P a g | 1 FROTIUL DE SÂNGE

METODA ETALĂRII MATERIALULUI BIOLOGIC ÎN MONOSTRAT

1. Obiective ........................................................................................................................................... 2 2. Tehnica efectuării frotiului de sânge ................................................................................................ 2

2.1. Prelevarea sângelui prin puncție capilară .................................................................................. 3 2.2. Etalarea – efectuarea frotiului propriu-zis ................................................................................. 3 2.3. Fixarea frotiului ......................................................................................................................... 7

3. Colorarea frotiului de sânge ............................................................................................................. 7 3.1. Colorația Leihsman .................................................................................................................... 7 3.2. Colorația May Grunwald Giemsa .............................................................................................. 7 3.3. Protocoale de lucru .................................................................................................................... 8

3.3.1. Metoda Leihsman ............................................................................................................... 8 3.3.2. Metoda May-Grunwald Giemsa ......................................................................................... 9

4. Examinarea frotiului de sânge ........................................................................................................ 11 5. Variaţii fiziologice ale numărului elementelor sângelui periferic .................................................. 11

5.1. Hemoleucograma ..................................................................................................................... 11 6. Hematopoieza ................................................................................................................................. 12 7. Morfologia elementelor figurate din sângele periferic ................................................................... 12

7.1. Eritrocitul ................................................................................................................................. 12 7.1.1. Morfologia eritrocitului .................................................................................................... 13 7.1.2. Anomaliile de formă ale eritrocitelor ............................................................................... 13 7.1.3. Morfologia leucocitelor .................................................................................................... 16 7.1.4. Morfologia trombocitelor (plachete sangvine) ................................................................. 17

P a g | 2 FROTIUL DE SÂNGE

METODA ETALĂRII MATERIALULUI BIOLOGIC ÎN MONOSTRAT

Această metodă cuprinde tehnica frotiului şi amprentelor de organe. Prin tehnica frotiului, se

realizează întinderea celulelor în monostrat pe lame de sticlă, putând fi examinate celulele sanguine (periferice şi medulare) celulele epiteliale descuamate sau exfoliate (din piele, cavitate bucală, faringe, căi respiratorii extra şi intrapulmonare, vagin, col uterin, endometru, căi galactofore, lichid cefalo-rahidian, lichid pleural, lichid de ascită), amprente de organe.

Metoda este mult utilizată în citologie, devenind prioritară atât în domeniul cercetării biologice cât şi ca procedeu de diagnostic în practica medicală.

1. Obiective - definirea optimă a substratului recoltat pentru efectuarea unui frotiu (în speță un frotiu de sânge

periferic); - deprinderea tehnicii corecte de efectuare a unui frotiu de sânge; - evaluarea calităților unui frotiu acceptabil într-un laborator clinic; - definirea principiilor de colorare la nivelul frotiului de sânge cu referire specială la afinitatea

coloranților pentru diferitele componente și tipuri celulare; - colorarea frotiului printr-o tehnică de tip Romanowsky - evaluarea elementelor celulare pe frotiul de sânge, numărătoarea elementelor figurate, date de

morfologie a acestora.

2. Tehnica efectuării frotiului de sânge Etapele realizării și colorării frotiului de sânge presupun o ordine similară cu celelalte tehnici

prezentate (secțiunile fine la gheață sau parafină) dar cu anumite particularități. Deoarece sângele este un țesut fluid, etapa de recoltare este urmată imediat de cea de etalare pe lamă, urmând apoi fixarea și colorarea. În cazul frotiului de sânge nu se pune problema includerii sau secționării, implicit numărul de etape fiind mai redus. După etapa de colorare este posibilă reluarea etapelor de postcolorare pentru montare în mediu anhidru, dar aceasta este o opțiune rar apelată.

Executarea unui frotiu de sânge constituie o tehnică de bază a microscopiei clinice, căci după principiile executării sale se execută şi frotiurile de măduvă osoasă, suc gastric, sedimente de lichide seroase etc. Sângele din care se poate efectua frotiul se poate proveni din recoltatul venos pe anticoagulant sau din recoltatul capilar, obținut prin puncție directă, fără să necesite anticoagulant. Cele mai bune rezultate sunt obținute dacă frotiul este etalat la maxim 2 ore de la recoltare (în cazul recoltării în tub pe anticoagulant). Sângele astfel recoltat poate fi stocat pe termen scurt (sub 8 ore la 4°C). Înainte de folosire, tubul trebuie rotit cu 180° de cel puțin 10 ori.

Lamele folosite, murdare, pot fi refolosite pentru efectuarea

frotiurilor (deși nu este o metodă recomandată). Curățarea acestor lame se face prin imersie în soluție de detergent la 60°C pentru 15-20 min și spălare în apă fierbinte, înainte de uscare.

Pentru lamele noi, nefolosite, este necesară imersia în dicromat de potasiu (20 g Cr2K2O7 în 100 ml apă cu 900 ml H2SO4) timp de 48 de ore. După această perioadă, lamele se spală cu apă curentă

Lamele sunt păstrate în metanol 95% iar înainte de utilizare trebuie bine șterse și uscate.

P a g | 3 2.1. Prelevarea sângelui prin puncție capilară Se realizează la adult prin puncţionarea părţii laterale a pulpei degetului inelar sau medius, iar la nou

născut şi sugar din lobul urechii, partea laterală a halucelui sau din călcâi. Locul puncţionării se dezinfectează şi se degresează cu ajutorul unui tampon îmbibat în alcool sau eter. Se prinde degetul subiectului cu mâna stângă, fixându-l între index şi police şi printr-o mişcare rapidă se puncţionează locul dezinfectat cu un ac pentru injecţii subcutanate, sterilizat. Primele două picături se şterg cu ajutorul unei comprese uscate deoarece conţin prea mult lichid interstiţial sau impurităţi de pe piele.

2.2. Etalarea – efectuarea frotiului propriu-zis Constă în întinderea pe o lamă portobiect curată a unei picături de sânge într-un strat subţire şi

uniform. Dacă recoltarea s-a realizat prin puncție capilară, picătura de sânge care apare pe pulpa degetului se

preia cu marginea mică (sau mare) a unei lame şlefuite. Se preferă însă absorbția picăturii cu tuburi capilare de plastic.

Dacă sângele provine din tuburi cu recoltat venos pe anticoagulant, preluarea acestuia se face cu pipete de unică folosință de plastic, cu tuburi capilare de preferat de plastic și nu de sticlă (risc de rupere/spargere). Tuburile nu trebuie să fie heparinate.

Un dispozitiv interesant pentru realizarea picăturii de sânge preluate din tubul de recoltare a sângelui venos este DIFF-SAFE.

Acest dispozitiv elimină formarea de micropicături de sânge (aerosoli) în timpul efectuării frotiului,

iar tubul de recoltare nu trebuie deschis. De asemenea, elimină necesitatea utilizării de pipete și poate regla volumul picăturii de sânge aplicate. Tehnica de utilizare este prezentată mai jos.

Dispozitivul DIFF-SAFE se aplică prin puncționarea dopului cauciucat al tubului de

recoltare Tubul se ține cu dopul în sus, nu în jos

Se aplică tubul cu DIFF-SAFE pe lamă și se apasă. În funcție de presiunea exercitată, se

obțin picături mai mici sau mai mari

Nu uitați! Toate manevrele referitoare la frotiul de sânge se efectuează cu mănuși.

P a g | 4 Picătura de sânge trebuie să aibă circa 30 μl pentru a realiza un frotiu de o grosime potrivită și cu o

lungime de 2,5-4 cm. Picătura trebuie amplasată cam la 1 cm de capătul destinat marcării scriptice sau la circa 2 cm de

marginea unei lame simple, fără spațiu de marcaj scriptic.

Se preia lama de întindere între police și index. Cu cealaltă mână se înclină ușor lama suport, cu picătura de sânge depusă.

Se aplică lama de întindere, cu marginea lungă pe lame suport, în vecinătatea picăturii, dar dincolo de aceasta, înspre capătul liber al lamei suport.

P a g | 5 În momentul contactului cu lama suport, lama de întindere, înclinată la circa 30-45 grade, este

deplasată spre capătul unde este depusă picătura. Astfel, marginea lamei de întindere intră în contact cu picătura de sânge iar aceasta se va întinde pe lungimea zonei de contact dintre lame.

Lama de întindere este apoi împinsă spre capătul liber al lamei suport, realizând frotiul.

Etalarea se poate face și cu marginea scurtă a lamei de întindere, dar tehnica este mai dificilă. Frotiul este bine executat dacă are: - două margini laterale şi un capăt spre zona liberă a lamei suport, care se termină în franjuri; - o grosime potrivită: elementele figurate să nu fie suprapuse şi totodată suficient de dese. Grosimea frotiului de sânge depinde de:

- mărimea picăturii de sânge (picătură mică = frotiu scurt/subțire; picătură mare = frotiu lung/gros); - unghiul dintre lama de întindere şi lama suport (unghi mic = frotiu lung/subţire);

P a g | 6 viteza de întindere (viteză mare – frotiu scurt).

P a g | 7 2.3. Fixarea frotiului

Se poate face prin: - uscare – sau desicare la temperatura laboratorului prin agitarea lamei pentru a obţine o uscare rapidă;

uscarea lentă duce la ratatinarea celulelor; - soluţii fixatoare – frotiu umed; alcoolul etilic absolut timp de 15 min., alcool etilic absolut şi eter în

părţi egale timp de 5-15 min., alcool metilic timp de 2 min. sau prin vapori de OsO4 (soluţie 2%). După fixare se execută colorarea preparatului.

3. Colorarea frotiului de sânge Prima tehnică de colorare a frotiului de sânge a fost brevetată de Paul Ehrlich în 1879. Erlich a

propus un amestec de coloranți acizi și bazici pentru această tehnică: fucsină (colorant acid) și albastru metil (colorant bazic). În 1891, Ernst Malachowski și Dmitry Leonidovich Romanowsky au dezvoltat tehnici de colorare independente, folosind un amestec de eozină Y și albastru de metil modificat, obţinând o nuanţă distinctivă purpurie. William Boog Leishman și James Homer Wright au introdus metanolul ca fixator util înainte de etapa de colorare. Gustav Giemsa a ameliorat tehnica prin standardizarea soluțiilor de colorare și prin adăugarea glicerolului pentru a ameliora stabilitatea soluțiilor.

Numele de colorație Romanowsky reprezintă orice combinație de coloranți care include eozina Y sau eozina B alături de albastrul de metil și oricare dintre produșii săi de oxidare (oxidarea albastrului de metil produce un amestec de Azur A, Azur B, violet de metil). Combinațiile de coloranți de tip Romanowsky determină colorarea nucleilor leucocitelor sau a granulaţiilor neutrofilelor în violet în timp ce proteinele citoplasmatice sunt colorate în nuanțe de roz. Mai exact toate componentele bazice din celulă (hemoglobină, incluziuni, unele granulații) se cuplează la regiunea acidă a colorantului eozină, fiind astfel denumite „structuri eozinofile”; structurile eozinofile sunt colorate în nuanțe de roz până la roșu. Componentele acide ale celulelor (acizi nucleici, granulații cu conținut acid în neutrofile, citoplasmă reactivă) cuplează componenta bazică a coloranților (implicit albastrul de metil sau derivații săi de oxidare menționați mai sus) colorându-se în nuanțe de albastru sau violet.

pH-ul trebuie atent controlat în timpul etapelor de colorare, la un nivel de 6,4-7,2. Dacă pH-ul este prea acid, colorația va suferi o nuanțare accentuată spre roz iar nucleii vor fi slab colorați. Dacă pH-ul este prea bazic, nucleii și structurile bazofile se vor colora albastru foarte închis, cu o structură slab definită.

Colorația Wright (descrisă de James Homer Wright, în 1902) este o variantă de colorație Romanowky, utilizată pentru colorarea frotiului de sânge.

3.1. Colorația Leihsman În unele laboratoare se folosește o variantă rapidă de colorare a frotiului bazată pe colorația Wright,

numită uneori colorație Leishman. Se folosește un kit hematologic de colorare format din: - metanol – pentru fixarea frotiului; - eozină – colorant acid – va determina colorarea structurilor bazice din citoplasmă (hemoglobină,

granulații eozinofile), în nuanțe de roz-roșu; - albastru de metil – colorant bazic - va determina colorarea structurilor acide din celule (acizi nucleici,

granulații bazofile), în nuanțe de albastru-violet. Soluțiile sunt de obicei condiționate în urocultoare și lamele cu frotiul efectuat sunt scufundate repetat

în acestea. Tehnica este detaliată mai jos, în cadrul protocolului de lucru.

3.2. Colorația May Grunwald Giemsa Colorația dublă cu soluţie May-Grunwald-Giemsa combină efectul eozinei acide alături de cel al

albastrului de metil bazic din compoziția colorantului May-Grunwald cu efectul azurului din colorantul Giemsa (reamintim că azurii reprezintă compuși de ai demetilării albastrului de metil).

Compoziţia coloranților utilizați: - soluţia May-Grunwald conține:

o Methanol 99 % o (Eozină + albastru de metil) 0,2 % (cu Eozină G, albastru de metil)

- Soluția Giemsa conține: o Metanol 73 % o Glicerol 26 % o (Azur + Eozină + Albastru de metil) 0,6 % (cu Azur I, Eozină G, Albastru de metil)

P a g | 8 Materiale necesare

- Soluția May-Grunwald, concentrată. Unii autori susțin prepararea extemporanee și a soluției May-Grunwald diluate, care acționează ca și colorant. Se preferă însă diluarea soluției concentrate direct pe lamă, deoarece altfel se poate afecta gradul de colorare a unor granulații intracelulare.

- Soluția Giemsa, concentrată. Pentru utilizarea ca și colorant, se va realiza o diluție 5% (pentru 1 ml soluție de lucru – 50 μl soluție Giemsa + 950 μl apă tamponată (pH=7)

- apă distilată neutră; pipete Pasteur, pipete gradate; pH-ul apei distilate trebuie să fie 6,8-7,2. Apa distilată este de obicei acidă. Neutralizarea ei se obţine

adăugând câteva picături dintr-o soluţie alcalină de hidroxid de sodiu, încercându-se pH-ul cu un indicator universal de hârtie sau de preferat cu un pH-metru digital;

3.3. Protocoale de lucru

3.3.1. Metoda Leihsman 1. Recoltarea și etalarea frotiului de sânge, așa cum s-a prezentat anterior 2. Uscare (fixare temporară) prin agitare în aer la temperatura laboratorului. Nu se suflă asupra

frotiului. 3. Fixarea chimică a frotiului, cu metanol – pentru completarea fixării fizice;

Fixarea cu metanol scufundări succesive ale lamei timp de 10 secunde

4. Colorarea cu eozină – colorant acid – va determina colorarea structurilor bazice din citoplasmă

(hemoglobină, granulații eozinofile), în nuanțe de roz-roșu; Colorarea cu eozină

scufundări succesive ale lamei timp de 20 secunde

5. Contracolorarea cu albastru de metil – colorant bazic - va determina colorarea structurilor acide

din celule (acizi nucleici, granulații bazofile), în nuanțe de albastru-violet. Colorarea se poate face cu derivați de albastru de metil, rezultați prin demetilarea acestuia într-o soluție apoasă, alcalină cu încălzire. Rezultă un amestec de Azur A, B violet și albastru metil.

Colorarea cu albastru de metil sau azur metil

scufundări succesive ale lamei timp de 30 secunde

P a g | 9 La final, frotiul colorat se spală la jet redus de apă de robinet. Se așează în suportul de uscare, iar după

uscare se poate examina.

3.3.2. Metoda May-Grunwald Giemsa 1. Recoltarea și etalarea frotiului de sânge, așa cum s-a prezentat anterior 2. Uscare (fixare temporară) prin agitare în aer la temperatura laboratorului. Nu se suflă asupra

frotiului. 3. Fixarea chimică a frotiului

- Se poate realiza ca și mai sus, cu metanol – pentru completarea fixării fizice; - Fixarea directă, cu soluția May-Grunwald concentrată, care conține metanol 99%; fixarea cu

metanol pur se poate ignora.

Această tehnică presupune acoperirea frotiului cu soluțiile de fixare/colorare, prin picurare cu o pipetă simplă sau automată. Un volum de circa 1 ml este de obicei suficient pentru a acoperi frotiul Durata fixării chimice cu soluția May-Grunwald concentrată este de 2 min:30sec.

4. Colorarea cu soluția May-Grunwald diluată.

Practic, fără a arunca soluția concentrată utilizată în etapa (3) pentru fixare, peste această soluție se adaugă un volum egal de apă distilată tamponată cu pH=7. Atenție! Este important ca volumul inițial de soluție May-Grunwald să nu fie prea mare, pentru ca adăugarea unui volum similar de apă distilată tamponată să nu ducă la deversarea soluției care trebuie să acționeze ca și colorant. Astfel, volumul propus inițial pentru fixare (May-Grunwald concentrată) este de 1 ml, urmând ca pentru obținerea colorantului să se adauge 1 ml de apă distilată tamponată. Timpul de colorare este de 2min:30sec; se poate prelungi dacă se remarcă o subcolorare a frotiului.

5. Colorarea cu soluția Giemsa. Se îndepărtează colorantul May-Grunwald, fără spălare, apoi se acoperă frotiul cu soluţie de lucru Giemsa.

Soluția de lucru Giemsa se prepară din soluția stoc Giemsa concentrată, diluată cu apă distilată (AD) tamponată la pH=7 pentru a obține o soluție 5% (exemplu - 50μl Giemsa concentrat + 950 μl AD, pentru 1 ml colorant Giemsa de lucru); pentru acoperirea unui frotiu este suficient un volum de colorant de lucru Giemsa de 1 ml; după ce frotiul este complet și corect acoperit, se așteaptă 25-30 min.

6. Se spală lamă sub jet redus de apă; 7. Se efectuează o sugativare uşoară, fără a atinge suprafața colorată; 8. Se aşează în stativ pentru uscare. Frotiul trebuie colorat cât mai curând după realizare. Clasa unui element sau gradul lui de maturare se stabilesc pe baza unor criterii ce privesc bazofilia

citoplasmei elementelor tinere, afinitatea tinctorială a granulaţiilor granulocitelor şi acidofilia eritrocitelor mature.

Cu cât o celulă este mai tânără cu atât citoplasma ei este bazofilă, dat fiind concentraţia mare de acid ribonucleic. Pe măsură maturării, celula devine tot mai acidofilă deoarece scade concentraţia în acid ribonucleic (ex: evoluţia eritroblaştilor). Termenii de eozinofil, bazofil, acidofil, indică afinitatea faţă de coloranţii acizi.

Afinitățile pentru diferiții coloranți utilizați pentru frotiul de sânge sunt: bazofilia – afinitatea pentru albastrul de metil

P a g | 10 azurofilia – afinitatea pentru produșii de oxidare ai albastrului de metil – numiți azuri – care

determină o colorație roșiatic-violetă acidofilia – afinitatea pentru eozină neutrofilia – afinitatea pentru un complex de coloranți în amestec (așa cum este soluția Wright gata

preparată) – care induce o colorație lila-palidă. Pentru frotiul de sânge

eritrocitele vor cupla eozina datorită hemoglobinei și vor apărea roz-portocalii, nucleii leucocitelor apar albastru-violeți, granulațiile bazofile sunt colorate albastru-violet închis, granulațiile eozinofile sunt colorate roșu-portocaliu, granulațiile neutrofile sunt colorate roșu-maroniu spre lila, trombocitele sunt colorate violet, citoplasma limfocitelor este colorată albastru palid.

P a g | 11

4. Examinarea frotiului de sânge Se începe cu obiectivul de 10x pentru verificarea calităţii tehnice a frotiului. Apoi se pune la punct cu obiectivul cu imersie şi se examinează pe rând: - morfologia eritrocitelor; - frecvenţa şi morfologia trombocitelor; - frecvenţa şi morfologia leucocitelor, eventual cu întocmirea formulei leucocitare (exprimarea procentuală a diferitelor forme de leucocite).

Pentru întocmirea formulei leucocitare, se examinează frotiul de sânge pe margine, lama deplasându-se într-o singură direcţie, notându-se fiecare tip de leucocit din 100 de leucocite numărate.

5. Variaţii fiziologice ale numărului elementelor sângelui periferic 5.1. Hemoleucograma

Minim Maxim Unități de măsură

Eritrocite/ Globule roşii (RBC în literatura anglosaxonă = red blood cells)

Masculin 4.2 5.7 x1012/L sau milioane/mm3 sau per l

Feminin 3.5 5.1

Copii 3.8 5.5

Reticulocite Hematii imature, Hematii nucleate http://en.wikipedia.org/wiki/Reticulocyte

Valori medii

26 130 x109/L

Adult 0.5 1.5 % of RBC

Nou-născut 1.1 4.5 % of RBC

<7 ani (prescolar)

0.5 3.1 % of RBC

Trombocite (plachete sangvine) 140 400 x103/mm3 sau per μl

5.2. Formula leucocitară Tip celular Minim Maxim Unități de măsură

Leucocite totale (WBC = white blood cells)

Adult 4 9

x109/L sau x103/mm3 sau x103/μL Nou-născut 9 30

1 an 6 18

Granulocite neutrofile (PMN + polimorfonucleare neutrofile, sau neutrofile segmentate)

Adult 1,8 5 x109/L sau x103/mm3 sau x103/μL

50 70 % din WBC

Nou-născut 6 26 x109/L

Granulocite neutrofile immature (nesegmentate)

Adult 0,7 x109/L

3 5 % din WBC

Granulocite eozinofile Adult

0,04 0.5 x109/L

1 6 % of WBC

Nou-născut 0.02 0.85 x109/L

Granulocite bazofile Adult

40 300 x106/L

0.5 1 % of WBC

Nou-născut 0.64 x109/L

Limfocite Adult

1 3,5 x109/L

20 35 % din WBC

Nou-născut 2 11 x109/L

Monocite Adult

0,1 0,8 x109/L

4 8 % din WBC

Nou-născut 0,4 3,1 x109/L

P a g | 12

NU UITAȚI! Exprimarea numerică a elementelor figurate se realizează astfel: nr. celule /L sau nr. celule /mm3 sau /μl nr. celule /cm3 sau /ml

6. Hematopoieza Este un proces normal de reînnoire a celulelor sângelui periferic.

Prezintă două etape etapa embrionară

- sac vitelin - z14-z19 intrauterine (IU) – hematopoieză mezoblastică – RBC nucleate - ficat – S6 IU + splină S12 IU - centri de osificare – cartilaj – L4-5 IU – măduvă osoasă hematogenă

etapa postnatală - 4-25 ani - măduvă osoasă hematogenă - Adult - oasele craniului, coastelor, sternului, scapulelor, claviculelor, vertebrelor, femurului si

humerusului

Sediul eritropoiezei

Tipul predominant al eritropoiezei

Celula finală Tipurile principale de

hemoglobină

Sac vitelin Megaloblastic Nucleată Gower I (ζ2 ε2) Gower II (α2 ε2) Portland (ζ2 γ2)

Ficat fetal Normoblastic Macrocit anucleat

Hemoglobina fetala (Hb. F. α2 γ2)

Măduvă osoasă fetală

Normoblastic Macrocit anucleat

HbF si HbA (α2 β2)

7. Morfologia elementelor figurate din sângele periferic 7.1. Eritrocitul Numit și hematie sau globul roşu, are un diametru de aproximativ 6 m la celula uscată şi 8 m la

hematia proaspătă circulantă. Eritropoieza durează 25 ore și are următoarea secvență

P a g | 13 Reticulocitele rezultate, părăsesc măduva şi trec în circulaţie unde se maturează după aproximativ 48

ore trecând în eritrocite mature. Eritrocitele umane produse în cadrul procesului de eritropoieză se dezvoltă pornind de la celulele stem

într-o perioadă de 7 zile. Durata de viață a eritrocitelor circulante este de 120 zile. Funcția principală este de transport al gazelor respiratorii (oxigen – de la plămâni la țesuturi și CO2 în

sens invers).

7.1.1. Morfologia eritrocitului Eritrocitul adult este o celulă anucleată, discoidală şi biconcavă. Este alcătuit din citoplasmă şi

membrană celulară. În citoplasmă se găsesc în special macromolecule proteice structurale şi protein-enzime precum şi cantităţi mici de lipide, vitamine (mai ales din grupul B) şi elementul principal hemoglobina.

Membrana eritrocitului prezintă pe suprafaţa sa antigeni numiţi aglutinogeni după a căror prezenţă sau absenţă, se pot identifica grupele sanguine, de care se ţine seama în practica medicală când se efectuează transfuzia de sânge. În afara acestora, pe suprafaţa externă a membranei eritrocitare s-a evidenţiat şi factorul Rh.

Eritrocitele au o culoare roşu cărămiziu pe frotiul de sânge colorat cu soluţia May-Grumwald Giemsa şi o formă rotunjită, văzute din faţă şi de disc biconcav văzute din profil (discocite).

7.1.2. Anomaliile de formă ale eritrocitelor

Anomaliile de formă ale eritrocitelor sunt regrupate sub numele de poikilocitoză. Poikilocitele sunt eritrocite cu forme variate, dar anormale. Aceste forme anormale pot fi permanente sau temporare. Cauzele apariției acestor forme anormale țin de structura membranei eritrocitare sau de traume ale întregii celule.

Anomalii de membrană eritrocitară 1. Acantocite – formă ireversibilă – (engl. spurr/spike cells). Sunt eritrocite ale căror membrane

prezintă prelungiri de dimensiuni variabile. Acantocitoza reprezintă situația în care acantocitele domină în sângele periferic. Acantocitoza se întâlnește în stări patologice precum abetalipoproteinemia, diferite afecțiuni hepatice, unele boli neurologice. Există forme congenitale cât și dobândite de acantocitoză. Cauza apariției acestor deformări este reprezentată de defecte în unele proteine componente structurale ale citoscheletului cortical.

P a g | 14 2. Codocite – formă ireversibilă – (target cells, Mexican hat cells). Sunt eritrocite care apar niște ținte.

Celulele prezintă un centru întunecat înconjurat de un inel decolorat și încă un inel exterior întunecat. In vivo, aceste celule au formă de clopot şi numai pe frotiu apar în formă de ţintă. Celulele de acest tip prezintă o disproporție între suprafața și volumul celular.

Cauza apariției acestor celule poate fi determinată de: - Creșteri ale suprafeței membranare, de obicei datorate unor tulburări ale metabolismului lipidic - Reducerea volumului citoplasmatic este asociată cu reducerea producției de hemoglobină, în deficitul

de fier sau în diferite hemoglobinopatii, cum este talasemia (sinteza de hemoglobine genetic defecte). - Mai apar în disfuncții splenice

3. Echinocitele – formă reversibilă – (burr cells). Reprezintă o variantă de acantocite la care prelungirile (țepii) sunt regulate și egale.

Apar în - Expunerea eritrocitelor la acizi grași, lizolecitină, pH crescut. - După administrarea de heparină, - În sindromul hemolitic uremic, - Stări de malabsorbție care induc hipomagneziemie, hipofosfatemie - Depleție de ATP, acumulare de Ca

P a g | 15 4. Eliptocite/ovalocite – formă reversibilă – se găsesc în sângele periferic în proporţie de 10-15% din globulele roşii, putând fi întâlnite şi în unele boli sanguine (eliptocitoză ereditară, talasemie, deficit de Fe, anemie megaloblastică).

5. Stomatocitele – hematii rotunde ce reprezintă într-o anumită zonă o înfundătură ca o gură (stomă); ele apar la un pH uşor scăzut sub 7; revenirea pH-ului la normal determină transformarea lor în discocite; în hemoglobinopatii apar forme ireversibile de stomatocite

6. Drepanocitele – hematii în corn sau seceră; se întâlnesc în hemoglobinopatii, (hemoglobinoza S-drepanocitoza), talasemie şi deficit de fier în organism.

P a g | 16 Creşterea hematiei determină apariţia macrocitelor; când diametrul depăşeşte 10 m, vorbim de

megalocite (acestea apar de obicei în boli sanguine-anemii). Scăderea diametrului eritrocitului sub 7 m determină apariţia în sânge a microcitelor. Variaţiile de diametru eritrocitar poartă denumirea de anizocitoză.

Culoarea eritrocitelor se poate modifica, celulele apărând fie palide (hipocromie) în anemii, fie diferit colorate, în tulburările eritropoiezei.

7.1.3. Morfologia leucocitelor Leucocitele se împart în două clase majore:

a. granulocite (prezintă numeroase granule în citoplasmă) b. agranulocite sau leucocite agranulare

P a g | 17

Tipul de celula Funcțiile principale

Eritrocite Transportul de O2 de la plamani la țesuturi, transportul de CO

2 de la tesuturi la plamani

Granulocite Neutrofile

Chemotaxie, fagocitoza, distrugerea bacteriilor fagocitate

Eozinofile

Functii identice cu ale neutrofilelor; celule efectoare in distrugerea mediata prin anticorpi a metazoarelor, regleaza reactiile de hipersensibilitate imediata (inactiveaza histamina si substanta cu actiune lenta a anafilaxiei – SRS-A eliberate de bazofile si mastocite)

Bazofilul

Intervine in reactia de hipersensibilitate imediata (bazofilele purtatoare de receptori lgE reactioneaza cu antigenul specific si eliberează histamina si substanța cu actiune lenta a anafilaxiei (SRS-A); moduleaza raspunsurile inflamatorii prin eliberarea de heparina si proteaze

Monocitele Chemotaxie, fagocitoza, distrugerea unor microorganisme, devin active cand se transforma in macrofage

Trombocitele Adera la zona subendoteliala, participand in procesul de hemostaza

Limfocitele Implicate in răspunsurile imune

7.1.4. Morfologia trombocitelor (plachete sangvine) Trombocitele iau naştere în măduva osoasă hematogenă prin fragmentarea citoplasmei elementelor

seriei megacariocitare (megacarioblastul, celula cap de serie, megacariocitul bazofil sau promegacariocitul, megacariocitul granulat netrombocitogen, megacariocitul granulat trombocitogen, trombocitul).

Trombocitele se formează deci din citoplasma megacariocitului, prin diferenţierea acesteia, la un anumit stadiu de maturaţie a celulei. Desprinse din megacariocit, trombocitele trec în stadiu de maturaţie, având dimensiuni care variază între 2-5 μm şi o durată de viaţă de circa 7-10 zile. În sângele periferic ele se găsesc în proporţie de 150000-400000/mm3.

Trombocitul este o “celulă” elipsoidă, cu formă de lentilă biconvexă când se află în stare proaspătă, în vasele sanguine.

Trombocitul este anucleat, fiind alcătuit din membrană şi citoplasmă.

Membrana trombocitelor este lipoproteică, acoperită de un strat de glicoproteine care permite absorbţia unor proteine plasmatice, în special fibrinogen şi factorul 8, jucând un rol în interacţiunea dintre trombocit şi peretele vascular sau alte suprafeţe străine (adeziune) şi cu alte plachete (agregare). Pe suprafaţa externă a membranei celulare se găsesc diferite lucruri specifice antigenice, ca şi receptori pentru agenţii stimulatori sau inhibitori ai procesului de agregare plachetară. Membrana trombocitului mai prezintă şi mici ondulaţii şi prelungiri dendritiforme rare.

Citoplasma se prezintă la examenul microscopic alcătuită din două zone: una externă, ectoplasmică, clară, numită hialomer şi alta centrală, întunecată numită granulomer.

Hialomerul conţine microtubi, microfilamente şi diferite proteine implicate în procesul de coagulare sangvină.

Granulomerul este un ansamblu de granule şi vacuole de mărimi diferite; el este alcătuit din mitocondrii mici; câţiva lizozomi ce apar pe frotiu ca granulaţii azurofile, câţiva peroxizomi ce conţin catalază, microvezicule golgiene, puţine profiluri de reticol endoplasmatic şi granule dense ce conţin serotonină, epinefrină (adrenalină), ioni de calciu.

Trombocitul este o celulă direct implicată în procesul de coagulare a sângelui, intervenind şi în procesele inflamatorii, în reacţiile imune, în vindecarea rănilor; poate endocita, particule foarte mici.