filtracion por membrana
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NORMAS ISO PARA DETERMINACIONES MICROBIOLÓGICAS DE AGUAS
Directiva Europea 98/83/CE
Relativa a la calidad de las aguas
destinadas al consumo humano
ANEXO III: 1. PARÁMETROS PARA LOS QUE SE ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS
Los siguientes principios se dan ya sea como
referencia, en los casos en que se da un método
CEN/ISO, o como guía, en espera de la posible
adopción futura de nuevos métodos internacionales
CEN/ISO.
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESPECIFICADOS
• Bacterias coliformes y Escherichia coli UNE-EN ISO 9308-1: 2001
• Enterococos UNE-EN ISO 7899-2: 2001
• Pseudomonas aeruginosa prEN ISO 12780
• Enumeración de microorganismos cultivables a 22ºC y 37ºC UNE-EN ISO 6222: 1999
• Clostridium perfringens (incluidas las esporas) método descrito en la Directiva.
ISO 7899-2: ENTEROCOCOS INTESTINALESFILTRACIÓN DE MEMBRANA
CAMPO DE APLICACIÓN:• Aguas de bebida• Piscinas• Aguas desinfectadas
EXCEPCIONES: Alto contenido en materia en suspensión y microorganismos interferentes
DEFINICIÓN: Bacterias capaces de reducir el TTC a 362ºC e hidrolizar esculina a 440,5ºC
INTRODUCCIÓN
MEDIOS DE CULTIVO: Slanetz y Bartley Bilis Esculina agar: confirmación 100%
Grandes volúmenes de agua con bajo contenido de enterococos
prEN - ISO 12780: PSEUDOMONAS AERUGINOSAFILTRACIÓN DE MEMBRANA
CAMPO DE APLICACIÓN:• Aguas embotelladas• Piscinas• Aguas de red
DEFINICIÓN: Microorganismos capaces de crecer con cetrimida a 362ºC y: - Producen piocianina o - Oxidasa +, Fluorescentes a 360nm y amonio de acetamida
MEDIOS DE CULTIVO: Cetrimida-NalidixicoKing’s BCaldo acetamida
Confirmación: subcultivo
ISO 6222: RECUENTO DE MICROORGANISMOSCULTIVABLES
CAMPO DE APLICACIÓN: Indicado para medir la eficacia
operativa del proceso de tratamiento del agua de red.
DEFINICIÓN: Todas las bacterias aerobias, levaduras y
hongos capaces de formar colonias en el medio especificado
bajo las condiciones descritas
MEDIO DE CULTIVO y MÉTODO: ¿ADECUADOS?
Agar extracto de levadura
Siembra en profundidad: 36 2ºC; 444 horas
22 2ºC; 682 horas
DIRECTIVA: 22ºC Y 37ºC, NORMA 222ºC Y 362ºC
Confirmación mediante examen y, la aportación de
evidencias objetivas que demuestren
el cumplimiento de ciertos requisitos para
el uso específico previsto
(ISO 17025)
VALIDACIÓN DE MÉTODOS: DEFINICIÓN
ISO 9308-1: COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLIFILTRACIÓN DE MEMBRANA
CAMPO DE APLICACIÓN: Método poco selectivo específicopara bacterias lesionadas.
• Aguas de bebida desinfectadas• Aguas de bebida con bajo contenido bacteriano
DOS MÉTODOS: Estándar para coliformes y E.coli Rápido para E.coli
DEFINICIONES: - Bacterias Lactosa +: Capaces de crecer en medio lactosado selectivo diferencial a 362ºC y producir ácido- Coliformes: Lactosa + que son oxidasa -- E.coli: 1.- Coliformes que producen indol del triptófano a 440,5ºC 2.- Bacterias resistentes a la bilis que producen indol del triptófano a 44 0,5ºC
FILTRACIÓN: 100 ml ó 250 ml
Lactosa TTC-Tergitol362ºC, 213 h ó 444h
Alternativa: otra membrana440,5ºC, 213 h
TSA: Triptona-soja-agar362ºC 4-5 h
TBA: Triptona-Bilis-Agar44±0,5ºC 19-20 h
Confirmación del 100%Indol
Alternativa: Doble capa
Lactosa +: colonias amarillas
Agar no selectivo: 362ºC, 212 h
Oxidasa Indol de triptófano44±0,5ºC , 213 h
10 colonias
ISO WD 6461-2: CLOSTRIDIUM PERFRINGENSFILTRACIÓN DE MEMBRANA
ANTECEDENTES
¿QUÉ MÉTODO DESARROLLAR PARA LA NUEVA NORMA?
ESTUDIO COMPARATIVOAlemania 60 laboratorios
• El TSC (Triptona-Sulfito-cicloserina) recupera 15% más que m-CP• El m-CP resulta afectado por el tipo y lote de membranas• El revelado del m-CP resulta tóxico para bacterias y personas• El TSC resulta afectado por la frescura del medio(1 día)• Las pruebas de confirmación con mayores índices de S y E:
•Nitratos: +•Movilidad : -•Lactosa: +•Gelatinasa: +
ISO WD 6461-2: CLOSTRIDIUM PERFRINGENSFILTRACIÓN DE MEMBRANA
CAMPO DE APLICACIÓN:• Todo tipo de aguas que no contengan materiasparticuladas o coloidales
DEFINICIÓN:Presuntivos: colonias negras a marrón-amarillas en
TSC a 44±1ºC Confirmadas: Presuntivas inmóviles, reducen nitratos
fermentan lactosa y licúan gelatina
DIRECTIVA: incluidas esporas, NORMA: pasteurización
MÉTODO: Pasteurización a 60 ±2ºC, 15 min
Los Estados miembros podrán emplear métodos
alternativos: Art.7. 5: Siempre que se demuestre que
los resultados son al menos tan fiables como los de
referencia. Se facilitará a la Comisión toda
la información del método y su equivalencia
ANEXO III: 1. PARÁMETROS PARA LOS QUE SE ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS
ISO 17994: “Criterios para el establecimiento
de la equivalencia entre métodos microbiológicos”
Dos métodos son equivalentes, cuando la diferencia
relativa media de sus recuentos confirmados no
difiere significativamente de cero y tanto el límite
inferior como el superior del intervalo de confianza
al 95% de la media no superan un nivel máximo de
desviación aceptable D (10)
BLnALnRD 100%
n
ixi
nX
1
1
1
1
2
n
xxi
S
n
i
n
SXIC 2%95
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN
— D 0 D LI LS
y
NO DIFERENTES
— D 0 DLS < < LI ó
DIFERENTES
INDIFERENTES: Estadísticamentediferentes, pero la diferencia es tan pequeña queno tiene significación microbiológica
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN
— D 0 LS < < LI y
ó
D0< LI y LS <
NO CONCLUYENTE
— D 0LI < y < LS
ó
D0
yLI < < LS
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS: INTERPRETACIÓN
Método propio Método de referencia
Muestra 1 89 112Muestra 2 82 58Muestra 3 123 137Muestra 4 87 82Muestra 5 109 103Muestra 6 84 117Muestra 7 65 66Muestra 8 111 70Muestra 9 92 93Muestra 10 115 111
Media = 2,63Desviación estándar = 23,76Límite inferior del IC95% = -12,39Límite superior del IC 95% = 17,66
Conclusión: Resultados son no concluyentes,
LI<0 y LS>+D,
Se requiere un número mayor de muestras
n=C.S2= 0,1600x23,762= 90 muestras
VALIDACIÓN - REVALIDACIÓNCONTROL DE CALIDAD MÉTODOS CUANTITATIVOS
• INTERNO:
- Positivo: Mat. Referencia en matriz neg. (Recuperación)
- Negativo: Mat. Referencia en matriz neg. (Selectividad)
- Control de replicados: tres (Precisión y límites de
recuento)
- Ident. de colonias diana y no-diana: (Tasa de
confirmación)
• EXTERNO: Muestras con diferentes niveles (Recuperación)