I n s t i t u t o P o l i t é c n i c o N a c i o n a l

E s c u e l a N a c i o n a l D e C i e n c i a s B i o l ó g i c a s

Q u í m i c o Fa r m a c é u t i c o I n d u s t r i a l

Lab. De Métodos de Separación e Instrumentación Analítica

Castillo Plata Alejandra Ivonne

Castro Loa Fernando Adrian

6FM1 - QFI

H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d

C h r o m a t o g r a p h y .

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Es un método de separación analítica, que se lleva a cabo gracias a la afinidad que tiene un compuesto (analíto), por una fase fija o estacionaria, o por una fase móvil.

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución, Eficiencia, o Rendimiento.

Fenómenos por los cuales ocurre una separación en HPLC. 1. Adsorción. Fenómeno de superficie que ocurre por la interacción

física o química de un adsorbente de un adsorbato.

2. Partición. Es el fenómeno de reparto de un soluto en 2 fases distintas.

3. Intercambio Iónico. Es un fenómeno generado por la interacción electrostática entre moléculas cargadas eléctricamente.

4. Exclusión. Es un fenómeno físico que consiste más que nada en separar moléculas en base a su tamaño molecular.

5. Afinidad. Se combina la alta especificidad de ciertas moléculas por un sustrato, tales como Ab, Enzimas, Receptores, etc.

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Cromatografía por Partición 1. Fase Estacionaria [FE]. Su naturaleza química debe ser no polar. La fase estacionaria a base de Sílice (SiO2)

debe estar recubierta con C6, C8, C12, C18 , y además puede tener un segundo recubrimiento con grupos Fenilo, Ciano, u otros que hacen a la FE más resistente a solventes polares como H2O, Metanol, etc. (Fase enlazada).

2. Fase Móvil [FM]. Su naturaleza química debe ser polar o más polar que la FE, los disolventes pueden ser H2O,

Metanol, Etanol, etc.

3. Analíto. Debe ser no polar o no tan polar como la FM para poder ser retenido por la FE.

O I O-Si O l O

R I - Si - C18

l R’

O \ O - Si O / O

R I - Si - C18

l R’

\ O - Si O - Y / O

Silación con C18 Fase Enlazada

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Instrumentación 1. Reservorio. Contiene a la Fase Móvil.

2. Bomba. Impulsa a la Fase Móvil dentro del sistema de elución de HPLC.

3. Inyector (Automuestrador o Manual). Permite introducir la muestra al sistema.

4. Columna (Precolumna, Guardacolumna y Horno). Sistema de análisis.

5. Detector. Es un transductor que tiene como función el registro del paso de componentes de una muestra en el orden en el que eluyen.

6. Colector de Fracciones. Sirve para recibir o contener por separado los componentes que ya eluyeron por si se requiere un análisis posterior de alguno de ellos.

7. Computador. Sistema de almacenamiento.

Columna Microboro o “Brownlee microbore”

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1) Consideraciones del Reservorio • Frasco cerrado de vidrio o de algún polímero resistente al

disolvente con paredes homogéneas.

• Contiene un filtro de metal poroso que ayuda a retener partículas de tamaño mayor a 10μm.

• Previo al bombeo del disolvente hacia el sistema de HPLC, se realiza un tratamiento por desgasificación por ultrasonicación o un burbujeo con un gas inerte (He excelencia).

Consideraciones del Disolvente • El disolvente debe ser de alta pureza (grado HPLC). • Disolver el analíto. • Tener baja viscosidad. • No debe reaccionar con el empaque de la columna. • Debe ser volátil. • Polaridad adecuada para el tipo de análisis que se lleve a cabo.

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2) Bombas • Impulsan a la FM hacia el sistema de HPLC.

• Generan presiones de hasta 6000 psi (lb/in2).

• Tienen flujo libre de pulsaciones, evitando así la variación de presión dentro del sistema.

• Tienen intervalos caudal de 0.1 a 10 ml/min.

Tipos de bombas • Binarias: Impulsan un solo disolvente hacia el sistema.

• Secundarias: Impulsan 2 disolventes hacia el sistema.

• Terciarias: Impulsan 3 disolventes hacia el sistema.

• Secundarias: Impulsan 4 disolventes hacia el sistema.

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Elución Isocrática Se mantiene la misma proporción de disolventes durante todo el proceso. Elución en gradiente La proporción de la mezcla de disolventes cambia en algún punto del proceso. Este tipo de elución se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de componentes con polaridad diferente.

UMA

t(min) 10 40

70% H2O 30% MetOH

UMA

t(min) 10

70% H2O 30% MetOH

80% H2O 20% MetOH

5 min

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Método Isocrático Método en Gradiente

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3) Inyector • Permite introducir la muestra al sistema de HPLC para su análisis sin despresurizar el sistema y sin interrumpir

el caudal.

• La muestra se introduce en el “Loop”, el cual se encarga de introducir la muestra al sistema.

• Tiene una posición de carga y otra de inyección.

Septum Microjeringas de Inyección Sistema de Inyección

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3) Columnas y Precolumnas • Es el medio donde se lleva a cabo la separación y es el contenedor de la

FE.

• Las precolumnas deben contener la misma FE que el empaque de la columna, este evita el posible ingreso de partículas contaminantes y en general prolonga la vida media de la columna.

Tipos de columnas

Columna de vidrio

Precolumnas

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Características de las columnas • Diámetro interno 3.9 - 4.6 mm • Longitud de 10, 15, 25, 30 cm • Tamaño de partícula de 3.5, 5, 10 μm

Variación de Longitud (Same Particle Size)

Variación del tamaño de partícula (Same Lenght)

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3) Detector UV/VIS • Se encarga de transducir la energía emitida de un

compuesto.

• Funciona únicamente para compuestos que absorban en UV/VIS.

• Puede utilizarse en gradiente de elución.

• Es altamente selectivo sobre compuestos que posean dobles enlaces.

Regiones de absorción de luz

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t(min)

tr1

tr2

t0

Cima del pico

Inicio de Pico

Fin del pico

ABC

w1 w2

Tiempo muerto Tiempo trascurrido

desde que se introduce la muestra hasta la aparición de un pico no retenido

Tiempo de retención Tiempo trascurrido

desde que se introduce la muestra hasta la aparición de

un pico retenido

Tiempo relativo de retención

Es la diferencia del tr de un compuesto y t0

Partes principales de un cromatograma.

UM

A