Diffusione e trasporto Matteo Paolucci Cenni storici

• 1828 Brown (botanico) descrive il moto di granelli di polline in un liquido (utilizza microscopio),

che prenderà il suo nome

o moto casuale a zig-zag; non è un moto vitale; brusco cambio di direzione

• 1905 Einstein pubblica un lavoro nel quale sostiene che la traiettoria erratica di una particella

sospesa in un liquido è il risultato di collisioni casuali con le molecole di liquido

molecole colpiscono particella ; granello è rivelatore di molecole o Einstein predice che il moto della particella è statisticamente regolare. La distanza

quadratica media aumenta linearmente nel tempo.

!

!

"x2# t

! equazione di Stokes-Einstein (vale per molecole sferiche):

!

"x2

= 2Dt

" D: coefficiente di diffusione o diffusività

!

D ="x

2

2t=m2[ ]t[ ]

= m2s#1 = cm2

s#1

Diffusione di una goccia di inchiostro in acqua

moto browniano dell’inchiostro che diffonde nell’acqua

se si prende in considerazione la sezione, all’inizio la goccia è concentrata nel punto 0 # sia al t1 che al t2

mantiene forma sferica perché la probabilità di muoversi è uguale in tutte le direzioni

quindi:

!

"x = "y = 0 # molecole diffondono in tutte le direzioni

ma

!

"x2

è un valore positivo

per un gas rarefatto

!

"x # t , per particelle più grandi (moto browniano)

!

"x2# t (distanze percorse sono più

piccole)

il mezzo deve essere uniforme (probabilità di urto in ogni punto del mezzo è la stessa) e omogeneo

!

D =K

B" T

6# " r "$ # cm2s-1

• r: raggio di Stokes della particella (r di molecole sferiche)

• !: viscosità del mezzo

numeratore: energia cinetica media delle molecole (Kb: costante di Boltzman)

• se è maggiore, la diffusione è facilitata (è infatti accelerata da un aumento di temperatura)

denominatore:

• r: se r aumenta, la diffusione viene rallentata # molecole grandi diffondono meno velocemente

rispetto a molecole piccole

• !: dipende da raggio molecolare e da densità del mezzo # diffusione è più veloce in mezzo meno

denso: più veloce in aria che in acqua (minore densità=meno urti)

Valori esemplificativi del coefficiente di diffusione D a 20°

Molecole PM (Dalton) Solvente D (m2s-1) note

Idrogeno 2 Aria 6,4 x 10-5

Ossigeno 32 Aria 1,8 x 10-5 aumento di r # aumento di PM (r è

proporzalla rad. cub. di PM) # D diminuisce

Ossigeno 32 Acqua 1,0 x 10-9 aumento ! del mezzo # D minore di 4

ordini

Glucosio 180 Acqua 6,7 x 10-10

Emoglobina 64 x 103 Acqua 6,9 x 10-11

esempio: quanto tempo impiega in media una molecola di ossigeno per diffondere in 1 cm di acqua? #

bisogna specificare T per avere D # 20°

!

t ="x

2

2D=

10#2( )

2

2 $ 1,0 $10#9( )

=10

#4m2

2 $10#9m2s#1

= 5 $10#4 s =13,9ore

diffusioni efficaci per distanze microscopiche; su distanze macroscopiche (mm, cm), i processi di diffusione

sono molto lenti (mezzo è immobile)

• negli organismi pluricellulari il trasporto è principalmente convettivo

o es.: trasporto ossigeno

! ventilazione polmonare

! circolazione sanguigna

Diffusione tende a rendere uguali le concentrazioni tra 2 compartimenti

J: vettore: va da concentrazione elevata a concentrazione minore

• flusso iniziale: max

• flusso è detto netto: si prende in considerazione la somma algebrica del flusso positivo e di

quello negativo

• si raggiunge un equilibrio dinamico (2 velocità sono uguali)

Legge di Fick

!

J = "D # A #$C

$x #

!

"C

"x=#C è il gradiente di concentrazione (grandezza fisica che varia a seconda

della distanza)

Flusso è direttamente proporzionale a:

• coefficiente di diffusione

• superficie A

• gradiente di concentrazione

segno - : gradiente è negativo, serve a far diventare positivo il flusso

gradiente lineare: concentrazione diminuisce linearmente con l’aumentare della distanza # per "x positivo, "C

è negativo # "C/"x negativo

secondo gradiente # in discesa, down hill

contro gradiente # no diffusione ma trasporto attivo (spesa energetica)

es.: cellula # molecola che diffonde nel citoplasma o all’esterno; per quanto riguarda il passaggio attraverso la

membrana, i mezzi sono diversi

• necessario conoscere la solubilità di x nei lipidi di membrana

## – coefficiente di partizione (solubilità relativa di una sostanza tra mezzo idrofobico e

acqua)

!

"x

=x[ ]

B

x[ ]A

supponendo che [x]A (fase acquosa) e [x]B (fase lipidica) siano in equilibrio

considerando il tutto come la reazione [x]A⇌[x]B

se x è idrofilica:

• reazione diretta: sfavorita

• reazione inversa: favorita

• v(AB)=k(AB)[x]A

• v(BA)=k(BA)[x]B

o se x è idrofilia, k(BA) è maggiore: [x]A!"[x]B

o all’equilibrio v(AB)=v(BA) - se k(AB) è minore, [x]A è maggiore; se k(BA) è maggiore,

[x]B è minore

Passaggio attraverso la membrana cellulare (2 fasi acquose separate da una fase lipidica)

gradiente efficace è dato da concentrazione alle due facce della membrana # [x]A’: concentrazione di x su

strato lipidico della membrana che si affaccia su A

• gradiente efficace:

!

"C =x[ ]

# A $ x[ ]

# B

%x

• dato che:

!

x[ ]" A = #

x$ x[ ]

A e

!

x[ ]" B = #

x$ x[ ]

B, allora

!

J = "Dx# A # $

x

x[ ]A" x[ ]

B( )

%x considerando "x (spessore della membrana) circa 5 nm

• k(p): coefficiente di permeabilità

!

kp =Dx " #x

$x

o quindi:

!

J = "kp # A # $C "C è la diversa concentrazione tra le due fasi acquose

Quanto più basso è il coefficiente di partizione, tanto più bassa è la permeabilità della membrana (ma influisce

anche il peso molecolare)

infatti la permeabilità dell’alcol metilico è maggiore di quella dell’alcol etilico, ma il suo coefficiente di partizione

è minore # alcol metilico è più piccolo

Diffusione di O2 e CO2

• processo passivo, secondo gradiente

• MAC membrana alveolo capillare

!: flusso di massa # quantità di gas che diffonde nella membrana per unità di tempo

K: coefficiente di diffusione di Krogh

Area di scambio è elevatissima: pari a quella di un campo da tennis

!

˙ M = K " A "#P

#x

"P: gradiente di pressione parziale

"x: spessore di membrana

"pO2=60 mmHg

"pCO2=6 mmHg

o ma i due flussi sono praticamente uguali

! K(CO2) è più elevata di K(O2) # K(CO2)>K(O2)

" CO2 è apolare, O2 è polare # maggiore solubilità di CO2 nei lipidi di

membrana

Diffusione attraverso canali nella membrana

proteine creano pori idrofilici nella membrana

• permettono passaggio di sostanze che non riuscirebbero a passare per diffusione nei lipidi # acqua,

ioni a basso PM

CANALI

• conferiscono una permeabilità selettiva alla membrana per specifiche molecole (Na+, K+, H2O, Cl-,

Ca++)

• la forza motrice per il movimento delle molecole è il gradiente elettrochimico (diffusione secondo

gradiente # passiva)

• sono proteine di membrana con domini idrofobici, che permettono l’ancoraggio nella membrana, e

domini idrofilici, che formano il poro (=tunnel idrofilico per il passaggio delle molecole)

o molecole antifiliche su superficie idrofobia (amminoacidi idrofobici)

o amminoacidi idrofilici in porzione di proteina che crea il tunnel

es.: aquaporina-2 (tubulo renale) – regolata dall’ADH

o

o o domini transmembrana: amminoacidi idrofobici (triptofano) e idrofilici (istidina, ac.

glutammico)

o si trova in membrane con alta permeabilità a acqua dovuta a loro funzioni

! in epitelio del tubulo renale

! in epitelio intestinale

! in eritrociti

! in epitelio del cristallino

H2O

! diffusione semplice attraverso spazi tra lipidi (via lenta, poco efficiente; lipidi

hanno permeabilità finita)

! attraverso canali (rapida, molto efficiente)

! forza motrice è gradiente osmotico

• di solito sono costituiti da varie subunità tenute insieme da legami non covalenti (tetrameri,

pentameri, esameri…). Ogni subunità=1 polipeptide

o diametro del poro aumenta con l’aumentare del numero di subunità

! tetrameri: altamente selettivi # ioni; voltaggio dipendenti

! pentameri: ligando selettivi

(# 2 subunità $ # 2 molecole di ACh)

! esameri: gap junctions

proteine connessine:

• 6 connessine # 1 emiconnessone su ogni cellula #

connessone

• vie di trasmissione di molecole (anche ATP) e corrente

elettrica

• la selettività dipende da fattori quali il diametro del poro e le cariche elettriche presenti sulla

superficie del poro (“filtro di selettività”)

o canale voltaggio dipendente per il potassio - sezione

! diametro grande all’imbocco, ma poi si restringe

! per poter passare attraverso la strettoia, lo ione si deve disidratare:

" potassio in H2O:

# raggio dello ione idratato è molto maggiore di quello

dello ione

" la prima reazione (disidratazione) non è spontanea # necessaria spesa

energetica; il costo energetico necessario a rimuovere l’acqua è quello

che seleziona gli ioni (es.: costo maggiore per il sodio rispetto al

potassio)

" costo è speso da cariche negative, che stabilizzano lo ione in forma

non idratata

" necessario comunque il gradiente per aver flusso netto; parte del costo

(non tutto) è recuperata da deidratazione

Si possono distinguere:

• canali sempre aperti (# permeabilità costitutiva) – canali di leakage

• canali regolati: stato chiuso/stato aperto (# permeabilità regolata)

o stato è conferito dai cancelli – gates (numero di cancelli è variabile per ogni cellula)

Canali

• voltaggio dipendenti: cancelli sensibili a voltaggio transmembrana

• legando dipendenti: cancelli sensibili a concentrazioni di legando (segnale chimico)

Classi di canali e relativi esempi

Canali sono alla base di moltissime funzioni cellulari!

• scambio di sostanze, motilità, trasmissione sinaptica, ritmicità…

Classi tipo attivato da permeabile a funzione

aquaporrina 1,2 - H2O permeabilità a H2O (tubulo

renale, eritrocita, cristallino)

canali

permanente-

mente aperti c. di leakage - Na+ K+ Cl- potenziale di membrana a

riposo

c. rap. del sodio Na+

delayed rectifier K+

potenziale di azione nella fibra

nervosa (e muscolare)

canali voltaggio

dipendenti

c. del Ca++ (vari

tipi)

"% (potenziale

elettrico

transmembranico) Ca++ secrezione (NT, ormoni,

enzimi digestivi, granule) e

potenziale azione (neuroni

invertebrati, fibra muscolare

cardiaca e liscia)

recettore

nicotinico

ACh (acetilcolina) Na+ e K+

(cationi

monovalenti)

trasmissione neuromuscolare,

trasm. sinaptica nei gangli

autonomici

KACh (secreto da

nervo vago #

parasimpatico)

GK K+ cellule pacemaker – neuroni

del SNC

recettore di

glutammato

Glu, NMDA, Kainato Na+ Ca++ sinapsi eccitatore del SNC (fa

aumentare attività elettrica

della cellula postsinaptica)

rec. di GABA

(acido gamma

aminobutirrico)

GABA Cl- sinapsi inibitorie del SNC (fa

diminuire attività elettrica

della cellula postsinaptica)

rec. di glicina glicina Cl- sinapsi inibitorie del midollo

spinale (se disattivato #

spasmi muscolari: tetano)

canali ligando

dipendenti

canale del Ca++

del reticolo

endoplasmatico

IP3 e altri (inozitolo

trifosfato – prodotto

intracellulare del

metabolismo dei

lipidi)

Ca++ mobilità cellulare (mitosi,

migrazione, avanzamento del

cono di crescita assonale)

Passaggio mediato da trasportatori – trasporto

conformazioni del trasportatore

• T(cis): trasportatore aperto in cis

• T(trans): trasportatore aperto in trans

• S: soluto

soluto in posizione cis non legato al trasportatore # formazione complesso attivato # soluto in posizione trans

non legato al trasportatore

cinetica della reazione:

cinetica di saturazione: dopo un certo valore, tende a raggiungere asintoticamente un massimo (J max)

si applica equazione di Michaelis-Menten (valida per enzimi e per trasportatori):

!

J =Jmax

" S[ ]S[ ] + K

m

Km: costante di Michaelis-Menten [mol/L]

• se [S] << (molto minore) Km # si trascura [S] al denominatore perché molto piccolo # J max e

Km sono costanti # J è proporzionale a [S]:

!

J =Jmax

Km

" S[ ]

o finchè [S] è molto piccolo, relazione tra J e S è lineare:

• se [S] >> Km # si trascura Km # J tende a J max

• se [S]=Km #

!

J = Jmax

"1

2

Proprietà comuni del trasporto passivo (no consumo di energia, secondo gradiente) e del trasporto attivo

(consumo energia, contro gradiente)

• più rapido che semplice diffusione (per concentrazioni basse); il soluto si lega alle proteine carrier

o però si raggiunge saturazione: velocità non può aumentare ulteriormente

• cinetica di saturazione

• specificità (addirittura fino a isomeri e stereoisomeri)

o es.: trasportatori del glucosio sono selettivi per D-glucosio (L-glucosio solo diffusione)

• inibizione competitiva da parte di molecole strutturalmente simili (es. fruttosio)

o a concentrazioni alte può bloccare siti di attacco del glucosio

! fenilchetonuria (malattia genetica) – mutazione del gene che codifica per

enzima che modifica amminoacido fenilalanina in tyr # ipofenilalaninemia

" fenilchetoni

" interferisce con trasportatori che portano amminoacidi a cervello #

mal sviluppo cerebrale (si può scoprire con test di Ames)

o competitiva: stessa forma, stessi punti di legame # invece inibizione non competitiva è

data da una molecola con diversa forma e altro punto di legame sul trasportatore, che

viene così modificato

Trasporto attivo e passivo

• attivo: contro gradiente – necessita di energia metabolica (ATP)

• passivo: secondo gradiente – non necessita di energia metabolica (ATP)

se si aumenta substrato, reazione è favorita

• [S] in cis diminuisce, [S] in trans aumenta

• diffusione avrebbe invece eguagliato concentrazione da entrambe le parti

Equilibrio dinamico # v1=v-1

• v1=k1[S][Tcis]

• v-1=k-1[STcis]

KD, costante di dissociazione:

!

KD

=kdissociazione

kassociazione

!

KDcis

=k"1

k1

;

!

KDtrans

=k2

k"2

o se K(D) è elevato # prevale dissociazione

o se K(D) è piccolo # prevale associazione

! TRASPORTO PASSIVO: KD CIS=KD TRANS

! TRASPORTO ATTIVO: KD CIS < KD TRANS

" in cis è favorita associazione e in trans è favorita dissociazione

[S]cis può essere minore di [S]trans

k1

k-1

k2

k-2

ATP

Trasporto attivo:

Trasporto passivo:

Trasporto attivo si divide in primario e secondario:

• primario:

o legato direttamente a metabolismo dell’ATP # POMPE

o pompa del sodio e del potassio – ATPasi Na+/K+ dipendente

! accumula K+ all’interno e Na+ all’esterno

! ogni 3 Na+ vengono trasportati 2 K+

• secondario:

o utilizza gradienti già presenti (es. ionici) per generare altri gradienti

o trasporto Na+ dipendente del glucosio (GLUT)

! gradiente di Na+ (accumulato all’esterno# va verso interno)

! non richiede direttamente ATP, ma gradiente di Na+ (però per creare gradiente

serve ATPasi Na/K dipendente)

nell’epitelio intestinale e nell’epitelio renale sono presenti entrambi i sistemi

o circuito di Na+ # esce con pompa e rientra con gradiente

! $: subunità catalitica

! #: subunità regolatrice (modula attività $)

! pompa genera differenza di potenziale elettrico transmembranico (eccesso di

cariche positive all’esterno)

" esterno elettropositivo

" interno elettronegativo

! uabaina: inibitore (bloccante selettivo e potente)

" veleno, ma utilizzata nei farmaci cardiaci

Ciclo ipotetico della ATPasi Na/K dipendente

Trasporto attivo secondario

Na dipendente

es.:

• trasportatore Na-dipendente del glucosio SGLT1

o epitelio intestinale, tubulo renale

• trasportatore Na-dipendente di amminoacidi

• trasportatore Na-dipendente del calcio

o muscolo scheletrico, muscolo cardiaco

Trasporto di amminoacido metionina

!

gradienteNa

+ =Na

+[ ]esternoNa

+[ ]interno;

!

gradienteMet =Met[ ]internoMet[ ]esterno

• Met si accumula all’interno e non all’esterno

o maggiore il gradiente di Na, maggiore è l’accumulo di Met

Trasportatori di glucosio (GT o GLT)

• G2 (lievito) GT4 (cellule muscolari embrionali)

• nell’adulto:

o GT1: Na-dipendente

o GT3

o GT5: insulino-dipendente

! insulina: ormone (pancreas) ipoglicemizzante # abbassa concentrazione

glucosio nel sangue (trasporta da esterno a interno cellule)

Meccanismi di stimolazione del trasporto del glucosio

• presente in muscolo scheletrico adipocita

Trasportatori degli amminoacidi

20 amminoacidi # 3 famiglie principali di trasportatori

• amminoacidi neutri

o A – am. piccolo e idrofilici (Na-dipendente)

o L – leucina e am. idrofobici (trasp. passivo)

o ASC – alanina, serina, cisteina (Na-dipendente)

• amminoacidi acidi (ASP, GLU)

• amminoacidi basici (ARG, LYS)

Metionina è trasportata per

o 60% da L # prevale trasporto passivo

o 20% da ASC e 10% da A # Na-dipendente

o 10% NS (non saturabile) # semplice diffusione (am. neutro)

Sintesi ATP

enzima ATP-sintetasi :pompa protonica

• membrana interna mitocondri

• sfruttando un gradiente di idrogenioni, generato da trasporto elettroni nella catena respiratoria, è

in grado di generare ATP

o proteina transmembrana F0F1

o funzionamento simile a dinamo

o 3 subunità catalitiche ($#)

Assorbimento sostanze nutritive nell’intestino

• passaggio da esterno (lume) a interno

o passaggio dei di/tripeptidi:

o passaggio di glucosio:

o lipidi (scissi da lipasi – enz. pancreatico) – resi solubili tramite sali biliari e colesterolo #

formazione micelle

o acqua – elevata permeabilità grazie a canali (aquaporina-1)

! 1 – via transcellulare

! 2 – via paracellulare (attraverso tight junction)

geni codificano per trasportatori

• possibili mutazioni possono dare intolleranze (es. fruttosio # gene codifica male per il

trasportatore)

Potenziale di membrana Matteo Paolucci Quantità di carica

• e-=-1,6 x 10-19 C

• Na+=+1,6 x 10-19 C

• Ca2+=3,2 x 10-19 C

Costante di Faraday: F=105 C

quantità di carica di una mole di ione monovalente: e- x N° Avogadro

Intensità di corrente: quantità di carica che passa per una sezione in una certa unità di tempo

!

I =Q

"t

!

Ampere =1C

1s

"

# $ %

& '

Legge di Ohm

• forza elettromotrice (differenza di potenziale) muove le cariche attraverso resistenze

o per convenzione I va da + a -, anche se sono gli elettroni a muoversi

o "V=I x R; R="V / I; [&=1V/1A]

• due tipi di resistenze:

o resistenze ohmiche

o resistenze non ohmiche

Condensatore: accumula cariche di segno opposto sulle due armature (separate da dielettrico # non c’è

passaggio di corrente)

• capacità: quantità di carica separata per una determinata differenza di potenziale

o C=Q/"V

Leggi di Kirchoff

• I: resistenze in serie – "V="V1+"V2+"V3

o differenza di potenziale totale è data dalla somma delle singole cadute di potenziale dopo

ogni resistenza

• II: maglie – la corrente entrante è uguale alla somma delle correnti uscenti

o caso specifico di legge della conservazione dell’energia

Cellula in soluzione fisiologica (# equilibrio osmotico)

in fisiologia per misura d.d.p. si usa oscilloscopio invece del voltmetro:

infilando l’elettrodo all’interno della membrana, si nota che l’interno è più elettronegativo rispetto all’esterno

(millivolt)

questo è un fenomeno locale di membrana: potenziale transmembranario

• misurabile solo a cavallo della membrana

• carica netta intracellulare è 0

• # chiamato potenziale di diffusione

potenziale è causato da diffusione di ioni (K+) secondo gradiente

• inizialmente K+ passa da A in B per ristabilire equilibrio (Cl- non può passare)

• dopo il passaggio di K+,

o in B c’è un eccesso di cariche positive (K+ > Cl-)

o in A c’è un eccesso di cariche negative (Cl- > K+)

• si genera un campo # E: potenziale elettrico

o "V=EA-EB

o vettore campo elettrico va in direzione opposta alla direzione degli ioni (va da B ad A)

o ad un certo momento il vettore diventa abbastanza grande da equilibrare il passaggio di

ioni

Legge di Nernst

!

EA" E

B= E

K+ =

RT

zFln

K+[ ]

B

K+[ ]

A

= "RT

zFln

K+[ ]

A

K+[ ]

B

EA-EB # all’equilibrio

EK+# potenziale di diffusione del potassio

z # valenza dello ione

!

EK

+ = "2,303RT

FLog

K+[ ]

A

K+[ ]

B

(in base 10)

Valori di 2,303 RT/F a varie T

°C 2,303 RT/F [mV]

0 54,20

10 56,18

20 58,17

30 60,15

37 61,54

Potenziale di equilibrio: potenziale elettrico quando c’è equilibrio tra forza chimica (A#B) e forza elettrica

(B#A)

• corrente è uguale a 0 quando il potenziale elettrico è uguale e opposto al potenziale chimico

Calcolo del potenziale di equilibrio di alcuni ioni fondamentali

concentrazioni ioni in cellula muscolare di mammifero a 30° [mmoli/L]

K+ Na+ Cl-

Interno 155 12 4

Esterno 4 155 120

Potenziale di equilibrio a 30° EK+= -60,15 log (155/4)! -97 mV

ENa+= -60,15 log (12/155)! +66 mV

ECl-= +60,15 log (4/120)! -90 mV

Nella maggior parte delle cellule il potenziale di membrana a riposo è molto vicino al potenziale di equilibrio del

potassio, perché la membrana è quasi esclusivamente permeabile al potassio

Potenziale di membrana a riposo è direttamente proporzionale a log[Kesterno]/[Kinterno]

• a potenziali molto negativi si discosta da previsioni perché interviene anche il sodio (potenziale

diventa meno negativo)

• sostituendo il sodio con la colina (infatti, mentre è impossibile sostituire ciò che è all’interno della

cellula, è facile cambiare ciò che è all’esterno # soluzione), il grafico segue perfettamente i valori

predetti

o catione come il sodio, ma non riesce a passare attraverso canali

• iperkalemia: aumenta concentrazione di K+ nel sangue # troppo K+ extracellulare

o varia il Ke # nel grafico, a diversi valori di Ke il potenziale di membrana è influenzato in

maniera diversa

Conduttanza g=1/R [Siemens, S]

I="V/R # I=g"V

Passaggio K+ attraverso membrana

IK+=gK+(Em-EK+) • gK+ # data da canale

• Em-EK+ # differenza tra potenziale di membrana e potenziale di equilibrio del potassio

o supponendo che

! Em=-20 mV

! EK+=-97 mV

IK+=gK+[-20-(-97)]=gK+(+77)

" ione si muove da interno verso esterno

o supponendo che

! Em=-97 mV

! EK+=-97 mV

IK+=0 # ione non passa: non basta il canale, per muovere lo ione c’è bisogno anche

di f.e.m.

o supponendo che

! Em=-110 mV

! EK+=-97 mV

ione si muove da esterno a interno # contro gradiente

Canali specifici per Na+ e K+ su membrana cellulare

quanto vale Em?

• IK+=gK+(Em-EK+)

• INa+=gNa+(Em-ENa+)

Em stabile quando la somma algebrica delle due correnti è 0

• IK++ INa+=0

o gK+(Em-EK+)+ gNa+(Em-ENa+)=0

Equazione di Goldman Hodgkin Huxley:

!

Em =gK

+ EK

+ + gNa

+ ENa

+

gK

+ + gNa

+

simile a media ponderata:

!

xP

=P1x1

+ P2x2

+ ...+ Pnxn

P1

+ P2

+ ...+ Pn

! è la media ponderata dei potenziali di membrana pesati sulle rispettive

conduttanze

! se conduttanza è uguale a 0 per uno ione # impermeabilità a quello ione

! pot. di membrana può variare rapidamente; variazioni # segnali

Potenziale di membrana

# Cambio rapporti di permeabilità:

• 1) gK+>> gNa+

• 2) gNa+>> gK+

• 3) gK+>> gNa+

Pompa sodio/potassio # elettrogenica

• contribuisce al potenziale di membrana

o debolmente in cellule nervose

o pesantemente in altre cellule

deficit di cariche positive all’interno; Em negativo • sodio può rientrare attraverso canale

• potassio può rientrare attraverso pompa

o # creazione corrente (IK+T e INa+T sono dovute al trasportatore)

quindi si ottiene un Em stabile se

IK++ INa++ IK+T + INa+T =0

Modello elettrico del potenziale di membrana

• circuito necessita di: batteria, resistenze, condensatore

• batteria del potassio: "V # Em-EK+

o se Em è 0, EK+ tende a far uscire K+

o infatti:

! canale # K+ all’esterno

! trasportatore # K+ all’interno

• batteria del sodio: "V # Em-ENa+

o se Em è 0, ENa+ tende a far entrare Na+

o infatti:

! canale # Na+ all’interno

! trasportatore # Na+ all’esterno

Ioni cloro – solo trasporto passivo

ECl-=Em

• a seconda della direzione Em, ICl- cambia direzione

• se Em=0 # ECl-=0: stessa concentrazione di Cl- all’interno e all’esterno

Generalmente le resistenze sono variabili

• permeabilità può cambiare in base a diversi fattori:

o canali voltaggio dipendenti: cambiano permeabilità a seconda del potenziale di

membrana

Fasi del potenziale di azione (fibra nervosa)

-

+

quando pot. supera il valore soglia, si innesca pot. d’azione

dopo innesco valore soglia, rapida depolarizzazione

durata del pot. varia a seconda delle cellula

• cellule nervose: molto rapido # trasmissione segnale

o processo molto rapido: può avvenire 500 volte in un secondo

• cellule muscolari cardiache # stimolo di contrazione

o 4-5 impulsi al minuto, dai 60 ai 200 al min.

Variazione di permeabilità della membrana

Em come media ponderata

depolarizzazione # rapido aumento conduttanza Na+

ripolarizzazione # rapida diminuzione conduttanza Na+ e aumento conduttanza K+

Conduttanza determinate da canali voltaggio-dipendenti

Potenziale soglia # si aprono canali voltaggio-dipendenti per Na+ (prima erano chiusi)

• fanno entrare Na+

o depolarizzazione ulteriore

! si aprono ulteriori canali

" ecc. # processo esplosivo; si arriva fino quasi a ENa+

Cellula si ripolarizza

• si aprono canali voltaggio-dipendenti del potassio

o “Delayed rectifier”: riporta pot. di membrana a riposo; stabilizzano pot. membrana a

valori negativi

• canali del sodio si inattivano (sono aperti ma un meccanismo impedisce passaggio ioni)

o conduttività per sodio diminuisce molto rapidamente

Introduzione alla fisiologia delle membrane eccitabili

• eccitabilità: capacità della membrana biologica di generare attivamente unsegnale elettrico in

risposta ad uno stimolo; si differenzia quindi dalla risposta passiva

• segnale: prende il nome di potenziale d’azione (spike=punta)

• potenziale d’azione si innesca solo se Em supera in certo valore soglia

• cellule in grado di generare un potenziale d’azione prendono il nome di cellule eccitabili (neurone,

fibra muscolare, cellule endocrine)

• ampiezza [differenza tra il potenziale a riposo e massimo potenziale depolarizzato] del potenziale

d’azione è indipendente da intensità stimolo # evento “tutto o nulla” (a differenza della risposta

passiva # proporzionale a intensità stimolo)

• fenomeno non lineare: effetto “crinale” # analogia con esplosione

• forma e durata del potenziale d’azione dipendono dal tipo di cellula

• al potenziale d’azione è sempre associato un periodo di tempo nel quale la membrana non è

eccitabile # periodo refrattario

o periodo refrattario assoluto (non è possibile generare nuovo spike)

o periodo refrattario relativo (membrana parzialmente eccitabile: si può creare nuovo

spike ma serve uno stimolo di intensità maggiore rispetto al primo # aumento del valore

soglia)

o # limita la frequenza con cui una cellula può generare impulsi

! p. r. assoluto determina durata massima del potenziale d’azione

• la fase di depolarizzazione rapida è dovuta all’attivazione di canali voltaggio-dipendenti del sodio;

la fase di ripolarizzazione è dovuta a due fattori:

o inattivazione dei canali del sodio

o attivazione ritardata dei canali voltaggio-dipendenti del potassio

Funzioni del potenziale di azione

• è il segnale elettrico nella membrana della fibra muscolare che innesca la cascata di eventi alla

base della contrazione muscolare (accoppiamento eccitazione-contrazione)

• è il segnale che induce il rilascio del neurotrasmettitore nei terminali sinaptici

• è il segnale che induce il rilascio di ormoni da cellule endocrine

• è alla base della conduzione dei segnali elettrici a lunga distanza nelle fibre nervose (assoni); a

differenza della conduzione elettrotonica (passiva), la conduzione del potenziale d’azione avviene

senza decremento, grazie al fatto che il potenziale d’azione si autorigenera lungo la fibra

(ampiezza costante)

• nelle fibre amieliniche il potenziale d’azione si autorigenera in ogni punto della fibra; nelle fibre

mieliniche il potenziale si autorigenera solo nei nodi di Ranvier. Nel tratto intendale il potenziale si

propaga tramite conduzione elettrotonica. In tal modo si raggiunge un compromesso “ideale” tra

velocità di conduzione ed efficienza.

o amieliniche # più lente

o mieliniche # più rapide

Modello cellulare

• Young (1936) scopre che lungo il filamento nel tentacolo del calamaro non è un vaso sanguigno,

bensì una fibra nervosa (assone) gigante; diametro 1-2 mm

• Cole e Curtis (1939) introducono un elettrodo nell’assone di calamaro

o elettrodo introdotto non tocca le pareti # misura potenziale transmembranario

o possibile spremere assoplasma fuori da assone # rimangono solo pareti

! si sostituisce citoplasma con altre soluzioni fisiologiche: forma del potenziale

con assoplasma o soluzione rimane la stessa (può cambiare solo altezza spike)

dimostrarono che la conduttanza della membrana (assolemma) aumenta di 40x durante il

potenziale di azione. Ciò sembra confermare la teoria di Bernstein, secondo la quale durante

il PDA avviene un “collasso” della barriera della membrana (membrane breakdown)

! ma pensavano a permeabilità indiscriminata a tutti gli ioni # Em sarebbe però

uguale a 0

• Hodgkin e Huxley (1939) scoprono che, all’apice del PDA, il potenziale di membrana acquista

valori nettamente positivi (# overshoot). Ciò contraddice la teoria di Bernstein

• Hodgkin e Katz (1949) dimostrano che il fenomeno dell’overshoot è determinato da ENa+ ed è

dovuto all’entrata di ioni Na+ durante il PDA

• Hodgkin e Huxley (1952) sviluppano la tecnica del Voltage Clamp (morsa di voltaggio) per

misurare gli spostamenti degli ioni in seguito a variazioni rapide del potenziale di membrana.

Scoprono che la depolarizzazione della membrana induce una corrente entrante (inward current)

seguita da una corrente uscente (outward current)

o Voltage Clump induce variazioni del potenziale di membrana a piacimento e consente di

mantenere un certo potenziale costante

o a certi potenziali costanti (variabile indipendente # x=Em) si misurano varie correnti

(variabile dipendente # f(x)=Im)

o late current rimane costante finchè non varia potenziale # canale potassio rimane

sempre aperto, e si chiude solo al variare del potenziale

o a riposo scorre corrente (canali leakage aperti) # viene sottratta dal modello, analisi

solo della corrente ulteriore # a riposo, I=0

o early current # portata da Na+

o late current # portata da K+

o curva è somma delle due curve di corrente del sodio e del potassio

! per vedere una delle due curve sostituirono Na+ con Colina (ione non

permeante)

" curva del sodio si ottiene per sottrazione da curva del potassio e di

entrambe (curva potassio ottenibile da sostituzione sodio con colina)

! INa+ # corrente entrante si attiva rapidamente: early current

! IK+ # corrente uscente più lenta; raggiunge valori massimi in tempi più lunghi:

late current – delayed rectifier

! corrente di potassio è continua, corrente di sodio va incontro a in attivazione

o Isolamento farmacologico – neurotossine (al posto di colina)

! TTX tetrodotossina (pesce palla); bloccante selettivo dei canali voltaggio

dipendenti del sodio (esperimento con TTX dà stessi risultati di quello con

colina)

" TEA ammoniotetraetile; bloccante selettivo dei canali del potassio

• Hodgkin e Huxley (1952) deducono che la permeabilità (conduttanza) della membrana per Na+ e

per K+ è una funzione del tempo e del potenziale di. La rivoluzione concettuale operata da H&H

consiste nel fatto di aver considerato la permeabilità al Na+ e al K+ come due fenomeni separati,

e di aver indicato il potenziale di membrana quale variabile che determina la permeabilità # due

meccanismi separati=superamento teoria del collasso

• H&H calcolano le costanti cinetiche per le variazioni della conduttanza

• questi esperimenti hanno permesso di definire le due proprietà fondamentali delle macromolecole

che oggi sappiamo essere alla base delle variazioni del potenziale di membrana: i canali ionici (i

canali ai tempi di H&H non erano conosciuti!)

o 1 – PERMEAZIONE: ognuna delle componenti della corrente obbedisce alle leggi di Ohm,

e il suo potenziale di inversione (reversal potential) è pari al potenziale di equilibrio

secondo Nernst

!

IIONE = gIONE (Vm " EIONE (Nernst))

gli spostamenti degli ioni avvengono esclusivamente per diffusione seguendo il

rispettivo gradiente elettrochimico; non interviene nessuna forza addizionale

o 2 – ATTIVAZIONE (GATING): le permeabilità a Na+ e K+ hanno un andamento

temporale completamente differente durante la depolarizzazione. Modificazioni delle

concentrazioni degli ioni cambiano la direzione del flusso di corrente, ma non

l’andamento temporale

! canali potassio # attivazione; formati da 4 particelle (gate) “n”

" il canale è aperto solo se tutte e 4 le particelle sono aperte

#

!

IK

+ = gK

+ " n4" Em # EK

+( )

n4 # probabilità (composta) che il cancello sia aperto

0'n'1; n(Em, t): funzione del pot. di membrana e del tempo

! canali sodio # inattivazione; formati da 3 cancelli di attivazione e uno di

inattivazione

" canale è aperto solo se sia i 3 che quello di inattivazione sono entrambi

aperti

#

!

INa

+ = gNa

+ "m3" h " Em # EK

+( )

andamento di m analogo ad n; andamento di h è speculare

TRASMISSIONE SINAPTICA

Sinapsi = zona di contatto tra 2 neuroni

• trasmissione:

o elettrica [muscolatura liscia, cellule epiteliali fegato]

o chimica (95%) [sistema nervoso centrale]

Trasmissione elettrica

o continuità citoplasmatica

o se si iniettano cariche positive, impulso depolarizzante passa anche in cellula

postsinaptica

o flusso è bidirezionale (stesso effetto con stimolazione di una o altra cellula)

o non rettificanti

o non esiste specializzazione morfologica delle cellule

Trasmissione chimica

o arrivo potenziale d’azione # rilascio neuro trasmettitore: traduzione del messaggio

elettrico in messaggio chimico

o cellula specializzata

! presin.: vescicole

! postsin.: recettori

o depolarizzazione o iperpolarizzazione in cellula postsinaptica è dovuta al

neurotrasmettitore

o flusso unidirezionale

Cellula neuronale:

depolarizzazione # flusso eccitatorio – E meno negativo

iperpolarizzazione # flusso inibitorio – E più negativo

equilibrio:

• ENa+ # depolarizzazione membrana tende a questo valore, ma non ci arriva: nel frattempo

apertura dei canali del potassio e chiusura dei canali del sodio

• EK+ # flusso verso l’interno è un flusso inverso che si genera per l’accumulo di cariche positive

all’esterno; quando si egualgliano i due flussi si raggiunge il potenziale di equilibrio

• considerando Em=-90mV, il gradiente elettrochimico del sodio è maggiore ("V=145 mV [-90-55])

# preponderante entrata di cariche positive

Sinapsi di tipo elettrico (presenza di connessine)

# 6 connessine = 1 connessone (contiene amminoacidi

con catene laterali neutre o idrofobiche # contatto con membrana)

ogni subunità attraversa la membrana ed è unita alle altre da un’ansa:

Motoneurone SNP

cellule di Schwann - gliali # assoni motori, rivestiti da guaina mielinica

bottoni sinaptici: zona di congiunzione tra assone e fibra muscolare # pieghe giunzionali con elevato numero di

recettori colinergici

• presinapsi:

o vescicole con neurotrasmettitore (acetilcolina ACh)

o zone dense

• postsinapsi

o recettore acetilcolina (ligando dipendenti, funziona da canale)

TRASMISSIONE COLINERGICA:

recettore-canale ACh ACh si lega a subunità $

selettivo sia a Na+ che a K+ (Na+ verso interno, K+ verso esterno)

M2: catena rivolta verso l’interno del canale # stesso amminoacido: Glu

SINAPSI CHIMICA – legame recettore # cambio istantaneo in postsinaptica

SINAPSI NEUROMUSCOLARE

nel terminale nervoso avvengono 2 eventi distinti

• potenziale di placca (canali recettori ACh) – supera sempre livello soglia

• canali voltaggio-dipendenti Na+

si sommano

• in presenza di curaro i recettori colinergici sono bloccati # si riduce sottosoglia il potenziale di

placca

Ampiezza del potenziale diminuisce con distanza da assone:

Divisione in segmenti neuronali:

• resistenze: canali passivi

• condensatore: membrana (capacità # separazione cariche)

"Vm=Im x R

!

"Vm

=Q

C capacità elettrica

!

µF

cm2

"

# $ %

& '

flussi ionici di dissipazione vanno diminuendo con la distanza:

o Rm # canali ionici passivi

o Ra # resistenza assiale (scontri ioni / volume citoplasmatico)

!

Ra

= ra" x

Costante di spazio

(: costante di spazio

!

"Vm

= "V0# e

$x /%

(: decremento del 37% di "Vm # 37% di "V0

individua la distanza x a cui corrisponde un "Vm pari al 37% di "V0

# proprietà passiva del neurone

Voltage Clamp

porta cariche positive all’esterno:

ne evita l’accumulo

• impedita genesi di un

potenziale d’azione,

ma è possibile

misurare i flussi ionici

mantenendo un nuovo potenziale di

riposo, si misurano i flussi entranti o

uscenti:

• Potenziale di placca o se Eepsp fosse dovuto a solo movimento di soli Na+

in realtà Eepsp è dovuto sia a Na+ che a K+; più si avvicina a potenziale di equilibrio della

specie ionica, meno corrente è generata

potenziale di inversione: media ponderata tra i 2 potenziali di equilibrio (ENa+= 55;

EK+= -100); Eepsp = 0 mV

prevalente potenziale sodio

# prevalente flusso di cariche entranti # allontanamento da potenziale sodio

SISTEMA NERVOSO CENTRALE

sinapsi più piccole (sinapsi neuromuscolare: 70 mV)

# processo di sommazione di potenziali eccitatori o inibitori:

• EPSP: excitatory post synaptic potentials

• IPSP: inhibitory post synaptic potentials

o asson hillock: numerosi canali volt dip. – presenti elementi che danno il via alla partenza

del segnale

! all’hillock deve arrivare un potenziale alto:

" sommazione

" poco decremento (necessaria alta ()

o ACh – a seconda del tipo di recettori, o eccitatori o inibitori (rec. muscarinici – muscolo

cardiaco)

ESOCITOSI – vescicole:

1 – citoscheletro

o mobilizzazione (entrata Ca++)

2 – compartimento di trasporto

o trafficking – targeting

3 – ancoraggio, “priming”

o zona attiva # formazione del poro di fusione # rilascio

! tutto il processo avviene in pochi ms (processi sovrapposti)

ancoraggio delle vescicole: proteine attorno a vescicole

a 1 mm

# con (=0,1 mm – necessarie

numerose sinapsi

priming: rendere competenti le vescicole alla secrezione

o trattamento e riconoscimento proteico

poro di fusione: specie molecolari su membrana

o vescicole riconoscono le proteine sulla membrana presinaptica

# formazione poro

EPP (potenziale placca) aumenta esponenzialmente con [Ca2+] – effetto cooperativo

[Ca2+] extracellulare # 10.000 [Ca2+] intracellulare

• Mg2+: inibitore competitivo Ca2+ # sposta verso destra la retta di proporzione

!

EPP " Ca2+[ ]

3,9

(proporzionale a)

Ponendo una fibra muscolare in soluzione a bassa concentrazione di Ca2+ extracellulare:

• stimolazione tramite elettrodo: rilascio quasi nullo di neurotrasmettitori

• aumentando [Ca2+]

o stimolo # rilascio neurotrasmettitori

o senza stimolo # non succede niente

o dopo stimolo # non succede niente

# [Ca2+] extracellulare deve essere presente prima del sopraggiungere dello stimolo

superficie presinaptica: zone dense condensate in Array

• canali Ca2+ voltaggio-dipendenti in corrispondenza dei siti di rilascio (maggiore efficacia)

• Ca2+ disancora vescicole

Clatrine avvolgono la membrana delle vescicole in endocitosi postsinaptica

• Dense-core: vescicole più grandi di quelle del SNC

• nel sistema immunitario, mastociti

o contengono istamina (esocitosi e endocitosi); rilascio dopo interazione con IgE

Esocitosi misurabile tramite misura della capacità elettrica

separazione cariche: CAPACITÀ 1f(femto)F=0,1 µm2

allo stesso tempo la membrana è misura della resistenza (canali)

"Vm= Q/C

esocitosi # aumenta dimensione della membrana: fusione delle vescicole

o # aumenta capacità

fusioni sono diverse: diversa grandezza delle vescicole

o nel momento in cui c’è un picco di capacità # picco di concentrazione Ca2+

Meccanismo di rilascio del neurotrasmettitori: quintale

MEPPS # potenziale di placca in miniatura

• in assenza di stimolazione, spontanei

potenziale d’zione su membrana postsinaptica dovuti a apertura di canali colinergici (flusso entrante di

Na+)

o attirati da neurotrasmettitori

! dipende da fusione delle vescicole

ogni depolarizzazione è un multiplo di un potenziale d’azione unitario (più piccolo riscontrabile: circa

0,4 mV), ma il potenziale di placca da -90 a -20 # -70 mV

MEPP: determinata da fusione di una singola vescicola

• non c’è risposta più piccola del MEPP

• anche a riposo c’è un’attività di base

durante un MEPP si aprono 2000 canali colinergici

1 MEPP=0,4 mV # 1 canale ACh=0,2-0,3 µV

per aprire un canale colinergico (5 subunità) servono 2 molecole di ACH

! una vescicola contiene all’incirca 5000 ACh # non tutto il neurotrasemttitore

arriva sui canali:

" diffusione

" degradazione enzimatica (ACh esterasi)

! il contenuto di una singola vescicola è definito QUANTO

! fusione vescicole: eventi indipendenti – tutto o niente – studiabili con leggi di

probabilità

" P: probabilità fusione; q: probabilità non fusione; P+q=1

" singola vescicola: P=1-q

" 2 vescicole: (P+q)2=P2+2Pq+q2

" 3 vescicole: (P+q)3=P3+3Pq2+3P2q+q3

in sinapsi neuromuscolare: P=0,7

• sinapsi periferiche (rapporto 1:1 presinapsi-postsinapsi):

bisogna garantire elevato fattore di sicurezza

in sinapsi SNC: P=0,1-0,2

• dipendono da sommazione temporali di molte sinapsi #

regolazione più fine

ampiezza MEPP:

o temperatura

o proprietà passive della membrana postsinaptica

! resistenza di membrana (meno canali # più resistenza)

! capacità

o numero di recettori presenti sulla membrana postsinaptica # sensibilità

Ca2+: non influenza l’ampiezza del potenziale unitario, ma la frequenza degli eventi di rilascio

Interazione vescicola/presinapsi (disancoraggio, mobilitazione, targeting)

• fosforilazioni regolano il funzionamento di alcune molecole (es.: canali)

o Ca2+ calmoduline (all’interno del liquido citoplasmatico della presinapsi)- kinasi che

fosforilano substrati (# sinaptofisina-P)

• fase di ancoraggio

o VAMPS (sinaptobrevine) espresse su membrana della vescicola

! interagiscono con proteine integrali (SNAP-25, Sintaxina) della membrana della

presinapsi (faccia citoplasmatica)

! formano SNARE complex: complesso recettoriale sensibile a NFS

! tossina botulinica # taglia VAMPS: impedisce la fusione della vescicola # non

c’è trasmissione alla postsinapsi

o Sinaptotagmina (su vescicola)

! recettore Neurexina su presinapsi

! implicate nella formazione del poro di fusione

! tossina: latrotoxina (impedisce la formazione del poro)

" fa uscire le vescicole massicciamente ma non le fa rientrare per

endocitosi: prima spasmo poi paralisi

• fusione vescicole # attacco su membrana e rilascio del neurotrasmettitore attraverso il poro – 2

modalità:

o completa: fusione completa e riformazione vescicole per endocitosi

o kiss and run: chiusura poro transiente e conservazione vescicola (dipende dal corredo

molecolare sulla membrana)

nella stessa sinapsi sia fusione completa che kiss and run

vescicole in presinapsi: organizzate in compartimenti

Ampiezza dipende da proprietà passive del neurone

!

"Vm

= "V0# e

$x /%

COSTANTE DI SPAZIO

• caso 1 – ( (0,1 – 1 mm)

( troppo piccolo # non si sommano – non c’è impulso

• caso 2 – (=1 mm

A e B integrati da SOMMAZIONE SPAZIALE

COSTANTE DI TEMPO (altra caratteristica passiva dei neuroni)

# processi di sommazione temporale

dipende da caratteristiche passive della membrana

• se membrana fosse solo una resistenza:

direttamente proporzionale a I

• ma membrana è anche capacità (separazione delle cariche interno/esterno):

se avesse solo caratteristiche di capacità # aumento separazione cariche

• dato che la membrana ha sia caratteristiche di resistenza che di capacità:

all’inizio si comporta come capacità:

! impulso va a modificare la quantità di carica ai lati della membrana # deposita

cariche positive all’interno

ma cariche tendono a scorrere attraverso i canali ionici (# resistenze)

Costante di tempo:

!

"Vm

= Im# R # 1$ e

$t /%( )

!

" = R #C - rappresenta il tempo al quale il "V(m) equivale al 63% del valore del "V(m) finale

o ( # fase discendente – decadimento "V

o ) # fase ascendente – aumento "V

con il perdurare della corrente, sempre meno cariche saranno disponibili per la separazione,

e sempre più cariche saranno disposte ad attraversare le resistenze

# capacità regola la velocità di variazione del "V(m)

! velocità di variazione del "V(m) decresce con il tempo

! ) oscilla tra 1 e 20 msec

un neurone con costante di tempo elevata tende a favorire la sommazione degli impulsi

Fisiologia Muscolare Matteo Paolucci Muscoli: 40% massa corporea

• generano forza: movimento F=m*a

• opposizione ad altre forze

o (estensioni gambe, dorso, collo:opposizione a gravità)

o tono vasomotore:impedisce dilatazione vaso dovuta a pressione sanguigna (muscoli lisci)

Muscolatura:

• liscia (involontaria):

o apparato gastrointestinale (peristalsi): tubo, sfinteri

o apparato genito-urinario

o vie respiratorie

o muscoli oculari interni (muscolo ciliare # muove il cristallino, muscolo pupillare #

restringe e allarga la pupilla)

• striata:

o scheletrica (volontaria): muscoli scheletrici (origine e inserzione su scheletro), muscoli

oculari esterni

o cardiaca (involontaria)

Proprietà cellule muscolari: • eccitabilità (fenomeno elettrico): capacità di rispondere a stimoli generando potenziale d’azione

• contrattilità (fenomeno meccanico): capacità di generare contrazione muscolare # forza

# accoppiamento elettro-meccanico

differenze nei tipi muscoli dell’origine dello stimolo:

• scheletrico: deve essere innervato; stimolo non originato nel muscolo ma dal sistema nervoso

(anestesia # inibizione nervi # paralisi # desensibilazione)

• cardiaca e liscia: stimolo intrinseco proveniente dallo stesso muscolo # cellule modificate

(pacemaker)

Sarcomero: unità anatomo-funzionale (unità che da sola è in grado di svolgere tutte le funzioni dell’organo,es:

alveolo, neurone etc)del muscolo; porzione di fibra muscolare compresa tra due linee (linee Z) visibili in

sezione al microscopio elettronico

Due tipi di filamenti:

-sottili (composti di actina, proteina

filamentosa)

-spessi (proteina miosina)

+titina

-filamenti sottili si inseriscono sulle linee Z

(circolari # nel piano è un disco; si

inseriscono come “setole in spazzola”)

-filamenti spessi non ancorati su linee Z

# filamenti sottili e spessi sono parzialmente

sovrapposti # bandeggio del sarcomero

Bande:

• I: isotropa (zona adiacente a linee Z, no sovrapposizione di filamenti sottili e spessi, prende due

emisarcomeri adiacenti)

• A: anisotropa (zona di sovrapposizione, al centro della banda A solo filamenti spessi # banda H

# al centro di tutti i filamenti spessi passa linea M)

#alternate nel sarcomero

varie ipotesi di contrazione (# avvicinamento linee z):

• accorciamento dei filamenti

• teoria dello slittamento dei filamenti: aumenta il grado di sovrapposizione attraverso lo

scivolamento degli uni sugli altri # teoria corretta

MIOSINA E ACTINA

Miosina: proteina filamentosa – dimero formato da 2 catene pesanti (200 kDa ciascuna); ad ogni catena

pesante sono associate 2 catene leggere (20 kDa)

• catene pesanti:

o porzione a bastoncello ($-elica) – coda filamentosa

o estremità globulare (testa)

o tra le 2 porzioni: collo

o teste di miosina protendono lateralmente in ogni punto del filamento spesso (vedi fig. B)

o catene leggere: funzione regolatrice

Actina: polimero formato da monomeri di actina, tenuti insieme da legami non covalenti

• filamenti sottili: F-actina (filamentosa)

o polimero avvolto a coiled coil

• monomeri: G-actina (globulare)

o monomeri possono associarsi solo in un determinato orientamento

filamento sottile

filamento spesso

hanno estremità + e -: determinano direzione del movimento delle teste di miosina

• proteine regolatrici associate ad actina:

o complesso della troponina

o tropomiosina (filamentosa) – non parallela al filamento sottile, ma lo avvolge

! si inserisce nelle 2 scanalature tra i 2 filamenti

3° filamento: proteina che si estende dalla linea M alla linea Z: TITINA (vedi fig. B)

• determina lunghezza a riposo del sarcomero # è elastica

contrazione:

• diminuisce distanza Z-Z

• accorciamento banda I

• banda A rimane costante

teste di miosina camminano sui filamenti di actina

CICLO DELLA CONTRAZIONE MUSCOLARE

rigidità muscolare:

o attiva

o rigor mortis

Legge di Hook (molla)

!

F = "k#x

ritorno elastico (elastic recoil)

ioni Ca2+:

• azione su miosina (testa # siti enzimatici ATP-asi)

• azione su troponina c (associata con actina) # sensore-interruttore Ca2+ dipendente

Miosina: ATP-asi calcio-actina dipendente

o senza: 1 scissione ogni 30 sec.

Cinetica sigmoide:

o a basse [Ca2+], aumento V è esponenziale – effetto cooperativo

o poi porzione lineare fino a saturazione

percentuale di saturazione dei siti di legame coincide con velocità di consumo dell’ATP

o al di sotto della soglia si ha praticamente una forza nulla

movimento asincrono delle teste:

o forza generata durante power stroke

! se tutte le teste lavorassero sincronicamente, movimento sarebbe a scatti

movimento sincrono nel miocardio

Motori molecolari

• macchine proteiche che generano forza o energia da energia chimica (ATP)

• 2 famiglie:

o lineari

! su elementi del citoscheletro:

" sarcomero # MIOSINA (direzione lineare delle teste di miosina)

" trasporto di vescicole # KINESINE, DINEINE (trasp. assonale

anterograda/retrogrado)

" fuso mitotico (trasporto di cromosomi)

! su acido nucleico: ribosoma su mRNA

o rotativi:

! ATP-sintetasi

! flagelli dei batteri e code spermatozoi

• motori lineari # processività:

o movimento deve essere sempre nella stessa direzione

o passo: power stroke – 10nm (working distance)

MECCANICA MUSCOLARE

muscolo: elasticità passiva # molla

Isteresi elastica

scossa muscolare – twitch – facendo passare una scossa elettrica attraverso il muscolo

contrazione tetanica: forza mantenuta a lungo

• contrazione continua

latenza: espressione della cascata biochimica fino all’attivazione del ciclo muscolare

contrazione avviene solo se lo stimolo supera la soglia del potenziale di azione

aumentando l’intensità dello stimolo, aumenta l’intensità del twitch fino a un valore massimo di forza

# le cellule hanno diversi valori soglia (alcune lo hanno più alto)

Relazione temporale tra potenziale d’azione, concentrazione intracellulare di calcio e contrazione nella fibra

muscolare

o accoppiamento eccitazione-contrazione

sommazione temporale --<> contrazione tetanica (tetano muscolare)

• ogni scossa dura 200-300 ms con pochi ms di refrattarietà (meno degli intervalli dei cicli)

• impulsi al secondo: Hz

o 2/s – 1 stimolo ogni 0,5 s

o 10/s – 1 stimolo ogni 100 ms

o 50/s – 1 stimolo ogni 20 ms

• andamento del [Ca2+] segue l’andamento di ogni forza:

o transienti # nel twitch

o oscillazioni # tetano imperfetto

o concentrazione elevata stabile # tetano perfetto

è [Ca2+] che determina il tipo di forza

• 50 Hz: frequenza della corrente elettrica # induce corrente tetanica in chi subisce una scossa

Contrazione:

• isometrica

o lunghezza del muscolo non cambia # generazione di forza senza accorciamento

• isotonica

o accorciamento # forza generata costante

!

F = "k#x - contrazione si può esprimere come: • F # pura forza

• "x # puro accorciamento

• L(0): lunghezza propria muscolo – stirato passivamente

• F attiva: curva a campana

o generata da stimolo elettrico

o L*: lunghezza ottimale del sarcomero per cui la forza è massima # 2,2 µm (sarcomero)

! permette interazione ideale tra actina e miosina

! cuore: dilatandosi aumenta l’efficienza sistolica # volumi maggiori # portano a

lunghezza ottimale

" cuore con scompensi: dilatato oltre lunghezza ottimale

• F passiva + F attiva = F totale

• titina responsabile di curve a campana: se stesa troppo o troppo poco si perde in efficienza

o efficienza dei cicli di contrazione muscolare # titina

CONTRAZIONE ISOTONICA

sul muscolo agisce una forza costante

legge di Hill:quanto più grande è la forza peso, tanto più lento è l’accorciamento

quanto più è piccola la forza peso del carico, tanto è più rapido l’accorciamento

relazione asintotica (iperbolica) velocità/carico

o P(0): peso esattamente uguale alla forza massima che il muscolo può generare

o *: rottura dei ponti trasversali

o P: forza peso del carico

velocità: accorciamento "x in un determinato t

P(0) in contrazione isotonica corrisponde ad una contrazione isometrica (non c’è più accorciamento)

• contrazione isometrica è condizione particolare della contrazione isotonica

aumentando il peso oltre P(0) # muscolo si allunga (stirato) # V negativa

• oltre punto critico, rottura dei ponti trasversali

!

V =b " (P

0# P)

P + a

• P: variabile indipendente

• P(0): carico massimo (isometrico)

• a e b: parametri determinati sperimentalmente

o sono quelli che danno il miglior fitting

metodo statistico di fitting: somma degli scarti quadratici minimi; da vari punti sul grafico si ricava la

linea più simile

o valori non sono esattamente quelli che ci si aspetta (non giacciono esattamente sulla

curva) # errori di misura

• se P=P(0) # V=0

• se P=0 # V=V max= (b/a)*P(0)

forza esercitata nel power stroke # sposta il filamento sottile di un determinato passo ("x)

• se "x è percorso in poco t # V è alta

o c’è meno tempo di generare forza

• se "x è percorso in t alto # V è bassa

o c’è più tempo di generare forza

Muscolo papillare isolato (parete del miocardio)

• condizioni isotoniche

• frequenza di stimolazione: 1/s

in presenza di adrenalina:

! a carico costante, V di contrazione aumenta

! a V costante, forza di contrazione è maggiore

# aumenta V o forza di contrazione generata

MUSCOLATURA LISCIA (apparato gastrointestinale, parete dei vasi sanguigni, vie respiratorie, muscoli oculari

interni, apparato genito-urinario)

Particolarità della muscolatura liscia:

LISCIA SCHELETRICA

contrazione muscolare iniziata da:

• potenziale d’azione

• attivazione di recettori di membrana da

parte di antagonisti (acetilcolina,

noradrenalina)

contrazione iniziata dal potenziale d’azione nel

sarcolemma

attivatori della contrazione: aumento [Ca2+] nel

citosol e PKC (parete dei vasi – protein kinasi C)

attivatore della contrazione: aumento [Ca2+] nel

citosol

rilascio di Ca2+ mediato da:

• RyR

• IP3-R (inosil fosfato)

• canali voltaggio dipendenti del

sarcolemma

• scambiatore Na+/Ca2+

rilascio di Ca2+ da parte del recettore di Ryr

(rianodina) dal reticolo sarcoplasmico

velocità dei cicli regolata da fosforilazione delle light

chain LC20 della miosina

velocità dei cicli regolata da [Ca2+] – [calmodulina]

modificazione covalente della miosina (fosforilazione

LC20) # MCLK/miosina fosfatasi: enzimi che regolano

la fosforilazione della miosina

• MCLK: kinasi # fosforila # cicli veloci

• fosfatasi # defosforila # cicli lenti

attività ATP-asica della miosina; nessuna

modificazione covalente della miosina (P: rimane

imprigionato nella tasca che lega ATP)

complesso Ca2+-calmodulina attiva MCLK Ca2+:

• aumenta attività ATP-asica della miosina

• causa cambio conformazionale del

complesso troponina-tropomiosina

muscolo liscio non genera movimenti rapidi, ma forze costanti

• es.: pareti vasi

o forza costante per contrastare pressione che tende a dilatare i vasi

o movimento del sangue dovuto a pressione, non a muscoli

• apparato digerente:

o onde di contrazione lenta # generano peristalsi – movimento del bolo alimentare nella

direzione appropriata