1. Centrifuge ekstrak (yang dibutuhkan supernatan)

2. Ekstrak di larutkan dengan PBS, dan kemudian di sterilkan

Gambar 4.4: alat filter ekstrak

3. Ektrak kulit buah manggis ditaruh dalam sampel cup (wadah tertutup ),

kemudian timbang beratnya dengan electrical balance (1,5 gr estrak).

4. Menghitung kadar ekstrak dalam media eagles dan FBS (250 g/ml). Di

dapatkan dari 1,5 gr ekstrak dalam 6 ml media eagles dan FBS (1,5 gr/ 6

ml = 1500 mg/ 6000 l = 0,25 mg/ l= 250 g/ l ).

5. Microplate 24 well kapasitas ekstrak 1 ml dan 96 well kapasitas

ekstraknya hanya 200 l. Jadi setiap konsentrasikan di konversikan

terlebih dahulu

a. 1ml = 1000 l, 1000 l/ 200 l= 5. Masing-masing konsentrasi di bagi

5. Konsentrasi 200 g/ml menjadi 40 g/ well; 300 g/ml menjadi 60

g/ well; 400 g/ml menjadi 80 g/ well; 500 g/ml menjadi 100 g/

well; 600 g/ml menjadi 120 g/ well; 700 g/ml menjadi 140 g/

well; 800 g/ml menjadi 160 g/ well.



b. Setelah itu setiap konsentarsi di kalikan tujuh (karena jumlah sampel

ada 7) 40 g/ well menjadi 280 g/well; 60 g/ well menjadi 460 g/

well; 80 g/ well menjadi 560 g/ well; 100 g/ well menjadi 700

g/ well; 120 g/ well menjadi 840 g/ well; 140 g/ well menjadi

980 g/ well; 160 g/ well menjadi 1120 g/ well.

c. Masing-masing ekstrak kemudian di bagi dengan kadar ekstrak supaya

bisa dimasukkan dalam satuan l . 280 g menjadi 1,12 l; 460 g

menjadi 1,84 l; 560 g menjadi 2,24 l; 700 g menjadi 2,8 l; 840

g menjadi 3,36 l; 980 g menjadi 3,92 l; 1120 g menjadi 4,48 l.

d. Tambahkan masing-masing ekstrak dengan medium 1225 l (media

eagles dan FBS ) per well =175 l/ well x 7 sampel = 1225 l). 1,12 l

menjadi 1226,12 l; 1,84g menjadi 1226,84 l; 2,24 g menjadi

1227,24 l; 2,8 g menjadi 1227,8 l; 3,36 g menjadi 1228,36 l;

3,92 g/ml menjadi 1228,92 l; 4,48 l menjadi 1229,48 l.

Gambar 4.5: Simpel cup diisi dengan medium dan FBS sebelum diisi ekstrak



Gambar 4.6: Simpel cup diisi dengan ekstrak

e. Kemudian dibagi 7, untuk membagi ektrak yang diberikan pada

masing-masing well. Konsentrasi 200 g/ml masing-masing well diisi

175 l; konsentrasi 300 g/ml masing-masing well diisi 175,26 l;

konsentrasi 400 g/ml masing-masing well diisi 175,32 l; konsentrasi

500 g/ml masing-masing well diisi 175,4 l; konsentrasi 600 g/ml

masing-masing well diisi 175,5 l; konsentrasi 700 g/ml masing-

masing well diisi 175,6 l; konsentrasi 800 g/ml masing-masing well

diisi 175,64 l .

4.7.3 Tahap persiapan pada kultur sel fibroblas gingiva manusia (hari

ke-1) :

1. Mengambil sel kultur gingiva fibroblas manusia, di dalam incubator CO2

370C

Gambar 4.7: Inkubator CO2 5%, 370C



2. Melihat keadaan sel fibroblas dalam keadaan log phase (sel fibroblas

terlihat padat)

Gambar 4.8: Melihat keadaan sel fibroblast menggunakan mikroskop mikro inferted

3. Dilakukan splinting sel

a. Medium dibuang, dicuci dengan PBS

b. Pemeberian versene trypsine

c. Pemberian media eagles dan FBS

4. Centrifuge 2000 RPM selama 5 menit

Gambar 4.9: Electric Centrifuge



5. Medium dibuang, kemudian masukkan sel kedalam microplate 96 well

dengan kepadatan 5x104 per well

Gambar 4.10: Microplate 96 well

6. Diberi media eagles dan FBS 175g/ml per well

7. Inkubasi C02 selama 24 jam suhu 370C

4.7.4 Tahap perlakuan pada kultur sel fibroblas gingiva manusia ( hari

ke-2 ) :

1. Pengambilan kultur sel line fibroblas gingiva manusia dari incubator C02

370C

2. Media eagles dan FBS dibuang, kultur sel line dicuci dengan PBS 3-5x

3. Masukkan ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 200 g/ml, 300

g/ml, 400 g/ml, 500 g/ml, 600 g/ml, 700 g/ml, 800 g/ml. Pada

perlakuan kontrol tidak ditetesi. ekstrak sebelumnya telah di filter dan

diencerkan dengan media eagles dan FBS. Inkubasi selama 20 jam.



Gambar 4.11: Pengisian ekstrak ke dalam microplate 96 well

4.7.5 Tahap Pengamatan dan Pembacaan Hasil Perlakuan ( hari ke-3 )

1. Pembacaan dengan menggunakan Elisa Reader, sebelum dilakukan

pembacaan, media dibuang, lalu menetesi setiap well dengan MTT

sebanyak 25l. Kemudian melakukan inkubasi lagi selama 4 jam.

Gambar 4.12: Menetesi setiap well dengan MTT assay

2. Menetesi setiap well dengan 200 l DMSO dan menggoyangnya



Gambar 4.13: Pemberian DMSO

3. Menyiapkan microplate, kemudian dilakukan pembacaan dengan

memasukkan microplate tersebut ke dalam Elisa Reader dan mengukur

absorbansinya .

Gambar 4.14: Pembacaan menggunakan ELISA Reader

4.8 Analisis Data

Data yang diperoleh diuji statistik menggunakan One-way analysis of

variance (ANOVA) untuk mengetahui perbandingan antara kelompok perlakuan

maupun kontrol. Dilanjutkan dengan Least Significant Difference (LSD).



gdlhub-gdl-s1-2013-hayyunoves-26696-13.bab-4

Documents