Download - ANALISIS METABOLOMIK SEMASA PEMASAKAN ... - UKM

ANALISIS METABOLOMIK SEMASA PEMASAKAN

DARIPADA PELBAGAI TISU BUAH

Garcinia mangostana Linn.

UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA

SITI FARAH BINTI MAMAT

PERAKUAN TEStS SARJANA I DOKTORFALSAFAH (CERTIFICATION OF MASTERS / DOCTORAL THESIS)

Nama Penuh Pengarang (Author's Full Name)

No. Pendaftaran Pelajar (Student's Registration No.)

sic IMIP14 kSiwi\ \cnrT

Sesi Akademik (Academic

p860k Session)

Tajuk Tesis ANA Usk S 1NaoLetciz se1t&g PcaMPw.Atv

(Thesis Title) DARIPADA PELPjCp 1\su P"JM'I Qc4rcjt1jq

(hcffl9csftlflq Utho.

Merujuk kepada Klausa 4.2 Dasar Harts Intelek Pelajar UKM (Tambahan), tesis adatah hak milik pelajar. Saya mengaku tesis mi sebagai: (With regard to Clause 4.2 of the UKM Student Intellectual Property Policy (Supplementary), the thesis is the student's property. I hereby declare this thesis as:)

RAHSIA Mengandungi maklumat rahsia di bawah AKTA RAHSIA RASMI (CONFIDENTIAL) 1972

(Consisting of classified information under the OFFICIAL SECRETS ACT 1972)

TERHAD Mengandungi maklumat TERHAD yang telah ditentukan oleh (RESTRICTED) organisasi/badan di mane penyelidikan dijalankan

(Consisting of RESTRICTED information which has been determined by the organisation/body where the research was conducted)

I ,,/f AKSES Saya membenarkan tesis mi diterbitkan secara akses terbuka,

TERBUKA teks penuh atau dibuat salirtan untuk tujuan pengajian, ITIDAK TERHAD pembelajaran, penyelidikan sahaja. (OPEN ACCESS! (I allow this thesis to be published through open access, full text or NON-RESTRICTED) copied for study, learning and research purposes only.)

Bagi kategori Akses Terbuka/Tidak Terhad, saya membenarkan tesis (Sarjana/Doktor Falsafah) ini di simpan di Perpustakaan Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM)* dengan syarat-syarat kegunaan seperti berikut: (For the Open Access/Non-Restricted category, I allow this (Master's/Doctoral) Thesis to be kept in the Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM) Library with the following usage conditions:)

1. Perpustakaan UKM mempunyai hak untuk membuat salman untuk tujuan pengajian, pembelajaran, penyelidikan sahaja. (11KM Library has the right to reproduce the thesis for study, learning and research purposes only.)

2. Perpustakaan (Jniversiti Kebangsaan Malaysia dibenarkan membuat saW (1) salman tesis ni untuk tujuan pertukaran antara institusi pengajian tinggi dan mana-mana badan/ agensi kerajaan, tertakluk kepada terms dan syarat. (UKM Library is allowed to make one (1) copy of this thesis for exchange purpose among higher education institutions and any government body/agency, subject to terms and conditions.)

DISAHKAN OLEH: (VERIFIED BY:)

TANDATANGhN PELAJAR TAND dPENYELIAI (STUDENT'S SIGNATURE)

PEN—ElUCI JK SJCWAZAH (SUPERVISOR'S / CIIAIRrZPCON

SUPERVISION COMMITTEE SIGNATURE)

30 8014 -

OrvJ AL(k'.144 k' won KAD PENGENALAN I NAMA PENYELIAI W'GwJip

NO. PASPORT PENOERUSWAZAH (IDENTITY CARD/PASSPORT

(SUPERVISOR'S /CHAIRPERSON NO.) SUPERVISION COMMITTEE NAME)

Tarikhf Tarikh/ Date: (0 / to /t q Date: tI.( tt(c

ANALISIS METABOLOMIK SEMASA PEMASAKAN DARIPADA PELBAGAI

TISU BUAH Garcinia mangostana Linn.

2019

SITI FARAH BINTI MAMAT

TESIS YANG DIKEMUKAKAN UNTUK MEMPEROLEHI

IJAZAH SARJANA BIOLOGI SISTEM (SAINS BIOMOLEKUL)

INSTITUT BIOLOGI SISTEM

UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA

BANGI

ii

PENGAKUAN

Saya akui karya ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali nukilan dan ringkasan yang tiap-

tiap satunya telah saya jelaskan sumbernya.

12 Jun 2019 SITI FARAH BINTI MAMAT

P88609

iii

PENGHARGAAN

Dengan nama Allah S.W.T yang Maha Pemurah lagi Maha Penyayang.

Terlebih dahulu, bersyukur saya ke hadrat Ilahi kerana dengan izin-Nya saya telah berjaya

melengkapkan penulisan tesis sebagai syarat untuk menamatkan pengajian di Institut

Biologi Sistem (INBIOSIS), UKM dalam bidang Sarjana Biologi Sistem (Sains

Biomolekul) dalam jangka masa yang telah diperuntukkan.

Sekalung penghargaan ditujukan khas kepada penyelia utama saya, Dr. Wan Mohd

Aizat Wan Kamaruddin kerana telah membimbing serta mendidik saya sepanjang tempoh

pengajian saya di INBIOSIS. Beliau banyak membantu saya dengan memupuk pelbagai

kemahiran dalam diri saya seperti kebolehan merangka dan menjalankan eksperimen,

kemampuan untuk menyampaikan maklumat dengan berkesan melalui pemantapan teknik

penulisan dan kemahiran berkomunikasi semasa melakukan pembentangan.

Seterusnya, jutaan terima kasih juga ingin saya sampaikan kepada Prof. Madya Dr.

Syarul Nataqain Baharum, Dr. Kamalrul Azlan Azizan dan Prof. Emeritus Dr. Normah

Mohd Noor merangkap penyelia bersama dalam kajian ini. Perkongsian ilmu yang

bermanfaat serta bimbingan untuk menjalankan kajian menjadi antara pendorong utama

saya untuk menyiapkan kajian ini. Selain itu, tidak lupa juga kepada felo penyelidik yang

lain di INBIOSIS serta warga kerja INBIOSIS terutamanya Puan Sarah Ibrahim, Puan

Rafidah Ahmad dan En. Syahmi Afiq Mustaza yang telah membantu secara langsung dalam

aspek teknikal analisis metabolomik.

Tidak lengkap rasanya pengajian saya di INBIOSIS tanpa rakan-rakan

seperjuangan yang sentiasa mendorong saya. Terima kasih tidak terhingga kepada rakan-

rakan kajian manggis iaitu Azhani Abdul Rahman, Salahuddin Sanusi dan Othman Mazlan,

rakan-rakan makmal metabolomik iaitu Ku Nurul Aqmar Ku Bahaudin, Yosmetha A/P

Mayalvanan, Arief Izzairy Zamani, Aqil Fitri Rosli, Fahmeeda Mohamad Jazamuddin,

Rubashiny A/P Veeramohan dan Shuhaila Sharif. Tidak lupa juga kepada rakan-rakan

pengajian yang lain termasuklah Marhaini Mostapha, Khaidatul Akmar Kamaruzaman,

Muhammad Redha Abdullah Zawawi, Muhammad Iqmal Abdullah, Pang Sze Lei dan lain-

lain. Tidak ketinggalan, ingin saya kongsikan kejayaan saya bersama ibu bapa saya, Sdiah

binti Hussin dan Mamat bin Sulong serta keluarga saya yang sentiasa menjadi tulang

belakang saya dalam apa jua yang saya lakukan. Terakhir, ucapan terima kasih juga ingin

saya sampaikan kepada pihak yang terlibat secara langsung atau tidak langsung dalam

kajian ini termasuklah biasiswa Zamalah Pendidikan UKM dan geran penyelidikan

Sciencefund (02-01-02-SF1237) yang menyumbang dari segi kewangan.

Terima kasih.

iv

ABSTRAK

Garcinia mangostana Linn. (manggis) adalah buah tropika bersifat klimakterik yang

digelar sebagai “Permaisuri buah” ekoran daripada rasanya yang manis dan unik. Manggis

mempunyai pelbagai fungsi biologi dan farmaseutikal seperti anti-kanser, anti-radang, anti-

malaria dan anti-oksida berikutan kandungan sebatian bioaktif yang tinggi terutamanya

xanton. Meskipun permintaan pasaran manggis semakin meningkat, namun pengetahuan

mengenai mekanisme pemasakan manggis yang kompleks masih lagi kurang. Oleh itu,

pendekatan biologi sistem menggunakan platform metabolomik telah digunakan dalam

kajian ini bagi meningkatkan kefahaman tentang pengawalaturan metabolik semasa

pemasakan manggis. Metabolit manggis telah diekstrak daripada empat peringkat

pemasakan (peringkat 0, 2, 4, dan 6) dan dibezakan tisunya (perikarpa, isi dan biji

manggis). Pada awalnya, beberapa kaedah pengekstrakan menggunakan bahan pelarut

berbeza dengan nisbah yang berlainan telah diuji bagi mendapatkan jumlah metabolit yang

paling optimum. Dua kaedah terbaik telah dipilih dan digunakan untuk menganalisis

kesemua sampel manggis iaitu metanol/klorofom/air (3:1:1) disertai teknik sonikasi bagi

analisis kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-MS) dan metanol/asid formik (599:1)

disertai teknik sonikasi bagi analisis kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS).

Corak perubahan metabolit bagi setiap kumpulan eksperimen seterusnya diproses

menggunakan analisis statistik univariat dan multivariat serta analisis varians dua-hala

(two-way ANOVA) dan kaedah bioinformatik. Sebanyak 155 metabolit telah dikenalpasti

secara putatif merangkumi pelbagai kumpulan metabolit primer dan sekunder termasuklah

gula, asid amino, asid organik, fenolik, terpenoid, alkaloid dan xanton. Hasil kajian

mencadangkan bahawa metabolit berpengaruh tinggi dengan nilai pembolehubah

berkepentingan dalam unjuran (VIP) melebihi 1.00 (VIP ≥1.00) dan signifikan secara

statistik (p ≤0.05) terdiri daripada metabolit primer (contohnya L-manopiranosa, myo-

inositol, arabinofuranosa, asid galakturonik, asid L-(+)-tartarik dan butanal) dan metabolit

sekunder (contohnya neoisotegana, epirobinatidiol-(4β,8)-katesin, α-mangostin dan

gartanin). Metabolit ini mungkin menyumbang kepada degradasi dinding sel,

perkembangan rasa, warna dan aroma serta sistem pertahanan di dalam pelbagai tisu

manggis. Analisis tapak jalan seterusnya mendapati bahawa pengawalaturan metabolisme

galaktosa, metabolisme askorbat dan aldarat, metabolisme glioksilat dan dikarboksilat,

penyalingtukaran pentosa dan glukuronat serta kitaran asid trikarboksilik (TCA) berlaku

pada tahap yang berbeza semasa pemasakan manggis. Ini adalah laporan pertama yang

telah berjaya merungkai metabolom dan tapak jalan metabolik semasa pemasakan manggis

menggunakan pendekatan GC-MS dan LC-MS serta analisis bioinformatik. Hasil kajian ini

diharap akan menjadi asas kepada penambahbaikan dalam penghasilan buah dan

pembangunan teknologi lepas tuai buah manggis serta peningkatan nilai komersial dan

ekonomi buah yang bermanfaat tinggi ini pada masa hadapan.

v

METABOLOMICS ANALYSIS OF Garcinia mangostana Linn. DURING RIPENING IN

DIFFERENT FRUIT TISSUES

ABSTRACT

Garcinia mangostana Linn. (mangosteen) is a climacteric tropical fruit that has been

dubbed as the “Queen of fruit” due to its unique taste and flavour. Mangosteen possesses

various biological and pharmaceutical functions such as anti-cancer, anti-inflammation,

anti-malaria and anti-oxidant due to the high content of bioactive compounds especially

xanthones. Despite the increasing market demand for mangosteen, less is known about its

complex ripening mechanism. Hence, systems biology approach using metabolomics

platform was applied in this study to enhance the understanding of the metabolic regulation

during mangosteen ripening. Metabolites were extracted from four ripening stages (stages

0, 2, 4 and 6) and separated according to tissue types (pericarp, aril and seed). Initially, a

few extraction methods using different solvents with different ratio were tested to obtain

the most optimal number of total metabolites. The two best methods were chosen and used

to analyse all mangosteen samples which were methanol/chloroform/water (3:1:1) assisted

with sonication for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and methanol/formic

acid (599:1) assisted with sonication for liquid chromatography-mass spectrometry (LC-

MS) analyses. The metabolite distribution pattern between experimental groups were then

analysed using univariate and multivariate statistical analyses as well as two-way ANOVA

and bioinformatics approach. A total of 155 metabolites were putatively identified,

covering a broad range of primary and secondary metabolites including sugars, amino

acids, organic acids, phenolics, terpenoids, alkaloids and xanthones. The results suggest

that highly influence metabolites with variable importance of projection (VIP) value

exceeding 1.00 (VIP ≥1.00) and statistically significant (p ≤0.05) consists of primary

metabolites (for examples L-mannopyranose, myo-inositol, arabinofuranose, galacturonic

acid, L-(+)-tartaric acid and butanal) and secondary metabolites (for examples

neoisostegane, epirobinetinidol-(4β,8)-catechin, α-mangostin and gartanin). Such

metabolites may contribute to the cell wall degradation, flavour, colour and aroma

developments as well as defense systems in various manggosteen tissues. Pathway analysis

revealed that galactose metabolism, ascorbate and aldarate metabolism, glyoxylate and

dicarboxylate metabolism, pentose and glucuronate interconversions as well as

tricarboxylic acid (TCA) were differentially regulated during mangosteen ripening. This is

the first report that has successfully profiled the metabolome and metabolic pathways of

mangosteen ripening using GC-MS and LC-MS as well as bioinformatics analysis

approaches. The findings of this project could be the basis for improving the production of

the fruit and the development of related post-harvest technologies as well as increasing the

commercial and economical value of this highly beneficial fruit in the future.

vi

KANDUNGAN

Halaman

PENGAKUAN ii

PENGHARGAAN iii

ABSTRAK iv

ABSTRACT v

KANDUNGAN vi

SENARAI JADUAL x

SENARAI RAJAH xii

SENARAI SINGKATAN xiv

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Pengenalan 1

1.2 Permasalahan Kajian 5

1.3 Objektif Kajian 7

1.3.1 Objektif umum 7

1.3.2 Objektif khusus 7

BAB II KAJIAN KEPUSTAKAAN

2.1 Pemasakan Buah 8

2.1.1 Buah klimakterik dan bukan-klimakterik 8 2.1.2 Perubahan struktur dan degradasi dinding sel 10 2.1.3 Perubahan kandungan metabolit primer dan sekunder 10

2.2 Garcinia mangostana Linn. 12

2.2.1 Proses pemasakan manggis 15 2.2.2 Manfaat dan bioaktiviti manggis 17 2.2.3 Potensi manggis di pasaran 23

2.3 Pendekatan Biologi Sistem Berasaskan Metabolomik 25

2.3.1 Penyediaan dan pengekstrakan sampel 28 2.3.2 Analisis sampel menggunakan teknik analitikal 31 2.3.3 Analisis data 37

vii

BAB III BAHAN DAN KAEDAH

3.1 Bahan 41

3.1.1 Sumber sampel 41 3.1.2 Bahan kimia dan reagen 41

3.2 Kaedah 42

3.2.1 Pensampelan dan penyediaan sampel 42 3.2.2 Pengekstrakan metabolit 42 3.2.3 Penyediaan sampel bagi analisis GC-MS 44 3.2.4 Penyediaan sampel bagi analisis LC-MS dan LC-

MS/MS 45

3.2.5 Parameter analisis GC-MS 45

3.2.6 Parameter analisis LC-MS 46 3.2.7 Pemprosesan data GC-MS 46 3.2.8 Pemprosesan data LC-MS 47 3.2.9 Analisis multivariat 49

3.2.10 Analisis bioinformatik 49

BAB IV HASIL

4.1 Perbandingan Kaedah Pengekstrakan Metabolit 50

4.1.1 Perbandingan lima kaedah pengekstrakan metabolit

disertai proses derivatisasi MSTFA bagi analisis GC-

MS 50 4.1.2 Perbandingan dua kaedah pengekstrakan metabolit

disertai derivatisasi menggunakan BSTFA bagi

analisis GC-MS 59

4.1.3 Perbandingan dua kaedah pengekstrakan serta mod

pengionan berbeza bagi analisis LC-MS 67

4.2 Pemprofilan Metabolit Tisu Perikarpa, Isi dan Biji Manggis

daripada Empat Peringkat Pemasakan Berbeza 68

4.2.1 Pemprofilan metabolit putatif menggunakan analisis

GC-MS 68 4.2.2 Pemprofilan metabolit putatif menggunakan analisis

LC-MS 76 4.2.3 Analisis tapak jalan metabolomik 90

BAB V PERBINCANGAN

5.1 Perbandingan Kaedah Pengekstrakan Metabolit 94

5.1.1 Perbandingan keberkesanan derivatisasi menggunakan

MSTFA dan BSTFA terhadap pengesanan dan

pengenalpastian metabolit 94

viii

5.1.2 Perbandingan jenis dan nisbah pelarut serta teknik lisis

terhadap pengekstrakan metabolit menggunakan lima

kaedah pengekstrakan berbeza dan derivatisasi

MSTFA 96

5.1.3 Kesan nisbah pelarut terhadap pengekstrakan

metabolit menggunakan dua kaedah pengekstrakan

berbeza dan derivatisasi BSTFA 99 5.1.4 Perbandingan kaedah pengekstrakan dan mod

pengionan LC-MS terhadap pengenalpastian metabolit 101

5.2 Pengawalaturan Metabolisme Metabolit Primer dan Sekunder

Semasa Pemasakan Manggis 102

5.2.1 Analisis multivariat mendedahkan pemisahan

kelompok metabolit mengikut peringkat pemasakan

berdasarkan jenis tisu yang berbeza 102 5.2.2 Pengawalaturan metabolik gula, asid amino, asid

organik serta fitohormon menyumbang kepada ciri-ciri

pemasakan manggis 103

5.2.3 Pengawalaturan dinamik metabolisme sekunder

manggis melibatkan metabolit fenolik, terpenoid,

alkaloid dan xanton 107

BAB VI KESIMPULAN DAN CADANGAN

6.1 Kesimpulan 114

6.2 Cadangan Kajian Lanjutan 116

RUJUKAN 118

Lampiran A Perbandingan Kromatogram Ion Jumlah (TIC) bagi Lima

Kaedah Pengekstrakan Berbeza (Kaedah 1, 2, 3, 4 dan 5) 140

Lampiran B Senarai Metabolit yang Dikenalpasti daripada Lima Kaedah

Pengekstrakan Berbeza (Kaedah 1, 2, 3, 4 dan 5) Menggunakan

Analisis GC-MS 141

Lampiran C Plot VIP bagi Analisis Perbandingan Lima Kaedah

Pengekstrakan 145

Lampiran D Perbandingan Kromatogram Ion Jumlah (TIC) bagi Sampel

Perikarpa, Isi dan Biji Manggis Menggunakan Kaedah

Pengekstrakan 3 146

ix

Lampiran E Perbandingan Kromatogram Ion Jumlah (TIC) bagi Sampel

Perikarpa, Isi dan Biji Manggis Menggunakan Kaedah

Pengekstrakan 5 147

Lampiran F Senarai Metabolit yang Dikenalpasti daripada Dua Kaedah

Pengekstrakan Berbeza (Kaedah 3 dan 5) Menggunakan

Analisis GC-MS 148

Lampiran G Plot VIP bagi Analisis Perbandingan Dua Kaedah

Pengekstrakan (Kaedah 3 dan 5) 151

Lampiran H Senarai Puncak (Pasangan RT: m/z) dalam Kromatogram bagi

Analisis Perbandingan Kaedah Pengekstrakan 1 dan 5 pada

Dua Mod Pengionan LC-MS 152

Lampiran I Senarai Metabolit daripada Analisis Pemprofilan Menggunakan

GC-MS 158

Lampiran J Senarai Metabolit VIP ≥1.00 yang Dikenalpasti daripada

Analisis GC-MS 162

Lampiran K Senarai Metabolit daripada Analisis Pemprofilan Menggunakan

LC-MS 163

Lampiran L Senarai RT: m/z yang Tidak Dapat Dikenalpasti daripada

Analisis LC-MS 171

Lampiran M Senarai Metabolit VIP ≥1.00 yang Dikenalpasti daripada

Analisis LC-MS 177

Lampiran N Senarai Metabolit Bukan Berpengaruh Tinggi yang

Dikenalpasti Melalui Kedua-dua Analisis LC-MS dan LC-

MS/MS 179

Lampiran O Struktur Molekul α-Mangostin Berserta Kedudukan Tapak

Fragmentasi yang Dicadangkan 180

x

SENARAI JADUAL

No. Jadual Halaman

Jadual 2.1 Perbezaan buah manggis dengan mesta 14

Jadual 2.2 Indeks kematangan manggis di Malaysia 15

Jadual 2.3 Klasifikasi terpenoid 22

Jadual 2.4 Kajian metabolomik terhadap pemasakan buah menggunakan

teknik nuklear magnetik resonans (NMR) dan spektrometri jisim

(MS) 33

Jadual 3.1 Senarai pangkalan data umum yang digunakan untuk

pengenalpastian metabolit bagi data daripada analisis LC-MS 48

Jadual 4.1 Ringkasan bagi lima kaedah pengekstrakan yang berbeza daripada

segi campuran pelarut, nisbah pelarut dan kaedah lisis 51

Jadual 4.2 Senarai metabolit yang diperoleh daripada analisis gambar rajah

Venn untuk pengekstrakan metabolit daripada perikarpa manggis

peringkat 6 menggunakan lima kaedah pengekstrakan berbeza 57

Jadual 4.3 Ringkasan bagi dua kaedah pengekstrakan (kaedah 3 dan 5) yang

berbeza dari segi nisbah pelarut 60

Jadual 4.4 Hasil analisis gambar rajah Venn bagi pengekstrakan metabolit

daripada tisu perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6

menggunakan dua kaedah pengekstrakan berbeza (kaedah 3 dan 5) 65

Jadual 4.5 Perbandingan dua kaedah pengekstrakan dan mod pengionan bagi

analisis LC-MS untuk sampel perikarpa manggis peringkat 6 68

Jadual 4.6 Analisis sisa ramalan pengesahan silang-analisis varians (CV-

ANOVA) model PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit

perikarpa, isi dan biji manggis pada peringkat pemasakan berbeza

menggunakan GC-MS 73

Jadual 4.7 Analisis sisa ramalan pengesahan silang-analisis varians (CV-

ANOVA) model PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit


menggunakan LC-MS 80

Jadual 4.8 Senarai metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 dan p ≤0.05)

yang dikenalpasti melalui analisis LC-MS/MS 87

xi

Jadual 4.9 Hasil analisis tapak jalan metabolomik (MetPA) 90

xii

SENARAI RAJAH

No. Rajah Halaman

Rajah 2.1 Corak pemasakan buah klimakterik dan bukan klimakterik 9

Rajah 2.2 Keratan rentas buah manggis 13

Rajah 2.3 Struktur rangka asas xanton 18

Rajah 2.4 Xanton utama di dalam manggis 20

Rajah 2.5 Sistem kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-MS) 35

Rajah 2.6 Sistem kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS) 36

Rajah 4.1 Bilangan dan jenis metabolit yang diekstrak daripada perikarpa

manggis peringkat 6 menggunakan lima kaedah pengekstrakan

berbeza 53

Rajah 4.2 Plot skor PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan taburan

metabolit di dalam perikarpa manggis peringkat 6 menggunakan

lima kaedah pengekstrakan berbeza 54

Rajah 4.3 Plot pemuatan PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan

taburan metabolit di dalam perikarpa manggis peringkat 6

menggunakan lima kaedah pengekstrakan berbeza 55

Rajah 4.4 Analisis gambar rajah Venn untuk analisis perbandingan lima

kaedah pengekstrakan bagi perikarpa manggis peringkat 6 57

Rajah 4.5 Bilangan dan jenis metabolit yang diekstrak daripada perikarpa, isi

dan biji manggis peringkat 6 menggunakan dua kaedah

pengekstrakan berbeza (kaedah 3 dan 5) 60

Rajah 4.6 Plot skor PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan taburan

metabolit di dalam perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6


Rajah 4.7 Plot pemuatan PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan

taburan metabolit di dalam tisu perikarpa, isi dan biji manggis

peringkat 6 menggunakan dua kaedah pengekstrakan berbeza

(kaedah 3 dan 5) 63

xiii

Rajah 4.8 Analisis gambar rajah Venn yang membandingkan metabolit yang

diekstrak daripada tisu perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6


Rajah 4.9 Analisis PCA dan PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit


menggunakan GC-MS 70

Rajah 4.10 Ujian permutasi validasi model PLS-DA bagi analisis pemprofilan

metabolit perikarpa, isi dan biji manggis pada peringkat

pemasakan berbeza menggunakan GC-MS 72

Rajah 4.11 Graf metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 and p ≤0.05) bagi

kumpulan metabolit gula (a), glikosida gula (b), asid gula (c),

alkohol gula (d), alkohol (e), asid organik (f), aldehid (g) dan lain-

lain (h) 74

Rajah 4.12 Analisis PCA dan PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit


menggunakan LC-MS 78

Rajah 4.13 Ujian permutasi validasi model PLS-DA bagi analisis pemprofilan

metabolit perikarpa, isi dan biji manggis pada peringkat

pemasakan berbeza menggunakan LC-MS 79


kumpulan metabolit gula (a), asid gula (b), fosfat gula (c),

glikosida (d), asid organik (e), asid lemak (f), asid amino dan

terbitan (g), kuinon (h), alkaloid (i), terpenoid (j) dan xanton (k) 82


kumpulan metabolit fenolik (a) dan lain-lain (b) 83

Rajah 4.16 Pemetaan metabolit dalam tapak jalan metabolik pemasakan

manggis 93

xiv

SENARAI SINGKATAN

Δppm Ralat jisim molekul

1-MCP 1-Metilsiklopropena

ACC Asid 1-aminosiklopropana-1-karboksilik

AMDIS Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification

System

ANOVA Analisis varians

APCI Pengionan kimia tekanan atmosfera

AutoMS Spektrometri jisim automatik

BSTFA N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroasetamida

CE-MS Elektroforesis kapilari-spektrometri jisim

ChEBI Chemical Entities of Biological Interest

CV-ANOVA Pengesahan silang-analisis varians

DF Darjah kebebasan

DMMBP 1,2-Dimetoksi-13-metil-[1,3]benzodioksolo[5,6-c]fenantridina

ES-242-4 (3S,3'S,4S,4'S)-7,7',9,9'-Tetrametoksi-3,3'-dimetil-3,3',4,4'-

tetrahidro-1H,1'H-5,5'-bibenzo[g]isokromena-4,4',10,10'-tetrol

ESI Pengionan semburan elektro

F Nilai ujian F

FiehnLib Fiehn Metabolomics Library

GC-FID Kromatografi gas-pengesan pengionan api

GC-MS Kromatografi gas-spektrometri jisim

GMD Golm Metabolic Databases

HMDB Human Metabolome Database

HPLC Kromatografi cecair berprestasi tinggi

xv

KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

LC-MS Kromatografi cecair-spektrometri jisim

LC-MS/MS Kromatografi cecair-spektrometri jisim seiring

LC-QTOF-MS Kromatografi cecair-masa penerbangan tetrakutub-spektrometri

jisim

MetPA Analisis tapak jalan metabolit

MRM Pemantauan tindak balas berganda

MS Purata persegi

MS Spektrometri jisim

MSEA Analisis pengkayaan set metabolit

MSTFA N-Metil-N-(trimetilsilil)trifluoroasetamida

m/z Nisbah jisim kepada caj

NIST National Institute of Standards and Technology

NMR Resonans magnetik nuklear satu dimensi

p Nilai kebarangkalian

PC Komponen utama

PCA Analisis komponen utama

PLS-DA Analisis diskriminan-separa kuasa dua terkecil

q Tetrakutub

RI Indeks penahanan

RT Masa penahanan

SAM S-Adenosil-metionina

SD Sisihan piawai

SE Ralat piawai

SIR Rakaman ion terpilih

xvi

SRM Pemantauan tindak balas terpilih

SS Jumlah persegi

TCA Asid trikarboksilik

TIC Kromatogram ion jumlah

TMCS Trimetilklorosilana

TOF Masa penerbangan

UPLC Kromatografi cecair berprestasi ultra

UV Ultraungu

VIP Pembolehubah berkepentingan dalam unjuran

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 PENGENALAN

Pemasakan buah adalah satu proses yang diprogram secara genetik dan melibatkan

pelbagai siri pengubahsuaian daripada aspek fisiologi, biokimia dan struktur buah

seperti perubahan struktur dinding sel, kadar metabolisme, pengumpulan pigmen serta

biosintesis metabolit sekunder (Mworia et al. 2012; Prasanna et al. 2007). Bagi buah

klimakterik, perubahan ini dirangsang oleh peningkatan kadar kandungan hormon

etilena semasa pemasakan terjadi (Osorio et al. 2013). Daripada aspek biokimia, proses

pemasakan melibatkan perubahan pada kadar kandungan metabolit primer seperti gula,

asid organik, alkohol serta metabolit sekunder seperti fenolik, flavonoid, terpenoid dan

alkaloid (Baldi et al. 2018; Osorio & Fernie 2014). Perubahan pada kadar kandungan

metabolit ini turut melibatkan penghasilan pelbagai nutrisi semasa pemasakan seperti

serat, asid askorbik dan pelbagai vitamin serta anti-oksida (Osorio et al. 2013; Prasanna

et al. 2007). Hal ini seterusnya akan menyebabkan perubahan daripada segi fisiologi

buah di mana rupa, tekstur, rasa dan aroma buah akan berubah sehinggalah ianya

mencapai tahap akhir pemasakan. Perubahan yang berlaku ini akan meningkatkan daya

tarikan buah kepada hidupan lain termasuklah manusia dan haiwan, yang seterusnya

membawa kepada penyebaran biji benih secara meluas.

Garcinia mangostana Linn. atau lebih dikenali sebagai manggis yang turut

digelar sebagai “Permaisuri buah” adalah buah tropika yang berasal daripada famili

Clusiaceae. Manggis ditanam secara meluas di selatan Vietnam, Myanmar, Thailand

dan juga Malaysia. Di Malaysia, manggis ditanam secara meluas termasuklah di

beberapa kawasan utama iaitu negeri Perak, Johor, Kelantan, Kedah dan Pahang.

Manggis dikelaskan sebagai buah klimakterik berdasarkan pada peningkatan kadar

2

respirasi dan kadar penghasilan hormon etilena sepanjang proses pemasakan buah ini

terjadi (Lerslerwong et al. 2013; Palapol et al. 2009b). Manggis, terutamanya perikarpa

atau kulit luar manggis digunakan dalam perubatan tradisional untuk mengubati

pelbagai jenis penyakit seperti jangkitan luka, cirit-birit, sakit perut, leukorea, gonorea

dan ulser yang kronik (Chaijaroenkul et al. 2014; Mohamed et al. 2014; Shibata et al.

2011). Pada masa kini, manggis juga telah digunakan sebagai ramuan dalam makanan

tambahan bernutrisi dan produk kosmetik (Mohamed et al. 2014).

Sehingga kini, para penyelidik telah melaporkan bahawa manggis mempunyai

pelbagai manfaat seperti anti-radang, anti-malaria, anti-alergi, anti-oksida dan anti-

kanser (Ayman et al. 2019; Chaijaroenkul et al. 2014; Ibrahim et al. 2016; Mohamed et

al. 2014; Shibata et al. 2011; Thong et al. 2015). Kehadiran pelbagai sebatian bioaktif

terutamanya xanton (Mohamed et al. 2014; Nguyen et al. 2005) telah dilaporkan

menyumbang kepada fungsi biologikal dan farmaseutikal di dalam manggis. Selain itu,

kehadiran metabolit sekunder seperti fenolik, alkaloid dan terpenoid turut menyumbang

kepada bioaktiviti manggis termasuklah sebagai anti-mutagenik, anti-proliperatif dan

anti-mikrob (Kampa et al. 2004; Qin et al. 2017; Zarena & Sankar 2012). Kajian lepas

lebih tertumpu kepada pemencilan dan penggunaan sebatian bioaktif daripada manggis,

namun, mekanisme molekular yang berlaku semasa pemasakan manggis masih belum

difahami serta diperincikan dengan baik dan mendalam terutamanya melibatkan

pengawalaturan penghasilan metabolit primer dan sekunder. Antara faktor utama yang

mempengaruhi perubahan dalam komposisi metabolit buah adalah proses pemasakan.

Justeru itu, pendekatan biologi sistem seperti metabolomik diketengahkan dalam kajian

ini untuk mengkaji corak perubahan metabolit manggis semasa proses pemasakan

terjadi seterusnya merungkai pemasakan manggis yang kompleks.

Metabolomik digunakan untuk mengkaji pelbagai metabolit sasaran atau bukan

sasaran yang mempunyai berat molekular yang rendah (50-1500 Dalton) secara global

(Aretz & Meierhofer 2016; Patti et al. 2012; Zhang et al. 2016). Sehingga kini,

metabolomik telah diaplikasikan secara meluas dalam pelbagai cabang penyelidikan

termasuklah kajian toksikologi tumbuhan, nutrisi, sains tumbuhan dan biologi sistem

(Robertson et al. 2011; Sumner et al. 2003). Metabolomik didefinisikan sebagai analisis

pemprofilan metabolit secara komprehensif di dalam cecair biologi, sel, tisu, organ atau

3

organisma (Johnson et al. 2016). Analisis metabolomik menawarkan pengukuran

metabolit secara kualitatif dan kuantitatif untuk mengenalpasti metabolit yang

memainkan peranan sama ada sebagai substrat atau produk dalam sesuatu tapak jalan

biokimia (Aizat et al. 2014; Fiehn 2002) dan merupakan kaedah yang berpotensi tinggi

untuk mengkaji dan meneroka pengawalaturan fungsi dan selular daripada mana-mana

sampel hidupan (Patti et al. 2012). Metabolit bertindak sebagai rekod visual bagi

keadaan selular dan merupakan gambaran langsung kepada fenotip dan aktiviti

biokimia, berbeza dengan gen atau protein (Baharum & Azizan 2018; Patti et al. 2012).

Ini disebabkan fungsi gen dipengaruhi oleh pengawalaturan epigenetik dan protein pula

dipengaruhi oleh modifikasi pasca-translasi (Patti et al. 2012).

Analisis metabolomik umumnya dikategorikan kepada dua iaitu analisis sasaran

dan analisis bukan sasaran. Analisis sasaran memfokuskan kepada pengukuran

metabolit tertentu yang telah disasarkan. Analisis ini diaplikasikan untuk menilai aras

sesuatu sebatian di dalam sampel yang wujud dalam keadaan atau rawatan tertentu.

Kaedah ini kebiasaannya memerlukan tahap penulenan sebatian yang lebih tinggi dan

kaedah pemencilan metabolit yang spesifik terhadap metabolit yang ingin dipencilkan.

Berbeza dengan kaedah analisis bukan sasaran (turut dikenali sebagai analisis

komprehensif), analisis ini memfokuskan kepada pengenalpastian metabolit secara

maksimum dan melibatkan lebih daripada satu tapak jalan biokimia (Cevallos-Cevallos

et al. 2009; Patti et al. 2012; Soga et al. 2003).

Terdapat dua jenis teknik utama yang sering digunakan dalam kajian

metabolomik iaitu resonans magnetik nuklear (NMR) dan spektrometri jisim (MS). MS

sering digabungkan dengan sistem pemisah sebatian seperti kromatografi gas (GC),

kromatografi cecair (LC) atau elektroforesis kapilari (CE) (Aizat et al. 2014; Goodacre

et al. 2004; Patti et al. 2012). Pengasingan sebatian bagi analisis GC-MS dilakukan

berdasarkan kadar kemeruapan sebatian dengan cara mengalirkan gas lengai seperti

helium, nitrogen, argon atau hidrogen yang akan bertindak untuk membawa sampel

melalui fasa pegun di dalam kolum (Hussain & Maqbool 2014). Sebatian yang

mempunyai kadar kemeruapan yang lebih tinggi akan berimigrasi dengan lebih pantas

di dalam kolum berbanding sebatian yang mempunyai kadar kemeruapan yang lebih

redah. Bagi sebatian berkutub yang tidak meruap, proses derivatisasi kimia diperlukan

4

untuk menukarkan sebatian ini kepada molekul terbitan yang meruap dan stabil haba

bagi membolehkan sebatian ini sesuai untuk dianalisis menggunakan sistem GC-MS.

Sistem LC mampu memisahkan pelbagai jenis sebatian organik dengan efektif

termasuklah molekul kecil, peptida, protein dan juga metabolit gula (Kang 2012).

Aplikasi kaedah LC-MS dalam kajian metabolomik telah berkembang secara meluas

setelah beberapa teknik pengionan seperti sumber ion tekanan atmosfera (API),

pengionan semburan elektro (ESI) dan pengionan kimia tekanan atmosfera (APCI)

diperkenalkan. Teknik-teknik ini mempunyai tahap sensitiviti yang tinggi sekali gus

membolehkan sistem ini mengenalpasti dan memisahkan sebatian dalam julat yang

lebih luas berbanding kaedah GC-MS (Kang 2012). Teknologi LC-MS menggabungkan

teknik pemisahan kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) yang mempunyai

resolusi tinggi dan fungsi analisis yang fleksibel dengan pengenalpastian metabolit

menggunakan komponen MS (Shulaev 2006). Komponen sebatian akan dipisahkan di

dalam kolum HPLC dan seterusnya memasuki bahagian MS di mana ion yang terhasil

daripada sebatian akan dikenal pasti. Analisis LC-MS seringkali diikuti dengan analisis

spektrometri jisim seiring (MS/MS) menggunakan teknik seperti spektrometri jisim

automatik (AutoMS) dan pemantauan tindak balas berganda (MRM) untuk kajian yang

lebih teliti dan mendalam mengenai sifat molekular sesuatu metabolit.

Umumnya, analisis GC-MS digunakan untuk mengenalpasti dan

mengkuantifikasi sebatian meruap dan stabil haba seperti alkohol dan minyak pati

tumbuhan (Baharum et al. 2010) serta kumpulan metabolit berkutub dan semi-kutub

yang kebanyakannya terdiri daripada metabolit primer seperti gula, asid organik dan

asid amino (Gullberg et al. 2004; Lee et al. 2013; Okazaki et al. 2016; t’Kindt et al.

2009). Sementara itu, analisis LC-MS pula memfokuskan kepada jenis metabolit yang

lebih pelbagai serta mempunyai struktur yang lebih kompleks, merangkumi metabolit

primer (seperti gula disakarida dan polisakarida) serta metabolit sekunder (seperti

fenolik, flavonoid, alkaloid dan xanton), bergantung kepada jenis fasa pegun yang

digunakan di dalam sistem LC-MS (De Vos et al. 2007; Lee et al. 2013; t’Kindt et al.

2009).

5

Bagi kajian ini, kedua-dua analisis GC-MS dan LC-MS telah digunakan untuk

mengenalpasti dan mengukur aras metabolit jumlah bagi perikarpa, isi dan biji manggis

daripada peringkat pemasakan yang berbeza iaitu peringkat 0 (hijau), 2 (hijau

kekuningan disertai tompokan merah jambu), 4 (merah keperangan) dan 6 (ungu gelap)

yang ditentukan berdasarkan Indeks Kematangan Manggis Malaysia (Osman & Milan

2006). Data daripada kedua-dua sistem analitikal GC-MS dan LC-MS diproses dan

dikaji menggunakan beberapa analisis seperti analisis statistik univarit dan multivariat

serta analisis tapak jalan metabolik. Akhir sekali, mekanisme molekular semasa proses

pemasakan manggis telah dirungkaikan dan dibincangkan berdasarkan corak perubahan

metabolit manggis semasa proses ini terjadi. Kajian ini membekalkan maklumat asas

yang boleh digunakan bagi penghasilan teknologi untuk meningkatkan jangka hayat

lepas tuai buah manggis dan penambahbaikan proses penyimpanan buah manggis,

seterusnya meningkatkan nilai komersial dan ekonomi buah tropika ini. Secara tidak

langsung, kadar pengeksportan buah manggis akan turut meningkat.

1.2 PERMASALAHAN KAJIAN

Penggunaan manggis, terutamanya kulit buah manggis sebagai bahan perubatan

alternatif untuk mengubati pelbagai jenis penyakit terutamanya luka dan cirit-birit telah

bermula sejak beberapa abad yang lepas (Osman & Milan 2006). Potensi manggis

sebagai ejen penyembuhan ini mendapat perhatian para penyelidik serta industri yang

seterusnya membawa kepada penggunaan buah ini dalam penghasilan pelbagai jenis

ubat-ubatan, produk makanan tambahan dan juga produk kosmetik (Mohamed et al.

2014). Di Malaysia, manggis pernah dipilih sebagai buah kemegahan negara dalam

Dasar Pertanian Negara Ketiga (1998-2010) (Abu Dardak et al. 2011). Kualiti manggis

dari negara ini yang tinggi dan bebas daripada bahan kimia diterima baik serta mendapat

permintaan tinggi daripada negara Eropah dan China (Abu Dardak et al. 2011). Pasaran

manggis turut dijangka terus berkembang dan permintaan manggis segar dunia dijangka

meningkat sebanyak lebih 3% setahun kerana wujudnya pasaran baru di negara Arab

seperti Arab Saudi, Emeriah Arab Bersatu dan Qatar (Abu Dardak et al. 2011).

Namun, pada tahun 2017, laporan statistik yang dikeluarkan oleh Lembaga

Pemasaran Pertanian Persekutuan (FAMA), Malaysia menyatakan kadar pengeksportan

6

manggis ke negara luar telah berkurang sebanyak 63.6% pada tahun 2015 berbanding

tahun sebelumnya iaitu tahun 2014 (Lembaga Pemasaran Pertanian Persekutuan 2017).

Antara salah satu faktor yang menyebabkan kemerosotan dari segi kadar eksport

manggis adalah persaingan daripada negara jiran seperti Thailand dan Indonesia.

Justeru itu, kualiti manggis yang dieksport haruslah dititikberatkan kerana faktor ini

mempengaruhi permintaan manggis di pasaran. Teknologi lepas tuai memainkan

peranan penting dalam memastikan manggis dapat dieksport dalam keadaan yang

terbaik. Kunci kepada penambahbaikan dan peningkatan kualiti buah adalah dengan

memahami mekanisme pemasakan sesuatu buah itu.

Walau bagaimanapun, mekanisme pemasakan manggis yang kompleks masih

tidak difahami dengan jelas dan terperinci sehingga kini. Manggis yang dituai pada

peringkat pemasakan yang berbeza akan menghasilkan kualiti buah masak yang berbeza

kerana kadar metabolit termasuklah sebatian bioaktif seperti fenolik dan xanton di

dalam buah manggis dipengaruhi oleh beberapa faktor termasuklah peringkat

pemasakan dan pengurusan lepas tuai buah (Palapol et al. 2009b; Zadernowski et al.

2009). Selain itu, identiti serta kadar sebatian bioaktif ini serta metabolit sekunder yang

lain seperti terpenoid dan alkaloid di dalam buah manggis pada peringkat pemasakan

yang berbeza masih belum dilaporkan dengan terperinci. Perbezaan kandungan

metabolit antara tisu manggis yang berbeza juga masih tidak jelas dan memerlukan

kajian lanjutan bagi meneroka metabolit jumlah daripada tisu ini.

Pendekatan metabolomik digunakan dalam kajian ini untuk mengkaji corak

perubahan metabolit semasa proses pemasakan manggis sekaligus merungkai

mekanisme pemasakan manggis dan seterusnya mendalami proses molekular yang

terlibat. Justeru itu, pemahaman ini akan menjadi asas serta membantu kepada kajian

seterusnya pada masa hadapan. Pemahaman ini diharap turut dapat menyumbang

kepada industri pertanian di negara ini melalui penghasilan bahan atau teknik bagi

kawalan tanaman di ladang atau melalui penambahbaikan teknologi lepas tuai buah.

Hal ini seterusnya akan meningkatkan nilai komersial buah-buahan tempatan

terutamanya manggis, serta industri pembuatan seperti penghasilan makanan dan

minuman, produk kosmetik serta pil makanan tambahan berasaskan manggis.

7

1.3 OBJEKTIF KAJIAN

1.3.1 Objektif umum

Matlamat kajian ini adalah untuk mengkaji corak perubahan metabolit manggis semasa

proses pemasakan dengan cara memprofil metabolit manggis pada peringkat

pemasakan yang berbeza iaitu peringkat 0, 2, 4 dan 6. Tisu manggis yang berbeza iaitu

perikarpa, isi dan biji digunakan untuk perbandingan yang lebih terperinci.

1.3.2 Objektif khusus

Objektif bagi kajian ini adalah seperti berikut:

1) Mendapatkan kaedah pengekstrakan metabolit daripada manggis yang sesuai

dengan membandingkan faktor jenis dan nisbah pelarut serta teknik

pengekstrakan

2) Memprofil metabolit daripada perikarpa, isi dan biji manggis pada empat

peringkat pemasakan yang berbeza iaitu peringkat 0, 2, 4 dan 6 menggunakan

kaedah GC-MS dan LC-MS

3) Pemetaan tapak jalan biokimia pemasakan manggis menggunakan analisis

bioinformatik

8

BAB II

KAJIAN KEPUSTAKAAN

2.1 PEMASAKAN BUAH

Buah-buahan merupakan makanan yang mempunyai kepentingan dari segi ekonomi

serta memainkan peranan penting dalam diet pemakanan manusia dan haiwan herbivor

dengan membekalkan pelbagai nutrien seperti vitamin, serat dan mineral yang

diperlukan untuk mengekalkan hidup yang sihat (Giovannoni et al. 2017; Osorio &

Fernie 2014). Buah-buahan yang masak menjadi tarikan kepada hidupan yang turut

bertindak sebagai agen penting dalam penyebaran dan evolusi perkembangan biji benih

(Giovannoni et al. 2017). Proses pemasakan buah bermula apabila biji benih buah telah

mengalami proses pertumbuhan dan perkembangan yang lengkap.

Pemasakan buah merupakan satu proses yang kompleks, tersusun dan telah

dijadualkan secara genetik yang membawa kepada penghasilan rasa buah yang enak

disertai dengan aroma yang harum (Giovannoni 2001; Giovannoni et al. 2017; Osorio

& Fernie 2014). Proses pemasakan buah melibatkan satu siri perubahan dan

pengubahsuaian dari aspek fisiologi, biokimia serta struktur buah yang menyebabkan

perubahan pada rupa, tekstur, rasa dan aroma buah. Perubahan dan pengubahsuaian ini

termasuklah pada kadar metabolisme, peleraian dan penyusunan semula polisakarida

dinding sel, penghasilan dan pengumpulan pigmen serta penghasilan metabolit

sekunder (Giovannoni et al. 2017; Mworia et al. 2012; Prasanna et al. 2007).

2.1.1 Buah klimakterik dan bukan-klimakterik

Terdapat dua pengkelasan utama bagi pemasakan buah iaitu buah klimakterik dan

bukan-klimakterik yang ditentukan berdasarkan perbezaan pada kadar respirasi dan

9

kadar penghasilan hormon etilena (Aizat et al. 2013; Giovannoni 2001; Giovannoni et

al. 2017; Saladié et al. 2015) seperti yang dipamerkan di dalam Rajah 2.1 di bawah.

Buah klimakterik seperti tomato, pisang, avokado, epal dan manggis mengalami

peningkatan pada kadar respirasi dan kadar penghasilan hormon etilena sepanjang

proses pemasakan berlaku (Giovannoni et al. 2017; Osorio & Fernie 2014; Osorio et al.

2013). Kadar hormon etilena adalah minimum pada peringkat awal pemasakan dan

meningkat secara mendadak sehingga mencapai kadar optimum semasa kemuncak

proses pemasakan, seterusnya menurun pada peringkat akhir pemasakan sebelum buah

memasuki fasa senesens (Kou & Wu 2018; Paul et al. 2012; Prasanna et al. 2007) (Rajah

2.1).

Hormon etilena diperlukan untuk pengawalaturan serta untuk melengkapkan

proses pemasakan dalam buah klimakterik (Osorio et al. 2013). Oleh itu, buah

klimakterik boleh mengalami pemasakan yang sempurna meskipun telah berpisah

daripada pokok induk. Berbeza dengan buah bukan-klimakterik seperti strawberi dan

buah-buahan sitrus yang mana ianya tidak bergantung kepada kehadiran hormon etilena

untuk merangsang proses pemasakan. Proses pemasakan buah bukan klimakterik akan

terhenti sekiranya buah terpisah daripada pokok induk sebelum proses pemasakan

lengkap (Kou & Wu 2018; Paul et al. 2012).

Rajah 2.1 Corak pemasakan buah klimakterik dan bukan klimakterik

Sumber: Paul dan Pellny (2003)

10

2.1.2 Perubahan struktur dan degradasi dinding sel

Pelembutan buah yang berlaku disebabkan perubahan atau degradasi pada struktur

polisakarida dinding sel adalah antara fenomena utama yang terjadi semasa proses

pemasakan (Brummell 2006; Osorio & Fernie 2014). Kelas-kelas utama polisakarida

dinding sel yang terlibat semasa pemasakan buah adalah pektin, selulosa dan

hemiselulosa (Brummell 2006). Pelembutan buah semasa proses pemasakan tidak

semestinya melibatkan perubahan pada keseluruhan komposisi dinding sel tetapi ianya

berlaku mungkin hanya disebabkan perubahan pada sebahagian daripada komponen

polisakarida (Robinson & Davies 2000). Pelembutan buah semasa proses pemasakan

terjadi disebabkan berlakunya pengubahsuaian pada polisakarida dinding sel primer

serta lamela tengah yang menyebabkan struktur sel menjadi lemah. Lamela tengah

adalah lapisan yang kaya dengan pektin yang berada di antara sel dan bertindak sebagai

penyambung antara sel (Jarvis et al. 2003; Saladié et al. 2007).

Kajian lepas menggunakan mikroskop elektron mendapati bahawa pembubaran

pada lapisan lamela tengah adalah merupakan perubahan awal yang belaku pada

dinding sel semasa proses pemasakan terjadi (Crookes & Grierson 1983; Hallett et al.

1992). Proses ini diikuti dengan gangguan pada lapisan dinding sel primer, menandakan

telah berlakunya proses degradasi yang signifikan pada dinding sel (Brummell 2006).

Seterusnya, perubahan pada ikatan antara polimer akan menyebabkan pemisahan sel

meningkat, dan apabila disertai dengan perubahan turgor akan menyebabkan

pelembutan dan perubahan pada struktur buah (Brummell 2006). Tekanan turgor

dikatakan menurun semasa pemasakan buah (Harker & Sutherland 1993; Shackel et al.

1991) disebabkan pengumpulan larutan osmotik di dalam apoplas serta kehilangan

kandungan air di dalam buah. Pengurangan pada tekanan turgor ini seterusnya akan

mengurangkan tekanan pengembangan terhadap dinding sel buah (Brummell 2006).

2.1.3 Perubahan kandungan metabolit primer dan sekunder

Kebanyakan buah mengalami perubahan dari segi warna, rasa, tekstur, aroma dan juga

rintangan terhadap patogen semasa proses pemasakan berlaku (Giovannoni 2001;

Giovannoni et al. 2017). Perkembangan pada rasa, warna dan aroma buah terjadi

disebabkan penghasilan dan perubahan kandungan metabolit primer dan sekunder

11

(Baldi et al. 2018; Osorio & Fernie 2014). Metabolit primer adalah merupakan sebatian

perantara bagi tapak jalan katabolik dan anabolik yang terjadi dalam semua tumbuhan

seperti gula dan terbitan (metabolit terbitan gula seperti asid gula, alkohol gula dan

fosfat gula), asid organik, asid amino dan asid lemak.

Metabolit primer berperanan penting dalam pertumbuhan dan perkembangan

tumbuhan serta diperlukan oleh tumbuhan untuk terus hidup. Kumpulan metabolit ini

terlibat secara langsung dalam proses fotosintesis, kitaran Krebs (kitaran asid

trikarboksilik) serta rantaian pengangkutan elektron (Klaser Cheng 2017). Gula atau

gula alkohol ditukarkan ke dalam bentuk kanji di dalam buah (contoh: mangga, pisang,

buah kiwi) atau lipid (contoh: zaitun) atau disimpan oleh buah dalam bentuk gula

penurun (contoh: tomato) dan sukrosa (contoh: tembikai, anggur) (Osorio & Fernie

2014). Sukrosa, glukosa dan fruktosa adalah metabolit gula yang paling banyak terdapat

di dalam tumbuhan serta merupakan komponen makanan yang terbanyak diperoleh

daripada tumbuhan. Rasa buah yang manis ditentukan oleh jumlah kandungan gula serta

nisbah antara gula yang berlainan yang hadir di dalam buah. Kemanisan buah adalah

ciri-ciri utama buah yang menentukan kualiti buah tersebut.

Selain daripada metabolit gula, asid organik juga adalah metabolit penting yang

menyumbang kepada rasa dan kualiti buah (Osorio & Fernie 2014). Asid organik turut

berperanan sebagai pelopor kepada biosintesis pelbagai metabolit sekunder (Klaser

Cheng 2017). Kandungan asid organik bergantung kepada beberapa aktiviti tapak jalan

utama seperti glikolisis dan kitaran asid trikarboksilik (TCA). Asid organik utama

terdapat dalam buah adalah metabolit perantaraan sitrat dan malat. Manakala, beberapa

metabolit perantaraan TCA yang lain iaitu oksalat, suksinat, isositrat dan fumarat hadir

dalam jumlah yang lebih rendah berbanding sitrat dan malat (Klaser Cheng 2017).

Metabolit sekunder pula tidak terlibat secara langsung dalam pertumbuhan dan

perkembangan tumbuhan (Klaser Cheng 2017; Lattanzio et al. 2008). Namun,

kumpulan metabolit ini diperlukan oleh tumbuhan untuk adaptasi dengan alam sekitar

termasuklah untuk ketahanan tumbuhan terhadap serangan herbivor, patogen, penyakit,

haiwan penyebar biji benih serta tekanan abiotik (hujan, kemarau dan sebagainya)

(Lattanzio et al. 2008; Wink & Schimmer 2018).

12

Selain itu, metabolit sekunder juga berperanan sebagai isyarat untuk penyebaran

biji benih dan pendebungaan (Wink & Schimmer 2018). Berbeza dengan metabolit

primer yang hadir dalam kebanyakan tumbuhan, metabolit sekunder lebih bersifat

spesifik terhadap sesetengah spesies tumbuhan atau hanya dihasilkan dan terkumpul

dalam sesetengah tisu bagi tumbuhan tersebut (Klaser Cheng 2017; Lattanzio et al.

2008). Biosintesis metabolit sekunder adalah melibatkan beberapa tapak jalan utama

iaitu tapak jalan sikimat, mevalonat dan asetat ( Klaser Cheng 2017; Lattanzio et al.

2008). Tapak jalan sikimat menghasilkan metabolit fenilpropanoid manakala tapak

jalan mevalonat pula menghasilkan terpenoid. Asid lemak dan poliketida pula terhasil

melalui tapak jalan asetat (Klaser Cheng 2017; Lattanzio et al. 2008). Kumpulan

metabolit ini menyumbang kepada rasa, warna, dan kadar rintangan buah terhadap

tekanan biotik dan abiotik semasa proses pemasakan terjadi (Baldi et al. 2018; Tohge

et al. 2014).

2.2 Garcinia mangostana Linn.

Garcinia mangostana Linn. merupakan salah satu buah-buahan tropika yang ditanam

secara meluas di negara-negara Asia Tenggara termasuklah Selatan Vietnam,

Myanmar, Thailand dan Malaysia. Umumnya, Garcinia mangostana Linn. tergolong

dalam famili Clusiaceae (Guttiferae) dan dikenali sebagai manggis di Malaysia. Selain

itu, buah ini juga turut dikenali dengan beberapa nama lain iaitu masta, mestor,

sementoh atau semetah di Malaysia dan Indonesia, mangkhut di Thailand, cay mang cut

di Vietnam, mangostan di Filipina dan mangostin di India (Osman & Milan 2006). Di

Malaysia, penanaman manggis bertumpu di beberapa negeri utama iaitu Johor,

Kelantan, Perak, Kedah dan Pahang (Abu Dardak et al. 2011; Jabatan Pertanian Negeri

Pulau Pinang 2018).

Pokok manggis merupakan sejenis tumbuhan malar hijau tropika yang

mempunyai batang berkayu dengan ketinggian antara 6-15 meter (Osman & Milan

2006) dan kanopi pokok yang membentuk piramid bersaiz sederhana iaitu 9-12 meter

lebar. Tumbuhan berbunga ini mempunyai daun berwarna hijau yang berbentuk bujur

dan eliptik, berukuran antara 15-25 cm panjang dan 7-13 cm lebar serta mempunyai

struktur yang tebal, keras dan licin (Brunner & Morales-Payan 2010; Failla &

13

Gutiérrez-Orozco 2017; Jabatan Pertanian Negeri Pulau Pinang 2018; Osman & Milan

2006). Setiap organ pokok manggis termasuk daun, batang dan buah manggis

menghasilkan getah berwarna kuning (Lan 1989; Osman & Milan 2006).

Buah manggis pula bersaiz purata antara 6-8 cm daripada garis pusat. Kulit buah

manggis mempunyai permukaan yang licin dan bulat serta mempunyai warna yang

berubah mengikut peringkat pemasakan (daripada warna hijau kepada ungu gelap).

Kulit manggis mempunyai ketebalan antara 0.6-1.0 cm (Jabatan Pertanian Negeri Pulau

Pinang 2018). Selain itu, terdapat empat hingga lapan bekas kelopak stigma yang akan

kelihatan dengan jelas apabila manggis menghampiri peringkat akhir pemasakan.

Jumlah kelopak stigma ini menunjukkan jumlah isi di dalam setiap buah manggis

(Jabatan Pertanian Negeri Pulau Pinang 2018; Osman & Milan 2006). Isi buah manggis

adalah berwarna putih, bertekstur lembut dan berair serta mempunyai gabungan rasa

masam dan manis disertai aroma yang menyenangkan (Lan 1989; Thong et al. 2015).

Sesetengah isi manggis mempunyai biji yang ringan berwarna perang dan melekat

dengan isi buah manggis. Biji buah manggis yang matang tidak mempunyai

endosperma, rata dan hadir dalam pelbagai saiz yang kebanyakannya adalah

berketebalan 0.3-0.5 cm dan berukuran 1.0-1.5 cm (Lan 1989; Osman & Milan 2006).

Rajah 2.2 di bawah menunjukkan keratan rentas bagi buah manggis:

Rajah 2.2 Keratan rentas buah manggis

Selain daripada manggis, terdapat satu lagi klon Garcinia mangostana L. yang

didaftarkan oleh Jabatan Pertanian Malaysia iaitu mesta. Perbezaan ketara antara

14

manggis dengan mesta adalah mesta mempunyai bentuk yang bujur serta isi yang halus

dan kering tanpa kehadiran biji (Abu Dardak et al. 2011; Sandrang et al. 2015). Batang

pokok mesta pula lebih licin serta mempunyai cabang yang lebih rapat dan rendah

berbanding pokok manggis sementara daun mesta lebih panjang dan tirus. Skop

penanaman mesta di Malaysia adalah lebih kecil berbanding manggis dan

kebanyakannya boleh didapati di Temerloh, Maran dan Kuantan di negeri Pahang

(Sandrang et al. 2015). Selain itu, prospek pasaran manggis di peringkat domestik dan

antarabangsa juga lebih besar berbanding mesta. Justeru itu, manggis digunakan

sebagai organisma pilihan dalam kajian ini. Perbezaan antara buah manggis dengan

mesta dapat dilihat seperti dalam Jadual 2.1.

Jadual 2.1 Perbezaan buah manggis dengan mesta. Buah dituai dari plot tumbuhan

Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM), Bangi, Selangor

Manggis Mesta

Pokok manggis disifatkan sebagai tumbuhan diesius, di mana pokok manggis

terbahagi kepada dua organ pembiakan iaitu “jantan” dan “betina”. Pokok manggis

yang ditanam secara penanaman biji benih mengambil masa selama 6-12 tahun untuk

berbuah bergantung kepada kaedah pengurusan, jenis tanah dan baka. Di Malaysia,

pokok manggis kebiasaannya menghasilkan buah sebanyak dua kali setahun, iaitu

antara bulan Jun-Ogos dan November-Januari (Osman & Milan 2006). Walau

bagaimanapun, tumbuhan bermusim seperti manggis ini boleh dipengaruhi oleh

perubahan pada cuaca persekitaran yang lembap dan kering, menyebabkan sesetengah

pokok hanya berbuah pada salah satu musim sahaja. Cuaca dan persekitaran yang sesuai

akan menggalakkan pendebungaan pokok manggis, seterusnya meningkatkan

penghasilan buah manggis (Apiratikorn et al. 2012; Lerslerwong et al. 2013). Musim

kering yang singkat juga diperlukan untuk merangsang dan memulakan proses antesis

pokok manggis (Osman & Milan 2006). Osman dan Milan (2006) turut melaporkan

15

bahawa julat suhu 25-35°C dan taburan hujan tahunan sebanyak 1200 mm atau lebih

disertai kelembapan yang tinggi tanpa musim kering yang berpanjangan adalah paling

optimum untuk proses antesis manggis.

2.2.1 Proses pemasakan manggis

Proses kematangan manggis umumnya adalah tidak seragam, kesan daripada proses

antesis yang berterusan pada pokok induk (Osman & Milan 2006). Proses kematangan

bermula apabila terdapat perubahan warna pada kulit manggis. Manggis memasuki fasa

kematangan bermula seawal minggu ke-14 selepas antesis dan mengambil masa kira-

kira selama dua minggu iaitu pada minggu ke-14 hingga minggu ke-15. Menurut Indeks

Kematangan Manggis Malaysia seperti yang dilaporkan oleh Osman dan Milan (2006),

proses pemasakan atau kematangan manggis terdiri daripada tujuh peringkat bermula

daripada muda semasa kulit luar manggis (perikarpa) berwarna hijau sehingga masak

di mana perikarpa manggis bertukar kepada ungu gelap. Perincian bagi indeks

kematangan manggis adalah seperti yang dinyatakan dalam Jadual 2.2.

Jadual 2.2 Indeks kematangan manggis di Malaysia

Indeks

kematangan

Tempoh selepas

antesis

Perincian

Peringkat 0

Minggu 12

Buah tidak matang dan berwarna hijau kekuningan.

Perikarpa, isi dan biji manggis belum dapat dipisahkan

sepenuhnya pada peringkat ini. Lapisan getah sangat tebal

pada kulit dalam buah.

Peringkat 1

Minggu 14

(purata 17 hari

selepas peringkat 0)

Buah sedang matang dan berwarna kuning atau hijau

pucat disertai titik merah jambu. Perikarpa, isi dan biji

mulai dapat dipisahkan dengan sempurna. Lapisan getah

tebal pada kulit dalam buah.

Peringkat 3

Minggu 14

(purata 3 hari


Buah menghampiri kematangan dan berwarna merah

jambu yang sekata di keseluruhan perikarpa. Lapisan

getah nipis pada kulit dalam buah. Buah pada peringkat

ini sesuai untuk dituai bagi tujuan eksport.

bersambung...

16

...sambungan

Peringkat 4

Minggu 15

(purata 1-2 hari


Buah matang dan berwarna merah atau merah

keperangan. Perikarpa, isi dan biji dapat dipisahkan

dengan mudah dan sempurna. Getah sangat nipis atau

tiada pada lapisan dalam kulit buah.

Peringkat 5

Minggu 15

(purata 1-2 hari


Buah masak dan berwarna merah-ungu. Tiada kehadiran

getah pada kulit dalam buah. Pada peringkat ini, buah

sesuai dimakan sebagai buah segar.

Peringkat 6

Minggu 15

(purata 1 hari


Buah masak dengan sempurna dan berwarna ungu, ungu

gelap atau hitam. Buah sesuai dimakan sebagai buah

segar tetapi tidak sesuai dieksport kerana mudah rosak.

Sumber: Diadaptasi daripada Osman dan Milan (2006)

Kondo et al. (2002) adalah sebahagian kumpulan penyelidik yang memulakan

kajian awal dalam merungkai mekanisme pemasakan dalam manggis. Kajian ini

memfokuskan kepada metabolisme asid absisik di dalam perikarpa, isi dan biji manggis

dan melaporkan kadar metabolisme yang berbeza pada peringkat perkembangan dan

pematangan manggis di dalam ketiga-tiga tisu ini. Kajian oleh Palapol et al. (2009a)

pula melaporkan faktor transkripsi MYB iaitu GmMYB10 memainkan peranan untuk

mengatur proses biosintesis antosianin dalam manggis semasa pemasakan berlaku.

Sementara itu, perkembangan warna dan kualiti manggis serta kadar penghasilan

hormon etilena dan kandungan antosianin pula dikaji oleh Palapol et al. (2009b) dengan

membandingkan enam peringkat pemasakan manggis yang berbeza. Kajian ini turut

melaporkan antosianin utama yang ditemui pada bahagian luar dan dalam perikarpa

manggis seperti sianidin-soforosida, sianidin-glukosida dan sianidin-

glukosidapentisida melalui analisis kromatografi cecair berprestasi tinggi/ spektrometri

jisim (HPLC/MS).

17

Terbaharu, Abdul-Rahman et al. (2017) mengkaji pemasakan manggis pada

peringkat RNA dengan membandingkan tiga peringkat pemasakan iaitu peringkat 0, 2

dan 6. Kajian ini membekalkan data yang penting untuk kajian-kajian pemprofilan

transkriptom pada masa akan datang. Selain itu, penglibatan metabolit utama seperti

asid 2-aminoisobutirik, pikosa dan beberapa asid amino (fenilanalina, valina dan

isoleusina) telah dilaporkan menunjukkan perubahan yang seiring dengan proses

pemasakan apabila dianalisis menggunakan kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-

MS) (Parijadi et al. 2017). Namun, kajian secara komprehensif terhadap profil metabolit

di dalam manggis semasa pemasakan berlaku masih lagi terhad dan memerlukan kajian

yang lebih mendalam.

2.2.2 Manfaat dan bioaktiviti manggis

Manggis digelar sebagai “Permaisuri buah” ekoran daripada rasanya yang unik dan

enak (Fairchild 1915). Selain itu, manggis juga didapati mengandungi jumlah kalori

yang rendah dan sesuai dimakan begitu sahaja atau ditinkan, dibekukan atau diproses

menjadi jus minuman, kordial, jem atau gula-gula. Perikarpa manggis kebiasaannya

dicampurkan dengan bahan atau buah-buahan lain sebelum dijadikan produk seperti

jus, kapsul makanan tambahan, pencuci muka, atau sabun mandian. Penggunaan

manggis sebagai bahan semula jadi dalam pembuatan produk-produk kosmetik dan

kesihatan semakin meningkat dari semasa ke semasa.

Selain digelar sebagai “Permaisuri Buah”, manggis turut mendapat gelaran

“Buah Masa Hadapan” kerana potensinya untuk dikomersialkan pada masa hadapan

serta “Superfruit” kerana ciri-ciri perubatan yang terdapat pada buah ini (Failla &

Gutiérrez-Orozco 2017; Gutierrez-Orozco & Failla 2013; Saleem 2009). Buah manggis

terutamanya bahagian perikarpa telah digunakan sebagai ramuan dalam perubatan

tradisional oleh masyarakat setempat sejak zaman dahulu lagi kerana keberkesanannya

untuk mengubati pelbagai jenis penyakit termasuklah jangkitan luka, cirit-birit, disentri,

sakit perut, leukorea, gonorea dan ulser kronik (Osman & Milan 2006; Pedraza-

Chaverri et al. 2008; Yaacob & Tindall 1995). Dalam perubatan tradisional, perikarpa

manggis dikeringkan dan disapu pada luka. Bagi tujuan mengubati sakit perut dan

18

disentri pula, perikarpa manggis direbus dan dicampurkan dengan air, air limau atau air

beras sebelum diminum (Osman & Milan 2006; Yaacob & Tindall 1995).

Manggis terkenal dengan kehadiran metabolit bioaktif terutamanya xanton

(Mohamed et al. 2014; Nguyen et al. 2005) yang mempunyai ciri-ciri biologikal dan

farmaseutikal seperti anti-radang (Chen et al. 2008; Ibrahim et al. 2016), anti-malaria

(Chaijaroenkul et al. 2014), anti-alergi (Ibrahim et al. 2016; Nakatani et al. 2002), anti-

oksida (Mohamed et al. 2014; Thong et al. 2015), anti-kanser (Ibrahim et al. 2016;

Matsumoto et al. 2003; Shibata et al. 2011), anti-diabetes (Ibrahim et al. 2016) dan anti-

obesiti (Ibrahim et al. 2016; Liu et al. 2015). Pelbagai kajian telah dilakukan untuk

merungkai potensi manggis sebagai ramuan dalam penjagaan kesihatan melalui

penghasilan ubat-ubatan yang memfokuskan kepada xanton (Failla & Gutiérrez-Orozco

2017; Shan et al. 2011; Watanapokasin et al. 2010).

Kebanyakan xanton adalah terdiri daripada metabolit tidak-berkutub dan semi-

kutub (El-Seedi et al. 2009). Xanton mempunyai struktur kimia yang unik iaitu struktur

sistem aromatik trisiklik (C6-C3-C6). Kehadiran kumpulan fungsi isoprin, metoksil dan

hidroksil di pelbagai lokasi pada cincin A dan B (Rajah 2.3) menghasilkan struktur

xanton yang pelbagai. Xanton yang dipencilkan daripada sumber semula jadi boleh

dikategorikan kepada enam kumpulan iaitu xanton mudah, glikosida xanton, xanton

terprenil, xantonolignoid, bisxanton dan xanton pelbagai (El-Seedi et al. 2010; Vieira

& Kijjoa 2005).

Rajah 2.3 Struktur rangka asas xanton

Sumber: Pangkalan data ChemSpider

19

Sehingga tahun 2012, sebanyak 278 xanton dilaporkan telah ditemui daripada

sumber semula jadi iaitu di dalam 20 famili tumbuhan tinggi (Gentianaceae, Guttiferae,

Moraceae, Clusiaceae dan Polygalaceae) yang merangkumi 122 spesies dan 44 genera.

Selain itu, xanton juga turut dikenalpasti dan dipencilkan daripada 19 spesies kulat dan

tiga spesies liken (Negi et al. 2013; Vieira & Kijjoa 2005). Xanton daripada tumbuhan

tinggi paling banyak di dapati di dalam famili tumbuhan Clusiaceae (55 spesies dalam

12 genera termasuk manggis) dan Gentianaceae (28 spesies dalam 8 genera).

Terdapat sekurang-kurangnya sebanyak 68 xanton telah ditemui dan

dikenalpasti di beberapa bahagian pokok manggis yang berbeza termasuklah perikarpa

(Mohamed et al. 2014; Suksamrarn et al. 2003; Thong et al. 2015), isi (Suksamrarn et

al. 2003; Thong et al. 2015; Wittenauer et al. 2012), biji (Suksamrarn et al. 2003), daun

(Hamid et al. 2012; Parveen & Khan 1988), getah manggis yang berwarna kuning

(Sukatta et al. 2013) serta teras kayu atau batang pokok manggis (Harrison & Nilar

2002). Perikarpa manggis dilaporkan mempunyai kandungan xanton yang paling tinggi

dan terdapat sekurang-kurangnya sebanyak 50 xanton telah dikenalpasti di dalam

perikarpa manggis (El-Seedi et al. 2009; Pedraza-Chaverri et al. 2008). Antara xanton

utama yang ditemui di dalam manggis adalah mangostin (nama mangostin

kemudiannya ditukarkan kepada α-mangostin) yang mula ditemui pada tahun 1855

(Pedraza-Chaverri et al. 2008; Schmid 1855). Selain α-mangostin, β-mangostin, γ-

mangostin, gartanin dan garsinon E juga telah dilaporkan sebagai xanton utama di

dalam manggis (El-Seedi et al. 2010; El-Seedi et al. 2009; Shan et al. 2011; Sukatta et

al. 2013; Wittenauer et al. 2012) (Rajah 2.4).

20

Rajah 2.4 Xanton utama di dalam manggis

Sumber: Pangkalan data METLIN

Selain daripada xanton, manggis juga mengandungi sebatian bioaktif lain yang

terdiri daripada metabolit sekunder seperti tanin, antosianin, prosianidin dan fenolik

termasuklah asid fenolik, fenol dan flavonoid yang semakin menjadi tumpuan para

penyelidik pada masa kini. Pelbagai kajian yang memfokuskan kepada bioaktiviti bagi

metabolit sekunder telah dijalankan, antaranya, Pothitirat et al. (2009) telah

membandingkan aktiviti anti-oksida dan aktiviti bakteria pendorong anti-jerawat bagi

sebatian fenolik, flavonoid dan tanin daripada manggis muda dan matang. Selain itu,

terdapat juga kajian yang telah dijalankan untuk menentukan aktiviti anti-oksida bagi

sebatian prosianidin (Qin et al. 2017) dan sebatian fenolik serta flavonoid (Zarena &

Sankar 2012) daripada perikarpa manggis.

Kumpulan fenolik merupakan kumpulan metabolit sekunder yang paling

banyak didapati di dalam tumbuhan termasuklah buah-buahan (Dai & Mumper 2010;

Lattanzio et al. 2008). Metabolit di dalam kumpulan ini mempunyai struktur satu cincin

aromatik yang mengandungi satu atau lebih bahan ganti hidroksi, dan terhasil melalui

tapak jalan sikimat/fenilpropanoid atau tapak jalan “poliketida” asetat/malonat, atau

kedua-duanya (Lattanzio et al. 2008). Pengkelasan fenolik adalah rumit, namun fenolik

boleh diklasifikasikan kepada beberapa kumpulan berdasarkan tapak jalan biosintetik

21

dan ciri strukturnya. Antaranya adalah polifenol (flavonoid, flavonol, xanton), asid

fenolik, koumarin, fenolik glikosida, kuersetin, tanin dan lignin.

Fenolik kebiasaannya hadir dalam bentuk ester atau konjugat glikosida kepada

sebatian semula jadi yang lain seperti flavonoid, alkohol, sterol atau glukosida (Dai &

Mumper 2010; Lattanzio et al. 2008). Zarena dan Sankar (2012) melaporkan beberapa

fenolik utama di dalam ekstrak perikarpa manggis yang berbeza. Asid kafeik, asid t-

sinamik, asid vanilik, asid sinapik dan asid siringik dikenalpasti sebagai asid fenolik

utama dalam ekstrak asid fenolik berasid terhidrolisis manakala asid galik pula adalah

asid fenolik utama di dalam ekstrak asid fenolik beralkali terhidrolisis. Selain itu,

ekstrak asid fenolik bebas dan ekstrak asid fenolik berasid terhidrolisis turut

menunjukkan aktiviti antioksida yang memberangsangkan berdasarkan analisis asai

DPPH yang dijalankan (Zarena & Sankar 2012).

Aktiviti anti-oksida fenolik adalah penting untuk melindungi tumbuhan

daripada sinaran ultra ungu (UV) yang merbahaya. Radiasi sinaran UV boleh

merangsang penghasilan spesies oksigen reaktif (ROS) yang boleh mempengaruhi

DNA, protein dan membran, seterusnya menyebabkan berlakunya perubahan pada

metabolisme tumbuhan (Lattanzio et al. 2008). Selain daripada berfungsi sebagai anti-

oksida, fenolik turut dilaporkan mempunyai aktiviti anti-mutagenik, anti-proliperatif

dan anti-mikrob (Kampa et al. 2004; Zarena & Sankar 2012). Selain itu, sesetengah

kumpulan fenolik seperti flavonoid, terutamanya klorofil dan antosianin berperanan

dalam perkembangan warna dan rasa tumbuhan, termasuklah buah-buahan (Zarena &

Sankar 2012).

Flavonoid dikategorikan sebagai polifenol dan dikelaskan berdasarkan

kehadiran rangka struktur difenilpropana (C6C3C6). Kelas utama bagi flavonoid adalah

flavon, flavanon, flavonol, isoflavonoid, antosianin dan kalkon (Panche et al. 2016).

Flavonoid merangkumi lebih daripada 4000 metabolit sekunder yang turut hadir

sebagai konjugat kepada gula (Miean & Mohamed 2001; Rhodes & Price 1996) di

dalam tumbuhan. Katesin yang dijumpai di dalam ekstrak asid fenolik bebas dan

kuersetin di dalam ekstrak asid fenolik berasid terhidrolisis telah dilaporkan sebagai

flavonoid utama di dalam perikarpa manggis (Zarena & Sankar 2012).

22

Terpenoid (atau juga dipanggil sebagai isoprenoid) adalah kumpulan metabolit

yang mempunyai struktur isoprena dan dikategorikan mengikut rangka karbon seperti

yang diringkaskan di dalam jadual di bawah (Jadual 2.3). Kumpulan terpenoid

menjalankan pelbagai fungsi penting kepada tumbuhan (Cheng et al. 2007; Grassmann

2005). Selain daripada fenolik, terpenoid juga merupakan kumpulan utama yang

bertindak sebagai anti-oksida tumbuhan (Grassmann 2005).

Jadual 2.3 Klasifikasi terpenoid

Kelas terpenoid Bilangan atom

karbon

Bilangan subunit

isoprena

Formula

molekul

Contoh terpenoid

Monoterpenoid 10 2 C10H16 Mentol

Timol

Seskuiterpenoid 15 3 C15H24 Asid absisik

Farnesol

Diterpenoid 20 4 C20H32 Karnosol

Asid giberelik

Triterpenoid 30 6 C30H48 Asid oleanolik

Asid ursolik

Tetraterpenoid 40 8 C40H64 Karotin

Kriptoxantin

Politerpenoid > 40 > 8 (C5H8)n Getah

Sumber: Grassmann (2005)

Monoterpenoid dan diterpenoid dikenalpasti sebagai komponen utama di dalam

pati minyak tumbuhan dan memainkan peranan sebagai agen alelopati. Kumpulan

metabolit ini terlibat dalam interaksi antara satu tumbuhan dengan tumbuhan yang lain

serta tumbuhan-patogen/herbivor (Cheng et al. 2007; Grassmann 2005; Zwenger &

Basu 2008). Karetenoid di bawah kumpulan tetraterpenoid pula berfungsi sebagai

aksesori pigmen untuk menyerap cahaya matahari dan dalam masa yang sama

membekalkan perlindungan kepada tumbuhan daripada kerosakan molekular yang

disebabkan oleh cahaya matahari. Karetenoid juga membekalkan pigmentasi kepada

tumbuhan dan mempunyai fungsi yang sama seperti flavonoid (klorofil dan antosianin)

dalam perkembangan warna dan rasa tumbuhan serta buah-buahan.

Terpenoid digunakan secara meluas sebagai bahan perasa tambahan, wangian,

farmaseutikal dan racun serangga (Tholl 2015). Meskipun skop kajian terhadap

terpenoid di dalam manggis masih lagi kecil, namun terdapat beberapa kajian kualitatif

dan kuantitatif yang telah melaporkan kehadiran kumpulan metabolit ini di dalam

beberapa bahagian manggis. Kehadiran skualina dan vitamin E telah dilaporkan oleh

23

Hapsari et al. (2018) di dalam biji manggis manakala terpenoid lain iaitu si-kar-otenal

telah dikenalpasti di dalam tisu yang sama semasa biji manggis mengalami fasa

percambahan (Mazlan et al. 2019). Selain itu, terpenoid juga dilaporkan hadir di dalam

perikarpa (Adnyana et al. 2016; Tjitrosemito & Poerwanto 2008), batang pokok, getah

dan isi manggis (Tjitrosemito & Poerwanto 2008).

Alkaloid pula adalah kumpulan bagi pelbagai metabolit yang mempunyai berat

molekul yang rendah serta dikelaskan berdasarkan kehadiran atom nitrogen asas

(Kabera et al. 2014; Zulak et al. 2006). Alkaloid dijumpai di dalam 20% daripada

spesies tumbuhan termasuklah tumbuhan daripada famili Apocyanaceae,

Ranunculaceae, Papaveraceae, Solanaceae dan Rutaceae. Alkaloid boleh didapati

daripada pelbagai bahagian pokok yang berbeza daripada famili tumbuhan ini,

antaranya seperti nikotin pada daun, kinkonina dan kuinina pada batang, nibidina pada

biji dan rawelfinina pada akar pokok (Wansi et al. 2013). Alkaloid kebanyakannya

terhasil daripada asid amino triptofan, fenilalanina, tirosina dan asid antranilik melalui

tapak jalan sikimat (Klaser Cheng 2017).

Seperti fenolik dan terpenoid, alkaloid juga mempunyai pelbagai aktiviti biologi

dan farmakologi dan digunakan secara meluas di dalam bidang perubatan (Croteau et

al. 2000; Kabera et al. 2014) serta sebagai perangsang, narkotik dan racun seperti

kafein, morfin, nikotin, dan kokain (Zulak et al. 2006). Sementara itu, lain-lain alkaloid

seperti anopterina, alpinina dan 1,2-dimetoksi-13-metil-[1,3]benzodioksolo[5,6-

c]fenantridina (DMMBP) dipercayai terlibat dalam proses percambahan biji benih

manggis dengan memainkan peranan dalam pertahanan daripada serangan herbivor dan

serangga (Mazlan et al. 2019). Selain itu, alkaloid turut dilaporkan menyumbang kepada

aktiviti anti-oksida dalam perikarpa manggis (Sinaga & Siregar 2016).

2.2.3 Potensi manggis di pasaran

Manggis menjadi tumpuan di beberapa negara termasuklah China-Taiwan, Jepun,

Australia dan Eropah ekoran daripada rasanya yang unik. Manggis mula terkenal di

Barat Eropah dan Amerika Syarikat sejak abad ke-20 ekoran daripada kesan positifnya

terhadap kesihatan manusia (Brunner & Morales-Payan 2010). Negara-negara Asia

menjadi pengeluar utama kepada pasaran manggis di Eropah. Abu Dardak et al. (2011)

24

turut melaporkan permintaan daripada negara-negara Timur Tengah juga semakin

meningkat. Pasaran antarabangsa berkembang dari semasa ke semasa, terutamanya

negara China yang menganggap manggis sebagai makanan “sejuk” di dalam konsep

budaya yin-yang yang diamalkan penduduk di negara tersebut. Manggis juga dikatakan

pelengkap kepada buah durian, di mana manggis bertindak sebagai “penyejuk” kepada

buah durian yang bersifat “panas” (Osman & Milan 2006). Peningkatan kadar

permintaan manggis segera dan produk-produk berasaskan manggis dianggarkan

bernilai lebih RM50 juta setahun di pasaran domestik dan RM580 juta setahun di

pasaran antarabangsa (Abu Dardak et al. 2011). Namun, kadar pengeksportan manggis

ke negara luar telah dilaporkan berkurang sebanyak 63.6% pada tahun 2015 berbanding

tahun sebelumnya iaitu tahun 2014 (Lembaga Pemasaran Pertanian Persekutuan 2017)

ekoran daripada persaingan yang tinggi daripada negara jiran seperti Thailand dan

Indonesia.

Bagi tujuan eksport ke pasaran domestik dan antarabangsa, manggis biasanya

dieksport sebagai buah segar atau telah diproses di dalam bentuk sejuk beku. Buah

manggis mempunyai jangka hayat lepas tuai yang pendek iaitu selama dua minggu

(Osman & Milan 2006). Bagi buah segar, manggis disimpan di dalam suhu sejuk di

bawah 18 °C untuk meningkatkan daya tahan (sehingga 21 hari) dari kerosakan semasa

proses pengangkutan (Abu Dardak et al. 2011). Bagi tujuan eksport buah manggis

segar, pelbagai kajian telah dijalankan untuk memanjangkan tempoh penuaian,

meningkatkan jangka hayat lepas tuai manggis serta meningkatkan hasil penanaman

manggis. Antaranya, kajian oleh Lerslerwong et al. (2013) melaporkan bahawa

penggunaan asid 2-kloroetanafosfonik (etefon) boleh mempercepatkan proses

pemasakan manggis selama satu minggu jika manggis yang masih berada pada pokok

induk dirawat dengan etefon apabila menghampiri tempoh penuaian (Lerslerwong et al.

2013). Etefon adalah sejenis sebatian yang bertindak menggalakkan perembesan etilena

oleh buah, terutamanya buah klimakterik seperti manggis (Lerslerwong et al. 2013; Li

et al. 2017). Hormon ini akan bertindak mengawal pelbagai proses pertumbuhan,

perkembangan dan senesens tumbuhan termasuklah pemasakan buah selain tindak balas

tumbuhan terhadap alam sekitar (Abeles et al. 2012; Lieberman 1979; Yang & Hoffman

1984).

25

Lerslerwong et al. (2013) juga melaporkan bahawa 1-metilsiklopropena (1-

MCP) boleh melambatkan proses pemasakan manggis jika kaedah yang sama

dikenakan iaitu dengan cara merawat buah yang masih berada pada pokok induk dengan

1-MCP apabila buah menghampiri tempoh penuaian. Sebatian 1-MCP bertindak

sebagai perencat kepada hormon etilena dan telah terbukti boleh melambatkan proses

pemasakan dan dalam masa yang sama mengekalkan kualiti pelbagai jenis tanaman

(Blankenship & Dole 2003; Watkins 2008). Selain itu, satu kajian oleh penyelidik di

Indonesia iaitu Poerwanto et al. (2006) melaporkan bahawa jangka hayat selepas tuai

manggis boleh dipanjangkan kepada 40 hari jika manggis disalut dengan kitosan dan

dibungkus dengan plastik filem polietilena serta disimpan pada suhu 15 °C. Kitosan

adalah metabolit terbitan kepada kitin dan merupakan sebatian anti-mikrob semulajadi

yang banyak digunakan untuk tujuan pengawetan buah-buahan dan sayur-sayuran

(Devlieghere et al. 2004; Jianglian & Shaoying 2013).

Sementara itu, di Malaysia, Institut Penyelidikan dan Kemajuan Pertanian

Malaysia (MARDI) telah memperkenalkan anak benih “Advance Planting Material”

yang mampu mempercepatkan pengeluaran hasil tanaman manggis sekaligus

memendekkan tempoh pulangan modal pelaburan bagi pengusaha tanaman (Abu

Dardak et al. 2011). Namun begitu, kajian terhadap mekanisme semasa pemasakan

buah manggis yang kompleks masih lagi kurang. Pemasakan buah adalah antara faktor

utama yang menyumbang kepada perubahan dalam komposisi buah. Pemahaman

terhadap pemasakan manggis boleh menyumbang kepada eksploitasi potensi manggis

yang lebih luas sama ada sebagai buah segar atau penghasilan produk-produk berasakan

manggis, sekaligus meningkatkan nilai ekonomi buah tropika ini setanding dengan

negara pengeluar utama seperti Thailand dan Indonesia.

2.3 PENDEKATAN BIOLOGI SISTEM BERASASKAN METABOLOMIK

Pendekatan biologi sistem telah digunakan sebagai platform untuk merungkai

pemasakan manggis dalam kajian ini. Biologi sistem didefinisikan sebagai kajian

saintifik mengenai ciri sistematik dan interaksi dinamik sesuatu komponen biologi,

sama ada molekul, sel, organisma atau keseluruhan spesies secara kualitatif mahupun

kuantitatif (Klipp et al. 2016). Definisi “sistem” dalam aspek “biologi sistem” pula

26

adalah satu set bahagian yang berhubung dan membentuk satu keseluruhan yang

kompleks. Sistem hidupan adalah dinamik dan kompleks serta tingkah laku mereka

sukar untuk diramal jika hanya merujuk kepada beberapa bahagian tertentu sahaja. Bagi

memahami biologi pada peringkat sistem, struktur dan dinamik bagi fungsi selular dan

fungsi organisma haruslah dikaji dan bukan hanya tertumpu kepada komponen terpencil

sesuatu sel atau organisma (Kitano 2002).

Antara pendekatan yang seringkali digunakan dalam biologi sistem adalah

genomik, preoteomik, transkriptomik, metabolomik dan glikomik serta disokong

dengan kajian bioinformatik (Aizat et al. 2018; Zierer et al. 2015). Genomik adalah

kajian terhadap gen, proteomik dijalankan untuk mengkaji aras dan identiti protein dan

transkriptomik pula adalah kajian pada peringkat RNA manakala metabolomik

memfokuskan kepada pengenalpastian metabolit di dalam sesuatu sampel biologi

(Aizat et al. 2018; Zierer et al. 2015). Pendekatan metabolomik telah digunakan dalam

kajian ini bagi merungkai mekanisme pemasakan buah manggis (Garcinia mangostana

Linn.) pada pelbagai peringkat pemasakan dengan cara melihat kepada komposisi

metabolit di dalam jenis tisu manggis yang berbeza. Oleh itu, kaedah metabolomik akan

dibincangkan dengan lebih terperinci dalam penerangan seterusnya.

Metabolomik adalah antara kaedah “omik” yang terbaharu di dalam bidang

kajian sistem biologi (Ryan & Robards 2006). Metabolomik adalah satu kajian saintifik

mengenai profil metabolit yang hadir di dalam sel, tisu atau organisma (Wei et al. 2018).

Metabolit merupakan molekul kecil (50-1500 Dalton) yang mengalami perubahan

kimia semasa proses metabolisme, manakala metabolom pula didefinisikan sebagai

metabolit jumlah yang hadir di dalam sel, tisu atau organisma (Aretz & Meierhofer

2016; Patti et al. 2012; Zhang et al. 2016). Metabolit dianggap sebagai gambaran

langsung kepada keadaan selular di dalam sesuatu organisma (Patti et al. 2012). Berbeza

dengan gen dan protein, metabolit lebih menggambarkan fenotip serta aktiviti biokimia

sesuatu organisma (Baharum & Azizan 2018; Patti et al. 2012). Hal ini kerana fungsi

gen boleh berubah kerana dipengaruhi oleh pengawalaturan epigenetik, manakala

protein pula akan berubah apabila mengalami modifikasi semasa proses pasca-translasi

(Aretz & Meierhofer 2016; Patti et al. 2012).

27

Analisis metabolomik terbahagi kepada dua iaitu analisis sasaran dan bukan

sasaran (Roberts et al. 2012; Shulaev 2006). Analisis sasaran sesuai digunakan untuk

mengukur kepekatan metabolit yang disasarkan dengan tepat atau mengkaji struktur

metabolit tersebut dengan lebih terperinci (Bingol 2018; Roberts et al. 2012). Maklumat

asas mengenai metabolit yang ingin disasarkan seperti struktur, berat molekul ataupun

kumpulan fungsi diperlukan sebagai panduan untuk menjalankan analisis metabolomik

sasaran termasuklah bagi menentukan teknik dan parameter sistem analitikal yang akan

digunakan serta pengenalpastian metabolit melalui pencarian dalam pangkalan data

metabolomik. Penggunaan piawai dalaman pula membolehkan analisis dijalankan

secara kuantitatif atau semi-kuantitatif (Roberts et al. 2012). Namun, limitasi bagi

analisis sasaran ini adalah metabolit yang ingin dikaji haruslah diekstrak dan hadir

dalam bentuk asli serta berkepekatan tinggi. Oleh itu, kaedah ini tidak sesuai digunakan

untuk mengkaji penanda metabolit yang unik atau perubahan metabolit secara global

(Shulaev 2006).

Sementara itu, analisis bukan sasaran atau turut dikenali sebagai analisis cap jari

metabolik tidak memfokuskan kepada identifikasi atau pengukuran metabolit secara

spesifik (Bingol 2018; De Vos et al. 2007). Sebaliknya, analisis bukan sasaran adalah

satu analisis komprehensif yang memfokuskan kepada kesemua metabolit di dalam

sesuatu sampel biologi termasuklah metabolit yang tidak diketahui atau belum pernah

ditemui (Roberts et al. 2012). Analisis ini digunakan untuk mengenalpasti jumlah profil

atau corak unik perubahan metabolit di dalam sesuatu sampel biologi yang mencirikan

sesuatu sel atau tisu (De Vos et al. 2007; Shulaev 2006) serta untuk pengesanan dan

diagnostik penanda biologi. Pelbagai teknik analitikal boleh digunakan untuk

menjalankan analisis metabolomik seperti nuklear magnetik resonans (NMR),

kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-MS), kromatografi cecair (LC-MS) dan

elektroforesis kapilari (CE-MS) (Bingol 2018). Secara amnya, analisis metabolomik

terbahagi kepada beberapa bahagian atau langkah utama iaitu penyediaan dan

pengekstrakan sampel, analisis sampel menggunakan kaedah analitikal (pemisahan dan

pengesanan metabolit) dan analisis data (Cevallos-Cevallos et al. 2009; Kim &

Verpoorte 2010).

28

Kajian lepas menggunakan pendekatan metabolomik terhadap manggis banyak

memfokuskan kepada pengenalpastian dan pengukuran tahap sebatian bioaktif

terutamanya xanton (Sugita et al. 2017; Sukatta et al. 2013; Zarena & Sankar 2009;

Zhou et al. 2008). Terdapat juga kajian metabolomik telah dilakukan terhadap

organisma tertentu yang telah didedahkan terhadap ekstrak manggis bagi mengkaji

aktiviti anti-malaria manggis seperti yang telah dilakukan terhadap parasit manusia,

Plasmodium falciparum (Chaijaroenkul et al. 2014). Selain itu, pemprofilan asid fenolik

manggis turut dijalankan oleh Zadernowski et al. (2009) dengan membandingkan tisu

manggis yang berbeza iaitu kulit luar, kulit dalam dan isi manggis. Beberapa tahun

selepas itu, Zarena & Sankar (2012) pula memprofil metabolit asid fenolik dan

flavonoid di dalam perikarpa manggis menggunakan kaedah pengekstrakan yang

berbeza.

Terbaharu, kajian terhadap komposisi metabolit semasa perkembangan biji

manggis turut dijalankan oleh Mazlan et al. (2018a) dan Mazlan et al. (2018b)

manakala beberapa kajian untuk merungkai pemasakan manggis telah dijalankan oleh

Parijadi et al. (2017) dan Gondokesumo et al. (2019) dengan membandingkan peringkat

pemasakan manggis yang berbeza. Walaubagaimanapun, kajian oleh Parijadi et al.

(2017) yang membandingkan tisu manggis yang berbeza pada tujuh peringkat

pemasakan hanya melibatkan penggunaan satu teknik analitikal iaitu GC-MS manakala

kajian oleh Gondokesumo et al. (2019) pula memfokuskan kepada metabolit xanton di

dalam tisu perikarpa dan bukan keseluruhan metabolom manggis.

2.3.1 Penyediaan dan pengekstrakan sampel

Penyediaan sampel adalah satu langkah yang kritikal di dalam setiap analisis

metabolomik dan perlu dijalankan menggunakan teknik yang betul (Kim & Verpoorte

2010). Proses ini akan mempengaruhi sebatian atau metabolit yang akan dipisahkan dan

dikenalpasti melalui analisis analitikal serta menentukan ketepatan hasil dan tahap

sensitiviti bagi keseluruhan analisis metabolomik yang akan dijalankan (Kim &

Verpoorte 2010; Mushtaq et al. 2014). Penyediaan sampel merangkumi beberapa tahap

iaitu pengumpulan sampel (atau penuaian bagi sampel buah), pengeringan dan diikuti

dengan pengekstrakan sampel. Sampel pepejal seperti tisu tumbuhan atau buah (daun,

29

kulit, biji dan sebagainya) biasanya dikisar menjadi serbuk halus bagi meningkatkan

kadar penyerapan pelarut, seterusnya menggalakkan pembebasan metabolit oleh sel

semasa proses pengekstrakan (Cevallos-Cevallos et al. 2009). Cecair nitrogen (-190°C)

sering digunakan semasa proses pengisaran sampel bagi menghentikan semua aktiviti

enzim serta metabolisme yang berlaku dalam sampel biologi kerana aktiviti ini akan

mengubah profil metabolit asal sampel biologi tersebut (Abdel-Farid et al. 2007;

Mushtaq et al. 2014).

Seterusnya, sampel yang telah dikisar akan dikeringkan menggunakan beberapa

teknik seperti pengeringan menggunakan ketuhar, ketuhar gelombang mikro, udara

panas (Harbourne et al. 2009) atau pengeringan sejuk-beku (Mushtaq et al. 2014) bagi

membuang kandungan air di dalam sampel. Proses pengeringan sampel sangat penting

bagi memudahkan penyimpanan sampel untuk jangka masa panjang kerana proses ini

akan menghalang atau mengurangkan sebarang aktiviti enzim serta pertumbuhan

mikrob pada sampel. Selain itu, perbezaan kandungan kelembapan (kandungan air) di

dalam sampel juga boleh mengganggu proses analisis menggunakan instrumen

analitikal seperti GC-MS, LC-MS dan NMR. Kandungan air akan menyebabkan

resolusi spektrum NMR yang terhasil akan berkurang serta kadar kebolehulangan bagi

analisis GC-MS menurun (Mushtaq et al. 2014; Rangarajan & Ghosh 2011).

Pengeringan sejuk-beku dilaporkan mampu memberi hasil pengeringan yang

paling bagus berbanding teknik-teknik pengeringan yang lain (Mushtaq et al. 2014).

Bagi teknik pengeringan sejuk-beku, sampel harus disejukkan menggunakan cecair

nitrogen terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam ruang khas yang mempunyai

suhu dan tekanan yang rendah supaya proses pengeringan boleh berlaku. Teknik ini

sangat sesuai digunakan bagi sampel yang sensitif terhadap suhu yang tinggi. Sampel

yang telah dikeringkan haruslah disimpan pada suhu -80 °C atau di dalam cecair

nitrogen bagi mengelakkan berlakunya penyerapan semula air daripada persekitaran

(Mushtaq et al. 2014).

Selain daripada proses penyediaan sampel, proses pengekstrakan juga adalah

langkah penting dalam analisis metabolomik kerana langkah ini akan menentukan

jumlah metabolit dan jenis metabolit yang akan diekstrak daripada sampel (Cevallos-

30

Cevallos et al. 2009; Drouin et al. 2018). Terdapat dua faktor yang mempengaruhi

proses pengekstrakan iaitu faktor kimia dan faktor fizikal (Kim & Verpoorte 2010;

Mushtaq et al. 2014). Faktor kimia seperti jenis pelarut, tahap kekutuban serta nisbah

pelarut ditentukan berdasarkan tujuan analisis metabolomik yang dijalankan.

Bagi analisis metabolomik sasaran, pemilihan pelarut adalah bergantung kepada

jenis metabolit yang ingin diekstrak (Cevallos-Cevallos et al. 2009). Disebabkan

kehadiran metabolit yang pelbagai di dalam sampel biologi, penggunaan hanya satu

jenis pelarut adalah mustahil untuk mengekstrak semua jenis metabolit. Oleh itu, bagi

analisis bukan sasaran atau analisis metabolomik global, gabungan pelarut seringkali

digunakan untuk memaksimumkan hasil yang bakal diperoleh (Kim & Verpoorte 2010;

Mushtaq et al. 2014). Pelarut umum seperti air sesuai digunakan untuk mengekstrak

pelbagai jenis metabolit berkutub termasuklah gula. Pelarut tidak berkutub seperti

kloroform pula sesuai digunakan untuk mengekstrak metabolit tidak berkutub.

Gabungan pelbagai pelarut seperti air-metanol-kloroform dengan nisbah yang berbeza

sering digunakan dalam kajian metabolomik pada masa kini untuk meningkatkan

kepelbagaian jenis metabolit yang merangkumi metabolit tidak berkutub, metabolit

yang berkutub tinggi serta metabolit hidrofilik dan hidrofobik (Mushtaq et al. 2014).

Faktor fizikal seperti teknik sonikasi atau gelombang ketuhar turut digunakan

untuk meningkatkan hasil pengekstrakan metabolit (Cevallos-Cevallos et al. 2009; Das

& Eun 2018; Mushtaq et al. 2014). Teknik ini dijalankan bertujuan untuk meningkatkan

kadar pembebasan metabolit daripada sel (Cevallos-Cevallos et al. 2009; Das & Eun

2018). Teknik sonikasi melibatkan pendedahan sampel terhadap nadi atau gelombang

bunyi berfrekuensi tinggi untuk memecahkan sel manakala teknik gelombang ketuhar

pula digunakan untuk memanaskan pelarut melebihi tekanan takat didih tekanan

atmosfera pelarut tersebut bagi meningkatkan kadar penyerapan pelarut ke dalam

sampel (Kaufmann & Christen 2002; Vinatoru 2001).

31

2.3.2 Analisis sampel menggunakan teknik analitikal

a. Teknik analitikal dalam kajian pemasakan buah

Teknik analitikal bagi kajian metabolomik terbahagi kepada dua pengkelasan utama

iaitu resonans magnetik nuklear (NMR) dan spektrometri jisim (MS) (Cambiaghi et al.

2017; De Vos et al. 2007; Theodoridis et al. 2012a). Kedua-dua teknik ini telah

dibuktikan keberkesanannya melalui kajian-kajian lepas untuk mengkaji tentang

pemasakan buah seperti yang disenaraikan di dalam Jadual 2.4. Sistem NMR

menawarkan pengenalpastian dan kuantifikasi metabolit secara langsung, terutamanya

metabolit yang hadir dalam kepekatan yang tinggi di dalam sesuatu sampel biologi

(Theodoridis et al. 2012b). Berbanding sistem MS, sistem NMR adalah lebih kukuh dan

mempunyai kadar kebolehulangan yang lebih tinggi. Sistem NMR membenarkan

pengenalpastian struktur sesuatu molekul dengan tepat dan berkesan (Theodoridis et al.

2012b). Namun, seperti yang dinyatakan sebelum ini, NMR hanya boleh mengenalpasti

metabolit yang berkepekatan tinggi di dalam sesuatu sampel (Cambiaghi et al. 2017;

Theodoridis et al. 2012b) serta melibatkan kos permulaan pemasangan alat yang tinggi

(Theodoridis et al. 2012b).

Sistem MS pula beroperasi dengan cara menukarkan molekul analit kepada

keadaan bercaj (ionised). Ion dan fragmen ion yang terhasil semasa proses pegionan

akan dianalisis berdasarkan nisbah jisim terhadap caj (mass to charge ratio) atau nilai

m/z (Metz et al. 2017; Pitt 2009; Theodoridis et al. 2012b). MS yang digabungkan

dengan sistem pemisahan seperti GC, LC dan CE berperanan penting dan seringkali

digunakan bagi analisis pemprofilan metabolit secara holistik ekoran daripada tahap

sensitiviti sistem ini yang tinggi serta boleh didapati secara meluas (Metz et al. 2017).

Sistem MS mempunyai tahap sensitiviti yang lebih tinggi berbanding sistem NMR

(Cambiaghi et al. 2017; Theodoridis et al. 2012b) kerana sistem ini berkeupayaan untuk

mengenalpasti metabolit yang hadir dalam kepekatan yang rendah di dalam sesuatu

sampel biologi yang tidak dapat dikesan melalui sistem NMR (De Vos et al. 2007;

Theodoridis et al. 2012a).

Bilangan sistem MS yang digunakan di seluruh dunia juga lebih tinggi

berbanding sistem NMR berikutan daripada kos pemasangan yang lebih rendah. Oleh

32

itu, bilangan pengguna serta pakar dalam penggunaan MS yang berkemampuan untuk

membekalkan serta mengendalikan data metabolomik juga adalah lebih tinggi. Justeru

itu, sistem MS semakin banyak digunakan bagi tujuan pemprofilan metabolik serta

pengenalpastian metabolit sasaran terutamanya sejak beberapa tahun kebelakangan ini

(Griffiths et al. 2010; Theodoridis et al. 2012b). Dalam kajian ini, sistem GC dan LC

yang dilengkapi dengan sistem MS telah digunakan untuk memprofil metabolit

daripada manggis.

.

33

Jadual 2.4 Kajian metabolomik terhadap pemasakan buah menggunakan teknik nuklear magnetik resonans (NMR) dan spektrometri jisim (MS)

Buah Larutan pengekstrakan Teknik analitikal Rujukan

Capsicum annuum L. (lada benggala) Metanol/air GC-MS & LC-MS Aizat et al. (2014)

Citrus sinensis L. (oren) Etanol/amonium asetat LC–MS Pan et al. (2014)

Metanol GC-MS Wang et al. (2016)

Coriandrum sativum L (ketumbar) 2-Metil-butana GC-FID & GC-MS Msaada et al. (2007)

Cucumis melo (tembikai) GC-MS: metanol/kloroform/air

LC-MS: metanol/0.1% asid formik

GC-MS & LC-TOF-MS Moing et al. (2011)

Garcinia mangostana L. (manggis) Metanol/asid hidroklorik HPLC-MS Palapol et al. (2009b)

Metanol/kloroform/air GC-MS Parijadi et al. (2017)

Etanol LC-MS/MS Gondokesumo et al. (2019)

Persea americana Mill. (alpukat) Metanol/kloroform/air GC-TOF-MS & LC-TOF-MS Pedreschi et al. (2014)

Metanol GC-APCI-TOF-MS Hurtado-Fernández et al.

(2015)

Prunus persica L. (pic) Metanol GC-MS Lombardo et al. (2011)

Metanol/kloroform/air NMR Capitani et al. (2012)

Psidium guajava L. (jambu batu) Metanol GC-TOF-MS Lee et al. (2010)

Rubus coreanus Miquel (rasberi

hitam)

Metanol/air dan etilasetat NMR Kim et al. (2011)

Solanum lycopersicum (tomato) Metanol GC-MS Oms-Oliu et al. (2011)

Vitis hybrid (anggur) Etanol HPLC & NMR Son et al. (2009)

Vitis vinifera L. (anggur) Metanol/kloroform/air UPLC-TOF-MS Theodoridis et al. (2012a)

Vitis vinifera L. (beri) Metanol HPLC-MS Vondras et al. (2017)

Singkatan; GC-APCI-TOF-MS: kromatografi gas-pengionan kimia tekanan atmosfera-masa penerbangan-spektrometri jisim, GC-FID: kromatografi gas-

pengesan pengionan api, GC-MS: kromatografi gas-spektrometri jisim, HPLC: kromatografi cecair berprestasi tinggi, HPLC-MS: kromatografi cecair

berprestasi tinggi-spektrometri jisim, LC-TOF-MS: kromatografi cecair-masa penerbangan-spektrometri jisim, LC-MS: kromatografi cecair-spektrometri

jisim, UPLC-TOF-MS: kromatografi cecair berprestasi ultra- masa penerbangan-spektrometri jisim

34

b. Kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-MS) dan kromatografi cecair-

spektrometri jisim (LC-MS)

Sehingga kini, kajian metabolomik yang dilakukan terhadap pemasakan manggis adalah

tidak bersifat komprehensif dan hanya memfokuskan kepada salah satu platform analitikal

sahaja (GC-MS atau LC-MS) atau kumpulan metabolit tertentu terutamanya xanton dan

fenolik sahaja (Gondokesumo et al. 2019; Ji et al. 2007; Parijadi et al. 2017; Yang et al.

2017; Zarena et al. 2012; Zarena & Sankar 2009). Dalam kajian ini, kedua-dua analisis GC-

MS dan LC-MS telah digunakan bagi memaksimumkan pengenalpastian jumlah metabolit

yang hadir dalam sampel manggis (perikarpa, isi dan biji) pada peringkat pemasakan yang

berbeza (peringkat 0, 2, 4 dan 6) merangkumi pelbagai jenis metabolit termasuklah

metabolit tidak berkutub sehingga berkutub, hidrofilik dan hidrofobik.

GC-MS menawarkan kaedah pemisahan sebatian yang sangat berkesan disertai

tahap sensitiviti, kebolehulangan dan resolusi yang tinggi, menjadikan sistem ini sangat

sesuai digunakan untuk menganalisis sampel biologi yang kompleks (Niessen 1999;

Theodoridis et al. 2012b). GC-MS mampu memisahkan pelbagai jenis sebatian dengan

berkesan terutamanya metabolit (dan metabolit terbitan) yang meruap, metabolit berkutub

dan semi-kutub yang kebanyakannya adalah metabolit primer seperti metabolit gula, asid

amino, asid organik, alkohol, sterol, toksin, hormon dan asid lemak (Fiehn 2016).

Kumpulan metabolit ini mempengaruhi serta menentukan ciri-ciri serta kualiti sesuatu

tumbuhan atau buah (Osorio & Fernie 2014), sekaligus menyebabkan analisis GC-MS ini

banyak digunakan dalam kajian metabolomik terhadap tumbuhan dan buah. Analisis GC-

MS adalah satu proses yang melibatkan pemisahan sampel di dalam turus komponen GC

diikuti dengan proses pengionan dan pemecahan sampel apabila sampel keluar dari hujung

turus (Rajah 2.5). Kemudian, sampel akan dipecahkan kepada serpihan berdasarkan berat

jisim dan membentuk corak pemecahan yang seterusnya akan dikesan oleh pengesan MS.

Corak pemecahan serta masa penahanan (RT) adalah spesifik dan unik kepada setiap

sebatian di dalam sampel, justeru dianggap sebagai ciri pengenalpastian atau turut

dikatakan sebagai cap jari molekul bagi sebatian tersebut.

35

Rajah 2.5 Sistem kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-MS)

Sumber: Hussain and Maqbool (2014)

Analisis sampel menggunakan GC-MS memerlukan proses tambahan selepas

pengekstrakan sampel dijalankan iaitu derivatisasi sampel. Proses derivatisasi akan

menukarkan sebatian berkutub yang tidak meruap atau kurang meruap kepada molekul

terbitan yang lebih meruap dan stabil haba bagi membolehkan sebatian dapat dikenalpasti

di dalam sistem GC-MS pada suhu yang sesuai tanpa berlakunya penguraian terma (Knapp

1979; Orata 2012) atau pengubahsuaian pada struktur molekul (Kühnel et al. 2007; Orata

2012). Selain mengubah suai kumpulan fungsi metabolit agar dapat dianalisis di dalam

sistem GC-MS, proses derivatisasi juga dijalankan bertujuan untuk mengurangkan

penjerapan analit di dalam sistem GC-MS serta meningkatkan tindak balas pengesanan MS

(Orata 2012). Proses derivatisasi yang berkesan akan menghasilkan puncak metabolit yang

tajam, bersimetri, jelas dan mempunyai resolusi yang tinggi pada kromatogram (Orata

2012), seterusnya memudahkan proses pengenalpastian bagi setiap individu metabolit.

Kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS) pula adalah satu teknik analitikal

kimia yang menggabungkan keupayaan pemisahan fizikal kromatografi cecair dengan

kebolehan analisis jisim oleh spektrometri jisim untuk mengenalpasti kehadiran metabolit

di dalam sesuatu sampel biologi (Rajah 2.6). LC-MS telah menjadi salah satu teknik pilihan

dan telah digunakan secara meluas dalam pelbagai bidang kajian termasuklah bidang

farmaseutikal, alam sekitar, biokimia, bioteknologi dan sebagainya sejak beberapa dekad

36

terakhir pada abad ke-20 (Niessen 1999) kerana kebolehan sistem ini untuk memisahkan

dan mengenalpasti julat molekul yang besar (Theodoridis et al. 2012b).

Rajah 2.6 Sistem kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS)

Sumber: Anon (2017)

Antara kelas metabolit yang boleh dikenalpasti melalui sistem LC-MS adalah

metabolit sekunder tumbuhan seperti alkaloid, saponin, asid fenolik, fenilpropanoid,

flavonoid dan glukosinolat (De Vos et al. 2007; Huhman & Sumner 2002; Moco et al.

2006) yang mempunyai pelbagai kepentingan dari sudut ekonomi. Kajian mengenai

metabolit sekunder tumbuhan banyak difokuskan kepada kesan rintangan tumbuhan

terhadap tekanan persekitaran, bioaktiviti serta perkembangan warna dan rasa dalam

tumbuhan atau pemasakan buah (De Vos et al. 2007). Analisis LC-MS seringkali diikuti

dengan analisis spektrometri jisim seiring (MS/MS) menggunakan teknik seperti

spektrometri jisim automatik (AutoMS) dan pemantauan tindak balas berganda (MRM)

untuk kajian yang lebih teliti dan mendalam mengenai sifat molekular sesuatu metabolit.

37

2.3.3 Analisis data

a. Pemprosesan data mentah

Pengendalian dan pemprosesan data mentah adalah proses yang paling mencabar dan

mengambil masa yang paling lama dalam suatu kajian metabolomik (Shulaev 2006;

Theodoridis et al. 2012b). Data yang terhasil daripada analisis MS adalah besar dan

kompleks serta terdiri daripada tiga dimensi yang mewakili masa penahanan (retention

time) (RT), nilai m/z dan intensiti signal (Theodoridis et al. 2012b). Perlombongan data

seterusnya diperlukan untuk menjalankan proses penapisan bunyi, pembetulan garis dasar,

pemusatan, pengenyahkonvolusi spektrum, normalisasi, pemilihan puncak, integrasi

puncak dan penyelarasan masa penahanan (Cambiaghi et al. 2017; Theodoridis et al.

2012b). Proses ini akan menukarkan data matriks tiga dimensi kepada dua dimensi yang

terhasil di dalam bentuk jadual tersusun yang mengandungi nilai m/z, RT dan intensiti yang

sepadan bagi setiap puncak yang dikenalpasti.

Proses perlombongan data ini biasanya dijalankan menggunakan perisian yang

dikhususkan kepada sesuatu instrumen analisis seperti Bruker® DataAnalysis dan Bruker®

ProfileAnalysis untuk instrumen daripada Bruker, perisian MassHunter untuk instrumen

Agilent, perisian MarkerLynx untuk instrumen Waters dan perisian Turbo Mass daripada

Perkin Elmer (Theodoridis et al. 2012b). Terdapat juga perisian yang boleh dicapai secara

percuma dan terbuka kepada umum seperti MZmine (Pluskal et al. 2010; Theodoridis et al.

2012b), XCMS (Smith et al. 2006; Theodoridis et al. 2012b) dan MET-IDEA (Broeckling

et al. 2006; Lei et al. 2012) yang boleh memproses data daripada pelbagai instrumen

analisis. Perisian-perisian ini beroperasi dengan menggunakan fail data berformat NetCDF

(Fiehn 2008).

Selain itu, perisian seperti Leco Chromatof dan AMDIS (Automated Mass Spectral

Deconvolution and Identification System) menawarkan analisis tambahan iaitu

pengenyahkonvolusi data khususnya untuk pemprosesan data daripada analisis GC-MS

(Behrends et al. 2011; Shulaev 2006). Perisian ini jarang digunakan untuk analisis data

38

daripada instrumen yang lain seperti LC-MS kerana proses pengenyahkonvolusi data

daripada instrumen ini boleh dilakukan menggunakan perisian khusus seperti Bruker®

DataAnalysis. Data daripada analisis metabolomik seringkali menghasilkan kromatogram

yang mempunyai puncak sebatian yang bertindih. Proses pegenyahkonvolusi dijalankan

bertujuan untuk mengekstrak spektrum jisim tunggal daripada puncak yang bertindih

seterusnya menghasilkan spektrum jisim yang spesifik kepada hanya satu sebatian sahaja

(Behrends et al. 2011).

Analisis metabolomik turut menawarkan beberapa pangkalan data yang kukuh bagi

proses pengenalpastian metabolit. Antaranya adalah National Institute of Standards and

Technology (NIST), METLIN (Tautenhahn et al. 2012), Human Metabolome Database

(HMDB) (Wishart et al. 2012), Chemical Entities of Biological Interest (ChEBI) (Marco-

Ramell et al. 2018), MassBank (Horai et al. 2010) dan Kyoto Encyclopedia of Genes and

Genomes (KEGG) (Kanehisa & Goto 2000; Marco-Ramell et al. 2018). Pangkalan data ini

menawarkan proses anotasi yang pantas dan tepat menggunakan maklumat seperti masa

penahanan (RT), nilai m/z serta fragmentasi ion yang terdapat pada metabolit atau sebatian

yang berjaya dikesan melalui instrumen analisis metabolomik (Garg et al. 2015).

b. Analisis statistik univariat dan multivariat

Analisis data metabolomik biasanya disertai dengan analisis univariat dan analisis

multivariat. Analisis statistik seperti t-test atau analisis varians (ANOVA) diperlukan untuk

mengenalpasti komponen-komponen atau metabolit yang signifikan bagi setiap kumpulan

sampel yang dibandingkan (Vinaixa et al. 2012). Analisis ini boleh dijalankan

menggunakan beberapa perisian seperti SPSS dan GraphPad Prism serta pelayan

MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca/). MetaboAnalyst adalah satu pelayan web

yang direka untuk menjalankan analisis komprehensif, visualisasi dan interpretasi bagi data

metabolomik yang kompleks. Pelayan ini boleh mengendalikan data metabolomik daripada

pelbagai platform MS dan NMR yang melibatkan pelbagai jenis analisis (analisis sasaran,

bukan sasaran, kuantitatif) (Xia et al. 2015b).

39

MetaboAnalyst boleh menjalankan pelbagai analisis serta visualisasi data

menggunakan pelbagai kaedah univariat dan multivariat seperti t-test, ANOVA, analisis

komponen utama (PCA), analisis diskriminan-separa kuasa dua terkecil (PLS-DA) dan

pengelompokan peta haba. MetaboAnalyst turut menawarkan pelbagai analisis interpretasi

data metabolomik seperti analisis pengkayaan set metabolit (MSEA) dan analisis tapak

jalan metabolomik (MetPA). Selain daripada pelayan Metaboanalyst, perisian SIMCA-P

juga sering diaplikasikan dalam kajian metabolomik untuk menjalankan analisis

multivariat seperti PCA dan PLS-DA. Seperti MetaboAnalyst, SIMCA-P juga boleh

mengendalikan data metabolomik dari pelbagai sumber. MetaboAnalyst dan SIMCA-P

turut menawarkan analisis pra-pemprosesan data seperti normalisasi, penskalaan, dan

transformasi sebelum analisis multivariat dijalankan.

PCA dan PLS-DA adalah dua analisis multivariat utama yang dijalankan untuk

melihat taburan metabolit di dalam setiap kumpulan sampel yang dibandingkan. PCA

adalah analisis data tanpa seliaan yang dijalankan dengan cara melakukan transformasi data

terhadap set pembolehubah baru atau dikenali sebagai komponen utama (PCs) yang tidak

berkait antara satu sama lain (Jolliffe 2011; Yi et al. 2016). PCA dijalankan bertujuan untuk

mengurangkan dimensi data metabolomik yang mengandungi sejumlah besar

pembolehubah yang saling berkaitan dengan mengekalkan sebanyak mungkin variasi yang

wujud di dalam setiap pembolehubah asal (Jolliffe 2011). Dalam analisis PCA, data boleh

dilihat dalam bentuk plot 2-dimensi atau 3-dimensi yang dikenali sebagai plot skor dan plot

pemuatan. Plot skor lazimnya digunakan untuk menentukan corak pemisahan metabolit dan

melihat taburan metabolit antara kelompok manakala plot pemuatan pula digunakan untuk

mengenalpasti pembolehubah atau metabolit yang mempengaruhi pemisahan antara

kumpulan metabolit (Ren et al. 2015; Xia et al. 2015b).

Analisis PLS-DA pula adalah satu teknik analisis seliaan yang memerlukan

pengguna untuk menentukan kumpulan metabolit secara manual. Seperti analisis PCA,

hasil analisis PLS-DA juga boleh dilihat dalam bentuk plot skor dan plot pemuatan.

Analisis ini digunakan untuk menjalankan analisis diskriminasi serta pengenalpastian

pembolehubah atau metabolit berkaitan yang berpotensi menyumbang kepada pemisahan

40

antara metabolit melalui analisis pembolehubah berkepentingan dalam unjuran (VIP).

Secara ringkasnya, semakin tinggi nilai VIP sesuatu metabolit, semakin tinggi pengaruh

metabolit tersebut terhadap pemisahan antara kelompok metabolit (Azizan et al. 2016; Kind

et al. 2007). Analisis PLS-DA banyak digunakan bagi tujuan pengenalpastian penanda

biologi serta pengelasan penyakit (Kind et al. 2007; Xia et al. 2015b).

BAB III

BAHAN DAN KAEDAH

3.1 BAHAN

3.1.1 Sumber sampel

Buah manggis dituai dari plot tumbuhan Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM) yang

terletak di Bangi, Selangor (2°55′09.0″N 101°47′04.8″E) semasa musim pemasakan

manggis pada bulan Jun hingga Ogos 2014 dan Jun hingga Ogos 2016. Buah yang dituai

pada tahun 2014 telah digunakan untuk mencapai objektif kajian yang pertama manakala

buah yang dituai pada tahun 2016 pula telah digunakan untuk mencapai objektif ke-2. Buah

manggis dipetik pada empat peringkat pemasakan yang berbeza iaitu semasa peringkat 0

(hijau), 2 (hijau kekuningan disertai tompokan merah jambu), 4 (merah keperangan) dan

6 (ungu gelap) berdasarkan Indeks Kematangan Manggis Malaysia (Osman & Milan 2006).

3.1.2 Bahan kimia dan reagen

Pelarut gred analisis terdiri daripada metanol dan kloroform diperoleh dari Syarikat Merck

(Jerman) dan asid formik diperoleh daripada APS Ajax Finechem (Auburn, Australia).

Piridin, metoksiamina hidroklorida (MeOX), N-metil-N-(trimetilsilil) trifluoroasetamina

(MSTFA), N,O-bistrifluoroasetamina (BSTFA), (±)-naringenin, asid isopimarik, asid sitrik

dan asid malik diperoleh daripada Sigma Aldrich, St. Loius, MO, USA. α-Mangostin dan

γ-mangostin diperoleh daripada ChamFaces (Wuhan Economic and Technological

Development Zone, Wuhan, Hubei).

42

3.2 KAEDAH

3.2.1 Pensampelan dan penyediaan sampel

Buah manggis yang telah dipetik dibawa ke makmal dan diasingkan kepada jenis tisu yang

berbeza iaitu perikarpa, isi dan biji kecuali manggis yang dipetik pada peringkat 0

pemasakan kerana biji dan isi sukar dipisahkan daripada kulit pada peringkat ini (Osman

& Milan 2006). Kemudian, setiap tisu manggis dikisar secara berasingan ke dalam bentuk

serbuk halus menggunakan alu dan lesung atau pengisar gred makmal yang telah

disejukkan terlebih dahulu dengan cecair nitrogen (-196°C). Semua peralatan yang

digunakan semasa penyediaan sampel iaitu alu, lesung, spatula, pisau pemotong dan papan

pemotong disterilkan terlebih dahulu menggunakan cecair etanol (75%). Sampel buah

manggis yang telah dikisar kemudian dikeringkan menggunakan pengering sejuk-beku

(Labconco, model: 74200) untuk mengeluarkan kandungan air sebelum disimpan di dalam

-80°C sebelum pengekstrakan dijalankan.

3.2.2 Pengekstrakan metabolit

Bagi pemilihan kaedah pengekstrakan yang paling sesuai untuk pemprofilan metabolit

daripada buah manggis menggunakan analisis kromatografi gas-spektrometri jisim (GC-

MS) dan kromatografi cecair-spektrometri jisim (LC-MS), pengoptimuman kaedah

pengekstrakan metabolit telah dijalankan terlebih dahulu. Sebanyak lima kaedah

pengekstrakan metabolit telah digunakan dan dibandingkan. Kaedah-kaedah ini

mempunyai perbezaan dari aspek kimia (jenis dan nisbah pelarut) serta aspek fizikal

(keberkesanan teknik sonikasi). Lima kaedah ini dipilih berdasarkan kemampuan untuk

mengekstrak pelbagai jenis metabolit merangkumi metabolit berkutub, tidak berkutub,

hidrofilik serta hidrofobik dan telah dibuktikan keberkesanannya melalui kajian-kajian

lepas dalam analisis metabolomik bagi sampel tumbuhan (Cadahía et al. 2015; De Vos et

al. 2007; Lisec et al. 2006; Okazaki et al. 2016). Kaedah yang berjaya mengekstrak

metabolit paling banyak serta merangkumi pelbagai kelas atau kumpulan metabolit

43

seterusnya dipilih untuk analisis keseluruhan peringkat pemasakan buah manggis

(peringkat 0, 2, 4, 6) dalam tisu manggis yang berbeza (perikarpa, isi dan biji).

a. Kaedah pengekstrakan 1

Kaedah 1 diubah suai daripada De Vos et al. (2007). Sebanyak 200 mg sampel yang telah

dikering-beku dilarutkan ke dalam larutan pengekstrakan sejuk yang disediakan segar (599

µL bagi 75% metanol dan 1.0 µL bagi 0.1% asid formik) berkadar isi padu per berat dengan

nisbah 3:1. Sampel divorteks selama 10 saat. Kemudian, setiap sampel disonikasi selama

20 minit pada frekuensi maksimum (40 kHz) secara berterusan di dalam air rendaman pada

suhu bilik. Selepas itu, sampel diempar selama sepuluh minit dengan kelajuan maksimum

(16,100 x g) pada suhu bilik. Supernatan yang berada pada lapisan atas (fasa berkutub)

diasingkan daripada pelet dan dikumpulkan ke dalam tiub baru.

b. Kaedah pengekstrakan 2

Kaedah 2 diperoleh daripada Lisec et al. (2006) dan diubah suai. Sebanyak kira-kira 200

mg sampel kering-beku dilarutkan ke dalam 1.5 mL larutan sejuk metanol (4°C) dan

divorteks selama 10 minit. Campuran ini kemudiannya dibiarkan selama 10 minit di dalam

air rendaman bersuhu 70°C. Kemudian, campuran diempar selama 10 minit pada kelajuan

11,000 x g dan supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tiub baru. Selepas itu,

sebanyak 0.75 mL kloroform sejuk ditambah, diikuti dengan 1.5 mL air suling. Campuran

divorteks selama 10 saat dan diempar selama 15 minit pada kelajuan 2,200 x g. Akhirnya,

supernatan diambil daripada lapisan atas (fasa berkutub) dan dimasukkan ke dalam tiub

yang baru.

c. Kaedah pengekstrakan 3

Kaedah 3 diubah suai daripada kaedah 1 dan kaedah 2 untuk membandingkan keberkesanan

teknik sonikasi yang diaplikasikan dalam kaedah 1 dengan menggunakan campuran pelarut

yang sama dengan kaedah 2. Sebanyak 200 mg serbuk sampel sejuk-beku dicampurkan

dengan larutan pengekstrakan yang terdiri daripada 1.5 mL metanol, 0.75 mL kloroform

44

dan 1.5 mL air suling. Campuran ini divorteks selama 10 saat dan disonikasi selama 15

minit pada kelajuan maksimum (40 kHz) secara berterusan di dalam air rendaman bersuhu

bilik. Kemudian, campuran ini diempar selama 10 minit pada kelajuan (16,100 x g) pada

suhu bilik. Supernatan yang berada pada lapisan atas (fasa berkutub) dikumpulkan dan

dipindahkan ke dalam tiub baru.

d. Kaedah pengekstrakan 4

Kaedah 4 diubah suai daripada Okazaki et al. (2016). Sebanyak 1.5 mL campuran larutan

pengekstrakan terdiri daripada metanol/kloroform/air suling (3:1:1 isipadu/isipadu)

dicampurkan dengan 200 mg sampel sejuk beku. Sampel kemudiannya divorteks selama

30 saat dan dibiarkan di dalam ais selama 30 minit sebelum dicampurkan dengan 0.4 mL

air suling (untuk mengekstrak metabolit akueus). Selepas itu, sampel divorteks kembali

selama 30 saat dan diempar pada kelajuan 1,400 rpm pada suhu 4°C selama dua minit untuk

memisahkan lapisan yang terbentuk. Supernatan yang diperoleh daripada lapisan atas (fasa

berkutub) dipindahkan ke dalam tiub baru.

e. Kaedah pengekstrakan 5

Kaedah 5 diubah suai daripada kaedah Cadahia et al. (2015). Sebanyak 200 mg serbuk

sampel dicampurkan dengan 0.4 mL kloroform sejuk dan disonikasi dalam air rendaman

selama 20 minit pada suhu bilik. Kemudian, 1.6 mL metanol sejuk dan air suling dengan

nisbah (3:1 isipadu/isipadu) ditambahkan ke dalam campuran dan disonikasi selama 20

minit. Campuran diempar pada kelajuan maksimum selama 10 minit dan akhir sekali,

supernatan pada lapisan atas (fasa berkutub) dikumpulkan dan dipindahkan ke dalam tiub

baru.

3.2.3 Penyediaan sampel bagi analisis GC-MS

Bagi analisis GC-MS, asid isopimarik digunakan sebagai piawai dalaman. Asid

isopimarik berkepekatan 100 ppm dicampurkan ke dalam setiap sampel yang telah

diekstrak (supernatan yang telah diasingkan pada langkah akhir setiap kaedah

45

pengekstrakan metabolit) sebelum sampel diderivatisasi menggunakan agen derivatisasi

MSTFA atau BSTFA. Sebanyak 50 µL supernatan yang mengandungi metabolit yang telah

diekstrak dan piawai dalaman dikeringkan dan dipekatkan terlebih dahulu di dalam vakum

pemekat (CHRIST, model: RVC2-18/MZ2C). Untuk derivatisasi MSTFA, kaedah diubah

suai daripada Okazaki et al. (2016). Sampel yang telah kering dilarutkan ke dalam 20

mg/mL metoksiamina hidroklorida di dalam piridin sebanyak 40 µL dan dibiarkan selama

90 minit pada suhu 40°C. Kemudian, sebanyak 40 µL MSTFA ditambah dan campuran

dibiarkan selama 30 minit pada suhu 40°C. Akhir sekali, sampel dipindahkan ke dalam

botol kaca untuk analisis GC-MS. Proses derivatisasi menggunakan BSTFA dijalankan

berdasarkan kaedah yang diubah suai daripada Cadahía et al. (2015). Sampel yang telah

kering dilarutkan ke dalam 40 µL 20 mg/mL metoksiamina hidroklorida dalam piridin dan

divorteks selama 10 saat. Kemudian, 40 µL BSTFA ditambah dan campuran divorteks

selama 10 saat. Seterusnya, sampel dibiarkan selama satu jam pada suhu 60°C sebelum

dipindahkan ke dalam botol kaca untuk analisis GC-MS.

3.2.4 Penyediaan sampel bagi analisis LC-MS dan LC-MS/MS

Bagi analisis LC-MS, supernatan yang mengandungi metabolit dicampurkan dengan

naringenin (100 ppm) yang berperanan sebagai piawai dalaman. Kemudian, sebanyak 50

µL sampel dilarutkan ke dalam 950 µL metanol untuk mencapai isi padu akhir sebanyak 1

mL. Kemudian, sampel dipindahkan ke dalam botol kaca untuk analisis LC-MS. Bagi

analisis LC-MS/MS pula, sebanyak 50 µL dari setiap kumpulan sampel yang telah

dicampurkan terlebih dahulu dengan naringenin disatukan menjadi satu sampel sebelum

dihantar untuk analisis.

3.2.5 Parameter analisis GC-MS

Sampel telah dianalisis menggunakan Perkin Elmer Clarus 600 Turbo Mass GC (Perkin

Elmer, USA) yang digabungkan dengan MS jenis tetrakutub yang beroperasi pada 70 eV.

Sampel sebanyak 1.0 μL telah disuntik ke dalam turus Elite 5MS (5% difenil 95%

dimetilpolisiloxan, 30.0 m x 0.25 mm ID x 250 µm). Parameter sistem GC-MS diubah suai

46

daripada Azizan et al. (2015) berdasarkan kesesuaian terhadap sampel yang digunakan. Gas

helium digunakan sebagai gas pembawa dan julat imbasan ditetapkan kepada 50-600 Da.

Suhu awal ditetapkan kepada 70°C untuk minit pertama, kemudian dinaikkan kepada 76°C

dengan kadar kenaikan sebanyak 1°C/minit sebelum dikekalkan selama satu minit.

Seterusnya, suhu dinaikkan kepada 300°C dengan kadar kenaikan sebanyak 6°C/minit dan

akhir sekali ditahan selama lima minit. Suhu injektor dan suhu pindahan ditetapkan kepada

250°C sementara suhu punca pula diubah kepada 300°C. Julat imbasan penuh berjaya

diperoleh selepas tempoh kelewatan pelarut selama lapan minit dengan nisbah pecahan

50:1.

3.2.6 Parameter analisis LC-MS

Pemisahan sebatian dilakukan menggunakan turus Thermo Scientific C18 (AcclaimTM

Polar Advantage II, 3 m x 150 mm, 3 µm) dalam sistem Thermo Scientific Dionex UltiMate

3000 UHPLC. Parameter sistem LC-MS diubah suai daripada Rosli et al. (2017) untuk

mendapatkan parameter yang paling sesuai dengan sampel yang digunakan. Isipadu sampel

yang disuntik adalah 1.0 μL. Elusi kecerunan dijalankan selama 25 minit (0.4 mL/min,

40°C) menggunakan H2O + 0.1% asid formik (A) dan 100% asetonitril (B). Kecerunan

bermula dengan 60% pelarut B (0-3 minit), 95% pelarut B (3-5 minit), 95% pelarut B (5-

10 minit), 60% pelarut B (10-20 minit) dan seterusnya 60% pelarut B (20-25 minit).

Spektrometri jisim beresolusi tinggi dijalankan menggunakan sistem MicroTOF QIII

Bruker Daltonic (Bruker, Germany). Pengionan ESI pada mod positif dan negatif

dijalankan menggunakan parameter berikut; voltan kapilari: 4500 V, tekanan pengabut: 1.2

bar, gas pengeringan: 8 L/min pada suhu 200 °C dan julat jisim: 50-1000 m/z. Bagi analisis

kromatografi cecair-spektrometri jisim seiring (LC-MS/MS), tetapan bagi sistem

kromatografi dan spektrometri jisim yang sama telah digunakan.

3.2.7 Pemprosesan data GC-MS

Data mentah GC-MS yang mengandungi maklumat nama metabolit, masa penahanan (RT),

nilai padanan, nilai padanan relatif dan kawasan puncak telah dijana daripada perisian

47

Turbo Mass (Perkin Elmer, USA). Pengenalpastian metabolit dijalankan menggunakan

perpustakaan spektrum jisim National Institute of Standards and Technology (NIST, 2008)

dengan nilai padanan minimum 700. Format data mentah GC-MS ini kemudian ditukarkan

kepada format .NetCDF sebelum dimuatnaik ke dalam perisian Automated Mass Spectra

Deconvolution and Identification System (AMDIS) versi 2.71 untuk pengenalpastian

puncak yang bertindih (proses pengenyahkonvolutan) dan seterusnya mendapatkan

spektrum jisim individu. Nilai padanan minimum bagi pengenalpastian metabolit

menggunakan AMDIS juga ditetapkan kepada 700.

Nilai padanan minimum ditetapkan kepada 700 bagi memastikan tiada hasil positif

palsu dan negatif palsu terjadi semasa proses pengenalpastian metabolit (Grapp et al. 2016;

Meyer et al. 2010) dan telah banyak digunakan dalam kajian lepas (Baharum et al. 2010;

Halket et al. 2005; Jonsson et al. 2005; Lee et al. 2013; Simon-Manso et al. 2013). Metabolit

yang mempunyai nilai padanan 700 dan ke atas serta mempunyai signal yang tinggi pada

kromatogram ion jumlah (TIC) telah dilaporkan dalam kajian ini manakala metabolit yang

mempunyai nama yang disertai dengan tanda soal (?) tidak diambil kira kerana metabolit

ini adalah berkemungkinan merupakan padanan positif palsu. Nilai indeks penahanan (RI)

bagi setiap metabolit yang dikenalpasti juga telah ditentukan menggunakan perisian

AMDIS. Kemudian, proses penjajaran secara manual menggunakan perisian Microsoft

Excel (2016) telah dijalankan terhadap data output yang diperoleh daripada AMDIS bagi

analisis seterusnya iaitu analisis statistik univariat dan multivariat.

3.2.8 Pemprosesan data LC-MS

Bagi analisis LC-MS, data mentah dijana daripada sistem MicroTOF QIII Bruker Daltonic

melalui perisian Bruker Compass DataAnalysisViewer versi 2.0 (Bruker Daltonics,

Germany) dan diperoleh dalam format .d. Seterusnya, data ini dimuatnaik ke perisian

ProfileAnalysis versi 2.1 (Bruker Daltonic, Germany) untuk pengelasan data (data

bucketing). Penjajaran puncak metabolit dijalankan dengan pengenalan data mentah

terhadap pencirian ciri-ciri molekul atau Find Molecular Features (FMF) menggunakan

parameter yang diubah suai daripada Krug et al. (2008) seperti berikut: ambang nisbah

48

signal kepada hingar (S/N): 5, pekali korelasi: 0.7, panjang minimum sebatian: 10 dan lebar

pelicinan: 3. Jadual pengkelasan (bucket table) sebatian dikira menggunakan ciri

pengkelasan lanjutan (advanced bucketing) menggunakan penetapan daripada penjajaran

masa (time alignment). Julat masa ditetapkan kepada 1 minit sehingga 25.02 minit dan julat

jisim ditetapkan kepada 50 hingga 1000 m/z. Senarai keseluruhan bagi nilai m/z berserta

RT kemudian dijana untuk seterusnya iaitu analisis multivariat dan pengenalpastian

metabolit.

Pengenalpastian metabolit bagi data yang diperoleh daripada analisis LC-MS

dijalankan berdasarkan struktur molekul yang dijana menggunakan Smart Formula

daripada perisian ProfileAnalysis versi 2.1 serta menggunakan pangkalan data

metabolomik METLIN (http://metlin.scripps.edu/) terhadap pangkalan data umum seperti

di dalam Jadual 3.1 di bawah.

Jadual 3.1 Senarai pangkalan data umum yang digunakan untuk pengenalpastian metabolit

bagi data daripada analisis LC-MS

Pangkalan data Pautan

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) http://www.kegg.jp/kegg/

Chemical Entities of Biological Interest (ChEBI) https://www.ebi.ac.uk/chebi/

Human Metabolome Database (HMDB) http://www.hmdb.ca/

MetaCyc Metabolic Pathway Database (MetaCyc) https://metacyc.org/

Struktur molekul yang dicadangkan berdasarkan Smart Formula bagi setiap nilai

m/z dijadikan panduan bagi mengenalpasti metabolit menggunakan pangkalan data

METLIN. Pencarian dilakukan menggunakan carian mudah (simple search) menggunakan

parameter berikut; caj: negatif, toleransi: 30 ppm dan aduk: [M-H]-. Bagi data LC-MS/MS,

pencarian melalui pangkalan data METLIN dilakukan menggunakan padanan persamaan

pecahan (fragment similarity match) dan carian padanan spektrum MS/MS (MS/MS

spectrum match search) menggunakan parameter yang sama seperti carian mudah (simple

search). Pengenalpastian metabolit serta tapak fragmentasi pada struktur molekul metabolit

bagi data LC-MS/MS turut dilakukan melalui pangkalan data Metfrag (https://msbi.ipb-

halle.de/MetFragBeta/) menggunakan parameter pencarian yang ditetapkan seperti berikut;

ion aduk: [M-H]-, ppm carian: 30, pangkalan data: KEGG, ChEBI, HMDB dan MetaCyc.

http://metlin.scripps.edu/

http://www.kegg.jp/kegg/

https://www.ebi.ac.uk/chebi/

http://www.hmdb.ca/

https://metacyc.org/

https://msbi.ipb-halle.de/MetFragBeta/

https://msbi.ipb-halle.de/MetFragBeta/

49

Pencarian dilakukan dengan cara memasukkan nilai ion prakursor dan diikuti dengan nilai

m/z serta intensiti bagi setiap fragmen ion yang terhasil.

3.2.9 Analisis multivariat

Data daripada kedua-dua analisis GC-MS dan LC-MS yang telah diproses kemudian

dimuatnaik ke pelayan MetaboAnalyst 3.0 (www.metaboanalyst.ca) untuk normalisasi

integral. Parameter pelayan MetaboAnalyst ditetapkan seperti berikut; ciri normalisasi:

jumlah, transformasi data: transformasi log, penskalaan data: penskalaan pareto. Kumpulan

sampel yang mengandungi nilai hilang ditapis dan digantikan dengan nilai kecil (separuh

daripada nilai positif minimum data) (Xia et al. 2015a). Analisis peta haba dan analisis

statistik iaitu analisis varians (ANOVA) dua-hala turut dijalankan menggunakan data yang

telah diproses. Akhir sekali, data yang telah diproses dimuatnaik ke perisian SIMCA-P+

versi 14 (Umetrics AB, Umea, Sweden) untuk analisis data multivariat iaitu analisis

komponen utama (PCA) dan analisis diskriminan-separa kuasa dua terkecil (PLS-DA).

3.2.10 Analisis bioinformatik

Analisis gambar rajah Venn dilakukan menggunakan pelayan bioinformatik & genetik

evolusi yang boleh dicapai di pautan http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/.

Analisis tapak jalan biokimia pemasakan manggis pula dijalankan melalui analisis tapak

jalan metabolomik (MetPA) (http://metpa.metabolomics.ca.) berdasarkan pencarian

terhadap pangkalan data KEGG. Pemetaan tapak jalan dilakukan berdasarkan hasil yang

diperoleh dari analisis MetPA serta rujukan terhadap beberapa pangkalan data seperti

KEGG dan MetaCyc serta kajian kepustakaan daripada kajian-kajian lepas.

http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/

http://metpa.metabolomics.ca/

BAB IV

HASIL

4.1 PERBANDINGAN KAEDAH PENGEKSTRAKAN METABOLIT

4.1.1 Perbandingan lima kaedah pengekstrakan metabolit disertai proses derivatisasi

MSTFA bagi analisis GC-MS

a. Pengenalpastian jumlah keseluruhan metabolit di dalam perikarpa manggis

Bagi tujuan pengoptimuman kaedah pengekstrakan metabolit, lima kaedah

pengekstrakan yang berbeza dibandingkan dan dinilai seperti yang diringkaskan di

dalam Jadual 4.1. Ini bagi mengenalpasti kaedah yang sesuai dan mampu memberikan

jumlah metabolit terbanyak daripada sampel manggis. Untuk tujuan pengoptimuman

ini juga, hanya sampel perikarpa manggis daripada peringkat akhir pemasakan

(peringkat 6) telah digunakan kerana manggis pada peringkat ini lebih mudah didapati.

Faktor kimia iaitu jenis pelarut dan nisbah pelarut serta faktor fizikal iaitu teknik

sonikasi yang memainkan peranan penting terhadap hasil pengekstrakan metabolit telah

dibandingkan dan dinilai keberkesanannya berdasarkan jumlah dan jenis metabolit yang

berjaya diekstrak (Jadual 4.1).

Kromatogram ion jumlah (TIC) yang diperoleh dari analisis GC-MS bagi

kelima-lima kaedah pengekstrakan (kaedah 1, 2, 3, 4 dan 5) dilampirkan di dalam

Lampiran A. Secara kualitatifnya, kaedah 3 dan kaedah 5 menghasilkan pemisahan

puncak yang lebih jelas, tajam dan merangkumi bilangan puncak yang lebih banyak

berbanding kaedah yang lain. Daripada analisis pengenalpastian metabolit yang

dijalankan terhadap pangkalan data National Institute of Standards and Technology

(NIST) pula, terdapat sebanyak 73 metabolit telah berjaya dikenalpasti secara putatif

daripada kelima-lima kaedah pengekstrakan (Lampiran B).

51

Jadual 4.1 Ringkasan bagi lima kaedah pengekstrakan yang berbeza daripada segi

campuran pelarut, nisbah pelarut dan kaedah lisis. Keputusan jumlah

metabolit dan metabolit primer yang dikenalpasti daripada analisis GC-MS

bagi tisu perikarpa manggis peringkat 6 ini juga dibandingkan

Kaedah Rujukan Pelarut Kaedah

lisis

Jumlah

metabolit

Jumlah

metabolit

primer

1 De Vos et al. (2007) Metanol (75%)/asid

formik (0.1%) (599:1)

Lisis

kimia &

sonikasi

28 17

2 Lisec et al. (2006) Metanol/kloroform/air

(2:1:2)

Lisis

kimia

22 20

3 Lisec et al. (2006) &

De Vos et al. (2007)

Metanol/kloroform/air

(2:1:2)

Lisis

kimia &

sonikasi

31 27

4 Okazaki et al. (2016) Metanol/kloroform/air

(3:1:1)

Lisis

kimia

14 13

5 Cadahia et al. (2015) Metanol/kloroform/air

(3:1:1)

Lisis

kimia &

sonikasi

34 28

Merujuk Jadual 4.1, kaedah 5 berjaya memprofilkan jumlah metabolit yang

paling tinggi iaitu sebanyak 34 metabolit dan diikuti dengan kaedah 3, 1, 2 dan 4 dengan

jumlah masing-masing sebanyak 31, 28, 22 dan 14 metabolit. Selain itu, kaedah 5 juga

menghasilkan jumlah metabolit primer yang paling tinggi iaitu sebanyak 28 metabolit

diikuti dengan kaedah 3, 2, 1 dan terakhir adalah kaedah 4 dengan jumlah masing-

masing sebanyak 27, 20, 17 dan 13 metabolit. Kaedah yang menggunakan campuran

pelarut metanol, kloroform dan air disertai dengan teknik sonikasi iaitu kaedah 3 dan

kaedah 5 berjaya mengekstrak jumlah metabolit serta jumlah metabolit primer yang

lebih tinggi jika dibandingkan dengan kaedah 1 yang menggunakan campuran larutan

metanol dengan asid formik serta kaedah 2 dan 4 yang menggunakan campuran larutan

metanol, kloroform dengan air tetapi tidak disertai dengan teknik sonikasi. Bagi

pengekstrakan metabolit sekunder pula, kaedah 1 berjaya mengekstrak jumlah

metabolit sekunder yang paling tinggi berbanding kaedah pengekstrakan yang lain

(Rajah 4.1).

Secara keseluruhannya, kelima-lima kaedah yang telah dikaji menunjukkan

pengekstrakan metabolit daripada kelas yang berbeza bagi sampel perikarpa manggis

pada peringkat akhir pemasakan ini (Rajah 4.1). Metabolit daripada kelas atau

kumpulan gula didapati merangkumi hampir separuh daripada jumlah keseluruhan

metabolit yang berjaya dikesan (49.32%). Kumpulan metabolit kedua terbesar pula

52

adalah kumpulan alkohol (termasuk alkohol gula) iaitu sebanyak 9.59%, diikuti dengan

kumpulan asid gula (8.22%), asid organik (6.85%) dan aldehid (1.37%). Kumpulan

metabolit sekunder turut dikenalpasti dalam peratusan kecil iaitu asid fenolik (5.48%)

dan sebatian aromatik (2.74%). Sebatian lain yang tidak tergolong di dalam mana-mana

kumpulan sebatian sebelum ini merangkumi 16.44% daripada keseluruhan metabolit

(Rajah 4.1).

Berdasarkan Rajah 4.1, kaedah 5 berjaya mengekstrak jumlah gula yang paling

banyak dan diikuti dengan kaedah 3. Kaedah 1, 2 dan 4 pula berjaya mengekstrak

jumlah gula yang sama. Alkohol berjaya diekstrak dalam jumlah yang sama kecuali

kaedah 1 yang menghasilkan jumlah metabolit yang lebih tinggi berbanding empat

kaedah pengekstrakan yang lain. Sementara itu, asid gula dan asid organik diekstrak

pada kadar yang berbeza bagi kebanyakan kaedah pengekstrakan yang digunakan.

Manakala, aldehid berjaya dikenalpasti melalui tiga kaedah pengekstrakan sahaja iaitu

kaedah 1, 2 dan 3. Metabolit sekunder yang merangkumi sebatian fenolik dan sebatian

aromatik hanya berjaya diekstrak melalui kaedah 1, 3 dan 5 dengan jumlah metabolit

sekunder paling banyak diperoleh daripada kaedah 1 (Rajah 4.1).

53

Rajah 4.1 Bilangan dan jenis metabolit yang diekstrak daripada perikarpa manggis

peringkat 6 menggunakan lima kaedah pengekstrakan berbeza. Sila rujuk

Lampiran B untuk senarai keseluruhan metabolit

b. Analisis multivariat

Analisis tanpa seliaan iaitu analisis komponen utama (PCA) telah dijalankan untuk

menentukan corak pemisahan metabolit antara kaedah pengekstrakan yang

dibandingkan serta untuk mengenalpasti kehadiran metabolit yang terpisah atau

terpencil daripada kelompok metabolit yang dikenali sebagai outlier. Metabolit

dikelaskan mengikut kaedah pengekstrakan yang telah dijalankan. Seperti yang dapat

dilihat dalam Rajah 4.2a, model terbaik bagi plot skor PCA diperoleh daripada dua

komponen utama (PC) iaitu PC1 dan PC2 dengan nilai kumulatif varians X ((R2X

(kum)) setinggi 0.525 (53%).

Berdasarkan plot skor (Rajah 4.3a), metabolit di dalam kelompok kaedah 5

dapat dilihat berada dalam kuadran bawah di bahagian kanan dan terpisah jauh daripada

kelompok metabolit yang lain. Pemisahan ini menunjukkan bahawa terdapat variasi

yang ketara antara metabolit di dalam kelompok kaedah 5 dengan kelompok metabolit

daripada kaedah pengekstrakan yang lain. Sementara itu, empat kaedah pengekstrakan

54

yang lain iaitu kaedah 1, 2, 3 dan 4 dapat dilihat saling bertindih antara satu sama lain,

menunjukkan bahawa variasi antara kaedah-kaedah ini adalah rendah (Rajah 4.2a).

Selain itu, kaedah 2 dan kaedah 5 menunjukkan kedudukan tiga replikat biologi bagi

setiap kaedah pengekstrakan adalah lebih rapat antara satu sama berbanding kaedah

pengekstrakan yang lain. Corak pemisahan yang sama dapat dilihat dalam model

PLSDA (Rajah 4.2b) dengan nilai R2X (kum) setinggi 0.518 (52%). Kaedah 5 dapat

dilihat terpisah daripada kelompok metabolit daripada kaedah yang lain.

Rajah 4.2 Plot skor PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan taburan metabolit

di dalam perikarpa manggis peringkat 6 menggunakan lima kaedah

pengekstrakan berbeza. Setiap kumpulan sampel diwakili oleh tiga replikat

biologi

55

Rajah 4.3 Plot pemuatan PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan taburan

metabolit di dalam perikarpa manggis peringkat 6 menggunakan lima

kaedah pengekstrakan berbeza. Bentuk segi tiga berwarna hitam di dalam

plot pemuatan PLS-DA mewakili metabolit yang mempunyai nilai VIP

≥1.00

Plot pemuatan (Rajah 4.3a dan b) pula menunjukkan taburan metabolit yang

mempengaruhi pemisahan di antara kaedah pengekstrakan yang dibandingkan.

Berdasarkan plot pemuatan dalam Rajah 4.3b ini serta plot pembolehubah

berkepentingan dalam unjuran (VIP) yang dilampirkan di Lampiran C, pemisahan

ketara antara kaedah 5 daripada kelompok metabolit yang lain dapat dilihat dipengaruhi

oleh beberapa metabolit yang mempunyai nilai VIP ≥1.00 (diwakili oleh bentuk segitiga

berwarna hitam). Metabolit ini berada pada bahagian kiri kuadran bawah dan

kebanyakannya terdiri daripada metabolit gula iaitu 2-deoksi-galaktopiranosa,

56

arabinosa, D-xilofuranosa, arabinitol, glikosida, glukopiranosa, glukofuranosida, talosa

dan asid pentonik serta asid organik iaitu asid malik (VIP ≥1.00).

c. Analisis perbandingan antara lima kaedah pengekstrakan berbeza

Analisis perbandingan menggunakan gambar rajah Venn (Rajah 4.4) menunjukkan

persamaan dan perbezaan bagi kelima-lima kaedah pengekstrakan metabolit yang telah

digunakan. Berdasarkah Rajah 4.4, terdapat lapan metabolit telah berjaya diekstrak

menggunakan kelima-lima kaedah pengekstrakan. iaitu tujuh Lapan metabolit ini terdiri

daripada tujuh metabolit primer iaitu arabinitol, D-glukosa, D-ribosa, D-manosa, D-

fruktosa, D-xilosa dan D-galaktosa dan satu metabolit daripada kategori “lain-lain” iaitu

timol-α-d-glukopiranosida (Jadual 4.2). Kaedah 1 dan 5 berjaya mengekstrak jumlah

metabolit unik yang paling banyak berbanding kaedah-kaedah yang lain iaitu sebanyak

16 metabolit unik bagi kaedah 1 dan 14 metabolit unik bagi kaedah 5. Metabolit unik

adalah merujuk kepada metabolit yang hanya berjaya diekstrak menggunakan kaedah

tertentu sahaja. Metabolit unik daripada kaedah 1 turut merangkumi lima metabolit

sekunder iaitu empat asid fenolik (asid salisilik, asid benzoik, asid 3,4-

dihidroksibenzoik dan 4-hidroksifeniletanol) dan satu sebatian aromatik (benzildehid)

(Jadual 4.2). Majoriti metabolit unik yang berjaya diekstrak menggunakan kaedah 5

pula adalah daripada kumpulan gula termasuklah talosa, manopiranosa dan D-

xilofuranosa. Satu asid gula iaitu asid pentonik turut dikenalpasti melalui kaedah 5.

Asid gula yang lain telah dikenalpasti sebagai metabolit unik bagi kaedah

pengekstrakan yang berbeza. Sebagai contoh, asid ribonik dan asid manonik hanya

hadir di dalam ekstrak perikarpa manggis daripada kaedah 2 manakala asid β-D-

galaktopiranosiduronik dan asid 2-keto-d-glukonik pula hanya dikenalpasti

menggunakan kaedah 3. Asid gula yang lain seperti asid glukonik pula adalah metabolit

unik bagi kaedah 1. Dua asid organik iaitu asid metilmaleik dan asid propanadioik

dikenalpasti sebagai metabolit unik bagi kaedah 3 manakala asid butanadioik pula

dikenalpasti sebagai metabolit unik bagi kaedah 2. Selain itu, asid organik seperti asid

malik dan asid L-(+)-tartarik pula berjaya diekstrak menggunakan lebih daripada satu

kaedah pengekstrakan. Asid malik telah dikenalpasti di dalam ekstrak daripada kaedah

57

2, 3 dan 5 manakala asid L-(+)-tartarik berjaya diekstrak melalui dua kaedah iaitu

kaedah 2 dan 3 (Jadual 4.2).

Rajah 4.4 Analisis gambar rajah Venn untuk analisis perbandingan lima kaedah

pengekstrakan bagi perikarpa manggis peringkat 6

Jadual 4.2 Senarai metabolit yang diperoleh daripada analisis gambar rajah Venn (rujuk

Rajah 4.4) untuk pengekstrakan metabolit daripada perikarpa manggis

peringkat 6 menggunakan lima kaedah pengekstrakan berbeza

Kaedah pengekstrakan Bilangan

metabolit

Metabolit

Kaedah 1, Kaedah 2, Kaedah 3, Kaedah 4 dan

Kaedah 5

8 Timol-α-d-glukopiranosida

Arabinitol

D-Glukosa

D-Ribosa

Manosa

D-Fruktosa

D-Xilosa

D-Galaktosa

Kaedah 1 , Kaedah 2, Kaedah 3 dan Kaedah 5 1 myo-Inositol

Kaedah 1, Kaedah 3, Kaedah 4 dan Kaedah 5 2 Arabinofuranosa

α-D-Glukopiranosida

Kaedah 1, Kaedah 2 dan Kaedah 3 1 Butanal

Kaedah 2, Kaedah 3 dan Kaedah 4 1 D-Xilopiranosa

Kaedah 2, Kaedah 3 dan Kaedah 5 2 Adonitol

Asid malik

bersambung...

58

sambungan...

Kaedah 3, Kaedah 4 dan Kaedah 5 1 D-Ribofuranosa

Kaedah 2 dan Kaedah 3 2 Liksosa

Asid L-(+)-tartarik

Kaedah 2 dan Kaedah 5 1 Arabinosa

Kaedah 3 dan Kaedah 4 1 D-Turanosa

Kaedah 3 dan Kaedah 5 3 2H-1-Benzopiran

Siklopenta-1,3-diena

Glukopiranosa

Kaedah 4 dan Kaedah 5 2 Glukofuranosida

α-DL-Arabinopiranosa

Kaedah 1

16 Asid glukonik

1,4-sikloheksadiena

Pirokatekol

Asid benzoik

Benzena

1,4-Pentadiena

Asid 3,4-dihidroksibenzoik

Benzaldehid

Asid salisilik

β-DL-Liksofuranosida

Asid 2-hidroksimandelik

α-DL-Liksofuranosida

α-l-Galaktofuranosida

Asid 3-merkaptobenzoik

Fenol

4-Hidroksifeniletanol

Kaedah 2 6 Asid ribonik

Asid butanadioik

Asid manonik

β-D-Manopiranosida

Asid 2-piridinakarboksilik

α-D-Galaktofuranosida

Kaedah 3 9 Asid β-D-

galaktopiranosiduronik Sorbopiranosa

Asid propanadioik

Inososa

Asid 2-keto-d-glukonik

Gulosa

Eritrosa

Asid α,β-L-idopiranuronik

Asid metilmaleik

Kaedah 4 3 Treitol

Pentitol

bersambung...

59

...sambungan

α-DL-Liksopiranosa

Kaedah 5 14 Liksopiranosida

Talosa

Glikosida

Manopiranosa

Secara keseluruhannya, kaedah pengekstrakan 3 (metanol: kloroform: air

dengan nisbah 2:1:2 disertai teknik sonikasi) dan kaedah pengekstrakan 5 (metanol;

kloroform: air dengan nisbah 3:1:1 disertai teknik sonikasi) menghasilkan jumlah

keseluruhan metabolit yang paling tinggi iaitu masing-masing sebanyak 31 dan 34

metabolit. Kaedah ini kemudian dipilih untuk proses pengoptimuman seterusnya iaitu

pengekstrakan metabolit daripada sampel tisu manggis yang berbeza iaitu perikarpa, isi

dan biji disertai derivatisasi menggunakan N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroasetamida)

(BSTFA).

4.1.2 Perbandingan dua kaedah pengekstrakan metabolit disertai derivatisasi

menggunakan BSTFA bagi analisis GC-MS

a. Pengenalpastian jumlah keseluruhan metabolit di dalam perikarpa, isi dan biji

manggis

Selanjutnya, kajian diteruskan untuk mengenalpasti samada teknik pengekstrakan yang

digunakan adalah sesuai untuk jenis tisu manggis yang berbeza. Sampel tisu perikarpa,

isi dan biji manggis daripada peringkat 6 diekstrak menggunakan dua pengekstrakan

berbeza iaitu kaedah 3 (metanol: kloroform: air dengan nisbah 2:1:2 disertai teknik

sonikasi) dan kaedah 5 (metanol: kloroform: air dengan nisbah 3:1:1 disertai teknik

sonikasi). Dua kaedah ini dipilih berdasarkan jumlah metabolit terbanyak daripada

keputusan kajian pengoptimuman sebelum ini (Bab 4.1.1). Selain itu, ekstrak tisu

manggis juga diderivatisasi menggunakan BSTFA untuk menguji keberkesanan reagen

ini berbanding MSTFA yang telah digunakan sebelum ini.

Hasil daripada analisis GC-MS yang telah dijalankan, pemisahan puncak yang

jelas, tajam dan menyeluruh dapat dilihat bagi kedua-dua kaedah pengekstrakan

berdasarkan gambar rajah TIC pada Lampiran D dan Lampiran E. Secara

keseluruhannya, sebanyak 43 metabolit telah dikenalpasti hadir di dalam ketiga-tiga

60

replikat biologi bagi sekurangnya-kurangnya satu daripada tiga tisu manggis yang

digunakan (Lampiran F). Kaedah 3 dan kaedah 5 berjaya mengekstrak jumlah metabolit

yang sama iaitu sebanyak 36 metabolit bagi setiap kaedah (Jadual 4.3). Sementara itu,

kaedah 3 dan 5 masing-masing menghasilkan sebanyak 31 dan 32 metabolit primer.

Jadual 4.3 Ringkasan bagi dua kaedah pengekstrakan (kaedah 3 dan 5) yang berbeza

dari segi nisbah pelarut. Hasil jumlah metabolit dan jumlah metabolit primer

daripada analisis GC-MS bagi tisu perikarpa, isi dan biji manggis peringkat

6 ini juga dibandingkan

Kaedah Pelarut Jumlah

metabolit

Jumlah metabolit

primer

3 Metanol/kloroform/air (2:1:2) 36 31

5 Metanol/kloroform/air (3:1:1) 36 32

Rajah 4.5 Bilangan dan jenis metabolit yang diekstrak daripada perikarpa, isi dan biji

manggis peringkat 6 menggunakan dua kaedah pengekstrakan berbeza

(kaedah 3 dan 5). Peratusan bagi setiap kumpulan metabolit dikira

berdasarkan bilangan metabolit bagi setiap kaedah pengekstrakan

dibahagikan dengan jumlah keseluruhan metabolit di dalam kumpulan

tersebut dan didarabkan dengan 100%

Kumpulan metabolit gula didapati mendominasi jumlah metabolit yang

dkenalpasti, merangkumi separuh (51%) daripada jumlah keseluruhan metabolit (Rajah

4.5). Asid organik merangkumi sebanyak 14% daripada jumlah keseluruhan metabolit,

diikuti dengan asid gula (12%), alkohol (5%) dan alkohol gula (5%). Aldehid dan

sebatian aromatik turut dikenalpasti pada kuantiti yang rendah iaitu masing-masing

61

sebanyak 2%. Sebanyak 9% daripada jumlah keseluruhan metabolit tidak dikategorikan

ke dalam mana-mana kelas metabolit dan dilabel sebagai “lain-lain”(Rajah 4.5).

Berdasarkan Rajah 4.5 di atas, kaedah 3 berjaya mengekstrak jumlah gula yang

lebih banyak berbanding kaedah 5. Selain itu, kedua-dua kaedah menghasilkan bilangan

metabolit asid gula, alkohol gula dan aldehid yang sama. Bagi asid organik, alkohol dan

sebatian aromatik pula, kaedah 5 menunjukkan hasil pengekstrakan yang lebih baik

berbanding kaedah 3. Selebihnya, kaedah 3 dan kaedah 5 turut mengekstrak metabolit

yang tidak dikategorikan kepada mana-mana kumpulan metabolit dengan bilangan yang

lebih tinggi ditunjukkan oleh kaedah 3 berbanding kaedah 5.

b. Analisis multivariat

Plot skor dan plot pemuatan PCA dihasilkan untuk menilai persamaan dan perbezaan

profil metabolit yang diperoleh daripada kaedah pengekstrakan 3 dan 5. Rajah 4.6a

menunjukkan plot PCA dihasilkan daripada dua komponen utama dengan jumlah

varians (R2) (campuran nilai R2X[1] dan R2X[2]) setinggi 0.607 (61%). Berdasarkan

plot skor PCA di dalam Rajah 4.6, dapat dilihat kebanyakan kelompok metabolit

daripada setiap kaedah pengekstrakan (kaedah 3 dan kaedah 5) serta tisu manggis yang

berbeza (perikarpa, isi dan biji) berjaya dipisahkan daripada satu sama lain. Pertindihan

hanya dapat dilihat berlaku pada kelompok metabolit daripada sampel isi antara kaedah

3 dan kaedah 5.

Plot skor PLS-DA (Rajah 4.6b) juga menunjukkan corak pemisahan yang

hampir sama di mana pertindihan antara kelompok metabolit hanya berlaku pada

kelompok metabolit daripada sampel isi bagi kaedah 3 dan 5 pada bahagian atas

kuadran tengah. Nilai R2 juga tidak berubah iaitu setinggi 0.607 (61%). Plot pemuatan

bagi plot PCA (Rajah 4.7a) dan PLS-DA (Rajah 4.7b) pula menunjukkan taburan

metabolit dalam setiap kelompok yang menyumbang kepada pemisahan yang berlaku

di dalam plot skor. Analisis VIP turut dijalankan untuk mengenalpasti metabolit yang

berpengaruh tinggi bagi pemisahan kelompok metabolit daripada kaedah pengekstrakan

dan jenis tisu yang berbeza. Metabolit yang mempunyai nilai VIP ≥1.00 diwakili oleh

simbol segitiga berwarna hitam (Rajah 4.7b) dan plot metabolit VIP dilampirkan di

dalam Lampiran G.

62

Rajah 4.6 Plot skor PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan taburan metabolit

di dalam perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6 menggunakan dua

kaedah pengekstrakan berbeza (kaedah 3 dan 5). Setiap kumpulan sampel

diwakili oleh tiga replikat biologi

Berdasarkan plot pemuatan PLS-DA pada Rajah 4.7b dan senarai keseluruhan

metabolit berserta nilai purata kawasan puncak relatif pada Lampiran F, metabolit VIP

≥1.00 yang mempengaruhi pemisahan kelompok metabolit daripada sampel perikarpa

dikenalpasti terdiri daripada arabinofuranosa, asid galaktarik, asid galakturonik,

galakto-heksodialdosa dan xilulosa bagi kaedah 3 serta asid β-hidroksipiruvik, asid L-

(+)-tartarik dan asid ribonik bagi kaedah 5. Metabolit yang mempengaruhi kelompok

metabolit daripada sampel isi pula adalah D-ribofuranosa dan timol-α-D-

glukopiranosida (kaedah 3) serta arabinitol (kaedah 5). Manakala, glikosida pula

63

menyebabkan pemisahan kelompok metabolit daripada biji manggis bagi kaedah 3

daripada kaedah 5 yang dipengaruhi oleh beberapa metabolit lain iaitu β-D-

galaktofuranosa, asid butanoik dan myo-inositol (Rajah 4.7).

Rajah 4.7 Plot pemuatan PCA (a) dan PLS-DA (b) yang membandingkan taburan

metabolit di dalam tisu perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6

menggunakan dua kaedah pengekstrakan berbeza (kaedah 3 dan 5). Bentuk

segi tiga berwarna hitam di dalam plot pemuatan PLS-DA menunjukkan

metabolit dengan nilai VIP ≥1.00

64

c. Analisis perbandingan bagi dua kaedah pengekstrakan berbeza

Analisis perbandingan menggunakan gambar rajah Venn (Rajah 4.8 dan Jadual 4.4)

menunjukkan persamaan dan perbezaan antara dua kaedah pengekstrakan metabolit

berbeza tersebut mengikut jenis tisu manggis iaitu perikarpa, isi dan biji. Berdasarkan

gambar rajah Venn di bawah, kaedah 3 berjaya mengekstrak 10 metabolit yang sama

daripada ketiga-tiga jenis tisu manggis manakala kaedah 5 pula berjaya mengekstrak 13

metabolit daripada tisu yang sama.

Rajah 4.8 Analisis gambar rajah Venn yang membandingkan metabolit yang diekstrak

daripada tisu perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6 menggunakan dua

kaedah pengekstrakan berbeza (kaedah 3 dan 5)

65

Jadual 4.4 Hasil analisis gambar rajah Venn (rujuk Rajah 4.8) bagi pengekstrakan

metabolit daripada tisu perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6

menggunakan dua kaedah pengekstrakan berbeza (kaedah 3 dan 5)

Kaedah 3 Kaedah 5

Sampel Bil. Metabolit Sampel Bil. Metabolit

Perikarpa,

Isi, Biji

10 3,8-Dioksa-2,9-

disiladekana

Perikarpa,

Isi, Biji

13 Arabinitol

Asid malik

Asid sitrik

Asid sitrik

Butanal

D-Fruktosa

D-Fruktosa

D-Glukosa

D-Glukosa

D-Ribosa

D-Ribofuranosa

D-Xilopiranosa

D-Ribosa

Glukopiranosa

D-Xilopiranosa

myo-Inositol

D-Xilosa


Glukopiranosa

Perikarpa,

Isi

5 Arabinitol

Liksosa

Asid ribonik

Manosa

Butanal


D-Ribofuranosa Perikarpa,

Isi

1 Timol-α-D-

glukopiranosida Timol-α-D-

glukopiranosida

Perikarpa,

Biji

3 Asid malik

Perikarpa,

Biji

4 Arabinofuranosa

D-Galaktosa

D-Xilosa

myo-Inositol

Manosa Isi, Biji 1 3,8-Dioksa-2,9-

disiladekana Xilulosa Perikarpa 9 2,3-Butanadiol

Isi, Biji 4 D-Galaktosa

Arabinopiranosa

D-Xilofuranosa

Asid arabino-heksarik

Liksosa

Asid galakturonik

β-D-Galaktofuranosa

Asid L-(+)-tartarik

Perikarpa 8 Arabinopiranosa

Asid ribonik

Asid arabino-heksarik

Asid β-D-

galaktopiranosiduronik Asid galaktarik

Asid β-hidroksipiruvik

Asid galakturonik

Sorbopiranosa

Asid L-(+)-tartarik Isi 2 2H-1-Benzopiran

Asid β-hidroksipiruvik

α-D-Galaktofuranosa

Galakto-heksodialdosa Biji 7 Asid butanoik

β-D-Glukopiranosida

Asid L-treonik

Isi 1 α-D-Galaktofuranosa

Asid propanoik

Biji 4 Asid akrilik

Glikosida

Asid butanoik

Gulosa

Asid L-treonik

Treitol

Glikosida

β-D-Galaktofuranosa

66

Berdasarkan Jadual 4.4, enam gula iaitu D-fruktosa, D-glukosa, D-ribosa, D-

xilopiranosa, glukopiranosa dan α-D-glukopiranosida serta satu asid organik iaitu asid

sitrik telah berjaya diekstrak menggunakan kedua-dua kaedah pengekstrakan (kaedah

3: dan kaedah 5) daripada semua tisu manggis (perikarpa, isi dan biji) peringkat 6 ini.

Gula yang lain pula hanya didapati di dalam tisu manggis yang tertentu, contohnya,

arabinopiranosa hanya didapati di dalam perikarpa manggis sementara α-D-

galaktofuranosa pula hanya ditemui di dalam isi manggis apabila diekstrak

menggunakan kedua-dua kaedah pengekstrakan. Arabinofuranosa, galakto-

heksodialdosa, D-xilofuranosa, β-D-glukopiranosida dan xilulosa hanya berjaya

diekstrak menggunakan kaedah 3 daripada sekurang-kurangnya satu tisu manggis

manakala gulosa dan sorbopiranosa pula didapati merupakan metabolit unik kepada

kaedah 5 (Jadual 4.4).

Kedua-dua kaedah pengekstrakan berjaya mengekstrak dua asid gula iaitu asid

galakturonik dan asid ribonik daripada perikarpa manggis. Asid ribonik juga ditemui di

dalam isi manggis daripada kaedah 3. Asid L-treonik pula merupakan metabolit unik

untuk biji manggis bagi kedua-dua kaedah pengekstrakan. Asid galaktarik hanya

dikenalpasti di dalam ekstrak perikarpa daripada kaedah 3 manakala asid β-D-

galaktopiranosiduronik dikenalpasti di dalam tisu yang sama daripada kaedah 5. Bagi

asid organik pula, asid sitrik dikenalpasti di dalam ketiga-tiga tisu manggis daripada

kaedah 3 dan 5 manakala asid malik ditemui di dalam ketiga-tiga tisu daripada kaedah

3 tetapi hanya ditemui di dalam perikarpa dan isi manggis daripada kaedah 5. Asid

arabino-heksarik dan asid L-(+)-tartarik dikenalpasti sebagai metabolit unik kepada tisu

perikarpa manakala asid butanoik merupakan metabolit unik kepada tisu biji bagi

kedua-dua kaedah pengekstrakan. Kaedah 5 turut berjaya mengekstrak satu asid organik

lain iaitu asid propanoik daripada biji manggis (Jadual 4.4).

Kaedah 3 dan 5 masing-masing berjaya mengekstrak dua metabolit gula yang

sama iaitu arabinitol dan myo-inositol daripada tisu yang berbeza. Arabinitol hadir di

dalam ketiga-tiga tisu daripada kaedah 5 tetapi hanya hadir di dalam perikarpa dan isi

bagi daripada kaedah 3. myo-Inositol pula dikenalpasti di dalam ketiga-tiga tisu bagi

daripada kaedah 3 tetapi hanya ditemui di dalam tisu perikarpa dan biji daripada kaedah

5. Selain itu, dua alkohol iaitu 2,3-butanadiol dan treitol masing-masing dikenalpasti

67

sebagai metabolit unik kepada perikarpa dan biji bagi kaedah 5. Butanal berjaya

diekstrak daripada kedua-dua kedah pengekstrakan (perikarpa dan isi bagi kaedah 3 dan

ketiga-tiga tisu bagi kaedah 5). Timol-α-D-glukopiranosida pula diekstrak daripada tisu

perikarpa dan isi manggis menggunakan kedua-dua kaedah pengekstrakan sementara

asid β-hidroksipiruvik pula hanya dikesan di dalam perikarpa. Asid akrilik hanya

dikenalpasti di dalam biji manggis apabila diekstrak menggunakan kaedah 3 manakala

3,8-dioksa-2,9-disiladekana dikenalpasti di dalam ketiga-tiga tisu daripada kaedah 3

dan tisu isi serta biji daripada kaedah 5 (Jadual 4.4).

Secara kesimpulannya, kaedah 3 dan 5 masing-masing menunjukkan hasil

pengekstrakan yang memberangsangkan dengan penghasilan jumlah metabolit yang

sama iaitu 36 metabolit. Namun, kaedah 5 memberikan jumlah metabolit primer yang

lebih tinggi (32 metabolit) berbanding kaedah 3 (31 metabolit). Kaedah 5 kemudiannya

dipilih untuk analisis pemprofilan metabolit daripada perikarpa, isi dan biji manggis

pada peringkat pemasakan yang berbeza (peringkat 0, 2, 4 dan 6) meskipun perbezaan

antara dua kaedah ini adalah tidak ketara.

4.1.3 Perbandingan dua kaedah pengekstrakan serta mod pengionan berbeza bagi

analisis LC-MS

Dua kaedah pengekstrakan iaitu kaedah 1 (metanol/asid formik dengan nisbah 599:1)

dan 5 (metanol/kloroform/air dengan nisbah 3:1:1) telah dibandingkan sekali lagi

menggunakan analisis LC-MS bagi mengkaji kesesuaian kaedah ini dengan sistem

analisis yang berbeza. Kaedah 1 dan kaedah 5 dipilih berdasarkan hasil analisis

perbandingan kaedah pengekstrakan yang telah dijalankan sebelum ini. Kaedah 1

dipilih kerana kemampuan kaedah ini untuk mengekstrak metabolit sekunder (Rajah

4.1) manakala kaedah 5 pula dipilih kerana kaedah ini mampu mengekstrak jumlah

metabolit yang lebih tinggi berbanding kaedah lain (Rajah 4.1 dan Rajah 4.5)

Sampel ekstrak daripada perikarpa manggis peringkat 6 diuji pada dua mod

pengionan semburan elektro (ESI) bagi analisis LC-MS iaitu mod positif dan mod

negatif. Hasil analisis diperoleh daripada perisian DataAnalysisViewer dan dinilai

berdasarkan bilangan puncak pada kromatogram yang diwakili dengan pasangan RT:

m/z yang diperoleh daripada setiap kaedah pengekstrakan pada mod pengionan yang

68

berbeza tanpa analisis pengenalpastian metabolit. Hasil analisis telah diringkaskan

seperti dalam Jadual 4.5 di bawah.

Jadual 4.5 Perbandingan dua kaedah pengekstrakan dan mod pengionan bagi analisis

LC-MS untuk sampel perikarpa manggis peringkat 6. Senarai penuh

bilangan puncak (pasangan RT: m/z) boleh dirujuk pada Lampiran H

Kaedah

pengekstrakan

Bilangan puncak (pasangan RT: m/z)

Mod pengionan

Positif Negatif

Kaedah 1 46 58

Kaedah 5 55 41

Kaedah 1 menghasilkan lebih banyak bilangan puncak pada mod negatif iaitu

sebanyak 58 pasangan RT: m/z manakala hanya 46 pasangan RT: m/z dihasilkan pada

mod positif. Berbeza dengan kaedah 1, kaedah 5 didapati lebih sesuai digunakan pada

mod positif kerana penghasilan bilangan pasangan RT: m/z adalah lebih tinggi pada

mod ini iaitu sebanyak 55 pasangan RT: m/z berbanding 41 pasangan RT: m/z pada mod

negatif. Secara keseluruhannya, kaedah 1 yang diuji pada mod pengionan negatif telah

memberikan hasil yang paling memberangsangkan. Oleh itu, kaedah ini kemudiannya

dipilih untuk pemprofilan metabolit daripada perikarpa, isi dan biji manggis yang dituai

pada empat peringkat pemasakan berbeza (peringkat 0, 2, 4 dan 6).

4.2 PEMPROFILAN METABOLIT TISU PERIKARPA, ISI DAN BIJI MANGGIS

DARIPADA EMPAT PERINGKAT PEMASAKAN BERBEZA

4.2.1 Pemprofilan metabolit putatif menggunakan analisis GC-MS

Analisis GC-MS telah dijalankan untuk menganalisis kandungan metabolit secara

global daripada perikarpa, isi dan biji manggis yang dituai pada empat peringkat

pemasakan yang berbeza iaitu peringkat 0, 2, 4 dan 6. Empat peringkat ini dipilih kerana

ianya merangkumi peringkat awal pemasakan (peringkat 0), peringkat pertengahan

(peringkat 2 dan 4) dan peringkat akhir pemasakan (peringkat 6). Terlebih dahulu,

manggis yang dituai daripada empat peringkat pemasakan ini diproses dan dipisahkan

kepada tiga jenis tisu yang berbeza iaitu perikarpa, isi dan biji kecuali manggis

peringkat 0 kerana ketiga-tiga tisu ini tidak dapat dipisahkan dengan sebaiknya pada

peringkat ini (Osman dan Milan 2006). Kemudian, setiap sampel diekstrak

69

menggunakan kaedah pengekstrakan yang telah dioptimumkan sebelum ini iaitu

menggunakan metanol/kloroform/air dengan nisbah 3:1:1 disertai teknik sonikasi

(kaedah pengekstrakan 5) dan derivatisasi menggunakan BSTFA memandangkan

kaedah ini mampu mengekstrak jumlah metabolit yang tinggi serta merangkumi

pelbagai kumpulan metabolit.

Daripada analisis GC-MS yang telah dijalankan, sebanyak 57 metabolit berjaya

dikenalpasti secara putatif seperti yang disenaraikan di dalam Lampiran I. Metabolit ini

merangkumi pelbagai kelas metabolit terutamanya metabolit primer iaitu gula yang

didapati dengan jumlah yang paling tinggi sebanyak 23 metabolit dan diikuti dengan

kumpulan glikosida gula (enam metabolit), alkohol gula (enam metabolit) dan asid

organik (enam metabolit). Metabolit alkohol, sebatian aromatik dan aldehid turut

dikenalpasti dengan jumlah yang kecil iaitu hanya satu metabolit bagi setiap kelas.

Selain itu, turut dikenalpasti adalah metabolit yang tidak dikategorikan kepada mana-

mana kelas metabolit atau “lain-lain” sebanyak 8 metabolit.

a. Analisis statistik data univariat dan multivariat

Analisis komponen utama (PCA) telah dijalankan untuk melihat taburan metabolit

antara peringkat pemasakan yang berbeza berdasarkan kepada jenis tisu manggis.

Analisis PCA dijalankan secara berasingan bagi setiap tisu manggis seperti yang dapat

dilihat dalam Rajah 4.9a bagi tisu perikarpa, Rajah 4.9b bagi tisu isi dan Rajah 4.9c

bagi tisu biji manggis. Ketiga-tiga plot skor PCA mencapai jumlah keseluruhan variasi,

R2 (jumlah bagi R2X[1] dan R2X [2]) yang tinggi dan melebihi 50% (0.5) iaitu 0.679

bagi sampel perikarpa, 0.628 bagi sampel isi dan 0.678 bagi sampel biji manggis.

70

Rajah 4.9 Analisis PCA dan PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit perikarpa,

isi dan biji manggis pada peringkat pemasakan berbeza menggunakan GC-

MS. a) Plot skor PCA sampel perikarpa, b) plot skor PCA sampel isi, c) plot

skor PCA sampel biji, d) plot skor PLS-DA sampel perikarpa, e) plot skor

PLS-DA sampel isi dan f) plot skor PLS-DA sampel biji. Setiap kumpulan

sampel diwakili oleh tiga replikat biologi

Berdasarkan plot skor PCA yang telah dijana daripada perisian SIMCA-P+ versi

14 ini, perbezaan yang jelas disertai kedudukan yang rapat antara replikat biologi dapat

dilihat antara setiap peringkat pemasakan 0, 2, 4 dan 6 bagi ketiga-tiga jenis tisu

manggis. Sedikit pertindihan berlaku antara sampel daripada peringkat 0 dengan sampel

perikarpa daripada peringkat 2 (Rajah 4.9a). Kemudian, analisis PLS-DA (Rajah 4.9d,

e dan f) turut dijalankan dengan memfokuskan kepada analisis pengenalpastian

metabolit berkepentingan dalam unjuran (VIP) bagi mengesan metabolit yang

berkemungkinan sebagai penanda biologi dalam pemasakan buah manggis.

Seperti analisis PCA, analisis PLS-DA juga berjaya memisahkan kelompok

metabolit bagi peringkat pemasakan yang berbeza mengikut jenis tisu. Model PLS-DA

mencapai jumlah R2 yang tinggi dengan nilai yang sama atau hampir sama dengan

model PCA sepadan iaitu 0.679 bagi model PLS-DA sampel perikarpa (Rajah 4.9d),

0.628 bagi sampel isi (Rajah 4.9e) dan 0.680 (Rajah 4.9f) bagi sampel biji manggis.

Senarai metabolit yang mempunyai nilai melebihi 1.00 (VIP ≥1.00) telah disenaraikan

di dalam Lampiran J.

71

Analisis validasi bagi model PLS-DA yang merangkumi analisis permutasi

(Rajah 4.10) dan analisis sisa ramalan pengesahan silang-analisis varians (CV-ANOVA)

(Jadual 4.6) turut dijalankan untuk mengesahsahihkan model PLS-DA bagi setiap

sampel tisu. Berdasarkan hasil analisis validasi yang diperoleh, didapati semua model

PLS-DA adalah sah apabila dinilai berdasarkan analisis permutasi atau analisis CV-

ANOVA atau kedua-duanya. Berdasarkan analisis permutasi (Rajah 4.10), ketiga-tiga

model PLS-DA memberikan nilai R2Y asal (simbol bulat berwarna hijau pada

kedudukan paling kanan) dan nilai Q2Y asal (simbol kotak berwarna biru pada

kedudukan paling kanan) yang lebih tinggi berbanding nilai permutasi R2Y dan Q2Y di

sebelah kiri.

Selain itu, garisan regresi berwarna biru bagi titik Q2 bersilang dengan paksi

menegak (Y) pada sebelah kiri pada kedudukan (0.0, -0.415) bagi validasi model PLS-

DA perikarpa (Rajah 4.10a), (0.0, -0.503) bagi validasi model PLS-DA sampel isi

(Rajah 4.10b) dan (0.0, -0.416) bagi validasi model PLS-DA sampel biji manggis

(Rajah 4.10c). Persilangan garisan regresi Q2 pada titik negatif bagi paksi Y

menandakan bahawa model PLS-DA ini adalah sah dan tidak berlakunya overfitting (Li

et al. 2009). Manakala, analisis CV-ANOVA yang menunjukkan nilai p regresi 0.0007

bagi validasi model PLS-DA perikarpa dan 0.0104 bagi validasi model PLS-DA biji

juga membuktikan bahawa model PLS-DA adalah signifikan (p ≤0.05). Hanya nilai p

bagi validasi model sampel isi memberikan nilai melebihi 0.05 iaitu 0.5601 (Jadual 4.6).

72

Rajah 4.10 Ujian permutasi validasi model PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit


menggunakan GC-MS. a) validasi model PLS-DA sampel perikarpa, b)

validasi model PLS-DA sampel isi dan c) model PLS-DA sampel biji

manggis

73

Jadual 4.6 Analisis sisa ramalan pengesahan silang-analisis varians (CV-ANOVA)

model PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit perikarpa, isi dan biji

manggis pada peringkat pemasakan berbeza menggunakan GC-MS.

Singkatan; SS: jumlah persegi, DF: darjah kebebasan, MS: purata persegi,

F: nilai ujian F, p: nilai kebarangkalian, SD: sisihan piawai

Model

PLS-DA

SS DF MS F p SD

Perikarpa Jumlah

diperbetulkan 33 33 1 - - 1

Regresi 26.8077 15 1.7872 5.1951 0.0007 1.3369

Sisa 6.1923 18 0.3440 - - 0.5865

Isi Jumlah


Regresi 14.3190 15 0.9546 0.9198 0.5601 0.9770

Sisa 18.6810 18 1.0378 - - 1.0187

Biji Jumlah


Regresi 24.0019 15 1.6001 3.2009 0.0104 1.2650

Sisa 8.9983 18 0.4999 - - 0.7070

b. Pengenalpastian metabolit berpengaruh tinggi semasa pemasakan manggis

daripada analisis GC-MS

Berdasarkan analisis statistik ANOVA dua-hala, didapati 21 metabolit daripada 33

metabolit VIP yang dikenalpasti melalui analisis PLS-DA hadir secara signifikan (p

≤0.05) pada satu atau lebih peringkat pemasakan atau tisu manggis (Rajah 4.11).

Metabolit yang mempunyai nilai VIP ≥1.00 and p ≤0.05 terdiri daripada 14 metabolit

daripada kumpulan gula termasuklah tiga gula (arabinofuranosa, L(-)-fukosa, L-

manopiranosa), dua glikosida gula (2-O-gliserol-α-D-galaktopiranosida dan

fruktofuranosida), lima asid gula (asid 2,3,4-trihidroksibutirik, asid D-glukuronik, asid

galakturonik, asid L-treonik dan asid ribonik) dan empat alkohol gula (arabinitol, myo-

inositol, pentitol dan xilitol). Selain itu, satu alkohol (2,3-butanadiol), satu asid organik

(asid L-(+)-tartarik), satu aldehid (butanal), dan empat metabolit yang tidak dikelaskan

kepada mana-mana kumpulan berfungsi atau kelas “lain-lain” (benzena, gliserol,

isoxantopterin dan timol-β-D-glukopiranosida) turut dikenalpasti sebagai metabolit

berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 and p ≤0.05) (Rajah 4.11).

74

Rajah 4.11 Graf metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 and p ≤0.05) bagi kumpulan metabolit gula (a), glikosida gula (b), asid gula (c), alkohol gula (d),

alkohol (e), asid organik (f), aldehid (g) dan lain-lain (h). Data diperoleh daripada analisis pemprofilan metabolit perikarpa, isi dan biji manggis

pada peringkat pemasakan berbeza menggunakan analisis GC-MS. Paksi Y menunjukkan nilai kawasan puncak relatif (kpr) manakala nilai

purata ralat piawai daripada tiga replikat biologi digunakan sebagai bar ralat. Singkatan; PO: peringkat 0, P2: peringkat 2, P4: peringkat 4, P6:

peringkat 6

75

Kadar metabolit berpengaruh tinggi yang dikenalpasti adalah berbeza antara

peringkat pemasakan atau jenis tisu manggis atau kedua-duanya. Contohnya, hanya

arabinofuranosa dikenalpasti seawal peringkat pertama pemasakan iaitu peringkat 0

manakala metabolit gula yang lain hanya mula dikesan pada peringkat 2 di dalam tisu

yang berlainan iaitu di dalam biji bagi L(-)-fukosa dan perikarpa bagi L-manopiranosa

(Rajah 4.11a). Kadar arabinofuranosa kemudian menurun terutamanya di dalam tisu

perikarpa dan biji apabila menghampiri peringkat akhir pemasakan manakala L-

manopiranosa tinggi di dalam perikarpa pada peringkat 2 dan 6.

Selain itu, aras metabolit 2-O-gliserol-α-D-galaktopiranosida tinggi di dalam

tisu isi pada peringkat pertengahan hingga akhir pemasakan manakala fruktofuranosida

hanya hadir pada peringkat 4 (tisu isi) (Rajah 4.11b). Bagi metabolit berpengaruh tinggi

dari kelas asid gula pula (Rajah 4.11c), hanya asid galakturonik dan asid ribonik hadir

pada peringkat 0. Asid ribonik juga didapati hadir dalam ketiga-tiga tisu manggis pada

peringkat pemasakan yang tertentu. Manakala, asid gula yang lain (asid 2,3,4-

trihidroksibutirik, asid D-glukuronik dan asid L-treonik) hanya dikesan seawal

peringkat 2 dan ke atas pada kadar yang berbeza. Asid 2,3,4-trihidroksibutirik

(peringkat 4), asid D-glukuronik (peringkat 2) dan asid L-treonik (peringkat 2 hingga

6) didapati tinggi di dalam tisu biji manggis berbanding tisu yang lain (Rajah 4.11c).

Selain itu, untuk kelas alkohol gula, terdapat metabolit seperti arabinitol dan

myo-inositol telah hadir pada seawal peringkat 0 (Rajah 4.11d). Arabinitol

kemudiannya meningkat sehingga akhir pemasakan pada isi manggis manakala myo-

inositol pula kekal tinggi di dalam tisu biji berbanding tisu yang lain. Selain itu, pentitol

pula hanya ditemui pada peringkat 2 (biji) dan xilitol didapati unik kepada peringkat 4

pemasakan (perikarpa dan isi) (Rajah 4.11d). Metabolit lain seperti 2,3-butanadiol, L-

(+)-tartarik dan butanal juga didapati hadir seawal peringkat 0. Aras metabolit 2,3-

butanadiol kemudian meningkat dalam perikarpa peringkat 2 dan didapati tinggi pada

peringkat 4 dan 6 di dalam tisu isi (Rajah 4.11e). Manakala, asid L-(+)-tartarik

menunjukkan kadar paling tinggi dalam sampel perikarpa (peringkat 2 dan 4)

berbanding sampel isi (peringkat 4 dan 6) (Rajah 4.11f). Butanal pula didapati

meningkat dalam tisu isi dan biji pada peringkat 2 kepada peringkat 4 namun menurun

semasa peringkat 6 (Rajah 4.11g).

76

Manakala, metabolit daripada kumpulan “lain-lain” dilihat bersifat lebih

spesifik terhadap jenis tisu manggis. Contohnya, benzena hanya dikesan di dalam biji

(peringkat 2 dan 6) manakala isoxantopterin hanya hadir di dalam isi (peringkat 2) dan

timol-β-D-glukopiranosida unik kepada perikarpa manggis (peringkat 2). Gliserol pula

dikenalpasti di dalam ketiga-tiga tisu manggis pada peringkat 2 atau 4 (Rajah 4.11h).

4.2.2 Pemprofilan metabolit putatif menggunakan analisis LC-MS

Selain daripada analisis GC-MS, analisis LC-MS bukan sasaran juga telah dijalankan

dalam kajian ini bagi memprofilkan metabolit dalam perikarpa, isi dan biji manggis

pada peringkat 0, 2, 4 dan 6. Sampel manggis diekstrak menggunakan kaedah yang

telah dioptimumkan iaitu kaedah pengekstrakan 1 (metanol/asid formik dengan nisbah

599:1 disertai teknik sonikasi) kerana kaedah ini telah menunjukkan hasil

pengekstrakan metabolit sekunder yang paling berkesan berbanding kaedah-kaedah

yang lain (kaedah 2, 3, 4 dan 5) (Rajah 4.1). Mod pengionan LC-MS ditetapkan kepada

mod negatif kerana ekstrak manggis daripada kaedah pengekstrakan 1 didapati lebih

sesuai dianalisis pada mod negatif berdasarkan penghasilan puncak yang lebih banyak

iaitu 58 puncak berbanding 41 puncak pada mod positif (Jadual 4.5).

Hasilnya, sebanyak 1919 nilai RT: m/z (masa pengekalan: nisbah jisim kepada

caj) berjaya diekstrak daripada perisian ProfileAnalysis. Kemudian, data ditapis dengan

hanya mengambil kira metabolit yang hadir dalam ketiga-tiga replikat biologi dalam

sekurang-kurangnya satu kumpulan sampel yang dikaji. Dengan itu, sebanyak 416 RT:

m/z telah dipilih untuk proses seterusnya iaitu analisis statistik dan pengenalpastian

metabolit. Analisis varians dua-hala (two-way ANOVA) telah dijalankan dan hasil

analisis mendapati sebanyak 354 RT: m/z adalah signifikan secara statistik (p ≤0.05)

sama ada antara peringkat pemasakan, jenis tisu atau interaksi antara pembolehubah

peringkat pemasakan dan jenis tisu yang dibandingkan. Manakala, RT: m/z yang

selebihnya (62) adalah tidak signifikan secara statistik.

Daripada 416 RT: m/z yang diperoleh ini, sebanyak 98 metabolit telah berjaya

dikenalpasti (Lampiran K) menggunakan pangkalan data METLIN dan MetFrag

menerusi pencarian terhadap pangkalan data umum seperti KEGG, ChEBI, HMDB dan

MetaCyc. Walau bagaimanapun, terdapat juga sebanyak 102 RT: m/z yang tidak dapat

77

dikenalpasti dan telah dilaporkan di dalam Lampiran L. Kemudian, analisis multivariat

(analisis PCA dan PLS-DA) telah dijalankan terhadap gabungan data metabolit yang

telah dikenalpasti (98 metabolit) dan data RT: m/z yang tidak dapat dikenalpasti (102

RT: m/z).

a. Analisis statistik data multivariat

Analisis data multivariat (analisis PCA dan PLS-DA) telah dijalankan untuk mengkaji

taburan metabolit antara peringkat pemasakan yang berbeza dengan melihat kepada

setiap tisu manggis yang telah dibandingkan. Analisis PCA dan PLS-DA berjaya

memisahkan kelompok metabolit mengikut setiap peringkat pemasakan (peringkat 0, 2,

4 dan 6) dengan nilai R2 melebihi 50% (0.5) seperti yang dapat dilihat dalam Rajah 4.12

di bawah. Plot skor PCA dan PLS-DA bagi sampel perikarpa memberikan nilai varians

keseluruhan (R2) yang sama iaitu 0.717 (Rajah 4.12a dan d) manakala plot skor PCA

dan PLS-DA bagi sampel isi dan biji manggis masing-masing memberikan nilai R2

setinggi 0.690 (Rajah 4.12b dan e) dan 0.723 (Rajah 4.12c dan f).

Kesemua model PCA dan PLS-DA menunjukkan pemisahan yang jelas antara

kumpulan sampel, membuktikan bahawa jenis atau kadar metabolit yang berjaya

diekstrak daripada analisis LC-MS mempunyai perbezaan yang tinggi antara peringkat

pemasakan yang berbeza di dalam manggis. Kedudukan replikat biologi bagi setiap

kelompok adalah rapat antara satu sama lain, menandakan tahap kebolehulangan

replikat yang tinggi. Analisis PLS-DA dijalankan untuk mengenalpasti metabolit VIP

yang mempengaruhi pemisahan antara kumpulan sampel yang dibandingkan. Daripada

analisis yang dijalankan, 58 metabolit dikenalpasti mempunyai nilai VIP yang tinggi

(VIP ≥1.00) (Lampiran M), sekaligus mempengaruhi pemisahan antara kumpulan

sampel dan akan dibincangkan dengan lebih terperinci pada bahagian seterusnya.

Model PLS-DA juga telah disahsahihkan melalui ujian permutasi (Rajah 4.13) dan ujian

CV-ANOVA (Jadual 4.7).

78

Rajah 4.12 Analisis PCA dan PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit perikarpa,

isi dan biji manggis pada peringkat pemasakan berbeza menggunakan LC-

MS. a) Plot skor PCA sampel perikarpa, b) plot skor PCA sampel isi, c) plot

skor PCA sampel biji, d) plot skor PLS-DA sampel perikarpa, e) plot skor

PLS-DA sampel isi dan f) plot skor PLS-DA sampel biji manggis. Setiap

kumpulan sampel diwakili oleh tiga replikat biologi

79

Rajah 4.13 Ujian permutasi validasi model PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit


menggunakan LC-MS. a) validasi model PLS-DA sampel perikarpa, b)

validasi model PLS-DA sampel isi dan c) validasi model PLS-DA sampel

biji manggis

80

Jadual 4.7 Analisis sisa ramalan pengesahan silang-analisis varians (CV-ANOVA)

model PLS-DA bagi analisis pemprofilan metabolit perikarpa, isi dan biji

manggis pada peringkat pemasakan berbeza menggunakan LC-MS.

Singkatan; SS: jumlah persegi, DF: darjah kebebasan, MS: purata persegi,

F: nilai ujian F, p: nilai kebarangkalian, SD: sisihan piawai.

Model

PLS-DA

SS DF MS F p SD

Perikarpa Jumlah


Regresi 21.1931 15 1.4129 2.1540 0.0614 1.1886

Sisa 11.8069 18 0.6559 - - 0.8099

Isi Jumlah


Regresi 24.2736 15 1.6182 3.3380 0.0084 1.2721

Sisa 8.7264 18 0.4848 - - 0.6963

Biji Jumlah


Regresi 22.6575 15 1.5105 2.6289 0.0267 1.2290

Sisa 10.3425 18 0.5746 - - 0.7580

Model PLS-DA didapati sah dan tidak berlakunya overfitting sama ada melalui

ujian permutasi atau ujian CV-ANOVA atau kedua-duanya. Berdasarkan ujian

permutasi (Rajah 4.13), dapat dilihat nilai R2Y asal dan nilai Q2Y asal berada pada titik

kedudukan yang lebih tinggi berbanding nilai R2Y dan Q2Y permutasi bagi ketiga-tiga

model PLS-DA. Garisan regresi bagi titik Q2 juga bersilang pada nilai yang rendah pada

paksi menegak (Y) iaitu pada titik kedudukan (0.0, -0.534) bagi validasi model PLS-

DA sampel perikarpa (Rajah 4.13a), titik kedudukan (0.0, -0.570) bagi validasi model

PLS-DA sampel isi dan titik kedudukan (0.0, -0.597) bagi validasi model PLS-DA

sampel biji manggis. Ujian CV-ANOVA pula menunjukkan nilai p yang signifikan (p

≤0.05) bagi model PLS-DA sampel isi iaitu 0.0084 dan model PLS-DA sampel biji iaitu

0.0267. Namun bagi model PLS-DA perikarpa, nilai p adalah tidak signifikan iaitu

0.0614 (Jadual 4.7).

81

b. Pengenalpastian metabolit berpengaruh tinggi dalam pemasakan manggis

daripada analisis LC-MS

Daripada 58 metabolit VIP (VIP ≥1.00) yang dikenalpasti melalui analisis multivariat

PLS-DA, didapati 55 metabolit hadir secara signifikan (p ≤0.05) di dalam sampel

manggis sama ada antara peringkat pemasakan berbeza, tisu yang berbeza atau interaksi

antara pembolehubah peringkat pemasakan dan jenis tisu (Rajah 4.14 dan Rajah 4.15).

Berdasarkan Rajah 4.14, metabolit berpengaruh tinggi ini merangkumi beberapa kelas

metabolit primer dan sekunder termasuklah satu metabolit gula (sukrosa), satu asid gula

(asid L-askorbik-2-glukosida), satu fosfat gula (D-glukosa 6-fosfat), satu glikosida (asid

L-askorbik-2-glukosida), dua asid organik (asid 2-butinaioik dan asid kuinik) dan satu

asid lemak iaitu 1-(3-metilbutanoil)-6-apiosilglukosa. Selain itu, turut dikenalpasti

adalah lima asid amino dan terbitan iaitu S-adenosilhomosisteina, asid aspartik, (S)-N-

[3-(3,4-metilenadioksifenil)-2-(asetiltio)metil-1-oksooprolil]-(S)-alanina benzil ester,

Asn-Trp-OH dan temokaprilat serta satu kuinon iaitu knifolona.

Sebanyak empat alkaloid (6-hirdoksiprotopina, normorfin 3-glukuronida,

oksinarkotina dan xantina), enam terpenoid ((asid (+)-absisik, giberelin A3, ginggolida

C, katalposida, montanol dan salvinorin A)) dan empat xanton (α-mangostin,

astikolorin B, gartanin dan kratoksiarborenon C) (Rajah 4.14) turut didapati mempunyai

nilai VIP ≥1.00 dan p ≤0.05). Selain itu, metabolit yang turut dikenalpasti dengan

jumlah tertinggi (19 metabolit) adalah metabolit daripada kumpulan fenolik seperti

epirobinatinidol-(4β,8)-katesin, kuersetin 3,3'-dimetil eter 4'-glukosida, neoisostegana

dan sebagainya (Rajah 4.15). Metabolit yang tidak dikelaskan ke dalam mana-mana

kumpulan turut dikenalpasti sebagai metabolit berpengaruh tinggi sebanyak lapan

metabolit seperti asid meso-tartarik monohidrat, fisalin K, melampodinin dan

sebagainya (Rajah 4.15).

82

Rajah 4.14 Graf metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 and p ≤0.05) bagi kumpulan metabolit gula (a), asid gula (b), fosfat gula (c), glikosida (d), asid

organik (e), asid lemak (f), asid amino dan terbitan (g), kuinon (h), alkaloid (i), terpenoid (j) dan xanton (k). Data diperoleh daripada analisis

pemprofilan metabolit perikarpa, isi dan biji manggis pada peringkat pemasakan berbeza menggunakan analisis LC-MS. Paksi Y menunjukkan

nilai ketinggian puncak relatif (kpr) manakala nilai purata ralat piawai daripada tiga replikat biologi digunakan sebagai bar ralat. Singkatan; PO:

peringkat 0, P2: peringkat 2, P4: peringkat 4, P6: peringkat 6

83

Rajah 4.15 Graf metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 and p ≤0.05) bagi kumpulan metabolit fenolik (a) dan lain-lain (b). Data diperoleh daripada

analisis pemprofilan metabolit perikarpa, isi dan biji manggis pada peringkat pemasakan berbeza menggunakan analisis LC-MS. Paksi Y

menunjukkan nilai ketinggian puncak relatif (kpr) manakala nilai purata ralat piawai daripada tiga replikat biologi digunakan sebagai bar ralat.

Singkatan; PO: peringkat 0, P2: peringkat 2, P4: peringkat 4, P6: peringkat 6 dan ES-242-4: (3S,3'S,4S,4'S)-7,7',9,9'-Tetrametoksi-3,3'-dimetil-

3,3',4,4'-tetrahidro-1H,1'H-5,5'-bibenzo[g]isokromena-4,4',10,10'-tetrol

84

Kadar metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 and p ≤0.05) adalah berbeza

mengikut peringkat pemasakan atau tisu manggis yang berbeza. Sukrosa tidak dapat

dikesan pada peringkat awal pemasakan (peringkat 0 dan 2) namun didapati meningkat di

dalam tisu biji dan perikarpa pada peringkat akhir pemasakan iaitu peringkat 6 (Rajah

4.14a). Beberapa metabolit lain seperti 3-deoksi-D-mano-oktulosonat, D-glukosa 6-fosfat,

asid L-askorbik-2-glukosida, 2-butinaioik dan asid kuinik juga tidak ditemui pada

peringkat 0 namun ditemui pada peringkat 2 atau seterusnya. Contohnya, 3-deoksi-D-

mano-oktulosonat dikesan di dalam tisu isi pada peringkat 2 dan 4 dan di dalam perikarpa

dan biji pada peringkat 6) (Rajah 4.14b). D-glukosa 6-fosfat pula hadir di dalam perikarpa

(peringkat 2 dan 4) dan biji (peringkat 6) (Rajah 4.14c). Asid L-askorbik-2-glukosida hadir

pada kadar yang hampir konsisten di dalam perikarpa pada peringkat 4 dan 6 dan turut

menunjukkan kadar yang tinggi dalam isi (peringkat 4) dan biji (peringkat 6) (Rajah 4.14d).

Asid 2-butinaioik pula tinggi di dalam tisu perikarpa dan isi pada peringkat 2 dan 6

manakala asid kuinik pula hadir pada peringkat 2 (isi), 4 (biji) dan 6 (perikarpa) (Rajah

4.14e).

Daripada enam asid amino dan terbitan yang dikenalpasti sebagai metabolit

berpengaruh tinggi, hanya S-adenosilhomosisteina dan asid aspartik dikesan seawal

peringkat 0 pemasakan (Rajah 4.14f). S-adenosilhomosisteina kemudian meningkat dalam

perikarpa dan menurun kembali pada peringkat 6. Sementara dalam tisu biji, metabolit ini

meningkat sehingga peringkat 6. Asid aspartik pula tinggi pada peringkat 0 dan kekal tinggi

pada peringkat 2 (biji), peringkat 4 (perikarpa, isi dan biji) dan peringkat 6 (isi). Sementara

itu, Asn-Trp-OH, (S)-N-[3-(3,4-metilenadioksifenil)-2-(asetiltio)metil-1-oksooprolil]-(S)-

alanina benzil ester dan temokaprilat pula hanya dikenalpasti bermula peringkat 2 sama ada

dalam perikarpa atau biji manggis (Rajah 4.14g).

Metabolit alkaloid iaitu 6-hirdoksiprotopina, normorfin 3-glukuronida,

oksinarkotina dan xantina didapati bersifat spesifik terhadap jenis tisu pada peringkat

pemasakan yang tertentu (Rajah 4.14i). Contohnya, semua alkaloid hanya dikenalpasti di

dalam perikarpa semasa peringkat 4 sahaja manakala tiga daripadanya iaitu 6-

85

hirdoksiprotopina, normorfin 3-glukuronida dan xantina hanya ditemui dalam isi manggis

pada peringkat 6. Sementara itu, kehadiran 6-hirdoksiprotopina, oksinarkotina dan xantina

dalam biji manggis hanya dikenalpasti pada peringkat 2 (Rajah 4.14i).

Seterusnya, tiga daripada enam terpenoid yang dikenalpasti sebagai metabolit

berpengaruh tinggi iaitu asid (+)-absisik, katalposida dan salvinorin A dikenalpasti pada

peringkat 0 (Rajah 4.14j). Salvinorin A tidak ditemui dalam mana-mana tisu pada peringkat

2 dan seterusnya tetapi asid (+)-absisik dan katalposida serta dua lagi terpenoid iaitu

giberelin A3 dan ginggolida C didapati meningkat dalam tisu biji menuju peringkat akhir

pemasakan. Penurunan pada kadar giberelin A3 dan katalposida dapat dilihat berlaku dalam

perikarpa daripada peringkat 2 kepada peringkat 4. Montanol pula unik kepada tisu biji

(peringkat 4 dan 6) dan hadir pada kadar yang tinggi (Rajah 4.14j).

Kumpulan metabolit bioaktif utama dalam buah manggis iaitu xanton turut

dikenalpasti sebagai metabolit berpengaruh tinggi dalam pemasakan manggis (Rajah

4.14k). Berdasarkan kumpulan fungsi, xanton telah dikategorikan dalam kelas polifenol

(fenolik), namun dalam kajian ini, xanton akan dibincangkan sebagai satu kumpulan

metabolit yang berasingan daripada kumpulan fenolik. Dua daripada empat xanton yang

dikenalpasti sebagai metabolit berpengaruh tinggi iaitu α-mangostin dan kratoksiarborenon

C menunjukkan penurunan dalam perikarpa manggis sepanjang proses pemasakan.

Manakala dalam biji manggis pula, kadar kedua-dua metabolit ini meningkat sewaktu

proses pemasakan. α-Mangostin dan kratoksiarborenon C juga hadir di dalam tisu isi pada

peringkat 2, tetapi hanya hadir pada peringkat 6 untuk α-mangostin dan peringkat 4 untuk

kratoksiarborenon C bagi tisu yang sama. Manakala astikolorin B hanya dikenalpasti dalam

sampel biji (peringkat 2) dan gartanin hanya hadir dan didapati meningkat daripada

peringkat 4 ke 6 bagi sampel perikarpa (Rajah 4.14k).

Berdasarkan Rajah 4.15a, hanya enam daripada 19 fenolik iaitu 4'-metil-(-)-

epigalokatesin 3'-glukuronida, ginketin, kerkosporin, kuersetin 3,3'-dimetil eter 4'-

glukosida, leufolin A dan metilofiopogonona B didapati hadir pada peringkat 0 pemasakan.

Kemudian, 4'-metil-(-)-epigalokatesin 3'-glukuronida didapati meningkat dalam tisu biji

86

pada peringkat 6 bersama beberapa metabolit lain seperti 3-glukosil-2,3',4,4',6-

pentahidroksibenzofenon, 5,7,3'-trihidroksi-6,4',5'-trimetoksiflavanon dan bis-N-butil

ftalat. Bis-N-butil ftalat dan beberapa fenolik lain seperti epirobinatinidol-(4β,8)-katesin,

kuersetin 3,3'-dimetil eter 4'-glukosida, leufolin A, neoisostegana, okrokarpin E dan

soiuflavon A hadir dalam tisu perikarpa pada kadar yang tinggi pada peringkat 2. Kesemua

metabolit ini kemudiannya menurun dalam perikarpa apabila memasuki peringkat 4 tetapi

dua daripadanya iaitu bis-N-butil ftalat dan epirobinatinidol-(4β,8)-katesin kembali

meningkat dalam tisu yang sama pada peringkat akhir pemasakan manakala metabolit yang

selebihnya (kuersetin 3,3'-dimetil eter 4'-glukosida, leufolin A, neoisostegana, okrokarpin

E dan soiuflavon A) tidak ditemui pada peringkat 6 ini. Sebaliknya, leufolin A,

neoisostegana, okrokarpin E dan soiuflavon A didapati semakin meningkat dalam tisu biji

pada peringkat 6 (Rajah 4.15a).

Antara metabolit lain yang turut dikenalpasti mempunyai nilai VIP ≥1.00 dan p

≤0.05 adalah fisalin K dan melampodinin yang dikesan seawal peringkat 0 (Rajah 4.15b).

Fisalin K tidak ditemui dalam mana-mana tisu pada peringkat seterusnya manakala

melampodinin hadir pada kadar yang tinggi dalam tisu biji pada peringkat 2 dan mengalami

penurunan pada peringkat 4 dan 6. Sebaliknya, rodomirtoksin pula meningkat dalam tisu

yang sama sepanjang proses pemasakan. Rubriflordilakton B pula unik kepada tisu

perikarpa (peringkat 6).

c. Analisis LC-MS/MS

Analisis LC-MS/MS yang merangkumi analisis Auto-MS dan analisis LC-MS/MS sasaran

menggunakan teknik pemantauan tindak balas berganda (MRM) telah dijalankan untuk

mengenalpasti identiti metabolit yang diperoleh dari analisis LC-MS sebelum ini dengan

lebih tepat berdasarkan maklumat fragmentasi ion yang diperoleh. Dua metabolit piawai

iaitu α-mangostin dan γ-mangostin turut dianalisis bagi membandingkan fragmentasi ion

yang terhasil.

87

Terdapat 12 metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 dan p ≤0.05) (Jadual 4.8) dan

lima metabolit bukan berpengaruh tinggi (Lampiran N) telah dapat dikenalpasti melalui

analisis LC-MS/MS. Berdasarkan Jadual 4.8 di bawah, metabolit yang berpengaruh tinggi

adalah merangkumi asid amino dan terbitan (S-adenosilhomosisteina), fosfat gula (D-

glukosa 6-fosfat), fenolik ((5,7,3''-trihidroksi-3,5''-dimetoksi-2''-(3''-metilbut-2-enil)flavon,

epirobinatinidol-(4β,8)-katesin, leufolin A dan okrokarpin E)) serta xanton (gartanin,

kratoksiarborenon C dan α-mangostin). Selain itu, turut dilaporkan adalah fragmentasi bagi

metabolit terpenoid iaitu giberelin A3 yang turut dikenalpasti sebagai fitohormon dalam

pemasakan manggis. Fragmentasi bagi metabolit yang tidak dikelaskan ke dalam mana-

mana kumpulan fungsi (lain-lain) iaitu rodomirtoksin dan rubriflordilakton B turut

dikenalpasti dalam kajian ini.

Jadual 4.8 Senarai metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 dan p ≤0.05) yang dikenalpasti

melalui analisis LC-MS/MS

Metabolit RT: m/z Ion aduk Fragmentasi MS/MS

m/z Intensiti Formula kimia

Metabolit Piawai

α-Mangostin 9.6min:

409.1653m/z

[M-2H]- 351.0870 410199 [C20H17O6-H]-H-

377.1387 121695 [C23H23O5-H]-H-

339.0868 194135 [C19H17O6-H]-H-

394.1418 319625 [C23H23O6]-H-

γ-Mangostin 9.7min:

395.1496m/z

[M-H]- 283.0238 49138 [C15H10O6-2H]-H-

339.0861 15691 [C19H17O6-H]-H-

326.0770 13298 [C18H15O6]-H-

Asid amino dan terbitan

S-Adenosilhomosisteina 2.10min:

383.117m/z

[M-H]- 191.0562 215929 [C8H7N4O2]-

193.0605 4241 [C7H7N5O2]-

195.0509 2124 [C7H7N4O3]-

Fosfat gula

D-Glukosa 6-fosfat

5.93min:

259.022m/z

[M-H]- 138.9796 728 [C2H5O5P]-H-

259.0244 210 NA

215.0346 114 [C5H11O7P+H]-

Fenolik

5,7,3''-Trihidroksi-3,5''-

dimetoksi-2''-(3''-metilbut-2-

enil)flavon

2.26min:

397.128m/z

[M-H]- 283.0260 2749 [C15H10O6-2H]-H-

271.0261 1407 [C14H9O6-H]-H-

309.0779 1133 [C18H16O5-2H]-H-

bersambung…

88

...sambungan

Epirobinatinidol-(4β,8)-

katesin

1.93min:

577.130m/z

[M-H]- 289.0725 128031 [C15H13O6]-

407.0781 73150 [C22H17O8-H]-H-

125.0238 41186 [C6H5O3]-

161.0243 17959 [C9H8O3-2H]-H-

Leufolin A 2.20min:

579.148m/z

[M-H]- 289.0729 47362 [C15H16O6-2H]-H-

224.0498 6500 [C14H11O3-2H]-H-

245.0826 8329 [C14H11O4+2H]-

Okrokarpin E 18.14min:

407.147m/z

[M-H]- 349.0719 77185 [C20H14O6]-H-

375.1241 26902 [C23H20O5]-H-

337.0714 41568 [C19H15O6-H]-H-

392.1262 6713 [C23H21O6]-H-

Xanton

Gartanin 15.47min:

395.152m/z

[M-H]- 271.0254 30338 [C14H8O6]-H-

283.0251 25284 [C15H10O6-2H]-H-

339.0877 23020 [C19H17O6-H]-H-

Kratoksiarborenon C 16.45min:

423.178m/z

[M-H]- 365.1032 178829 [C21H19O6-H]-H-

408.1579 101106 [C24H25O6]-H-

353.1028 92199 [C20H19O6-H]-H-

391.1550 57954 [C24H25O5-H]-H-

393.1357 54119 [C23H22O6]-H-


409.162m/z

[M-2H]- 351.0885 20020 [C20H17O6-H]-H-

339.0885 5331 [C19H17O6-H]-H-

394.1427 5321 [C23H23O6]-H-

Terpenoid

Giberelin A3 6.29min:

345.131m/z

[M-H]- 284.1074 4994 [C17H18O4-H]-H-

312.1022 4105 [C18H18O5-H]-H-

327.1261 2623 [C19H21O5-H]-H-

Lain-lain

Rodomirtoksin 16.28min:

427.175m/z

[M-H]- 339.0901 2532 [C19H18O6-2H]-H-

354.1101 1972 [C20H18O6]-

413.1620 759 [C23H25O7]-

Rubriflordilakton B 12.10min:

461.201m/z

[M-H]- 379.1575 1653 [C23H23O5]-

377.1404 1556 [C23H21O5]-

395.1495 1080 [C23H24O6]-H-

Metabolit yang dilaporkan ini menunjukkan fragmentasi ion yang sepadan dengan

pangkalan data yang dirujuk (pencarian menggunakan METLIN dan MetFrag terhadap

pangkalan data umum seperti KEGG, ChEBI, HMDB dan MetaCyc). Dua metabolit piawai

telah digunakan iaitu α-mangostin dan γ-mangostin dan dianalisis menggunakan parameter

89

dan sistem LC-MS/MS yang sama. Corak fragmentasi bagi α-mangostin di dalam sampel

manggis didapati sepadan dengan metabolit piawai yang telah digunakan manakala γ-

mangostin pula tidak dapat dikenalpasti di dalam mana-mana tisu manggis (Jadual 4.8).

Tapak fragmentasi yang dicadangkan pada struktur molekul α-mangostin yang

menghasilkan fragmen ion yang berlainan boleh dirujuk pada Lampiran O manakala tapak

fragmentasi pada struktur molekul lain-lain metabolit yang telah dikenalpasti daripada

analisis LC-MS telah dilampirkan di dalam cakera padat (compact disc) sebagai data

tambahan bagi kajian ini.

90

4.2.3 Analisis tapak jalan metabolomik

Berdasarkan analisis tapak jalan yang dijalankan melalui Analisis Tapak Jalan

Metabolomik (MetPA) terhadap model organisma Arabidopsis thaliana menggunakan

pelayan MetaboAnalyst, 10 tapak jalan yang mempunyai impak paling tinggi

disenaraikan seperti dalam Jadual 4.9 di bawah. Impak dikira dengan membahagikan

bilangan padanan dengan jumlah metabolit dalam tapak jalan yang sepadan. Impak

yang tinggi menggambarkan penglibatan metabolit yang lebih tinggi dalam sesuatu

tapak jalan (Chen et al. 2015), oleh itu ianya sangat berguna bagi membolehkan data

metabolit yang diperoleh daripada analisis GC-MS dan LC-MS dapat dikaji secara

global pada peringkat tapak jalan biosintesis metabolit.

Jadual 4.9 Hasil analisis tapak jalan metabolomik (MetPA). Analisis dijalankan

menggunakan data yang diperoleh daripada analisis pemprofilan metabolit


menggunakan GC-MS dan LC-MS

Tapak jalan Jumlah

metabolit

Padanan Impak Metabolit

Metabolisme galaktosa 26 8 0.3077 D-fruktosa, D-galaktosa, D-glukosa,

D-manosa, gliserol, glukosa 6-fosfat,

myo-inositol, sukrosa

Metabolisme askorbat

dan aldarat

15 4 0.2667 asid D-glukuronik, D-galaktosa,

D-glukarat, myo-inositol

Metabolisme glioksilat

dan dikarboksilat

17 3 0.1765 asid isositrik, asid malik, asid sitrik

Penyalingtukaran pentosa

dan glukuronat

12 2 0.1667 D-xilosa, D-xilulosa

Kitaran asid

trikarboksilik (TCA)

20 3 0.1500 asid isositrik, asid malik, asid sitrik

Metabolisme kanji dan

sukrosa

30 4 0.1333 D-fruktosa, D-glukosa, glukosa 6-

fosfat, sukrosa

Metabolisme gula amino

dan gula nukleotida

41 5 0.1220 arabinosa, D-fruktosa, D-galaktosa,

D-manosa, glukosa 6-fosfat,

Tapak jalan pentosa

fosfat

18 2 0.1111 D-ribosa, glukosa 6-fosfat

Biosintesis Lisin 10 1 0.1000 asid L-aspartik

Metabolisme inositol

fosfat

24 2 0.0833 asid D-glukuronik, myo-inositol

Tapak jalan metabolisme galaktosa didapati menunjukkan padanan bilangan

metabolit yang paling tinggi dengan bilangan asal metabolit di dalam tapak jalan

tersebut iaitu sebanyak lapan metabolit. D-fruktosa, D-galaktosa, D-glukosa, D-

manosa, gliserol, glukosa 6-fosfat, myo-inositol dan sukrosa didapati terlibat dalam

tapak jalan ini. Kebanyakan metabolit yang terlibat dalam tapak jalan ini turut terlibat

91

di dalam beberapa tapak jalan yang lain. Contohnya, D-galaktosa turut terlibat dalam

metabolisme askorbat dan aldarat serta metabolisme gula amino dan gula nukleotida.

Glukosa 6-fosfat pula turut terlibat dalam metabolisme kanji dan sukrosa dan

metabolisme gula amino dan gula nukleotida serta tapak jalan pentosa fosfat.

Selain itu, tapak jalan metabolisme askorbat dan aldarat serta metabolisme

glioksilat dan dikarboksilat juga menunjukkan kadar impak yang tinggi dengan

penglibatan tiga ke empat metabolit. Tapak jalan pentosa fosfat, biosintesis lisin dan

metabolisme inositol fosfat menunjukkan penglibatan metabolit paling rendah iaitu

antara satu dan dua metabolit sahaja. Seterusnya, kajian tapak jalan juga dilakukan

dengan merujuk kepada kajian-kajian lepas (Aizat et al. 2014; Mazlan et al. 2019).

Ekoran daripada maklumat mengenai proses pemasakan buah manggis yang masih

terhad, masih tiada tapak jalan yang lengkap untuk proses pemasakan bagi buah ini.

Oleh itu, kajian kepustakaan difokuskan kepada tapak jalan metabolit dalam tumbuhan

dan buah berdasarkan pangkalan data KEGG.

Selain daripada terlibat dalam beberapa tapak jalan utama seperti metabolisme

galaktosa dan metabolisme askorbat dan aldarat, metabolit gula seperti sukrosa, D-

glukosa dan D-fruktosa juga berkait rapat dengan tapak jalan glikolisis melalui

penghasilan glukosa-6-fosfat dan fruktosa-6-fosfat. Tapak jalan glikolisis berperanan

membekalkan substrat bagi pelbagai tapak jalan lain termasuklah kitaran asid

trikarboksilik (TCA) melalui penghasilan asetil-CoA dan metabolisme sisteina dan

metionina serta biosintesis etilena melalui penghasilan asid aspartik. Selain itu,

glikolisis juga menghasilkan substrat yang terlibat dalam tapak jalan metabolit sekunder

melalui penghasilan fosfoenol piruvat yang menyumbang kepada penghasilan alkaloid,

terpenoid, flavonoid dan juga xanton (Rajah 4.16).

Berpandukan hasil analisis MetPA, metabolit yang dikenalpasti melalui analisis

GC-MS dan LC-MS telah dipetakan ke dalam gabungan tapak jalan yang telah

diringkaskan seperti yang dapat dilihat di dalam Rajah 4.16 di bawah. Setiap metabolit

yang telah dikenalpasti diwakili dengan peta haba yang menunjukkan nilai purata

kawasan puncak yang telah dinormalisasikan bagi analisis GC-MS dan purata

92

ketinggian puncak yang telah dinormalisasikan bagi analisis LC-MS. Tahap sesuatu

metabolit dapat ditentukan berdasarkan peta haba ini.

Sebagai contoh, α-mangostin didapati tinggi di dalam perikarpa bermula

peringkat 2 pemasakan dan paling tinggi di dalam biji manggis pada peringkat akhir

pemasakan. Metabolit xanton lain seperti gartanin pula didapati tinggi di dalam

perikarpa manggis pada peringkat 4 dan 6 manakala 1,3,5-trihidroksixanton pula adalah

paling tinggi di dalam isi manggis pada peringkat akhir pemasakan (peringkat 6).

Maklumat ini boleh digunakan untuk mendapatkan gambaran mengenai peringkat

pemasakan dan tisu manggis yang paling sesuai untuk digunakan bagi mendapatkan

sebatian bioaktif manggis yang paling tinggi.

Kebanyakan kajian lepas terhadap pengekstrakan xanton seperti mangostin

hanya memfokuskan kepada peringkat 6, iaitu peringkat akhir pemasakan (Aizat et al.

2019; Failla & Gutiérrez-Orozco 2017). Namun, kajian ini mendapati bahawa metabolit

ini telah hadir dalam kadar yang tinggi bermula peringkat 2 pemasakan. Justeru itu,

maklumat ini bukan sahaja akan menyumbang kepada pelbagai kajian mengenai

sebatian bioaktif bernilai tinggi yang terdapat di dalam manggis malah boleh

dimanfaatkan sebagai panduan bagi tujuan penuaian buah manggis. Tapak jalan

pemasakan manggis ini adalah yang pertama dilaporkan menggabungkan beberapa

tapak jalan yang berlainan seperti tapak jalan kanji dan sukrosa, glikolisis serta

metabolisme sisteina dan metionina yang merupakan hasil yang signifikan bagi kajian

ini.

93

Rajah 4.16 Pemetaan metabolit dalam tapak jalan metabolik pemasakan manggis. Metabolit yang dikenalpasti melalui analisis GC-MS dan LC-MS diwakili

dengan peta haba berdasarkan nilai purata kawasan puncak yang telah dinormalisasikan bagi analisis GC-MS dan purata ketinggian puncak yang

telah dinormalisasikan bagi analisis LC-MS. Peta haba disusun mengikut peringkat pemasakan dan jenis tisu. Singkatan; P0: peringkat 0, P2:

peringkat 2, P4: peringkat 4, P6: peringkat 6, P: perikarpa, I: isi, B: biji, SAM: S-adenosil-metionina, ACC: asid 1-aminosiklopropana-1-

karboksilik

BAB V

PERBINCANGAN

5.1 PERBANDINGAN KAEDAH PENGEKSTRAKAN METABOLIT

5.1.1 Perbandingan keberkesanan derivatisasi menggunakan MSTFA dan BSTFA

terhadap pengesanan dan pengenalpastian metabolit

Dalam analisis pengoptimuman kaedah pengekstrakan ini, proses derivatisasi sampel telah

dijalankan melalui kaedah sililasi dengan menggunakan N-metil-N-(trimetilsilil)

trifluoroasetamina (MSTFA) atau N,O-bistrifluoroasetamina (BSTFA) untuk

menghasilkan metabolit dengan ciri-ciri yang sesuai bagi analisis GC-MS iaitu meruap dan

stabil haba. Keberkesanan tahap penderma sililasi bagi MSTFA telah dilaporkan setanding

dengan BSTFA dan N,O-bistrimetillsililasetamida (BSA), namun kadar kemeruapan

MSTFA didapati lebih tinggi, menyebabkannya lebih sesuai digunakan untuk analisis GC

(Halket et al. 2005). Penambahan 1% trimetilklorosilana (TMCS) ke dalam MSTFA pula

telah dilaporkan mampu menghasilkan fragmentasi ion yang stabil dan tidak menyebabkan

sebarang gangguan kepada sistem kromatografi semasa analisis dijalankan (Kushnir &

Komaromy-Hiller 2000). Hal ini kerana MSTFA kebiasaannya akan menghasilkan produk

sampingan atau artifak yang boleh mengganggu sistem kromatografi (Little 1999).

Manakala, BSTFA pula telah dilaporkan mampu bertindak balas dengan molekul

sebatian terutamanya asid organik dengan cepat, seterusnya memberikan hasil derivatisasi

yang tinggi (Orata 2012). Sifat BSTFA dan produk sampingannya yang mempunyai kadar

kemeruapan yang tinggi menyebabkan puncak terelusi awal dan pemisahan berlaku pada

95

puncak ini. Produk yang terhasil daripada derivatisasi BSTFA mempunyai tahap hingar

yang rendah dan tidak tercemar seterusnya menyebabkan penghasilan puncak yang tajam

dan jelas (Orata 2012). Campuran BSTFA dengan 1% TMCS pula boleh mengurangkan

gangguan (kesan matriks) semasa analisis GC-MS dijalankan (Azizan et al. 2012; Deng et

al. 2005). Proses derivatisasi yang berkesan akan menghasilkan puncak metabolit yang

tajam, bersimetri, jelas dan mempunyai resolusi yang tinggi pada kromatogram (Orata

2012), seterusnya memudahkan proses pengenalpastian bagi setiap individu metabolit.

Pada awalnya, metabolit daripada perikarpa manggis diekstrak menggunakan lima

kaedah pengekstrakan berbeza (kaedah 1, 2, 3, 4 dan 5) dan diderivatisasi menggunakan

MSTFA (Jadual 4.1). Berdasarkan kromatogram ion jumlah (TIC) yang diperoleh

(Lampiran A), campuran MSTFA dan 1% TMCS didapati sesuai digunakan bagi kelima-

lima kaedah pengekstrakan terutamanya kaedah 3 dan kaedah 5 yang menunjukkan

pemisahan puncak yang lebih jelas, tajam dan menghasilkan bilangan puncak yang lebih

banyak berbanding kaedah yang lain (kaedah 1, 2 dan 5). Selain itu, berdasarkan analisis

pengenalpastian metabolit, kaedah 3 (metanol/kloroform/air dengan nisbah 2:1:2) dan

kaedah 5 (metanol/kloroform/air dengan nisbah 3:1:1) juga menghasilkan jumlah

keseluruhan metabolit tertinggi berbanding kaedah 1, 2 dan 4 iaitu sebanyak 31 metabolit

bagi kaedah 3 dan 34 metabolit bagi kaedah 5 (Jadual 4.1).

Kaedah 3 dan 5 kemudiannya telah dipilih untuk menilai keupayaan kedua-dua

kaedah ini untuk mengekstrak metabolit daripada tisu yang berbeza iaitu perikarpa, isi dan

biji manggis. Bagi analisis pengoptimuman kaedah pengekstrakan terhadap tisu manggis

yang berbeza ini, sampel manggis telah diderivatisasi menggunakan BSTFA. Berdasarkan

TIC yang diperoleh daripada analisis GC-MS, kaedah 3 (Lampiran D) dan 5 (Lampiran E)

menunjukkan hasil pemisahan puncak yang jelas dan tajam bagi ketiga-tiga jenis tisu

manggis (perikarpa, isi dan biji), menandakan bahawa campuran BSTFA dengan 1%

TMCS sesuai digunakan untuk kedua-dua kaedah pengekstrakan bagi analisis GC-MS.

Berdasarkan analisis pengenalpastian metabolit pula, kaedah 3 dan 5 masing-masing

menunjukkan keberkesanan dalam pengekstrakan metabolit dengan penghasilan jumlah

metabolit keseluruhan yang sama iaitu sebanyak 36 metabolit bagi setiap kaedah (Jadual

96

4.3). Namun, kaedah 3 menghasilkan jumlah metabolit primer yang lebih rendah (31

metabolit) berbanding kaedah 5 (32 metabolit).

Sementara itu, apabila dibandingkan hasil pengekstrakan berdasarkan kaedah

pengekstrakan yang sama (kaedah 3 dan 5) dengan hasil analisis pengoptimuman

menggunakan MSTFA yang dijalankan sebelum ini, didapati bahawa bilangan metabolit

yang dikenalpasti menggunakan derivatisasi BSTFA adalah lebih banyak berbanding

MSTFA. Tisu manggis yang diekstrak menggunakan kaedah 3 dan 5 dan diderivatisasi

menggunakan BSTFA menghasilkan 1.41%-7.46% lebih tinggi metabolit berbanding tisu

yang diekstrak menggunakan kaedah yang sama tetapi diderivatisasi menggunakan

MSTFA. Oleh itu, kaedah derivatisasi menggunakan BSTFA telah dipilih untuk

menjalankan analisis pemprofilan metabolit daripada perikarpa, isi dan biji manggis pada

peringkat pemasakan yang berbeza (peringkat 0, 2, 4 dan 6). Tambahan pula, proses

derivatisasi sampel menggunakan BSTFA memerlukan masa penyediaan yang lebih

pendek iaitu selama satu jam berbanding MSTFA yang mengambil masa penyediaan

selama dua jam (Bab 3.2.3). Ini membolehkan proses penyediaan sampel dijalankan dengan

lebih cepat dan berkesan.

5.1.2 Perbandingan jenis dan nisbah pelarut serta teknik lisis terhadap pengekstrakan

metabolit menggunakan lima kaedah pengekstrakan berbeza dan derivatisasi

MSTFA

Pengoptimuman kaedah pengekstrakan metabolit adalah satu proses yang sangat penting

dalam kajian metabolomik kerana kaedah pengekstrakan akan mempengaruhi jenis,

bilangan serta kadar kepekatan metabolit yang boleh diekstrak daripada mana-mana sampel

biologi (Cevallos-Cevallos et al. 2009; Kim & Verpoorte 2010; Mushtaq et al. 2014).

Kaedah pengekstrakan yang berkesan akan memberikan hasil yang maksimum kepada

kajian yang dijalankan. Bagi kajian metabolomik bukan sasaran, identiti serta sifat

kebanyakan metabolit yang terkandung di dalam sampel adalah tidak diketahui (Cevallos-

Cevallos et al. 2009). Oleh itu, beberapa faktor yang mempengaruhi keberkesanan kaedah

pengekstrakan haruslah diuji, dibandingkan serta dinilai dengan teliti.

97

Dalam kajian ini, terdapat tiga faktor yang merangkumi faktor kimia serta faktor

fizikal iaitu, 1) jenis larutan, 2) nisbah larutan serta 3) kesan teknik sonikasi terhadap hasil

pengekstrakan metabolit telah dibandingkan (Jadual 4.1). Terdapat dua jenis campuran

larutan telah digunakan iaitu metanol: kloroform: air dengan nisbah berbeza (2:1:2 dan

3:1:3), disertai teknik sonikasi atau tanpa teknik sonikasi serta campuran larutan metanol:

asid formik (599:1) disertai teknik sonikasi telah digunakan. Campuran larutan metanol,

kloroform dengan air telah dipilih kerana campuran larutan ini dipercayai berkesan untuk

memberikan hasil analisis yang memberangsangkan dan campuran ini seringkali digunakan

dalam kajian metabolomik untuk mengekstrak pelbagai jenis sampel biologi tumbuhan

seperti Solanum tuberosum (kentang) (Dobson et al. 2008), Camellia sinensis (teh hijau

Jepun), Fagus sylvatica L. (bic) (Cadahía et al. 2015) dan Cucurbita maxima (labu)

(Okazaki et al. 2016). Nisbah 2:1:2 dan 3:1:3 juga telah terbukti berkesan dalam

mengekstrak pelbagai jenis metabolit berkutub, tidak berkutub, hidrofobik dan hidrofilik

(Cadahía et al. 2015; Lisec et al. 2006; Okazaki et al. 2016).

Hasil daripada analisis perbandingan yang telah dijalankan, gabungan beberapa

pelarut seperti metanol dengan asid formik serta metanol dengan kloroform dan air dapat

dilihat menunjukkan perbezaan dari segi jenis metabolit yang berjaya diekstrak (Rajah 4.1).

Gabungan pelarut metanol, kloroform dan air menunjukkan hasil pengekstrakan yang lebih

baik kerana kaedah ini berjaya mengekstrak pelbagai jenis metabolit yang merangkumi

kumpulan gula, alkohol dan gula alkohol, asid organik dan juga metabolit sekunder. Hal

ini kerana campuran ketiga-tiga pelarut ini sangat sesuai digunakan untuk mengekstrak

metabolit daripada kumpulan berkutub sehingga ke metabolit kumpulan tidak berkutub

daripada pelbagai sampel biologi (Kim & Verpoorte 2010; Mushtaq et al. 2014)

termasuklah sampel tumbuhan seperti Arabidopsis thaliana (Gullberg et al. 2004) dan

Cucurbita maxima (labu) (Okazaki et al. 2016).

Kaedah pengekstrakan yang diiringi dengan teknik sonikasi iaitu kaedah 1, 3 dan 5

juga berjaya mengenalpasti bilangan metabolit yang lebih tinggi iaitu masing-masing

sebanyak 28, 31 dan 34 metabolit berbanding kaedah pengekstrakan yang tidak diiringi

dengan teknik ini iaitu kaedah 2 dan 4 yang masing-masing menghasilkan sebanyak 22 dan

98

14 metabolit sahaja (Jadual 4.1). Hal ini membuktikan bahawa teknik sonikasi adalah

berkesan untuk menggalakkan pengeluaran metabolit daripada sel perikarpa manggis tanpa

dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan. Teknik sonikasi dilakukan dengan cara

mendedahkan sampel kepada gelombang bunyi berfrekuensi tinggi di dalam air rendaman

dengan suhu yang sesuai. Gelombang bunyi ini akan menyebabkan sel pecah seterusnya

menggalakkan pembebasan metabolit daripada dalam sel tersebut. Teknik sonikasi telah

terbukti berjaya meningkatkan kadar pengekstrakan metabolit daripada pelbagai tisu

sampel biologi seperti Glycine max (kacang soya) (Rostagno et al. 2003) dan turunan sel

karsinoma endometrium manusia (ECCI) (Matheus et al. 2014). Oleh itu, teknik ini sesuai

untuk diaplikasikan dalam setiap kaedah pengekstrakan metabolit daripada mana-mana

sampel biologi.

Kaedah 1 yang menggunakan campuran pelarut metanol dengan asid formik disertai

teknik sonikasi turut berjaya mengekstrak jumlah keseluruhan metabolit yang ketiga

tertinggi selepas kaedah 3 dan kaedah 5 yang menggunakan campuran metanol, kloroform

dan air disertai dengan teknik sonikasi. De Vos et al. (2007) melaporkan bahawa campuran

pelarut metanol dengan asid formik adalah sesuai digunakan untuk mengekstrak julat

metabolit yang besar merangkumi pelbagai jenis metabolit sekunder daripada tisu

tumbuhan. Kaedah ini telah berjaya mengekstrak jumlah metabolit sekunder yang lebih

tinggi iaitu sebanyak lima metabolit berbanding kaedah-kaedah pengekstrakan yang lain

(Rajah 4.1). Kaedah 3 dan 5 masing-masing berjaya mengekstrak satu metabolit sekunder

manakala tiada metabolit sekunder dapat diekstrak menggunakan kaedah 2 dan 4. Namun

begitu, jumlah keseluruhan metabolit sekunder yang dapat diekstrak menggunakan kelima-

lima kaedah pengekstrakan adalah terlalu rendah. Hal ini mungkin disebabkan oleh limitasi

yang terdapat pada sistem GC-MS yang lebih sensitif terhadap metabolit primer seperti

gula, alkohol, asid organik dan asid amino (Gullberg et al. 2004; Lee et al. 2013; Okazaki

et al. 2016; t’Kindt et al. 2009). Pengenalpastian metabolit sekunder pula dilaporkan lebih

sesuai dijalankan dengan menggunakan analisis LC-MS yang lebih sensitif terhadap

metabolit sekunder seperti flavonoid, alkaloid, saponin, fenilpropanoid dan xanton (De Vos

et al. 2007; Lee et al. 2013; t’Kindt et al. 2009).

99

5.1.3 Kesan nisbah pelarut terhadap pengekstrakan metabolit menggunakan dua kaedah

pengekstrakan berbeza dan derivatisasi BSTFA

Daripada analisis GC-MS yang telah dijalankan dengan derivatisasi BSTFA, kedua-dua

kaedah pengekstrakan (kaedah 3 dan kaedah 5) berjaya mengekstrak jumlah metabolit yang

sama iaitu sebanyak 36 metabolit bagi setiap kaedah (Jadual 4.3). Meskipun kaedah 3 dan

kaedah 5 menghasilkan jumlah metabolit yang sama, terdapat sebilangan metabolit yang

diekstrak adalah berbeza antara dua kaedah pengekstrakan ini yang seterusnya membawa

kepada jumlah keseluruhan metabolit yang dapat dikesan daripada kedua-dua kaedah

adalah sebanyak 43 metabolit (Lampiran B). Perbezaan dapat dilihat dari segi jenis

metabolit yang diekstrak dan bilangan metabolit bagi jenis metabolit tertentu antara kaedah

3 dan 5 (Rajah 4.5).

Berdasarkan analisis multivariat yang telah dijalankan pula, plot skor PCA dalam

Rajah 4.6 menunjukkan pemisahan antara kelompok metabolit lebih cenderung bergantung

kepada jenis tisu berbanding kaedah pengekstrakan. Pertindihan antara kelompok metabolit

hanya berlaku antara kelompok metabolit daripada sampel isi bagi kedua-dua kaedah

pengekstrakan (kaedah 3: metanol/kloroform/air, 2:1:2 dan kaedah 5:

metanol/kloroform/air, 3:1:1). Kelompok metabolit daripada sampel perikarpa dan biji

daripada kaedah 3 dan 5 masing-masing menunjukkan pemisahan yang jelas. Pemisahan

ini mungkin berlaku disebabkan sifat biologi setiap jenis tisu itu sendiri di mana setiap tisu

iaitu perikarpa, isi dan biji memainkan fungsi metabolisme yang berbeza dalam tumbuhan

dan buah.

Seterusnya, analisis perbandingan melalui analisis gambar rajah Venn telah

dijalankan untuk mengkaji dengan lebih teliti persamaan dan perbezaan hasil

pengekstrakan menggunakan dua kaedah pengekstrakan berbeza daripada tiga jenis tisu

manggis (Rajah 4.8 dan Jadual 4.4). Hasil analisis mendapati bahawa darjah kekutuban

pelarut mempengaruhi jenis dan bilangan metabolit yang diekstrak seperti yang telah

dilaporkan dalam kajian lepas (Azizan et al. 2015; Mushtaq et al. 2014). Seperti yang

dibincangkan di dalam bahagian pengoptimuman lima kaedah pengekstrakan sebelum ini

100

(Bab 5.1.2), gabungan pelarut metanol, kloroform dan air digunakan kerana keberkesanan

gabungan pelarut ini untuk mengekstrak pelbagai jenis metabolit berkutub, tidak berkutub,

hidrofilik dan hidrofobik serta tahap kebolehulangan yang tinggi dalam kajian berkaitan

metabolomik tumbuhan (De Vos et al. 2007; Lisec et al. 2006; Mushtaq et al. 2014; Okazaki

et al. 2016).

Berdasarkan Jadual 4.4, kaedah 3 didapati berjaya mengekstrak lebih banyak

metabolit unik yang berkutub berbanding kaedah 5. Contohnya, metabolit berkutub seperti

arabinofuranosa, galakto-heksodialdosa, D-xilofuranosa dan β-D-glukopiranosida hanya

dapat dikesan menggunakan kaedah 3. Hal ini mungkin disebabkan nisbah pelarut berkutub

yang digunakan dalam kaedah 3 (dua nisbah air berbanding satu nisbah air dalam kaedah

5). Tambahan lagi, dua alkohol iaitu 2,3-butanediol dan treitol merupakan metabolit unik

bagi kaedah 5 sama ada daripada sampel perikarpa atau biji. Ini membuktikan bahawa

nisbah metanol yang digunakan dalam kaedah 5 (nisbah 3 berbanding nisbah 2 bagi kaedah

3) menyumbang kepada pengenalpastian metabolit alkohol dalam kajian ini. Hasil kajian

menjelaskan bahawa gabungan pelarut yang berbeza nisbah boleh mempengaruhi

pengekstrakan metabolit, seterusnya menekankan kepentingan kaedah pengekstrakan yang

optimum dalam mana-mana kajian berasakan metabolomik.

Secara kesimpulannya, kedua-dua kaedah pengekstrakan telah menunjukkan hasil

yang memberangsangkan. Kaedah 3 dan 5 sesuai digunakan untuk mengekstrak metabolit

dari perikarpa, isi dan manggis serta melalui proses derivatisasi sampel menggunakan

BSTFA. Namun, kaedah 5 telah dipilih untuk analisis seterusnya iaitu analisis pemprofilan

metabolit daripada perikarpa, isi dan biji manggis pada peringkat pemasakan yang berbeza

(peringkat 0, 2, 4 dan 6) kerana kaedah ini mampu mengekstrak metabolit primer dengan

lebih berkesan berbanding kaedah 3 meskipun perbezaan antara kedua-dua kaedah ini

adalah tidak begitu ketara.

101

5.1.4 Perbandingan kaedah pengekstrakan dan mod pengionan LC-MS terhadap

pengenalpastian metabolit

Keberkesanan kaedah 1 (metanol/asid formik dengan nisbah 599:1) dan kaedah 5

(metanol/kloroform/air dengan nisbah 3:1:1) terhadap pengekstrakan metabolit turut dikaji

menggunakan analisis LC-MS. Kaedah 1 dipilih kerana kaedah ini memberikan hasil

pengekstrakan metabolit sekunder yang paling tinggi berdasarkan analisis pengoptimuman

menggunakan GC-MS yang dijalankan sebelum ini iaitu sebanyak lima metabolit sekunder

berbanding kaedah 2 dan 4 yang tidak dapat mengekstrak metabolit sekunder serta kaedah

3 dan 5 yang masing-masing hanya menghasilkan satu metabolit sekunder sahaja (Rajah

4.1). Sementara itu, kaedah 5 pula dipilih kerana berjaya mengekstrak jumlah keseluruhan

metabolit yang paling tinggi berbanding kaedah lain (Jadual 4.1 dan Jadual 4.3).

Selain daripada kaedah pengekstrakan, mod pengionan (positif atau negatif) juga

mempengaruhi hasil analisis LC-MS dari segi jenis dan bilangan metabolit yang akan

dikenalpasti (Theodoridis et al. 2012b). Satu mod (positif atau negatif) tidak dapat meliputi

semua jenis metabolit (berkutub, tidak berkutub, ionik, neutral dan sebagainya) kerana

sesetengah jenis metabolit mempunyai kadar pengionan yang tinggi dalam salah satu mod

analisis, manakala sesetengah jenis metabolit yang lain pula mempunyai kadar pengionan

tinggi di dalam mod pengionan yang lain. Mod positif seringkali digunakan dalam analisis

LC-MS kerana keberkesanannya untuk mengionkan pelbagai metabolit berkutub dan tidak

berkutub manakala mod negatif dilaporkan berprestasi tinggi mengionkan kelas metabolit

yang tertentu seperti metabolit gula dan asid organik (Theodoridis et al. 2012b).

Bagi analisis perbandingan ini, kaedah 1 dan kaedah 5 dinilai berdasarkan

penghasilan bilangan puncak pada kromatogram yang diwakili dengan pasangan RT: m/z

pada kedua-dua mod positif dan negatif tanpa analisis pengenalpastian metabolit yang

kompleks dan memerlukan masa kajian yang lebih lama. Berdasarkan hasil yang diperolehi

(Jadual 4.5), kaedah 1 menghasilkan sebanyak 46 pasangan RT: m/z pada mod positif dan

58 pasangan RT: m/z pada mod negatif manakala kaedah 5 pula menghasilkan bilangan

pasangan RT: m/z yang lebih tinggi pada mod positif iaitu 55 pasangan RT: m/z dan

102

bilangan puncak yang lebih rendah pada mod negatif iaitu sebanyak 41 pasangan RT: m/z.

Secara kesimpulannya, kaedah 1 menunjukkan hasil yang lebih memberangsangkan

dengan jumlah pasangan RT: m/z yang lebih tinggi berbanding kaedah 5 terutamanya bagi

mod pengionan negatif.

Kaedah 1 seterusnya telah dipilih untuk digunakan bagi analisis pemprofilan

metabolit daripada pelbagai tisu (perikarpa, isi dan biji) manggis pada peringkat pemasakan

yang berbeza (peringkat 0, 2, 4 dan 6). Manakala, mod pengionan pula ditetapkan kepada

mod negatif. Tambahan pula, mod pengionan negatif ESI-MS juga dikatakan sesuai untuk

mengkaji metabolit xanton yang merupakan kumpulan bioaktif utama dalam manggis. Hal

ini kerana mod negatif mampu meningkatkan fragmentasi metabolit xanton, sekaligus

memudahkan proses pengenalpastian dan penentuan struktur xanton (Wittenauer et al.

2012).

5.2 PENGAWALATURAN METABOLISME METABOLIT PRIMER DAN

SEKUNDER SEMASA PEMASAKAN MANGGIS

5.2.1 Analisis multivariat mendedahkan pemisahan kelompok metabolit mengikut

peringkat pemasakan berdasarkan jenis tisu yang berbeza

Analisis multivariat yang merangkumi analisis PCA dan PLS-DA telah dijalankan secara

berasingan bagi data yang diperoleh daripada analisis GC-MS (Rajah 4.9) dan LC-MS

(Rajah 4.12). Terlebih dahulu, analisis PCA telah dijalankan mengikut jenis tisu (perikarpa,

isi dan biji) untuk melihat pemisahan antara peringkat pemasakan yang berbeza iaitu

peringkat 0, 2, 4 dan 6. Kemudian, analisis PLS-DA turut dijalankan untuk mengenalpasti

pembolehubah yang berkepentingan dalam unjuran (VIP) atau metabolit berpengaruh

tinggi yang berkemungkinan memainkan peranan penting dalam pemasakan manggis.

Bagi analisis GC-MS, hasil kajian menunjukkan bahawa taburan metabolit dalam

tisu manggis yang berbeza iaitu perikarpa (Rajah 4.9a dan d), isi (Rajah 4.9b dan e) dan

biji (Rajah 4.9c dan f) pada empat peringkat pemasakan berjaya didiskriminasikan

menggunakan kedua-dua analisis PCA dan PLS-DA ini. Pemisahan yang jelas antara

103

kelompok sampel yang dibandingkan menerangkan bahawa taburan metabolit adalah

dipengaruhi oleh jenis tisu serta peringkat pemasakan dalam manggis. Namun, terdapat

sedikit pertindihan antara kelompok metabolit daripada peringkat 0 dengan perikarpa

(peringkat 2) (Rajah 4.9a dan d), menunjukkan terdapat persamaan antara dua kelompok

metabolit ini. Hal ini mungkin terjadi disebabkan metabolit primer daripada peringkat 0

dan 2 tidak mempunyai perbezaan yang ketara kerana kedua-dua peringkat ini dianggap

sebagai peringkat awal pemasakan atau belum-masak (Osman & Milan 2006; Parijadi et al.

2017).

Manakala bagi data yang diperoleh daripada analisis LC-MS, pemisahan yang jelas

berjaya diperoleh bagi semua plot skor PCA dan PLS-DA, menunjukkan bahawa variasi

antara kelompok metabolit daripada peringkat pemasakan yang berbeza adalah tinggi

mengikut jenis tisu. Sementara itu, ketepatan yang tinggi antara replikat biologi bagi setiap

kelompok metabolit yang dapat dilihat di dalam semua plot skor PCA dan PLS-DA bagi

kedua-dua analisis GC-MS dan LC-MS menandakan tahap kebolehulangan yang tinggi

antara sampel mengikut peringkat dan jenis tisu. Ini sekaligus memberikan gambaran

bahawa pensampelan dan pemprosesan sampel telah dilakukan dengan teliti dan tepat.

5.2.2 Pengawalaturan metabolik gula, asid amino, asid organik serta fitohormon

menyumbang kepada ciri-ciri pemasakan manggis

Pemasakan buah berkait rapat dengan beberapa fenomena utama seperti degradasi dinding

sel yang membawa kepada pelembutan buah serta diikuti dengan perkembangan rasa,

aroma dan bau. Fenomena ini melibatkan biosintesis dan modifikasi pada tahap sesetengah

metabolit termasuklah gula, asid gula, asid organik dan sebatian meruap (Osorio & Fernie

2014; Osorio et al. 2013; Sharon‐Asa et al. 2003). Galaktosa dan manosa adalah antara

metabolit yang telah dikenalpasti sebagai komponen dinding sel yang terlibat dengan

pelembutan buah semasa pemasakan berlaku seperti yang dilaporkan bagi Solanum

lycopersicum (tomato) (Oms-Oliu et al. 2011). Dalam kajian ini, metabolit terbitan kepada

manosa iaitu L-manopiranosa dikenalpasti sebagai metabolit berpengaruh tinggi di dalam

perikarpa manggis dengan nilai VIP ≥1.00 dan p ≤0.05 (Rajah 4.11a) . Pengumpulan L-

104

manopiranosa di dalam perikarpa menunjukkan bahawa degradasi dinding sel berlaku

secara aktif di dalam perikarpa manggis semasa proses pemasakan. Tambahan lagi, analisis

tapak jalan metabolomik (MetPA) menyatakan bahawa metabolisme galaktosa merupakan

tapak jalan paling dominan dalam proses pemasakan manggis di mana manosa dan

galaktosa juga terlibat dalam tapak jalan ini (Jadual 4.9).

Selain itu, myo-inositol juga didapati turut terlibat dalam metabolisme galaktosa

serta metabolisme askorbat dan aldarat yang juga dikenalpasti sebagai tapak jalan utama di

dalam pemasakan manggis (Jadual 4.9). Kehadiran myo-inositol daripada perikarpa

manggis serta kadar metabolit ini yang tinggi di dalam biji manggis pada peringkat 2 dan

6 (Rajah 4.11d) mungkin berkait dengan fungsinya sebagai pelopor yang penting kepada

biosintesis pelbagai polisakarida dinding sel termasuklah pektin dan hemiselulosa (Oms-

Oliu et al. 2011). Oleh itu, apabila ketegaran dinding sel buah menurun apabila

menghampiri peringkat akhir pemasakan, myo-inositol berkumpul di dalam kedua-dua tisu

perikarpa dan biji manggis. myo-Inositol juga berperanan dalam pengisyaratan (Shi et al.

2005; Valluru & Van den Ende 2011) dan kawalan tindak balas tekanan di dalam tumbuhan

dan buah (Nkang 2002; Valluru & Van den Ende 2011; Yildizli et al. 2018). Proses

pemasakan diketahui turut melibatkan proses pengisyaratan dan kawalan tindak balas

tekanan yang kompleks, yang mana kehadiran myo-inositol mungkin terlibat dalam proses

ini.

Gula lain yang turut dikenalpasti dalam kajian ini adalah arabinofuranosa (Rajah

4.11a). Arabinofuranosa sering hadir sebagai arabinogalaktan, komponen utama rantaian

sampingan bagi pektin di dalam dinding sel (Denman & Morris 2015; Robinson & Davies

2000). Penurunan yang signifikan bagi arabinofuranosa di dalam tisu perikarpa dan biji

manggis daripada peringkat pertengahan pemasakan (peringkat 2 atau 4) kepada peringkat

akhir pemasakan (peringkat 6) menunjukkan bahawa berlakunya modifikasi terhadap

struktur pektin di dalam buah manggis. Pektin adalah polisakarida dinding sel yang kaya

dengan asid galakturonik dan merupakan polisakarida yang mempunyai struktur dan fungsi

yang paling kompleks dalam dinding sel tumbuhan (Caffall & Mohnen 2009; Mohnen

2008). Kehadiran asid galakturonik pada kadar yang tinggi semasa peringkat 0 dan

105

peringkat 2 (perikarpa) pemasakan tetapi tidak pada peringkat yang seterusnya (Rajah

4.11c) membuktikan bahawa berlakunya degradasi pektin di dalam struktur dinding sel

manggis yang seterusnya membawa kepada pelembutan buah semasa proses pemasakan

(Osorio & Fernie 2014). Degradasi polisakarida pektin semasa buah masak dipercayai

membawa kepada proses pemasakan buah yang sebenar (Prasanna et al. 2007).

Modifikasi pada kandungan metabolit gula adalah salah satu perubahan utama yang

berlaku semasa pemasakan bagi kebanyakan buah tidak kira sama ada buah klimakterik

atau bukan-klimakterik (Aizat et al. 2014; Fait et al. 2008; Osorio et al. 2012). Kadar yang

tinggi bagi D-glukosa 6-fosfat di dalam perikarpa manggis pada peringkat 2 dan 4 (Rajah

4.14c) didapati selaras dengan aras D-glukosa sewaktu proses pemasakan (Lampiran K).

D-glukosa 6-fosfat merupakan salah satu metabolit yang terlibat dalam bahagian awal tapak

jalan glikolisis (Rajah 4.16) yang merupakan tapak jalan penjanaan tenaga daripada proses

pembubaran glukosa (Aizat et al. 2014; Paul & Pellny 2003). Kadar D-glukosa 6-fosfat

yang tinggi mencadangkan bahawa aktiviti glikolitik di dalam perikarpa manggis adalah

aktif semasa peringkat pertengahan pemasakan (peringkat 2 dan 4). Ini mungkin

disebabkan oleh peranan tapak jalan glikolisis dalam membekalkan pelbagai pelopor

penting kepada tapak jalan yang lain seperti kitaran asid trikarboksilik (TCA), biosintesis

etilena dan biosintesis metabolit sekunder (Rajah 4.16) sewaktu proses pemasakan.

Metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 dan p ≤0.05) yang lain merangkumi

metabolit gula dan asid organik seperti L(-)-fukosa (Rajah 4.11a), asid ribonik (Rajah 4.11c)

dan asid L-(+)-tartarik (Rajah 4.11f). Kajian oleh Mahmood et al. (2012) melaporkan

kehadiran asid askorbik (vitamin C) yang menyumbang kepada rasa masam berasid dalam

buah strawberi dan ceri manis yang masak. Asid askorbik tidak dapat dikesan di dalam

kajian terhadap manggis ini, namun metabolit terbitan bagi asid askorbik iaitu asid L-

askorbik-2-glukosida dikenalpasti sebagai metabolit berpengaruh tinggi semasa proses

pemasakan (Rajah 4.14d). Metabolit ini dikesan pada kadar yang tinggi pada peringkat

pertengahan dan akhir pemasakan, memberikan gambaran bahawa ianya mungkin

menyumbang kepada rasa masam manggis selepas dituai. Selain itu, asid tartarik turut

dilaporkan berkumpul pada peringkat akhir pemasakan bagi buah mulberi panjang, mulberi

106

kecil dan strawberi, seperti juga di dalam perikarpa manggis di dalam kajian ini (Rajah

4.11f) (Mahmood et al. 2012).

Sebatian meruap yang merangkumi alkohol, ester dan aldehid pula merupakan

kumpulan metabolit utama yang menyumbang kepada ciri-ciri aroma bagi buah masak

(Defilippi et al. 2009; Dixon & Hewett 2000; Osorio et al. 2013; Yang et al. 2016). Buah

manggis yang telah masak mempunyai aroma yang tersendiri. Aroma yang menyenangkan

dalam buah ini dipercayai berkait rapat dengan kadar arabinitol dalam perikarpa dan isi

manggis (pada peringkat 6) (Rajah 4.11) dan 2,3-butanadiol dalam isi manggis (pada

peringkat 4 dan 6) (Rajah 4.11e). Selain itu, peningkatan pada kadar penghasilan butanal

dilihat meningkat di dalam sampel isi dan biji manggis daripada peringkat 2 kepada

peringkat 4 pemasakan dan seterusnya menurun di dalam tisu yang sama pada peringkat 6

(Rajah 4.11). Perubahan ini mungkin berlaku disebabkan penukaran metabolit aldehid ini

kepada alkohol aromatik atau ester yang sepadan (Dixon & Hewett 2000; Yamashita et al.

1976) di dalam manggis sewaktu proses pemasakan.

Asid aspartik dan S-adenosilhomosisteina pula dipercayai terlibat dalam proses

pemasakan manggis melalui metabolisme sisteina dan metionina serta biosintesis etilena

(Rajah 4.16). Metionina adalah molekul utama kepada biosintesis fitohormon etilena yang

bertindak merangsang proses pemasakan buah klimakterik termasuklah manggis (Hesse et

al. 2004; Ravanel et al. 1998). Metionina boleh disintesis daripada aspartat dan

kemudiannya ditukarkan kepada S-adenosil-metionina (SAM) dan seterusnya kepada asid

1-aminosiklopropana-1-karboksilik (ACC) sebelum terhasilnya hormon etilena. Selain itu,

SAM juga boleh membentuk S-adenosilhomosisteina dengan pertambahan molekul tenaga

ATP (Bürstenbinder et al. 2007; Gellekink et al. 2005; Hesse et al. 2004; Ravanel et al.

1998). Dalam kajian ini, metabolit asid aspatik dan S-adenosilhomosisteina yang berkait

rapat dengan metabolisme metionina menunjukkan perubahan semasa pemasakan manggis.

Kadar asid aspartik yang tinggi di dalam ketiga-tiga tisu manggis sama ada pada peringkat

pertengahan atau akhir pemasakan (Rajah 4.14g) menandakan bahawa metabolisme

sisteina dan metionina serta biosintesis hormon etilena adalah aktif pada peringkat ini.

Kadar S-adenosilhomosisteina pula didapati menurun di dalam perikarpa sepanjang proses

107

pemasakan manggis (Rajah 4.14g). Hal ini mungkin berlaku disebabkan pelopornya iaitu

SAM mungkin digunakan dalam penghasilan hormon etilena (Rajah 4.16) yang diketahui

tinggi sewaktu pemasakan manggis (Paul et al. 2012).

Asid absisik (ABA) turut dilaporkan bertindak secara sinergi dengan hormon

etilena untuk menggalakkan pelembutan tisu buah dengan cara merangsang aktiviti

hidrolase dinding sel terutamanya pektin metil esterase (PME) dan pektat liase (PL) di

dalam buah pisang (Lohani et al. 2004). ABA juga berperanan dalam pengawalaturan

aktiviti proses pemasakan yang lain seperti pengumpulan gula dan perkembangan warna

(Nicolas et al. 2014). Dalam kajian ini, peningkatan ABA dalam biji manggis pada

peringkat akhir pemasakan (Rajah 4.14j) didapati selari dengan peningkatan sukrosa di

dalam tisu yang sama (Rajah 4.14a). Penemuan ini adalah sepadan dengan kajian oleh Jia

et al. (2011) yang melaporkan bahawa pengumpulan ABA boleh dirangsang oleh gula

eksogenus terutamanya sukrosa dan glukosa. Selain itu, Kondo et al. (2002) dalam

kajiannya pula turut mencadangkan bahawa ABA mungkin mencetuskan atau memulakan

proses pematangan manggis. Hal ini mungkin menjelaskan kehadiran ABA pada peringkat

0 pemasakan dan meningkat di dalam perikarpa dan biji apabila memasuki peringkat 2

(Rajah 4.14j).

5.2.3 Pengawalaturan dinamik metabolisme sekunder manggis melibatkan metabolit

fenolik, terpenoid, alkaloid dan xanton

Fenolik adalah kumpulan metabolit sekunder yang mempunyai taburan paling meluas di

dalam tumbuhan dan penghasilan kumpulan metabolit ini adalah bergantung kepada

spesies dan varieti tumbuhan (Lattanzio et al. 2008). Dalam kajian ini, metabolit fenolik

yang berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 dan p ≤0.05) dikenalpasti dengan jumlah yang paling

banyak iaitu 19 metabolit (Rajah 4.15a) berbanding kumpulan metabolit sekunder yang lain.

Salah satu fungsi utama kumpulan fenolik adalah untuk melindungi tumbuhan daripada

sinaran ultraungu (UV) merbahaya yang boleh merosakkan tumbuhan melalui penghasilan

kumpulan spesies oksigen aktif (ROS) (Lattanzio et al. 2008). Metabolit fenolik yang

merangkumi flavonoid, koumarin, fenolik glikosida dan kuersetin dikesan dalam jumlah

108

yang berbeza-beza daripada sampel perikarpa, isi dan biji manggis. Sebagai contoh,

peningkatan kadar beberapa fenolik yang dikenalpasti sebagai flavonoid seperti

metilofiogoponona B (perikarpa), leufolin A, prunin 6''-O-galat (isi) dan soiuflavon A (biji)

serta lignan seperti neoisostegana (biji) antara peringkat pemasakan yang tertentu (Rajah

4.15a) menunjukkan bahawa tapak jalan fenilpropanoid berlaku pada tahap yang berbeza

dalam setiap tisu manggis semasa proses pemasakan berlaku. Pengenalpastian leufolin A

turut disokong oleh data daripada analisis MS/MS dengan penghasilan fragmentasi puncak

[M-H]- pada m/z 579, sepadan dengan hasil kajian yang dilaporkan oleh Noor et al. (2007).

Perubahan kadar beberapa fenolik di dalam manggis boleh dikaitkan dengan

pelbagai fungsi kumpulan metabolit ini terhadap tumbuhan. Contohnya, lignan yang

dikategorikan bawah kumpulan fenolik mempunyai bioaktiviti anti-oksida dan

sitopelindung (cytoprotective) seperti yang telah dilaporkan di dalam Euterpe oleracea

(buah acai) (Chin et al. 2008). Peningkatan kadar neoisostegana iaitu metabolit lignan di

dalam biji manggis daripada peringkat 2 kepada peringkat 4 dan 6 (Rajah 4.15a)

menunjukkan bahawa metabolit ini mungkin dihasilkan secara aktif untuk perlindungan

manggis terhadap jangkitan patogen atau serangan daripada serangga (Harmatha & Dinan

2003). Sesetengah lignan turut dilaporkan berupaya untuk mempengaruhi perkembangan

serangga dengan mengubah pelbagai fungsi fisiologi serangga tersebut melalui aktiviti

antagonistik ekdisteroid (Harmatha & Dinan 2003). Hal ini juga mungkin menjelaskan

kadar neoisostegana yang tinggi di dalam perikarpa manggis pada peringkat 2 (Rajah 4.15a)

yang mungkin menunjukkan bahawa aktiviti pertahanan telah bermula dari sejak awal

proses pemasakan lagi bagi menjamin pemasakan buah yang sempurna sehingga peringkat

akhir pemasakan.

Sesetengah fenolik memainkan peranan dalam perkembangan warna, rasa dan nilai

nutrisi bagi buah segar (Zarena & Sankar 2012). Perkembangan warna manggis berkait

rapat dengan proses pemasakan di mana kulit manggis akan berubah daripada warna hijau

pada peringkat awal pemasakan kepada warna ungu gelap apabila menghampiri peringkat

akhir pemasakan (Osman & Milan 2006; Palapol et al. 2009b). Perubahan warna kulit buah

bertindak sebagai penunjuk utama untuk menilai tahap kematangan manggis terutamanya

109

bagi tujuan penuaian. Flavonoid terutamanya antosianin dan flavonol berperanan penting

dalam perkembangan warna bagi buah dan tumbuhan (Lancaster & Dougall 1992; Palapol

et al. 2009b). Salah satu metabolit yang berperanan sebagai pelopor bagi biosintesis

flavonoid telah dikenalpasti dalam kajian ini sebagai asid kuinik (Albertini et al. 2006;

Leuschner et al. 1995). Pengenalpastian asid kuinik di dalam perikarpa manggis

terutamanya pada peringkat terakhir pemasakan iaitu peringkat 6 (Rajah 4.14e) mungkin

disebabkan biosintesis kumpulan metabolit flavonoid adalah aktif pada peringkat ini.

Kuersetin 3,3'-dimetil eter 4'-glukosida yang dikategorikan sebagai kuersetin

(sejenis bioflavonoid) dikenalpasti sebagai metabolit berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 dan p

≤0.05) daripada manggis dan merupakan metabolit unik kepada sampel peringkat 0 dan

sampel perikarpa daripada peringkat 2 (Rajah 4.15a). Kuersetin merupakan flavonoid

berwarna kuning yang terhasil daripada tapak jalan biosintesis yang sama dengan

antosianin (Lancaster & Dougall 1992). Kuersetin telah dilaporkan menunjukkan aktiviti

anti-oksida dalam pelbagai buah dan tumbuhan (Miean & Mohamed 2001; Sultana &

Anwar 2008). Menurut kajian oleh Lancaster dan Dougall (1992), kuersetin dan kuersetin

glikosida banyak didapati di dalam kulit buah epal hijau seperti kultivar ”Granny Smith”

dan “Golden Delicious”. Manakala di dalam manggis, kehadiran metabolit ini pada

peringkat awal pemasakan mungkin berkait dengan warna hijau kekuningan pada perikarpa

manggis muda. Metabolit ini tidak dapat dikesan pada peringkat pertengahan (peringkat 4)

dan peringkat akhir pemasakan (peringkat 6) setelah manggis bertukar warna kepada merah

keperangan dan ungu gelap (Rajah 4.15a). Perubahan warna ini mungkin disebabkan

kehadiran antosianin yang lain seperti sianidin-3-soforosida dan sianidin-3-glukosida yang

dilaporkan meningkat seiring dengan proses pemasakan manggis (Palapol et al. 2009b).

Fungsi individu bagi kebanyakan fenolik yang telah dikenalpasti adalah masih

belum diketahui secara jelas dan terperinci disebabkan tahap metabolit ini yang berbeza-

beza dan tidak konsisten di dalam tisu manggis sepanjang proses pemasakan. Sebagai

contoh, epirobinatinidol-(4β,8)-katesin adalah proantosianidin yang telah ditemui dalam

batang pokok Acacia mearnsii (Kusano et al. 2010). Metabolit ini belum pernah dilaporkan

dalam manggis, namun, unit kumpulan berfungsi katesin telah dilaporkan dalam beberapa

110

kajian lepas sebagai komponen utama dalam proantosianidin yang ditemui di dalam

manggis (Fu et al. 2007; Yoshimura et al. 2015). Secara amnya pula, proantosianidin dan

fenolik secara keseluruhannya adalah berfungsi sebagai pemangsa radikal bebas yang

sangat kuat. Fungsi kumpulan metabolit ini secara langsung menyumbang kepada

kepentingan serta kelebihan buah dan tumbuhan terhadap aspek kesihatan manusia (Fu et

al. 2007; Naczk & Shahidi 2006; Prior & Gu 2005). Namun, mekanisme spesifik bagi

metabolit epirobinatinidol-(4β,8)-katesin ini dan metabolit fenolik yang lain memerlukan

kajian lanjutan yang lebih mendalam dan fokus terhadap fungsi di dalam pemasakan

manggis.

Kumpulan terpenoid seperti timol-β-D-glukopiranosida (Rajah 4.11h), giberelin A3,

ginggolida C, katalposida, montanol dan salvinorin A (Rajah 4.14j) memainkan pelbagai

fungsi di dalam tumbuhan dan buah termasuklah sebagai komponen hormon fotosintesis,

pengawalaturan tumbuhan serta pertahanan terhadap bakteria dan patogen kulat (Croteau

et al. 2000; McGarvey & Croteau 1995). Mazlan et al. (2018b) melaporkan bahawa timol-

β-D-glukopiranosida mungkin terlibat secara signifikan dalam pertahanan manggis

terhadap serangan patogen kerana kumpulan berfungsi timol telah dilaporkan mempunyai

ciri-ciri anti-mikrob (Nabavi et al. 2015) dan anti-fungal (Yang et al. 2011). Timol-β-D-

glukopiranosida yang merupakan monoterpena ini mungkin memainkan peranan yang

sama di dalam manggis semasa peringkat awal pemasakan di mana kadar metabolit ini

adalah tinggi di dalam perikarpa manggis pada peringkat 2 (Rajah 4.11h). Metabolit ini

juga mungkin menyumbang kepada perkembangan rasa dan aroma manggis (Ikan et al.

1993).

Mod pengionan negatif ESI-MS yang digunakan bagi menjalankan analisis LC-MS

dalam kajian ini telah dilaporkan mampu meningkatkan fragmentasi metabolit xanton,

sekaligus memudahkan proses pengenalpastian dan penentuan struktur xanton (Wittenauer

et al. 2012). Namun, hanya tujuh xanton berjaya dikenalpasti daripada kajian ini (Lampiran

K) dan empat daripadanya (α-mangostin, astikolorin B, gartanin dan kratoksiarborenon C)

dikenalpasti sebagai metabolit berpengaruh tinggi dalam pemasakan manggis (Rajah

4.14k). Hal ini mungkin kerana jenis pelarut yang digunakan dalam kaedah pengekstrakan

111

metabolit memfokuskan kepada pengekstrakan keseluruhan metabolit secara global

merentasi pelbagai kumpulan metabolit terutamanya metabolit sekunder dan tidak spesifik

kepada hanya xanton.

α-Mangostin adalah salah satu xanton utama dalam manggis dan metabolit ini telah

dilaporkan mempunyai pelbagai bioaktiviti dalam tumbuhan iaitu anti-oksida (Fang et al.

2016; Thong et al. 2015), anti-tumor (Hafeez et al. 2014; Shibata et al. 2011), anti-bakteria

(Koh et al. 2013) dan anti-radang (Mohan et al. 2018). Pengenalpastian α-mangostin di

dalam kajian ini turut disokong oleh data analisis MS/MS serta metabolit piawai.

Berdasarkan Jadual 4.8 dan Lampiran O, puncak pradominan bagi α-mangostin

dikenalpasti pada m/z 351 adalah terhasil melalui kehilangan radikal C3H7 (-43 Da)

manakala fragmentasi pada m/z 339 pula terhasil daripada reaksi ion radikal daripada

kumpulan fenil yang menyebabkan kehilangan radikal C4H7 (-55 Da) (Wittenauer et al.

2012). Dalam kajian ini, α-mangostin dikenalpasti menunjukkan kandungan yang paling

tinggi di dalam tisu perikarpa pada peringkat 2 dan 4 namun pada peringkat 6, kadar

metabolit ini menurun sehingga menjadi lebih rendah berbanding isi dan biji manggis

(Rajah 4.14k). Sebaliknya kajian lepas oleh Wittenauer et al. (2012) menyatakan bahawa

kandungan α-mangostin adalah lebih tinggi di dalam perikarpa berbanding isi dan biji

manggis. Perbezaan ini mungkin disebabkan penggunaan peringkat manggis yang lebih

awal oleh Wittenauer et al. (2012). Selain itu, metabolit ini mungkin larut ke dalam tisu

manggis pada peringkat akhir pemasakan, menyebabkan pengumpulan pada tisu isi dan

sekaligus memberikan manfaat kepada kesihatan.

Sementara itu, fragmentasi ion bagi gartanin (m/z 395) pula dilaporkan berlaku pada

m/z 271, 283 dan 339 pada masa penahanan minit ke 15.47, iaitu sebelum α-mangostin

pada minit ke 15.83, sepadan dengan kajian yang dijalankan oleh Wittenauer et al. (2012)

dan Zarena dan Sankar (2009). Gartanin hanya dikenalpasti di dalam perikarpa sahaja

dengan kadar yang meningkat daripada peringkat 4 ke peringkat 6, sejajar dengan laporan

oleh Wittenauer et al. (2012). Peningkatan pada kadar kandungan α-mangostin, gartanin

dan xanton yang lain iaitu astikolorin B dan kratoksiarborenon C di dalam biji manggis

apabila menghampiri peringkat akhir pemasakan (Rajah 4.14k) mungkin berkait dengan

112

fungsi utama xanton sebagai anti-oksida dan anti-mikrob dalam mekanisme perlindungan

buah terhadap jangkitan patogen dan tekanan biotik (Gutierrez-Orozco & Failla 2013;

Thong et al. 2015; Wittenauer et al. 2012). Radikal bebas boleh terhasil sebagai produk

sampingan daripada proses metabolisme buah dan boleh meningkat apabila buah

mengalami tekanan persekitaran (Fernie et al. 2004; Van Dongen et al. 2011).

Selain itu, terdapat tiga xanton yang belum pernah dilaporkan di dalam manggis

telah dikenalpasti melalui kajian ini iaitu astikolorin B, kratoksiarborenon C dan 1,3,5-

trihidroksixanton. Pengenalpastian dua daripada tiga xanton ini turut disokong dengan data

daripada analisis LC-MS/MS seperti yang dinyatakan di dalam Jadual 4.8 bagi

kratoksiarborenon C dan Lampiran N bagi 1,3,5-trihidroksixanton. Berdasarkan kajian

lepas, kehadiran kratoksiarborenon C telah dilaporkan di dalam Cratoxylum sumatranum

iaitu sejenis tumbuhan berbunga daripada famili Hypericaceae (Seo et al. 2002). Metabolit

ini mempunyai aktiviti sitotoksik sederhana terhadap turunan sel epidermoid oral manusia

(Seo et al. 2002). Manakala, 1,3,5-trihidroksixanton pula dilaporkan hadir dalam Garcinia

smeathmannii (Komguem et al. 2005) dan Garcinia assigu (Ito et al. 1998). Metabolit ini

turut dilaporkan mempunyai aktiviti anti-malaria terhadap parasit Plasmodium falciparum

(Ignatushchenko et al. 2000) dan aktiviti anti-virus (Ito et al. 1998). Penentuan struktur

molekul keempat-empat xanton ini daripada manggis menggunakan analisis NMR

mungkin diperlukan sebagai kajian lanjutan pada masa akan datang untuk pengenalpastian

identiti sebatian ini dengan lebih tepat.

Terdapat sebanyak 102 metabolit yang tidak dapat dikenalpasti telah diperoleh

daripada analisis LC-MS (Lampiran L). Analisis LC-MS/MS turut dijalankan dengan

menyasarkan kepada pengenalpastian metabolit ini namun tiada pengenalpastian yang tepat

diperoleh (tiada padanan antara fragmentasi metabolit dengan pangkalan data yang dirujuk

atau fragmentasi didapati sepadan dengan lebih daripada satu metabolit). Oleh itu, kajian

lanjutan iaitu kajian metabolomik sasaran yang melibatkan pemencilan metabolit

menggunakan kaedah pengekstrakan yang lebih spesifik dan analisis metabolit

menggunakan NMR mungkin diperlukan untuk menentukan struktur dan identiti metabolit

113

ini. Selain itu, metabolit ini juga boleh dikaji dari segi bioaktivitinya yang mungkin

berpotensi dalam aplikasi nutraseutikal dan farmaseutikal pada masa hadapan.

114

BAB VI

KESIMPULAN DAN CADANGAN

6.1 KESIMPULAN

Kajian komprehensif terhadap perubahan metabolik semasa pemasakan buah manggis

telah dijalankan menggunakan platform analitikal GC-MS dan LC-MS. Awalnya,

beberapa kaedah pengekstrakan telah dikaji dan dioptimumkan untuk analisis

metabolomik ini. Kaedah pengekstrakan menggunakan campuran larutan

metanol/kloroform/air dengan nisbah 3:1:1 disertai teknik sonikasi (kaedah 5) dan

diikuti dengan derivatisasi sampel menggunakan BSTFA telah digunakan untuk

memprofil kandungan metabolit manggis menggunakan GC-MS. Ini adalah kerana

kaedah ini telah menghasilkan jumlah metabolit tertinggi berbanding kaedah yang lain.

Kaedah ini juga menunjukkan hasil pemisahan puncak yang jelas, tajam serta

merangkumi bilangan puncak yang lebih banyak berbanding kaedah lain. Manakala,

kaedah pengekstrakan menggunakan larutan metanol/asid formik dengan nisbah 599:1

(kaedah 1) pula digunakan bagi pemprofilan metabolit menggunakan analisis LC-MS

manakala mod pengionan sistem LC-MS pula ditetapkan kepada mod negatif. Hal ini

kerana kaedah dan protokol ini dilihat lebih berkesan dalam pengekstrakan metabolit

sekunder berbanding kaedah lain yang dibandingkan.

Daripada analisis yang dijalankan merangkumi sampel perikarpa, isi dan biji

manggis pada empat peringkat pemasakan yang berbeza (peringkat 0, 2, 4 dan 6),

analisis GC-MS berjaya memprofil sebanyak 57 metabolit manakala 98 metabolit pula

berjaya dikenalpasti melalui analisis LC-MS. Metabolit yang dikenalpasti merangkumi

pelbagai kelas metabolit termasuklah gula dan terbitan, asid amino dan terbitan, asid

organik, fenolik, terpenoid dan alkaloid dan xanton. Taburan metabolit antara peringkat

pemasakan dan jenis tisu manggis yang berbeza dapat dilihat dan dikaji menggunakan

115

analisis statistik multivariat termasuklah analisis PCA dan PLS-DA. Analisis

pembolehubah berkepentingan dalam unjuran (VIP) disertai dengan analisis statistik

univariat (analisis varians dua-hala) pula mendedahkan kehadiran 21 metabolit

berpengaruh tinggi (VIP ≥1.00 and p ≤0.05) daripada analisis GC-MS dan 55 metabolit

berpengaruh tinggi daripada analisis LC-MS yang terlibat dalam pelbagai tapak jalan

biosintesis. Antaranya adalah tapak jalan metabolisme galaktosa, metabolisme askorbat

dan aldarat, metabolisme glioksilat dan dikarboksilat, penyalingtukaran pentosa dan

glukuronat dan kitaran asid trikarboksilik (TCA). Metabolit yang berjaya dikenalpasti

dalam kajian ini telah dipetakan ke dalam tapak jalan metabolomik pemasakan manggis

yang menggabungkan beberapa tapak jalan berlainan.

Kajian ini adalah yang pertama mengkaji tentang pemasakan manggis melalui

pemprofilan metabolit perikarpa, isi dan biji manggis pada peringkat pemasakan yang

berbeza menggunakan gabungan platform GC-MS dan LC-MS. Tapak jalan pemasakan

manggis juga adalah yang pertama dilaporkan menggabungkan beberapa tapak jalan

yang berlainan seperti tapak jalan kanji dan sukrosa, glikolisis serta metabolisme

sisteina dan metionina. Pemetaan metabolit ke dalam tapak jalan pemasakan manggis

ini merupakan hasil yang berimpak besar diperoleh daripada kajian ini. Secara

keseluruhannya, pendekatan metabolomik khususnya menggunakan platform analitikal

GC-MS dan LC-MS disertai analisis data seperti analisis univariat dan multivariat

berupaya merungkai perubahan metabolit di dalam pelbagai tisu manggis pada

peringkat pemasakan yang berbeza. Teknik ini boleh digunakan untuk mengkaji

pengawalaturan, biosintesis serta fungsi metabolit yang membawa kepada pemahaman

yang lebih baik terhadap biokimia tumbuhan dalam konteks pemasakan buah. Platform

serta teknik bagi kajian metabolomik yang digunakan dalam kajian ini adalah bersifat

universal dan sesuai untuk diaplikasikan terhadap mana-mana sampel tumbuhan.

Pemahaman mengenai perubahan metabolit semasa proses pemasakan manggis yang

diperoleh melalui kajian ini diharapkan dapat menjadi asas kepada kajian akan datang

untuk merungkai dengan lebih mendalam terhadap manggis yang mempunyai pelbagai

potensi dan kelebihan dari segi kesihatan mahupun prospek ekonomi negara.

116

6.2 CADANGAN KAJIAN LANJUTAN

Antara cabaran atau limitasi yang dihadapi dalam kajian ini adalah proses

pengenalpastian metabolit bagi data yang diperoleh daripada analisis LC-MS yang

kompleks dan melibatkan masa kajian yang lama. Hal ini kerana analisis LC-MS tidak

mempunyai pangkalan data yang khusus dan kukuh seperti analisis GC-MS yang

mempunyai perpustakaan sebatian rujukan yang sangat teratur dan tepat seperti

National Institute of Standards and Technology (NIST). Oleh itu, pembangunan

pangkalan data yang khusus adalah sangat penting bagi melancarkan serta

mengurangkan masa yang diperlukan bagi proses pengenalpastian metabolit bagi

analisis LC-MS seterusnya menghasilkan dapatan kajian yang lebih tepat dan berkesan.

Kajian pada masa akan datang mungkin boleh difokuskan kepada pembangunan

pangkalan data dalaman (in-house) yang seterusnya boleh digunakan bagi analisis

metabolomik tumbuhan yang lain.

Selain itu, kajian yang lebih mendalam terhadap metabolit yang telah berjaya

dikenalpasti melalui kajian ini dipercayai dapat merungkai dengan lebih banyak dan

lebih terperinci mengenai fungsi metabolit ini sama ada terhadap pemasakan manggis

sendiri atau fungsi lain sebagai metabolit bioaktif. Sebagai contoh, kajian ini telah

melaporkan kehadiran lignan (neoisostegana) dalam manggis. Sesetengah lignan telah

dilaporkan mempunyai keupayaan untuk mempengaruhi perkembangan serangga

dengan mengubah pelbagai fungsi fisiologi serangga tersebut melalui aktiviti

antagonistik ekdisteroid (Harmatha & Dinan 2003). Kajian terhadap metabolit lignan

ini mungkin boleh diaplikasikan untuk menghasilkan racun serangga biologi pada masa

akan datang seterusnya membantu dalam sektor pertanian negara.

Pengenalpastian tiga metabolit xanton iaitu 1,3,5-trihidroksixanton, astikolorin

B dan kratoksiarborenon C yang belum pernah dilaporkan dalam manggis juga adalah

sangat menarik untuk dikaji dengan lebih mendalam. Xanton 1,3,5-trihidroksixanton

telah dilaporkan mempunyai aktiviti anti-malaria (Ignatushchenko et al. 2000) dan anti-

virus (Ito et al. 1998) manakala kratoksiarborenon C pula telah dilaporkan mempunyai

aktiviti sitotoksik (Seo et al. 2002). Metabolit ini perlu dipencilkan terlebih dahulu

menggunakan kaedah pengekstrakan yang spesifik sebelum dianalisis untuk

117

mendapatkan maklumat mengenai struktur kimia molekul. Penerokaan terhadap

bioaktiviti metabolit ini serta metabolit xanton yang lain akan meningkatkan lagi nilai

manggis sebagai salah satu sumber sebatian bioaktif yang berkepentingan tinggi dalam

industri farmaseutikal dan perubatan.

Selain itu, sebanyak 102 metabolit yang tidak dapat dikenalpasti telah diperoleh

daripada analisis LC-MS dan telah dilaporkan dalam Lampiran L. Kajian metabolomik

sasaran menggunakan kaedah pengekstrakan yang lebih spesifik untuk memencilkan

metabolit ini dan diikuti dengan analisis analitik menggunakan NMR mungkin

diperlukan untuk menentukan struktur molekul dan identiti metabolit ini. Seterusnya,

kajian bioaktiviti juga boleh dilakukan sekiranya terdapat molekul yang berpotensi

sebagai sebatian bioaktif daripada manggis.

118

RUJUKAN

Abdel-Farid, I. B., Kim, H. K., Choi, Y. H. & Verpoorte, R. 2007. Metabolic

characterization of Brassica rapa leaves by NMR spectroscopy. Journal of

Agricultural and Food Chemistry 55(19): 7936-7943.

Abdul-Rahman, A., Goh, H.-H., Loke, K.-K., Noor, N. M. & Aizat, W. M. 2017. RNA-

seq analysis of mangosteen (Garcinia mangostana L.) fruit ripening. Genomics

Data 12: 159-160.

Abeles, F. B., Morgan, P. W. & Saltveit Jr, M. E. 2012. Ethylene in Plant Biology. Ed.

ke-2. New York: Elsevier Science.

Abu Dardak, R., Ab. Halim, N., Kasa, J. & Mahmood, Z. 2011. Challenges and prospect

of mangosteen industry in Malaysia. Economic and Technology Management

Review 6: 19-31.

Adnyana, I. K., Abuzaid, A. S., Isk, E. Y. & Kurniati, N. F. 2016. Pancreatic lipase and

a-amylase inhibitory potential of mangosteen (Garcinia mangostana Linn.)

pericarp extract. International Journal of Medical Research & Health Sciences

5(1): 23-28.

Aizat, W. M., Able, J. A., Stangoulis, J. C. & Able, A. J. 2013. Characterisation of

ethylene pathway components in non-climacteric capsicum. BMC Plant Biology

13(1): 191.

Aizat, W. M., Dias, D. A., Stangoulis, J. C., Able, J. A., Roessner, U. & Able, A. J.

2014. Metabolomics of capsicum ripening reveals modification of the ethylene

related-pathway and carbon metabolism. Postharvest Biology and Technology

89: 19-31.

Aizat, W. M., Ismail, I. & Noor, N. M. 2018. Recent Development in Omics Studies.

Dlm. Aizat, W. M., Goh, H.-H. & Baharum, S. N. (pnyt.). Omics Applications

for Systems Biology. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1102.

hlm. 1-9. Bangi: Springer, Cham.

Aizat, W. M., Jamil, I. N., Ahmad-Hashim, F. H. & Noor, N. M. 2019. Recent updates

on metabolite composition and medicinal benefits of mangosteen plant. PeerJ

7: e6324.

Albertini, M.-V., Carcouet, E., Pailly, O., Gambotti, C., Luro, F. & Berti, L. 2006.

Changes in organic acids and sugars during early stages of development of

acidic and acidless citrus fruit. Journal of Agricultural and Food Chemistry

54(21): 8335-8339.

Anon. 2017. Liquid chromatography–mass spectrometry.

https://en.wikipedia.org/wiki/Liquid_chromatography%E2%80%93mass_spec

trometry [9 April 2019]

https://en.wikipedia.org/wiki/Liquid_chromatography%E2%80%93mass_spectrometry

https://en.wikipedia.org/wiki/Liquid_chromatography%E2%80%93mass_spectrometry

119

Apiratikorn, S., Sdoodee, S., Lerslerwong, L. & Rongsawat, S. 2012. The impact of

climatic variability on phenological change, yield and fruit quality of

mangosteen in Phatthalung province, Southern Thailand. Kasetsart Journal

(Natural Science) 46: 1-9.

Aretz, I. & Meierhofer, D. 2016. Advantages and pitfalls of mass spectrometry based

metabolome profiling in systems biology. International Journal of Molecular

Sciences 17(5): 632.

Ayman, E., Hassan, S. M. & Osman, H.-E. H. 2019. Mangosteen (Garcinia mangostana

L.). Dlm. Nabavi, S. M. N. & Silva, A. S. (pnyt.). Nonvitamin and Nonmineral

Nutritional Supplements, hlm. 313-319. Elsevier.

Azizan, K. A., Baharum, S. N., Ressom, H. W. & Noor, N. M. 2012. GC-MS analysis

and PLS-DA validation of the trimethyl silyl-derivatization techniques.

American Journal of Applied Sciences 9(7): 1124-1136.

Azizan, K. A., Ghani, N. H. A. & Nawawi, M. F. 2015. GC-MS based metabolomics

and multivariate statistical analysis of Wedelia trilobata extracts for the

identification of potential phytochemical properties. Plant Omics 8(6): 537-543.

Azizan, K. A., Ibrahim, S., Ghani, N. H. A. & Nawawi, M. F. 2016. LC-MS based

metabolomics analysis to identify potential allelochemicals in Wedelia

trilobata. Records of Natural Products 10(6): 788.

Baharum, S. N. & Azizan, K. A. 2018. Metabolomics in systems biology. Dlm. Aizat,

W. M., Goh, H.-H. & Baharum, S. N. (pnyt.). Omics Applications for Systems

Biology. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1102. hlm. 51-68.

Springer.

Baharum, S. N., Bunawan, H., Ghani, M. a. A., Mustapha, W. a. W. & Noor, N. M.

2010. Analysis of the chemical composition of the essential oil of Polygonum

minus Huds. using two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass

spectrometry (GC-TOF MS). Molecules 15(10): 7006-7015.

Baldi, P., Orsucci, S., Moser, M., Brilli, M., Giongo, L. & Si-Ammour, A. 2018. Gene

expression and metabolite accumulation during strawberry (Fragaria x

ananassa) fruit development and ripening. Planta 248(5): 1143-1157.

Behrends, V., Tredwell, G. D. & Bundy, J. G. 2011. A software complement to AMDIS

for processing GC-MS metabolomic data. Analytical Biochemistry 415(2): 206-

208.

Bingol, K. 2018. Recent advances in targeted and untargeted metabolomics by NMR

and MS/NMR methods. High-Throughput 7(2): 9.

Blankenship, S. M. & Dole, J. M. 2003. 1-Methylcyclopropene: a review. Postharvest

Biology and Technology 28(1): 1-25.

120

Broeckling, C. D., Reddy, I. R., Duran, A. L., Zhao, X. & Sumner, L. W. 2006. MET-

IDEA: data extraction tool for mass spectrometry-based metabolomics.

Analytical Chemistry 78(13): 4334-4341.

Brummell, D. A. 2006. Cell wall disassembly in ripening fruit. Functional Plant

Biology 33(2): 103-119.

Brunner, B. R. & Morales-Payan, J. P. 2010. Soils,plant growth and crop production-

Mangosteen and rambutan. Encyclopedia of Life Support Systems 1-10.

Bürstenbinder, K., Rzewuski, G., Wirtz, M., Hell, R. & Sauter, M. 2007. The role of

methionine recycling for ethylene synthesis in Arabidopsis. The Plant Journal

49(2): 238-249.

Cadahia, E., Fernandez De Simon, B., Aranda, I., Sanz, M., Sanchez‐Gomez, D. &

Pinto, E. 2015. Non-targeted metabolomic profile of Fagus sylvatica L. leaves

using liquid chromatography with mass spectrometry and gas chromatography

with mass spectrometry. Phytochemical Analysis 26(2): 171-182.

Cadahía, E., Fernández De Simón, B., Aranda, I., Sanz, M., Sánchez‐Gómez, D. &

Pinto, E. 2015. Non‐targeted metabolomic profile of Fagus sylvatica L. leaves

using liquid chromatography with mass spectrometry and gas chromatography

with mass spectrometry. Phytochemical Analysis 26(2): 171-182.

Caffall, K. H. & Mohnen, D. 2009. The structure, function, and biosynthesis of plant

cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research 344(14): 1879-1900.

Cambiaghi, A., Ferrario, M. & Masseroli, M. 2017. Analysis of metabolomic data:

tools, current strategies and future challenges for omics data integration.

Briefings in Bioinformatics 18(3): 498-510.

Capitani, D., Sobolev, A. P., Tomassini, A., Sciubba, F., De Salvador, F. R., Mannina,

L. & Delfini, M. 2012. Peach fruit: metabolic comparative analysis of two

varieties with different resistances to insect attacks by NMR spectroscopy.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 61(8): 1718-1726.

Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D. &

Rodrick, G. E. 2009. Metabolomic analysis in food science: a review. Trends in

Food Science & Technology 20(11-12): 557-566.

Chaijaroenkul, W., Mubaraki, M. A., Ward, S. A. & Na-Bangchang, K. 2014.

Metabolite footprinting of Plasmodium falciparum following exposure to

Garcinia mangostana Linn. crude extract. Experimental Parasitology 145(1):

80-86.

Chen, H.-H., Tseng, Y. J., Wang, S.-Y., Tsai, Y.-S., Chang, C.-S., Kuo, T.-C., Yao, W.-

J., Shieh, C.-C., Wu, C.-H. & Kuo, P.-H. 2015. The metabolome profiling and

pathway analysis in metabolic healthy and abnormal obesity. International

Journal of Obesity 39(8): 1241.

121

Chen, L.-G., Yang, L.-L. & Wang, C.-C. 2008. Anti-inflammatory activity of

mangostins from Garcinia mangostana. Food and Chemical Toxicology 46(2):

688-693.

Cheng, A. X., Lou, Y. G., Mao, Y. B., Lu, S., Wang, L. J. & Chen, X. Y. 2007. Plant

terpenoids: biosynthesis and ecological functions. Journal of Integrative Plant

Biology 49(2): 179-186.

Chin, Y.-W., Chai, H.-B., Keller, W. J. & Kinghorn, A. D. 2008. Lignans and other

constituents of the fruits of Euterpe oleracea (acai) with antioxidant and

cytoprotective activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(17):

7759-7764.

Crookes, P. R. & Grierson, D. 1983. Ultrastructure of tomato fruit ripening and the role

of polygalacturonase isoenzymes in cell wall degradation. Plant Physiology

72(4): 1088-1093.

Croteau, R., Kutchan, T. M. & Lewis, N. G. 2000. Natural products (secondary

metabolites). Dlm. Buchanan, B. B., Gruissem, W. & Jones, R. L. (pnyt.).

Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 24. hlm. 1250-1318. Rockville:

American Society of Plant Physiologists.

Dai, J. & Mumper, R. J. 2010. Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant

and anticancer properties. Molecules 15(10): 7313-7352.

Das, P. R. & Eun, J.-B. 2018. A comparative study of ultra-sonication and agitation

extraction techniques on bioactive metabolites of green tea extract. Food

Chemistry 253: 22-29.

De Vos, R. C., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J., Bino, R. J. & Hall, R. D. 2007.

Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography

coupled to mass spectrometry. Nature Protocols 2(4): 778-791.

Defilippi, B. G., Manríquez, D., Luengwilai, K. & González-Agüero, M. 2009. Aroma

volatiles: biosynthesis and mechanisms of modulation during fruit ripening.

Advances in Botanical Research 50: 1-37.

Deng, C., Yin, X., Zhang, L. & Zhang, X. 2005. Development of microwave‐assisted

derivatization followed by gas chromatography/mass spectrometry for fast

determination of amino acids in neonatal blood samples. Rapid

Communications in Mass Spectrometry 19(16): 2227-2234.

Denman, L. J. & Morris, G. A. 2015. An experimental design approach to the chemical

characterisation of pectin polysaccharides extracted from Cucumis melo

Inodorus. Carbohydrate Polymers 117: 364-369.

Devlieghere, F., Vermeulen, A. & Debevere, J. 2004. Chitosan: antimicrobial activity,

interactions with food components and applicability as a coating on fruit and

vegetables. Food Microbiology 21(6): 703-714.

122

Dixon, J. & Hewett, E. W. 2000. Factors affecting apple aroma/flavour volatile

concentration: a review. New Zealand Journal of Crop and Horticultural

Science 28(3): 155-173.

Dobson, G., Shepherd, T., Verrall, S. R., Conner, S., Mcnicol, J. W., Ramsay, G.,

Shepherd, L. V., Davies, H. V. & Stewart, D. 2008. Phytochemical diversity in

tubers of potato cultivars and landraces using a GC-MS metabolomics approach.


Drouin, N., Rudaz, S. & Schappler, J. 2018. Sample preparation for polar metabolites

in bioanalysis. Analyst 143(1): 16-20.

El-Seedi, H. R., El-Barbary, M., El-Ghorab, D., Bohlin, L., Borg-Karlson, A.-K.,

Goransson, U. & Verpoorte, R. 2010. Recent insights into the biosynthesis and

biological activities of natural xanthones. Current Medicinal Chemistry 17(9):

854-901.

El-Seedi, H. R., El-Ghorab, D. M., El-Barbary, M. A., Zayed, M. F., Goransson, U.,

Larsson, S. & Verpoorte, R. 2009. Naturally occurring xanthones; latest

investigations: isolation, structure elucidation and chemosystematic

significance. Current Medicinal Chemistry 16(20): 2581-2626.

Failla, M. L. & Gutiérrez-Orozco, F. 2017. Mangosteen xanthones: Bioavailability and

bioactivities. Fruit and Vegetable Phytochemicals: Chemistry and Human

Health 1(2): 165-182.

Fairchild, D. 1915. The mangosteen “Queen of Fruits” now almost confined to Malayan

archipelago, but can be acclimated in many parts of tropics-experiments in

America-desirability of widespread cultivation. Journal of Heredity 6(8): 339-

347.

Fait, A., Hanhineva, K., Beleggia, R., Dai, N., Rogachev, I., Nikiforova, V. J., Fernie,

A. R. & Aharoni, A. 2008. Reconfiguration of the achene and receptacle

metabolic networks during strawberry fruit development. Plant Physiology

148(2): 730-750.

Fang, Y., Su, T., Qiu, X., Mao, P., Xu, Y., Hu, Z., Zhang, Y., Zheng, X., Xie, P. & Liu,

Q. 2016. Protective effect of alpha-mangostin against oxidative stress induced-

retinal cell death. Scientific Reports 6: 21018.

Fernie, A. R., Carrari, F. & Sweetlove, L. J. 2004. Respiratory metabolism: glycolysis,

the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Current Opinion in Plant

Biology 7(3): 254-261.

Fiehn, O. 2002. Metabolomics-The link between genotypes and phenotypes. Plant

Molecular Biology 48(1-2): 155-171.

123

Fiehn, O. 2008. Extending the breadth of metabolite profiling by gas chromatography

coupled to mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry 27(3): 261-

269.

Fiehn, O. 2016. Metabolomics by gas chromatography–mass spectrometry: combined

targeted and untargeted profiling. Current Protocols in Molecular Biology

114(1): 1-32.

Fu, C., Loo, A. E. K., Chia, F. P. P. & Huang, D. 2007. Oligomeric proanthocyanidins

from mangosteen pericarps. Journal of Agricultural and Food Chemistry

55(19): 7689-7694.

Garg, N., Kapono, C. A., Lim, Y. W., Koyama, N., Vermeij, M. J., Conrad, D., Rohwer,

F. & Dorrestein, P. C. 2015. Mass spectral similarity for untargeted

metabolomics data analysis of complex mixtures. International Journal Of

Mass Spectrometry 377: 719-727.

Gellekink, H., Van Oppenraaij-Emmerzaal, D., Van Rooij, A., Struys, E. A., Den

Heijer, M. & Blom, H. J. 2005. Stable-isotope dilution liquid chromatography–

electrospray injection tandem mass spectrometry method for fast, selective

measurement of S-adenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine in plasma.

Clinical Chemistry 51(8): 1487-1492.

Giovannoni, J. 2001. Molecular biology of fruit maturation and ripening. Annual

Review of Plant Biology 52(1): 725-749.

Giovannoni, J., Nguyen, C., Ampofo, B., Zhong, S. & Fei, Z. 2017. The epigenome and

transcriptional dynamics of fruit ripening. Annual Review of Plant Biology 68:

61-84.

Gondokesumo, M. E., Pardjianto, B., Sumitro, S. B. & Widowati, W. 2019. Xanthones

analysis and antioxidant activity analysis (applying ESR) of six different

maturity levels of mangosteen rind extract (Garcinia mangostana Linn.).

Pharmacognosy Journal 11(2): 369-373.

Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G. & Kell, D. B. 2004.

Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data.

Trends in Biotechnology 22(5): 245-252.

Grassmann, J. 2005. Terpenoids as plant antioxidants. Vitamins & Hormones 72: 505-

535.

Griffiths, W. J., Koal, T., Wang, Y., Kohl, M., Enot, D. P. & Deigner, H. P. 2010.

Targeted metabolomics for biomarker discovery. Angewandte Chemie

International Edition 49(32): 5426-5445.

Gullberg, J., Jonsson, P., Nordstrom, A., Sjostrom, M. & Moritz, T. 2004. Design of

experiments: an efficient strategy to identify factors influencing extraction and

124

derivatization of Arabidopsis thaliana samples in metabolomic studies with gas

chromatography/mass spectrometry. Analytical Biochemistry 331(2): 283-295.

Gutierrez-Orozco, F. & Failla, M. L. 2013. Biological activities and bioavailability of

mangosteen xanthones: a critical review of the current evidence. Nutrients 5(8):

3163-3183.

Hafeez, B. B., Mustafa, A., Fischer, J. W., Singh, A., Zhong, W., Shekhani, M. O.,

Meske, L., Havighurst, T., Kim, K. & Verma, A. K. 2014. α-Mangostin: a

dietary antioxidant derived from the pericarp of Garcinia mangostana L.

inhibits pancreatic tumor growth in xenograft mouse model. Antioxidants &

Redox Signaling 21(5): 682-699.

Halket, J. M., Waterman, D., Przyborowska, A. M., Patel, R. K., Fraser, P. D. &

Bramley, P. M. 2005. Chemical derivatization and mass spectral libraries in

metabolic profiling by GC/MS and LC/MS/MS. Journal of Experimental

Botany 56(410): 219-243.

Hallett, I. C., Macrae, E. A. & Wegrzyn, T. F. 1992. Changes in kiwifruit cell wall

ultrastructure and cell packing during postharvest ripening. International

Journal of Plant Sciences 153(1): 49-60.

Hamid, M. A., Sarmidi, M. R. & Park, C. S. 2012. Mangosteen leaf extract increases

melanogenesis in B16F1 melanoma cells by stimulating tyrosinase activity in

vitro and by up-regulating tyrosinase gene expression. International Journal Of

Molecular Medicine 29(2): 209-217.

Hapsari, D. P., Poerwanto, R., Sopandie, D. & Santosa, E. 2018. Partial root-zone

irrigation effects on growth, metabolism and calcium status of Mangosteen

seedling (Garcinia mangostana L.). Advances in Horticultural Science 32(1):

49-59.

Harbourne, N., Marete, E., Jacquier, J. C. & O'riordan, D. 2009. Effect of drying

methods on the phenolic constituents of meadowsweet (Filipendula ulmaria)

and willow (Salix alba). LWT-Food Science and Technology 42(9): 1468-1473.

Harker, F. & Sutherland, P. 1993. Physiological changes associated with fruit ripening

and the development of mealy texture during storage of nectarines. Postharvest

Biology and Technology 2(4): 269-277.

Harmatha, J. & Dinan, L. 2003. Biological activities of lignans and stilbenoids

associated with plant-insect chemical interactions. Phytochemistry Reviews

2(3): 321-330.

Harrison, L. J. & Nilar. 2002. Xanthones from the heartwood of Garcinia mangostana.

Phytochemistry 60(5): 541-548.

125

Hesse, H., Kreft, O., Maimann, S., Zeh, M. & Hoefgen, R. 2004. Current understanding

of the regulation of methionine biosynthesis in plants. Journal of Experimental

Botany 55(404): 1799-1808.

Horai, H., Arita, M., Kanaya, S., Nihei, Y., Ikeda, T., Suwa, K., Ojima, Y., Tanaka, K.,

Tanaka, S. & Aoshima, K. 2010. MassBank: a public repository for sharing

mass spectral data for life sciences. Journal of Mass Spectrometry 45(7): 703-

714.

Huhman, D. V. & Sumner, L. W. 2002. Metabolic profiling of saponins in Medicago

sativa and Medicago truncatula using HPLC coupled to an electrospray ion-trap

mass spectrometer. Phytochemistry 59(3): 347-360.

Hurtado-Fernández, E., Pacchiarotta, T., Mayboroda, O., Fernández-Gutiérrez, A. &

Carrasco-Pancorbo, A. 2015. Metabolomic analysis of avocado fruits by GC-

APCI-TOF MS: effects of ripening degrees and fruit varieties. Analytical and

Bioanalytical Chemistry 407(2): 547-555.

Hussain, S. Z. & Maqbool, K. 2014. GC-MS: Principle, technique and its application in

food science. International Journal of Current Science 13: 116-126.

Ibrahim, M. Y., Hashim, N. M., Mariod, A. A., Mohan, S., Abdulla, M. A.,

Abdelwahab, S. I. & Arbab, I. A. 2016. α-Mangostin from Garcinia mangostana

Linn.: an updated review of its pharmacological properties. Arabian Journal of

Chemistry 9(3): 317-329.

Ignatushchenko, M. V., Winter, R. W. & Riscoe, M. 2000. Xanthones as antimalarial

agents: stage specificity. The American Journal of Tropical Medicine and

Hygiene 62(1): 77-81.

Ikan, R., Weinstein, V., Milner, Y., Bravdo, B., Shoseyov, O., Segal, D., Altman, A. &

Chet, I. 1993. Natural glycosides as potential odorants and flavorants.

International Symposium on Medicinal and Aromatic Plants hlm. 17-28.

Ito, C., Itoigawa, M., Furukawa, H., Rao, K. S., Enjo, F., Bu, P., Takayasu, J., Tokuda,

H. & Nishino, H. 1998. Xanthones as inhibitors of Epstein–Barr virus

activation1. Cancer Letters 132(1-2): 113-117.

Jabatan Pertanian Negeri Pulau Pinang. 2018. Keterangan am.

http://jpn.penang.gov.my/index.php/teknologi-tanaman-2/buah-buahan/67-

manggis-sp-17566 [15 Mei 2019]

Jarvis, M., Briggs, S. & Knox, J. 2003. Intercellular adhesion and cell separation in

plants. Plant, Cell & Environment 26(7): 977-989.

Ji, X., Avula, B. & Khan, I. A. 2007. Quantitative and qualitative determination of six

xanthones in Garcinia mangostana L. by LC–PDA and LC–ESI-MS. Journal

of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43(4): 1270-1276.

http://jpn.penang.gov.my/index.php/teknologi-tanaman-2/buah-buahan/67-manggis-sp-17566

http://jpn.penang.gov.my/index.php/teknologi-tanaman-2/buah-buahan/67-manggis-sp-17566

126

Jia, H.-F., Chai, Y.-M., Li, C.-L., Lu, D., Luo, J.-J., Qin, L. & Shen, Y.-Y. 2011.

Abscisic acid plays an important role in the regulation of strawberry fruit

ripening. Plant Physiology 157(1): 188-199.

Jianglian, D. & Shaoying, Z. 2013. Application of chitosan based coating in fruit and

vegetable preservation: a review. Journal of Food Processing & Technology

4(5): 227.

Johnson, C. H., Ivanisevic, J. & Siuzdak, G. 2016. Metabolomics: beyond biomarkers

and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell biology 17(7): 451.

Jolliffe, I. 2011. Principal component analysis. Dlm. Lovric, M. (pnyt.). International

Encyclopedia Of Statistical Science, hlm. 1094-1096. Berlin: Springer.

Kabera, J. N., Semana, E., Mussa, A. R. & He, X. 2014. Plant secondary metabolites:

biosynthesis, classification, function and pharmacological properties. Journal of

Pharmacy and Pharmacology 2: 377-392.

Kampa, M., Alexaki, V.-I., Notas, G., Nifli, A.-P., Nistikaki, A., Hatzoglou, A.,

Bakogeorgou, E., Kouimtzoglou, E., Blekas, G. & Boskou, D. 2004.

Antiproliferative and apoptotic effects of selective phenolic acids on T47D

human breast cancer cells: potential mechanisms of action. Breast Cancer

Research 6(2): R63.

Kanehisa, M. & Goto, S. 2000. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes.

Nucleic Acids Research 28(1): 27-30.

Kang, J.-S. 2012. Principles and applications of LC-MS/MS for the quantitative

bioanalysis of analytes in various biological samples. Tandem Mass

Spectrometry–Applications and Principles 441-492.

Kaufmann, B. & Christen, P. 2002. Recent extraction techniques for natural products:

microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.

Phytochemical Analysis 13(2): 105-113.

Kim, H.-S., Park, S. J., Hyun, S.-H., Yang, S.-O., Lee, J., Auh, J.-H., Kim, J.-H., Cho,

S.-M., Marriott, P. J. & Choi, H.-K. 2011. Biochemical monitoring of black

raspberry (Rubus coreanus Miquel) fruits according to maturation stage by 1H

NMR using multiple solvent systems. Food Research International 44(7): 1977-

1987.

Kim, H. K. & Verpoorte, R. 2010. Sample preparation for plant metabolomics.


Kind, T., Tolstikov, V., Fiehn, O. & Weiss, R. H. 2007. A comprehensive urinary

metabolomic approach for identifying kidney cancer. Analytical Biochemistry

363(2): 185-195.

127

Kitano, H. 2002. Systems biology: a brief overview. Science 295(5560): 1662-1664.

Klaser Cheng, D. M. 2017. Ethnobotany: A Phytochemical Perspective. Wiley-

Blackwell.

Klipp, E., Liebermeister, W., Wierling, C., Kowald, A. & Herwig, R. 2016. Systems

Biology: A Textbook. Berlin: John Wiley & Sons.

Knapp, D. R. 1979. Handbook of analytical derivatization reactions. New York: John

Wiley & Sons.

Koh, J.-J., Qiu, S., Zou, H., Lakshminarayanan, R., Li, J., Zhou, X., Tang, C.,

Saraswathi, P., Verma, C. & Tan, D. T. 2013. Rapid bactericidal action of alpha-

mangostin against MRSA as an outcome of membrane targeting. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1828(2): 834-844.

Komguem, J., Meli, A., Manfouo, R., Lontsi, D., Ngounou, F., Kuete, V., Kamdem, H.

W., Tane, P., Ngadjui, B. T. & Sondengam, B. L. 2005. Xanthones from

Garcinia smeathmannii (oliver) and their antimicrobial activity. Phytochemistry

66(14): 1713-1717.

Kondo, S., Ponrod, W., Kanlayanarat, S. & Hirai, N. 2002. Abscisic acid metabolism

during fruit development and maturation of mangosteens. Journal of the

American Society for Horticultural Science 127(5): 737-741.

Kou, X. & Wu, M. 2018. Characterization of climacteric and non-climacteric fruit

ripening. Dlm. Guo, Y. (pnyt.). Plant Senescence. Methods in Molecular

Biology, 1744. hlm. 89-102. New York: Humana Press.

Krug, D., Zurek, G., Schneider, B., Garcia, R. & Müller, R. 2008. Efficient mining of

myxobacterial metabolite profiles enabled by liquid chromatography–

electrospray ionisation-time-of-flight mass spectrometry and compound-based

principal component analysis. Analytica Chimica Acta 624(1): 97-106.

Kühnel, E., Laffan, D. D., Lloyd‐Jones, G. C., Martínez Del Campo, T., Shepperson, I.

R. & Slaughter, J. L. 2007. Mechanism of methyl esterification of carboxylic

acids by trimethylsilyldiazomethane. Angewandte Chemie International Edition

46(37): 7075-7078.

Kusano, R., Ogawa, S., Matsuo, Y., Tanaka, T., Yazaki, Y. & Kouno, I. 2010. α-

Amylase and lipase inhibitory activity and structural characterization of acacia

bark proanthocyanidins. Journal of Natural Products 74(2): 119-128.

Kushnir, M. M. & Komaromy-Hiller, G. 2000. Optimization and performance of a rapid

gas chromatography–mass spectrometry analysis for methylmalonic acid

determination in serum and plasma. Journal of Chromatography B: Biomedical

Sciences and Applications 741(2): 231-241.

Lan, L. 1989. The embryology of Garcinia mangostana L. (Clusiaceae). Gard Bull

Singap 37: 97-103.

128

Lancaster, J. & Dougall, D. K. 1992. Regulation of skin color in apples. Critical

Reviews in Plant Sciences 10(6): 487-502.

Lattanzio, V., Kroon, P. A., Quideau, S. & Treutter, D. 2008. Plant phenolics-secondary

metabolites with diverse functions. Dlm. Daayf, F. & Lattanzio, V. (pnyt.).

Recent Advances in Polyphenol Research, 1. hlm. 1-35. United Kingdom: John

Wiley & Sons.

Lee, D.-K., Yoon, M. H., Kang, Y. P., Yu, J., Park, J. H., Lee, J. & Kwon, S. W. 2013.

Comparison of primary and secondary metabolites for suitability to discriminate

the origins of Schisandra chinensis by GC/MS and LC/MS. Food Chemistry

141(4): 3931-3937.

Lee, S., Choi, H.-K., Cho, S. K. & Kim, Y.-S. 2010. Metabolic analysis of guava

(Psidium guajava L.) fruits at different ripening stages using different data-

processing approaches. Journal of Chromatography B 878(29): 2983-2988.

Lei, Z., Li, H., Chang, J., Zhao, P. X. & Sumner, L. W. 2012. MET-IDEA version 2.06;

improved efficiency and additional functions for mass spectrometry-based

metabolomics data processing. Metabolomics 8(1): 105-110.

Lembaga Pemasaran Pertanian Persekutuan. 2017. Statistik utama pemasaran FAMA

2017.

Lerslerwong, L., Rugkong, A., Imsabai, W. & Ketsa, S. 2013. The harvest period of

mangosteen fruit can be extended by chemical control of ripening-a proof of

concept study. Scientia Horticulturae 157: 13-18.

Leuschner, C., Herrmann, K. M. & Schultz, G. 1995. The metabolism of quinate in pea

roots (purification and partial characterization of a quinate hydrolyase). Plant

Physiology 108(1): 319-325.

Li, L., Guo, M., Wang, X., Zhang, X. & Liu, T. 2017. Effects and mechanism of 1‐

methylcyclopropene and ethephon on softening in Ailsa Craig tomato fruit.

Journal of Food Processing and Preservation 41(3): e12883.

Li, X., Xu, Z., Lu, X., Yang, X., Yin, P., Kong, H., Yu, Y. & Xu, G. 2009.

Comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass

spectrometry for metabonomics: biomarker discovery for diabetes mellitus.

Analytica Chimica Acta 633(2): 257-262.

Lieberman, M. 1979. Biosynthesis and action of ethylene. Annual Review of Plant

Physiology 30(1): 533-591.

Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L. & Fernie, A. R. 2006. Gas

chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature

Protocols 1(1): 387.

129

Little, J. L. 1999. Artifacts in trimethylsilyl derivatization reactions and ways to avoid

them. Journal of Chromatography A 844(1-2): 1-22.

Liu, Q.-Y., Wang, Y.-T. & Lin, L.-G. 2015. New insights into the anti-obesity activity

of xanthones from Garcinia mangostana. Food & Function 6(2): 383-393.

Lohani, S., Trivedi, P. K. & Nath, P. 2004. Changes in activities of cell wall hydrolases

during ethylene-induced ripening in banana: effect of 1-MCP, ABA and IAA.

Postharvest Biology and Technology 31(2): 119-126.

Lombardo, V. A., Osorio, S., Borsani, J., Lauxmann, M. A., Bustamante, C. A., Budde,

C. O., Andreo, C. S., Lara, M. V., Fernie, A. R. & Drincovich, M. F. 2011.

Metabolic profiling during peach fruit development and ripening reveals the

metabolic networks which underpin each developmental stage. Plant

Physiology 157: 1696-1710.

Mahmood, T., Anwar, F., Abbas, M., Boyce, M. C. & Saari, N. 2012. Compositional

variation in sugars and organic acids at different maturity stages in selected

small fruits from Pakistan. International Journal of Molecular Sciences 13(2):

1380-1392.

Marco-Ramell, A., Palau-Rodriguez, M., Alay, A., Tulipani, S., Urpi-Sarda, M.,

Sanchez-Pla, A. & Andres-Lacueva, C. 2018. Evaluation and comparison of

bioinformatic tools for the enrichment analysis of metabolomics data. BMC

Bioinformatics 19(1): 1.

Matheus, N., Hansen, S., Rozet, E., Peixoto, P., Maquoi, E., Lambert, V., Noel, A.,

Frederich, M., Mottet, D. & Tullio, P. 2014. An easy, convenient cell and tissue

extraction protocol for nuclear magnetic resonance metabolomics.


Matsumoto, K., Akao, Y., Kobayashi, E., Ohguchi, K., Ito, T., Tanaka, T., Iinuma, M.

& Nozawa, Y. 2003. Induction of apoptosis by xanthones from mangosteen in

human leukemia cell lines. Journal of Natural Products 66(8): 1124-1127.

Mazlan, O., Aizat, W. M., Baharum, S. N., Azizan, K. A. & Noor, N. M. 2018a. Mass

spectrometry dataset for LC-MS metabolomics analysis of Garcinia

mangostana L. seed development. Data in Brief 21: 548-551.

Mazlan, O., Aizat, W. M., Baharum, S. N., Azizan, K. A. & Noor, N. M. 2018b.

Metabolomics analysis of developing Garcinia mangostana seed reveals

modulated levels of sugars, organic acids and phenylpropanoid compounds.

Scientia Horticulturae 233: 323-330.

Mazlan, O., Aizat, W. M., Zuddin, N. S. A., Baharum, S. N. & Noor, N. M. 2019.

Metabolite profiling of mangosteen seed germination highlights metabolic

changes related to carbon utilization and seed protection. Scientia Horticulturae

243: 226-234.

130

Mcgarvey, D. J. & Croteau, R. 1995. Terpenoid metabolism. The Plant Cell 7(7): 1015.

Metz, T. O., Baker, E. S., Schymanski, E. L., Renslow, R. S., Thomas, D. G., Causon,

T. J., Webb, I. K., Hann, S., Smith, R. D. & Teeguarden, J. G. 2017. Integrating

ion mobility spectrometry into mass spectrometry-based exposome

measurements: what can it add and how far can it go? Bioanalysis 9(1): 81-98.

Miean, K. H. & Mohamed, S. 2001. Flavonoid (myricetin, quercetin, kaempferol,

luteolin, and apigenin) content of edible tropical plants. Journal of Agricultural

and Food Chemistry 49(6): 3106-3112.

Moco, S., Bino, R. J., Vorst, O., Verhoeven, H. A., De Groot, J., Van Beek, T. A.,

Vervoort, J. & De Vos, C. R. 2006. A liquid chromatography-mass

spectrometry-based metabolome database for tomato. Plant Physiology 141(4):

1205-1218.

Mohamed, G. A., Ibrahim, S. R., Shaaban, M. I. & Ross, S. A. 2014.

Mangostanaxanthones I and II, new xanthones from the pericarp of Garcinia

mangostana. Fitoterapia 98: 215-221.

Mohan, S., Abdelwahab, S. I. & Thangavel, N. 2018. Anti-inflammatory molecular

mechanism of action of α-mangostin, the major xanthone from the pericarp of

Garcinia mangostana; an in silico, in vitro and in vivo approach. Food &

Function 9: 3860-3871.

Mohnen, D. 2008. Pectin structure and biosynthesis. Current Opinion in Plant Biology

11(3): 266-277.

Moing, A., Aharoni, A., Biais, B., Rogachev, I., Meir, S., Brodsky, L., Allwood, J. W.,

Erban, A., Dunn, W. B. & Kay, L. 2011. Extensive metabolic cross‐talk in

melon fruit revealed by spatial and developmental combinatorial metabolomics.

New Phytologist 190(3): 683-696.

Msaada, K., Hosni, K., Taarit, M. B., Chahed, T., Kchouk, M. E. & Marzouk, B. 2007.

Changes on essential oil composition of coriander (Coriandrum sativum L.)

fruits during three stages of maturity. Food Chemistry 102(4): 1131-1134.

Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R. & Wilson, E. G. 2014. Extraction for

metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis 25(4): 291-

306.

Mworia, E. G., Yoshikawa, T., Salikon, N., Oda, C., Asiche, W. O., Yokotani, N., Abe,

D., Ushijima, K., Nakano, R. & Kubo, Y. 2012. Low-temperature-modulated

fruit ripening is independent of ethylene in ‘Sanuki Gold’ kiwifruit. Journal of

Experimental Botany 63(2): 963-971.

Nabavi, S. M., Marchese, A., Izadi, M., Curti, V., Daglia, M. & Nabavi, S. F. 2015.

Plants belonging to the genus Thymus as antibacterial agents: From farm to

pharmacy. Food Chemistry 173: 339-347.

131

Naczk, M. & Shahidi, F. 2006. Phenolics in cereals, fruits and vegetables: Occurrence,

extraction and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

41(5): 1523-1542.

Nakatani, K., Atsumi, M., Arakawa, T., Oosawa, K., Shimura, S., Nakahata, N. &

Ohizumi, Y. 2002. Inhibitions of histamine release and prostaglandin E2

synthesis by mangosteen, a Thai medicinal plant. Biological and

Pharmaceutical Bulletin 25(9): 1137-1141.

Negi, J., Bisht, V., Singh, P., Rawat, M. & Joshi, G. 2013. Naturally occurring

xanthones: chemistry and biology. Journal of Applied Chemistry 2013: 1-9.

Nguyen, L.-H. D., Venkatraman, G., Sim, K.-Y. & Harrison, L. J. 2005. Xanthones and

benzophenones from Garcinia griffithii and Garcinia mangostana.


Nicolas, P., Lecourieux, D., Kappel, C., Cluzet, S., Cramer, G., Delrot, S. &

Lecourieux, F. 2014. The basic leucine zipper transcription factor ABSCISIC

ACID RESPONSE ELEMENT-BINDING FACTOR2 is an important

transcriptional regulator of abscisic acid-dependent grape berry ripening

processes. Plant Physiology 164(1): 365-383.

Niessen, W. 1999. State-of-the-art in liquid chromatography–mass spectrometry.

Journal of Chromatography A 856(1-2): 179-197.

Nkang, A. 2002. Carbohydrate composition during seed development and germination

in two sub-tropical rainforest tree species (Erythrina caffra and Guilfoylia

monostylis). Journal of Plant Physiology 159(5): 473-483.

Noor, A., Fatima, I., Ahmad, I., Malik, A., Afza, N., Iqbal, L., Latif, M. & Khan, S. B.

2007. Leufolins A and B, potent butyrylcholinesterase-inhibiting flavonoid

glucosides from Leucas urticifolia. Molecules 12(7): 1447-1454.

Okazaki, K., Kimura, Y., Sugiyama, K., Kami, D., Nakamura, T. & Oka, N. 2016.

Discovering metabolic indices for early detection of squash (Cucurbita maxima)

storage quality using GC–MS-based metabolite profiling. Food Chemistry 196:

1150-1155.

Oms-Oliu, G., Hertog, M., Van De Poel, B., Ampofo-Asiama, J., Geeraerd, A. &

Nicolai, B. 2011. Metabolic characterization of tomato fruit during preharvest

development, ripening, and postharvest shelf-life. Postharvest Biology and

Technology 62(1): 7-16.

Orata, F. 2012. Derivatization reactions and reagents for gas chromatography analysis.

Masinde Muliro University of Science and Technology, Kenya: INTECH Open

Access Publisher Rijeka.

132

Osman, M. & Milan, A. R. 2006. Fruits for the future 9: Mangosteen-Garcinia

mangostana. Southampton Centre for Underutilised Crops, University of

Southampton, Southampton: Crops for the Future.

Osorio, S., Alba, R., Nikoloski, Z., Kochevenko, A., Fernie, A. R. & Giovannoni, J. J.

2012. Integrative comparative analyses of transcript and metabolite profiles

from pepper and tomato ripening and development stages uncovers species-

specific patterns of network regulatory behaviour. Plant Physiology 159: 1713-

1729.

Osorio, S. & Fernie, A. R. 2014. Fruit ripening: primary metabolism. Dlm. Nath, P.,

Bouzayen, M., Mattoo, A. & Pech, J. (pnyt.). Fruit Ripening: Physiology,

Signalling and Genomics, hlm. 15-27. Wallingford: CAB International.

Osorio, S., Scossa, F. & Fernie, A. 2013. Molecular regulation of fruit ripening.

Frontiers in Plant Science 4: 1-7.

Palapol, Y., Ketsa, S., Lin-Wang, K., Ferguson, I. B. & Allan, A. C. 2009a. A MYB

transcription factor regulates anthocyanin biosynthesis in mangosteen (Garcinia

mangostana L.) fruit during ripening. Planta 229(6): 1323-1334.

Palapol, Y., Ketsa, S., Stevenson, D., Cooney, J., Allan, A. & Ferguson, I. 2009b.

Colour development and quality of mangosteen (Garcinia mangostana L.) fruit

during ripening and after harvest. Postharvest Biology and Technology 51(3):

349-353.

Pan, Z., Li, Y., Deng, X. & Xiao, S. 2014. Non-targeted metabolomic analysis of orange

(Citrus sinensis [L.] Osbeck) wild type and bud mutant fruits by direct analysis

in real-time and HPLC-electrospray mass spectrometry. Metabolomics 10(3):

508-523.

Panche, A. N., Diwan, A. D. & Chandra, S. R. 2016. Flavonoids: an overview. Journal

of Nutritional Science 5(47): 1-15.

Parijadi, A. A., Putri, S. P., Ridwani, S., Dwivany, F. M. & Fukusaki, E. 2017.

Metabolic profiling of Garcinia mangostana (mangosteen) based on ripening

stages. Journal of Bioscience and Bioengineering 125(2): 238-244.

Parveen, M. & Khan, N. U.-D. 1988. Two xanthones from Garcinia mangostana.


Patti, G. J., Yanes, O. & Siuzdak, G. 2012. Innovation: Metabolomics: the apogee of

the omics trilogy. Nature Reviews Molecular Cell Biology 13(4): 263.

Paul, M. J. & Pellny, T. K. 2003. Carbon metabolite feedback regulation of leaf

photosynthesis and development. Journal of Experimental Botany 54(382): 539-

547.

133

Paul, V., Pandey, R. & Srivastava, G. C. 2012. The fading distinctions between classical

patterns of ripening in climacteric and non-climacteric fruit and the ubiquity of

ethylene-an overview. Journal of Food Science and Technology 49(1): 1-21.

Pedraza-Chaverri, J., Cárdenas-Rodríguez, N., Orozco-Ibarra, M. & Pérez-Rojas, J. M.

2008. Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana). Food and

Chemical Toxicology 46(10): 3227-3239.

Pedreschi, R., Muñoz, P., Robledo, P., Becerra, C., Defilippi, B. G., Van Eekelen, H.,

Mumm, R., Westra, E. & De Vos, R. C. 2014. Metabolomics analysis of

postharvest ripening heterogeneity of ‘Hass’ avocadoes. Postharvest Biology

and Technology 92: 172-179.

Pitt, J. J. 2009. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry

in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews 30(1): 19.

Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A. & Orešič, M. 2010. MZmine 2: modular

framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based

molecular profile data. BMC Bioinformatics 11(1): 395.

Poerwanto, R., Efendi, D. & Suhartanto, R. 2006. Improving productivity and quality

of Indonesian mangosteen. ISHS Acta Horticulturae 769: XXVII International

Horticultural Congress - IHC2006: International Symposium on Asian Plants

with Unique Horticultural Potential, hlm. 285-288.

Pothitirat, W., Chomnawang, M. T., Supabphol, R. & Gritsanapan, W. 2009.

Comparison of bioactive compounds content, free radical scavenging and anti-

acne inducing bacteria activities of extracts from the mangosteen fruit rind at

two stages of maturity. Fitoterapia 80(7): 442-447.

Prasanna, V., Prabha, T. & Tharanathan, R. 2007. Fruit ripening phenomena-an

overview. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 47(1): 1-19.

Prior, R. L. & Gu, L. 2005. Occurrence and biological significance of

proanthocyanidins in the American diet. Phytochemistry 66(18): 2264-2280.

Qin, Y., Sun, Y., Li, J., Xie, R., Deng, Z., Chen, H. & Li, H. 2017. Characterization and

antioxidant activities of procyanidins from lotus seedpod, mangosteen pericarp,

and camellia flower. International Journal of Food Properties 20(7): 1621-

1632.

Rangarajan, R. & Ghosh, P. 2011. Role of water contamination within the GC column

of a GasBench II peripheral on the reproducibility of 18O/16O ratios in water

samples. Isotopes in Environmental and Health Studies 47(4): 498-511.

Ravanel, S., Gakière, B., Job, D. & Douce, R. 1998. The specific features of methionine

biosynthesis and metabolism in plants. Proceedings of the National Academy of

Sciences 95(13): 7805-7812.

134

Ren, S., Hinzman, A. A., Kang, E. L., Szczesniak, R. D. & Lu, L. J. 2015.

Computational and statistical analysis of metabolomics data. Metabolomics

11(6): 1492-1513.

Rhodes, M. J. & Price, K. R. 1996. Analytical problems in the study of flavonoid

compounds in onions. Food Chemistry 57(1): 113-117.

Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E. & Clish, C. B. 2012. Targeted

metabolomics. Current Protocols in Molecular Biology 98: 1-24.

Robertson, D. G., Watkins, P. B. & Reily, M. D. 2011. Metabolomics in toxicology:

preclinical and clinical applications. Toxicological Sciences 120(suppl 1): S146-

S170.

Robinson, S. P. & Davies, C. 2000. Molecular biology of grape berry ripening.

Australian Journal of Grape and Wine Research 6(2): 175-188.

Rosli, M. a. F., Azizan, K. A., Baharum, S. N. & Goh, H.-H. 2017. Mass spectrometry

data of metabolomics analysis of Nepenthes pitchers. Data in Brief 14(295-297.

Rostagno, M. A., Palma, M. & Barroso, C. G. 2003. Ultrasound-assisted extraction of

soy isoflavones. Journal of Chromatography A 1012(2): 119-128.

Ryan, D. & Robards, K. 2006. Metabolomics: the greatest omics of them all? Analytical

Chemistry 78(23): 7954-7958.

Saladié, M., Cañizares, J., Phillips, M. A., Rodriguez-Concepcion, M., Larrigaudière,

C., Gibon, Y., Stitt, M., Lunn, J. E. & Garcia-Mas, J. 2015. Comparative

transcriptional profiling analysis of developing melon (Cucumis melo L.) fruit

from climacteric and non-climacteric varieties. BMC Genomics 16(1): 440.

Saladié, M., Matas, A. J., Isaacson, T., Jenks, M. A., Goodwin, S. M., Niklas, K. J.,

Xiaolin, R., Labavitch, J. M., Shackel, K. A. & Fernie, A. R. 2007. A

reevaluation of the key factors that influence tomato fruit softening and

integrity. Plant Physiology 144(2): 1012-1028.

Saleem, M. 2009. Lupeol, a novel anti-inflammatory and anti-cancer dietary triterpene.

Cancer Letters 285(2): 109-115.

Sandrang, A. K., Megat Amaddin, P. A., Idris, S., Mahmood, Z. & Hasan, M. R. H.

2015. Pembiakan mesta berskala besar dengan kaedah keratan mikro. Buletin

Teknologi MARDI 63-69.

Schmid, W. 1855. Ueber das mangostin. Justus Liebigs Annalen der Chemie 93(1): 83-

88.

Seo, E.-K., Kim, N.-C., Wani, M. C., Wall, M. E., Navarro, H. A., Burgess, J. P.,

Kawanishi, K., Kardono, L. B., Riswan, S. & Rose, W. C. 2002. Cytotoxic

135

prenylated xanthones and the unusual compounds anthraquinobenzophenones

from Cratoxylum sumatranum. Journal of Natural Products 65(3): 299-305.

Shackel, K. A., Greve, C., Labavitch, J. M. & Ahmadi, H. 1991. Cell turgor changes

associated with ripening in tomato pericarp tissue. Plant Physiology 97(2): 814-

816.

Shan, T., Ma, Q., Guo, K., Liu, J., Li, W., Wang, F. & Wu, E. 2011. Xanthones from

mangosteen extracts as natural chemopreventive agents: potential anticancer

drugs. Current Molecular Medicine 11(8): 666-677.

Sharon‐Asa, L., Shalit, M., Frydman, A., Bar, E., Holland, D., Or, E., Lavi, U.,

Lewinsohn, E. & Eyal, Y. 2003. Citrus fruit flavor and aroma biosynthesis:

isolation, functional characterization, and developmental regulation of Cstps1,

a key gene in the production of the sesquiterpene aroma compound valencene.

The Plant Journal 36(5): 664-674.

Shi, J., Wang, H., Hazebroek, J., Ertl, D. S. & Harp, T. 2005. The maize low-phytic

acid 3 encodes a myo-inositol kinase that plays a role in phytic acid biosynthesis

in developing seeds. The Plant Journal 42(5): 708-719.

Shibata, M.-A., Iinuma, M., Morimoto, J., Kurose, H., Akamatsu, K., Okuno, Y., Akao,

Y. & Otsuki, Y. 2011. α-Mangostin extracted from the pericarp of the

mangosteen (Garcinia mangostana Linn.) reduces tumor growth and lymph

node metastasis in an immunocompetent xenograft model of metastatic

mammary cancer carrying a p53 mutation. BMC Medicine 9(1): 69.

Shulaev, V. 2006. Metabolomics technology and bioinformatics. Briefings in

Bioinformatics 7(2): 128-139.

Sinaga, R. N. & Siregar, N. S. 2016. Phytochemical screening and test of antioxidant

activity in the extract of mangosteen rind. International Conference on Public

Health 2016, hlm. 124-124.

Smith, C. A., Want, E. J., O'maille, G., Abagyan, R. & Siuzdak, G. 2006. XCMS:

processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak

alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry 78(3): 779-787.

Soga, T., Ohashi, Y., Ueno, Y., Naraoka, H., Tomita, M. & Nishioka, T. 2003.

Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass

spectrometry. Journal of Proteome Research 2(5): 488-494.

Son, H.-S., Hwang, G.-S., Kim, K. M., Ahn, H.-J., Park, W.-M., Van Den Berg, F.,

Hong, Y.-S. & Lee, C.-H. 2009. Metabolomic studies on geographical grapes

and their wines using 1H NMR analysis coupled with multivariate statistics.


136

Sugita, P., Arya, S., Ilmiawati, A. & Arifin, B. 2017. Characterization, antibacterial and

antioxidant activity of mangosteen (Garcinia mangostana L.) pericarp

nanosized extract. Rasayan Journal of Chemistry 10(3): 707-715.

Sukatta, U., Takenaka, M., Ono, H., Okadome, H., Sotome, I., Nanayama, K.,

Thanapase, W. & Isobe, S. 2013. Distribution of major xanthones in the

pericarp, aril, and yellow gum of mangosteen (Garcinia mangostana Linn.) fruit

and their contribution to antioxidative activity. Bioscience, Biotechnology, and

Biochemistry 77(5): 984-987.

Suksamrarn, S., Suwannapoch, N., Phakhodee, W., Thanuhiranlert, J., Ratananukul, P.,

Chimnoi, N. & Suksamrarn, A. 2003. Antimycobacterial activity of prenylated

xanthones from the fruits of Garcinia mangostana. Chemical and

Pharmaceutical Bulletin 51(7): 857-859.

Sultana, B. & Anwar, F. 2008. Flavonols (kaempeferol, quercetin, myricetin) contents

of selected fruits, vegetables and medicinal plants. Food Chemistry 108(3): 879-

884.

Sumner, L. W., Mendes, P. & Dixon, R. A. 2003. Plant metabolomics: large-scale

phytochemistry in the functional genomics era. Phytochemistry 62(6): 817-836.

T’kindt, R., Morreel, K., Deforce, D., Boerjan, W. & Van Bocxlaer, J. 2009. Joint GC–

MS and LC–MS platforms for comprehensive plant metabolomics:

Repeatability and sample pre-treatment. Journal of Chromatography B 877(29):

3572-3580.

Tautenhahn, R., Cho, K., Uritboonthai, W., Zhu, Z., Patti, G. J. & Siuzdak, G. 2012. An

accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN

database. Nature Biotechnology 30(9): 826.

Theodoridis, G., Gika, H., Franceschi, P., Caputi, L., Arapitsas, P., Scholz, M.,

Masuero, D., Wehrens, R., Vrhovsek, U. & Mattivi, F. 2012a. LC-MS based

global metabolite profiling of grapes: solvent extraction protocol optimisation.

Metabolomics 8(2): 175-185.

Theodoridis, G. A., Gika, H. G., Want, E. J. & Wilson, I. D. 2012b. Liquid

chromatography–mass spectrometry based global metabolite profiling: a

review. Analytica Chimica Acta 711: 7-16.

Tholl, D. 2015. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants. Dlm.

Schrader, J. & Bohlmann, J. (pnyt.). Biotechnology of Isoprenoids. Advances

in Biochemical Engineering/Biotechnology, 148. hlm. 63-106. Springer.

Thong, N. M., Quang, D. T., Bui, N. H. T., Dao, D. Q. & Nam, P. C. 2015. Antioxidant

properties of xanthones extracted from the pericarp of Garcinia mangostana

(mangosteen): A theoretical study. Chemical Physics Letters 625: 30-35.

137

Tjitrosemito, S. & Poerwanto, R. 2008. secretory duct structure and phytochemistry

compounds of yellow latex in mangosteen fruit. HAYATI Journal of Biosciences

15(3): 99-104.

Tohge, T., Alseekh, S. & Fernie, A. R. 2014. On the regulation and function of

secondary metabolism during fruit development and ripening. Journal of

Experimental Botany 65(16): 4599-4611.

Valluru, R. & Van Den Ende, W. 2011. Myo-inositol and beyond-emerging networks

under stress. Plant Science 181(4): 387-400.

Van Dongen, J. T., Gupta, K. J., Ramírez-Aguilar, S. J., Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A.

& Fernie, A. R. 2011. Regulation of respiration in plants: a role for alternative

metabolic pathways. Journal of Plant Physiology 168(12): 1434-1443.

Vieira, L. & Kijjoa, A. 2005. Naturally-occurring xanthones: recent developments.

Current Medicinal Chemistry 12(21): 2413-2446.

Vinaixa, M., Samino, S., Saez, I., Duran, J., Guinovart, J. J. & Yanes, O. 2012. A

guideline to univariate statistical analysis for LC/MS-based untargeted

metabolomics-derived data. Metabolites 2(4): 775-795.

Vinatoru, M. 2001. An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive

principles from herbs. Ultrasonics Sonochemistry 8(3): 303-313.

Vondras, A. M., Commisso, M., Guzzo, F. & Deluc, L. G. 2017. Metabolite profiling

reveals developmental inequalities in pinot noir berry tissues late in ripening.

Frontiers in Plant Science 8(1108).

Wang, J., Sun, L., Xie, L., He, Y., Luo, T., Sheng, L., Luo, Y., Zeng, Y., Xu, J. & Deng,

X. 2016. Regulation of cuticle formation during fruit development and ripening

in ‘Newhall’navel orange (Citrus sinensis Osbeck) revealed by transcriptomic

and metabolomic profiling. Plant Science 243: 131-144.

Wansi, J. D., Devkota, K. P., Tshikalange, E. & Kuete, V. 2013. Alkaloids from the

medicinal plants of Africa. Dlm. Kuete, V. (pnyt.). Medicinal Plant Research

in Africa, hlm. 557-605. Oxford: Elsevier.

Watanapokasin, R., Jarinthanan, F., Jerusalmi, A., Suksamrarn, S., Nakamura, Y.,

Sukseree, S., Uthaisang-Tanethpongtamb, W., Ratananukul, P. & Sano, T.

2010. Potential of xanthones from tropical fruit mangosteen as anti-cancer

agents: caspase-dependent apoptosis induction in vitro and in mice. Applied

Biochemistry and Biotechnology 162(4): 1080-1094.

Watkins, C. B. 2008. Overview of 1-methylcyclopropene trials and uses for edible

horticultural crops. HortScience 43(1): 86-94.

138

Wei, R., Wang, J., Su, M., Jia, E., Chen, S., Chen, T. & Ni, Y. 2018. Missing value

imputation approach for mass spectrometry-based metabolomics data. Scientific

Reports 8(1): 663.

Wink, M. & Schimmer, O. 2018. Modes of action of defensive secondary metabolites.

Annual Plant Reviews 18-137.

Wishart, D. S., Jewison, T., Guo, A. C., Wilson, M., Knox, C., Liu, Y., Djoumbou, Y.,

Mandal, R., Aziat, F. & Dong, E. 2012. HMDB 3.0-the human metabolome

database in 2013. Nucleic Acids Research 41(D1): D801-D807.

Wittenauer, J., Falk, S., Schweiggert-Weisz, U. & Carle, R. 2012. Characterisation and

quantification of xanthones from the aril and pericarp of mangosteens (Garcinia

mangostana L.) and a mangosteen containing functional beverage by HPLC–

DAD–MSn. Food Chemistry 134(1): 445-452.

Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B. & Wishart, D. S. 2015a. MetaboAnalyst 3.0-making

metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research 43(W1): W251-W257.

Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B. & Wishart, D. S. 2015b. MetaboAnalyst 3.0-making

metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research 43(W1): W251-W257.

Yaacob, O. & Tindall, H. D. 1995. Mangosteen cultivation. Food & Agriculture Org.

Yamashita, I., Nemoto, Y. & Yoshikawa, S. 1976. Formation of volatile alcohols and

esters from aldehydes in strawberries. Phytochemistry 15(11): 1633-1637.

Yang, R., Li, P., Li, N., Zhang, Q., Bai, X., Wang, L., Xiao, Y., Sun, L., Yang, Q. &

Yan, J. 2017. Xanthones from the pericarp of Garcinia mangostana. Molecules

22(5): 683.

Yang, S. F. & Hoffman, N. E. 1984. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher

plants. Annual Review of Plant Physiology 35(1): 155-189.

Yang, T., Stoopen, G., Yalpani, N., Vervoort, J., De Vos, R., Voster, A., Verstappen,

F. W., Bouwmeester, H. J. & Jongsma, M. A. 2011. Metabolic engineering of

geranic acid in maize to achieve fungal resistance is compromised by novel

glycosylation patterns. Metabolic Engineering 13(4): 414-425.

Yang, X., Song, J., Du, L., Forney, C., Campbell-Palmer, L., Fillmore, S., Wismer, P.

& Zhang, Z. 2016. Ethylene and 1-MCP regulate major volatile biosynthetic

pathways in apple fruit. Food Chemistry 194: 325-336.

Yi, L., Dong, N., Yun, Y., Deng, B., Ren, D., Liu, S. & Liang, Y. 2016. Chemometric

methods in data processing of mass spectrometry-based metabolomics: a

review. Analytica Chimica Acta 914: 17-34.

139

Yildizli, A., Çevik, S. & Ünyayar, S. 2018. Effects of exogenous myo-inositol on leaf

water status and oxidative stress of Capsicum annuum under drought stress. Acta

Physiologiae Plantarum 40(6): 122.

Yoshimura, M., Ninomiya, K., Tagashira, Y., Maejima, K., Yoshida, T. & Amakura,

Y. 2015. Polyphenolic constituents of the pericarp of mangosteen (Garcinia

mangostana L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry 63(35): 7670-

7674.

Zadernowski, R., Czaplicki, S. & Naczk, M. 2009. Phenolic acid profiles of mangosteen

fruits (Garcinia mangostana). Food Chemistry 112(3): 685-689.

Zarena, A., Sachindra, N. & Sankar, K. U. 2012. Optimisation of ethanol modified

supercritical carbon dioxide on the extract yield and antioxidant activity from

Garcinia mangostana L. Food Chemistry 130(1): 203-208.

Zarena, A. & Sankar, K. U. 2009. Supercritical carbon dioxide extraction of xanthones

with antioxidant activity from Garcinia mangostana: Characterization by

HPLC/LC–ESI-MS. The Journal of Supercritical Fluids 49(3): 330-337.

Zarena, A. & Sankar, K. U. 2012. Phenolic acids, flavonoid profile and antioxidant

activity in mangosteen (Garcinia Mangostana L.) pericarp. Journal of Food

Biochemistry 36(5): 627-633.

Zhang, A., Sun, H., Yan, G., Wang, P. & Wang, X. 2016. Mass spectrometry‐based

metabolomics: applications to biomarker and metabolic pathway research.

Biomedical Chromatography 30(1): 7-12.

Zhou, Y., Han, Q.-B., Song, J.-Z., Qiao, C.-F. & Xu, H.-X. 2008. Characterization of

polyprenylated xanthones in Garcinia xipshuanbannaensis using liquid

chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight

tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1206(2): 131-139.

Zierer, J., Menni, C., Kastenmüller, G. & Spector, T. D. 2015. Integration of ‘omics’

data in aging research: from biomarkers to systems biology. Aging Cell 14(6):

933-944.

Zulak, K. G., Liscombe, D. K., Ashihara, H. & Facchini, P. J. 2006. Alkaloids. Dlm.

Crozier, A. C., Clifford, M. N. & Ashihara, H. (pnyt.). Plant Secondary

Metabolites: Occurrence, Structure and Role in the Human Diet, hlm. 102-136.

Oxford: Blackwell Publishing Ltd.

Zwenger, S. & Basu, C. 2008. Plant terpenoids: applications and future potentials.

Biotechnology and Molecular Biology Reviews 3(1): 1-7.

140

LAMPIRAN A

PERBANDINGAN KROMATOGRAM ION JUMLAH (TIC) BAGI LIMA KAEDAH

PENGEKSTRAKAN BERBEZA (KAEDAH 1, 2, 3, 4 DAN 5)

Gambar rajah TIC bagi sampel perikarpa manggis peringkat 6 yang diekstrak

menggunakan lima kaedah pengekstrakan berbeza disertai dengan derivatisasi

menggunakan MSTFA. a) TIC bagi kaedah 1 b) TIC bagi kaedah 2, c) TIC bagi kaedah

3, d) TIC bagi kaedah 4 dan e) TIC bagi kaedah 5

141

LAMPIRAN B

SENARAI METABOLIT YANG DIKENALPASTI DARIPADA LIMA KAEDAH PENGEKSTRAKAN BERBEZA (KAEDAH 1, 2, 3, 4 DAN 5)

MENGGUNAKAN ANALISIS GC-MS

Metabolit ID KEGG Kawasan puncak relatif (purata) ± SD

Kaedah 1 Kaedah 2 Kaedah 3 Kaedah 4 Kaedah 5

Gula (49.32%)

2-Deoksi-galaktopiranosa C00124 nd nd nd nd 7.5105 ± 3.94

Arabinofuranosa C06115 9.1110 ± 5.26 nd 414.7957 ± 237.79 nd 104.5254 ± 58.24

Arabinosa C00259 nd 0.04490 ± 0.03 nd nd 61.5461 ± 30.62

D-Fruktosa C00095 16.7760 ± 7.63 25.0694 ± 6.21 55.2019 ± 30.18 39.9064 ± 17.73 54.8634 ± 12.01

D-Galaktosa C00124 205.3409 ± 114.84 1.4938 ± 0.49 5.8186 ± 3.16 9.9933 ± 5.32 10.1579 ± 2.62

D-Glukosa C00031 1.0169 ± 0.59 11.6023 ± 4.08 21.6714 ± 7.63 409.6600 ± 235.53 2.2727 ± 1.15

D-Manosa C00159 249.6622 ± 142.68 0.0195 ± 0.01 1.5973 ± 0.80 0.0972 ± 0.05 189.1221 ± 100.39

Dimer dihidroksiaseton NA nd nd nd nd 3.5698 ± 2.06

D-Ribofuranosa C16639 nd nd 121.2284 ± 69.99 nd 5.1522 ± 2.64

D-Ribosa C00121 2.6853 ± 1.38 116.0368 ± 66.31 7.8612 ± 3.94 1.3585 ± 0.59 10.7110 ± 3.79

D-Turanosa C19636 nd nd 283.1452 ± 163.47 nd nd

D-Xilofuranosa NA nd nd nd nd 3.4055 ± 1.74

D-Xilopiranosa NA nd 0.0408 ± 0.02 112.3784 ± 64.87 0.0347 ± 0.02 nd

D-Xilosa C00181 0.2410 ± 0.14 27.0840 ± 15.43 12.4532 ± 7.19 0.0543 ± 0.03 153.0057 ± 86.32

Eritrosa C01796 nd nd 0.2504 ± 0.13 nd nd

Glukofuranosida NA nd nd nd 0.0768 ± 0.04 10.1610 ± 1.85

Glukopiranosa NA nd nd 10.6770 ± 5.44 nd 12.6349 ± 4.10

Glikosida NA nd nd nd nd 1.0009 ± 0.52

bersambung...

142

...sambungan

Gulosa C15923 nd nd 1298.6308 ± 749.76 nd nd

Inososa NA nd nd 0.2359 ± 0.14 nd nd

Liksopiranosida NA nd nd nd nd 117.3190 ± 67.73

Liksosa C01508 nd 0.0297 ± 0.02 10.1244 ± 5.85 nd nd

Manopiranosa C21056 nd nd nd nd 11.9671 ± 6.91

Sorbopiranosa NA nd nd 438.1043 ± 252.94 nd nd

Talosa C06467 nd nd nd nd 167.9375 ± 84.25

α-D-Galaktofuranosida NA nd 0.0242 ± 0.01 nd nd nd

α-D-Glukopiranosida NA 292.8833 ± 169.10 nd 1241.0133 ± 620.99 6.7862 ± 3.92 588.6889 ± 339.88

α-DL-Arabinopiranosa C00259 nd nd nd 0.1207 ± 0.06 3.3432 ± 1.93

α-DL-Liksofuranosida NA 2.6625 ± 1.54 nd nd nd nd

α-DL-Liksoopiranosa NA nd nd nd 0.0399 ± 0.02 nd

α-D-Mannopiranosida NA nd nd nd nd 985.6240 ± 569.05

α-1-Galaktofuranosida NA 2.9906 ± 1.73 nd nd nd nd

α-L-Manofuranosa NA nd nd nd nd 1.1823 ± 0.68

β-DL-Liksofuranosida NA 0.1624 ± 0.09 nd nd nd nd

β-D-Manopiranosida NA nd 0.0439 ± 0.02 nd nd nd

β-l-Galaktopiranosida NA nd nd nd nd 238.8975 ± 137.93

Asid gula (8.22%)

Asid β-D-

galaktopiranosiduronik NA nd nd 0.1739 ± 0.1 nd nd

Asid 2-keto-d-glukonik C06473 nd nd 834.9214 ± 482.04 nd nd

Asid glukonik C00257 0.6254 ± 0.36 nd nd nd nd

Asid manonik NA nd 0.0259 ± 0.01 nd nd nd

Asid pentonik NA nd nd nd nd 14.7932 ± 8.31

bersambung...

143

...sambungan

Asid ribonik C01685 nd 9.0426 ± 5.22 nd nd nd

Asid organik (6.85%)

Asid butanadioik C00042 nd 0.4687 ± 0.26 nd nd nd

Asid malik C00149 nd 0.0344 ± 0.02 3.2093 ± 1.80 nd 7.5619 ± 1.03

Asid metilmaleik C02226 nd nd 0.4383 ± 0.25 nd nd

Asid propanadioik C00383 nd nd 2.3975 ± 1.38 nd nd

Asid L-(+)-tartarik NA nd 0.1632 ± 0.09 0.5778 ± 0.33 nd nd

Alkohol (9.59%)

Adonitol C00474 nd 9.8687 ± 5.7 55.1888 ± 31.86 nd 6.7446 ± 3.89

Arabinitol C00532 40.8558 ± 23.59 0.2527 ± 0.11 0.8005 ± 0.41 0.1316 ± 0.08 76.2847 ± 47.34

myo-Inositol C00137 5.1401 ± 2.97 6.7599 ± 2.95 42.4426 ± 21.28 nd 68.3622 ± 21.25

Pentitol NA nd nd nd 0.6336 ± 0.37 nd

Fenol C00146 0.8247 ± 0.48 nd nd nd nd

Pirokatekol C00090 4.4868 ± 2.59 nd nd nd nd

Treitol C16884 nd nd nd 0.0966 ± 0.06 nd

Aldehid (1.37%)

Butanal C01412 31.7555 ± 18.33 0.0505 ± 0.03 0.0648 ± 0.04 nd nd

Sebatian fenolik (5.48%)

Asid salisilik C00805 12.9489 ± 7.48 nd nd nd nd

Asid 3,4-dihidroksibenzoik C00230 28.7896 ± 16.62 nd nd nd nd

4-Hidroksifeniletanol C06044 1.9647 ± 1.13 nd nd nd nd

bersambung...

144

...sambungan

Asid benzoic C00180 1.1622 ± 0.67 nd nd nd nd

Sebatian aromatik (2.74%)

2H-1-Benzopiran NA nd nd 28.2234 ± 16.29 nd 97.1145 ± 56.07

Benzaldehid C00261 0.7162 ± 0.41 nd nd nd nd

Lain-lain (16.44%)

Benzena NA 1.0224 ± 0.59 nd nd nd nd

1,4-Pentadiena NA 0.4472 ± 0.26 nd nd nd nd

Asid 2-hikroksimandelik NA 0.4334 ± 0.25 nd nd nd nd

Asid 2-piridinakarboksilik NA nd 0.0218 ± 0.01 nd nd nd

1,4-sikloheksadiena NA 0.5000 ± 0.29 nd nd nd nd

Asid 3-merkaptobenzoik NA 1.1459 ± 0.66 nd nd nd nd

Siklopenta-1,3-diena NA nd nd 0.3281 ± 0.19 nd 1.3550 ± 0.78

Asid α,β-L-idopiranuronik NA nd nd 1.4814 ± 0.86 nd nd

Asetamida NA nd nd nd nd 0.6451 ± 0.37

Gliserol NA nd nd nd nd 37.9061 ± 16.47

Metil 4-metil-4-nitroso-

pentanoat NA nd nd nd nd 0.4066 ± 0.23

Timol-α-d-glukopiranosida NA 2.5371 ± 1.46 6.7076 ± 2.53 24.4155 ± 12.30 3.5428 ± 2.02 7.4949 ± 4.33

Sampel perikarpa manggis peringkat 6 diekstrak menggunakan lima kaedah pengekstrakan metabolit yang berbeza (kaedah 1, 2, 3, 4 dan 5).

Sampel diderivatisasi menggunakan MSTFA dan dianalisis menggunakan GC-MS. Singkatan; SD: sisihan piawai, NA: not available, nd: not

detected

145

LAMPIRAN C

PLOT VIP BAGI ANALISIS PERBANDINGAN LIMA KAEDAH

PENGEKSTRAKAN

Garisan berwarna merah menunjukkan pembahagian metabolit yang mempunyai nilai

VIP ≥1.00 (ke kiri) dan nilai VIP <1.00 (ke kanan)

146

LAMPIRAN D

PERBANDINGAN KROMATOGRAM ION JUMLAH (TIC) BAGI SAMPEL

PERIKARPA, ISI DAN BIJI MANGGIS MENGGUNAKAN KAEDAH

PENGEKSTRAKAN 3

Gambar rajah TIC bagi sampel perikarpa manggis yang diekstrak menggunakan kaedah

pengekstrakan 3 (metanol/kloroform/air dengan nisbah 2:1:2) disertai dengan

derivatisasi menggunakan BSTFA. a) TIC bagi sampel perikarpa, b) TIC bagi sampel

isi dan c) TIC bagi sampel biji manggis

147

LAMPIRAN E

PERBANDINGAN KROMATOGRAM ION JUMLAH (TIC) BAGI SAMPEL

PERIKARPA, ISI DAN BIJI MANGGIS MENGGUNAKAN KAEDAH

PENGEKSTRAKAN 5

Gambar rajah TIC bagi kaedah pengekstrakan 5 (metanol/kloroform/air dengan nisbah

3:1:1) disertai dengan derivatisasi menggunakan BSTFA. a) TIC bagi sampel perikarpa,

b) TIC bagi sampel isi dan c) TIC bagi sampel biji manggis

148

LAMPIRAN F

SENARAI METABOLIT YANG DIKENALPASTI DARIPADA DUA KAEDAH PENGEKSTRAKAN BERBEZA (KAEDAH 3 DAN 5)

MENGGUNAKAN ANALISIS GC-MS

Metabolit ID KEGG Nilai p

(p ≤0.05)

Kaedah 3 Kaedah 5

Metanol/kloroform/air (2:1:2) Metanol/kloroform/air (3:1:1)

Kawasan puncak relatif (purata) ±SD Kawasan puncak relatif (purata) ±SD

Perikarpa Isi Biji Perikarpa Isi Biji

Gula (51%)

Arabinofuranosa C06115 0.0006 0.1105 ±0.184 nd 0.0043 ±0.001 nd nd nd

Arabinopiranosa NA 0.0006 0.0711 ±0.013 nd nd 0.0769 ±0.002 nd nd

D-Fruktosa C02336 ≥0.05 0.8143 ±0.211 1.6098 ±0.157 1.2900 ±0.501 1.8428 ±0.492 1.2770 ±0.151 1.8771 ±0.015

D-Galaktosa C00124 ≥0.05 nd 0.8538 ±0.529 1.3146 ±1.245 2.0485 ±0.905 nd 0.6917 ±1.081

D-Glukosa C00031 ≥0.05 0.2980 ±0.073 0.1640 ±0.146 0.3779 ±0.374 0.1405 ±0.028 0.5120 ±0.471 2.3935 ±0.342

D-Ribofuranosa NA <0.0001 0.3484 ±0.190 0.7936 ±0.296 nd 0.4772 ±0.114 0.5944 ±0.226 0.7988 ±0.431

D-Ribosa C00121 0.0011 0.0593 ±0.014 0.0170 ±0.005 0.0080 ±0.001 0.1380 ±0.020 0.0300 ±0.014 0.0140 ±0.002

D-Xilofuranosa NA ≥0.05 nd 0.8638 ±0.952 0.7535 ±0.172 nd nd nd

D-Xilopiranosa NA 0.0017 0.1383 ±0.202 0.1108 ±0.082 0.0037 ±0.003 0.1125 ±0.100 0.0181 ±0.004 0.0092 ±0.006

D-Xilosa C00181 0.0009 0.0322 ±0.025 nd 0.0604 ±0.087 0.0546 ±0.046 0.1140 ±0.075 0.0817 ±0.059

Galakto-heksodialdosa C03269 <0.0001 0.1292 ±0.013 nd nd nd nd nd

Glukopiranosa NA ≥0.05 0.6445 ±0.212 1.3048 ±0.533 2.2011 ±1.031 0.8252 ±0.172 2.0168 ±0.365 3.0966 ±1.483

Glikosida NA <0.0001 nd nd 0.0263 ±0.011 nd nd 0.1110 ±0.159

Gulosa C15923 ≥0.05 nd nd nd nd nd 0.2008 ±0.301

Liksosa C08348 0.0047 nd 0.0569 ±0.092 0.0052 ±0.003 0.0248 ±0.017 0.0108 ±0.003 0.0051 ±0.002

Manosa C00159 0.0002 0.1315 ±0.113 nd 0.0386 ±0.008 0.0880 ±0.130 0.5682 ±0.925 0.0472 ±0.004

bersambung...

149

...sambungan

Sorbopiranosa NA <0.0001 nd nd nd 0.0128 ±0.003 nd nd

Xilulosa C00310 <0.0001 0.1355 ±0.073 nd 0.0006 ± 1.388E-05

nd nd nd

α-D-Galaktofuranosa NA 0.0051 nd 0.0005 ±

5.716E-05

nd nd 0.0003 ±0.000 nd

β-D-Galaktofuranosa NA <0.0001 nd 0.0789 ±0.035 0.0374 ±0.007 nd nd 0.0651 ±0.028

α-D-Glukopiranosida NA 0.0009 2.2319 ±0.462 4.6907 ±2.574 4.3413 ±1.329 3.0484 ±0.899 7.0709 ±1.644 5.1506 ±1.214

β-D-Glukopiranosida NA ≥0.0500 0.0002 ±

2.501E-05

nd nd nd nd nd

Asid gula (12%)

Asid galaktarik C00879 <0.0001 0.0162 ±0.007 nd nd nd nd nd

Asid galakturonik C08348 0.0053 0.0287 ±0.011 nd nd 0.0191 ±0.005 nd nd

Asid L-treonik NA 0.0010 nd nd 0.0072 ±0.012 nd nd 0.0190 ±0.017

Asid ribonik C01685 <0.0001 0.0220 ±0.019 0.0001 ±0.000 nd 0.0486 ±0.012 nd nd

Asid β-D-galaktopiranosiduronik NA <0.0001 nd nd nd 0.0002 ±1.552E-05

nd nd

Alkohol gula (5%)

Arabinitol C00532 0.0407 0.0167 ±0.014 0.0180 ±0.003 nd 0.0600 ±0.013 0.0263 ±0.034 0.0091 ±0.003

myo-Inositol C00137 0.0323 0.0168 ±0.008 0.0051 ±0.004 0.1686 ±0.169 0.0383 ±0.014 nd 0.1996 ±0.174

Asid organik (14%)

Asid arabino-heksarik NA 0.0002 0.0072 ±0.006 nd nd 0.0002 ±0.000 nd nd

Asid butanoik C00246 0.0407 nd nd 0.0154 ±0.002 nd nd 0.0265 ±0.002

Asid sitrik C19806 ≥0.05 0.3682 ±0.171 0.6249 ±0.320 0.1515 ±0.124 0.2564 ±0.254 0.5022 ±0.428 0.2380 ±0.080

Asid L-(+)-tartarik C00898 <0.0001 0.0346 ±0.006 nd nd 0.0576 ±0.051 nd nd

Asid malik C00149 0.0178 0.1836 ±0.180 0.0550 ±0.047 0.1587 ±0.266 0.2777 ±0.236 nd 0.6027 ±0.039

bersambung...

150

...sambungan

Asid propanoik C00163 <0.0001 nd nd nd nd nd 0.0037 ±0.001

Alkohol (5%)

2,3-Butanadiol C00265 <0.0001 nd nd nd 0.0103 ±0.002 nd nd

Treitol C16884 0.0055 nd nd nd nd nd 0.0020 ±0.002

Aldehid (2%)

Butanal C01412 0.0021 0.0175 ±0.003 0.0334 ±0.022 nd 0.0166 ±0.003 0.0084 ±0.012 0.0128 ±0.015

Sebatian aromatik (2%)

2H-1-Benzopiran NA <0.0001 nd nd nd nd 0.0054 ±0.002 nd

Lain-lain (9%)

Asid akrilik C00511 <0.0001 nd nd 0.0006 ±0.4E-3 nd nd nd

3,8-Dioksa-2,9-disiladecana NA <0.0001 0.0300 ±0.010 0.0063 ± 0.185E-3

0.0039 ±0.002 nd 0.0075 ±0.005 0.0101 ±0.300E-3

Timol-α-D-glukopiranosida NA 0.0007 0.0218 ±0.003 0.1607 ±0.005 nd 0.0278 ±0.001 0.1265 ±0.004 nd

Asid β-hidroksipiruvik C00168 0.0009 0.0384 ±0.009 nd nd 0.0458 ±0.014 nd nd

Sampel perikarpa, isi dan biji manggis peringkat 6 diekstrak menggunakan dua kaedah pengekstrakan metabolit yang berbeza (kaedah 3 dan 5).

Sampel diderivatisasi menggunakan BSTFA dan dianalisis menggunakan GC-MS. Singkatan; SD: sisihan piawai, NA: not available, nd: not

detected

151

LAMPIRAN G

PLOT VIP BAGI ANALISIS PERBANDINGAN DUA KAEDAH PENGEKSTRAKAN

(KAEDAH 3 DAN 5)

Garisan berwarna merah menujukkan pembahagian metabolit yang mempunyai nilai

VIP ≥1.00 (ke kiri) dan nilai VIP <1.00 (ke kanan)

152

LAMPIRAN H

SENARAI PUNCAK (PASANGAN RT: m/z) DALAM KROMATOGRAM BAGI ANALISIS PERBANDINGAN KAEDAH PENGEKSTRAKAN

1 DAN 5 PADA DUA MOD PENGIONAN LC-MS

Intensiti

Intensiti

Kaedah 1

Kaedah 5

Kaedah 1

Kaedah 5

Mod pengionan

Mod pengionan

Mod pengionan

Mod pengionan

RT: m/z Positif Negatif

Positif Negatif

RT: m/z Positif Negatif

Positif Negatif

1.1min: 142.1584m/z

nd nd

nd 339182

15.3min: 396.1539m/z

2311 nd

nd nd

1.1min:

524.3406m/z

nd nd

nd 34418

15.4min:

414.1635m/z

2270 nd

nd nd

1.2min:

128.9565m/z

nd nd

4480 nd

15.4min:

414.1691m/z

nd 20433

nd nd

1.2min: 562.2984m/z

nd nd

nd 198880

15.4min: 424.1859m/z

3535 nd

nd nd

1.3min: 524.3409m/z

nd nd

nd 106251

15.5min: 424.1834m/z

5184 nd

nd nd

1.3min:

609.1345m/z

nd nd

4392 nd

15.7min:

424.1888m/z

nd 78664

nd nd

1.3min:

609.137m/z

nd nd

11744 nd

15.7min:

428.1788m/z

10147 nd

nd nd

1.3min: 610.1377m/z

5031 nd

nd nd

15.8min: 428.1785m/z

11692 nd

nd nd

1.3min:

610.1399m/z

18609 nd

nd nd

15.8min:

428.1807m/z

34387 nd

nd nd

1.3min:

610.1523m/z

nd 234485

nd nd

15.9min:

424.1887m/z

nd 263281

nd nd

1.3min: 610.1524m/z

nd 119889

nd nd

15.9min: 427.1722m/z

nd nd

46842 nd

1.4min:

611.1621m/z

nd nd nd 339305 16.1min:

424.1865m/z

nd 49642 nd nd

1.5min:

179.0525m/z

nd nd 142044 nd 16.2min:

428.1796m/z

1272 nd nd nd

bersambung…

153

sambungan…

1.5min: 179.0526m/z

nd nd

53733 nd

16.6min: 414.1629m/z

4933 nd

nd nd

1.5min:

325.1118m/z

nd nd

nd 331720

16.8min:

414.1627m/z

7942 nd

nd nd

1.5min:

362.1249m/z

23149 nd

nd nd

16.8min:

414.1647m/z

10720 nd

nd nd

1.5min: 387.109m/z

nd nd

170237 nd

16.8min: 414.1678m/z

nd 66117

nd nd

1.5min:

388.1116m/z

24739 nd

nd nd

16.9min:

413.1553m/z

nd nd

18508 nd

1.5min:

388.1134m/z

103795 nd

nd nd

16.9min:

413.1556m/z

nd nd

24722 nd

1.6min:

134.0457m/z

nd nd

nd 132995

16min:

425.1937m/z

nd nd

nd 150550

1.6min: 866.1859m/z

58196 nd

nd nd

17.1min: 415.1731m/z

nd nd

nd 71524

1.6min:

866.2023m/z

nd 95559

nd nd

18.2min:

407.1468m/z

nd nd

5518 nd

1.7min:

524.3411m/z

nd nd

nd 104985

2.1min:

354.0882m/z

13103 nd

nd nd

1.7min: 578.1271m/z

26084 nd

nd nd

2.1min: 354.0943m/z

nd 69590

nd nd

1.7min:

578.1293m/z

30194 nd

nd nd

2.2min:

354.0946m/z

nd 56961

nd nd

1.7min:

578.1388m/z

nd 117294

nd nd

2.2min:

417.3582m/z

nd 24234

nd nd

1.7min: 578.1415m/z

nd 204343

nd nd

2.3min: 191.0524m/z

nd nd

24640 nd

1.7min:

866.1836m/z

13344 nd nd nd 2.3min:

193.0319m/z

nd nd 57304 nd

1.7min:

866.1857m/z

24892 nd nd nd 2.3min:

291.0868m/z

nd nd nd 592602

1.7min: 866.2049m/z

nd 334654 nd nd 2.3min: 405.0618m/z

30385 nd nd nd

1.8min:

524.3438m/z

nd nd nd 128838 2.3min:

965.8846m/z

nd 49249 nd nd

1.8min:

578.1391m/z

nd 90857 nd nd 2.4min:

133.0112m/z

nd nd 111733 nd

10.1min: 524.1491m/z

8890 nd nd nd 2.4min: 291.0869m/z

nd nd nd 548387

bersambung…

154

sambungan…

10.2min: 464.2183m/z

nd 42097

nd nd

2.4min: 366.1435m/z

2593 nd

nd nd

10.2min:

523.1444m/z

nd nd

10390 nd

2.5min:

133.0111m/z

nd nd

25378 nd

10.2min:

523.1448m/z

nd nd

8488 nd

2.5min:

291.085m/z

nd nd

nd 188026

10.3min: 460.3438m/z

nd nd

nd 42131

2.5min: 386.0713m/z

nd 25612

nd nd

10.5min:

396.1506m/z

69942 nd

nd nd

2.7min:

738.3758m/z

nd 8021

nd nd

10.5min:

396.151m/z

69903 nd

nd nd

2.8min:

191.0164m/z

nd nd

6527 nd

10.5min:

396.152m/z

50958 nd

nd nd

2.8min:

385.0548m/z

nd nd

7684 nd

10.5min: 540.4034m/z

nd nd

nd 80918

2.8min: 524.3437m/z

nd nd

nd 173484

10.6min:

341.1002m/z

nd nd

5415 nd

20.2min:

197.8036m/z

nd nd

3304 nd

10.6min:

341.1006m/z

nd nd

9165 nd

20.5min:

197.8023m/z

nd nd

2788 nd

10.6min: 408.1585m/z

nd 32289

nd nd

2min: 582.1608m/z 17759 nd

nd nd

10.6min:

410.1587m/z

5077 nd

nd nd

3.3min:

217.0298m/z

nd nd

4306 nd

10.8min:

396.1513m/z

63347 nd

nd nd

3.5min:

223.0643m/z

nd nd

nd 38253

10.8min: 396.153m/z

60576 nd

nd nd

3.8min: 217.0325m/z

nd nd

11409 nd

10.9min:

142.159m/z

nd nd

nd 68581

3.8min:

217.0326m/z

nd nd

12597 nd

10.9min:

426.3771m/z

nd 191603

nd nd

3.9min:

386.1724m/z

nd 43221

nd nd

10min: 720.4126m/z

nd nd

nd 87833

4.1min: 149.0236m/z

nd nd

nd 43077

11.1min:

325.1051m/z

nd nd

5353 nd

4.5min:

387.181m/z

nd nd

nd 35453

11.1min:

396.1519m/z

57134 nd

nd nd

4.9min:

354.2851m/z

nd nd

nd 230588

11.1min: 426.3647m/z

nd 195448

nd nd

5.1min: 400.2882m/z

nd nd

nd 34445

bersambung…

155

…sambungan

11.2min: 327.1218m/z

nd nd

nd 28086

5.2min: 524.3413m/z

nd nd

nd 192239

11.2min:

366.0573m/z

7916 nd

nd nd

5.4min:

442.1615m/z

nd 18424

nd nd

11.4min:

506.1401m/z

10572 nd

nd nd

5.7min:

415.212m/z

nd nd

nd 88615

11.5min: 380.0383m/z

6267 nd

nd nd

5.8min: 524.3412m/z

nd nd

nd 258140

11.5min:

426.3616m/z

nd 205211

nd nd

5.9min:

443.1706m/z

nd nd

nd 40808

11.7min:

396.1517m/z

13847 nd

nd nd

5min: 414.2021m/z nd 18378

nd nd

11.7min:

505.1344m/z

nd nd

17352 nd

6.2min:

345.1324m/z

nd nd

2786 nd

11.8min: 505.1342m/z

nd nd

9668 nd

6.2min: 347.1491m/z

nd nd

nd 56505

11.9min:

142.1586m/z

nd nd

nd 212635

6.4min:

428.1715m/z

nd 11345

nd nd

11.9min:

426.3629m/z

nd 202514

nd nd

6.5min:

426.155m/z

nd 36799

nd nd

11min: 396.1516m/z

60626 nd

nd nd

6.5min: 524.3414m/z

nd nd

nd 373522

11min:

410.1667m/z

17813 nd

nd nd

6.6min:

297.2425m/z

nd nd

nd 42499

11min: 509.386m/z nd 375923

nd nd

6.6min:

426.1636m/z

707 nd

nd nd

11min: 510.3914m/z

nd nd

nd 552296

6.6min: 426.164m/z

1494 nd

nd nd

12.1min:

380.1586m/z

5638 nd

nd nd

6.6min:

426.1659m/z

nd 36955

nd nd

12.4min:

464.2145m/z

24562 nd

nd nd

6.8min:

427.1743m/z

nd nd

nd 86549

12.5min: 340.3189m/z

nd nd

nd 60303

6.9min: 394.0755m/z

nd nd

4945 nd

12.5min:

464.2146m/z

30254 nd

nd nd

7.3min:

684.2063m/z

1455 nd

nd nd

12.6min:

380.1597m/z

52659 nd

nd nd

7.4min:

279.1587m/z

nd nd

nd 253572

12.6min: 380.1636m/z

nd 76712

nd nd

7.8min: 512.5023m/z

nd nd

nd 213913

bersambung…

156

sambungan…

12.7min: 379.1522m/z

nd nd

50039 nd

7.8min: 524.3404m/z

nd nd

nd 319644

12.7min:

379.1525m/z

nd nd

35857 nd

7.9min:

598.422m/z

nd nd

nd 122319

12.8min:

381.1682m/z

nd nd

nd 153048

7min: 394.0738m/z nd nd

3903 nd

12.8min: 426.379m/z

nd 219337

nd nd

7min: 400.1812m/z 1492 nd

nd nd

12.9min:

178.8739m/z

nd nd

10293 nd

7min: 442.1551m/z 2718 nd

nd nd

12min:

523.4022m/z

nd 136850

nd nd

8.2min:

736.4094m/z

nd nd

nd 45746

12min:

524.4078m/z

nd nd

nd 343737

8.3min:

382.1732m/z

5077 nd

nd nd

13.1min: 142.1574m/z

nd nd

nd 238988

8.3min: 382.173m/z

12795 nd

nd nd

13.1min:

178.8755m/z

nd nd

8612 nd

8.3min:

382.1773m/z

nd 31518

nd nd

13.4min:

142.1573m/z

nd nd

nd 236968

8.4min:

381.1683m/z

nd nd

5118 nd

13.4min: 178.8757m/z

nd nd

6755 nd

8.5min: 396.1568m/z

nd 62421

nd nd

13.5min:

380.1581m/z

3455 nd

nd nd

8.6min:

525.3797m/z

nd 90022

nd nd

13.8min:

560.4319m/z

nd nd

nd 36480

8.7min:

526.3762m/z

nd nd

nd 162718

14.2min: 396.1528m/z

46896 nd

nd nd

8.8min: 397.1638m/z

nd nd

nd 136688

14.2min:

396.1549m/z

63970 nd

nd nd

9.1min:

352.2563m/z

3537 nd

nd nd

14.3min:

395.1466m/z

nd nd

39374 nd

9.2min:

539.3933m/z

nd 35547

nd nd

14.3min: 395.1468m/z

nd nd

55016 nd

9.3min: 410.165m/z

2803 nd

nd nd

14.3min:

396.1583m/z

nd 167506

nd nd

9.3min:

410.1716m/z

nd 149347

nd nd

14.4min:

397.1637m/z

nd nd nd 220530 9.3min:

540.4042m/z

nd nd nd 86162

14.4min: 424.1901m/z

nd 95203 nd nd 9.4min: 510.3893m/z

nd nd nd 48170

bersambung…

157

…sambungan

14.5min: 424.1848m/z

2979 nd nd nd 9.5min: 411.1774m/z

nd nd nd 197110

14.5min:

425.195m/z

nd nd nd 173453 9.6min:

761.5495m/z

nd 22657 nd nd

14.7min:

426.1537m/z

nd 86024

nd nd

9.7min:

526.3867m/z

nd nd

nd 72446

14.7min: 426.1697m/z

nd 18065

nd nd

9.7min: 981.3389m/z

11333 nd

nd nd

14.8min:

396.1547m/z

2823 nd

nd nd

9.9min:

325.1052m/z

nd nd

15383 nd

14.8min:

426.1556m/z

nd 84338

nd nd

9.9min:

325.1065m/z

nd nd

28119 nd

15.1min:

396.1589m/z

nd 21676

nd nd

9.9min:

327.1213m/z

nd nd

nd 39654

Sampel perikarpa manggis peringkat 6 diekstrak menggunakan dua kaedah pengekstrakan metabolit yang berbeza (kaedah 1 dan 5) dan dianalisis

menggunakan LC-MS. Singkatan; nd: not detected

158

LAMPIRAN I

SENARAI METABOLIT DARIPADA ANALISIS PEMPROFILAN MENGGUNAKAN GC-MS

Metabolit RI RT

(min)

ID

KEGG

Formula

kimia

Kawasan puncak relatif (purata) ±SE

PO

P2 P4 P6

P I S P I S P I S

Gula

Arabinofuranosa 1710 11.43 C06115 C5H10O5 0.0592

±0.0585

nd

0.0014

±0.0003

0.1939

±0.0401

0.1874

±0.0445

0.0328

±0.0306

nd 0.0504

±0.0448

0.0204

±0.0191

0.0459

±0.0416 Arabinosa 1706 11.38 C00259 C5H10O5 nd

nd

nd 0.0886

±0.0885

0.0178

±0.0107

nd nd nd nd nd

D-Fruktosa 1759 11.97 C00095 C6H12O6 0.6540 ±0.1327

0.7151 ±0.0716

1.5863 ±0.2734

1.3129 ±0.2700

0.9420 ±0.2085

1.7132 ±0.2281

1.6652 ±0.7829

0.8903 ±0.195

1.8271 ±0.5064

0.7279 ±0.1384

D-Galaktosa 1756 11.94 C00124 C6H12O6 0.0753

±0.0690

0.1398

±0.0809

0.3595

±0.286

0.0811

±0.0533

0.0666

±0.0545

0.2295

±0.1206

nd 0.1673

±0.0795

nd nd

D-Glukosa 1825 12.65 C00031 C6H12O6 0.0413

±0.0125

0.1669

±0.0253

0.2611

±0.0972

0.1387

±0.077

0.1839

±0.0786

0.3384

±0.1214

0.3037

±0.1024

0.1409

±0.0602

0.3301

±0.0859

0.0949

±0.0539

D-Manosa 1775 12.09 C00159 C6H12O6 0.0015 ±0.0005

0.0666 ±0.0194

0.0501 ±0.0424

0.0775 ±0.0185

0.0424 ±0.0214

0.0746 ±0.0343

0.1357 ±0.0900

0.0291 ±0.0092

0.1171 ±0.0991

0.0574 ±0.0177

D-Ribofuranosa 1777 12.14 C16639 C5H10O5 0.1273

±0.0289

0.1755

±0.0212

0.1663

±0.0359

nd 0.2176

±0.0844

0.4758

±0.1589

0.5208

±0.1299

0.4192

±0.1006

0.2931

±0.0939

0.1974

±0.0536 D-Ribosa 1679 11.09 C00121 C5H10O5 0.0076

±0.0026

0.0413

±0.0102

0.0066

±0.0005

0.0427

±0.0199

0.1653

±0.0372

0.0327

±0.0097

0.0424

±0.0178

0.1425

±0.0562

0.0212

±0.0007

0.0457

±0.0226

D-Turanosa 2045 14.84 C19636 C12H22O11 nd nd

0.5168 ±0.1757

nd nd 0.2966 ±0.1395

nd 0.0985 ±0.08

0.6488 ±0.2319

0.7551 ±0.1175

D-Xilofuranosa 1748 11.85 C01510 NA 0.0885

±0.0097

0.0417

±0.0323

0.1339

±0.0775

0.1865

±0.0394

0.1297

±0.0651

0.2787

±0.0632

0.3041

±0.2649

0.2195

±0.0897

0.3263

±0.1289

0.2480

±0.1115

D-Xilopiranosa 1768 12.04 NA NA 0.0235

±0.0210

0.0525

±0.03

0.0346

±0.0188

0.0079

±0.004

nd 0.0081

±0.0064

0.0203

±0.0102

0.0692

±0.0276

0.0439

±0.0432

0.0102

±0.005

D-Xilosa 1736 11.69 C00181 C5H10O5 0.0242 ±0.0163

0.0156 ±0.0061

0.0294 ±0.0203

0.0154 ±0.0044

0.1061 ±0.0533

0.0256 ±0.0039

0.0553 ±0.0258

0.1360 ±0.1073

0.0194 ±0.0067

0.0147 ±0.0065

Erytrosa 1779 12.19 C01796 C4H8O4 0.2741

±0.0408

nd

nd nd nd nd nd nd nd nd

Galaktopiranosa 1779 12.15 C00124 C6H12O6 nd

nd

0.1810

±0.1519

0.0596

±0.0519

0.1246

±0.0586

0.2298

±0.0611

0.4583

±0.2359

nd 0.2395

±0.1194

0.1762

±0.0452

Glukopiranosa 1806 12.48 C00031 C6H12O6 0.3428 ±0.1010

0.4636 ±0.0299

0.6533 ±0.0602

0.7629 ±0.1021

0.337 ±0.0917

0.6795 ±0.1006

1.2048 ±0.2902

0.5839 ±0.0661

0.6571 ±0.2063

0.7062 ±0.1476

bersambung…

159

…sambungan

Gulosa 1831 12.71 C06465 C6H12O6

nd

nd nd nd nd nd 0.2116

±0.1378 nd nd 0.0970

±0.0303

L-Fukosa 1696 11.28 C01019 C6H12O5 nd

nd

nd 0.0041

±0.0019

0.0072

±0.0027

nd nd nd 0.0064

±0.0002

nd

L-Manopiranosa 1855 12.89 NA NA nd 0.0016

±0.0008


±0.0007

nd nd

Liksosa 1721 11.54 C00476 C5H10O5 0.0197 ±0.0171

0.0296 ±0.024

0.0003 ±0.0002

0.0070 ±0.0061

0.1795 ±0.1794

0.0011 ±0.0009

0.0009 ±0.0009

0.0091 ±0.0046

0.0130 ±0.0051

0.0219 ±0.0218

Sorbopiranosa 1753 11.91 C08356 C6H12O6 nd 0.0429

±0.0093


Talosa 1790 12.31 C06467 C6H12O6 nd 0.1657

±0.0836


±0.0858

nd nd

Xilulosa 1766 12.05 C00310 C5H10O5 0.0022

±0.0013

0.0001

±0.16E-

5

4.98E-5

±9.52E-7

0.0040

±0.0039

0.0001

±2.91E-5

8.68E-5

±2.61E-5

0.0360

±0.0359

0.0032

±0.0030

nd 0.0001

±0.19E-4

β-D-Galaktofuranosa 1767 12.06 C21066 C6H12O6 0.0092

±0.0027

0.0105

±0.0048

0.1528

±0.1146

0.0537

±0.0213

0.0823

±0.0609

0.0297

±0.0072

0.1828

±0.1434

0.0290

±0.0085

0.0535

±0.0116

0.0973

±0.0477

Glikosida gula

2-O-Gliserol-α-D-galaktopiranosida

1945 13.88 NA NA nd nd 0.0030 ±0.0002

nd nd 0.0044 ±0.0011

nd nd 0.0031 ±0.0011

nd

Fruktofuranosida 1727 11.63 C03437 C6H11O6R nd nd nd nd nd 0.0022

±0.0007

nd nd nd nd

Glikosida 1854 12.96 NA NA 0.0110

±0.0078

0.0240

±0.0215

0.0019

±0.0019

0.0157

±0.0022

0.0478

±0.0436

0.0012

±0.0012

0.0346

±0.0223

0.0040

±0.0034

nd 0.0048

±0.0027

α-D-Glukopiranosida 2036 14.76 NA NA 2.0146 ±0.6576

1.2578 ±0.0326

2.7219 ±0.3001

2.9543 ±0.4251

1.1327 ±0.4125

3.1362 ±0.3348

3.4070 ±0.3607

1.6432 ±0.7174

2.1855 ±0.5838

3.5924 ±0.6151

α-D-Manopiranosida 1901 13.43 NA NA nd

nd

nd nd 0.0034

±0.0016

nd nd nd nd nd

β-D-Manopiranosida NA 13.65 NA NA nd

nd

nd nd nd nd nd nd 4.51E-5

±3.49E-3

nd

Alkohol gula

Arabinitol 1688 11.20 C01904 C5H12O5 0.0039 ±0.0006

0.0070 ±0.0018

nd nd nd 0.0011 ±0.0001

nd 0.0101 ±0.0051

0.0047 ±0.0013

nd

Inositol 1823 12.66 C00137 C6H12O6 nd

nd

0.0050

±0.0010

0.0079

±0.0066

0.0022

±0.0004

0.0016

±0.0007

0.0089

±0.0075

nd 0.001 ±0 0.0098

±0.0079 myo-Inositol 1842 12.85 C00137 C6H12O6

0.0103

±0.0016

0.0114

±0.0030

nd 0.1427

±0.0117

0.0109

±0.0001

nd nd 0.0535

±0.0478

nd 0.1423

±0.0329

bersambung…

160

…sambungan

Pentitol 1547 9.62 NA NA nd nd

nd 0.0009 ±0.0004

nd nd nd nd nd nd

Ribitol 1755 11.91 C00474 C5H12O5

nd

nd

0.2415

±0.0914

0.1449

±0.0472

0.3412

±0.0609

0.1494

±0.1105

0.6079

±0.1660

0.2293

±0.1351

0.4267

±0.0754

0.3594

±0.0645 Xilitol 1696 11.29 C00379 C5H12O5

nd

nd

nd nd 0.0047

±0.0022

0.0009

±0.0001

nd nd nd nd

Asid gula

Asid 2,3,4-trihidroksibutanoik

1573 9.91 C01620 NA nd nd

0.0003 ±0.0001

nd nd nd 0.0070 ±0.0033

0.0039 ±0.0021

nd nd

Asid D-glukuronik 1933 13.77 C16245 C6H10O7 nd

nd

nd 0.0034

±0.0010

nd nd nd nd nd nd

Asid galakturonik 1909 13.53 C08348 C6H10O7 0.0031

±0.0012

0.0048

±0.0014


Asid L-treonik 1573 9.91 C01620 NA nd

nd

nd 0.0190

±0.0018

nd 0.0096

±0.003

0.0031

±0.003

Asid ribonik 1724 11.59 C01685 C5H10O6 0.0061±

0.0011

0.0060

±0.0006

0.0046

±0.0010

0.0017

±0.0005

0.0068

±0.0009

0.0095

±0.0056

0.0116

±0.0054

Asid organik

Asid 3-butenoik 2018 14.59 NA NA nd 0.50E-4

±0.10E-4


Asid butanadioik 1586 10.02 NA NA nd nd nd nd nd 0.0044

±0.0041

nd nd nd nd

Asid malik 1503 9.12 C00711 C4H6O5 0.1334

±0.0154

0.1854

±0.1325

0.0660

±0.0195

0.3674

±0.0441

0.1509

±0.0445

0.0426

±0.0034

0.2062

±0.0373

0.0756

±0.0114

0.0432

±0.0097

0.1864

±0.0215

Asid propanoik 1670 10.98 C00163 C3H6O2 nd 0.0012 ±0.0007


Asid sitrik 1747 11.85 C00158 C6H8O7 0.0424

±0.0050

0.0379

±0.0013

0.2946

±0.0574

0.0680

±0.0296

0.0276

±0.0184

0.7173

±0.4066

0.0696

±0.0265

0.0294

±0.0083

0.1962

±0.0971

0.1257

±0.0290 Asid L-(+)-tartarik 1632 10.57 C00898 C4H6O6 0.0124

±0.0029

0.0150

±0.0047

nd nd 0.0161

±0.0025

0.0052

±0.0007

nd nd 0.0068

±0.0014

nd

Alkohol

2,3-Butanadiol 1695 11.28 NA NA 0.0002 ±0.42E-

4

0.0005 ±0.24E-

4

nd nd nd 0.0008 ±0.0003

nd nd 0.0008 ±0.0003

nd

bersambung…

161

…sambungan

Sebatian aromatik

2H-1-Benzopiran 2170 15.99 C05851 C9H6O2 nd 0.0665 ±0.0648

nd 0.0030 ±0.0012

0.0094 ±0.0035

nd 0.0360 ±0.0265

0.0670 ±0.0451

0.0043 ±0.0011

0.0208 ±0.0162

Aldehid

Butanal 1669 10.99 C01412 C4H8O 0.0052

±0.0016

0.0062

±0.0016

0.0033

±0.0021

0.0013

±0.0001

nd 0.0116

±0.0042

0.0051

±0.0023

0.0057

±0.0026

nd 0.0008

±0.0002

Lain-lain

3,8-Dioksa-2,9-

disiladekana

1698 11.31 NA NA 0.0283

±0.0270

0.0535

±0.0483

0.0008

±0.0003

nd 4.81E-5

±3.11E-6

0.0012

±0.0011

0.0021

±0.0009

0.0122

±0.0110

0.0080

±0.0072

0.0007

±0.0002

Asid β-hydroksipiruvik

1781 12.20 NA NA nd nd

nd 0.0149 ±0.0075

nd nd nd 0.0192 ±0.0053

nd nd

Asid akrilik 1786 12.27 C00511 C3H4O2 nd

nd

nd 0.0002

±0.0001


±0.0074

Benzena 1717 11.48 C01407 C6H6 nd

nd

nd 0.0032

±0.0015


±0.0036 Butana 1718 11.49 C21390 C4H10 nd

nd

nd nd 0.0088

±0.0027

nd nd nd 0.0463

±0.0405

nd

Gliserol 1743 11.80 NA NA nd nd

nd 0.6271 ±0.0551

0.1480 ±0.0916

0.3880 ±0.0612

nd nd nd nd

Isoxantopterin 2160 15.90 C03975 C6H5N5O2 nd

nd

0.0004

±2.87E-5

nd nd nd nd nd nd nd

Timol-β-D-

glukopiranosida

2107 15.41 NA NA nd 0.0033

±0.0005


Sampel perikarpa, isi dan biji manggis diekstrak menggunakan metanol/kloroform/air (3:1:1) diikuti dengan derivatisasi menggunakan BSTFA

dan analisis GC-MS. Singkatan; NA: not available, nd: not detected, RI: indeks penahanan, RT: masa penahanan, SE: ralat piawai, P0: peringkat

0, P2: peringkat 2, P4: peringkat 4, P6: peringkat 6, P: perikarpa, I: isi dan B: biji

162

LAMPIRAN J

SENARAI METABOLIT VIP ≥1.00 YANG DIKENALPASTI DARIPADA ANALISIS

GC-MS

Metabolit Nilai VIP

Perikarpa Isi Biji

2,3-Butanadiol <1.0000 1.02671 <1.0000

2H-1-Benzopiran 1.71637 1.26655 1.03095

2-O-Gliserol-α-D-galaktopiranosida <1.0000 1.0702 <1.0000

3,8-Dioksa-2,9-disiladekana <1.0000 <1.0000 1.07473

Arabinitol <1.0000 1.21167 1.06832

Arabinofuranosa 1.43809 <1.0000 1.39332

Arabinosa <1.0000 <1.0000 1.06021

Asid 2,3,4-trihidroksibutanoik 1.26365 <1.0000 1.34116

Asid akrilik <1.0000 <1.0000 1.08178

Asid butanadioik <1.0000 1.17013 <1.0000

Asid D-glukuronik <1.0000 <1.0000 1.32779

Asid galakturonik 1.32746 1.15198 1.04152

Asid L-(+)-tartarik 1.45959 1.32496 1.15091

Asid L-treonik <1.0000 <1.0000 1.04939

Asid propanoik 1.29178 <1.0000 <1.0000

Asid ribonik <1.0000 1.36171 <1.0000

Asid β-hydroksipiruvik 1.45681 <1.0000 1.42346

Benzena <1.0000 <1.0000 1.41219

Butanal <1.0000 1.31653 <1.0000

D-Manosa 1.29544 <1.0000 <1.0000

D-Xilopiranosa 1.02267 <1.0000 <1.0000

Fruktofuranosida <1.0000 1.34226 <1.0000

Galaktopiranosa 1.08147 <1.0000 1.22018

Glikosida <1.0000 1.04245 <1.0000

Gliserol 1.06717 <1.0000 <1.0000

Inositol <1.0000 1.04002 <1.0000

Isoxantopterin <1.0000 1.00741 <1.0000

L-Fukosa <1.0000 1.31399 1.25727

L-Mannopiranosa 1.2207 <1.0000 <1.0000

Myo-Inositol <1.0000 1.26765 1.71162

Pentitol <1.0000 <1.0000 1.16014

Timol-α-D-glukopiranosida 1.55706 <1.0000 <1.0000

Xilitol <1.0000 1.24333 <1.0000

Hasil analisis VIP diperoleh melalui analisis PLS-DA yang dijalankan secara

berasingan bagi tisu perikarpa, isi dan biji manggis

163

LAMPIRAN K

SENARAI METABOLIT DARIPADA ANALISIS PEMPROFILAN MENGGUNAKAN LC-MS

Metabolit RT:m/z Formula

kimia

ID

KEGG Δppm

Ketinggian puncak relatif (purata) ± SE

P0 P2 P4 P6

P I B P I B P I B

Piawai dalaman

(naringenin)

4.86min:

271.060m/z

C15H12O5 C00509 4ppm 0.9702

±0.1347

0.9861

±0.3362

0.6708

±0.203

1.0108

±0.0621

1.0108

±0.0698

1.1399

±0.0106

0.97

±0.0744

1.0739

±0.0437

1.0222

±0.0416

0.9814

±0.0394

Asid organik

Asid 2-butinaioik 10.76min:

112.985m/z

C4H2O4 C03248 26ppm nd 0.0469

±0.0141

0.0174

±0.0093

nd nd nd nd 0.0469

±0.0149

0.0453

±0.0205

0.0383

±0.0207

Asid 3-propilmalik 4.26min: 175.059m/z

C7H12O5 C02123 12ppm nd 0.0136 ±0.0062

nd nd nd nd nd nd nd 0.0113 ±0.0028

Asid kuinik 2.15min:

191.054m/z

C7H12O6 C00296 11ppm nd nd 0.1563

±0.0761

nd nd nd 0.2124

±0.103

0.1413

±0.0339

nd nd

Asid maleik 2.47min:

115.005m/z

C4H6O5 C00149

0.0985

±0.0158

0.0898

±0.0077

0.065

±0.008

0.1099

±0.0203

0.1224

±0.0085

0.0804

±0.0042

0.0719

±0.0118

0.0722

±0.0133

0.0973

±0.0083

0.0940

±0.0096

Isositrat 2.80min: 191.019m/z

C6H8O7 C00313 9ppm 0.0546 ±0.0221

0.0687 ±0.0053

nd nd 0.0123 ±0.0012

0.3251 ±0.2482

0.0715 ±0.0318

0.0566 ±0.0347

nd 0.0633 ±0.0125

Asid amino dan terbitan

(S)-N-[3-(3,4-

Metilenadioksifenil)-2-(asetiltio)metil-1-

oksooprolil]-(S)-alanina

benzil ester

2.61min:

499.164m/z

C25H28N20O7S C01316 19ppm nd 0.0389

±0.0113

nd nd nd nd nd nd nd 0.0471

±0.0051

Asid aspartik 1.81min:

132.031m/z

C4H7NO4 C16433

0.0955

±0.0234

nd nd 0.0923

±0.0173

0.1099

±0.0134

0.0793

±0.0398

0.0722

±0.0394

nd 0.0838

±0.0237

nd

Asn-Trp-OH 2.19min: 425.106m/z

C20H18N4O7 NA 10ppm nd nd nd 0.0295 ±0.0127

0.0363 ±0.0112

nd nd nd nd nd

Phe-His-OH 2.94min:

409.112m/z

C20H18N4O6 NA 8ppm nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0230

±0.0044 S-Adenosilhomosisteina 2.10min:

383.117m/z

C14H20N6O5S C00021 7ppm 0.0132

±0.0055

0.2310

±0.0733

nd 0.0219

±0.0077

nd 0.0750

±0.027

0.0909

±0.0278

0.0385

±0.0239

nd 0.2271

±0.0551

Temokaprilat 2.27min: 447.100m/z

C21H24N2O5S2 C11373 12ppm nd nd nd 0.029 ±0.0106

0.0324 ±0.0087

nd nd 0.0239 ±0.001

0.0209 ±0.0041

nd

bersambung…

164

…sambungan

Gula

Sukrosa 2.17min: 341.106m/z

C12H22O11 C00089 8ppm nd nd nd nd nd nd 0.0205 ±0.0141

0.0242 ±0.0123

nd 0.0437 ±0.0014

β-D-Xilopiranosil-(1-

>4)-α-L-ramnopiranosil-

(1->2)-L-arabinosa

6.77min:

427.145m/z

C16H28O13 NA 1ppm nd nd nd nd nd nd 0.009

±0.0053

nd nd 0.0158

±0.004

Asid gula

3-Deoksi-D-mano-

oktulosonat

2.78min:

237.060m/z

C8H14O8 C01187 6ppm nd nd 0.0177

±0.0055

nd nd 0.0207

±0.0067

nd 0.0179

±0.0021

nd 0.0269

±0.0084 Asid glukoheptonik 1.72min:

225.061m/z

C7H14O8 NA 2ppm 0.0911

±0.0163

0.0879

±0.0151

0.1010

±0.0152

0.1414

±0.0182

0.1488

±0.0106

0.1143

±0.0083

0.0994

±0.0121

0.1228

±0.0223

0.1022

±0.009

0.0801

±0.0258

D-Glukarat 2.58min: 209.032m/z

C6H10O8 C00818 8ppm 0.0491 ±0.0182

0.0971 ±0.0064

0.0611 ±0.0157

0.0553 ±0.0121

0.0764 ±0.0121

0.0979 ±0.0248

0.084 ±0.0252

0.1138 ±0.0449

0.0728 ±0.0048

0.1069 ±0.0223

Fosfat gula

D-Glukosa 6-fosfat 5.93min: 259.022m/z

C6H13O9P C00103 1ppm nd 0.0268 ±0.0047

nd nd 0.0341 ±0.0089

nd nd nd nd 0.0148 ±0.0029

Glikosida

Asid L-askorbik-2-

glukosida

2.61min:

337.085m/z

C12H18O11 C18339 21ppm nd nd nd nd 0.0064

±0.0014

0.0138

±0.0049

nd 0.0070

±0.0018

nd 0.0114

±0.0024

Lusitanikosida 1.85min: 441.184m/z

C21H30O10 C10474 16ppm nd nd nd nd 0.0108 ±0.0043

nd nd nd nd nd

Asid lemak

1-(3-Metilbutanoil)-6-

apiosilglukosa

9.55min:

395.163m/z

C16H28O11 NA 18ppm nd 0.2566

±0.0748

nd nd nd 0.0778

±0.0603

nd nd nd 0.2970

±0.1436 Egonol-2ʼʼʼ-metil

butanoat

12.60min:

409.168m/z

C24H26O6 NA NA nd nd nd nd nd nd nd 0.1586

±0.1051

nd nd

bersambung…

165

sambungan…

Aldehid

2-Hidroksi-5-karboksimetilmukonat

semialdehid

4.99min: 199.023m/z

C8H8O6 C04642 9ppm nd 0.0170 ±0.0055


Fenolik

(2S,2''S,3S,3''R,4S)-

3,4',5,7-Tetrahidroskiflavan(2-

>7,4->8)-3,4',5,7-

tetrahidroksiflavan

4.86min:

543.127m/z

C30H24O10 NA 4ppm 0.9702

±0.1347

1.0666

±0.1072

0.6708

±0.203

1.0108

±0.0621

1.0108

±0.0698

1.1349

±0.0106

0.970

±0.0911

1.0739

±0.0437

1.0222

±0.0416

0.9814

±0.0394

(3'R,4'R)-3'-

Epoksiangeloiloksi-4'-

asetoksi-3',4'-dihidroseselin

2.06min:

401.123m/z


±0.001

nd nd nd nd 0.0144

±0.0041

2,4,6-

Trihidroksibenzofenon

4.47min:

229.048m/z

C13H10O4 C06356 11ppm nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0298

±0.0032 3-Glukosil-2,3',4,4',6-

pentahidroksibenzofenon

1.79min:

423.089m/z

C19H20O11 NA 10ppm nd 0.0432

±0.0158

nd nd nd nd 0.0293

±0.0135

nd nd 0.0506

±0.0006

3'-Glukosil-2',4',6'-trihidroksiasetofenon

1.80min: 329.091m/z

C14H18O9 NA 9ppm nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0172 ±0.0045

nd

4',5,6,7-

Tetrametoksiflavon

12.52min:

341.100m/z

C19H18O6 C14472 8ppm nd 0.0142

±0.0039

nd nd 0.0034

±0.0007

0.0105

±0.0041

0.0407

±0.0222

0.016

±0.013

nd 0.0261

±0.0033 4'-Metil-(-)-

epigalokatesin 3'-

glukuronida

2.22min:

495.112m/z

C22H24O13 NA 4ppm 0.0219

±0.0107

0.0213

±0.0054

nd nd 0.0176

±0.0064

0.0141

±0.0051

nd nd 0.0111

±0.0006

0.0276

±0.0094

5,7,3',5'-Tetrahidroksi-

3,6,8,4'-

tetrametoksiflavon 3'-

glukosida

2.38min:

567.130m/z

C25H28O15 NA 8ppm nd 0.0418

±0.0215

nd nd 0.0117

±0.0035

nd nd nd 0.0094

±0.0011

0.0221

±0.0067

5,7,3''-Trihidroksi-3,5''-

dimetoksi-2''-(3''-metilbut-2-enil)flavon

2.26min:

397.128m/z

C22H22O7 NA NA nd nd nd 0.0926

±0.0350

0.0876

±0.0159

0.0225

±0.0142

nd nd 0.1226

±0.0356

nd

5,7,3'-Trihidroksi-6,4',5'-

trimetoksiflavanon

13.97min:

361.096m/z

C18H18O8 NA 8ppm nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0978

±0.0093 5-

Karboksipiranopelargoni

din 3-O-β-glukopiranosida

8.56min:

499.103m/z

C24H20O12 NA 29ppm nd 0.0050

±0.0013


bersambung…

166

…sambungan

7-Hidroksi-2-metil-4-okso-4H-1-benzopiran-

asid 5-karboksilik 7-

glukosida

3.39min: 381.082m/z

C17H18O10 NA 1ppm nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0216 ±0.0033

nd

Asid klorogenik 2.32min:

353.086m/z

C16H18O9 C00852 5ppm 0.1361

±0.1173

0.1657

±0.0255

0.1204

±0.0337

0.2049

±0.0641

0.2518

±0.044

0.1241

±0.0106

0.0846

±0.0433

0.186

±0.0918

0.3294

±0.0600

0.1597

±0.0410

Betagarin 13.56min: 327.085m/z

C18H16O6 C09479 7ppm nd nd nd 0.0066 ±0.0025

0.0093 ±0.0011

nd nd nd nd 0.0096 ±0.0062

Bis-N-butil ftalat 8.59min:

466.185m/z

C22H29NO10 NA 28ppm nd 0.0409

±0.0009

0.0253

±0.0004

0.0143

±0.0056

0.0146

±0.0077

0.0181

±0.0067

0.0253

±0.0094

0.0217

±0.0121

nd 0.0390

±0.0013

Deoksigomisin A 7.33min:

399.179m/z

C23H28O6 C10555 5ppm nd 0.0261

±0.0110

0.0051

±0.0030

nd 0.0056

±0.0022

0.0094

±0.0046

0.0090

±0.0025

0.0115

±0.0073

nd 0.0169

±0.0031 Didimokaliksin B 2.20min:

469.131m/z

C28H22O7 NA 3ppm nd nd nd nd 0.0115

±0.0024

nd 0.0066

±0.0009

nd 0.0063

±0.0009

0.0130

±0.005

Dikafeoilputressina 7.36min: 411.154

m/z

C22H24N2O6 NA 5ppm nd nd nd nd 0.0095 ±0.0045

nd nd nd 0.0045 ±0.0011

nd

Disenasionyl cis-kelaktona

6.89min: 425.157m/z

C24H26O7 NA 8ppm nd 0.0360 ±0.0098

0.0089 ±0.0032

nd 0.0092 ±0.0031

0.0129 ±0.0055

0.0110 ±0.0024

nd nd 0.0387 ±0.0066

Epirobinatinidol-(4β,8)-

katesin

1.93min:

577.130m/z

C30H26O12 NA NA nd 0.2512

±0.0639

nd nd nd 0.1635

±0.0766

0.1578

±0.0818

0.1541

±0.0994

0.1128

±0.0173

nd

Floretin 2.36min:

273.074m/z

C15H14O5 C00774 10ppm nd 0.0097

±0.0008


Ginketin 4.85min: 565.104

m/z

C32H22O10 C10048 15ppm 0.0069 ±0.0012

0.0063 ±0.0021

0.0046 ±0.0019

0.0064 ±0.0012

nd 0.0046 ±0.0019

nd 0.0048 ±0.0006

nd 0.0042 ±0.0007

Kapparilosida B 8.59min: 495.159m/z

C22H28N2O11 NA 6ppm nd 0.0154 ±0.0055

nd nd 0.0170 ±0.0057

0.0195 ±0.0029

0.0344 ±0.0098

nd nd 0.0144 ±0.0043

Kerkosporin 2.22min:

533.153m/z

C29H26O10 C10309 14ppm 0.0218

±0.0091

nd nd nd 0.0183

±0.0035

0.0118

±0.0048

0.0150

±0.007

0.0126

±0.004

0.0208

±0.0048

nd

Khelol glukosida 2.17min:

407.099m/z

C19H20O10 C09011 1ppm nd nd nd 0.0171

±0.0052

0.0103

±0.0019

nd nd nd 0.0053

±0.001

nd

Kolaflavanona 2.73min: 587.124m/z

C31H24O12 C09761 7ppm nd 0.0143 ±0.0061


Kuersetin 3,3'-dimetil

eter 4'-glukosida

11.51min:

509.135m/z

C23H26O13 NA 9ppm 0.0196

±0.005

0.0209

±0.0046


Leufolin A 2.20min:

579.148m/z

C30H28O12 NA NA 0.1002

±0.0531

0.2637

±0.0926

nd nd 0.1336

±0.0251

nd nd nd 0.1780

±0.053

0.3545

±0.0202

Metilofiopogonona B 11.51min: 325.109m/z

C19H18O5 C17475 2ppm 0.0276 ±0.0077

0.0189 ±0.0059

0.0474 ±0.0062

0.0548 ±0.0210

0.0117 ±0.0018

0.0314 ±0.0174

0.0620 ±0.0151

0.0684 ±0.0081

0.0375 ±0.0116

nd

bersambung…

167

…sambungan

Neoisostegana 17.53min: 413.157m/z

C23H26O7 C10707 8ppm nd 0.2777 ±0.0868

0.0478 ±0.0354

0.0370 ±0.0201

0.0667 ±0.0294

nd 0.0978 ±0.0216

nd nd 0.3509 ±0.0101

Okrokarpin E 18.14min:

407.147m/z

C24H24O6 NA NA nd 0.2140

±0.0078

0.0843

±0.0426

nd nd 0.0877

±0.0604

nd nd nd 0.1391

±0.0144 Prunin 6''-O-galat 2.44min:

585.126m/z

C28H26O14 NA 1ppm nd 0.0184

±0.0025

nd 0.0127

±0.0077

0.0186

±0.0059

nd nd nd 0.0278

±0.0055

0.0213

±0.0032

Sebatian WIN VIII 2.10min: 471.114m/z

C21H26Cl2N2O

6

C06491 9ppm nd nd nd nd 0.0119 ±0.0031

nd nd nd nd nd

Soiuflavon A 2.71min:

385.059m/z

C19H14O9 NA 6ppm nd 0.0933

±0.0263

0.0316

±0.0118

nd 0.0275

±0.0114

nd 0.0520

±0.027

nd nd 0.1024

±0.0104 Torvanol A 2.35min:

451.063m/z

C24H16O7 NA 16ppm nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0066

±0.0024

0.0096

±0.0028

Xanton

1,3,5-Trihidroksixanton 7.55min:

243.028m/z

C13H8O5 C10094 7ppm nd nd nd 0.0046

±0.0033

nd nd nd nd 0.0058

±0.0018

nd

1,3,7-Trihidroksi-2,4-

diisoprenilxanton

13.13min:

379.152m/z C23H24O5 NA NA 0.0551

±0.0101

0.1035

±0.0120

0.0620

±0.0083

0.0467

±0.0300

0.0479

±0.0082

0.0466

±0.021

0.0419

±0.0070

0.0986

±0.0174

0.0429

±0.008

0.0637

±0.0162

Astikolorin B 1.86min:

535.173m/z

C33H28O7 NA 6ppm nd nd nd 0.0099

±0.0048

nd nd nd nd nd nd

Gartanin 15.47min:

395.152m/z


±0.0142

nd nd 0.0584

±0.0268

nd nd

Kratoksiarborenon C 16.45min: 423.178m/z

C25H28O6 NA NA nd 0.1537 ±0.0434

0.0563 ±0.0137

0.0201 ±0.0034

0.0612 ±0.0253

0.0863 ±0.0479

0.0374 ±0.0117

0.0632 ±0.0470

nd 0.1435 ±0.0071

Mangostenona B 9.84min:

461.194m/z

C28H30O6 NA 6ppm nd nd nd nd 0.0111

±0.0032

nd nd nd nd nd


409.162m/z

C24H26O6 C10080 8ppm 0.1082

±0.0225

0.1834

±0.0119

0.1258

±0.0682

0.1049

±0.0195

0.1427

±0.0106

nd 0.1174

±0.0413

0.0380

±0.0145

0.1150

±0.0374

0.1625

±0.0081

Terpenoid

Asid (+)-absisik 2.93min: 263.126m/z

C15H20O4 C06082 10ppm 0.0079 ±0.0039

0.0166 ±0.0082

nd 0.0097 ±0.0038

0.0147 ±0.0039

nd nd nd 0.0055 ±0.0019

0.0205 ±0.0037

Giberelin A3 6.29min:

345.131 m/z

C19H22O6 C01699 9ppm nd 0.0464

±0.0152

0.0172

±0.0074

nd 0.0142

±0.0046

0.0285

±0.0122

0.0226

±0.0106

nd nd 0.0613

±0.0067

Ginggolida C 2.22min:

439.118m/z

C20H24O11 C07603 14ppm nd 0.0108

±0.0031

0.0084

±0.0027

nd 0.0145

±0.0092

nd 0.0218

±0.0155

nd 0.0133

±0.0065

0.0352

±0.0047 Katalposida 2.17min:

481.132m/z

C22H26O12 C09775 6ppm 0.0555

±0.0111

0.3092

±0.0989

0.0986

±0.0512

nd 0.1013

±0.0438

0.1794

±0.0856

0.1570

±0.0814

nd 0.1377

±0.0574

0.3287

±0.0133

bersambung…

168

…sambungan

Malotokromena 7.36min: 441.154m/z

C24H26O8 C09013 7ppm nd 0.0460 ±0.0139

0.0330 ±0.0252

0.0223 ±0.0156

0.0210 ±0.0043

0.0251 ±0.0076

0.0297 ±0.0028

0.0316 ±0.0181

nd 0.0411 ±0.0038

Montanol 9.54min:

351.250m/z

C21H36O4 C09137 0ppm nd nd nd nd nd nd 0.0193

±0.007

nd nd 0.0228

±0.0113 Salvinorin A 4.24min:

431.167m/z

C23H28O8 C20196 9ppm 0.0056

±0.0009

nd nd nd nd nd nd nd nd nd

Alkaloid

6-Hirdoksiprotopina 1.76min: 368.100m/z

C20H19NO6 C05190 NA nd nd nd 0.0531 ±0.0283

0.0738 ±0.0223

nd nd nd 0.0854 ±0.0405

nd

11-Hidroksikantin-6-ona 2.72min:

235.046m/z

C14H8N2O2 C09212 12ppm 0.0548

±0.0173

0.0377

±0.017

0.0329

±0.0090

0.0385

±0.0095

0.0674

±0.0208

0.0456

±0.0058

0.0323

±0.0109

0.0504

±0.0250

0.054

±0.0057

0.0482

±0.0066 N-(Hidrokinkonidin-8'-

yl)-4-azido-2-hidroksibenzamida

2.68min:

595.096m/z

C26H27IN6O3 C11600 26ppm nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0056

±0.0013

Normorfin 3-glukuronida 1.59min:

446.149m/z

C22H25NO9 NA 7ppm 0.0143

±0.0042

nd nd nd 0.0178

±0.0076

nd nd nd 0.0136

±0.0027

nd

Oksinarkotina 1.61min:

430.155m/z

C22H25NO8 NA 9ppm nd nd nd 0.0092

±0.0038

0.0093

±0.0018

nd nd nd nd nd

Senampelina A 1.60min: 472.204m/z

C25H31NO8 C10388 13ppm nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0149 ±0.0045

nd

Xantina 1.85min:

151.027m/z

C5H4N4O2 C00385 5ppm nd nd nd 0.0174

±0.0077

0.0291

±0.0107

nd nd nd 0.0145

±0.0019

nd

Kuinon

Knifolona 2.50min:

433.098m/z

C24H18O8 C10365 11ppm nd 0.0122

±0.007

nd nd nd nd 0.0085

±0.0019

nd nd nd

Lain-lain

(-)-1-Metilpropil 1-propanil disulfida

1.91min: 161.047m/z

C7H14S2 NA 3ppm nd nd nd nd nd 0.0064 ±0.004

nd nd nd nd

(2Z,4'Z)-2-(5-Metiltio-4-

penten-2-inilidena)-1,6-dioksaspiro[4.4]non-3-

ena

2.70min:

233.064m/z

C13H14O2S NA 0ppm nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0086

±0.0036

bersambung…

169

…sambungan

1-(2,4-Diklorofenil)-2-(1-imidazolil)etanol

glukuronida

5.66min: 431.034m/z

C17H18Cl12N2

O7

NA 18ppm nd 0.0074 ±0.0016


1,2,10-Trihidroksidihidro-trans-

linalil oksida 7-O-β-D-

glukopiranosida

8.59min: 381.169m/z

C16H30O10 NA 19ppm nd 0.1738 ±0.0108

0.1013 ±0.02

0.0806 ±0.0372

0.0881 ±0.0316

0.1147 ±0.0282

0.1433 ±0.0089

0.1023 ±0.0339

0.0632 ±0.0367

0.1485 ±0.0047

2,2-Dimetil-3-(4-

metoksifenil)-4-propil-

2H-1-benzopiran-7-ol asetat

8.74min:

365.173m/z

C23H26O4 C15053 7ppm nd 0.0140

±0.0043

0.0094

±0.0048

nd 0.0167

±0.0079

0.0062

±0.0023

0.0127

±0.0052

0.0073

±0.0027

nd 0.0065

±0.0006

2,4-Dikhlorotoluena 1.36min: 158.978m/z

C7H6Cl2 C18300 3ppm 0.0798 ±0.0022

0.0434 ±0.0141

0.0505 ±0.0174

0.0821 ±0.0054

0.0748 ±0.0060

0.0564 ±0.0100

0.0555 ±0.0094

0.0604 ±0.0123

0.0574 ±0.0145

0.0276 ±0.0032

3,5,7-Tris(asetilloksi)-2-

[4-(asetiloksi)-3-hidroksifenil]-4H-1-

benzopiran-4-ona

12.65min:

469.078m/z

C23H18O11 NA 0ppm nd 0.0214

±0.0087


±0.0041

5-[(1,2,3,4,5,6-

Heksahidroksiheksil)oksi

]-6-hidroksi-3-metoksi-9-

metil-4,5-dihidro-7H-oxefino[2,3-

g]isokromena-2,7(3H)-

diona

2.36min:

485.132m/z C21H26O13 NA 4ppm nd nd nd nd nd nd nd 0.0241

±0.0203

nd nd

Adikardin 2.23min:

455.118m/z

C20H24O12 NA 3ppm nd 0.0095

±0.0038

nd nd 0.0068

±0.0009

nd nd nd nd nd

Asid meso-tartarik monohidrat

1.79min: 167.020m/z

C4H8O7 NA 1ppm nd nd nd 0.0351 ±0.0267

0.0262 ±0.0107

nd nd nd nd nd

cis-1,2-Dihidroski-1,2-

dihidrodibenzotiofena

4.19min:

217.035m/z

C12H10O2S C06721 9ppm 0.0703

±0.0328

0.1061

±0.0272

0.0523

±0.0199

0.1011

±0.0286

0.1610

±0.0482

0.0832

±0.0147

0.0911

±0.0596

0.0993

±0.0446

0.1490

±0.0043

0.2138

±0.0458 ES-242-4 12.53min:

577.201m/z

C32H34O10 NA 11ppm nd 0.0124

±0.0022

0.0109

±0.0007

nd nd nd nd 0.0152

±0.0033

nd 0.0063

±0.0026

Fisalin K 2.20min: 557.150m/z

C28H30O12 NA 27ppm 0.0080 ±0.0025


Melampodinin 1.72min:

521.168m/z

C25H30O12

C09501 2ppm 0.0322

±0.0031

0.0267

±0.0127

0.0388

±0.018

0.0629

±0.0083

0.0590

±0.004

0.0330

±0.0126

nd 0.0431

±0.0267

0.0335

±0.0097

0.0078

±0.0014 Piperenol A triasetat 1.77min:

509.149

m/z

C27H26O10 NA 7ppm nd nd 0.0151

±0.0075

0.0341

±0.0138

0.0210

±0.0083

nd nd 0.0080

±0.0041

0.0142

±0.0029

nd

Rodomirtoksin 16.28min:

427.175m/z

C24H28O7 NA 2ppm nd 0.4495

±0.1164

0.1648

±0.0509

0.1125

±0.0377

0.1622

±0.0589

0.3050

±0.1480

0.1870

±0.0281

0.2267

±0.1592

nd 0.5952

±0.0291

bersambung...

170

...sambungan

Rubriflordilakton B 12.10min: 461.201m/z

C28H30O6 NA NA nd nd nd nd nd nd nd 0.0668 ±0.0331

nd nd

S-(2,5-Dimetil-3-furanil)

2-furankarbotioat

3.78min:

221.028m/z

C11H10O3S NA 0ppm nd 0.0254

±0.0156


±0.0088 Sativanina B 12.58min:

517.293m/z

C30H38N4O4 C10013 21ppm nd 0.0093

±0.0027


Singkatan; NA: not available, nd: not detected, RT:m/z: masa pengekalan/nisbah jisim kepada caj, Δppm: ralat jisim molekul, SE: ralat piawai,

P0: peringkat 0, P2: peringkat 2, P4: peringkat 4, P6: peringkat 6, P: perikarpa, I: isi dan B: biji

171

LAMPIRAN L

SENARAI RT: m/z YANG TIDAK DAPAT DIKENALPASTI DARIPADA ANALISIS LC-MS

RT: m/z

Formula

kimia yang

dicadangkan

Ketinggian puncak relatif (purata) ±SE

P0

P2 P4 P6

P I B P I B P I B

3.11min: 111.010m/z C5H4O3 0.0633

±0.0077

0.0256

±0.0157

0.0452

±0.0202

0.0506

±0.0069

0.0452

±0.0058

0.0368

±0.013

0.0414

±0.0203

0.0448

±0.0209

0.0422

±0.0081

0.0159

±0.0058 1.62min: 146.048m/z C5H9NO4 0.0120

±0.0045

nd nd 0.0500

±0.0152

0.0475

±0.011

nd nd nd 0.0272

±0.0064

nd

2.18min: 149.045m/z C5H10O5 nd 0.0669 ±0.0053

0.1128 ±0.0304

nd 0.0548 ±0.0219

0.0951 ±0.0136

0.1036 ±0.017

0.1551 ±0.078

0.0325 ±0.014

0.1047 ±0.0134

2.79min: 151.039m/z C8H8O3 0.0635

±0.0172


2.31min: 165.039m/z C5H10O6 nd 0.0809

±0.0043

0.0612

±0.0066

0.0328

±0.0155

0.0543

±0.016

0.0768

±0.028

0.0875

±0.0364

0.0605

±0.0185

nd 0.0967

±0.0278

3.09min: 173.010m/z C6H6O6 0.0309 ±0.0054

nd nd 0.0321 ±0.0022

0.0229 ±0.0019

0.0206 ±0.0089

nd nd 0.0235 ±0.0066

nd

1.73min: 179.056m/z C6H12O6 0.2440

±0.0416

0.2292

±0.0400

0.2730

±0.0521

0.3603

±0.0564

0.3954

±0.0307

0.3293

±0.019

0.2779

±0.0315

0.3329

±0.073

0.2616

±0.0236

0.2463

±0.0232 2.12min: 193.040m/z C6H10O7 nd nd nd nd 0.0095

±0.0040

nd 0.0422

±0.0092

nd nd nd

1.96min: 195.055m/z C6H12O7 nd nd nd 0.0387 ±0.0154

0.0279 ±0.0040

nd nd nd 0.0312 ±0.0106

nd

6.14min: 199.023m/z C8H8O6 nd 0.0053

±0.0003


2.19min: 209.062m/z C7H14O7 0.0293

±0.0022

0.0632

±0.0111

0.0376

±0.0042

0.0343

±0.0164

0.0443

±0.0032

0.0521

±0.0076

0.0526

±0.012

0.0612

±0.0036

0.0562

±0.0108

0.0610

±0.0028

1.75min: 215.034m/z C12H8O4 0.0020 ±0.0001

nd nd nd 0.0022 ±0.0002

nd nd nd nd nd

0.31min: 248.960m/z NA nd nd nd 0.0939

±0.0574

0.0085

±0.005

nd 0.0459

±0.0229

0.1441

±0.0234

0.1044

±0.0457

0.1269

±0.0663 2.23min: 267.069m/z C16H12O4 nd nd nd nd 0.0065

±0.0015

nd nd nd nd nd

1.91min: 288.976m/z NA nd nd 0.0044 ±0.0003


bersambung…

172

...sambungan

2.20min: 289.070m/z NA 0.1236 ±0.0722

0.2917 ±0.1273

0.1544 ±0.0535

0.1413 ±0.0646

0.1886 ±0.03

0.2433 ±0.0975

0.2066 ±0.1054

0.1717 ±0.0952

0.2345 ±0.0293

0.4127 ±0.004

5.44min: 292.925m/z NA nd nd nd nd 0.0443

±0.0131

nd nd nd 0.0429

±0.015

nd

1.41min: 296.880m/z NA 0.0164

±0.0072

nd 0.0121

±0.0023

nd nd nd 0.0155

±0.0016

nd nd nd

6.03min: 299.053m/z C16H12O6 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0113 ±0.0006

2.38min: 299.064m/z NA nd 0.0126

±0.0024

nd nd 0.0066

±0.0020

nd nd nd nd 0.0098

±0.0016 4.32min: 301.072m/z NA nd 0.0025

±0.0003

nd nd nd nd 0.0028

±0.0006

nd 0.0031

±0.0007

0.0039

±0.0001 1.62min: 310.148m/z NA nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0069

±0.0020

nd

8.30min: 311.126m/z NA nd 0.0088 ±0.0033


1.80min: 312.093m/z NA nd nd nd 0.0067

±0.0021

nd nd nd nd nd nd

7.53min: 315.120m/z NA nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0139

±0.0083

7.05min: 315.121m/z NA nd 0.0059 ±0.0012


6.35min: 317.055m/z NA nd nd nd 0.0871

±0.0274

0.0833

±0.0324

nd nd nd nd nd

2.56min: 325.056m/z C14H14O9 nd nd nd nd nd 0.0050

±0.002

nd 0.0052

±0.0028

nd nd

2.21min: 335.076m/z NA 0.0427 ±0.0144

0.0848 ±0.0284

0.0440 ±0.0211

0.0459 ±0.0175

nd 0.0629 ±0.0238

0.0544 ±0.0248

nd 0.0697 ±0.0114

0.0955 ±0.0127

4.88min: 339.048m/z C18H12O7 nd nd nd nd nd nd nd 0.0063

±0.0009

nd nd

3.99min: 339.069m/z C15H16O9 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0213

±0.0044

1.66min: 341.107m/z NA 0.1228 ±0.0202

0.0860 ±0.0169

0.0952 ±0.0296

0.1091 ±0.0052

0.092 ±0.0027

0.0912 ±0.0228

0.1012 ±0.0298

0.0946 ±0.0315

0.0838 ±0.0117

0.0517 ±0.0009

8.76min: 343.078m/z NA nd 0.0077

±0.0031



±0.0034

1.73min: 359.118m/z NA 0.025 ±0.0035

nd 0.0305 ±0.0032

0.0640 ±0.0189

0.0751 ±0.0108

0.0417 ±0.0015

0.0371 ±0.0049

0.0456 ±0.0231

0.0242 ±0.0028

0.0182 ±0.0058

bersambung…

173

...sambungan

2.63min: 365.143m/z NA nd 0.1808 ±0.0588

0.0648 ±0.0332

nd 0.0446 ±0.0205

0.1088 ±0.0443

0.0855 ±0.0389

0.0945 ±0.0283

nd 0.1936 ±0.0307

2.44min: 367.101m/z NA nd 0.0108

±0.0016

0.0077

±0.0034

0.0191

±0.0098

0.0191

±0.0036

0.0097

±0.0026

nd nd 0.0342

±0.0074

0.0093

±0.0037 2.45min: 371.090m/z C23H16O5 nd 0.0083

±0.0004

nd 0.0119

±0.0026

0.0158

±0.0055

nd nd nd 0.0115

±0.0034

nd

12.90min: 375.076m/z C18H16O9 nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0076 ±0.0022

nd

7.81min: 377.140m/z C23H22O5 0.0496

±0.0316

nd nd nd nd nd nd 0.0663

±0.0271

nd nd

6.75min: 383.109m/z C21H20O7 nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0186

±0.0032 0.30min: 384.933m/z NA 0.0767

±0.0239

0.1196

±0.0266

0.0246

±0.0111

0.1305

±0.0625

nd 0.0936

±0.079

nd nd 0.0976

±0.0423

0.1359

±0.0734


7.19min: 393.134m/z C23H22O6 nd 0.0886

±0.0116

nd nd 0.0649

±0.0136

nd nd nd nd 0.0781

±0.025


±0.0035

nd nd

10.88min: 395.148m/z C23H24O6 nd 0.1564 ±0.0259

0.1660 ±0.0135


1.90min: 399.134m/z NA nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0051

±0.0007

nd

3.25min: 405.027m/z NA 0.035

±0.0012

0.0254

±0.0041

0.0246

±0.0045

0.0315

±0.0018

0.0274

±0.0046

0.0271

±0.007

0.0268

±0.0042

0.0272

±0.0074

0.0273

±0.0029

0.0211

±0.0042

12.03min: 409.042m/z NA nd 0.1241 ±0.0555


13.55min: 409.043m/z NA nd nd nd nd nd nd 0.0298

±0.0096

nd nd nd

1.37min: 410.861m/z NA nd 0.0293

±0.0045

nd 0.0121

±0.0034

nd 0.0197

±0.0099

0.0249

±0.0085

0.0276

±0.0096

nd 0.0381

±0.0044

9.19min: 411.167m/z NA nd nd nd nd nd nd 0.0028 ±0.0005

nd nd nd

2.76min: 429.088m/z NA nd 0.0174

±0.0023

nd nd 0.0057

±0.0005

nd 0.0114

±0.0042

nd nd 0.0114

±0.0026 14.31min: 433.002m/z NA nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0102

±0.0025

11.73min: 435.056m/z NA nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0107 ±0.0027

bersambung…

174

...sambungan


1.36min: 440.881m/z C3H6O25 0.0242

±0.0079

0.0128

±0.0054

nd 0.0323

±0.0085

0.0352

±0.0018

0.0114

±0.0031

0.0092

±0.0006

0.0208

±0.0086

0.0299

±0.0055

0.0082

±0.0018 2.27min: 449.105m/z NA nd 0.046

±0.0183


±0.0183

9.91min: 455.103m/z C23H20O10 nd nd 0.033 ±0.0204


1.37min: 456.856m/z NA nd nd nd nd nd 0.0028

±0.0005

nd nd nd nd

1.85min: 461.141m/z NA nd nd nd nd 0.0143

±0.0074

nd nd nd nd nd


±0.0261

nd nd

12.44min: 463.210m/z C28H32O6 nd 0.3528 ±0.0180


13.63min: 463.211m/z C28H32O6 0.2037

±0.1084

nd nd nd 0.2978

±0.1412

0.1897

±0.1648

nd 0.3458

±0.0231

nd nd

1.44min: 464.804m/z NA 0.0083

±0.0017

nd 0.0062

±0.0003

nd 0.0147

±0.0014

nd nd nd nd nd

4.92min: 471.092m/z C23H20O11 nd 0.0215 ±0.0064

nd nd nd 0.0164 ±0.0064

nd nd 0.0070 ±0.0009

0.0451 ±0.0148

2.41min: 473.098m/z C19H22O14 nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0270

±0.0088

nd

2.46min: 475.139m/z NA nd 0.0089

±0.0021

0.0067

±0.0027

nd nd 0.0105

±0.0023

nd 0.0122

±0.0061

nd nd

8.12min: 477.225m/z NA nd 0.0352 ±0.0025

nd nd nd nd nd nd 0.0115 ±0.0022

0.0373 ±0.0123

21.35min: 481.219m/z NA nd 0.0231

±0.0157


1.62min: 488.161m/z NA 0.0318

±0.022

nd 0.0121

±0.0079

0.0499

±0.0097

0.0507

±0.016

0.0136

±0.008

0.0104

±0.005

nd 0.0391

±0.0053

nd

7.99min: 493.139m/z NA nd 0.0055 ±0.0017


14.18min: 493.144m/z NA 0.0133

±0.0043


13.26min: 493.147m/z NA 0.0308

±0.0103

0.0123

±0.0031

nd nd 0.0207

±0.0088

0.0231

±0.0029

0.0145

±0.0038

0.0271

±0.0095

nd nd

1.38min: 494.821m/z NA nd nd nd nd nd 0.0032 ±0.0006

0.0051 ±0.0017

nd nd nd

bersambung…

175

...sambungan

2.19min: 499.143m/z NA 0.0158 ±0.0044

0.0193 ±0.0055

nd 0.0159 ±0.0055

nd nd nd nd 0.0248 ±0.004

0.0224 ±0.0092

13.85min: 503.047m/z C19H22O14 nd 0.1220

±0.0557


±0.0109 12.08min: 505.134m/z NA nd 0.2259

±0.0854

nd nd nd nd 0.0865

±0.0579

nd nd 0.3409

±0.0255

9.63min: 509.170m/z C24H30O12 nd nd 0.0211 ±0.0132

nd 0.0177 ±0.008

nd nd 0.0145 ±0.0012

nd nd


±0.0063 2.31min: 519.136m/z NA nd nd 0.0109

±0.0027

0.0094

±0.0055

nd 0.0247

±0.0109

nd nd 0.0208

±0.0038

nd

0.30min: 520.907m/z NA 0.0235

±0.0061

0.1781

±0.0552

nd 0.1009

±0.0554

nd 0.1128

±0.0945

nd 0.1208

±0.0038

0.2035

±0.0853

0.1310

±0.0625

11.11min: 521.128m/z NA nd 0.0493 ±0.0158


10.54min: 523.148m/z C24H28O13 nd 0.0587

±0.0136

nd nd 0.0266

±0.0084

nd nd nd nd 0.0588

±0.0484

10.77min: 523.149m/z C24H28O13 nd nd nd nd nd nd nd nd 0.0531

±0.0377

0.0382

±0.0178

13.76min: 523.160m/z C24H28O13 nd nd nd nd nd nd nd 0.0124 ±0.0008

nd nd

2.70min: 529.116m/z NA nd 0.0254

±0.0073

nd nd nd nd 0.0085

±0.0016

nd nd 0.0305

±0.0042 2.29min: 529.150m/z NA nd 0.0434

±0.0085

nd 0.0227

±0.0093

0.0442

±0.0086

0.0317

±0.0110

nd nd 0.0533

±0.0072

0.0503

±0.0087

2.37min: 531.172m/z NA nd nd nd 0.0632 ±0.0312

0.0624 ±0.0120

nd nd nd 0.0504 ±0.0143

nd

2.12min: 539.161m/z NA nd nd nd 0.0215

±0.0106

nd nd nd nd nd nd

4.90min: 542.700m/z NA nd 0.0047

±0.0005


±0.0002

4.83min: 543.602m/z NA nd nd nd 0.0018 ±0.0001

nd nd nd nd nd nd

4.88min: 543.736m/z NA nd nd nd nd nd 0.0021

±0.0001

nd nd nd nd

2.29min: 545.140m/z NA nd 0.0142

±0.0053


1.75min: 548.164m/z NA nd nd nd 0.0807 ±0.0484

0.1142 ±0.0294

nd nd nd 0.1435 ±0.0567

nd

bersambung...

176

...sambungan

1.46min: 548.765m/z NA 0.0148 ±0.0094

nd 0.0051 ±0.0013

nd nd nd nd nd 0.0139 ±0.0027

nd

1.56min: 549.164m/z NA nd nd 0.0509

±0.0244

nd nd 0.0521

±0.0300

nd nd nd nd

3.10min: 575.068m/z NA nd 0.0423

±0.0204


±0.0078

2.49min: 577.117m/z C26H26O15 nd 0.0168 ±0.0114

nd nd 0.0374 ±0.0183

0.0199 ±0.0078

nd 0.0462 ±0.0311

0.0801 ±0.0163

nd

1.45min: 578.780m/z NA 0.0033

±0.0007

nd nd 0.0047

±0.0015

nd nd nd 0.0046

±0.0022

nd nd

0.28min: 588.386m/z NA nd 0.0030

±0.0001


0.30min: 588.894m/z NA 0.0645

±0.0347

0.2449

±0.0773

0.0573

±0.0217

0.1938

±0.0981

nd 0.1253

±0.1146

nd 0.1793

±0.0395

0.2001

±0.074

0.1518

±0.0755

Singkatan; NA: not available, nd: not detected, RT: m/z: masa pengekalan/nisbah jisim kepada caj, SE: ralat piawai, P0: peringkat 0, P2:

peringkat 2, P4: peringkat 4, P6: peringkat 6, P: perikarpa, I: isi dan B: biji

177

LAMPIRAN M

SENARAI METABOLIT VIP ≥1.00 YANG DIKENALPASTI DARIPADA ANALISIS LC-

MS

Metabolit Nilai VIP

Perikarpa Isi Biji

1-(3-Methilbutanoil)-6-apiosilglukosa 1.12931 1.27451 1.12448

1,2,10-Trihidroksidihidro-trans-linalil oksida 7-O-β-D-

glukopiranosida

1.51751 1.29611 1.4

3-Deoksi-D-mano-oktulosonat <1.0000 1.00969 1.06739

3-Glukosil-2,3',4,4',6-pentahidroksibenzofenon 1.07218 <1.0000 <1.0000

4',5,6,7-tetrametoksiflavon 1.12453 1.02161 <1.0000

4'-Metil-(-)-epigallokatesin 3'-glukuronida <1.0000 <1.0000 1.11301

4'-Metil-(-)-epigalokatesin 3'-glukuronida 1.44954 1.04659 <1.0000

5,7,3',5'-Tetrahidroksi-3,6,8,4'-tetrametoksiflavon 3'-glukosida <1.0000 <1.0000 1.00073

5,7,3''-Trihidroksi-3,5''-dimetoksi-2''-(3''-metilbut-2-enil)flavon 1.45244 1.33455 1.1956

5,7,3'-Trihidroksi-6,4',5'-trimetoksiflavanon 1.13037 <1.0000 <1.0000

6-Hirdoksiprotopina 1.32476 1.09169 1.1614

Asid (+)-absisik 1.13699 <1.0000 <1.0000

Asid 2-butinaioik <1.0000 1.1553 1.19344

Asid aspartik 1.16767 1.29377 1.41129

Asid kuinik 1.66858 1.46978 1.34523

Asid L-askorbik-2-glukosida <1.0000 1.07745 <1.0000

Asid meso-tartarik monohidrat 1.15247 <1.0000 <1.0000

Asn-Trp-OH 1.23167 <1.0000 1.06549

Astikolorin B 1.0284 <1.0000 <1.0000

Betagarin 1.05328 <1.0000 <1.0000

Bis-N-butil ftalat 1.22691 1.04549 1.08318

D-Glukosa 6-fosfat <1.0000 <1.0000 1.11795

Egonol-2ʼʼʼ-methil butanoat <1.0000 <1.0000 1.28981

Epirobinatinidol-(4B,8)-katesin <1.0000 <1.0000 1.02772

Epirobinatinidol-(4β,8)-katesin 1.61963 1.60707 1.29106

ES-242-4; (3S,3'S,4S,4'S)-7,7',9,9'-Tetrametoksi-3,3'-dimethil-

3,3',4,4'-tetrahidro-1H,1'H-5,5'-bibenzo[g]isokromena-4,4',10,10'-

tetrol

<1.0000 1.16066 <1.0000

Fisalin K 1.18992 1.07734 1.12707

Gartanin <1.0000 <1.0000 1.14031

Giberelin A3 1.08035 <1.0000 1.04643

Ginggolida C <1.0000 1.12489 <1.0000

Ginketin 1.03386 <1.0000 <1.0000

Isositrat 1.38553 1.50386 <1.0000

bersambung…

178

…sambungan

Kapparilosida B 1.21159 1.17351 <1.0000

Katalposida 1.46243 <1.0000 1.30734

Kerkosporin 1.39716 1.00982 <1.0000

Khelol glukosida 1.16356 <1.0000 <1.0000

Knifolona 1.20702 <1.0000 <1.0000

Kratoksiarborenon C 1.32224 1.11708 1.23074

Kuersetin 3,3'-dimetil eter 4'-glukosida 1.38718 1.24299 1.25744

Leufolin A 1.76537 1.25161 1.34603

Malotokromena 1.21588 <1.0000 1.13964

α-Mangostin <1.0000 1.54842 <1.0000

Melampodinin 1.3265 <1.0000 <1.0000

Metilofiopogonona B 1.20605 <1.0000 <1.0000

Montanol 1.0566 <1.0000 <1.0000

Neoisostegana 1.43061 1.27132 1.24587

Normorfin 3-glukuronida 1.31938 1.0201 1.13516

Okrokarpin E 1.17273 1.17297 1.11429

Oksinarkotina 1.01395 <1.0000 <1.0000

Piperenol A triasetat 1.28562 1.16886 1.0347

Prunin 6''-O-galat 1.20252 <1.0000 1.03433

Rodomirtoksin 1.61988 1.25501 1.43955

Rubriflordilakton B <1.0000 <1.0000 1.153

S-Adenosilhomosisteina <1.0000 1.34453 1.0694

Salvinorin A <1.0000 1.03541 <1.0000

Shoiuflavon A 1.19691 1.29996 1.12982

Sukrosa <1.0000 <1.0000 1.07057

Temokaprilat 1.25664 <1.0000 1.21413

Xantina 1.09855 <1.0000 1.04023

Hasil analisis VIP diperoleh melalui analisis PLS-DA yang dijalankan secara berasingan

bagi tisu perikarpa, isi dan biji manggis

179

LAMPIRAN N

SENARAI METABOLIT BUKAN BERPENGARUH TINGGI YANG DIKENALPASTI

MELALUI KEDUA-DUA ANALISIS LC-MS DAN LC-MS/MS

Metabolit RT: m/z Ion

aduk

Fragmentasi MS/MS

m/z Intensiti Formula kimia

Asid lemak

Egonol-2ʼʼʼ-metil butanoat 12.60min:

409.168m/z

[M-H]- 351.0897 395243 [C20H17O6-H]-H-

339.0891 193833 [C19H14O6+H]-

394.1450 176682 [C23H23O6]-H-

377.1420 115577 [C23H23O5-H]-H-

352.0928 82877 [C20H17O6]-H-

395.1484 45676 [C23H23O6]-

Fenolik

2,4,6-Trihidroksibenzofenon 4.47min:

229.048m/z

[M-H]- 145.0287 2660 [C9H6O2]-H-

151.0045 976 [C7H5O4-H]-H-

185.0607 323 [C12H8O2+H]-

Xanton

1,3,5-Trihidroksixanton 7.55min:

243.028m/z

[M-H]- 199.0410 3868 [C12H7O3]-

147.0463 2999 [C9H5O2+2H]-

201.0185 1349 [C11H6O4]-H-

1,3,7-Trihidroksi-2,4-

diisoprenilxanthon

13.13min:

379.152m/z

[M-H]- 310.0846 120704 [C18H15O5]-H-

267.0299 63609 [C15H10O5-2H]-H-

281.0454 36409 [C16H11O5-H]-H-

324.0997 29445 [C19H17O5]-H-

323.0920 23746 [C19H17O5-H]-H-

Terpenoid

Malotokromena 7.36min:

441.154m/z

[M-H]- 426.1333 10122 [C23H23O8]-H-

383.0776 9139 [C20H17O8-H]-H-

409.1318 3959 [C23H23O7-H]-H-

427.1396 2641 [C23H23O8]-

180

LAMPIRAN O

STRUKTUR MOLEKUL α-MANGOSTIN BERSERTA KEDUDUKAN TAPAK

FRAGMENTASI YANG DICADANGKAN

Nama metabolit : α- Mangostin

Formula molekul : C24H26O6

Penenalpasti : CHEBI:67547

Jisim monoisotopik : 410.173

Ion prakursor

Fragmen

Fragmen 1

Formula : [C19 H17O6-H]-H-

Jisim : 339.08746

m/z puncak : 339.0885

Fragmen 2

Formula : [C20H17O6-H]-H-

Jisim : 351.08746

m/z puncak : 351.0885

Fragmen 3

Formula : [C23H23O6]-H-

Jisim : 394.14227

m/z puncak : 394.1427

Download - ANALISIS METABOLOMIK SEMASA PEMASAKAN ... - UKM

Top Related