TEMA I

MATERIALES DE LABORATORIO

El laboratorio es el servicio centralizado de un hospital que generalmente se divide en varios departamentoscomo son: hematologa, bioqumica, inmunologa...

El laboratorio ha ido adquiriendo con el paso del tiempo un gran protagonismo debido a que se puede obteneruna gran informacin sobre multitud de enfermedades. Ha habido un gran avance en los ltimos tiemposutilizndose aparatos cada vez ms complicados en sus determinaciones, pero sencillo en su uso.

Actualmente la exploracin clnica proporciona datos que son completados o confirmados por el laboratorio.Por ejemplo: un paciente que presente sntomas como fatiga, palidez, etc. se puede pensar que padece unproceso anmico, lo cual ser confirmado o no mediante un anlisis de sangre. Por tanto para sacar unaconclusin adecuada debe existir una relacin entre los datos obtenidos en clnica y los obtenidos en ellaboratorio.

Las tcnicas analticas cumplen bsicamente 3 objetivos:

1 Aportan informacin, para que un mdico diagnostique adecuadamente

2 Pueden ser utilizadas como medidas preventivas para conocer el estado de salud de un individuo ydetectar precozmente alguna alteracin.

3 Permiten seguir la evolucin de una enfermedad durante el tratamiento.

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Par el buen funcionamiento de un laboratorio es necesario seguir unas normas; esto es doblemente importantesi se tiene en cuenta que en l hay varias personas trabajando.

1 Es necesario antes de empezar cualquier prueba saber que es lo que vamos a hacer para tener preparado elmaterial y reactivos que se necesitan.

2 Es esencial la limpieza tanto durante el trabajo como al finalizarlo.

3 En el laboratorio existen riesgos potenciales, como por ejemplo: quemaduras por calor o agentesqumicos, cortes, pinchazos,... que requieren una atencin especial. Es importante evitar los accidentes que engran manera se deben al descuido y excesiva rapidez en el trabajo, ms que a la ignorancia.

Las causas ms frecuentes de accidentes son:

1 Las prisas por llevar a trmino el trabajo.

2 La falta de cuidado y la fatiga.

3 La falta de concentracin en el trabajo.

NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO

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1 Debe utilizarse bata mientras se permanece en el laboratorio

2 No se debe comer no beber dentro del laboratorio, ni utilizar recipientes para guardar o conservarelementos.

3 No fumar

4 Antes de utilizar los reactivos leer los rtulos.

5 No dejar destapados los envases no las placas de cultivos.

6 Guardar las medidas de asepsia (lavarse las mano, utilizar guantes,...)

7 Mantener limpias las mesas y lavar el material utilizado al finalizar el trabajo

8 No pipetear por boca lquidos custicos o txicos o lquidos potencialmente contaminantes, sino utilizarperas de goma.

9 El material de vidrio roto se debe proteger antes de tirarlo para evitar cortes.

Si a pesar de las precauciones el accidente se produce el tcnico debe conocer algunas nociones de primerosauxilios. Por ejemplo: si hay cortes lo primero es saber si ha quedado algn trozo de un cuerpo extrao dentro;despus se dejar fluir la sangre libremente y se har un lavado con agua oxigenada y luego un antisptico.

NOTA: En el caso de quemaduras producidas generalmente por calor se pondr sobre la zona una gasaempapada en alcohol. En las quemaduras abiertas se aplicar una pomada antigente y se le pondr una gasaestril.

MATERIALES DE USO MS FRECUENTE

En los laboratorios clnicos para la caracterizacin y cuantificacin de sustancias, microorganismos, clulas ycristales presentes en los fluidos biolgicos se utiliza una gran variedad de materiales y dispositivos.

Este equipamiento vara segn sus caractersticas, necesidades, etc., pero en general se disponen de unasmesas en las que se desarrolla en trabajo y sobre las que estn colocados los aparatos. En ellas hay conexionespara: gas, luz, etc. Las mesas sern cmodas y de material impermeable y fcilmente lavable.

Adems habr taburetes, para evitar la fatiga en unos casos y siendo necesario en otros, como en el caso de lasobservaciones al microscopio. Tambin habr armarios en los que se guardarn reactivos y materiales.

No se puede dar una norma general en cuanto al material que se va a encontrar en el laboratorio, ya que estodepende de sus necesidades as como de las posibilidades econmicas.

De forma general el material no instrumenta se puede clasificar en material de vidrio, de plstico, deporcelana, etc.

Material de vidrio: el vidrio se caracteriza por una gran resistencia qumica frente al agua, cidos, bases, etc.mayor a la de la mayora de los plsticos, as como por su gran estabilidad resistencia al calor y transparencia.

Sin embargo no todo tipo de vidrio es adecuado para su uso en el laboratorio, por el contrario es necesarioemplear vidrios que se caracterizan por su resistencia qumica, mecnica y trmica.

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Actualmente existen diferentes tipos de vidrios para laboratorios; la mayora estn fabricados en vidrio deboro silicato que se caracteriza por su gran resistencia al calor; por ejemplo: el vidrio pirex... Al trabajar con elvidrio son necesarias unas precauciones como:

1 No someterlo a cambios bruscos de temperatura porque se pueden producir tensiones en l que dan lugar arupturas, por ejemplo: colocar el material de vidrio en la estufa de secado o esterilizacin en fro, calentar ydejarlo enfriar antes de sacarlo.

2 No aplicar fuerza sobre llaves o tapones

3 No someterlo a variaciones bruscas de presin

4 No conservar soluciones concentradas de lcalis bases en estos vidrios ya que son cucasis.

El vidrio se esteriliza en autoclave generalmente envuelto en papel de filtro.

Probetas: son vasos altos graduados de diferentes tamaos. Todos ellos llevan la correspondiente divisinfraccionada de su capacidad total. Sirven para medir volmenes sin demasiada precisin. Los volmenes msusados son: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 y 5000 ml

Matraces aforados: son recipientes en forma cnica en la parte inferior y un cuello fino en la parte superior.En el lleva una marca que corresponde al aforo que indica hasta donde hay que llenar el matraz para que ellquido contenido equivalga a la capacidad del mismo. Se utiliza para medir con precisin el volumen queindica el matraz. Son utilizados normalmente para preparar disoluciones de concentracin conocida. Losvolmenes ms frecuentes son: 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000 ml

NOTA: En la utilizacin de material volumtrico, el lquido contenido se debe enrasar en el menisco(curvatura que se encuentra en la superficie de un lquido contenido en un tubo estrecho de modo que el fondode este menisco se emplea como lnea de enrase. Hay que tener en cuenta en el enrase el llamado error deparalelaje, de modo que si el menisco se observa por encima de la lnea de enrase el volumen que nos indicaes menor del real.

Buretas: son tubos cilndricos estrechos con la parte inferior acabada en punta y la superior como un embudo(exagerado. Son precisos. En la parte inferior tiene una llave de paso. Estn graduadas y permiten medirvolmenes pequeos. El cero de la escala se encuentra en la parte superior. Las buretas se mantienen enposicin vertical, mediante un soporte. Su tamao es variable en 50 a 100 cm3. Antes de utilizarlas se debenpurgar y para ello se llenan con un poco ms de lquido de lo que est medido y se deja caer hasta enrasar encero, as se elimina el aire. Para manejarla se sujeta la bureta con la mano izquierda y se abre o cierra la llavecon el pulgar o ndice. El lquido caer sobre un Erlenmeyer que se sujeta con la derecha.

Pipetas: son tubos cilndricos estrechos cuya parte inferior acaba en punta, tambin sirven par medirvolmenes con precisiones generalmente volmenes pequeos (inferiores a 20ml) Son tubos estrechos depoco dimetro abiertos a ambos lados, terminando en punta el inferior, la salida del lquido se regula con eldedo ndice que tapa el orificio de la parte superior. Existen 2 tipos de pipetas las graduadas que midenfracciones de lquidos y las aforadas que miden un volumen fijo de lquido y tambin las hay de doble.

Pipetas pasteur: no sirven para medir volmenes sino echar gotas.

Vasos de precipitados: son vasos de vidrio de forma cilndrica. Miden volmenes aproximados y los haygraduados y no graduados. Los volmenes ms corrientes son: 50, 100, 500, 1000, 2000 y 5000ml Suelenestar construidos con vidrios que soportan temperaturas elevadas por lo que pueden ponerse en contacto conllamas de mechero o placas de calefaccin para calentar sus contenidos.

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Embudos: se utilizan para realizar operaciones de filtro con ayuda de un papel de fil

Tubos de ensayo: son tubos cilndricos de aproximadamente 2 cm3 de dimetro y con fondo cnico. Susaplicaciones son mltiples. Por ejemplo: se utilizan para realizar pruebas bioqumicas cualitativas.

Tubos de centrfuga: son tubos cilndricos en los que se colocan el material que va a ser centrifugado; puedenacabar en forma cnica o cilndrica y pueden estar graduados o sin graduar.

Erlenmeyer: es un recipiente de forma cnica utilizada para contener reactivos y soluciones, puede estargraduado o no y en todo caso miden volmenes con poca exactitud. Es adecuado para evitar prdidas demateriales efervescencia o en calentamiento prolongado porque la parte alta del matraz acta comocondensador de vapores, por lo tanto, da lugar a que haya menos evaporacin.

Portaobjetos: es una pequea lmina de vidrio rectangular donde se coloca la muestra para ser examinada almicroscopio. Existen portaobjetos con cavidades semiesfricas de distintos dimetros de profundidadutilizados para la observacin in vivo de microorganismos.

Cubreobjetos: es una fina lmina de vidrio con los que se cubren las muestras a examinar a microscopio.

Otros: varillas de vidrio, vidrio de reloj, embudos de decantacin, kitasato, placas de petri (son recipientesusados para el cultivo de microorganismos).

LIMPIEZA Y CONSERVACIN DEL MATERIAL DE VIDRIO

Hay que insistir en la importancia de la limpieza del material. Puede significar una fuente de error o tcnicasque debern ser repetidas. La limpieza se debe hacer al final de cada tcnica sin dejar secar el materialutilizado. Normalmente el material de vidrio se limpia con agua y jabn con el uso de escobillas adecuadas.En ocasiones pueden quedar restos siendo entonces necesario un lavado en mayor profundidad mediante lamezcla crmica formada por dicromtico potsico 60 gr, agua (primero el agua siempre) 200ml y cidosulfrico, suficiente para 1 litro.

Con esto se deja unos das u horas. Una vez limpio se debe aclarar varias veces con agua del grifo acabandocon un ltimo enjuague con agua destilada.

Material de plstico: En la actualidad asistimos en los laboratorios clnicos a una invasin de material puedeser de mltiple uso probetas, vasos de precipitados, etc. o de un solo uso puntas de pipetas de pistn, pipetaspasteur, placas de petri, etc. La mayora de los plsticos son atacables por disolventes orgnicos y algunos deellos por lo cidos fuertes. Adems tampoco soportan temperaturas elevadas sin deformarse o descomponerse.

Las ventajas frente al vidrio, son que son resistentes a la rotura, tienen poco peso, poco coste por lo que seutiliza como material desechable.

Pipetas de pistn o automticas: existe en el mercado una gran variedad de pipetas de pistn con puntas deplstico desechables. Estas pipetas han surgido al hacerse cada da ms evidente el peligro del pipeteo porsuccin de los fluidos biolgicos (suero, sangre, orina,...) con riesgo de contagio de enfermedades.

Por otro lado diversos disolventes orgnicos producen vapores txicos. Las pipetas de pistn pueden ser devolmenes fijos o regulables.

El mbolo tiene 3 posiciones: normal de reposo, intermedio y de presin a fondo.

Las pipetas se cargan apretando el mbolo hasta la posicin intermedia y soltndola para llenar la punta y se

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descargan una vez en la posicin normal apretando el mbolo hasta el fondo.

Dispensadores: son sistemas que proporcionan repetidamente un volumen seleccionado. Se utilizannormalmente para la adicin de reactivos a lotes de muestras reaccionantes. Hay una amplia gama dedispensadores con varios volmenes de utilizacin.

Cubetas: son recipientes usados como contenedores de muestras generalmente en disolucin en las tcnicas deespectrometras. Deben ser transparentes para la longitud de onda en la que se realiza la determinacin. Lasms usadas son de forma prismtica y son de cuarzo o slice fundido para el ultravioleta y visible; y de clorurosdico (NaCl) o de fluoruro clcico (F2Ca) para el infrarrojo.

Otros materiales

Estufas: es una caja rectangular provista de una serie de calor regulado por un mando situado en el exterior. Seutiliza a diario en el laboratorio de microbiologa para incubar cultivos de grmenes.

Mechero: el ms utilizado es de tipo Bunsen que consta de un pie sobre el que descansa un tubo por dondesale el gas. En la parte inferior llevan un orificio para la entrada de aire. Sirve para calentar reactivos, flamearasas de siembra,...

Gradillas: son soportes para tubos de ensayo, probetas,...

TEMA II

DISOLUCIONES

En numerosas ocasiones los reactivos son adquiridos por el laboratorio en forma de polvo que ha de serdisuelto en la proporcin adecuada para su uso, de ah la importancia de conocer la forma de expresar laconcentracin variada.

Conceptos bsicos: la materia est compuesta por unas unidades fundamentales llamadas tomos que secombinan entre s para formar molculas. Las masas de esos tomos son tan pequeos que su utilizacinresulta muy engorrosa para los clculos por eso se cre una escala relativa en la que se escoge un elementocomo tipo y los valores de los dems elementos se refieren a l por combinarse con casi todos los elementosse escogi el O2 al que se asign de forma arbitraria un peso atmico de 16.

tomos: el tomo es la parte ms pequea e indivisible de la materia. Actualmente podemos definir al tomocomo la partcula de un cuerpo simple que es qumicamente indivisible y que forma la menor cantidad de unelemento que puede entrar en combinacin.

Molculas: al unirse 2 o ms tomos se forman las molculas. La molcula es el lmite de la divisin fsica, esdecir, la parte ms pequea de una sustancia que conserva sus propiedades qumicas

Se denomina peso molecular de un componente a la suma de los pesos atmicos de los elementos quecomponen la molcula por cada uno de ellos por un coeficiente igual al nmero de tomos del mismo queentra a formar parte de ella.

Se denomina peso atmico gramo tomo gramo de un elemento a la cantidad del mismo equivalente a supeso atmico expresado en gramos.

Se denomina mol peso molecular molcula gramo de un compuesto a la cantidad del mismo que tiene engramos equivalentes a su peso molecular.

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Concepto de disolucin: se denomina disolucin a las mezclas ntimas de 2 ms cuerpos diferentes que nosofrecen a simple vista un aspecto homogneo.

El trmino de disolucin normalmente se suele utilizar para describir mezclas homogneas de 2 mslquidos de un lquido y 1 varios slidos.

En toda disolucin hay que distinguir el cuerpo disperso soluto que es el que se haya en menor proporcin yel cuerpo dispersante o disolvente que es el componente que interviene en mayor cantidad. Tanto el solutocomo el disolvente pueden ser slidos, lquido o gas: soluto (ClNa, azcar, alcohol) disolvente (agua, leche,agua)

La disolucin adopta el estado fsico del disolvente. En el laboratorio las disoluciones que se manejan conbastante frecuencia son las de slido en lquido y lquido en lquido generalmente. Especialmente se utilizanlas disoluciones acuosas.

Una disolucin se dice que est saturada cuando no admite ms sustancia en disolucin de tal modo que si seaade ms soluto queda en el fondo sin disolver.

Las disoluciones que se hallan lejos de la saturacin se llaman disoluciones diluidas y las que estn cerca deella se denominan disoluciones saturadas. La proporcin que hay entre soluto y disolvente se conoce comoconcentracin.

Hay varias maneras de expresarla.

MODOS DE EXPRESAR LA CONCENTRACIN

La concentracin de una disolucin nos indica la composicin de la misa en funcin de las cantidades que hayde soluto y disolvente. Unidades fsicas: partes por milln, tanto por % en: peso, volumen y p/v. Unidadesqumicas: molaridad, normalidad y molalidad.

Partes por milln: indica el nmero de gramos por soluto por cada milln de gramos de disolucin (el nmerode miligramos de soluto por cada 1000 gramos de disolucin). En disoluciones acuosas es equivalente asmismo a mg de soluto por litros de disolucin ya que al tratarse de disolucin extremadamente diluida sudensidad est muy cerca de la del disolvente, es decir, a la unidad.

5 ppm Fe en agua 5.000 mg de Fe en 1000 ml de agua.

% Peso: expresa los gramos de soluto contenidos en 100gr de disolucin

% Volumen: expresa los ml de soluto contenidos en 100ml de disolucin

% P/V: expresa los gramos contenidos en 100ml de disolucin

Molaridad: la M de una disolucin acuosa como nmeros de moles de soluto por litros de disolucin. Serepresenta por M

Normalidad: la N se define como el nmero de equivalentes gramos de soluto contenidos en 1 litro dedisolucin. Se representa por N. Si es valencia 1 la N = M.

Por equivalente de un elemento o compuestos entiende el peso de una sustancia que reacciona con 1 gramo dehidrgeno o con un peso que le equivalga. En las prcticas se hallan de la siguiente manera; en los cidos ybases se dividen su peso molecular por el nmero de iones H o hidroxilo respectivamente que produce sus

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molculas al disociarse..

Peso equivalente: Sosa NaOH

Peso equivalente: hidrxido potsico KOH

Peso equivalente: Hidrxido clcico Ca (OH)2

Peso equivalente: Hidrxido de aluminio Al (OH)3

Peso equivalente: cido clorhdrico HCl

Peso equivalente: cido ntrico HNO3

Peso equivalente: SO4H2

Peso equivalente: PO4H3

Para calcular el nmero de equivalentegramo en un determinado peso de un cido o base basta aplicar lasiguiente ecuacin. N = M Valencia

Molalidad: expresa el nmero el nmero de moles de soluto disueltos por 1 Kgr de disolvente. Una disolucin2 m de azcar en agua quiere decir que existe 2 moles de azcar por cada 1000 gr de disolvente.

PREPARACIN DE DISOLUCIONES

Los disolventes utilizados en la preparacin de disoluciones son muy variados aunque el agua es el msutilizado de todos ellos. A la hora de elegir el disolvente se ha de tener en cuenta que tenga propiedadesqumicas parecidas al soluto. En el laboratorio los productos que se manejan frecuentemente son cidos ysales utilizando como disolvente el agua. La operacin previa ser calcular que cantidades son las que vamosa necesitar dependiendo de las concentraciones que queramos obtener y la cantidad que vayamos a preparar.

Tcnica: se pesa la sustancia en un vidrio de reloj o en un vaso de precipitados (o en un papel de filtro). En elprimer caso una vez que se tiene pasada la cantidad deseada se transfiere a un vaso de precipitados lavandocon un disolvente el vidrio de reloj y echando estos lquidos de lavado en el vaso. Se disuelve entonces elsoluto con pequeas cantidades de disolvente y se va vertiendo sobre el matraz aforado en el que habremoscolocado un embudo. Se realiza varias veces para evitar que queden restos, en el vaso, se va aadiendodisolvente al matraz hasta llegar a la seal del aforo, el enrase es correcto cuando el fondo del menisco estangente a la lnea de aforo.

La cantidad de soluto contenido en un volumen dado de solucin es igual al producto del volumen por laconcentracin. Si diluimos una solucin, el volumen de la misma va aumentando a la par que suconcentracin va disminuyendo mientras que la cantidad de soluto presente permanecer constante, por ello 2soluciones con diferentes concentraciones, pero que contienen las mismas cantidades de soluto estrelacionadas de las siguientes formas (V1 C1 = C2 V2)

CONCEPTOS GENERALES

Cuando nos piden preparar un determinado volumen de una solucin de concentracin determinada siempre laprimera cuestin que se nos plantea es saber que cantidad de sustancia pura deber contener el volumensolicitado de la misma.

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Primer supuesto: soluto total/puro 100%. Si el soluto es una sustancia totalmente pura una vez calculada lacantidad necesaria del mismo no tendramos ms que pensar correctamente, disolver en una proporcin dedisolvente y enrasar hasta el volumen deseado.

Segundo supuesto: si la sustancia de partida es un lquido totalmente puro una vez calculada la cantidad enpeso necesaria del mismo, dado que en el caso de lquido es ms fcil medirlo en volumen que en pesotransformaremos el peso en volumen a travs de la densidad que es un dato conocido y luego enrasaremos conagua el volumen solicitado.

Tercer supuesto: si la sustancia de partida (soluto) no es totalmente puro (que esta va a ser la situacin real)entonces tendramos que tomar una cantidad mayor de sustancias que si fuera puro.

Riqueza: es una expresin que nos indica el grado de pureza de una sustancia.

DILUCIONES SERIADAS

En diferentes reas de laboratorio de anlisis clnicos se deben diluir las muestras, la sangre pura, lquidosorgnicos, etc. para preparar la concentracin medible, por ejemplo: diluciones de recuento de hematies,leucocitos, plaquetas, dilucin es de suero para determinar las titulaciones de anticuerpos (ANA), etc.

La dilucin puede ser definida como una expresin de concentracin. La dilucin expresa la cantidad ya seaen volumen o en peso de una sustancia en un volumen final especfico.

Una dilucin 1:5 o 1/5 contiene un volumen de una sustancia en 5 volumen del total. Por ejemplo: sangre 1/10(1 parte de sangre y 9 de agua). Siempre la misma cantidad de agua y de suero (en la proporcin).

CONCEPTOS DE pH

Al preparar una dilucin esta va a presentar carcter bsico, cido o neutro. Un cido es la sustancia capaz deceder protones (H+) y una base es la sustanica capaz de ceder iones hidroxilo (OH) o captar protones. Eltrmino que nos refleja ese carcter cido o base es el pH.

El pH se puede definir como el logaritmo del inverso de la concentracin de protones pH

Para los valores entre los que pueden oscilar hay que recurrir a la autoionizacin del agua. El agua se disociasegn la ecuacin: H2O [OH] [H+] La relacin que existe entre la parte disociada y la molecular viene dadapor la siguiente frmula

Experimentalmente se ha comprobado que Kw [H2O] = [OH] [H+] = 10

Sustituyendo ese valor en la expresion anterior resulta Al disociarse la molcula de agua nos da igualcantidad de [OH] que de [H]

Si predomina la [H+]en una sustancia, esa disolucin va a tener carcter cido

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

La determinacin del pH puede hacerse de forma cuantitativa mediante los aparatos peachmetros o de formacualitativa utilizando los papeles indicadores, estos son de muy fcil manejo. Se impregna el papel con elindicador durante unos segundos y se compara el color con una escala de colores. Ejemplo: si se introduce elpapel indicador en una disolucin y el color e rojo nos indica que el pH es cido (bajo)

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TEMA III

EL MICROSCOPIO

La palabra microscopio deriva de 2 vocablos griegos `micros' pequeo y `Scopein' ver.

En trminos generales un microscopio es todo instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o deun ser pequeo. El estudio de los microorganismos, clulas sanguneas, cristales en un sedimento orinario,...precisan de instrumentos que amplen el tamao de los microorganismos, hasta hacerlos visibles.

Segn el principio que se funda cada microscopio para ampliar las imgenes se pueden clasificar en 2 tipos:microscopio de luz u pticos y electrnicos.

Entre los primeros se distinguen varios tipos pero todos tienen en comn que utilizan lentes pticas. Tipos:microscopio de campo claro, oscuro, de fluorescencia y de cambio de fase.

Los segundos no incluyen lentes pticas si no que para ampliar las imgenes utilizan un haz de electrones.

Podemos hacer otra clasificacin:

Microscopio simple: son aquellos que utilizan una sola lente (lupas)

Microscopio compuesto: son aquellos que estn formados por 2 sistemas de lentes una situada cerca del ojo(ocular) y otra cercana al objeto (objetivo).

LUPA: es el sistema ptico ms sencillo. Permite la observacin de un objeto cuando se encuentra a la mnimadistancia de visin distinta, esto es, la distancia mnima por la cual el ojo puede percibir un objeto. Cuando seacerca un observador a un objeto crece el ngulo visual y este parece ser mayor. Sin embargo por debajo deuna determinada distancia (unos 25 cm) entre el ojo y el objeto, este no se ve con claridad. Este lmite se debea que se supera la capacidad mxima de deformacin del cristalino. Si se sita entre el ojo y el objeto unsistema ptico capaz de aumentar el ngulo visual se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad.

El aumento habitual de la lupa oscila entre 4 y 60 aumentos (la relacin existente entre el tamao del objetopercibido a simple vista y el apreciado). Por el microscopio, es decir, es el nmero de veces que se ve eltamao de un objeto por encima de su valor real.

En el microscopio compuesto el aumento se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo o delocular. Se resea por un nmero seguido del signo por (x).

Existen muchos modelos de lupas pero se utilizan normalmente para la diseccin de animales y observacinde colonias.

El PODER DE RESOLUCIN: el lmite de un microscopio es la capacidad de este para mostrar distintos yseparados puntos muy cercanos. El concepto es fcilmente comprensible si imaginamos un coche que vienepor la noche desde muy lejos hacia nosotros. En la lejana slo se visualiza un haz luminoso pero conforme seva acercando hay un instante a partir del cual se distingue la presencia de 2 faros prximos pero separados. Eneste momento nuestros ojos tienen un mximo de agudeza visual sobre el objetivo.

El lmite poder de resolucin se puede definir tambin como la distancia mnima entre 2 puntos que puedendistinguirse entre el microscopio. Si queremos que la resolucin de un microscopio sea alta el lmite o poderde resolucin deber ser lo ms pequeo posible.

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El lmite de resolucin se calcula mediante la siguiente ecuacin:

AN = apertura numrica

IR = ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y la lente

D = lmite de resolucin

= longitud de onda de la luz.

De esta ecuacin se deduce que la resolucin es mayor cuando menor es .

La resolucin es mayor (d es menor) cuanto ms grande es la apertura numrica de la lente utilizada (delobjetivo).

APERTURA NUMRICA: es la capacidad de la lente para juntar los grados de luz que se proyectan hacia ella.Depende del ndice de refraccin del medio que hay entre la lente y la muestra y del sen , siendo la mitaddel ngulo del cono de luz que penetra en la lente. Si se rellena el espacio existente entre la muestra y elobjetivo con una sustancia de mayor ndice de refraccin que el aire (por ejemplo: aceite de cedro `inmersin')se consigue que la mayor parte de los rayos partidos por los fenmenos pticos ocasionados en el condensadory el porta se refracta y penetra en el objetivo con lo que se incrementa la resolucin del microscopio.

LA PROFUNDIDAD DE FOCO: es el espesor del objetivo que se aprecia enfocado. El contraste es ladiferencia en la absorcin de luz entre el objeto estudiado y el medio que le rodea. Se puede aumentar elcontraste mediante tincin de la muestra.

PARTES DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO:

Se distingue 2 partes: mecnica y electrnica.

PARTE MECNICA: dentro de ella tenemos un sistema de soporte y uno de ajuste

Sistema de soporte: consta de:

Pie: sirve como base al microscopio y tiene el suficiente peso como para sostener el aparato. Antiguamentetena forma de herradura y ahora rectangular.

Brazo: une el pie con el tubo en caso de transporte se debe coger al microscopio por esa pieza.

Tubo: es la parte del microscopio que sujeta el objetivo y los oculares; mantenindolos en la distancia correctade trabajo.

Platina: es una placa horizontal que sostiene las preparaciones para realizar la observacin. El porta debequedar sobre la perforacin que hay en el centro de la platina que deja pasar la luz que viene del condensador.Hay una pinza que sujeta el porta.

Sistema de ajuste:

Manilla de ajuste de los oculares.

Tornillo: que permite al aflojarlo girar la pieza del tubo donde estn los oculares y observar fcilmente lapreparacin desde otra posicin.

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Tornillos reguladores de la platina: sirve para desplazar el porta a lo largo y ancho de la platina. Sumovimiento queda reajustado en dos escalas mviles lo que permite establecer la posicin exacta de cualquierpunto de la preparacin.

1 Se observa el valor ms bajo de la escala en mm; est ms cercano al 0 que la escala en dm (34)

2 Observar el valor de la escala en dm que coincide con uno de los valores de la escala en ml (34'9)

Tornillo de elevacin del condensador: se utiliza para elevar el condensador y disminuir la iluminacin oviceversa.

Tornillo de centrado del condensador: se utiliza para centrar el condensador respecto al objetivo.

Palanca de cierre del diafragma

Tornillo de enfoque: muevan la platina hacia arriba y hacia abajo y son 2 el macromtico o de avance rpido yotro es el micromtro o de avance lento. Llevan incorporados un mando del bloqueo que fija la platina a unadeterminada altura.

Regulador de la intensidad de la lmpara.

PARTE PTICA: dentro de ella tenemos un sistema de iluminacin y lentes.

Sistema de iluminacin:

Fuente de luz: lmpara halgena de intensidad variable. Situada al pie del microscopio. En su superficieexterna hay un anillo para colocar filtros que facilitan la visualizacin de algunas preparaciones.

Condensador: concentran la luz generada en la lmpara hacia la preparacin. Est entre la fuente luminosa y laplatina.

Diafragma o iris: sirve para ajustar la apertura numrica. Cuanto ms se cierra, ms empeora la resolucin ymejora el contraste. Est situada en el interior del condensador.

Lentes:

Objetivos: genera una imagen real invertida y aumentada del objeto. Estn colocados en la parte inferior deltubo a nivel de una pieza mecnica que permite cambiarlos fcilmente y que recibe el nombre de revlver.Los de mayor aumento poseen un sistema de amortiguacin que dificulta su ruptura al chocar con lapreparacin. Tiene dibujado un anillo coloreado que indica su nmero de aumentos: 4X (anillo rojo), 10X(anillo amarillo), 40X (anillo azul), 100X (anillo blanco, inmersin negro). El objetivo de 100 es el deinmersin porque precisa del uso de aceite de cedro sobre la preparacin.

Oculares: capta la imagen formada por el objetivo y la amplia. Los actuales microscopios son binoculares yestn unidos mediante un mecanismo que permite ajustar la distancia interpupilar. Los ms usados son de 10Xaumentos.

MANEJO DEL MICROSCOPIO

1 Accionando el revlver seleccionar el objetivo adecuado. Generalmente se empieza por un objetivo depoco aumento y luego se pasa a otro de mayor aumento. Si se hace esto basta con mover el tornillomicromtrico; para enfocar la muestra con este ltimo objetivo.

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2 Colocar la preparacin sobre la platina.

3 Encender la fuente de luz y regularla a una intensidad media para evitar que se funda rpidamente lalmpara.

4 Situar el condensador: bajo si se utiliza un objetivo de bajo poder de bajo aumento (10X).En la mitad desu recorrido si se utiliza un objetivo de gran poder de ampliacin (40X) y alto si se usa un objetivo deinmersin (100X). Tambin conviene ascender el condensador si se observa una muestra teida y descenderlosi se estudia una muestra en fresco.

5 Mirando por fuera de los oculares hacen ascender la platina con el tornillo macromtico hasta que elobjetivo est muy cerca de la preparacin.

Cuando se utiliza un objetivo de poco poder de ampliacin el microscopio tiene un tope que impide unacercamiento excesivo. Sin embargo si se emplea un objetivo de inmersin previamente hay que depositar unapequea gota de aceite sobre la preparacin y posteriormente hacer ascender la platina hasta que aquel(objetivo de inmersin) toque el aceite pero no la preparacin.

6 Ajustar la distancia interpupilar.

7 Moviendo el tornillo macromtrico hacer descender lentamente la platina hasta que se vea mirando porlos oculares la imagen de la muestra. Con el objetivo de inmersin nunca debe separarse tanto de lapreparacin como para perder el contacto con el aceite.

8 Afinar el enfoque con el tornillo micromtrico.

9 Desplazando horizontalmente la platina con movimientos en zigzag recorrer con el objetivo toda lapreparacin para realizar una correcta observacin de la misma.

10 Durante la observacin mover continuamente el tornillo micromtrico para enfocar los planos de lamuestra.

11 Una vez finalizada la observacin hacer descender totalmente la platina y se retira la preparacin. Si seha utilizado aceite de inmersin se debe limpiar con una pequea cantidad de xilol impregnado en una telasuave. Los objetivos secos pueden limpiarse con agua destilada el exterior del aparato con un pao hmedo.

AJUSTE DE LOS OCULARES

Se realiza una vez enfocada la muestra y se lleva a cabo de la siguiente forma:

1 Cerrar el ojo izquierdo y ajustar el enfoque del ojo derecho con el tornillo cm

2 Cerrar el ojo derecho y ajustar el enfoque del ojo izquierdo con el anillo de ajuste del ocular.

TIPOS DE MICROSCOPIOS

En el microscopio compuesto el campo est intensamente iluminado y los objetos se ven ms oscuros que l.Este microscopio permite el estudio de las estructuras externas de las muestras para la cual esta debe dispuestaen una fina capa que puede ser atravesado por la luz.

El microscopio de campo oscuro: es un microscopio ptico ordinario con un condensador especialmentefabricado para dirigir la luz nicamente desde los lados. Con esto se logra que la luz difragtada en un objeto se

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dirige y penetra en el objetivo. Si en el campo examinado no hay ninguna partcula de distinto ndice derefraccin se ve todo oscuro. Su mxima aplicacin es la de observar la de microorganismos vivos enpreparaciones en fresco o en gota pendiente. En ellas se observa el objeto que diafragta la luz brillante y elfondo oscuro. Tambin se ha utilizado mucho para la visualizacin directa del Treponema Pallioum (sifilis)

El microscopio de contraste de fases: consta de un dispositivo situado dentro o debajo del condensador queproduce una diferencia de un cuarto de en unos rayos luminosos respectos a otros. Esto origina unasvariaciones de luminosidad en los elementos estudiados que permiten diferenciarlos del resto de la muestra yobservar con mayor detalle su estructura interna. Es muy til para observar objetos transparentes y nocoloreados y as como para preparaciones bacterialgicas.

El microscopio de fluorescencia: es un microscopio en el cual la fuente luminosa es luz ultravioleta de modoque la estructura solo se har visible si es fluorescente. Podemos encontrarnos con sustancias que sonfluorescentes por s mismas o sustancias o estructuras que captan colorantes fluorescentes. As sucede porejemplo cuando se utiliza auramina para demostrar la presencia de vacilos de Koch. En esputos o cuando seemplea naranja de acridina se une a la Earduerella Vaginalles en exudados vaginales.

Este microscopio se utiliza en inmunofluorescencia de modo que la fijacin del colorante fluorescencia al quese le llama tambin fluorocromo que pueden ser fluoresterina, rodaminas y la ficoeritrina. La fijacin decolorante fluorescente a elemento investigado se realiza con un anticuerpo marcado. Por lo tanto el objetofluorescente se ve como un cuerpo brillante que resalta sobre un fondo oscuro.

El microscopio electrnico: est formado por un tubo en cuyo interior se ha hecho el vaco y a travs del culse propagan los electrones que inciden sobre el objeto. Despus estos electrones son refractados y se recogensobre una pantalla en la cul se dibuja la imagen del objeto.

TEMA IV

SANGRE: FISIOLOGA, COMPOSICIN Y CARACTERSTICAS FSICOQUMICAS

La sangre es un tejido constituido por clulas (leucocitos, hematies y plaquetas) y plasma (solucin proteicaen la que se hayan disueltos), iones y otros principios inmediatos

Los leucocitos, hematies y plaquetas reciben el nombre de elementos formes y gracias a que se hallansuspendidos en el plasma confieren a la sangre su fluidez caracterstica.

Los hematies tienen a su cargo la oxigenacin de los tejidos. Los leucocitos la defensa frente a agentesextraos y las plaquetas la hemostasia.

El plasma desarrolla diferentes funciones entre las que destaca la inmunitaria (completo, inmunoglobulinas),la hemosttica (factores de coagulacin), transporte (transferrina), nutritiva (vitamina A y principiosinmediatos), el equilibrio inico (oligoelementos) y la eliminacin de sustancias de deshecho (CO2 yproductos del metabolismo intermediario).

HEMATOPOYESIS

Se denomina hematopoyesis al proceso por el que se forma las distintas clulas de la sangre que tiene lugar ensu mayor parte en la mdula sea. Slo las clulas maduras pasan a sangre perifrica y estas se mantienen enunos lmites de normalidad gracias a un equilibrio entre construccin y destruccin.

La hematopoyesis comienza en las primeras semanas de vida embrionaria en el saco vitelino. Al tercer mes elprincipal rgano hematopoytico es el hgado. Hacia la mitad de la vida fetal el bazo y en menor extensin los

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ganglios linfticos, el timo y la mdula sea que presentan cierta actividad hematopoytica.

En el momento de nacer toda la mdula sea tiene capacidad hematopoytica siendo mxima su actividadhematopoytica.

En el individuo adulto la capacidad formadora de las clulas sanguneas se limita a la mdula sea de loshuesos planos (costillas, esternn, pelvis, crneo,...) a los huesos cortos (vrtebras) y epfisis de los huesoslargos.

TEJIDO HEMATOPOYTICO

El sistema hematopoytico engloba a los tejidos y rganos que intervienen en la produccin, maduracin ydestruccin de las clulas sanguneas. Este sistema comprende: el sistema mononuclear fagoctico, bazo,hgado, timo, mdula sea y glnglios linfticos.

Sistema Mononuclear Fagoctico: este sistema es un conjunto de monocitos, histocitos y macrfagos;distribuidos en los diferentes espacios intravasculares y extravasculares cuyas principales funciones sonfagocticas e inmunolgicas.

Bazo: es un rgano muy vascularizado que se localiza bajo el diafragma a la izquierda del estmago. En elbazo se produce una eliminacin de los hematies viejos o defectuosos as como de cualquier tipo de clulascon malformaciones morfolgicas o funcionales. El bazo acta tambin como reserva de plaquetas. En el fetotambin participa en la hematopoyesis

Hgado: es un rgano que se localiza bajo el diafragma en la parte superior derecha del abdomen. En el feto, elhgado es el lugar principal de la hematopoyesis desde el tercer mes de gestacin hasta poco antes delnacimiento. Aunque menos eficaz y selectivo que el bazo, tambin interviene en la retirada de la circulacinde hematies lesionados o defectuosos.

Timo: es un rgano linfticopoytico situado en la zona superior del mediastino (entre los dos pulmones) yase ha desarrollado en el momento del nacimiento y continua creciendo hasta la pubertad. Posteriormentecomienza a atrofiarse hasta que en la de servir como un compartimento para la maduracin de los linfocitos T.

Ganglios Linfticos: se disponen en grupos a lo largo de los capilares linfticos ms grandes. Contienen unazona interior llamada mdula y una exterior llamada corteza. En la corteza se encuentra linfocitos T,macrfagos y linfocitos B.

Mdula sea: es el rgano mayor del cuerpo humano. Es el lugar ms importante de la formacin de lasclulas sanguneas. Se divide en dos partes: mdula sea roja (donde tiene lugar la hematopoyesis activa) y lamdula sea amarilla (grasa; formada por clulas adiposas).

En los primeros aos de vida casi toda la mdula sea es roja. Despus se va sustituyendo paulatinamente pormdula sea amarilla. En los adultos la hematopoyesis est limitada a la mdula de los huesos planos, a lasvrtebras y a la epfisis de los huesos largos.

La celularidad de la mdula sea puede verse alterado por ciertos estados patolgicos. Por lo que esimportante conocer las proporciones celulares de las presentes series; as como la morfologa de un individuosano.

La mdula roja normal es capaz de responder a diferentes estmulos, por un lado puede hacerse hipercelular(incrementando su actividad de proliferacin) o por el contrario hipocelular (inactiva como consecuencia defactores ambientales, radiaciones o frmacos).

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Las clulas hematopoyticas una vez maduras pasan a la circulacin entre los factores que constituyen lamaduracin. Salen de una forma ordenada de las clulas de la mdula sea a la sangre perifrica; en la que seencuentran una serie de factores humorales y el crecimiento del parenquima.

ORIGEN Y DIFERENCIACIN DE LAS CLULAS HEMATOPOYTICAS

Todas las clulas sanguneas provienen de una misma clula primitiva denominada clula madre pluripotente(Stem cell o CFULM). Capaz de autoperpetuarse y de diferenciarse hacia cualquier lnea madurativa. Apartir de la CMP aparecen las clulas madres comprometidas que van a diferenciarse hacia la lnea linfoideque se conoce como CFUL o hacia la lnea mialoide CFUM y cuyo proceso de diferenciacin ymaduracin finalizar con la aparicin de la clula terminal presente en sangre perifrica (hematies, leucocitosy plaquetas).

El esquema de cmo van a surgir es el siguiente:

1 Precursor linfoide CFUL

1.1 PreT

A Linfocito T

1.2 PreB

B Linfocito B

B.1 Clula plasmtica

2 Precursor mialoide CFUGEMM CFUM

2.1 GFUGM

A Mialoblasto Neutrfilo

B Monoblasto Monocito Macrfago

2.2 CFUBas Promielocito basfilo Basfilo

2.3 CFUEO Promielocito eosinfilo Eosinfilos

2.4 BFUE Promielocito proeritroblasto Hematie

2.5 BFUMeg Megacarioblasto Plaquetas

La poblacin celular hematopoytica se clasifica en 3 grupos:

Clula Madre Stem Cell: se puede definir como la clula que posee una capacidad de automantenimientoque se prolonga durante una gran parte de la vida de un individuo. Todas las clulas sanguneas (hematies,plaquetas, granulocitos, monocitos, linfocitos, etc.) proceden. Slo un 10% de las clulas Stem se encuentraen fase de sntesis de ADN; pero el 90% restante que se encuentra en fase situacin de reposos posee lacapacidad de entrar en fase de sntesis en situacin de demanda.

El reconocimiento de las clulas madre hematopoyticas se basa fundamentalmente en los cultivos in vitro de

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mdula sea.

Se ha comprobado que las clulas maduras de la sangre se desarrollan cultivando mdula sea en diversascondiciones y con la adicin de diversas sustancias formando colonias (CFC) o tambin unidad formadora decolonias (UFC)

Clulas progenitoras comprometidas: (no se observan al microscopio) las clulas que constituyen estecompartimento se caracterizan por tener un gran potencial proliferativo y estar predestinadas a diferenciarseen una lnea celular concreta. Se han caracterizado factores de crecimiento, proliferacin y diferenciacin deestas clulas a los que se han llamado factores estimulantes de colonias (CSFS). Estas clulas progenitorasno pueden identificar morfolgicamente al microscopio.

Clula de morfologa reconocible: son las clulas con caractersticas morfolgicas y funcionales especficas yuna vida limitada.

ERITROPOYESIS

Eritropoyesis es la produccin de los hematies o eritrocitos. El hematie es el vehculo para el transporte de lahemoglobina. En situaciones anormales se pueden perder o destruir ms hematies de los habituales, esentonces, cuando la mdula sea puede aumentar la produccin temporalmente para volver a restablecer elequilibrio.

Etapas de la eritropoyesis:

Proeritroblastos (normoblasto): mide entre 2025 micras. Es la clula ms inmadura reconociblemorfolgicamente de la serie roja. Es grande tiene un ncleo redondo con varios nucleolos y escasocitoplasma azul.

Eritroblasto basfilo (normoblastos iniciales): tiene un tamao entre 1620 micras. Procede delproeritroblasto. Es ms pequeo. El ncleo ha perdido nucleolos que no se observan. Son de color azul.

Eritroblasto policromatfilo: es de menos tamao que el anterior. El ncleo se va haciendo ms pequeo. Elcitoplasma es policromtico (ms rosado). Es el ltimo estadio de la serie con capacidad mittica. Mide entre8 y 12 micras.

Eritroblasto ortocromtico: miden entre 7 y 10 micras. Tiene un ncleo pequeo, redondo y muy condensado.El citoplasma es acidfilo (rosado) por su alto contenido en hemoglobina. Una vez finalizado su maduracinel ncleo es expulsado de la clula y fagocitado por las clulas del sistema de la mdula sea (mononuclearfagoctico). No tiene capacidad mittica. Con la prdida del ncleo el eritroblasto ortocromtico se transformaen reticulocito.

Reticulocito: es una clula anucleada con capacidad de sntesis de hemoglobina, protenas y ARN. Con latincin vital de azul cresilo brillante puede observarse la sustancia ribosmica reticulada. El reticulocitopermanece 48 horas en mdula sea antes de pasar a la sangre perifrica donde continua como tal 24 horashasta convertirse en hematies maduros. El nmero de reticulocito en nios y adultos entre 0'2 y 2% dehematies. Es de gran valor para conocer la eficacia de la eritropoyesis.

Hematies: es el elemento forma ms maduro y ms pequeo de la serie roja (68 micras). Los hematiespresentan una vida media de 120 das y su principal misin es la captacin de O2 por medio de lahemoglobina y su transporte a los tejidos. Finalmente las funciones del hematie se deterioran y el bazoprincipalmente hace de filtro retirndolos de la sangre perifrica.

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La transformacin de proeritrocitos a hematies dura entre 6 y 9 das.

REGULACIN DE LA ERITROPOYESIS

Depende del grado de oxigenacin de los tejidos. Una hormona sintetizada en el rin y conocida comoeritroproyetina estimula la eritropoyesis de la mdula sea. La mdula sea puede aumentar la eritropoyesishasta 10 veces como respuesta a la eritroproyetina si se dispone de hierro suficiente.

Las acciones ms importantes de la eritroproyetina son:

~ Estimular la formacin y diferenciacin celular.

~ Reducir el tiempo de maduracin celular

~ Aumentar la concentracin de hemoglobina

~ Facilitar la liberacin de reticulocitos a la circulacin y se va a producir una hipercelularidad eritroblsticaen mdula sea.

Tambin los andrgenos estimulan la eritropoyesis, las hormonas hipofisarias, tiroideas y suprarrenales.

GRANULOPOYESIS

Los granulocitos se forman en la mdula sea a partir de la Stem Cell y la primera clula identificable es elMialoblasto. Las clulas de la granulopoyesis constituyen el 6065% de las clulas de la mdula sea.

El CFUGM es el precursor biopotencial que puede desarrollar CFUM para producir monocitos.

Las clulas de la serie granuloctica que se desarrollan a partir de CFUG; son la siguiente. La primera quepuede identificarse es el Mialoblasto.

Mialoblastos: son clulas grandes entre 15 y 20 micras. Ncleo redondo, grande y con nucleolo. El citoplasmaes escaso y normalmente sin granulaciones y color azul.

Promielocito: generalmente algo mayor que el mialoblasto. Presenta grnulos azurfilos. La cromatinanuclear empieza a condensarse y los nucleolos resultan menos evidentes. La relacin nucleocitoplasma esmenor (citoplasma es mayor).

Mielocito: ncleo redondeado y sin nucleolos. El citoplasma a perdido la basoflea (color rosado) y contienegran nmero de granulaciones especficas (neutrfilos, basfilos o eosinfilos) (tintes diferentes). Es la ltimaclula de capacidad mittica.

Metamielocito: ligeramente inferior al mielocito. Se caracteriza por un ncleo arrionado (forma rin) conuna cromatina ms condensador.

Cayado banda: tamao ligeramente inferior al anterior. El ncleo en forma de banda. En la base deformacin del cayado se produce la constriccin parcial del ncleo.

Hasta que se forma un fino filamento entre los lbulos y se forma el leucocito maduro o sementado.

Segn el tipo de granulacin especfica se habla de neutrfilos, eosinfilos basfilos cada una presenta unasfunciones especficas.

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CFULM (Stemcell) CFUGM

1 CFUG Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Cayado Leucocito maduro (neutrfilo,eosinfilo y/o basfilo)

2 CFUM Monocitos.

Tras un periodo de 7 horas el neutrfilo emigra por diapedesis (por pseudpodos) a los tejidos dondepermanece hasta su destruccin y muerte celular. Seguida de su fagocitosis por los macrfagos existente entodos los tejidos. La granulopoyesis dura entre 10 y 13 das. Los factores estimulantes del crecimiento regulanel desarrollo de los granulocitos y monocitos.

Tambin se han identificado sustancias inhibidoras de la granulopoyesis tales como la lactoferrina que esproducida por los grnulos secundarios de los neutrfilos.

LINFOPOYESIS

Los linfocitos se desarrollan principalmente en los tejidos linfoides del cuerpo como: los ganglios linfticos,los folculos linfoides del bazo, el tracto gastrointestinal (apndice), las amgdalas y otros sitios.

A partir del precursor linfoide (CFUL) aparece la primera clula primitiva que es el linfoblasto.

Linfoblasto: posee un citoplasma no granulado que se tie de azul oscuro en la periferia y ms claro en elcentro. El ncleo es grande. La cromatina est dispuesta en forma reticular y tiende a ser punteada. Por logeneral solo contiene 1 2 nucleolos.

Prolifocito: esta clula es ms pequea que su precursora y por lo general presenta una banda ancha decitoplasma azul. La cromatina nuclear tiende a aglomerarse y no se detecta un nucleolo definido.

Linfocito grande: su citoplasma es bastante abundante y adquiere un color azul celeste. Adems pueden existirunos pocos grnulos citoplasmticos azurfilos pequeos y muy bien definidos. El ncleo es redondo o unpoco dentado y la cromatina tiende a estar aglomerada.

Linfocito pequeo: de menor tamao y el citoplasma es escaso. El resto es idntico al linfocito grande.

Desde el ao 1962 se sabe que existen 2 tipos de linfocitos fundamentales linfocitos T y linfocitos B. Que a suvez constan de diversas subpoblaciones que se diferencian por una serie de caractersticas inmunolgicas yfuncionales.

Los linfocitos T constituyen entre 6075% de los linfocitos de sangre perifrica y los B entre u n1020%. Loslinfocitos B pueden transformarse en clulas plasmticas y estas ltimas son secretoras de inmunoglobulinas(anticuerpos). Los linfocitos entran y salen varias veces de la circulacin sangunea. Algunos viven entre1020 das y otros por espacio de varios aos.

Algunos linfocitos se transforman por un estmulo antignico, otros se pierden a travs del tracto digestivo yrespiratorio y la mayor parte son fagocitados por macrfagos en los ganglios.

CFUL

1 CFUL Linfoblatos Prolinfocito Linfocito grande pequeo

2 CFUM (plaquetas, hematies, neutrfilos,...)

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TROMBOPOYESIS

Es la produccin de plaquetas a partir de la Stemcell que se encuentra en la mdula sea. Las plaquetas secaracterizan por la endomitosis (divisin nuclear sin citoplasma). La clula mdula ms primitiva es elmegacarioblasto.

Megacarioblasto: es la clula ms pequea de la serie. Su ncleo es grande. Tiene nucleolos y el citoplasmaes basfilos y sin granulaciones.

Promegacariocitos: es mayor que el anterior y se identifica claramente en la mdula sea. El ncleo esmultiglobulado sin nucleolos y cromatina densa.

Megacariocito: es mayor que los anteriores. Es la clula ms grande de la mdula sea. El citoplasma esvoluminoso. Cubierto de granulacin azurfila. El ncleo es multilobulado. Suele ser pequeo encomparacin al citoplasma. La ruptura y desprendimiento del citoplasma dan origen a las plaquetas otrombocitos.

Un megacariocito es capaz de producir 16.000 plaquetas.

Plaquetas: carecen de ncleo son pequeos fragmentos de citoplasma que se han desprendido de la periferiadel megacariocito. Su tamao suele estar entre 24micras. Permanecen en sangre entre 812 das. Despus lasclulas del sistema fagoctico las destruyen en el bazo. Es muy probable que la maduracin y proliferacinestn reguladas por dos factores humorales.

1: El factor estimulante de las colonias megacariocticas que inducen la proliferacin de las clulasprogenitoras diferenciadas.

2: Es la trombopoyetina: tambin existen constituyentes que inhiben la trombopoyesis algunos de ellosproducidos por las propias plaquetas.

CFULM

1 CFUL

2 CFUM BFUMg Megacarioblasto Promegacarioblasto Megacariocito plaqueta.

MADURACIN DE LA SERIE MONOCTICA Y MACRFAGOS

Este tipo celular se forma principalmente en el bazo y los tejidos linfoides y en menor medida en la mdulasea. La primera clula madura reconocible al microscopio es el monoblasto.

Monoblasto: es muy similar al mieloblasto y por lo general pueden verse nucleolos, excepto que su citoplasmasuele ser ms claro.

Promonocito: algo mayor que el monoblasto. La relacin ncleocitoplasma es moderada. El ncleo esgrande y por lo general contorneado y el citoplasma es basfilo.

Monocito: (1520micras) presente tanto en la sangre como en la mdula sea. Con un citoplasma que secolorea de azul grisceo. A veces pueden reconocerse uno finos grnulos azurfilos y vacuolas. El ncleosuele ser redondo, reniforme o incluso puede ser tambin globulado. La cromatina est dispuesta en grietas amodo de madeja.

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RESUMEN

CFULM

1 CFUL (precursor linfoide) linfoblasto prolinfocito linfocito (grande o pequeo).

2 CFUGM (precursor mieloide)

2.1 BFUE Promieloblasto Eritroblasto basfilo Er. policromatfilo Er. ortocromtico reticulocito hematies

2.2 CFUG

A) CFUG Mieloblasto Promielocito Mielocito Metamielocito Cayado polimorfonucleares

B)CFUM Monoblasto Promonocito Monocito

2.3 BFMMeg Megacarioblasto Promegacariocito Megacariocito Plaquetas.

CONCEPTOS

La sangre circulante: la sangre es un lquido de color rojo que, circula a travs de los vasos del cuerpo aexcepcin de los vasos linfticos. Es fcilmente coagulable cuando se detiene. Est constituida por elementosslidos y un elemento lquido que es el plasma. La sangre es un lquido viscoso y denso que se desplazalentamente. Si el agua tiene una viscosidad de 1, la sangre tiene una viscosidad media de 5. Ello indica quefluir a una velocidad 5 veces ms lenta que el agua, as mismo, es ms pesada que es agua. Tiene unatemperatura de 37C, un pH entre 7'357'45 y una concentracin de cloruro sdico de 3'5% similar al agua demar, dndole un sabor salado. Supone el 8% del peso corporal. Con un volumen de 5 a 6 litros en un hombrede tamao medio.

Elementos que constituyen la sangre: la sangre est constituida por 2 porciones uno es el plasma que es dondese encuentra disuelto las sustancias y otros son los elementos formes (son clulas y corpsculos que estnsuspendidos en el plasma y son las siguientes: 1 Hematies, glbulos rojos: son clulas anucleadas quetransportan el O2 desde los pulmones a los tejidos.

2 Leucocitos o glbulos blancos:

Granulares (polinucleares PMN): Neutrfilos, eosinfilos, basfilos Agranulados (mononucleares): linfocitos, monocitos

3 Plaquetas

Plasma: es un lquido de color amarillento que queda en la parte superior de un tubo de ensayo despus decentrifugar el mismo con una determinada cantidad de sangre y un anticoagulante apropiado.

Se obtiene por centrifugacin de sangre mezclada con anticoagulante, variando el aspecto microscpico delmismo segn las condiciones y patologas del individuo. Siendo en condiciones normales un lquidoamarillento. La composicin es la siguiente:

Agua: constituye alrededor del 91% del plasma. Sus funciones son como medio absorbente de calor, actuarcomo solvente y ser el medio de suspensin de los elementos formes.

Protenas: constituyen el 8% de los solutos del plasma. Bsicamente existen las siguientes:

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~ Albminas: suponen ms de la mitad de las protenas plasmticas. Es producida por el hgado; dan origen ala viscosidad de la sangre; ayuda a conservar el balance hdrico entre los tejidos pues regula el volumen entrela sangre.

~ Globulinas: de estas el grupo ms importante son las:

Gammaglobulinas: que intervendrn en la defensa immunitaria

Fibringeno: es una protena de fase aguda; representa una pequea porcin de un papel especial en lacoagulacin sangunea.

Nitrgeno no proteico: son sustancias que contienen N2 y no son protenas. Son productos de desecho delmetabolismo proteico que se elimina por el rin, Son el cido rico, urea, creatinina y las sales de amonio.

Sustancias alimenticias: una vez en el tubo digestivo se descomponen los productos. Estos pasan a la sangre.Para ser distribuidos a todas las clulas del organismo. Estos productos son los aminocidos, la glucosa y loslpidos.

Sustancias reguladoras: son las enzimas y las hormonas. Los enzimas son producidos por las clulas delcuerpo y catalizan reacciones qumicas. Las hormonas son producidas por las glndulas endocrinas y regulanla defensa de funciones orgnicas.

Gases respiratorios: CO2 y O2. Estn ms relacionadas con los hematies que con el plasma.

Electrolitos: son iones que constituyen las sales inorgnicas del plasma. Los cationes son: Na, K, Ca+2,MG+2. Los aniones son: P, SO4, bicarbonatos, Cl. Estas salen tienen la funcin del mantenimiento de unapresin osmtica adecuada. La regulacin del pH y el mantenimiento de un balance fisiolgico adecuado entrela sangre y los tejidos.

Suero: el suero es simplemente el plasma menos las protenas de la coagulacin (fibringeno). La sangreextrada del organismo, introducida en un tubo de ensayo y centrifugada si se deja pasar un tiempo se observaen el plasma la formacin de una masa gelatinosa blanca que no es ni ms ni menos un cogulo formado porla accin del fibringeno. Si se retira este cogulo tendremos el plasma desprovisto de fibringeno y algunosfactores de coagulacin que es a lo que denominamos suero. El suero se obtiene al centrifugar una muestra desangre total recogida en un tubo de ensayo sin anticoagulante o bien obtenida en reposo tras la retraccin delcoagulo sanguneo.

Es de color amarillo limpio y transparente. Cuando se extrae suero despus de una comida copiosa puedetener un aspecto lechoso blanquecino por la presencia de innumerables gotitas de grasa (presencia decolesterol o triacilglicridos elevada).

El color del suero puede variar en ciertos estados patolgicos:

AMARILLO FUERTE: aumento de bilirrubina.

COLOR MUY PLIDO: en las anemias, en las hemodiluciones.

PARDO ROJIZO: hemlisis intensas (ruptura de hematies).

ROJIZO: aparece en caso de hemlisis. Tambin en caso de mala manipulacin de extraccin sangunea o delproceso de separacin de la muestra sangunea durante la centrifugacin de la misma.

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Anticoagulantes: los 3 anticoagulantes habitualmente utilizados en hematologa son: citrato trisdico, EDTA(las sales tripotsica idiosdicas de cidos etilendiaminotetractico) (los dos primeros previenen lacoagulacin por extraccin del calcio de la sangre mediante precipitacin o unin en forma no ionizada.),HEPARINA (acta formando un complejo con la antitrombina III del plasma que inhibe la trombosis y otrasetapas de la activacin de los factores de la coagulacin).

Citrato sdico: se utiliza para las pruebas del estudio de hemostasia (coagulacin) la proporcin es 1 parte decitrato en solucin acuosa y 9 partes de sangre total. En la actualidad se usa el citrato tamponado porqueayuda a estabilizar el pH del plasma. Para el estudio de VSG 1 de citrato y 4 de sangre.

EDTA: se utiliza en una concentracin de 1 a 2 mg/ml de sangre y es el anticoagulante preferido para losrecuentos celulares y los estudios morfolgicos.

Heparina: de 0'1 a 0'2 mg/ml de sangre no afecta al tamao celular o al hematocrito. Es el mejoranticoagulante para la prevencin de la hemlisis. No es satisfactorio para recuentos leucocitarios oplaquetarios debido a que produce agregacin celular.

CAUSAS DE ERROR

Las extensiones se deben preparar inmediatamente. Si no se pueden realizar en el trmino de 2 o 3 horas lasangre debe refrigerarse a 4. Si se mantiene a temperatura ambiente, el hinchazn de los hematies aumentaentre las 6 y las 24 horas. Los hematies aumenta el hematocrito y el volumen corpuscular medio y disminuyela concentracin corpuscular media de hemoglobina y la velocidad de sedimentacin.

Antes de tomar una muestra de un tubo con sangre venosa para una determinacin hematolgica es importantemezclar la sangre completamente. Si el tubo ha estado de pie debe invertirse al menos 60 veces o colocarlodurante 2 minutos en un rotador mecnico pues de lo contrario la precisin se vera afectada.

TEMA V

RECUENTOS DE CLULAS HEMTICAS

Los recuentos de eritrocitos, leucocitos y plaquetas se expresan como concentraciones que seran nmero declulas X unidad de volumen de sangre. Hasta hace poco se expresaban en V de mm3. Actualmente se expresaen litros.

RECUENTOS MANUALES

Para ellos se utiliza las cmaras de recuento o hemocitmetros; aunque este mtodo se utiliza raramente en elrecuento sistemtico, sin embargo, se requiere que el tcnico est capacitado para aplicarlo en:

~ La comprobacin de la validez de los mtodos electrnicos con objeto de intentar su calibracin.

~ Como mtodo de comprobacin de la validez de recuentos electrnicos en caso de leucopenia profunda opor el contrario leucemia.

~ Como mtodo de apoyo:

Cualquier mtodo de recuentos de clulas incluye 3 fases:

1 Dilucin de la sangre.

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2 Muestreo de la sangre diluida en un volumen determinado.

3 Recuento de las clulas en ese volumen.

RECUENTOS ERITROCITARIOS

Para la realizacin del recuento manual necesitamos un lquido de dilucin, una cmara de recuento ohemocitmetros, una pipeta diluidora y un microscopio.

Lquido de dilucin: el ms empleado es el lquido de Hayem. Est compuesto de 5g de ClNa, 2'5g deSO4Na2, 2'5g de Cl2Mg y agua destilada cantidad suficiente para 1000ml

En general vale cualquier solucin isotnica con un conservante que no hemolice, aglutine o deforme a loshematies al menos durante un tiempo (isotnica misma concentracin que el suero sanguneo al menos en estecaso).

Adems lleva un fijador que conserva la forma del eritrocito

Las diluciones de la sangre para recuentos celulares y determinaciones de hemoglobina se pueden realizartanto por mtodos manuales como por mtodos semiautomticos (ms rpidos y fiables)

Los mtodos semiautomticos son instrumentos que aspiran la muestra y la mezcla con el diluyente.

Los mtodos manuales utilizan pipetas de dilucin o pipetas microcapilares o un sistema denominadoUnopette que son tubos microcapilares con un vial de plstico que contiene el diluyente.

Pipetas de dilucin: son pipetas de cristal que constan de un tubo capilar graduado dividido en 10 partes ymarcado con 0'5 en la 5 seal y con 1 en la 10 seguido de un ensanchamiento o ampolla que lleva una perlitaen su interior para facilitar la mezcla. Por encima de la ampolla lleva un capilar corto por donde se introduceel tubo aspirador y con una seal 101 en la pipeta de hematies y una seal 11 grabado en la pipeta de dilucinde los leucocitos.

La pipeta de recuento de los hematies es roja y la de blancos es blanca. La pipeta de rojos tiene una capacidadde 100 veces el volumen del capilar y la de los leucocitos 10 veces el volumen del capilar. En la pipeta deeritrocitos cuando la sangre es aspirada, hasta la seal de 0'5 y el lquido de aspiracin hasta la seal 101. Ladilucin resultante es de 1/200 de lquido de dilucin. Una vez que se llena la ampolla el capilar no contieneclulas ya que han sido arrastradas por el lquido de dilucin. Para observarlo en la cmara de recuento habrque vaciar su contenido antes.

En la pipeta para recuentos de leucocitos las marcas sobre el tubo capilar son las mismas que la de la pipeta deeritrocitos pero la ampolla es ms pequea con una seal de 11 grabada por encima de ella.

Cuando la sangre es aspirada hasta 0'5 y diluida hasta 11 la dilucin resultante es de 1/20

Cmaras de recuentos: el hemocitmetro o cmara de recuento es un grueso portaobjetos de cristal en cuyotercio medio estn fijadas 3 plataformas paralelas que se extiende a lo ancho de su superficie. La plataformacentral est subdividida por una ranura transversal en 2 mitades cada una ms ancha que las 2 laterales yseparadas de ellas y entre s por fosos. Las plataformas centrales o piezas de fondo estn exactamente 0'1mlms bajas que las plataformas laterales y tienen una regla de Neubaver mejorada de 3X3 ml y est subdivididaen 9 cuadrados secundarios de 1X1 mm (1mm2). Los 4 cuadrados de las esquinas denominados A, B, C y Dse utilizan para el recuento de leucocitos y estos estn a su vez subdivididos en 16 partes llamados terciarios.El cuadrado central est dividido en 25 cuadrados terciarios, cada uno de los cuales mide 0'2 X 0'2 mm

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(0'04mm2) y cada uno de estos se dividen en 16 cuadrados ms pequeos.

Un grueso cubreobjetos que forma un plano perfecto acompaa a la cmara de reactivos. Cuando el cubre estsituado sobre la plataforma de la cmara de recuento hay un espacio de 0'1 mm de altura entre este y laplataforma rayada. Por tanto cada mm2 forma la base que tiene un espacio que mide 0'1 m3.

Limpieza de las cmaras, cubres y pipetas: las cmaras y cubres deben lavarse, inmediatamente despus desu utilizacin, con agua destilada y se dejan secar al aire. Estas superficies no se deben tocar con gasas(trapos,...), puesto que se pueden rayar y confundir con una cuadrcula.

La cmara y el cubre no se deben tocar puesto que las huellas son difciles de sacar. Antes de su utilizacin lassuperficies deben estar limpias, secas y sin hilos y marcas de agua. No se deben tocar excepto por los bordes.

Las pipetas recin usadas se dejarn con la punta hacia abajo en un recipiente con agua y con una gasa en elfondo. De esta forma evitaremos que se resequen y deterioren las puntas. Para su limpieza definitiva se usaruna bomba de succin o un chorro de agua con una jeringuilla y se pasar 1 con agua del grifo, luego conagua destilada, despus etanol (alcohol) y finalmente ter. Por ltimo se hace pasar por el interior de laspipetas una corriente de aire hasta que estn secas, lo que se comprueba por la bolita que se mueve librementesin adherirse a las paredes. Si no se necesitan hasta el da siguiente se coloca con la punta hacia abajo en unrecipiente de boca ancha con una gasa en el fondo y se eleva la estufa a 37C.

TCNICA

Los hematies son clulas anucleadas que se observan como discos bicncavos de 6 a 8 micras de dimetro y 2micras de espesor.

Se puede utilizar sangre capilar o venosa. Si se emplea sangre venosa debe ser recogida sobre EDTA (tapavioleta) debe mezclarse bien con el anticoagulante invirtiendo el tubo varias veces antes de cargar la pipeta.

Echaremos una pequea cantidad de sangre en un vidrio de reloj y procederemos a cargar la pipeta hasta lamarca 0'5 con cuidado de que no aparezcan burbujas. Se va llenando la pipeta en posicin horizontal. Si nospasamos de la marca eliminamos el exceso de sangre golpeando suavemente la punta de la pipeta sobre untrapo limpio o papel... Es necesaria mucha exactitud en esta parte ya que un pequeo error lo multiplicaramospor 200.

Limpiamos la punta de la pipeta con un trapo y la introducimos en la disolucin de Hayem aspirando amedida que rotamos la pipeta para que se mezcle bien la sangre. Llenamos hasta la marca 0'1 no siendonecesario que este enrase sea tan exacto porque en este caso el error es mnimo. A continuacin colocamos elcubre. La adhesin de este a la cmara debe ser perfecta para ello aplicamos una suave presin con lospulgares deslizando este (cubre) hacia arriba y abajo sobre las plataformas laterales hasta que confirmemos suadhesin. Esta adhesin se comprueba por la aparicin de los anillos multicolores de Newton que debenpersistir cuando dejemos de ejercer la presin (esta maniobra se favorece si previamente se humedeceligeramente la plataforma).

A continuacin procedemos a cargar la cmara expulsando las 3 4 primeras gotas que ocupan el tubo capilarque no contiene clulas. Colocamos la pipeta en el borde del cubre controlando que forme unos 30 con lacmara. El lquido se desliza bajo el cubre atrado por capilaridad y debemos controlar esta entrada haciendopresin con la punta de la lengua sobre la boquilla o con el dedo sobre el extremo de la pipeta. Debemos tenercuidado de que el lquido penetre en el espacio debajo del cubre sin que rebose o forme burbujas, ya que elexceso de lquido tiende a elevar el cubre y obtendramos recuentos errneamente elevados.

Se dejar que las clulas sedimente unos minutos en la cmara y se llevar al microscopio. Si no vamos a

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contar enseguida las clulas se debe proteger el lquido contra la evaporacin colocando la cmara en unaplaca de petri con un papel de filtro humedecido en su interior.

Observamos con un objetivo de 10X para comprobar que las clulas estn distribuidas uniformemente sino esas se repetir el proceso.

Se cierra parcialmente el diafragma condensador del microscopio para hacer que los hematies resalten connitidez al utilizar las lentes de poco aumento. Se cuenta los eritrocitos que hay en 80 cuadrados pequeos conel objetivo de 40X. Para ello se coge un cuadrado mediado central y los cuatro de las esquinas.

De aquellos hematies que cabalgan en las lneas de los cuadrados contaremos los que toquen 2 lneas ydespreciaremos los que toquen los otros 2. As podemos contar los que toquen los otros 2. As podemos contarlas que toquen la lnea de arriba y la de la derecha y despreciaremos los de abajo y los de la derecha.

LAS CARACTERSTICAS DE UNA CMARA DE RECUENTOS BIEN CARGADA SON:

El lquido debe llenar completo o casi completo donde se encuentra el retculo..

No debe existir lquido en el foso.

No debe existir burbujas.

RECUENTOS DE LEUCOCITOS

Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas. Hacemos lo mismo que para loshematies pero empleando la pipeta de blancos, de modo que la solucin que obtenemos es de 1/20. Se utilizael lquidos de Turck. El lquido de Turck es hipotnico de modo que se destruyen los hematies y as noentorpecen en el recuento. El lquido de Turck consta de cido actico glaciar 2ml, violeta de gencianadisolucin de 1% 1ml y agua destilada en cantidad suficiente para 1000ml. Deber filtrarse a menudo paraevitar levaduras y hongos.

Clculos

En un principio es un poco difcil distinguir los leucocitos de los restos de membranas de los hematieshemolizados. Se debe tener en cuenta que los leucocitos son ms refringentes (ms brillantes) al moverlo conel microscopio que los restos de hematies. Se debe observar la presencia de la membrana citoplasmtica y dela membrana nuclear (a veces ms) como lneas finas y brillantes. Esto se observa fcilmente moviendo elmicroscopio hacia delante y hacia atrs.

RECUENTOS DE PLAQUETAS

Debe evitarse la aglomeracin de plaquetas mediante una correcta y rpida puncin venosa. El recuento puedehacerse con la pipeta de rojo o la de blancos cogiendo sangre hasta 0'5 y diluyendo hasta la marca 11 de 101con un lquido de disolucin llamado PlaquetCrom. Est compuesta por oxalato amnico al 1%. Este lquidoprovoca la hemlisis de los hematies y adems contiene un antiagregante plaquetario. Una vez cargada lapipeta la agitamos y esperamos unos minutos para que se hemolicen bien los hematies. Cargamos la cmara yla colocamos en una placa de petri con un papel humedecido para evitar la evaporacin del lquido. Ladejamos reposar 15 minutos para despus hacer el recuento. Este se hace de la misma manera que loshematies de modo que si usamos la pipeta de rojos multiplicaremos el nmero contado por 10.000 y si ha sidola de blancos por 1.000

MTODO DE FONIO PARA RECUENTOS DE PLAQUETAS

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Se coloca sobre el pulpejo del dedo previamente desinfectado una gota de disolucin de sulfato de magnesio(MgSO4) al 14% estril y a travs de ella hacemos una puncin dactilar a fin de obtener una rpida dilucinde la sangre y evitar la autoaglutinacin de las plaquetas. Se procede a hacer una extensin y se tie como unafrmula normal pero manteniendo el colorante GIEMSA durante ms tiempo. Se lleva al microscopio y seobserva con el objetivo de inmersin.

Se cuenta el nmero de plaquetas que hay por cada 1000 hematies. Para ello contamos el nmero de hematiesque hay en un campo en el cual deben estar distribuidos homogneamente. Calculamos el nmero de camposque tenemos que ver para que 1000 hematies. Contamos en ese nmero de campos las plaquetas que sepresentarn como pequeos corpsculos de 2 a 4 micras teidas de color azul y algunas granulacionesprpuras. Despus sabiendo el nmero de hematies por mm3 podremos calcular fcilmente el nmero deplaquetas por mm3 (1000/Xhematies = al nmero de campos que tenga que mirar)

RECUENTOS DE RETICULOCITOS

Los reticulocitos o eritrocitos inmaduros existen en la sangre del individuo en proporcin de 510 % por cada1000 hematies en condiciones normales. Debido a que aunque permanecen etc. la mdula de 2 a 3 dasterminan su maduracin en la sangre perifrica en 24horas aproximadamente (por eso deben observarse dentrode las 6 primeras horas despus de la extraccin porque maduran un vitro) Su tamao es el de los demshematies pero se caracterizan por contener una pequea cantidad d ARN formando un retculogranulofilamentoso observable al ser teido. La cantidad de ARN es tanto menor cuanto ms madura es laclula.

EL MATERIAL

Tubo de hemlisis, porta, porta esmerilado, pipetas pasteur, microscopio, aceite de cedro, solucin colorantede azul cresil brillante (frmula: 1gr de cloruro de sodio al 0'85% cantidad suficiente para 100ml), sangreentera anticoagulada o capilar.

TCNICA

En un tubo de hemlisis se mezclan 3 gotas de sangre bien homogeneizada con 3 gotas de colorante, Mezclarsuavemente, dejar reposar 15 minutos de modo que el colorante tia los reticulocitos. Pasados los 15 minutosse homogeneiza y con la pipeta Pasteur se pone una gota en el porta y se realiza una extensin con el portaesmerilado.

NOTA: EXTENSIN: se pone una gota a 1cm del borde derecho del porta. En el extremo opuesto se sujetacon el ndice y pulgar de la mano izquierda. Con la derecha se toma el esmerilado sujetndolo desde arribacon el ndice y pulgar. Se apoya por delante de la gota a 45 de inclinacin. Se hace retroceder de modo que elborde coincida con la gota que se extiende por capilaridad por este. Antes de que llegue a los extremos sedesliza hacia delante con movimiento firme y rpido por el de la mesa. El movimiento de desplazamientotermina elevando el de la derecha antes de llegar al final. Se debe secar rpidamente por agitacin al aire demodo que no se distorsionen las clulas.

Miramos con objetivo de 100X se busca una zona en la extensin en el que el nmero de eritrocito por camposea de aproximadamente de 100 y se cuentan los reticulocitos que hay cada 1000 hematies. Para mayorexactitud se harn 2 extensiones. Los eritrocitos y reticulocitos aparecern con un color verdoso y el retculode ARN de azul oscuro se expresa en % %o de eritrocitos. Los valores son:

~ En recin nacidos (sangre del cordn): 26%

~ En adultos y nios: 0'22%

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RECUENTO ELECTRNICO DE CLULAS

La mayora de los mtodos utilizados actualmente para el recuento de clula sanguneas, estn basadas en unode los principios siguientes:

1 Un rayo de luz atraviesa una corriente de clulas y estas ocasionan reflexionan en el rayo que se conviertenen impulsos elctricos mediante un tubo que se llama fotomultiplicados.

2 Las clulas que pasan a travs de una abertura provocan cambios en una resistencia elctrica que quedanregistrados como impulsos elctricos.

RECUENTOS CON LUZ DISPERSA: un haz de luz de tipo monofocal es condensado por donde fluye lasangre diluida. Si no hay ninguna partcula la luz va a parar a una pantalla redonda o disco (D) que la retiene.

Si este haz condensado encuentra una partcula entonces se refleja la luz que ir a parar a un tipofotomultiplicador fotodetector que lo convierte en impulso elctrico.

Cuando para la sangre diluida los glbulos entran de uno en uno e irn dando seales al tubo fotomultiplicadorque sern posteriormente contadas (las seales). El tubo por el que atraviesan las clulas son de cristal.

En el caso de recuento de hematies el diluyente ser una dilucin isotpica para evitar la lisis de estos. En elcaso de los leucocitos el diluyente llevar un agente hemoltico como por ejemplo la saponina.

RECUENTOS BASADOS EN LA RESISTENCIA ELCTRICA: se funda en que las clulas van atravesaruna abertura o orificio por la cual est pasando una corriente elctrica de modo que provocan cambios en laresistencia elctrica de modo que provocan cambios en la resistencia elctrica que se registra como impulsoselctricos. La sangre se diluye en una disolucin isotnica conductora de la electricidad. El cilindro de cristallleva un lquido conductor. Tambin tiene un electrodo en su interior que es el E2 y en su pared un orificio detamao adecuado para permitir la entrada de las clulas. En el recipiente que contiene la dilucin celular(sangre diluida) hay otro electrodo que es el E1.

El cilindro est conectado a un tubo en forma de U parcialmente lleno de mercurio y que tiene 2 contactoselctricos.

El cilindro est sumergido en la suspensin de clulas que van a ser contadas y se lleva con la disolucinconductora (una bomba de vaco hace llegar el mercurio hasta la parte superior del tubo). Y la suspensin declulas fluye a travs del orificio hacia el interior del cilindro es menor que en le exterior.

Se cuentan los impulsos elctricos que son proporcionales al volumen de las clulas. Se empieza el recuentocuando el mercurio establece contacto con CE1 y se detiene cuando toca CE2 contndose un volumen desuspensin de clula igual al volumen que hay entre CE1 y CE2.

NORMAS GENERALES DEL MANEJO DEL APARATO DE REACCIN AUTOMTICO

Lo general es seguida los consejos del fabricante. Sin embargo hay una serie de acciones que son comunes ala mayor parte de los aparatos.

1 Al comenzar a hacer los recuentos conectar el aparato a la red y esperar el tiempo necesario para que secaliente.

2 Se limpian los circuitos por donde va a fluir la sangre y lquidos fluyentes con detergentes que nos va aproporcionar el fabricante.

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3 Una vez limpio lo circuito se debe calibrar el aparato con las suspensiones patrn

4 Comenzar el recuento

5 Una vez concluido el recuento el aparato debe quedar en conclusiones ptimas de reposo hasta el dasiguiente; por lo tanto se debern lavar los circuitos con el detergente y dejar el aparato segn las normasrecomendables por el fabricante.

LOS SISTEMAS DE RECUENTO SDR

No diferencian entre eritroblasto, hematies anucleados y leucocitos por lo que si mediante la observacin delfrotis se observa una presencia de eritroblastos mayor al 10% se debe hacer una correccin en el recuento deleucocitos.

Leucocitos reales =

CAUSAS DE ERROR EN LOS RECUENTOS ELCTRICOS

Al igual en el recuento con la cmara cuentaglbulos el empleo de mtodos electrnicos puede versesometido a varios errores, sobre todo si se olvida el control peridico y el calibrado diario de los elementos. Elerror debido al propio mtodo suele ser menor al 1% pero puede verse notablemente incrementado por lassiguientes causas:

1 Uso del diluyente incorrecto

2 Presencia de partculas extraas en el lquido diluyentes

3 Lisis incompleta de hemlisis en el recuento leucocitario

4 Obstruccin de capilares u orificio de recuento

5 Contaminacin de arrastre de una muestra a la siguiente

6 Dilucin incorrecta

7 Averas en los componentes elctricos de los aparatos

8 Mala agitacin de la muestra

Hoy en da hay aparatos electrnicos que hacen la diferenciacin de 5 poblaciones celulares de modo quedistinguen linfocito de monocitos y dentro de los basfilos, neutrfilos y eosinfilos. Estos aparatos se fundanen la utilizacin de tinciones citoqumicas. Adems dan alarma cuando hay clulas anormales, inmaduras.

VALORES NORMALES DE LAS CLULAS SANGUNEAS

Los hematies tienen los siguiente parmetros:

En nios de 1 ao estn entre 4'5 + 1'5 106 hem/mm3

En nios de 2 aos estn entre 4'5 + 2 106 hem/mm3

En los hombres estn entre 5'4 + 1'5 106 hem/mm3 (4'55)

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En las mujeres estn entre 4'8 + 1'2 106 hem/mm3 (44'5)

En el recin nacido las cifras son ms altas prximas a los 6.106 para descender a los pocos das a los valoresnormales.

Estas cifras son constantes no ofreciendo variaciones por causas de ejercicio fsico, la noche, etc. Sin embargopuede haber ms espesamiento de la sangre, o grandes sudaciones o prdidas de lquido (deshidrataciones)

Los hematies aumentan en personas que viven en lugares altos.

Durante el embarazo disminuye por hemodilucin (dilucin de la sangre).

Los leucocitos tienen los siguientes parmetros:

En nios de 1 ao estn entre 10 + 2'5 103 hem/mm3

En nios de 2 aos estn entre 8 + 1'5 103 hem/mm3

En hombres estn entre 7'4 + 3'5 103 hem/mm3

En mujeres estn entre 7'2 + 3'5 103 hem/mm3

Las cantidades normales son entre 5 103 y 10 103. Estas cantidades son de amplia variacin y las cifrashalladas en un mismo individuo con pocas horas de diferencia puede variar en estados normales en hasta en2.000/mm3; por la maana existen unos pocos menos que por la noche.

Existen ciertos leucocitosis (ms de 10.000/mm3) fisiolgicas creadas por el ejercicio muscular, la digestinla influencia del calor o del fro, las emociones extensas, embarazo, e incluso por cambios posturales.

Al nacer el nmero de leucocitos es muy elevado y al as 24 horas alcanza incluso las 20.000/mm3. En laprimera semana desciende hasta 8.000 a 10.000 permaneciendo en estas cifras y descendiendo paulatinamentehasta la pubertad donde alcanzan las cifras normales; adems la cifra de leucocitos en la primera infancia sonmuy variables individualmente pudiendo encontrarse cifras de hasta 16.000 /mm3 que no se consideranpatolgicas.

Los lmites correctos de las plaquetas son entre 100.000 400.000 plaq/ mm3.

Las cifras normales dependen en gran medida de los mtodos empleados en su recuento. Adems en elsupuesto sano ya existen normalmente variaciones individuales y espontneas.

VARIACIONES EN EL RECUENTO DE LAS CLULAS SANGUNEAS.

Terminologa:

ANEMIA: es la disminucin de la cantidad de hemoglobina acompaada la mayora de las veces dedisminucin de la cantidad de hematies. Puede obedecer a una prdida por hemorragia, a hemlisis o a unafalta de su formacin en la mdula sea (insuficiencia medular).

POLICITEMIA: aumento del nmero de hematies. Puede ser relativa o permanente (policitemia severa).

LEUCOCITOSIS: es el aumento del nmero de leucocitos por encima de 10.000/mm3. Se presenta en muchasenfermedades infecciosas en procesos inflamatorios, agudos y crnicas y alcanza los valores mximos en las

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leucemias en las que se pueden sobrepasar los 100.000mm3 (cuando se utilizan sistemas automticos derecuentos las muestras de sangre con gran nmero de leucocitos pueden contaminar la siguiente produciendocifras falsamente elevados).

LEUCOPENIA: disminucin de la cantidad de leucocitos por debajo de los 5.000/mm3. Se presentan algntipo de infecciones. Por ejemplo: fiebres tifoideas, sarampin, brucelosis y algunas enfermedades hemticas.

TROMBOPENIA: disminuye la cantidad de plaquetas por debajo de las 100.000/mm3. Se presentan porejemplo: por las prpuras T (manchas rojas de la piel).

TROMBOCITOSIS: aumento de las plaquetas por encima de 400.000.

TEMA VI

HEMATCRITO

La sangre est formada por una parte corpuscular (clulas sanguneas) y una parte lquida (plasma). De laparte corpuscular aproximadamente el 90% corresponde a glbulos rojos.

Si la sangre se hace in coagulable (por EDTA en proporcin 19) y se centrfuga; se obtiene la separacin dela parte corpuscular y la plasmtica. La primera en la que se observa hemates, leucocitos y plaquetas es la quetiene mayor densidad por lo que quedar en el fondo del tubo, en cambio el plasma corresponder a la parteflotante

El hematocrito de una muestra de sangre es la relacin del volumen de eritrocitos con el de sangre total. Seexpresa como un porcentaje P/V o preferiblemente en una fraccin decimal en las que las unidades L/L (sonlongitudes) estn implcitas.

La heparina seca, el oxalato equilibrado o el EDTA resultan satisfactorios como anticoagulantes.

El hematocrito venoso coincide estrechamente con el obtenido con la puncin cutnea (yema del dedo).Ambos son mayores que es hematocrito corporal total.

El hematocrito se puede medir directamente (por centrifugacin con macromtodos o micromtodos) o deforma indirecta (como el producto de CVM volumen corpuscular medio por el recuento de hemates enaparatos automticos). Analizando la sombra que produce la poblacin eritrocitaria al reflejarse en un campooscuro.

MACROMTODO DE WINTROBE

Consiste en un tubo de cristal graduado al que se centrfuga para separar las dos fases

COMO SE HACE LA LECTURA

La lectura se realiza midiendo la columna de eritrocito por ml (L1) y la altura de la muestra total de sangre(L2).

Valor hematocrito = L1/L2.

Por encima de la capa de glbulos rojos aparece una capa blanco griscea que corresponde a leucocitos yplaquetas y que no se debe incluir en L1.

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En esta tcnica el tiempo de centrifugacin es alto. Requiere una cantidad relativamente elevada de sangre (5ml) y adems los tubos que se utilizan no son desechables por lo que se ha abandonado a favor delmicromatocrito y sobre todo de los mtodos automticos.

MTODO MICROMATOCRITO

Tiene 2 ventajas: la primera es que se utiliza poca cantidad de sangre y la segunda es que se pueden hacer ungran nmero de pruebas a la vez y en poco tiempo.

EQUIPO

Se usa un tubo de hematocrito capilar de 7cm de longitud con un orificio uniforme de alrededor de 1mm.Estos tubos pueden estar:

Heparinizados: sirve para tomar sangre capilar directamente.

No heparinizados: sirve para tomar sangre venosa anticoagulada con EDTA.

Se debe disponer de centrfugas especiales que producen campos centrfugos que oscila entre 10.000 y 13.000Ges.

MTODO

El tubo de hematocrito se llena por atraccin capilar a partir del punto de puncin o de una sangre venosa bienmezclada. Los tubos capilares deben llenarse al menos 5 cm. El extremo vaco se sella con plstico moldeable(plastilina). Los tubos ya llenos se colocan en los canales o servos radiales del aparato de centrifugacin conel extremo cerrado dirigido hacia fuera.

Se coloca el fondo del tubo contra el relleno de goma para evitar rupturas. La centrifugacin durante 5minutos a 10.000 a 12.000 Ges (11.000 RPM) es satisfactoria. A menos que el hematocrito exceda del 50% eneste caso se centrfuga 5 minutos adicionales con objeto de asegurar que se a reducido al mnimos la cantidaddel plasma atrapado.

Los tubos capilares no estn grabados. La longitud de toda la columna y de la columna de eritrocito se debemedir con una regla milimetrada y una lupa o con un lector de hematocrito.

Para usar el lector de hematocrito se debe colocar el extremo inferior de la columna de sangre en la lneacorrespondiente al 0 y el superior al correspondiente al 100. En todo caso seguir las instrucciones delfabricante.

La determinacin del hematocrito debe utilizarse por duplicado y la diferencia entre los 2 valores no debe sersuperior a 0'01.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

El hematocrito normal para valores adultos es de 0'41 a 0'51 y par mujeres 0'36 a 0'45. Un valor por debajo delo normal en un individuo indica anemia y un valor ms alto policitemia. El valor del hematocrito es bajo enla hidriemia del embarazo (proporcin desusada de suero en sangre en relacin a los corpsculos sinincremento de la masa total de sangre).

El hematocrito puede ser normal o incluso elevado en el shock acompaado por hemoconcentraccin debido ala prdida de sangre aunque la masa total de eritrocitos puede estar considerablemen