LAPORAN KASUS ORAL MEDICINE

TELAAH JURNALMODUL LESI JARINGAN LUNAK MULUTEfek Supresif Frondoside A Pada Kelangsungan Hidup Kanker Paru-Paru, Pertumbuhan Tumor, Angiogenesis, Invasi, dan Metastasis

Diajukan untuk memenuhi syarat dalam melengkapi Kepaniteraan Klinik Modul Lesi Jaringan Lunak Mulut

Oleh:FIONA WARIZKY1010070110052

Penanggung Jawab Modul : drg. Utmi Arma, MDScRUMAH SAKIT GIGI DAN MULUTUNIVERSITAS BAITURRAHMAH

P A D A N G

2015MODUL LESI JARINGAN LUNAK MULUT

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGIMODUL LESI JARINGAN LUNAK MULUT

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS BAITURRAHMAH

PADANGHALAMAN PERSETUJUAN

Telah disetujui translate yang berjudul Efek Supresif Frondoside A Pada Kelangsungan Hidup Kanker Paru-Paru, Pertumbuhan Tumor, Angiogenesis, Invasi, dan Metastasis dengan judul asli Frondoside A Suppressive Effects on Lung Cancer Survival, Tumor Growth, Angiogenesis, Invasion, and Metastasis

Padang, Januari 2015

Disetujui Oleh

Penanggung Jawab Modul

( drg. Utmi Arma, MDSc )Efek Supresif Frondoside A Pada Kelangsungan Hidup Kanker Paru-Paru, Pertumbuhan Tumor, Angiogenesis, Invasi, dan MetastasisABSTRAK

Tantangan terbesar bagi ahli onkologi dan farmasi yaitu mengembangkan obat rendah racun yang dapat meningkatkan kelangsungan hidup pasien kanker paru-paru. Frondoside A merupakan glikosida triterpenoid yang diisolasi dari sea cucumber (teripang), Cucumaria frondosa dan terbukti menjadi senyawa yang aman. Kami meneliti dampak Frondoside A terhadap kelangsungan hidup, migrasi dan invasi in vitro, pertumbuhan tumor, metastasis dan angiogenesis secara in vivo saja serta dalam kombinasi dengan cisplatin. Frondoside A mengakibatkan penurunan konsentrasi terikat viabilitas LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, dan HepG2 dalam 24 jam melalui caspase 3/7 perjalanan kematian sel terikat. Konsentrasi IC50 (produksi inhibisi setengah maksimal) pada 24 jam antara 1,7 dan 2,5 M Frondoside A. Selain itu, Frondoside A mengakibatkan inhibisi waktu dan konsentrasi terikat migrasi sel, invasi, dan angiogenesis in vitro. Frondoside A (0,01 dan 1 mg/kg/hari selama 25 hari intraperitoneal) secara signifikan menurunkan pertumbuhan, angiogenesis, dan metastasis kelenjar getah bening xenograft tumor LNM35 pada tikus athymic, tanpa efek samping racun yang nyata. Frondoside A (0,1-0,5 M) juga secara signifikan mencegah basal dan induksi bFGF angiogensis pada uji CAM angiogenesis. Selain itu, Frondoside A meningkatkan hambatan pertumbuhan tumor paru-paru yang disebabkan oleh agen kemoterapi cisplatin. Temuan ini mengidentifikasi Frondoside A sebagai antigen agen terapi baru yang menjanjikan untuk kanker paru-paru.

PENDAHULUAN

Kanker paru-paru merupakan salah satu kanker yang paling umum dengan rata-rata angka kematian tertinggi di dunia. Sasaran terapi yaitu subkelompok yang dipilih dari pasien dengan kemajuan luar biasa dalam pengobatan kanker paru-paru. Meskipun demikian, masih ada kontroversi, pasien meninggal, dan obat yang sulit dipahami [1]. Senyawa alami banyak muncul sebagai generasi baru agen antikanker dengan toksisitas terbatas pada pasien kanker [2,3]. Agen antikanker ini memberikan efek besar pada tumor yang resisten terhadap kemoterapi klasik atau tahan terhadap tyrosine kinase inhibitor seperti gefitinib.

Teripang telah dinilai selama ratusan tahun dalam makanan Cina sebagai makanan yang lezat, serta obat berbagai macam penyakit. Di Amerika Serikat dan Kanada, jaringan teripang dikeringkan, ditumbuk dan dikemas sebagai neutraseutikal yang dijual bebas sebagai suplemen makanan kesehatan, terutama untuk peradangan pada manusia dan hewan peliharaan [4]. Frondoside A adalah glikosida triterpenoid yang diisolasi dari Atlantic cucumber, Cucumaria frondosa. (Lihat [5] untuk struktur kimia). Penelitian terbaru menunjukkan bahwa Frondoside A dengan konsentrasi rendah dapat menghambat pertumbuhan dan induksi apoptosis pankreas manusia, leukemia dan sel kanker payudara sel melalui aktivasi caspase [6-8].

Agen kemoterapi yang saat ini digunakan untuk kanker paru-paru masih kurang memuaskan karena terkait toksisitas co-lateral dan resistensi induksi obat [9-11] menjadi motivasi kami meneliti tentang dampak Frondoside A terhadap kelangsungan hidup sel non kecil kanker paru-paru manusia, migrasi dan invasi in vitro, pertumbuhan tumor, metastasis dan angiogenesis in vivo tunggal dan dikombinasi dengan cisplatin.BAHAN DAN METODEKultur Sel dan Reagen

Sel-sel kanker paru-paru manusia LNM35 (NSCLC) [12], A549 dan NCI-H460-Luc2 (Caliper Life Sciences, AS) yang dikelola di RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, UK), melanoma manusia MDAMB- 435, sel adenokarsinoma mammae manusia MCF- 7, dan sel-sel hepatoma manusia HepG2 yang dikelola di DMEM (Invitrogen, Paisley, UK). Seluruh media dilengkapi dengan antibiotik (penisilin 50 U/ml; streptomisin 50 g/ml) (Invitrogen, Cergy Pontoise, Perancis) dan 10% fetal bovine serum (FBS, Biowest, Nouaille, Prancis). Sel EndoGROTM Human Umbilical Vein endotel (HUVECs) (Millipore, Temecula, CA) yang dikelola EndoGROTM-MV-VEGF Complete Media Kit (Millipore, Temecula, CA). Cisplatin dibeli dari Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Prancis). Frondoside A dimurnikan dari Cucumaria frondosa, yang dipanen dekat Stonington, Maine dan kemurnian (99,9%) dikonfirmasi oleh NMR seperti yang dijelaskan sebelumnya [13,14].Viabilitas Sel

Sel ditanam dengan kepadatan 5.000 sel/lubang ke dalam 96 well plate. Setelah 24 jam, sel diberi perlakuan selama 24 jam dengan konsentrasi Frondoside A yang berbeda (0,01-5 M), dirangkap tiga. Kultur kontrol diberi perlakuan 0,1% DMSO (dimethyl sulfoxide) . Efek Frondoside A terhadap viabilitas sel ditentukan dengan menggunakan uji Cell-Titer- Glo Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Madison, USA), berdasarkan kuantifikasi ATP, yang menandakan adanya sel aktif secara metabolik. Sinyal luminescent diukur menggunakan sistem GLOMAX Luminometer. Data dicatat sebagai viabilitas proporsional (%) dengan membandingkan kelompok yang diberi perlakuan dengan sel yang tidak diberi perlakuan, kelangsungan hidup yang diasumsikan 100%.Aktivitas Caspase 3/7Sel LNM35 ditanam di kepadatan 5.000 sel/lubang ke dalam 96 well plate dan diberi perlakuan dengan Frondoside A (1-2,5 M) untuk 2 dan 24 jam, dalam rangkap tiga. Aktivitas caspase-3/7 diukur menggunakan luminescent Caspase-Glo 3/7 assay kit sesuai instruksi dari pabriknya (Promega Corporation, Madison, USA). Reagen caspase ditambahkan dan plate dicampur menggunakan orbital shaker (pengocok orbital) dan diinkubasi selama 2,5 jam pada suhu kamar. Luminasi diukur menggunakan sistem GLOMAX Luminometer.Uji Motilitas Penyembuhan Luka

Sel LNM35 dibiakkan dalam enam lubang media kultur jaringan sampai menyatu. Kultur diinkubasi selama 10 menit dengan Moscona buffer. Buat sebuah goresan melalui monolayer konfluen dengan ujung pipet plastik diameter 1 mm. Setelah itu, piring dicuci dua kali dan diinkubasi pada suhu 370C dalam RPMI segar mengandung 10% fetal bovine serum dengan ada atau tidak konsentrasi nontoksik Frondoside A (0,1-0,5 M). Pada bagian bawah setiap piring, dipilih dua tempat secara acak dan ditandai di mana lebar luka yang diukur dengan mikroskop terbalik (obyektif 64) (Olympus 1X71, Jepang). Motilitas dinyatakan rata-rata 6 S.E.M perbedaan antara pengukuran pada waktu nol dan 6, 24 dan 30 jam periode waktu yang dipertimbangkan.Uji Invasi Matrigel

Sel kanker paru-paru LNM35 invasif yang diberi perlakuan dengan Frondoside A (0,1-1 M) diuji menggunakan BD Matrigel Invasion Chamber (8-mm ukuran pori, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Prancis) sesuai dengan protokol produsen. PI3 kinase inhibitor LY294002 (20 M) digunakan sebagai inhibitor positif invasi seluler. Secara singkat, sel (sel 1x105 dalam 0,5 mL media dan konsentrasi yang ditunjukkan Frondoside A) yang dibiakkan ke bilik atas sistem, lubang bawah RPMI (Media Roswell Park Memorial Institut) dilengkapi dengan 10% fetal bovine serum sebagai kemoatraktan dan kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Sel nonpenetrasi dikeluarkan dari permukaan atas filter dengan cotton swab. Sel-sel yang bermigrasi melalui Matrigel difiksasi dengan 4% formaldehid, diwarnai dengan DAPI dan dihitung dalam 25 bidang acak di bawah mikroskop. Pengujian dilakukan dalam rangkap dua dan diulang tiga kali untuk analisis kuantitatif.Uji Angiogenesis Chorioallantoic Membrane

Pengujian ini dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [15], dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, telur yang dibuahi diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37,80C dengan kelembaban 48%. Pada hari ke-4, albumen (putih telur) dibuang untuk melepaskan shell (cangkang) dari CAM yang sedang berkembang dan dibuat sebuah lubang dalam cangkang, untuk mengekspos CAM, dan ditutup dengan breathing film (suprasorb F). Telur dikembalikan ke inkubator sampai 10 hari, sebelum aplikasi uji senyawa. Uji senyawa dan senyawa kontrol (DMEM tanpa 10% FBS) dilarutkan dalam DMEM tanpa 10% FBS yang dituangkan ke disc steril terpisah (diameter 12 mm), dibiarkan kering dalam kondisi steril. Larutan asetat kortison (125 mg/disc) dituangkan ke semua disk untuk mencegah respon inflamasi. Disc uji diperiksa dengan rekombinan bFGF manusia (Peprotech) yang berfungsi sebagai kontrol stimulasi angiogenesis. Setiap CAM, disk yang mengandung senyawa kontrol dan disk yang mengandung senyawa uji ditempatkan dengan jarak 1 cm. Lubang ditutup dan telur diinkubasi sampai hari ke-14, sebelum penilaian angiogenesis. Oleh karena itu, telur direndam 10% buffer formalin dan telur disimpan pada suhu kamar kira-kira 20 menit. CAM, daerah piringan dimasukkan, ditempatkan dalam cawan petri dengan 10% buffered formalin. Piringan plastik dibuang dan diambil gambar phasecontrast dari daerah daerah piringan plastik. Indeks vaskular diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya [16]. Perpotongan vaskular pada kisi yang berisi tiga lingkaran konsentris (diameter 6, 8 dan 10 mm sebagai ppusat disk) dihitung. Indeks angiogenik = (t-c) / c, yang mana t : jumlah perpotongan daerah yang tercakup dalam disk uji dan c jumlah perpotongan daerah yang tercakup ke dalam piringan kontrol pada telur yang sama. Mann-Whitney U-test digunakan untuk analisis statistik (p