folatos y su disponibilidad en alimentos evaluados …

AN. VET. (MURCIA) 20: 59-73 (2004). FOLATOS Y SU DISPONIBILIDAD EN ALIMENTOS EVALUADOS. OLIVARES, A.B., et al. 59

FOLATOS Y SU DISPONIBILIDAD EN ALIMENTOS EVALUADOS PORCROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC). VALIDACIÓN Y APLICACIONESEN CALIDA NUTRICIONAL DE ALIMENTOS

Folates and their Availability in Foods Evaluated by Liquid Chromatography (HPLC). Validationand Application in Food Nutritional Quality.

Olivares A.B.*, Bernal M.J., Ros G., Martínez C., Periago M.J.Departamento de Tecnología de Alimentos, Nutrición y Bromatología. Grupo de Investigación deNutrición y Bromatología (E098-02). Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia. Campus deEspinardo. 30100 Murcia.* Autor de referencia: [email protected]

RESUMEN

En este artículo se presenta el método cromatográfico de mayor precisión para la determinación de lasformas químicas (folatos) de la vitamina B

9 (ácido fólico o folacina) en alimentos, así como su disponibilidad

(mono o poliglutamatos). Se trata de un método basado en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC),cuyo protocolo permite la extracción de la vitamina, su purificación y posterior separación de las distintasformas de los folatos. Este método ha sido validado sobre estándares y alimentos de referencia certificados ycomparado con otros grupos de investigación frente a métodos microbiológicos.

Palabras clave: folatos, ácido fólico, derivados folato, conjugasa, cromatografía líquida

ABSTRACT

In this article it is presented the most precise chromatographic method to determine the different forms ofB

9 vitamin (folic acid or folacin) in foods, besides their availability (mono or polyglutamates). It is based in

high performance liquid chromatographic method (HPLC) which protocol permits the extraction, purificationand separation of folic acid and its different derivatives forms. This method has been validated with thestandards and certified reference materials and compared with others investigation groups versus microbiolo-gical assays.

Keywords: folates, folic acid, folates derivatives, conjugase, liquid chromatography

AN. VET. (MURCIA) 20: 59-73 (2004). FOLATOS Y SU DISPONIBILIDAD EN ALIMENTOS EVALUADOS. OLIVARES, A.B., et al.60

INTRODUCCIÓN

El término «folato» se utiliza de forma ge-nérica para denominar las distintas formas quí-micas derivadas del ácido fólico, una de lasvitaminas del grupo B (concretamente la vita-mina B

9)

que se encuentra mayoritariamente en

las verduras de hoja ancha, hígado y cereales.

Los folatos (más conocidos genéricamente comoácido fólico) son un componente esencial de ladieta, necesario para la formación de las célulasde las series blanca y roja de la sangre, y lascélulas epiteliales del tracto digestivo. Especial-mente en estas células de rápida multiplicacióny en otras células, los folatos forman parte delas reacciones de transferencia de carbono, des-tacando por su importancia las implicadas en elmetabolismo del ADN, ARN y amino ácidos.Es por tanto comprensible que durante periodosde rápida multiplicación y crecimiento celulareslos requerimientos de folato en la dieta seanmayores (Vahteristo, 1998). Así, por ejemplo,durante los periodos de gestación o lactancia lasingestas diarias recomendadas (IDR) pasan de200 a 400 µg/día (Centers for Disease Control,1992).

Los folatos, debido a su destacada funciónmetabólica, tienen una importante repercusiónen la salud. Juegan un papel esencial reconoci-do en la prevención de los defectos del tuboneural tal y como es la prevención de la apari-ción de espina bífida en neonatos (Czeizel yDudás, 1992), y existen claras evidencias epide-miológicas que sugieren que unos niveles ele-vados de homocisteína en plasma (>15µmol/L)constituye un factor de riesgo independiente paralas enfermedades cardiovasculares (Boushy etal., 1995). Sin embargo, una ingesta elevada deácido fólico reduce los niveles de homocisteínade modo que una dosis extra de 200µg de ácidofólico diaria provoca una reducción de 11-12%de los niveles de homocisteína plasmática (deJong et al. 2004). También estudios en pobla-ciones han permitido establecer una relaciónnegativa entre una alta ingesta de folatos y la

aparición de adenomas colorectales (Giovannuc-ci et al., 1993). Queda claro, como hemos ex-puesto anteriormente, que el ácido fólico y/o losfolatos juegan un papel esencial en la dieta, tan-to por su necesidad basal como por su efectopreventivo frente a distintas alteraciones de lasalud. Sin embargo, la eficacia de ambas formases distinta. Así, el ácido fólico utilizado comosuplemento posee una eficacia 1,7 veces mayorque los folatos que naturalmente existen en losalimentos (West Suitor y Bailey, 2000). La for-ma en los alimentos (ácido fólico o folatos) y sudisponibilidad (mono o poliglutámica) son esen-ciales para conocer nuestras necesidades realesen le dieta. Surge, por tanto, la necesidad deestablecer un método fiable de determinaciónde folatos en alimentos. Es deseable y necesariocaracterizar la exacta naturaleza y distribuciónde estos compuestos en la dieta para obtener unmayor conocimiento de su estabilidad y reacti-vidad en los distintos alimentos o su biodisponi-bilidad en las diferentes dietas, y con todo ellopoder brindar unas recomendaciones más realesy científicas, así como consejos para la obten-ción de una nutrición más óptima, en cuanto afolatos se refiere, para todos los grupos de po-blación.

El contenido total de folatos venia determi-nándose tradicionalmente mediante métodosmicrobiológicos (Finglas, 1993). Estos sólo es-timan el contenido total de folatos, pero no dis-crimina entre las diferentes formas químicas.Los folatos en los alimentos están presentes endistintas formas químicas (tetrahidrofolato, me-tilfolato, formilfolato) y en varios estados deoxidación (5,6,7,8-tetrahidropteroilglutamato,etc), con diferentes sustituyentes del átomo decarbono y diferente grado de conjugación con elácido glutámico. Se ha estimado que un 80% delos folatos presentes de forma natural en losalimentos se encuentran en forma poligutámica,y el resto como monoglutamatos, principalmen-te metiltetrahidrofolato. Las formas poliglutá-micas no son asimilables por el organismo hu-mano, ya que necesitan una desconjugación pre-


via hasta formas monoglutámicas las que si sonbiodisponibles (Gregory, 1996). Esta transfor-mación es realizada por la enzima g-glutamilhi-drolasa o folato conjugasa, la cual se localiza enel borde apical de las vellosidades de la mucosayeyunal (Figura 1) (Chandler et al., 1986; Gre-gory, 1997; Brouwer et al., 2001). A fin deseparar estas formas, se han ensayado métodoscromatográficos más precisos que los microbio-lógicos pero que poseen algunas peculiaridadesque deben ser tenidas en cuenta.

Las recientes investigaciones desarrolladaspara mejorar los métodos de determinación defolatos han dado lugar a una mayor fiabilidaden la calidad de los datos en las tablas de com-posición de alimentos, aunque el conocimientode las formas de folatos naturales y su conteni-do y distribución en alimentos es todavía muylimitado (Kehlenbach y Nau, 2004) ya que al-gunos de estos derivados folatos son muy hábi-les (debido a su sensibilidad a la luz y a que sereducen en presencia de oxígeno) (Gregory,1989), además de estar en muy baja cantidad enlos alimentos. Por ello, el objetivo de este traba-jo es mostrar un método optimizado y validadoque permite separar y cuantificar las formasmonoglutámicas, procedentes de distintas ma-trices alimentarias, que por otro lado, son lasbiológicamente activas (Vahteristo, 1998).

MATERIAL Y MÉTODOS

En la Figura 1 se presenta el esquema generalde las etapas del método cromatográfico emplea-do para el análisis de folatos en alimentos basadoen el método de Vahteristo et al. (1996).

Materiales

Materiales biológicos

Muestras de alimentos de referencia

Las muestras empleadas para este estudiofueron Materiales Certificados de Referencia

(MCR o CRM en inglés) procedentes del «Ins-titute for Reference Materials and Measure-ments» (IRMM, Geel, Bélgica) fueron sumi-nistrados por el Proyecto Europeo «Folate: fromFood to Functionality and Optimal Health». Setrataba de cuatro muestras liofilizadas de dis-tintos alimentos: mezcla de diferentes verduras(maíz dulce, tomate y zanahoria) (CRM 485),hígado de cerdo liofilizado (CRM 487), lecheen polvo enriquecida con ácido fólico (CRM421), y harina integral (CRM 121). El CRM421 es un material de referencia reconocidocomo tal, los otros tres son candidatos a mate-riales de referencia.

Materiales análiticos

Reactivos

Los reactivos usados eran específicos paracromatografía líquida como era el caso de Ace-tonitrilo y Metanol, y el resto eran degrado paraanálisis (p.a). Todos los reactivos fueron sumi-nistrados por Merck (Darmstad, Alemania). Elagua utilizada debía ser doblemente destilada,lo que se conseguía a través de un sistema Mili-Q (Millipore, USA).

Patrones

El ácido fólico (AF o PGA), el ácido ptero-yltri-γ-L-glutamico (Pte-Glu

3) y las formas re-

ducidas de folatos monoglutámicos: ácido(6R,S)-5,6,7,8-tetrahidrofólico sal de calcio(THF), ácido (6R,S)-5-HCO-5,6,7,8-tetrahidro-fólico sal de sodio (5-FTHF) y ácido (6R,S)-5-CH3-5,6,7,8-tetrahidrofólico sal de sodio (5-MTHF) fueron obtenidas de Dr. Schirck’s La-boratorios (Jona, Switzerland) y almacenadosen oscuridad a -40ºC hasta su uso en una cáma-ra frigorífica Radiber, S.A. La pureza de losestándar fue determinada según el procedimien-to desarrollado por Van den Berg et al. en 1994,usando los coeficientes de extinción molar deta-llados en el Cuadro 1 (Vatheristo, 1998).


Las soluciones estándar para almacenarfueron preparadas a concentración de 100mg/ml en tampón fosfato 0,1M a pH 6, conte-niendo 1% de ácido ascórbico y 0,1% de 2-mercaptoetanol. Alícuotas de 1ml de estassoluciones fueron sometidas a atmósfera denitrógeno, separadas en eppendorf y almace-nadas a -40ºC. De esta manera las solucionesde calibración eran preparadas antes de suuso a partir de las soluciones de almacena-miento, las cuales eran descongeladas y dilui-das en un tampón de elución de sodio acetato0,1 M, conteniendo 10% (p/v) de cloruro só-dico, 1% (p/v) de ácido ascórbico y 0,1% (v/v) de 2-mercaptoetanol.

Solución enzimática

La solución enzimática fue preparada si-guiendo las pautas descritas por Gregory et al.(1984), a partir de riñones de cerdo frescos re-cién sacrificados, que se obtenían en el matade-ro de Mercamurcia (El Palmar, Murcia). La en-zima purificada se denomina pteroylpoligluta-mil-γ-carboxipeptidasa o folato conjugasa;EC3.4.22.12. Para su obtención los riñones fue-ron descapsulados, y una porción de 400g detejido renal se homogeneiza en un Omnimixermodelo 17106 (OMNI) con 1200ml de 2-mer-captoetanol 10mM a 2ºC (baño de hielo). La

suspensión obtenida se ajusta a pH 5,0 con áci-do acético 1,0M. Seguidamente, se centrifugó a10.000giros (o 7.500 rpm) a 2ºC durante 20minutos en una centrífuga refrigerada Beckman,modelo J2-21. El sobrenadante obtenido se trans-firió a un matraz Erlenmeyer de 2L, el cual seintrodujo en un baño a 50ºC durante 2 horas enagitación continua. Trascurrido este tiempo serecentrifugó a 7.500 rpm durante 20 minutos a2ºC. La fracción sobrenadante se precipitó entreel 50 y el 75% de saturación con amonio sulfa-to. Se recentrifugó de nuevo en las mismas con-diciones y se desechó el sobrenadante reservan-do el precipitado, el cual fue resuspendido enun volumen mínimo de 0,05 M de acetato potá-sico, pH 5,0, conteniendo 2-mercaptoetanol10mM. Este volumen de precipitado se introdu-jo en una membrana de diálisis de unos 40cmde longitud, 21,5mm de diámetro y con tamañode poro para el paso de moléculas de 12-14.000daltons de peso, que se introduce en un matrazErlenmeyer con 2L de tampón 0,05 M durantetoda una noche.

El dializado con la preparación de conjuga-sa dio lugar a un volumen aproximado de 110ml(24mg de proteina /ml), los cuales fueron al-macenados en pequeñas porciones a –35ºC has-ta su uso. Esta preparación es estable al menos10 meses bajo estas condiciones de almacena-miento.

Cuadro 1. Coeficiente de absorción molar y peso molecular de las formas usadas para ladeterminación actual de la concentración en las soluciones stock

Calibrante ε (l mmol-1 cm-1) λ max (nm) pH Peso molecular

THF 29,1 297 7 445,4

5-MTHF 31,7 290 7 457,4

5-FTHF 37,2 285 7 473,5

AF 27,6 282 7 441,4

ε= Coeficiente de extinción molarλ= longitud de onda


Preparación de las muestras

Extracción de folatos

Los folatos, generalmente, son extraídos dela matriz del alimento mediante dilución en tam-pón (pH próximo a la neutralidad entre 6,5 y7,85) con adición de antioxidantes y aplicandoun tratamiento de calor (Figura 1). La prepara-ción de las muestras y los estándares se deberealizar en condiciones de reducida luminosi-dad (casi a oscuras) y evitando el contacto conel aire, preferiblemente bajo atmósfera de nitró-geno a fin de proteger los compuestos folatos.En el caso de muestras frescas se deben tomarde 10 a 12g, y si la muestra es liofilizada se

pesará aproximadamente 1g. Se le adiciona 25mlde tampón Ches-Hepes (Sigma-Aldrich), 50mMChes/50 mM Hepes (ajustado pH 7,85 con KOH)y conteniendo 2% de ascorbato sódico y de 2-mercaptoetanol 10 mM. Se homogeneizó lamuestra en Omnimixer, sometiendo a las mues-tras a atmósfera de nitrógeno durante 10 segun-dos. Los tubos se introdujeron en un baño enebullición durante 10 minutos, mantuvieron elbaño en agitación constante. Tras este tiempo,las muestras fueron enfriadas inmediatamenteen hielo. Una vez las muestras están frías, sehomogeneizan y transfieren a matraces de 50mldonde se enrasan con tampón de extracción. Seajusta el pH hasta 4,9 (con HCl 6N), y se aplicade nuevo nitrógeno a las muestras a fin de evitar

Figura 1. Mucosa yeyunal normal, corte histológico a bajo aumento que muestra las vellosida-des, que constituyen más de los 2/3 superiores de la mucosa: son delgadas y de bordeslaterales ondulados. En el extremo apical se localiza la enzima γ-glutamilhidrolasa o folatoconjugasa


la oxidación. Estos extractos se pueden almace-nar a –20º C hasta su utilización (Pfeiffer et al.,1997, Konings, 1999).

Purificación de los folatos

La mayoría de los folatos en los alimentosse encuentran en forma de poliglutamatos en losalimentos, requieren para su análisis cromato-gráfico ser hidrolizados enzimáticamente a for-mas mono o di-glutamatos antes de poder sercuantificados. Las fuentes más comunes de en-zimas conjugasas (γ-glutamilhidrolasa, EC3.4.22.12) son las provenientes de páncreas depollo (utilizada preferentemente en el métodomicrobiológico), la proveniente de riñón (decerdo), y las de plasma (humano o de rata) (Lei-chter et al., 1979). En el caso del método cro-matográfico las enzimas más usadas son las deriñón de cerdo y plasma, ya que dan lugar amonoglutamatos como producto final de reac-ción. La elección de la enzima correcta es, portanto, esencial para obtener unos resultados óp-timos. Para la obtención de los folatos de losalimentos se toman 5ml de extracto de cada unade las muestras objeto de estudio (ajustadas pre-viamente a pH 4,9 debido a que es el óptimo deactuación de la enzima conjugasa) y se les adi-ciona 1ml de solución de α-amilasa (20 mg deamilasa/ml de ascorbato 1%, A-0273, SigmaChemical Co.) y 1ml de solución de conjugasade riñón de cerdo (Gregory et al., 1984). Se lesaplica nitrógeno para crear una atmósfera nooxidante, y posteriormente se les introduce enun baño de agua durante 3 horas a 37ºC conagitación constante. Pasado este tiempo, el pHse ajusta a 7,0, añadiendo posteriormente 1mlde proteasa (2 mg de proteasa/ml de ascorbato1%, P-5147, Sigma Chemical Co). Se les aplicade nuevo nitrógeno y se introducen en un bañoa 37º C durante 1 hora, llevándose seguidamen-te a ebullición durante 5 minutos, a fin de inac-tivar la actividad enzimática. Inmediatamentetras la ebullición las muestras son enfriadas enhielo, tras lo cual, se filtran (filtros desechables

Whatman‚ de nylon con lecho de polipropileno,de 25 mm de diámetro y 0,45 mm de tamaño deporo). Las muestras así preparadas deben serpurificadas. Muchos procedimientos de purifi-cación incluyen el intercambio iónico fuerte através de sílice u otras resinas (Rebello, 1987),de tal forma que los folatos son retenidos enbase a sus cargas y recogidos con tamponesapropiados o soluciones de elución (Vatheristoet al., 1996). Es precisa la preparación de lascolumnas de afinidad o cartuchos (Figura 1)(columnas LiChrolut‚ para extracción en fasesólida intercambio fuerte de aniones –SAX–,500 mg), ya que se debe evitar que la columnaquede seca. Para ello se lava el cartucho conhexano, seguido de metanol, agua mili-Q y fi-nalmente se hace pasar el tampón pH 7,0 (solu-ción de purificación). Se vierten entonces lasmuestras en los cartuchos y se les deja pasarlentamente. Antes de que acaben de pasar lasmuestras se debe ir lavando con agua mili-Q lasparedes del cartucho. Posteriormente, se les aña-de entre 2 y 2,5ml de solución de elución queserán recogidos en viales previamente pesados.El volumen recogido será pesado, y esta es lamuestra que será analizada en HPLC.

Análisis de folatos con HPLC

Previamente al análisis el sistema debe serestabilizado para lo que se hace pasar un gra-diente de acetonitrilo y tampón fosfato potásico30 mM, pH 2,2, reactivos que conforman lafase móvil, en la misma proporción con la quecomienza el gradiente para la separación de lasmuestras.

El tiempo de adquisición de datos en cadamuestra es de 15-30 minutos. Entre la inyecciónde una muestra y la siguiente se establece untiempo de estabilización del sistema que puedeoscilar entre 30 y 40 minutos. El flujo se fija en0,9ml/min. Dependiendo de las muestras el vo-lumen de inyección usado puede variar entre25-300 µl, aunque el volumen más común es de40 µl (Pfeiffer et al., 1997; Konings, 1999). El


sistema HPLC empleado (Merck-Hitachi, 7000)está equipado con una bomba cuaternaria degradiente, loop de inyección de 100 µl, sistemade muestreado automático, columna en interiorde horno con temperatura ajustada a 35º C, de-tector de fluorescencia con unos valores de ex-citación y emisión de 280 y 350 nm respectiva-mente, y detector de ultravioleta con una longi-tud de onda de 290 nm (LaChrom, Merck-Hita-chi). La columna usada es LiChrocart® 250-4mm, HPLC Cartridge, con precolumna: LiChro-cart®4-4, LiChrospher® 100 RP-18 (5 µm)guardcolumns, a fin de evitar la entrada de impure-zas.

Las formas monoglutámicas THF, 5-MTHFy 5-FTHF pueden ser detectadas tanto en eldetector de fluorescencia como en ultravioleta(Figura 2). El ácido fólico únicamente es visibleen el rango de ultravioleta.

Cuantificación:

La cuantificación está basada en un métodode estándar externo (Vahteristo, 1998). Se utili-za una recta de calibración. El área del picoproblema se obtiene sustituyendo en la ecua-ción de la recta. Las rectas y ecuaciones obteni-das para cada patrón son las siguientes: y =23.089x-12.916, para el THF; y = 36.762x-22.419, para el 5-MTHF; y = 1498,6x-1533,5,para el 5-FTHF; y = 111,94x-224,44 para elAF, en las que «x» representa la concentraciónen ng/ml e «y» representa el área obtenida en elcromatograma.

Test de recuperaciones:

Los test de recuperación fueron realizadospor adición de soluciones estándar a la muestraantes de la homogenización. Las muestras asímarcadas fueron sometidas al proceso comple-to. Las recuperaciones fueron calculadas deacuerdo con Rodríguez et al., 1995 comoR=(C

hallada-C

muestra)/C

añadida, donde C

hallada es la con-

centración en la muestra marcada, Cmuestra

es la

concentración en la muestra antes de marcar yC

añadida es la cantidad conocida de estándar aña-

dido.

Análisis estadístico:

Para ver la variabilidad de los resultados entrelos laboratorios y las formas de folato indivi-dualmente por MCR, y entre el método de HPLCy el método microbiológico se realizará un aná-lisis multivariante (ANOVA), aplicando nivelesde significación de p<0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Validación

La separación de las distintas formas mono-glutámicas es óptima mediante los detectores deultravioleta y fluorescencia (Figura 2 A y B).En el caso del detector de ultravioleta se obser-varon nítidamente las cuatro formas (THF, 5-MTHF, 5-FTHF y PGA); mientras que el detec-tor de fluorescencia no permitió observar elPGA, ya que no es sensible a la luz fluorescen-te. La columna usada es LiChrocart® 250-4 mm,con la que se consiguió una óptima separaciónde las diferentes formas. Para conseguir unamayor separación de los compuestos folatos delas impurezas, previa a la columna se colocóuna precolumna compatible: Lichrocart‚4-4. Lostiempos de retención, en minutos, para cada com-puesto eran repetibles y reproducibles y estabanfijados en: 8,58±0,05 para el THF, 10,65±0,038para el 5-MTHF, 15,85±0,01 para el 5-FTHF y16,72±0,01 para el PGA. La adición de antioxi-dantes como el ácido ascórbico y el 2-mercap-toetanol no interfiere en la detección de dichoscompuestos ni en sus tiempos de retención. Eluso de antioxidantes está indicado debido a lasusceptibilidad de los folatos en condicionesoxidativas. El más comúnmente usado es el áci-do ascórbico, pero tioles como el 2-mercaptoe-tanol o el ditiotreitol también están indicados.Se recomienda el uso de ácido ascórbico (2%)


Figura 2. Esquema de procesado en el método cromatográfico.


junto al 2-mercaptoetanol ya que aseguran laestabilidad de compuestos tan lábiles como el10-formil tetrahidrofolato y otros a pH 7,85, almismo tiempo que el ácido ascórbico otorgauna mayor estabilidad en estas condiciones al-calinas (Wilson y Horne, 1984).

Las recuperaciones obtenidas en la fase depurificación a través de los cartuchos oscilaronentre el 75 y el 100% para THF, 70-99% para 5-MTHF, 80-100% para el 5-FTHF y 99-100%para el PGA. Estas recuperaciones fueron veri-ficadas con diferentes estándares, marcando lasmuestras antes de la extracción, con las que serealizaban ensayos por triplicado y a diferentesconcentraciones. Recuperaciones menores del100% indican que los niveles de folatos deter-minados pueden ser demasiado bajos. Por otrolado, se han estimado altas variaciones en lasrecuperaciones de formas como el 5-MTHF en-tre diferentes productos lácteos, con lo que seutilizaron diferentes factores de corrección paracada alimento (Wigertz et al., 1997).

La estabilidad de las soluciones de patro-nes en stock era comprobada regularmente,previo a cada análisis por inyección de las so-luciones de trabajo en el sistema LC, a fin decomprobar que las concentraciones se corres-pondían con las determinadas cuando dichassoluciones fueron preparadas para su almace-namiento.

La respuesta del sistema fue lineal en el ran-go de concentraciones entre 0-100ng/ml paratodos los derivados folatos. Estos límites se es-tablecen porque es el rango que comprende losvalores o concentraciones que se estiman enalimentos. El límite de detección se establecióen 25 ng/ml en el caso de AF, de 2,11 ng/mlpara el 5-MTHF, 23,87ng/ml para el 5-FTHF y1,78 ng/ml para el THF.

La optimización del método cromatográficoha llevado a la selección del tampón de extrac-ción pH 7,85 con sodio ascorbato y 2-mercap-toetanol (Vahteristo et al. 1996 y Pfeiffer et al.1997). La enzima utilizada fue conjugasa deriñón de cerdo (Gregory et al. 1984), por ser sus

productos de desconjugación derivados mono-glutamatos. Esta enzima tiene un pH óptimo deacción de 4,9. Cada vez que es preparada debeser comprobada su actividad frente al ácido Pte-roilglutámico (PteGlu3). Una vez preparada se al-macena a -80ºC, con un tiempo máximo de alma-cenamiento en estas condiciones de 3 meses.

La adición de α-amilasa y proteasa fue indi-cada por autores como De Souza y Eitenmilleren 1990 y Martin en 1995, sobre todo para lapurificación de muestras con alto contenido enalmidón, como es el caso de los vegetales o deproteína como en el caso de muestras cárnicas.En este estudio la optimización del proceso lle-vó a la utilización de conjugasa únicamente,debido a los resultados más claros obtenidoscon esta enzima.

Tras el proceso de desconjugación, se pro-cede a la purificación de los extractos de mues-tra. El procedimiento de elección fue el inter-cambio aniónico fuerte (o SAX) combinado conSPE o extracción en fase sólida. Para ello, seutilizan cartuchos con lecho de resina (colum-nas LiChrolut®), para concentrar los folatos.Tras el paso de los extractos a través de dichoscartuchos, estos son recogidos con la soluciónde elución y quedan así preparados para su de-tección en el HPLC.

Aplicación en la valoración de la calidad nu-tricional de folatos en alimentos

La validación del método se llevó a cabomediante el análisis de los Materiales Certifica-dos de Referencia o CRM, siguiendo las indica-ciones de la FDA (2001) y de la IUPAC (Thomp-son et al., 2002). Dichos CRM, fueron someti-dos a los procesos de extracción, desconjuga-ción, purificación y separación, a fin de deter-minar y cuantificar las formas monoglutámicaspresentes en cada uno de ellos (Cuadro 2). Asíse puede comprobar que los datos obtenidos sonsimilares a los existentes en la bibliografía acer-ca de contenido de folatos en estos CRM (Figu-ra 3).


Comparando los datos procedentes de la téc-nica cromatográfica con los obtenidos medianteel método microbiológico (Konings et al., 1999)se observa que, en general, el contenido de fola-tos es superior en el método microbiológico.Este es el método Oficial aprobado de la AOAC,y que permite valorar el contenido de folatostotales en alimentos. Por su comodidad es elmétodo utilizado de forma usual (Finglas et al.,1993). Este método no puede diferenciar entreformas distintas de folatos. El organismo co-múnmente usado es el Lactobacillus rhamnosusvariedad Casei quien responde a la presencia demonoglutamatos, así como a los di y trigluta-milfolatos (Martín, 1995) pero con crecimientodiferente. No obstante, ciertos compuestos pue-

den estimular o inhibir el crecimiento bacteria-no dando lugar a resultados no reales. La ex-tracción de folatos de la matriz del alimentosigue un proceso similar en ambas técnicas, ba-sado en la extracción mediante un tampón fos-fato. Tras la extracción sigue el tratamiento en-zimático, la desconjugación y tras esto la siem-bra en placa de la muestra junto al microorga-nismo. Tras 18-22 horas de incubación a 37ºCse valora el crecimiento y se cuantifica la canti-dad de folatos totales. Así se demuestra que losmétodos usados anteriormente pueden no habersido aplicados con las óptimas condiciones deextracción (DeSouza et al., 1990, Pfeiffer et al.,1997, Tamura et al., 1997). El uso de métodosoptimizados para el análisis de folatos en ali-

Cuadro 2. Determinación del contenido de monoglutamatos en los diferentes materiales dereferencia

MCR Formas 1 2 3 Media±Ds Totalmonoglutámicas (µg/100g PS) (µg/100g PS)

Hígado de THF 402,78 436,1 429,77 422,63±17,70 674,93cerdo 5-MTHF 257,68 237,13 262,84 252,30±13,60

5-FTHF nd nd nd(487) AF nd nd nd

Leche en THF 0,69 1,04 0,41 0,66±0,32polvo 5-MTHF 23,31 23,63 17,63 21,33±3,38 90,00

5-FTHF nd nd nd(421) AF 67,54 72,52 64,20 68,01±4,19

Harina THF 12,05 6,06 9,42 8,83±3,00integral 5-MTHF 74,7 90,53 80,77 81,74±7,99 90,57


Mezcla de THF nd nd ndhortalizas 5-MTHF 218,43 199,95 213,61 210,52±9,59 210,52


MCR= material certificado de referencia.nd = no detectado ocantidades inferiores a los límites de detección (ver sección Validación)PS = peso seco.1, 2, 3 = ensayo por triplicado de las muestras.


Figura 3. Cromatograma obtenido mediante el detector de Ultravioleta (A) y Fluorescencia(B) de una mezcla de los estándares; THF = tetrahidrofolato; 5-MTHF = 5-metiltetrahidrofo-lato;

5-FTHF = 5-formiltetrahidrolato y AF = ácido fólico.


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mentos pueden tener como resultados unos da-tos más reales.

El interés del método cromatográfico (Figu-ra 1), en consecuencia, radica en el hecho deque es capaz de detectar y discriminar las dife-rentes formas monoglutámicas presentes en losalimentos analizados, lo que permite la cuantifi-cación de cada una de ellas por separado. Nu-merosos estudios han demostrado que la biodis-ponibilidad de los folatos presentes de formanatural en la dieta es menor que la del ácidofólico sintético utilizado para el enriquecimien-to de alimentos (Sauberlich et al., 1987, Brouweret al., 1999). Esto es debido a que los folatospresentes en la dieta están, en su mayoría, enforma de poliglutamatos conjugados y, como yase explicó, estos poliglutamatos deben ser des-conjugados hasta formas monoglutámicas parasu correcta absorción a nivel intestinal. El ácidofólico es una forma monoglutámica y esto ex-plica su mayor accesibilidad. De ahí que paraconocer la proporción real de folatos de la queel organismo va a disponer cuando se ingiere unalimento, lo ideal es conocer la cantidad de for-mas monoglutámicas y cuales son, puesto quela accesibilidad también depende del tipo demonoglutamato del que se trate. Este objetivose consigue con el método cromatográfico, loque es esencial para el conocimiento del aporteexacto de folatos de la dieta y si estos folatosserán realmente útiles para el organismo. Así,comparando nuestros resultados con los obteni-dos por otros laboratorios para los mismos CRM(Figura 4), utilizando los dos métodos, croma-tográfico y microbiológico, se observa que, engeneral, los resultados procedentes del métodomicrobiológico son superiores en todos los ca-sos, excepto en la muestra de hígado de cerdo(CRM 487). El hecho de obtener resultados másaltos mediante el método microbiológico es de-bido a que esta técnica sobrestima la cantidadde folatos totales, puesto que no discrimina en-tre las diferentes formas de folatos (Martin,1995), y además pueden existir determinadoscompuestos no folatos contenidos en la mues-

tra, que pueden estimular o inhibir el crecimien-to microbiano, con lo que pueden obtenerse da-tos no reales (Konnings, 1999). Los datos decontenido de folatos en nuestro laboratorio, sonmuy similares a los datos obtenidos por croma-tografía en los laboratorios de Suecia (LC1),Finlandia (LC2) y Holanda (LC3) en todos loscasos. No obstante, se puede observar que nues-tros resultados son siempre inferiores a los apor-tados por los laboratorios mencionados, en unrango de 2 al 30%. Esto puede deberse al hechode que en nuestro método optimizado solamen-te se utiliza la enzima conjugasa (no α-amilasani proteasa), y está demostrado que con el mé-todo trienzimático se obtiene una más completaextracción de los folatos desde la matriz de losalimentos (De Souza y Eitenmiller, 1990; Mar-tin, 1995). Así en el CRM de hígado de cerdo,el contenido en folatos totales obtenido en nues-tro laboratorio es algo inferior que en el restodebido a la no utilización de proteasa; lo mismoocurre con la harina integral al no añadir a-amilasa, ya que estas muestras son ricas en pro-teína y almidón respectivamente. En el caso delhígado de cerdo la diferencia entre los datos esmayor de 30%, pero también se puede ver en lagráfica que en este MRC la variabilidad de losresultados es mayor que en el resto de muestrasanalizadas. No obstante, los resultados presen-tan unos niveles aceptables de acuerdo a losresultados presentados de otros autores, tantoen el caso de método cromatográfico como me-diante el método microbiológico (Konnings,1999).

CONCLUSIÓN

Este método puede ser considerado como unmétodo fiable y reproducible para alimentos condiferentes matrices. Las estimaciones de formasmonoglutámicas en las muestras analizadas guar-dan una relación satisfactoria con los resultadosobtenidos por otros laboratorios en muestras si-milares. De esta manera, podemos afirmar quela optimización del método cromatográfico, pre-


sentada en este estudio permite unos resultadosfiables para la determinación de las distintasformas de folatos en alimentos de diferentesorígenes.

AGRADECIMIENTOS

A la Comisión europea por la financiacióndel Proyecto: «Folate: From food to functionali-ty and optimal health» (QLK1-1999-00576). AlMinisterio de Ciencia y Tecnología por los pro-yectos AGL2000-2482-CE y AGL2003-03598(Funcionalidad de los folatos naturales frente asuplementos en zumos de frutas y sopas de hor-talizas).

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