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Biofarmaci verdi
Eugenio Benvenuto Laboratorio Biotecnologie Unità Tecnica Biologia delle Radiazioni e Salute dell’Uomo ENEA, Roma, Italy Firenze, 4 ottobre, 2013
Plant as Natural Bioreactectors
De materia medica è un trattato di medicina e botanica del I secolo d.C., scritto dal medico greco Pedanius Dioscor ides o Dioscoride. Descrizione di 500 piante Insieme alla preparazione di circa 1000 semplici semplici rimedi farmaceutici Rimane come testo base per 1500 anni
Taxus
What is Taxol? Taxol is an anti-cancer ("antineoplastic" or "cytotoxic") chemotherapy drug. Taxol is classified as a "plant alkaloid," a "taxane” "antimicrotubule agent. Paclitaxel
Plant as Natural Bioreactors
Plant as Natural Bioreactors
Catharanthus roseus Vinca alkaloids: Vincristine Vinblastine Vinorelbine
Plant as Natural Bioreactors
Digitalis purpurea Digitalis lanata Cardiac glycosides: digitoxin digoxin
Plant as Natural Bioreactors
Artemisinin
Digitoxin
Vincristine Paclitaxel
< 1000 dalton molecules > 100 PLANT-DERIVED PHARMACEUTICALS
WORLDWIDE
74% DISCOVERED FROM MEDICINAL PLANTS
Large scale production of biomolecules through genetic mod i f i c a t i o n o f p l a n t o r organelle genome The terms refer to agricultural applications due to the use of crops as biofactories for the production of high-added value molecules
‘Molecular farming’
“La pianta come biofabbrica “
Produzione su larga scale di molecole ad alto valore aggiunto
Vs
Metodi di Fermentazione Classica
Proteine di interesse farmaceutico prodotte in pianta
Adattato da Ma et al. 2003, Nature Reviews Genetics 4, 794-805
Hum
an
biop
harm
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acci
nes
Protein Host plant system Comments Growth hormone tabacco, sunflower In chloroplast ~ 7% TSP Human serum albumin tabacco, potato Full size, in chloroplast ~ 11% TSP
-interferon rice, turnip First pharmaceutical protein produced in rice Erytropoietin tobacco In suspension cells Human-secretd lkaline phosphatase tobacco In roots and leaves Aprotinin maize In seeds Collagen tobacco Correct modification of structural-protein polymer
1-antitrypsin rice In rice suspension cells IgG1 (Phosphonate ester) tobacco Correct assembling by crossing plants IgM (neuropeptide hapten) tobacco Accumulation in chloroplast SigA/G tobacco Complex assembling of a secretory antibody by plant
crossing scFv-bryodin 1 immunotoxin (CD 40) tobacco Recombinant antibody in cell-suspension culture IgG (herpes virus simplex) soybean In seeds LSC (herpes virus simplex) Chlamidomonas reinhardtii In algae Hepatitis B virus envelope protein tobacco In clinical trial Rabies virus glycoprotein tomato Potential edile vaccine Escherichia coli heat-labile endotoxin tabacco, potato In clinical trial Norwark virus capsid protein potato In clinical trial Diabetes autoantigen tabacco, potato In leaves and roots Cholera toxin B subunit tabacco, potato In chloroplast Cholera toxin B and A2 subunits + rotavirus endotoxin + E. coli fimbrial antigen
potato Multivalent recombinant antigen for enteric disease
Porcine transmissible gastroenteritis virus glycoprotein S
tabacco, mais For animal vaccination
Proteine ricombinanti prodotte in pianta in sperimentazione clinica
Everett et al. 2012, BioProcess International, 10(1): 16-26
* Lombardi R, Villani ME, Di Carli M, Brunetti P, Benvenuto E, Donini M. Optimisation of the purification process of a tumour-targeting antibody produced in N. benthamiana using vacuum-agroinfiltration. Transgenic Res. 2010;19(6):1083-97.
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico
Buone rese
Trasformazione del cloroplasto circa 20% TSP
Trasformazione nucleare 0.5% - 2% TSP (semi)
Sistemi transienti * 27% TSP corrispondenti a 15-20 mg proteina purificata/kg foglie
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico
Buone rese
Fattori che influenzano i livelli di espressione:
• caratteristiche della proteina
• codon usage
• sequenze regolatorie utilizzate
• sistema di espressione utilizzato (stabile o transiente)
• tipo di DNA trasformato (nucleare o plastidico)
• numero di copie inserite (per la trasformazione nucleare)
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico:
• assemblaggio di proteine complesse come gli anticorpi
• modificazioni post-traduzionali
Batteri: Assenza di glicosilazione Lieviti: Aggiungono N-glicani altamente immunogenici costituiti da catene di mannosio lunghe fino a 100 residui Cellule di mammifero: Possono contenere zuccheri ‘non umani’, come l’acido N-glicosilneuramidico, forma di acido sialico, (in cellule CHO) o l’α-(1,3)-galattosio terminale (in cellule murine)
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico
Buone rese
• trasformazione stabile: 2-3 mesi
• trasformazione transiente: 2-3 settimane
Tempi di produzione ridotti
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico
Buone rese
Stima dei costi di produzione in piante di mais: 10-100 $ per grammo di proteina
equivalenti a:
2-10% fermentatori microbici 0.1% culture di cellule di mammifero
Costi minori
Tempi di produzione ridotti
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico
Buone rese
Costi minori
Tempi di produzione ridotti
Assenza di contaminanti potenzialmente patogenici Le piante sono esenti dai rischi legati alla utilizzazione di sistemi di produzione di origine animale endotossine
virus, prioni, DNA oncogenico
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico
Buone rese
Costi minori
Tempi di produzione ridotti
Assenza di contaminanti potenzialmente patogenici
Impiego di piante edibili
Ottimizzazione del sistema di produzione in condizioni controllate
Serra a contenimento di classe 2
Sistema di coltivazione in condizioni idro-aeroponiche
-‐ Insulin -‐ Diabetes (SemBiosys; transgenic safflower) -‐ Interferon-‐alpha – HepaDDs C (Biolex, USA; Lemna)
Human Vaccines: Therapeu:c Proteins: Veterinary Vaccines: Therapeu:c enzymes:
Phase I trial
Phase II trial
Phase III trial
FDA approval veterinary
FDA approval therapeu:c
FDA approval vaccine
Plant as Biofactories: Vaccines & Therapeutic proteins in clinical trial/FDA approval
-‐ Pandemic and Seasonal Influenza (Medicago, Canada; agro-‐infiltrated tobacco) -‐ Norovirus (C. Arntzen, USA; transgenic potato)
-‐ Newcastle Disease (DowAgroScience, USA; tobacco cells)
-‐ Glucocerebrosidase – Gaucher’s disease (Protalix, Israel; Carrot cell culture; Phase III-‐FDA’s expanded access program, full licensure being sought)
Tecniche di espressione di proteine eterologhe in pianta
gene
nucleo
TRASFORMAZIONE STABILE
TRASFORMAZIONE TRANSIENTE
(EPICROMOSOMALE)
gene
cloroplasto
citoplasma
Agrobacterium tumefaciens
Agroinfiltrazione
Sistemi di espressione transiente
Virus vegetali Potato Virus X
comparsa sintomi infezione
estrazione e analisi
purificazione
2 giorni
2 giorni
7-10 giorni
7 giorni
1 giorno
2 giorni
mAbH10 yield aLer Agroinfiltra:on of N. benthamiana plants with silencing suppressor p19 from AMCV
Circelli P et al 2010
Environmentally contained
greenhouse and vacuum
AgroinfiltraDon chamber at ENEA
Agroinfltra:on of An:body genes & Silencing Suppressor
* Lombardi R, Villani ME, Di Carli M, Brunetti P, Benvenuto E, Donini M. Optimisation of the purification process of a tumour-targeting antibody produced in N. benthamiana using vacuum-agroinfiltration. Transgenic Res. 2010;19(6):1083-97.
I vantaggi della produzione in pianta
Sistema di espressione eucariotico
Buone rese
Trasformazione del cloroplasto circa 20% TSP
Trasformazione nucleare 0.5% - 2% TSP (semi)
Sistemi transienti * 27% TSP corrispondenti a 15-20 mg proteina purificata/kg foglie
Plant-based production of biopharmaceuticals: two different antibodies
!1. Anti-cancer Antibody
!2. Anti-fungal Antibody
Tenascin-C :
EGF-like domains Fibronectin type-3 homology repeats
Alternatively spliced domains
Large isoform:
Undetectable in healthy adult tissues;
Localized around vascular structures in the tumor stroma of a variety of different tumors (lung, gliomas, breast cancer)
Tenascin-C is a tumor marker
mAb H10
Large hexameric glycoprotein. Alternative splicing leads to a small and a large isoform with distinct biological functions.
Tenascin-C :
Human germline constant regions genes
Fully human IgG1 H10
Phage-displayed human scFv(H10)
Selection of an anti-tenascin C antibody and expression in plant
Plant produced mAb H10
VH VL
scFv(H10)
Transgenic lines
OD
405
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
3*3 5*1 6*3 8*1 7*4 7*6 6*4 8*3 8*4 12*3 positive
Quantitative and functional ELISA of IgG(H10) expressing lines on tenascin-C coated plate.
Best expressor: 0,7% TSP.
-100
0
100
200
300
400
-100 0 100 200 300 400
RU
Res
pons
e
s Time
Chip: IgG(H10) 3000 RU
Mouse tenascin-C
80 nM
375 nM
750 nM
3 µM 1,5 µM
• KD of 14 nM for recombinant tenascin-C.
Plant-produced IgG1 is fully functional"
U87 glioblastoma xenograft"
Negative control 20x"
H10 2µg/ml 20x"
Negative control 20x"
H10 2µg/ml 20x"
mAbH10 yield aLer Agroinfiltra:on of N. benthamiana plants with silencing suppressor p19 from AMCV
Expression Yield: 640 mg/Kg FW
Days post Agroinfiltration
+p19 –p19 +p19 –p19 +p19 –p19 +p19 –p19
Western Blot of extracts from leaves Agroinfiltrated with or without the viral p19 gene silencing suppressor protein
Anti-γ Anti-λ
• Sampling time influences antibody accumulation and integrity
Circelli P. et al 2010
Final Yield: 40mg/Kg
mAb Purity: 99.4%
Endotoxin: < 1 EU/ml Detection
Pilot-scale purification and characterisation of IgG H10 from vacuum-Agroinfiltrated leaves (250g)
Size-exclusion Chromatography
Protein A Purification
Silver staining of the eluted fractions
Cation-Exchange Chromatography (CEX)
Lombardi et al 2010 Transgenic Res. 19:1083
Two chimeric mouse–human Ab derived from an antifungal murine mAb (2G8), in the format of complete IgG or scFv-Fc, were generated and produced in plants.
Both recombinant Abs showed to bind the beta 1,3 glucan (a fungal cell wall component) which is the target recognized by the original mAb.
Immunofluorescence staining of major pathogenic fungi, Candida albicans (a), Aspergillus fumigatus (b) and Cryptococcus neoformans (c), by the recombinant anti-b-glucan Abs.
Given the effectiveness of such Abs, recombinant immunoglobulin of type A derived from 2G8 intended for topical application were also generated.
2G8 Recombinant IgA Formats
Critical Aspect: Glycosilation Plan
ts
Animals
Endoplasmic reticulum Golgi apparatus
Sialic acid
Galactose
α(1,3)fucose
ß(1,2)xylose
Possible solu:ons:
• ER Reten:on
• Plants “silenced” defec:ve in the ability to synthesize fucosyl-‐transferase e xylosyl-‐transferase
• Expressing human beta(1,4)-‐galactosyltransferase in plant cells to modify sugars and decrease contents of beta(1,2)-‐xylose and alpha(1,3)-‐fucose.
Vaccini prodotti in piante edibili
purificazione conservazione somministrazione smaltimento
Patogeno Vaccino Pianta Quantità tessuto
vegetale/ somministrazione
Quantità di vaccino/
somministrazione
Numero di somministrazioni Referenza
patata 100-110 g ~890 g 2-3 Thanavala et al. 2005, PNAS 102,3378-82 Virus Epatite B VLP HBsAg
lattuga 200-150 g ~60-45 g 2 Kapusta et al. 1999, FASEB J. 13,1796-99
Virus di Norwalk (gastroenterite) VLP NVCP patata 150 g 215-751 g 2-3 Tacket et al. 2000,
J Infect Disease 182,302-5
patata 100 g 970-485 g 3 Tacket et al. 1998, Nature Med 4 Enterotossina di
E. coli (diarrea) LT-B (subunità B) mais 2,1 mg ~ 1 mg 3 Tacket et al. 2004,
Vaccine 22,4385-89
Aumento del titolo anticorpale
• Approx. 1300 coat proteins per PVX particle
• N-terminus of each coat protein exposed on the outer surface
HIV-1
PVX
gp 41
Potato Virus X (PVX) surface display of HIV-derived epitope(s)
‘Broadly Neutralizing Antibodies Targeted to the Membrane-Proximal External Region of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Glycoprotein gp41’ ZWICK et al. J. VIROLOGY(2001) 10892–10905
Cartoon model of the HIV-1 putative trimeric envelope spike
Potato Virus X (PVX) surface display of CTL epitope(s)
PVX Influenza Virus
NP epitope
CVPs activate ASNENMTEM-specific CD8+ T cells
Multiepitope-Targeted Vaccines Based on HSP70 from Plants Biofactories of Recombinant Antigens
Plant Heat Shock proteins 70 do activate immune system! An immunization strategy based on these complexes, poorly explored so far, could help to overcome the problems related to epitope identification, resulting in naturally formulated multiepitope vaccines.
HPV Saponaria officinalis
Chlamydomonas reinhardtii
Nico.ana benthamiana
HPV 16 Piante Boreaaori di vaccini contro il virus del papilloma umano
Valutazione efficacia su modelli pre-‐clinici
+
Virus vegetali in bio-nanotecnologie
Journa l o f B iomolecu lar Structure and Dynamics Structure-based design and experimental engineering of a plant virus nanoparticle for the presentation of immunogenic epitopes and as a drug carrier
I successi ‘produttivi’ del ‘molecular farming’
PMI israeliana
Ruggiero et al. 2000, Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants, FEBS Letters 469, 132–136
• Collagene in tabacco transgenico
Israele
Taliglucerasi alfa. Sopperisce alla carenza dell’enzima glucocerebrosidasi (malattia di Gaucher, con disfunzioni nel processo di degradazione cellulare).
• Biofarmaceutici per malattie rare in cellule di carota
• Vaccini per le pandemie in piante agroinfiltrate
USA In collaborazione con il Pentagono, prodotte 10 milioni di dosi di vaccino contro l’influenza di tipo H1N1 in un mese.
Ten years of advanced molecular farming…..
Imagine a world in which any protein either naturally occurring or designed by man could be produced safely, inexpensively and in almost unlimited quantities using only simple nutrients, water and sunlight…..’
Julian Ma et al. Nature Review Genetics,
October 2003
Pharma-Planta Aims and Objectives
Pharma-Planta aims to build a plant based production platform for pharmaceuticals in Europe and to enter the first candidates of this pipeline into Phase I clinical trial.
Recombinant Pharmaceuticals from Plants for Human Health
2004 - 2009
Pharma-Planta-Who are we?
Scientific Co-ordinator: Professor Julian Ma St George’s Hospital
Medical School, London, UK
Friedrich Altmann, Austria Eugenio Benvenuto, Italy Ralph Bock, Germany Marc Boutry, Belgium Paul Christou, Germany Udo Conrad, Germany CSIR, S. Africa Phil Dale, UK Jurgen Denecke, UK Ann Depicker, Belgium Diamyd Medical AB, Sweden Phil Dix, Ireland Jurgen Drossard, Germany
Paul Dupree, UK Rainer Fischer, Germany Lorenzo Frigerio, UK Roger Frutos , France Paul Garside, UK John Gray, UK Chris Hawes, UK Friedemann Hesse, Austria Tony Kavanagh, Ireland Nikos Labrou, Greece David Lewis, UK George Lomonossoff, UK Julian Ma, UK
Richard Mahoney, UK Mosaic Systems BV, Netherlands Johnathan Napier, UK Jean-Marc Neuhaus, Switzerland Jacqueline Nugent, Ireland Mario Pezzotti, Italy PolyMun, Austria David Robinson, Germany Henri Salmon, France Stefan Schillberg, Germany Eva Stoeger, Germany Alessandro Vitale, Italy Christian Vivares, France
Partners:
www.pharma-planta.org
Pharma-Planta –Targets
HIV, rabies, Diabetes.
Plants as Bio-‐fermenters of recombinant medicines
Vs
Are these sufficient to compete with classical fermenta:on technology?
Key Words: Bio-‐Beaer Bio-‐Similar
Humanitarian Use First in human trial
< $10 /g
Monoclonal an:body produc:on in plants offers rapid produc:on advantages in comparison to mammalian cells, with at least equivalent product safety, purity and potency.
BIO
TEC
per
l’A
groa
limen
tare
!!!
Thank you for your attention!
http://biotecnologie.casaccia.enea.it
Molecular farming nel Laboratorio Biotecnologie
Tematica Pubblicazioni BIORAD-FARM Ottimizzazione produzione di proteine in piante attraverso il sistema PV X
• Betti et al. Mol Plant Pathol. 2012;13:198-203 • Lico et al. J Gener Virol. 2006;87:3103-12.
Ottimizzazione produzione di proteine in piante attraverso il sistema agroinfiltrazion e
• Circelli et al. Bioeng Bugs. 2010;1:221-4.
Accumulo di proteine in corpi oleos i • Capuano et al. Anal Chem. 2011;83:9267-72.
Potenziale azione immunostimolante di componenti vegetali
• Buriani et al. Plant Biotechnol J. 2012;10:363-71. • Buriani et al. Transgenic Res 2011;20:331-44 • Di Bonito et al. Int J Immunopathol Pharmacol 2009;22:967-
78.
Produzione in pianta di un peptide “killer” ad azione antibiotica.
• Donini et al. Appl Environm microbiol 2005;71:6360-7.
Produzione in pianta di anticorpi anti- -glucano ad azione antifungina.
• Capodicasa et al. Plant biotechnol J. 2011;9:776-87
Produzione in pianta di un anticorpo anti-tumorale • Lombardi et al. Transgenic Res. 2012;21:1005-21. • Lombardi et al. Transgenic Res. 2010;19:1083-97. • Villani et al. Plant Biotechnol J. 2009;7:59-72.
Produzione in pianta di un vaccino anti-HPV umano.
• Massa et al. Hum Vaccin. 2011;7 Suppl:147-55. • Giorgi et al. Expert Rev Vaccines. 2010;9:913-24. • Massa et al. Human Gene Therapy. 2008;19:354-64. • Massa et al. Vaccine. 2007;25:3018-21. • Franconi et al. Int J Immunopathol Pharmacol. 2006;19:187-
97. • Franconi et al. Cancer Res. 2002;62:3654-8.
Produzione in pianta di antigeni HI V • Marusic et al. Transgenic Res 2009;18:499-512. • Lombardi et al. BMC Biotechnol. 2009;9:96. • De Virgilio et al. J Experiment Botany. 2008;59:2815-29. • Marusic et al. BMC Biotechnol. 2007;7:12.
Produzione in pianta di antigeni del virus dell’influenza. • Lico C et al. Vaccine. 2009;27:5069-76.
Produzione in pianta di vaccini contro il virus della febbre suin a
• Marconi et alBMC biotechnol 2006;6:29.