Filogenia Microbiana

Genómica Ambiental- Metagenómica

Revisión Estructura Celular Procariota

Referencias:

-The Legacy of Carl Woese and Wolfang Zillig: from phylogeny to landmark discoveries.

S-V. Albers et al. Nature Rev. Microbiol. 11, 713-719 (2013)

-Metagenomics: Application of genomics to uncultured microorganisms.

Jo Handelsman. MMBR 68 (4): 669-685 (2004)

-Metagenomic Analysis: Past and Future Trends.

Simon, C. and Daniel R. AEM 77(4): 1153-1161 (2011)

- The archaeal cell envelope. S-V Albers and B.Meyer. Nature Rev. Microbiol. (9)415-427 ( 2011)

Filogenia: Historia evolutiva de un grupo de organismos

Inferida indirectamente por comparación de secuencias nucleotídicas

Genes empleados en análisis filogenéticos

Universalmente distribuidos en los grupos en estudio

Funcionalmente homólogos

Poseen regiones de secuencias conservadas (alineamiento de secuencias)

Otros genes: ATPasas, componentes aparato de traducción (factor de elongación Tu),

RecA, Hsp60, t-RNA sintetasas

Genes codificantes de ARNr 16S (procariotas) y 18S (eucariotas)

Small subunit rRNAs (SSU rRNA)

Carl Woese (1977) usa por primera vez SSU rRNA como herramienta

filogenética y propone el Arbol Filogenético Universal con 3 Dominios:

Bacteria, Archaea, Eukarya.

PROCARIOTAS EUCARIOTAS

(Adapted from Woese et al. PNAS 87: 4576-4579, 1990)

Estructura primaria y secundaria del ARNr de E. coli (bacteria)

El ARN 16S de las arqueas posee un plegamiento similar pero presenta numerosas diferencias

en la secuencia nt.

Análisis de la Filogenia

Amplificación por PCR y Secuenciación de los genes SSU ARNr

«Signature sequences» en los ARNrs:

Son oligonucleótidos cortos únicos a ciertos grupos de microorganismos.

Se conocen para los 3 dominios de la vida y para microorganismos específicos.

Sirven para el diseño de sondas o probes filogenéticos específicos que se usan

en la técnica FISH y para el diseño de cebadores en PCR

Aplicación de los SSU rRNAs: Métodos Filogenéticos

El análisis de SSU rRNAs permitió el desarrollo de herramientas que se utilizan

para la identificación de microorganismos en ecología microbiana y medicina.

Complementa técnicas fenotípicas y genotípicas usadas para la Taxonomía

bacteriana.

Sonda o probe: ADN simple cadena que se puede marcar y usar para hibridizar con

una secuencia complementaria de ac nucleico en una mezcla.

Pueden ser generales o específicos

Identificación y cuantificación de microorganismos

Se usan probes muy específicos complementarios a SSU rRNAs marcados con un

fluoróforo. Penetran en las células permeabilizadas e hibridizan con los ribosomas

(RNAr). Observación en microscopio de fluorescencia.

Análisis de muestras ambientales o células en cultivo.

Aplicación en ecología microbiana, diagnóstico clínico, microbiología de alimentos.

Sondas filogenéticas y FISH (fluorescence sin situ hybridization)

Estudia la biodiversidad y actividades existentes en las comunidades

microbianas (poblaciones de microorganismos que interaccionan en la

naturaleza)

Métodos de análisis de comunidades microbianas

1. Dependientes de cultivo. Enriquecimiento y aislamiento de los

microorganismos. Ej. Columna de Winogradsky (TP1)

2. Independientes de cultivo. No requiere el aislamiento de los

microorganismos. Son detectados mediante el análisis de sus genes

directamente de las muestras ambientales.

El estudio de biodiversidad requiere identificación y cuantificación de

microorganismos directamente en su habitat

Ecología Microbiana

Sucesión microbiana:

Columna Winogradsky

Aislamiento fotosintéticas

Análisis por PCR

gen rRNA16S bacterias

gen rRNA16S arqueas

gen sulfito reductasa

Extracción de ADN

Columna de Winogradsky: ecosistema microbiano artificial para el

enriquecimiento y posterior aislamiento de bacterias de suelo (fotosintéticas,

reductoras de sulfato, anaerobios)

Preparada por estudiantes de BBM

Métodos de tinción generales

Permiten cuantificar microoganismos en muestras naturales. No dan información sobre la

fisiología o filogenia de la células.

Cuantificación de células totales. DAPI (4, 6 diamido 2 phenylindole), naranja de acridina.,

SYBR Green I . Son colorantes fluorescentes que se unen al ADN. No son específicos. No

distinguen células vivas y muertas.

Análisis de comunidades microbianas

independiente de cultivo

Tinción de células viables. Se basan en la

integridad de la membrana celular.

Ej. LIVE/DEAD. El verde penetra en todas las

células; el rojo (ioduro de propidio) penetra

sólo en las células que poseen la membrana

rota (células muertas).

FISH

A, C. Tinción de células totales (DAPI).

B, D. Probes específicos para Acidithiobacillus ferrooxidans (B) y Acidiphillium spp (D).

Muestras tomadas del Rio Tinto, España. (AEM 2003)

Tinción

filogenética

Permite separar genes de igual tamaño y diferente

composición de bases (diferente Tm) en geles

desnaturalizantes con gradiente de urea o formamida.

DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)

Metagenómica

(Genómica Ambiental)

Estudio molecular de

comunidades microbianas

- Diversidad filogenética

- Diversidad metabólica

- Expresión génica

- Análisis funcional

- Reconstrucción total o parcial

de los genomas de

microorganiamos no cultivados

Método de PCR para analizar la actividad metabólica de las

comunidades microbianas

Genes usados

comunmente

para detectar

procesos

microbianos

en el ambiente

Existen más de 200 metagenomas secuenciados de diferentes ambientes:

- Tierra

- Océanos

- Intestino humano

- Ambientes extremos

Aplicación en investigaciones médicas y forenses

Projecto Metagenoma Humano (2009).

Mapear comunidades microbianas asociadas con el intestino humano, boca, piel.

Metatranscriptómica

Provee información sobre capacidades metabólicas y funcionales de una

comunidad microbiana.

Secuenciación directa de ADNc usando nuevas tecnologías de secuenciación

(next -generation sequencing technologies )

Ej. Pirosecuenciación

Metaproteómica

Caracterización en gran escala del conjunto de proteínas de la microbiota ambiental

en un determinado momento.

Su finalidad es determinar el potencial catalítico de una comunidad microbiana.

Electroforesis 2D y espectrometría de masas.

Es un área emergente.

Estructura general de la célula procariota

Micrografía electrónica

de transmisión (MET)

de una bacteria

Micrografía

electrónica de

barrido (SEM)

Lípidos de membrana de bacterias y arqueas

..

Fosfolípidos en bacterias y eucariotas:

ésteres de glicerol y ácidos grasos (a)

Fosfolípidos en arqueas:

alcoholes isoprenoides forman uniones

éter con el glicerol (b-c)

Forman monocapas (b) o bicapas (c)

lipídicas

Membranas más estables en

condiciones ambientales extremas

En Thermoplasma acidophilum

monocapa

Pared celular de bacterias y arqueas

Bacterias

Arqueas

Pared de

peptidoglicano

(mureína)

Capa-S

(Glicoproteína )

No poseen

mureína