· figura 8 -relações biossintéticas entre lignanas de forsythia inter media e podofilotoxina...
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"Camtnante; son tus huellas
el camino, y nadte mas;
Caminante, no hay camino,
se hace camino aI andar.
AI andar se hace camino,
y aI volver la vista atrás
se ve la senda que nunca
se ha de volver a pisar.
Caminante, no hay camino,
sino estelas en la mar."
Cantar 29.
Antonio Machado
Aos meus pais, Eliana Novaes Fonseca
e José Elias da Fonseca,
e à minha irmã Maria Hemila Fonseca,
pelo carinho, confiança, força, estímulo e compreensão.
Por estarem sempre do meu lado,
e por serem a maior preciosidade
que Deus me deu.
À pror. D~. Eny Ioshvet Segal Floh,
pela orientação nos experimentos
de cul1:ura de células,
pela sua força,
pelo seu carinho.
Pelo seu exemplo.
BIBLIOTECA INSTITUTO DE CUíMICA
Universidade de São Paulo
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Massuo Jorge Kato, pela orientação, apoio e pela
oportunidade de fazer parte de seu grupo.
Ao Prof. Dr. Walter Handro do Instituto de Biociências, pelo
apoio e pelas valiosas sugestões.
À Profi. D~. Maysa Furlan do Instituto de Química da UNESP
Araraquara, pela obtenção do extrato de caule adulto.
Ao Norberto P. Lopes, pelo auxílio, interesse e por ter
acompanhado de perto todas as etapas deste trabalho.
À Patrícia Sartorelli, pelo grande auxílio na fitoquímica dos
calos.
Ao Ernani Pinto Júnior pelas sementes.
Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais Ana Luísa,
Ana Paula, Ari, Cecília, Clara, Claudia, Dulce, Eduardo, Eva, Guilhermo, João,
Júlio, Leandro, Luciana, Lucianinha, Mara, Maria de Lurdes, Mônica, Dona Marina,
Paulo Benevides~ Paulo Brandão, Sérgio, Wagner, Seu Zé e em especial à Isabel,
pela ajuda e discussões sobre espectroscopia de massas e à Ana Cristina, pelo
seu companheirismo e amizade.
Ao "pessoal da bio", Ana Paula (s), Armando, Catarina,
Consuelo, Lázaro, Liane, Maria Anastácia, Nídia, Gilmar, Patrícia, pela companhia
agradável, e especialmente à grande amiga Carmen Silva (Carmínha), pela
paciência, ajuda e preciosos conselhos.
Aos "amigos da araucaria", Leandro Astarita e Jorge Solsrzano,
pelas sugestões, discussões e fotos.
Ao Chico e Jailson, pela perfeição no xerox.
Aos funcionários da Central Analítica, pela obtenção dos
espectros de RMN, massas, IV, especialmente ao Luiz Carlos Roque.
Aos funcionários da Biblioteca do Conjunto das Químicas,
especialmente à Adriana, Moema e Ângelo.
A todos aqueles que de alguma forma auxiliaram na execução
deste trabalho.
Ao CNPq, pela bolsa concedida.
v
SUMÁRIO
PÁGINA
Resumo VII
Abstract VII
Sumário de Figuras VIII
Sumário de Tabelas X
Sumário de Espectros XI
Abreviaturas e Símbolos XIII
INTRODUÇÃO 001
I - A família Araucariaceae e a espécie Araucaria angusfifolia.(Bert.) O. Ktze 001
II - Metabólitos secundários da família Araucariaceae 006
III - A cultura de células e tecidos vegetais no estudo do metabolismo
secundário
IV - Objetivos do trabalho
MATERIAIS E MÉTODOS
I - Materiais, reagentes e equipamentos utilizados
11 - Cultura de tecidos
11.1 - Material vegetal
11.2 - Obtenção dos explantes para cultura de tecidos
11. 2. A - Embriões
11. 2. B - Plântulas
11.3 - Indução e manutenção dos calos
11 . 3. A - Embriões
11 . 3. B - Plântulas
019
022
023
023
025
025
025
025
026
027
027
028
VI
111 - Fitoquímica 031
111. 1 - Material vegetal 031
111. 2 - Obtenção dos extratos de A. angustifolía 031
111. 3 - Fracionamento do extrato de caule adulto 033
111.4 - Fracionamento do extrato de calos 038
111.5 - Dados físicos e espectroscópicos das substâncias isoladas 040
111 .6 - Espectros obtidos 044
RESULTADOS E DISCUSSÃO 081
I - Cultura de Tecidos 081
I. 1 - Indução e manutenção de calos 081
I. 2 - Discussão 091
11 - Fitoquímica 092
11 .1 - Substâncias isoladas de Araucaria angustifolia 092
11 .2 - Determinação estrutural 094
11 .2 - A - Derivados do benzaldeído 094
11.2 - B - Fenilpropanóides 097
11.2 - C - Isoflavonas 110
11.2 - D - Lignanas furofurânicas 115
11.2 - E - Lígnanas tetraidrofurânicas 120
CONSIDERAÇÕES GERAIS 125
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 127
VII
RESUMO
o estudo fitoquímico do extrato etanólico de caules adultos de
Araucaria angustifolia resultou no isolamento e identificação da vanilina, p
hidroxibenzaldeído, coniferaldeído, dois isoflavonóides (cabreuvina e irisolidona),
quatro lignanas (pinoresinol, eudesmina, lariciresinol e 9'-O-acetato de
lariciresinol) e j3-sitosterol. Foi desenvolvido um protocolo para a obtenção de
calos, a partir de caules de plântulas estioladas, dos quais foram isolados e
caracterizados mistura de isômeros E e Z do p-cumarato de octadecila e do
ferulato de octadecila.
ABSTRACT
Phytochemical investigations carried out on ethanolic extract
from woods of Araucaria angustifolia resulted on the isolation and identification of
vanillin, p-hydroxybenzaldehyde, coniferaldehyde; two isoflavones (cabreuvine and
irisolidone); four lignans (pinoresinol , eudesmine, lariciresinol and 9'-O-lariciresinol
acetate), and j3-sitosterol. Its callus culture was showed to accumulate mixtures of
isomers E and Z of octadecyl p-cumarate and of octadecyl ferulate.
VIII
SUMÁRIO DE FIGURAS
Figura 1 - Exemplar adulto de Araucaria angustifolia 003
Figura 2 - Aspectos de uma pinha feminina madura e pinhões 004
Figura 3 - Plântulas de A. angustifolia cultivadas na casa de vegetação do
LQPN do Instituto de Química - USP 005
Figura 4 - Terpenos da família Araucariaceae 011
Figura 5 - Flavonóides da família Araucariaceae 015
Figura 6 - Lignóides da família Araucariaceae 017
Figura 7 - Algumas aplicações da cultura de células e tecidos vegetais 020
Figura 8 - Relações biossintéticas entre lignanas de Forsythia inter media
e podofilotoxina 022
Figura 9 - Obtenção das frações de polaridade média do extrato de caule
adulto e de calos 032
Figura 10 - Fracionamento cromatográfico da fração diclorometânica
do extrato etanólico do caule adulto 034
Figura 11 - Fracionamento cromatográfico das subfrações de F3/C8 035
Figura 12 - Fracionamento cromatográfico das frações F3/C9 e F3/C10 037
Figura 13 - Fracionamento cromatográfico da fração diclorometânica
dos calos ARA-4 039
Figura 14 - Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes
obtidos a partir de embriões inteiros, mantidos na luz 083
Figura 15 - Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes
obtidos a partir de embriões inteiros mantidos no escuro 083
Figura 16 - Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes
obtidos a partir de eixos embrionários mantidos na luz
Figura 17 - Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes
084
obtidos a partir de eixos embrionários mantidos no escuro 084
IX
Figura 18 - Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes
obtidos a partir de plântulas crescidas na luz 085
Figura 19 - Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes
obtidos a partir de plântulas estioladas 085
Figura 20 - Tempo de cultura para formação de calos em embriões inteiros 086
Figura 21 - Tempo de cultura para formação de calos em eixos embrionários 086
Figura 22 - Tempo de cultura para formação de calos em plântulas
crescidas na luz e estioladas 087
Figura 23 - Calos de segmentos de caule de plântulas 23 dias após
a inoculação 088
Figura 24 - Desenho esquemático de uma placa de Petri multipla 089
Figura 25 - Placa de Petri múltipla, com calos obtidos no meio ARA4,
montada segundo a Figura 24 089
Figura 26 - Calo de segmentos de caule de plântulas estioladas em ARA4,
20 dias após o primeiro repique 090
Figura 27 - Interpretação do espectro de massas obtido para 11, 12, 13 e 14 109
Figura 28 - Interpretação do espectro de massas obtido para a cabreuvina (~) 113
Figura 29 - Interpretação do espectro de massas obtido para a irisolidona (§) 114
Figura 30 - Esqueleto carbônico das lignanas furofurânicas 115
Figura 31 - Possibilidades isoméricas para lignanas furofurânicas 115
Figura 32 - Interpretação do espectro de massas obtido para o pinoresinol (§) 118
Figura 33 - Interpretação do espectro de massas obtido para a eudesmina (1) 119
Figura 34 - Proposta de fragmentação para o 9' -O-acetil-Iariciresinol (ª) 124
x
SUMÁRIO DE TABELAS
Tabela 1 - Metabólitos secundários da família Araucariaceae
Tabela 2 - Reguladores de crescimento utilizados para a indução e
007
manutenção de calos em embriões 028
Tabela 3 - Reguladores de crescimento utilizados para a indução e
manutenção de calos em plântulas 029
Tabela 4 - Fracionamento do extrato etanólico do caule adulto 033
Tabela 5 - Fracionamento do extrato de calos 038
Tabela 6 - Dados de RMN-1H (200 MHz, CDCb) do p-hidroxibenzaldeído (1) 096
Tabela 7 - Dados de RMN-1H (200 MHz, CDCb) da vanilina (~) 096
Tabela 8 - Dados de RMN-13C (50 MHz, CDCb) da vanilina (~) 096
Tabela 9 - Dados de RMN-1H (200MHz, CDCb) do coniferaldeído (ª) 099
Tabela 10 - Dados de RMN-13C (50MHz, CDCb) do coniferaldeído (ª) 100
Tabela 11 - Dados de RMN-1 H (300 MHz, CDCb) do
(E)- e (Z}-p-cumarato de octadecila (11 e 12) 103
Tabela 12 - Dados de RMN-13C (75 MHz, CDCb) do
(E)- e (Z}-p-cumarato de octadecila (11 e 12) 104
Tabela 13 - Dados de RMN-1H (300 MHz, CDCb) do
(E)- e (Z}-ferulato de octadecila (13 e 14) 107
Tabela 14 - Dados de RMN-13C (50MHz, CDCb) de
(E)- e (Z}-ferulato de octadecila (13 e 14)
Tabela 15 - Dados de RMN-1H (200MHz, CDCI3) da cabreuvina (~)
Tabela 16 - Dados de RMN-1 H (300MHz, CDCb) da irisolidona (~)
Tabela 17 - Dados de RMN-1H (200MHz, CDCb) do pinoresinol (§)
108
112
112
e eudesmina (Z) 117
Tabela 18 - Dados de RMN-1 H do lariciresinol Cª) (300MHz, CDCb) e
9' -O-acetil-Iariciresinol (~) (200MHz, CDCb) 122
Tabela 19 - Dados de RMN-13C lariciresinol (!!) (75MHz, CDCb) e
9'-O-acetil-lariciresinol (~) (50MHz, CDCb) 123
XI
SUMÁRIO DE ESPECTROS
Espectro 1 - RMN-1H da fração diclorometânica (A3) do extrato de calos 045
Espectro 2 - RMN-1H de 1 046
Espectro 3 - RMN-1H de ~ 047
Espectro 4 -RMN-13C de ~ 048
Espectro 5 - Espectro de massas de 1 049
Espectro 6 - Espectro de massas de ~ 049
Espectro 7 - RMN-1H de ~ 050
Espectro 8 - RMN HOMO - COSY 1H_1H de 3 051
Espectro 9 - RMN-13C de ~ 052
Espectro 10 - Espectro de massas de ~ 053
Espectro 11 - RMN-1H de 11 e 12 054 - -Espectro 12 - RMN-1 H de 11 e 12 - expansão 055
Espectro 13 - RMN-13C de 11 e 12 056
Espectro 14 - Espectro no infravermelho de 11 e 12 057
Espectro 15 - Espectro de massas de 11 e 12 057
Espectro 16 - RMN-1H de 13 e 14 058
Espectro 17 - RMN-1H de 13 e 14 - expansão 059
Espectro 18 - RMN-13C de 13 e 14 060
Espectro 19 - RMN-13C - DEPT 1350 de 13 e 14 061
Espectro 20 - Espectro no infravermelho de 13 e 14 062
Espectro 21 - Espectro de massas de 13 e 14 062
Espectro 22 - RMN-1H de ~ 063
Espectro 23 - RMN-1H de ~ - expansão 064
Espectro 24 - RMN HOMO - COSY lH _lH de ~ 065
Espectro 25 - RMN-1 H de .Q 066
Espectro 26 - Espectro de NOE diff. de.Q 067
Espectro 27 - Espectro de massas de ~ 068
Espectro 28 - Espectro de massas de .Q 068
Espectro 29 - RMN-1H de §
Espectro 30 - RMN-1 H de Z Espectro 31 - Espectro de massas de §
Espectro 32 - Espectro de massas de Z
Espectro 33 - RMN-1H de ª Espectro 34 - RMN-13C de ª Espectro 35 - RMN-1H de ª Espectro 36 - RMN HOMO - COSY 1 H _1 H de 9
Espectro 37 - RMN-13C de ª Espectro 38 - Espectro de massas de ª Espectro 39 - Espectro de massas de ª Espectro 40 - Espectro no infravermelho de ª Espectro 41 - RMN-1H de 10
Espectro 42 - Espectro de massas de 10
XII
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070
071
071
072
073
074
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076
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XIII
ABREVIATURAS E SíMBOLOS
ácido 2,4 - diclorofenoxiacético
acetato de etila
ácido a-naftalenoacético
ácido indolacético
ácido indol - 3 - butírico
arila
cromatografia em coluna
clorofórmio deuterado
cromatografia planar comparativa
cromatografia planar preparativa
cromatografia planar radial preparativa
cromatografia gasosa
diclorometano
Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
dubleto
duplo-dubleto
espectrometria de massas
guaiacila (4 - hidroxi -3- metoxifenila)
hexano
homonuclear correlated spectroscopy
hertz
intensidade relativa
infravermelho
constante de acoplamento
cinetina (6 - benzilamino-purina)
multipleto
pico do íon molecular
meio básico segundo Murashige e Skoog [72]
max
Me
MeOH
Me2CO
m/z
NOE
NOE diff.
OAc
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RMN-1H
RMN-13C
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v/v
Ve
Ú
máximo
metila
metano I
acetona
relação massa carga
nuclear overhauser effect
nuclear overhauser effect differential
acetila
potencial hidrogenioiônico
Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio
Ressonância Magnética Nuclear de carbono treze
singleto
singleto largo
tripleto
tetrametilsilano
volume por volume
veratrila (3,4 - dimetoxifenila)
deslocamento químico
XIV
1
INTRODUÇÃO
1- A família Araucariaceae e a espécie Araucaria angustifolia
(Bert.) O. Ktze
A família Araucariaceae, pertence à ordem das Coniferae,
à classe Coniferopsida e ao grupo das Gymnospermae [1].
A ordem das coníferas inclui várias espécies usadas na
medicina tradicional e, segundo Dallimore e Jackson [2], pode ser dividida em
seis famílias: Cephalotaxaceae, Podocarpaceae, Araucariaceae,
Cupressaceae, Taxodiaceae e Pinaceae. No Brasil, só ocorrem representantes
nativos das famílias Podocarpaceae (Podocarpus lamberfi e P. sellow/) e
Araucariaceae (Araucaria angustifolia) [1 , 2, 3].
A família Araucariaceae possui apenas dois gêneros -
Araucaria e Agathis [4] e apesar da distribuição desta família ser restrita ao
Hemisfério Sul (com exceção de algumas espécies de Agathis, as quais são
endêmicas do Arquipélago Malaio e Ilhas Filipinas), ela já foi muito mais ampla
no passado. Foram descobertos vários fósseis do gênero Araucaria em ambos
os hemisférios datando do Jurássico, enquanto que exemplares de Agathis só
foram encontrados no Hemisfério Sul no começo do Cretáceo [5].
O gênero Agathis possui cerca de treze espécies [6] e o
A ra uca ria , vinte [4]. Destas, apenas duas são nativas da América do Sul:
Araucaria araucana (= imbricata) , a qual ocorre no sul do Chile e Argentina, e
Araucaria angustifolia (= brasiliensis) , cuja ocorrência se restringe ao Brasil e
Território de Misiones na Argentina. Quanto ao gênero Agathis, com exceção
das espécies encontradas no Arquipélago Malaio e Ilhas Filipinas, todas são
endêmicas da Austrália. Aqui no Brasil é comum o cultivo de Araucaria excelsa,
Araucaria bidiwillii e, mais raramente, algumas espécies de Agathis com
finalidades ornamentais [3].
2
A espécie Araucaria angusfifolia (= brasiliensis) é
conhecida popularmente como araucária, pinheiro do Paraná, e entre os povos
indígenas como "cariúva" ou "curi". No exterior é conhecida como "brazilian
pine" (Figuras 1 a 3, p. 3 a 5).
Segundo Reitz e Klein [7] são árvores altas, chegando a
alcançar 50 m de altura, com 1-2 m ou mais de diâmetro; o tronco em geral é
cilíndrico, reto e raras vezes ramificado em dois ou mais, sua casca é grossa
(até 5 cm) e resinosa. As árvores adultas possuem formato de umbela,
enquanto as jovens possuem a copa cônica.
Quanto a sua utilidade, os pinhões fornecem alimento
nutritivo e muito apreciado por homens e animais. Mas sem dúvida, o uso mais
importante é o da madeira, geralmente chamada de pinho, que é usada para a
fabricação de taboados, vigamento, compensados, celulose, papel, lã e seda
artificiais; a resina serve de base para a fabricação de vernizes, terebentina, e
outros produtos químicos [7, 8, 9].
A araucária é encontrada formando agrupamentos densos,
principalmente na parte leste e central do planalto sul-brasileiro, abrangendo o
Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, ocorrendo em focos esparsos ao
sul de São Paulo e na Serra da Mantiqueira, e ainda ao sul de Minas Gerais e
Rio de Janeiro [7 , 1 Dl No início deste século, aproximadamente 20 milhões de
hectares no sul do país eram cobertos pelas "Florestas de Araucária", as quais
dominavam a paisagem destas regiões, entretanto, devido à intensa
exploração madeireira ocorrida principalmente na década de 60-70, e a
expansão das fronteiras agrícolas, chegou-se perto de sua completa extinção.
Apesar desta situação o reflorestamento ainda é muito pouco aplicado [11] .
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Figura 3: Plântulas de A. angustifolia cultivadas na casa de vegetação do LQPN do Instituto de
Química - USP.
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F2d
; F
2h;
F4f
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4g;
F5
10
[29]
[25
,26
]
[28]
[30,
33]
[27]
[30,
33]
11
T1a R1 = R2 = C02H T19 R1 = CH20H R2 = C02Me T1 b R1 = CH20H R2 = C02H T1h R1 = CHO R2 = C02Me T1c R1 = C02Me R2 = C02H T1i R1 = C02Me R2 = CH20H T1d R1 = CO2 H R2 = C02Me T1j R1 = C02Me R2 = CH20Ac T1e R1 = C02Me R2 = C02Me T11 R1 = C02H R2 = CH2COMe
R1 T1t R1 = CH20Ac R2 = C02Me T1 m R1 = CH20H R2 = CH20H
T2a R = C02H T2b R = CH20H T2c R = C02Me
~QC ~ CO,Me
~ T5
R1
T9a R1 = CHO R2 = CH20H T9b R1 = CH20H R2 = C02Me
T3a R = COOH T3b R = CH20H T3c R = C02Me
T6
TSa R1 = Me T8b R1 = Me T8c R1 = C02H TSd R1 = C02Me T8e R1 = CH20H
HO
R2 =Ac R2 = H R2 = H R2 =Ac R2 = H
T1 Da R = CH20H T10b R = C02H T10c R = CHO
R
Figura 4éi: Terpenos da família Araucariaceae
ctSXOOH
~ H
T4
T7
T8t R1 = CHO T8g R1 = C~OH T8h R1 = CHO T8i R1 = CH20Ac
R2 = H R2 =Ac R2 =Ac R2 =Ac
R2 T11a R1 = R2 = CH20H
çtYH , C02H
T12
T14a R1 = C02Me R2 = H T14b R1 = C02H R2 = C02Me T14c R1 = CHO R2 = H T14d R1 = CH20H R2 = H
~OC çt:rHR T17a R = C~Me T17b R = CH20H
T11b R1 = CHO R2 = CH20H T11c R1 = CHO R2 = CH20Ac T11d R1 = C02H R2 = CH20H T11e R1 = C02H R2 = CH20Ac
# " '" ~
/ C02H
T13
T15a R = CH2Me T15b R = CHO T15c R = CH20H
~r;( 9J~.
T18
" "C'/ CH20H
o ~
HO o
T20 T21
Figura 4b: Terpenos da família Araucariaceae
12
C02H
T16
çttl C~H _ O ~
$ C02Me
T19
HO
T22
T25 R = C02H T25 R = CHpH T25 R = CHO
T28a R = C02H T28b R = CH20H T28c R = C02Me
T31
T23
T26
HO T29
T32
§ ,~""""OH ~OH
H '1'1
HO"" ' ~ .,
T34 T35
Figura 4c: Terpenos da família Araucariaceae
13
T24
T27
T30
çJ90H
"" A '11,
HO .... '. !T T33
T36
14
çtr " T37 T38 T39
HO T42 T40 T41
0J: T43 T44 T45
(v @ P T46 T47 T46
9 :2 2 T49
TSO T51
~ ~ T52
T53
Figura 4d: Terpenos da família Araucariaceae
RsO
R20
R20
OR1 O
OH O
ORe
OR1 O
Fi R1 = R2 = R3 = ~ = Rs = Rs = H
ORe
OR3
F2a R1 = R2 = R3 = ~ = Rs = Rs = Me F2b R1 = R3 = ~ = Rs = Rs = H; ~ = Me F2c R1 = R3 = ~ = Rs = H; ~ = Rs = Me F2d R1 = ~ = H; R2 = R3 = Rs = Rs = Me F2e R1 = R2 = R3 = ~ = Rs = Rs = H F2f R1 = R3 = ~ = H; ~ = Rs = Rs = Me F2g R1 = ~ = Rs = H; ~ = Rs = R3 = Me F2h R1 = R2 = ~ = Rs = H; R3 = Rs = Me
O~
F3a R1 = R2 = R3 = ~ = H F3b R1 = R2 = ~ = H; ~ = Me F3c R2 = ~ = H; R1 = R3 = Me F3d R1 = R2 = R3 = R4 = Me F3e ~ = H; R1 = R2 = R3 = Me
Figura 5a: Flavonóides da família Araucariaceae
15
R30
OH O
O OH
O
HO
4'"
O~
OR1 7'
F4a R1 = R2 = R3 = ~ = H F4b R2 = R3 = R4 = H; R1 = Me F4c R1 = R2 = H; R3 = ~ = Me F4d R2 = H; R1 = R3 = ~ = Me F4e R1 = R2 = R3 = H; ~ = Me F4f R1 = R3 = H; R1 = ~ = Me F4g R1 = R3 = H; ~ = R2 = Me F4h R1 = R2 = R3 = ~ = Me
OH
OH
O OH
F5
O
OH
F6
Figura 5b: Flavonóides da família Araucariaceae
16
~HOHzC "",OH
7' I ~ "",,~
HO ~ ~OH
HO
L1
OH
L3
~O~
R,O~ rt OHm
yOR2
OR1
LSa R1 = R3 = H; ~ = ~ = Me LSb R1 = ~ = ~ = Me
RtO
R30
OR1
OH " , OH
"r'"
L7a R1 = R3 = H; R2 = Rt = Me L7b R1 = H; R2 = R3 = Rt = Me
HO
~
~/"""~
~OH L2
OR! ~OR3
17
go"""u R2
0)J""" I O R
1 ~
L4a R1 = R3 = H; R2 = ~ = Me L4b R1 = R2 = R3 = ~ = Me L4c R1 = H; ~ = R3 = ~ = Me
RtO OH
R30
OR1
L6a R1 = R:3 = H; ~ = ~ = Me L6b R1 = H; ~ = R:3 = ~ = Me
HO
O
L8
OH
Figura 6a: Ugnóides da família Araucariaceae
HO
MeO
MeO
L9
OMe
L11
OH
MeO
MeO
o < O
O
< O
L13
Figura 6b: Lignóides da família Araucariaceae
OMe
L10
L12
18
111- A Cultura de Células e Tecidos Vegetais no Estudo do
Metabolismo Secundário
19
o conhecimento da habilidade de uma célula vegetal crescer
e dividir continuamente de uma maneira autônoma, podendo regenerar um
organismo inteiro (totipotência), possibilitou o surgimento e o desenvolvimento
das técnicas de cultura de células e tecidos [46]. Os termos "cultura de células e
tecidos vegetais", são geralmente usados para descrever o cultivo "in vifro" e
asséptico de células, ou qualquer parte de um vegetal em um meio nutritivo sob
condições controladas [47].
Nas últimas duas décadas, a cultura de células e tecidos
vegetais emergiu como uma nova metodologia, capaz de complementar os
métodos convencionais na pesquisa básica de várias áreas científicas e da
indústria biotecnológica vegetal (Figura 7, p. 20).
Um campo que vem sendo explorado e · apresenta grande
potencial, é a aplicação destas técnicas no estudo do metabolismo secundário,
através do estudo de rotas biossintéticas e da produção "in vifro" de metabólitos
com interesses farmacêuticos elou químicos [48]. A possibilidade de produzir
compostos sobre condições ambientais controladas, independente das variações
climáticas, mudanças na composição do solo, e livre de ataque de patógenos e
predadores, fez com que as pesquisas nesta área aumentassem de maneira
exponencial [47, 49, 50].
21
Apesar dos resultados estimulantes, a maioria dos
metabólitos secundários de interesse são produzidos em baixas concentrações
ou não são produzidos em suspensões celulares. Outro fator importante, é a
instabilidade genética das linhagens de células selecionadas, as quais podem
sofrer mutações perdendo características metabólicas importantes [51 , 50].
A biossíntese de produtos naturais foi outra área que muito
se beneficiou com o desenvolvimento de tais técnicas. Embora culturas de muitas
espécies vegetais não expressem ou acumulem produtos do metabolismo
secundário, a informação genética pode estar presente. Tal fato, juntamente com
a ausência de produtos fenólicos, acabou por favorecer a purificação de enzimas,
o que levou a cultura de células, a ser explorada como fonte de tais,
principalmente a partir dos anos 70. Assim muitos detalhes enzimológicos
envolvidos em etapas de transformações de diversos produtos naturais, vieram a
ser conhecidos [55]. A partir de células de Forsythia intermedia, Dinkova Kostova
e colabaradores [56] isolaram duas formas funcionais da enzima (+)-pinoresinoll
(+)-Iariciresinol redutase, as quais catalisam a sequência de redução do (+)
pinoresinol ~ (+)-Iariciresinol ~ (-)-secoisolariciresinol (Figura 8, p. 22). Kutney
[57] e colaboradores [58] desenvolveram uma linhagem de células de Nicotiana
sy/vestris, as quais secretavam altas concentrações de peroxidases no meio de
cultura, capazes de biotransformar precursores exógenos de
dibenzilbutanolídeos, análogos ao (-)-matairesinol, em derivados da
podofilotoxina.
A capacidade de determinadas culturas expressarem rotas
metabólicas incomuns, levando a formação de produtos diferentes daqueles
encontrados nos tecidos das plantas intactas, torna a cultura de células uma
fonte potencial de novos produtos com atividade biológica e farmacológica [59,
60]. Do extrato de calos de Tripterygiun wilfordii, espécie conhecida na medicina
chinesa por suas propriedades anti-Ieucêmicas, foram isolados triterpenos
pentacíclicos, enquanto que no tecido indutor dos calos foram encontrados
basicamente diterpenos derivados do ácido abiético [61].
22
IV - Objetivos do Trabalho
o presente trabalho teve como objetivos o desenvolvimento
de estudos de indução e manutenção de calos, sob condições nutritivas e
ambientais totalmente controladas, visando a obtenção de um sistema
desdiferenciado como modelo para a investigação da expressão de rotas do
metabolismo secundário em A. angustifolia. Os metabólitos secundários do caule
de planta adulta foram caracterizados, visando a obtenção de padrões de
lignanas previamente descritos na literatura [8, 37, 38].
Este estudo tem como base, a possível semelhança entre o
sistema enzimático da rota biossintética (Figura 8), descrita para Forsythia
intermedia [62] e o da Araucaria angustifolia, uma vez que ambas acumulam as
lignanas (+ )-pinoresinol, (+ )-Iariciresinol e (-)-secoisolariciresinol. Acredita-se que
a formação de (+ )-pinoresinol , e as subsequentes etapas de reduções,
constituem-se etapas chave, possivelmente universais em vegetais, e que
poderiam ter como um dos produtos finais a lignana antitumoral podofilotoxina [62
-70]
~Oi ~Oi ~
2x t-O~ Oi
0Me
o 0 ~ mE ~ · m--~~
I-O~ (+) pinoresinol HO~ (+) lariciresinol álcool coniferUico
~OH 1-0,-, ... -0
.I \ ~"'" "OH
HO~ (-) secoisolariciresinol 0Me
0Me ale
MeO~ I o 1-0:::"" .... 11' r O
:::,...1
(_) rnatairesinol 0Me OH
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OH 0m:' < I O O:::,... ,"" Ir
0 0
MeO~OMe podofilotoxina 0Me
Figura 8: Relações biogênicas entre lignanas de Forsythia inter media e podofilotoxina
23
MATERIAIS E MÉTODOS
1- Materiais, reagentes e instrumentos utilizados
o grau de pureza dos solventes variou de acordo com a
finalidade. Para extração, CC, CPP, CPC e CPRP, utilizou-se solventes de grau
P.A. da Merck, Grupo Química e Vete c submetidos a destilação fracionada.
A fase estacionária utilizada para cromatografia em coluna
filtrante foi Si-60 da Merck, partículas de 63-21 O ~m .
Para CPC utilizou-se camadas de 0,50 mm, Si-60 GF254
Merck, partículas de 4-45~m. Para CPP utilizou-se camadas de 1,0 mm, Si-60254
Merck, partículas de 4-45 ~m. Para CPRP, foi utilizado Cromatotron - Harrison
Research (mod. 7924T), placa de sílica-gel 60 PF254 (partículas de 5-45~m) com
gesso e 2mm de espessura.
A revelação dos cromatogramas obtidos em placas foi
realizada com solução de sulfato cérico, cloreto férrico, vapores de iodo elou
irradiação no UV (254 e 356 nm).
Os experimento de cromatografia à gás, foram feitos em
aparelho Hewlett Packard modo 5890 series 11, com injetor automático HP7673,
integrador HP 3396A e detetor FIO. A coluna capilar utilizada foi HP-5, 30 m x
0,32 mm x 0,25 ~m, com split de 1 :20. O gás de arraste foi H2 .
Os espectros de RMN 1 H e 13C foram registrados em
espectrômetro Bruker AC-200 e 300, operando para 1 H a 200 e 300 MHz, e para
13C a 50 e 75 MHz, respectivamente, utilizando como solvente CDCb da Aldrich
ou Merck. Os d~dos estão expressos em deslocamento químico ó (ppm),
utilizando como referência interna o deslocamento químico do CDCb ou TMS.
24
Os espectros no infravermelho foram registrados em
aparelhos FT-IR 1750 Perkin Elmer e FT-IR 510 Nicolet, na forma de filmes
utilizando janelas de KBr. Os dados são expressos em números de onda \) (cm-\
Os espectros de UV foram obtidos em espectrômetro UVNIS
Hitachi U-3000, cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 em, em MeOH grau
espectroscópico.
Os espectros de massas foram obtidos em espectrômetros
HP5988A Hewlett Packard (quadrupolo) , Mat 90 Finnigan (duplo foco geometria
reversa) e INCOS 50 Finnigan-Mat (quadrupolo), injeção direta e impacto
eletrônico (EI) a 30 e 70 eV conforme especificado no espectro. Este último foi
usado nas análises por CG-EM acoplado a cromatógrafo 3400 Varian coluna DB-
5, 30 m e 0,25 mm. Os dados estão expressos como relação massa/carga (m/z)
dos íons fragmentários correspondentes.
As medidas de rotação específica [ajo foram realizadas em
polarímetro digital JASCO DIP-370, filtro Na, com caminho óptico de 1 em.
Nos experimentos de cultura de tecidos, os reagentes usados
foram de grau P. A., especiais para cultura de células, das marcas Sigma e
Merck.
25
11- Cultura de Tecidos
11. 1 - Material Vegetal
Foram utilizados embriões e plântulas de A. angustifo/ia,
obtidos a partir de sementes adquiridas no comércio da cidade de Santo Antônio
dos Pinhais - SP- no mês de maio, local onde se concentra um foco de "mata de
araucária" .
11.2- Obtenção Dos Explantes Para Cultura de Tecidos
Na tentativa de obter-se calos friáveis, foram testados seis
tipos diferentes de explantes de Araucaria angustifolia:
11.2 - A - Embriões inteiros e seccionados em cotilédones, eixo embrionário, e
polo radicular;
11.2 - B - Segmentos de caule de plântulas crescidas na luz e estioladas,
contendo pelo menos uma gema lateral;
11.2- A- Embriões
As sementes foram lavadas com Tween 10% v/v durante 10
minutos sob agitação. Os megagametófitos foram isolados, mergulhados em
álcool 70% v/v por mais 5 minutos e desinfetados com solução aquosa de
hipoclorito de sódio comercial 80% v/v durante 20 minutos sob agitação. Os
embriões foram excisados do megagametófito, imersos em solução aquosa da
hipoclorito de sódio 5% v/v e lavados três vezes com água destilada autoclavada.
Uma vez desinfetados, estes foram seccionados ou não, dependendo do
experimento.
26
11.2- B.- Plântulas
Com o intuito de diminuir o índice de contaminação dos
explantes, as sementes antes de serem germinadas, foram previamente lavadas
com Tween 10% v/v, agitadas em solução aquosa de hipoclorito de sódio
comercial 80% v/v durante 5 minutos, e desinfetadas com solução aquosa do
fungicida Bayfidan 250 PM da Bayer (triadimenol) 3g/L durante 10 minutos. Uma
vez limpas, estas foram germinadas em vermiculita, na presença de luz e em
câmara escura, ambos os casos com temperatura a 26°C ± 1°C. Ao atingirem
cerca de 16 cm de altura, estas foram colhidas e submetidas ao processo de
esteril ização.
Devido ao alto nível de contaminação destes explantes, foram
testados vários métodos diferentes de assepsia, sendo o mais efetivo descrito
abaixo:
-retirar as gemas apicais e o sistema radicular das plântulas;
-retirar 5 cm da base do caule e descartar;
-escovar os caules com detergente, lavar e secar;
-cortar os caules em pedaços de cerca de 4 em de comprimento;
-agitar 5 minutos em solução aquosa de Tween 0,1% v/v;
-lavar com água destilada;
-agitar 1 minuto em álcool etílico 70% v/v;
-agitar 20 minutos em solução aquosa de NaDCI comercial 50% v/v;
-lavar com água destilada autoclavada três vezes;
-agitar os caules em meio líquido com a seguinte composição [71] :
meio básico Murashige & Skoog [72];
sacarose 20 g/L;
mioinositol 100 mg/L;
complexo vitamínico de Nitsch & Nitsch [73];
Bayfidan 3 g/L;
rifampcina 25 mg/L;
ácido ascórbico 25 mg/L
27
-deixar em agitação sob pouca luminosidade (10 Ilm. m-2. S-1) , durante doze
horas;
Após a assepsia os explantes foram cortados em solução
aquosa de ácido ascórbico 1 g/1 OOmL, na qual permaneceram durante 5 minutos
antes da inoculação.
11.3 - Indução e Manutenção dos Calos
11.3- A- Embriões
Para as etapas de indução e manutenção dos calos,
embriões inteiros e seccionados foram submetidos a diferentes tratamentos
conforme descrito na Tabela 2 (p. 28). O meio básico continha os sais minerais
do meio MS [72]. Nos meios F1A a F4A foram acrescentados 200 mg/L de
complexo vitamínico M.S. marca Sigma (N° de catálogo M-7150), 400 mg/L de
hidrolisado de caseína bovina e 25 mg/L de ácido ascórbico. A concentração de
sacarose foi alterada para 30 g/L.
Como agente geleificante, foi usado Phytagel da Sigma (N°
de catálogo P-8169) na concentração de 1,6 g/L. O pH foi ajustado para 5,8 antes
da autoclavagem. O ácido ascórbico, foi esterilizado por membrana filtrante de
0,2211m, antes de ser adicionado ao meio esterilizado.
28
--- ----- -
Código do Reguladores de Crescimento
meio Auxina (mg/L) Citocinina (mg/L)
M1A 2,4-0 1,0 -
M3A 2,4-0 3,0 -
M5A 2,4-0 5,0 -
F1A 2,4-0 2,0 K 0,1
F2A AIA 2,0 K 0,1
F3A AIS 2,0 K 0,1
F4A ANA 2,0 K 0,1 - - -
Tabela 2: Reguladores de crescimento utilizados para indução e manutenção de calos em embriões
Foram inoculados três explantes por placa de Petri ,
perfazendo um mínimo de vinte e quatro unidades para cada tipo de explante,
para cada tipo de tratamento. Parte do material (50%), foi mantido em sala de
crescimento com temperatura a 26° ± 1°C, e fotoperíodo de 18 horas de luz, sob
intensidade luminosa de 45~m . m-2. S-1; o restante foi mantido em câmara escura
com temperatura a 26° ± 1°C.
Para a manutenção os calos obtidos foram repicados para o
mesmo meio de indução, com intervalos de cerca de 30 dias.
11.3- B- Plântulas
Devido a pequena intensidade na indução e a impossibilidade
de subcultivo dos calos obtidos a partir de embriões, optou-se por testar outras
fontes de explantes.
i
29
Handro & Ferreira [75] e Penchel [76] relataram a formação
de calos em explantes de caule de plântulas estioladas ou crescidas na luz.
Dessa forma segmentos de caule de plântulas crescidas na luz e crescidas no
escuro foram submetidos aos tratamentos com reguladores descritos na Tabela
3. Utilizou-se meio básico MS. Aos meios ARA 1 a ARA4 foram acrescentados
100 mg/L de mioinositol, 30 g/L de sacarose, 50 mg/L de arginina, 20 mg/L de
glutamina, 20 mg/L de uréia, 150 mg/L de ácido cítrico e complexo vitamínico de
Nitsch & Nitsch; o meio MBF-13 foi suplementado com 400 mg/L de hidrolisado
de caseína bovina, 200 mg/L de complexo vitamínico MS da Sigma e 30 g/L de
sacarose. Mais uma vez, foi utilizado Phytagel como agente geleificante. O pH foi
ajustado para 5,8 antes do processo de esterilização. O complexo vitamínico, e
as soluções de aminoácidos, antioxidante e uréia foram esterilizados por
membrana filtrante de O,22Jlm da Mi"ipore.
Código do Reguladores de Crescimento
meio Auxina (mg/L) Citocinina (mg/L)
ARA1 2,4-D 2,0 K 0,1
ARA2. AIA 2,0 K 0,1
ARA3 AIB 2,0 K 0,1
ARA4 ANA 2,0 K 0,1
MBF13 2,4-D 2,0 -Tabela 3: Reguladores de crescimento utilizados para indução e manutenção de calos em
plântulas
Foi inoculado um explante por tubo de ensaio, de modo a
obter-se um mínimo de vinte e quatro unidades para cada tratamento. O material
inoculado foi mantido em sala de crescimento com temperatura a 26°C ± 1°C e
fotoperíodo de 18 horas de luz sob intensidade luminosa de 10Jlm. m-2. S-1.
OS calos obtidos foram repicados para meios de mesma
composição com intervalos de cerca de 50 dias.
30
Considerando que quinze dias após o repique, 70% dos calos
estavam oxidados, foram realizados os seguintes ensaios, no material
proveniente dos meiosARA1, ARA3, ARA4 e MBF-13:
a) transferir os calos, de modo a deixá-los intactos, sem retirar as
células mortas elou oxidadas e restos de explantes;
b) retirar dos calos, restos de explantes e células oxidadas elou
mortas.
c) variar a concentração de auxina, para 2,0 mg/L, 1,0 mg/L e 0,0
mg/L.
111- Fitoquímica
111. 1 - Material Vegetal
Para o estudo fitoquímicos foram utilizados:
- caule de planta adulta (Figura 1, p. 3);
- calos induzidos em ARA 4 (Figura 26, p. 90).
31
Pedaços de caule adulto foram coletados no Sítio Jaqueira, bairro
Dos Ferreiras, estrada de Salesópolis - SP - Km1 .
As linhagens de calos foram obtidas no meio de cultura ARA 4,
conforme descrito no item 11 de Materiais e Métodos.
111.2- Obtenção dos Extratos de A. angustifolia
Pedaços de caule adulto de A. angustífolía foram secos, moídos e
submetidos a extração com etanol com auxílio de ultrassom durante 20 minutos, sendo
o processo repetido por três vezes. O extrato obtido (10g) foi suspendido em uma
mistura de MeOH/H20 4: 1 e submetido a partição com hexano a fim de retirar o
excesso de ácidos graxos. A fração resultante foi novamente particionada com DCM e
solução aquosa saturada de NaCI. A fração diclorometânica resultante foi tratada com
água destilada, com o intuito de retirar o excesso de sal , obtendo-se assim uma
terceira fração (F3) com 4g (Figura 9, p. 32), a qual foi submetida ao fracionamento
cromatográfico.
Células frescas (182 g), provenientes do meio ARA-4, recém
tiradas do meio de cultura, foram congeladas em nitrogênio líquido e trituradas. A
extração foi feita com EtOH (500 ml 4X) em ultrassom. O extrato bruto obtido (3,678 g)
foi suspendido em 100ml de uma mistura de MeOH/H20 4: 1 e submetido ao mesmo
processo de extração (Figura 9, p. 32) descrito para o extrato bruto de caule.
32
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33
111.3- Fracionamento do Extrato do Caule Adulto
A fração diclorometânica F3 (4,0 g) do caule adulto foi
submetida a cromatografia em coluna de sílica gel (60H -10,0 x 30,0 cm) sob
pressão, eluída com sistema DCM/MeOH em ordem crescente de polaridade,
resultando em 150 frações de aproximadamente 25 ml, as quais depois de
analisadas por CPC foram agrupadas conforme a Tabela 4:
Fração Massa (mg) Fração Massa (mg)
F3/1 8,3 F3/12 50,4
F 3/2 9,1 F3/13 58,5
F3/3 9,8 F3/14 34,3
F3/4 10,1 F3/15 98,4
F 3/5 9,4 F3/16 117,5
F3/6 9,5 F3/17 66,1
F 317 2,5 F3/18 78,3
F 3/8 515,8 F3/19 99,2
F3/9 168,3 F 3/2 O 549,0
F3/10 357,2 F3/21 576,0
F3/11 93,4 F 3/22 540,5
Tabela 4: Fracionamento do extrato etanólico do caule adulto.
A fração F3/8, foi dividida em duas porções de cerca de 250
mg e submetida CPRP fornecendo dois lotes de subfrações, as quais foram
purificadas conforme resumido nas Figuras 11a (p. 35) e 11b (p.36).
O fracionamento das demais frações estão descritos nas
Figuras 10 (p. 34) e 12 (p. 37).
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37
38
111.4- Fracionamento do Extrato de Calos
o espectro de RMN-1 H (Espectro 1, p. 45) da fração
diclorometânica (A3), apresentou sinais referentes a hidrogênios aromáticos (6,88
- 7,0), propenílicos (6,28 - 7,68) e metoxilícos (3,68), indicando a presença de
fenilpropanóides.
A fração diclorometânica A3 (238,5 mg) foi submetida a
cromatografia em coluna de sílica gel 60-H (7,0 x 25 cm), eluída com sistema de
DCM/MeOH em ordem crescente de polaridade, fornecendo 201 frações de
aproximadamente 10 ml, as quais depois de analisadas por CPC foram
agrupadas conforme a Tabela 5:
Fração Massa (mg) Fração Massa (mg)
A3/1 2,5 A3/10 3,7
A3/2 22,4 A3/11 4,9
A3/3 2,3 A3/12 2,1 I
A3/4 4,2 A3/13 1,7 I
A3/5 6,4 A3/14 9,8 I
A3/6 26,7 A3/15 2,1
A317 13,6 A3/16 4,6
A3/8 4,1 A3/17 10,0
A3/9 4,9 A3/18 5,1
Tabela 5: Fracionamento do extrato de calos.
A fração A3/2 foi purificada conforme descrito na Figura 13
(p.39).
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Fração Diclorometânica
638,5 mg
I a
A3/2 ... 22,4 mg
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I I
a = cc sílica 60-H (7.0 x 25,0 cm) gradiente de DCM/MeOH em ordem crescente de polaridade
b=CPP benzeno/MeOH 8:2
A3/2-1 A3/2-2 6,4 mg
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14
Figura 13: Fracionamento cromatográfico da fração diclorometânica dos calos ARA-4
39
111. 5. Dados Espectroscópicos das Substâncias Isoladas
4-Hidroxibenzaldeído (1)
C7H602
EM (70 eV) m/z(int. rel.): 122 [M+] (86),123 [M+1] (7),
121 (100),93 (34) , 65 (24). Espectro 5, p. 49.
RMN-1H (200 MHz, CDCb): Espectro 2, p. 46; Tabela 6, p. 96.
4-Hidroxi-3-metoxibenzaldeído (~)
Vanilina
CSHS0 3
EM (70 eV) m/z (int. rel.) : 152 [M+] (96), 151 (100),
137 (5), 123 (20), 109 (18), 95 (2), 81 (23),65 (8). Espectro 6, p. 49.
RMN-1H (200 MHz, CDCb): Espectro 3, p. 47; Tabela 7, p. 96.
RMN_13C (50 MHz, CDCb): Espectro 4, p. 48; Tabela 8, p. 96.
(E)-4-Hidroxi-3-metoxicinamaldeído (~)
Coniferaldeído
C1OH1003
EM (70 eV) m/z (int. rel.) : 178 (100),
161 (21), 151 (7), 147 (39), 135 (48),77 (42). Espectro 10, p. 53.
RMN-1H (200 MHz, CDCb): Espectro 7, p. 50; Tabela 9, p. 99.
RMN_13C (50 MHz, CDCb): Espectro 9, p. 52; Tabela 10, p. 100.
(E)-4-Hidroxicinamato de octadecila (11)
(E)-p-Cumarato de octadecila
C27H440 3
IV Vma/ lme cm-1: 3390, 1716, 1640, 1608, 1588, 980. Espectro 14, p. 57.
EM (70 eV) m/z (int. rel.): 416 [M+1] (3), 417 [M+2] (1) , 177 (2),
164 (100) , 147 (56), 119 (12) , 107 (17). Espectro 15, p. 57; Figura 27, p 109.
RMN-1H (300 MHz, CDCb): Espectro 11 , p. 54; Tabela 11 , p. 103.
RMN_13C (75 MHz, CDCb): Espectro 13, p. 56; Tabela 12, p. 104.
8'BL'OTECA \NSTITUTO DE QUIMICA Universidade de São Paulo
40
(Z)-4-Hidroxicinamato de octadecila (12)
(Z)-p-Cumarato de octadecila
C27H440 3
IVvma/,mcm-1: 3390,1716, 1640,1608,1588,720. Espectro 14, p. 57.
EM (70 eV) mlz (int. rel.): 416 [M+1] (3), 417 [M+2] (1)., 177 (2),
164 (100),147 (56),119 (12),107 (17). Espectro 15, p. 57; Figura 27, p 109.
RMN-1H (300 MHz, CDCb): Espectro 11, p. 54; Tabela 11, p. 103.
RMN_13C (75 MHz, CDCb): Espectro 13, p. 56; Tabela 12, p. 104.
(E)-4-Hidroxi-3-metoxicinamato de octadecila (13)
(E)-Ferulato de octadecila
C28H460 4
IV Vmaxfilm cm-1: 3422, 2851, 1711, 1634, 1161,982. Espectro 20, p. 62.
EM (70 eV) m/z (int. rel.): 446 [M+1] (14), 447 [M+2] (1), 207 (1), 194 (100),
177 (55),149 (16), 17 (23). ). Espectro 21, p. 62; Figura 27, p. 109.
RMN-1H (300 MHz, CDCb): Espectro 16, p. 58; Tabela 13, p. 107.
RMN-13C (75 MHz, CDCb): Espectro 18, p. 60; Tabela 14, p. 108.
(Z)-4-Hidroxi-3-metoxicinamato de octadecila (14)
(Z)-Ferulato de octadecila
C28H4604
IV Vma/,m cm-1: 3422, 2851, 1711, 1634, 1161,721. Espectro 20, p. 62;
EM (70 eV) m/z (int. rel.): 446 [M+1] (14),
447 [M+2] (1), 207 (1),194 (100),177 (55),
149 (16),17 (23). Espectro 21, p. 62; Figura 27, p. 109.
RMN-1H (300 MHz, CDCb): Espectro 16, p. 58; Tabela 13, p. 107.
RMN_13C (75 MHz, CDCb): Espectro 18, p. 60; Tabela 14, p. 108.
7,3' ,4' -Trimetoxi-isoflavona (~)
Cabreuvina
C18H1605
EM (70 eV) m/z (int. rel.): 312 [M+] (2),156 (3),297 (3),150 (6),122 (11),
119 (15),162 (5). Espectro 27, p. 68, Figura 28, p. 113.
RMN-1H (200 MHz, CDCb): Espectro 22, p. 63; Tabela 15, p. 112.
41
5,7 -Diidroxi- 4',7' -dimetoxi-isoflavona (~)
Irisolidona
C17H1406
EM (35 eV) m/z (int. reL): 314 [M+] (66),315 [M+1] (13) , 316 [M+2] (12),
299 (100), 271 (40) , 182 (1),
167 (4), 139 (33) , 132 (4). Espectro 28, p. 68, Figura 29, p. 114.
RMN-1H (2000 MHz, CDCb): Espectro 25, p. 66; Tabela 16, p. 112.
(75, 8R, 7'5, 8'R)-4,4'-Diidroxi-3,3'-dimetoxi-7,9':7',9-diepoxi-lignana (§)
(+ )-Pinoresinol
C2QH 2206
[0.]025 + 84.4° ( c 1.0 MeOH)
EM (70 eV) m/z (int. reL): 356 [M+] (18) ,
205 (12),163 (22), 151 (100), 137 (46) ,
123 (8) , 77(15). Espectro 31 , p. 71 , Figura 32, p. 118.
RMN-1H (200MHz, CDCb): Espectro 29, p. 69; Tabela 17, p. 117.
(75, 8R, 7'5, 8'R)- 3,3'- 4,4'- Tetrametoxi- 7, 9':7',9 - diepoxi-lignana (1)
(+ )-Eudesmina
C22H2606
[0.]025 + 60,5° ( c 1.0; MeOH)
EM (70 eV) m/z (int. reL): 386 [M+] (29), 220 (4),219 (1) , 194 (9),193 (4) , 180 (3),
177(67), 165 (100) , 151 (65) , 137 (7) Espectro 32, p. 71 , Figura 33, p. 119.
RMN-1H (200MHz, CDCb): Espectro 30, p. 70, Tabela 17, p. 117.
rei - (7R, 85, 8'5) - 4,4',9 - Triidroxi-3,3'- dimetoxi-7,9'- epoxilignana HH (+ )-Lariciresinol
C2QH 240 6
[0.]025 + 23° (c 1.0; Me20)
EM(70 eV) m/z (int.rel ): 360 [M+] (27) , 342 (2) , 219 (10) , 194 (30) , 152 (16),
151 (51) , 137 (100) ,123 (13) , 122 (27). Espectro 38, p. 77.
RMN-1H (300 MHz, CDCb): Espectro 33, p. 72, Tabela 18, p. 122.
RMN_13C (50 MHz, CDCb): Espectro 35, p. 73, Tabela 19, p. 123.
42
rei - (7 R, 85, 8'5)-4,4' -Diidroxi-9-acetiloxi-3,3' -dimetoxi-7 ,9' -epoxilignana (~)
(+ )-9' -O-Acetil-Iariciresinol
C22H2607
[a]o25 + 3,50 (c 1,0; Me20)
IVvmaxl7lmcm-1: 3415,1734,1460,1270, 1123, 1035,
819,800. Espectro 40, p. 78.
EM (70 eV) m/z (int. rei): 402 [M+] (19) , 342 (5), 219 (18),
205 (22),151 (54),137 (100) , 123 (8) , 122 (16).
Espectro 39, p. 77, Figura 34, p. 124.
RMN-1H (200 MHz, CDCb): Espectro 35, p. 74, Tabela 18, p. 122.
RMN_13C (50 MHz, CDCb): Espectro 37, p. 76, Tabela 19, p. 123.
f3- sitosterol (.11) [74]
C29HsoO
EM (70 eV) m/z (int. rei): 414 [M+] (78) ,
396 (43), 329 (56) , 303 (51), 273 (32), 255 (42) ,
213 (51), 55 (100). Espectro 42, p. 80.
RMN-1H (200 MHz, CDCb): Espectro 41 , p. 79.
43
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Espectro 1: Espectro de RMN-1 H (200 MHz, CDCI3) da fração diclorometânica (A3) do extrato de calos
45
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Scan 934 (21.387 min) of DATA:0295.D
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PL 4-2
Espectro 42: Espectro de massas (70 eV) de 10.
81
RESULTADOS E DISCUSSÃO
1- Cultura de Tecidos
1.1 - Indução e Manutenção de Calos
Dos diferentes explantes de A. angustifolia testados, apenas
embriões inteiros e eixos embrionários, obtidos nos meios M1A e F1A foram
efetivos na indução de calos (Figuras 14, p. 83 a 26, p. 90). Os meios F2A e F3A
não induziram de calos.
As principais dificuldades na manutenção das culturas de
calos, foram os processos de necrose e oxidação apresentado por cerca de 90%
do material , após 15 dias de transferência.
1.1-A. Plântulas
As tentativas de estabelecimento de culturas tendo-se como
explantes, segmentos de caules de plântulas crescidas sob condições normais de
luminosidade não foram satisfatórias, pois apresentaram altos índices de
contaminação e oxidação (Figura 18, p. 85 e 22, p. 87.
O material proveniente das plântulas estioladas (Figuras 19,
p. 85; 22, p. 87 e 23, p. 88) , mostrou resultados satisfatórios, com exceção de
ARA2 (Figura 23, p. 88) o qual não foi efetivo na indução da desdiferenciação. O
subcultivo em massa porém não foi possível , pois cerca de 30 dias após a
transferência, 70% dos calos estavam oxidados. Foi verificado que o ferimento
demasiado dos calos durante a transferência favorecia o processo de oxidação,
não sendo porém o fator determinante para tal processo, pois em cerca de 25
dias, 33% do material não injuriado permaneceu com a mesma coloração
esverdeada, enquanto que 27% do material injuriado também mostrou o mesmo
quadro. A variação da concentração de auxinas também não afetou visualmente o
comportamento das colônias celulares (Figuras 24, p. 89 e 25, p. 89). Entretanto
82
como cerca de 13% dos calos de ARA4 resistiram à primeira transferência
(Figura 26, p. 90), optou-se pela inoculação em massa de explantes neste meio a
fim de obter material suficiente para as análises fitoquímicas. Os calos obtidos
foram repicados mais duas vezes a cada 50 dias, depois do que foram
submetidos ao processo de extração (Materiais e Métodos).
100 90 80 70
% 60 50 40 30 20 10
O
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M1A M3A M5A F1A F4A
Meio de cultura
• Formação de calos
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Figura 14: Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes obtidos a partir de embriões inteiros mantidos na luz
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calos 60 50 40 30 20 10 O
M1A M3A M5A F1A F4A
Meio de cultura
• Oxidação
Figura 15:Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes obtidos a partir de embriões inteiros mantidos no escuro
83
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%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
O M1A M3A M5A F1A
Meio de cultura F4A
• Formação de calos O Oxidação
Figura 16: Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes obtidos a partir de eixos embrionários mantidos na luz
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M1A M3A M5A F1A F4A Meio de cultura
Figura 17: Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes obtidos a partir de eixos embrionários mantidos no escuro
84
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Meio de cultura
Figura 18: Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes obtidos a partir de plântulas crescidas na luz
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
O ARA 1 ARA3 ARA4 MBF-13
Meio de cultura
o Formação de calos
• Oxidação
Figura 19: Porcentagem de formação de calos e oxidação dos explantes obtidos a partir de plântulas estioladas
85
Dias
Dias
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 O
M1A M3A M5A F1A F4A
Meio de cultura
Figura 20: Tempo de cultura para formação de calos em embriões inteiros
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 O
M1A M3A M5A F1A
Meio de cultura
Figura 21: Tempo de cultura para formação de calos em eixos embrionários
F4A
86
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• Escuro
CJ Luz
• Escuro
100 90 80
Dias 70 60 50 40 30 20 10 O
ARA1 ARA3 ARA4 M8F-13
Meio de cultura
Figura 22: Tempo de cultura para formação
• Plântulas crescidas na luz
O Plântulas estioladas
de calos em plântulas crescidas na luz e estioladas
87
co co
89
Figura; 24: Desenho esquemático de uma placa de Petri multi pIa, onde os círculos vermelhos e azuis
representam repectivamente os calos transferidos intactos e injuriados. Nas linhas houveram variação quanto
a concentração de auxina.
Figura 25: Placa de Petri múltipla, com calos obtidos no meio ARA4, montada segundo a Figura 24.
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91
11.2 - Discussão
Dos explantes testados, os provenientes do caule de plântulas
estioladas, apresentaram melhores resultados. Embriões inteiros e eixos
embrionários também foram efetivos na formação de calos friáveis com bom
crescimento, entretanto não foi possível subcultivá-Ios.
Quanto a composição dos meios de cultura, as auxinas 2,4-D
e ANA foram efetivas na indução da proliferação celular, o que também foi
constatado para outras espécies de coníferas [77]. Entre os meios testados,
ARA4 foi o único efetivo na promoção da desdiferenciação e na manutenção dos
calos obtidos; o meio MBF-13 induziu calos num período de tempo bem mais
curto que ARA4, entretanto não foi efetivo no subcultivo das massas celulares
obtidas.
o maior problema encontrado no cultivo de calos desta
espécie, foi a manutenção das colônias celulares obtidas, o que também foi
relatado para várias espécies do gênero Araucaria [75, 78-83}. A redução do
crescimento ou a morte das colônias celulares após a fase de indução, parece
ocorrer em muitas culturas de coníferas. Em Pícea abíes, somente 10 a 15% das
massas celulares induzidas continuaram a proliferação. Respostas similares
foram observadas também para Pícea glauca e P. engelmanii [84 - 86]. Em seu
trabalho sobre morfogênese celular e poliembriogênese somática de A.
angustifolia, Astarita [87] observou que durante a fase de estabilização e
multiplicação das culturas induzidas, ocorria grande diminuição no número de
colônias celulares e que mesmo reduzindo as concentrações dos reguladores de
crescimento, apenas 11 ,2% das massa celulares permanecem vivas.
Como 13% dos calos resistiram às duas transferências
realizadas, optou-se por inocular grande quantidade de explantes a fim de obter
massa celular suficiente para as análises fitoquímicas.
11- Fifoquímica
11.1 - Substâncias Isoladas de Araucaria angustifolia
Caule Adulto
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94
11.2 - Determinação Estrutural
11.2 - A - Derivados do Benzaldeído
Nos espectros de massas (Espectros 5 e 6, p. 49) das
substâncias 1 e ~ , é possível observar picos relativos aos íons moleculares em
m/z 152 e 122. Estes valores associados a integração de hidrogênios no espectro
de RMN de 1H, foram compatíveis com as respectivas fórmulas moleculares
CSHS0 3 e C7H60 2, o que possibilitou identificá-Ias respectivamente, como sendo o
p-hidroxibenzaldeído [88, 89] e o 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído (vanilina) [88, 90] .
Os espectros de RMN - 1 H (Espectros 2, p. 46 e 3, p. 47) apresentaram como
característica comum, um singleto na região de 9,7'6 referente ao hidrogênio
aldeídico, além de diversos sinais na região dos hidrogênios aromáticos.
No espectro de RMN de 1 H (Espectro 2, p. 46; Tabela 6, p.
96) do p-hidroxibenzaldeído 1, pode-se observar dois dubletos em 6,94'6 e 7,79'6
com J=8,1 Hz, atribuídos aos H-3/H-5 e H-2/H-6 respectivamente, os quais
acoplam num sistema AxBx [90], indicando portanto, um anel aromático para
substituído. Considerando que os hidrogênios desprotegidos estão em posição
orto à carbonila aldeídica, e que os outros hidrogênios estão acoplados a estes, a
estrutura do p-hidroxibenzaldeído tornou-se evidente.
o o
2
OMe
OH 1 2 OH
95
No espectro de RMN-1 H (Espectro 3, p. 47 e Tabela 7 p. 96)
da substância 2, foi possível observar, além de um singleto de hidrogênios
metoxílicos em 3,918 (3H), um dubleto em 6,988, atribuído à H-5, o qual acopla
com H-6 (J=8,08 Hz) e um multipleto em 7,368 atribuído a H-6/H-2. Tal padrão de
substituição, associado a presença de uma hidroxila e uma metoxila como
substituíntes, possibilitaram identificá-Ia como a vanilina. A confirmação definitiva
foi obtida através dos dados de RMN - 13C (Espectro 4, p. 48 e Tabela 8, p. 96) e
por comparação cromatográfica com uma amostra autêntica da mesma.
Os íons fragmentários apresentados foram compatíveis com
benzaldeídos substituídos, confirmando as estruturas apresentadas.
O p-hidroxibenzaldeído é frequentemente encontrado na sua
forma glicosilada [91] , no estado livre entretanto havia sido isolado somente nas
espécies Papa ver somniferun (Papaveraceae) e Iryanthera lancifolia
(Myristicaceae) [92] . A vanilina foi primeiramente isolada dos frutos da Vanilla
planifolia , uma espécie de orquídea vivaz e espontânea nas florestas úmidas do
México, atualmente cultivada em várias partes do mundo [93]. Hoje ela pode ser
produzida industrialmente por oxidação do isoeugenol e do piperonal (3,4-
metilenodioxibenzaldeído) [94, 95].
Hidrogênios 8 (ppm)
p-hidroxibenzaldeído (1)
H-3/H-5 6,94 (d, J= 8,1 Hz, 2H)
H-2/H-6 7,79 (d, J=8,1 Hz,2H)
CHO 9,76 (s, 1H)
Tabela 6: Dados de RMN-1H (200 MHz, CDCI3) do p
hidroxibenzaldeído (1).
Hidrogênios 8 (ppm)
vanlina (2)
H-5 6,98 (d, J= 8,08 Hz, 1 H)
H-2/H-6 7,36 (m, 2H)
Ar-OCH3 3,91 (s, 3H)
Ar-OH 3,59 (sI, 1 H)
CHO 9,76 (s, 1H)
Tabela 7: Dados de RMN-1H (200 MHz, CDCI3) da vanilina ~)
96
Carbonos 8 (ppm)
Vanilina (2)
C-1 129,99
C-2 108,89
C-3 147,10
C-4 151,83
C-5 114,34
C-6 127,55
CHO 190,88 I
Ar-OCH3 56,12
Tabela 8: Dados de RMN-13C (50 MHz, CDCI3) da vanilina ~)
97
11.2 - B. Fenilpropanóides
A) Coniferaldeído
A substância ~ foi identificada como sendo o fenilpropanóide,
coniferaldeído, com base nas técnicas espectroscópicas de RMN de 1H, 13C e
HOMO-COSY 1H_1H, e ainda na espectrometria de massas.
No espectro de RMN-1H (Espectro 7, p. 50; Tabela 9, p. 99),
um singleto largo em 5,910, integrando para um hidrogênio, e outro singleto em
3,880, integrando para três hidrogênios, indicaram a presença de uma hidroxila e
de uma metoxila aromática, respectivamente. O duplo dubleto em 7,060 (J = 1,8 e
8,1 Hz) acoplando com os dubletos em 7,000 (1 ,8 Hz) e em 6,69 (8,1 Hz),
característicos para prótons com relação meta e orto, foram atribuídos aos
hidrogênios H-6, H-2 e H-5, respectivamente. A definição do padrão de
substituição como sendo 4-hidroxi-3-metoxifenila foi confirmada através dos
dados obtidos no espectro de RMN-13C (Espectro 9, p. 52; Tabela 10, p. 100).
O espectro de RMN-1H, apresenta ainda um dubleto em 7,330
(H-7) e um duplo-dubleto em 6,520 (H-8) que acoplam entre si com J=15,8 Hz,
característico de hidrogênios em ligação dupla trans. Através do espectro de
HOMO-COSY 1 H_1 H (Espectro 8, p. 51) e das constantes de acoplamento, pode
se observar que H-8, também acopla com um outro hidrogênio em 9,580 como um
dubleto, o que sugere a presença de um grupamento cinamaldeídico. Tal fato foi
confirmado pelo espectro de RMN-13C, o qual mostrou sinais em 193,500, típico
para carbonila de aldeídos conjugados e em 153,00 (C-7) e 124,040 (C-8)
(Espectro 9, p. 52; Tabela 10, p. 100). Os sinais referentes aos carbonos
aromáticos foram concordantes com aqueles correspondentes ao coniferaldeído
[96] .
o 6 7
H
HO
OMe
98
A configuração definitiva foi obtida pela espectrometria de
massas (Espectro 10, p. 53), que apresentou pico em m/z 178 correspondente ao
íon molecular, e o íon fragmentário em m/z 137, indicando um íon tropílio
substituído por uma hidroxila e uma metoxila.
Os dados encontrados foram coerentes com os registrados
para o coniferaldeído [96, 97]. Este possui ampla distribuição no reino vegetal,
tendo sido relatado juntamente com siringaldeído, como os principais
componentes do extrato aquoso de Senra íncana (Malvaceae). Estudos
farmacológicos sobre este extrato, e seus principais constituintes isolados,
revelaram que o coniferaldeído é capaz de inibir a prostaglandina-sintetase numa
potência cinco vezes maior que o ácido acetilsalicílico [97] .
BIBLIOTECA INSTITUTO DE QUíMICA
Universidade de São Paulo
99
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9
,58
(d,
J=
7,7
Hz,
1 H
)
Ar-
OM
e
3,8
8 (
s, 3
H)
Ar-
OH
5,
91 (
si,
1 H
)
Ta
be
la 9
: D
ados
de
RM
N-1 H
(20
0MH
z, C
DC
I 3)
do c
onife
rald
eído
@).
Carbonos 8 (ppm)
coniferaldeído (~
C-1 128,82
C-2 109,41
C-3 146,91
C-4 148,89
C-5 114,90
C-6 126,45
C-7 153,00
C-8 124,04
C-9 193,56
Ar-OCH3 55,99
Tabela 10: Dados de RMN_13C (SOMHz, CDCI3) do coniferaldeído @)
BIBLIOTE CA INSTITUTO DE QUíMICA
Universidade de São Paulo
100
101
B) (E)- e (Z)-p-Cumarato de octadecila
o espectro na região do IV (Espectro 14, p. 57) da mistura de
11 e 12 (fração A3/2-1) apresentou bandas de absorções em, 1716 cm-1,
correspondente a uma carbonila de éster u , p -insaturada, e em 1675, 1608, 1588,
1465 cm-1, correspondentes à ligação dupla conjugada e anéis aromáticos.
No espectro de RMN-1 H (Espectros 11 , p. 54 e 12, p. 55) da
fração C2-1 observa-se na região dos hidrogênios aromáticos, dois dubletos em
6,790 e 7,360, cujos acoplamentos de 8,6 Hz (Tabela 11 , p. 103) indicam
claramente a presença de um sistema aromático para dissubstituído AxBx. Um
singleto largo em 5,458 indicou que uma hidroxila seria um dos substituíntes deste
anel, enquanto as cadeias cinamílicas foram determinadas através da observação
de dois dubletos em 7,558 e 6,238 (J=15,9 Hz) e 6,748 e 5,768 (J=12,9Hz),
caracterizam hidrogênios olefínicos E e . Z, respectivamente. Bandas de
deformação C=C em 980 cm-1 e 720 cm-1 no espectro de . IV, confirmaram
respectivamente a presença dos sistemas E e Z.
o 20'
II l ' CH3 7 ~O""'C~' (CH2h 6"""
HO 11
3~8 .AJ6 ~~ l ' 20'
HO 5 o O_CH2'(CH2h6-CH3
12 5
102
A definição da estrutura como sendo um éster graxo do ácido
p-cumárico foi propiciada pela RMN de 1 H, onde pode-se observar a intensidade
relativa do singleto largo em 1,190, referente à uma longa cadeia metilênica e do
tripleto em 0,810 (6,9 Hz) referente à uma metila terminal. Dados conclusivos que
afastaram a possibilidade da cadeia alifática estar presente devido à impurezas,
foram as absorções de dois tripletos em 4,110 e 4,050, referentes aos hidrogênios
metilênicos H-1 '(trans e cis) desprotegidos pelo oxigênio carbinólico. Esta
possibilidade estrutural foi confirmada pelo espectro de RMN de 13C (Espectro
13, p. 56; Tabela 12, p. 104), que mostrou absorções em 167,530 e em 64,630,
características de carbonila de éster e de carbono carbinólico, respectivamente.
Os dados de RMN de 13C confirmaram ainda o padrão de substiuição do anel
aromático (Tabela 12, p. 104).
A proposta do tamanho desta cadeia alifática como sendo
C18H37, foi feita com base na espectroscopia de massas (Espectro 15, p. 57,
Figura 27, p. 109) que indicou m/z 416 (C27H4403) como íon molecular, e ainda o
pico base em m/z 164 (C9H703), atribuído ao íon acílio correspondente.
Os dados obtidos confrontados com os publicados [98 - 100],
possibilitaram confirmar as estruturas das substâncias 11 e 12 como sendo o (E)
p-cumarato de octadecila e o (Z)-p-cumarato de octadecila, respectivamente. A
integração dos hidrogênios do espectro de RMN - 1 H apontou para uma proporção
aproximada de 4:1 entre os isômeros cis e trans na mistura.
Tais produtos, tem sido descrito em várias espécies [101
103]. Um dos motivos de ampla distribuição talvez seja o seu possível
envolvimento, juntamente com ésteres análogos do ácido ferúlico no processo de
formação da suberina [103] .
103
Hid
rog
ên
ios
o (p
pm
)
(E)-
p-c
um
ara
to d
e o
ctad
ecíla
(1.
1)
(Z)-
p-cu
mar
ato
de o
ctad
ecíla
(1.
1)
H-2
/H-6
6
,79
(d,
J= 8
,6 H
z, 2
H)
6,7
9 (d
, J=
8,6
Hz,
2H
)
H-3
/H-5
7,
36 (
d, J
= 8
,6 H
z, 2
H)
7,36
(d
, J=
8,6
Hz,
2H
)
H-7
7
,55
(d,
J= 1
5,9
Hz,
1 H
) 6
,74
(d, J
= 12
,7 H
z, 1
H)
H-8
6
,23
(d, J
= 1
5,9
Hz,
1 H
) 5
,76
(d, J
= 12
,7 H
z, 1
H)
H-1
' 4
,11
(t, J
= 6
,7 H
z, 2
H)
4,0
5 (t
, J=
6,7
Hz,
2H
)
H-2
' 1,
61 (
m,
2H)
1,61
(m
, 2H
)
-(C
H2
)17-
1,1
8(s
l,3
0H
) 1
,18
(sl,
30H
)
H-2
0'
0,8
1 (t,
J=
6,9
Hz,
3H
) 0
,81
(t, J
= 6
,9 H
z, 3
H)
Ar-
OH
5,
46 (
si,
1 H)
5,46
(si
, 1 H
)
Ta
be
la 1
1: D
ados
de
RM
N-1 H
(30
0 M
Hz,
CD
CI 3
) do
(E
)-e
(Z)-
p-cu
mar
ato
de o
ctad
ecila
11
e 12
.
104
Carbonos 8 (ppm)
(E)-p-cumarato de octadecila
(11)
C-1 129,90
C-2/C-6 132,30
C-3/C-5 115,85
C-4 157,78
C-7 144,24
C-8 115,75
C-9 167,53
C-1 ' 64,63
C-2' 31 ,92
C-3' 25,98
C-4'-C-19' 29,68
C-2O' 14,07
Tabela 12: Dados de RMN-13C (75 MHz, CDCI3) do (E)- e (Z)-p-cumarato de octadecila 11 e 12.
105 C) Ferulato de octadecila
o espectro na região do IV (Espectro 20, p. 62) da fração
A3/2-2, mostrou bandas de absorções em 3422 cm-l e 1711 cm-l , indicando um
grupamento hidroxila e uma carbonila de éster a ,B-insaturada, respectivamente e
em 1634, 1519 e 874 cm-1, referentes ao estiramento de um anel aromático.
Bandas em 983 cm-1 e 721 cm-1 sugeriram uma mistura de isômeros trans e eis.
Os espectros de RMN de 1H (Espectros 16, p. 58 e 17, p. 59;
Tabela 13, p. 107) e de l3C (Espectros 18, p. 60 e 19, p. 61 ; Tabela 14, p. 108),
mostraram sinais característicos para o ferulato, e confirmaram a presença de
uma mistura de isômeros; a configuração da ligação dupla foi deduzida a partir
das constantes de acoplamento dos dubletos relativos aos hidrogênios olefínicos
em 7,54õ e 6,22õ, (J=15,9 Hz), típicos de sistemas E e 6,72õ e 5,74õ (J=12,9 Hz)
típicos de sistemas Z, de forma análoga aos ésteres alifáticos do ácido p
cumárico.
A cadeia alifática, constatada através de um singleto largo em
1,84õ, foi novamente considerada como ligada à molécula devido as absorções
dos tripletos em 4,12õ e 4,05õ, referentes aos hidrogênios H-1'dos isômeros E e
Z, respectivamente, e pelo tripleto em O,77Õ, referente à metila terminal. O
tamanho da cadeia metilênica foi deduzido a partir do espectro de massas
(Espectro 21, p. 62, Figura 27, p. 109), que mostrou o íon fragmentário em m/z
474 (C28H460 4) como M+1 e m/z 475 como M+2; o pico base em m/z 194
(C1QH904) corresponde à estrutura do ferulato.
2 7 l ' 2fJ
9"""" O"" C H2 ..... (CHV16/CH3
2 7
MeO~8
N 6 ,,~9 l' 2fJ
HO 5 o 0-C~'(CH2)1 6-CH3
o
HO 5
13 14
106
A proporção entre os dois isomeros foi estimada também
como 4:1 , com base na integração dos diversos sinais no espectro de RMN-1H.
Com base nos dados espectroscópicos obtidos e na literatura
[104-1 06] as substâncias 13 e 14 foram identificadas como sendo o (E)- ferulato
de octadecila e (Z)- ferulato de octadecila, respectivamente.
Tais produtos foram previamente isolados em cultura de
células de Kalanchões daigremotiana [107] e em vários tecidos de outras
espécies [104- 108].
107
Hidrogênios o (ppm)
(E)-ferulato de octadecila (11) (Z)-ferulato de octadecila (11)
H-2 6,97 (d, J= 1,B Hz, 1 H) 6 ,97 (d, J= 1,B Hz, 1 H)
H-5 6,B4 (d, J= B,1 Hz, 1 H) 6 ,B4 (d, J= B,1 Hz, 1 H)
H-6 7,00 (dd, J= B,1 e 1,B Hz, 1 H) 7,00 (dd, J= B,1 e 1,B Hz, 1 H)
H-7 7,54 (d, J= 15,9 Hz, 1H) 6,72 (d, J= 12,9 Hz, 1H)
H-B 6,22 (d, J= 15,9 Hz, 1 H) 5,74 (d, J= 12,9 Hz, 1H)
H-1' 4,12(t, J=6,BHz,1H) 4,05 (t, J= 6,B Hz, 1 H)
H-2' 1,61 (m, 2H) 1,61 (m, 2H)
-(CH 2h7- 1,18 (si, 30H) 1,18 (s', 30H)
H-20' 0,77 (t, J= 6,8 Hz, 3H) 0,77 (t, J= 6,8 Hz, 3H)
Tabela 13: Dados de RMN-1H (300 MHz, CDCI3) do (E)- e (Z)-ferulato de octadecila (ll e 14).
108
Carbonos 8 (ppm)
(E)-feru/ato de octadecila (11)
C-1 128,83
C-2 109,26
C-3 146,72 ,
i
C-4 147,86
C-5 114,67
C-6 123,03
C-7 144,60
C-8 115,68
C-9 167,38
C-1' 64,44
C-2' 31,91
C-3' 25,98
C-4'-C-19' 29,30
C-20' 14,11
Ar-OCH3 55,92
Tabela 14: Dados de RMN_13C (50MHz, CDCI3) do (E)- e (Z)-ferulato de octadecila (tl e tl) .
l+
7 . CH=CH-CO R,O~ ,-C"H"
R2
~C1~
A- 416 [M+] (3)*
8- 446 [M+] (14)*
~CH=CH-C02-CH2+
RP~ ~CH=CH-CO~ l: RP~
..
R2 A- 177 (2)
8- 207 (1)
A 148+ (6) B 178+ (7)
~/ Rp R2
A- 107 (17)
8- 137 (23)
A- R1 = R2 = H C11 e 12)
8- R1= H; R2= OMe (13 e 14)
R2
A-164 (100)
8- 194 (100)
1
~CH-CH-CO+ I -
RP ~ R2
A-147 (56)
8- 177 (55)
j ~CH=C+H
RP~ R2
A- 119 (12)
8- 149 (6)
Figura 27: Interpretação do espectro de massas obtido para 11, 12, 13 e 14
109
110
11.2 - C. Isoflavonas
As isoflavonas ~ e ~, foram identificadas através da análise
dos seus espectros de RMN de lH e de massas, além de comparação com dados
descritos na literatura [109 - 110].
Um pico em m/z 312 M+, no espectro de massas de ~ ,
(Espectro 27, p. 68 e Figura 28, p. 113), associado às absorções de hidrogênio
aromático (6H), olefínico (1 H) e metoxílicos (9H), no espectro de RMN-1H
(Espectros 22, p. 63 e 23, p. 64; Tabela 15, p. 112), é compatível com a fórmula
molecular C18H1605.
A presença do singleto em 7,908, referente a um hidrogênio
desprotegido diagnosticou o esqueleto carbônico da substância como sendo de
isoflavonóide. Um dubleto em 8,848 (J = 8,9 Hz), referente a um hidrogênio
desprotegido por ligação de hidrogênio, foi atribuído ao H-5. Através das
constantes de acoplamento do espectro de RMN de 1 H e de correlações
observadas no espectro de HOMO-COSY 1 H_1 H (Espectro 24, p. 65), foi possível
verificar o acoplamento de H-5 com um duplo-dubleto em 6,948 (J = 8,9 e 2,4 Hz)
atribuído a H-6, e este por sua vez, acoplando numa relação meta com um
dubleto em 6,808 (J=2,4 Hz ) foi atribuído a H-8. A presença de um duplo
dubletoem 7,008 (J=8,3 Hz e 1,9 Hz), acoplando com um dubleto em 6,868 (8,3
Hz), e com um dubleto em 7,158 (J=1 ,9 Hz), com relações orlo e meta entre
esses hidrogênios, definiram o padrão de substituições do anel B.
8 8
MeO
OMe 4
OMe I
OMe 5
111
A presença de três metoxilas aromáticas juntamente com
sinais dos hidrogênios aromáticos dos anéis A e B no espectro de RMN de 1 H e
HOMO-COSY 1 H_1 H, possibilitaram a atribuição destes grupamentos nas
posições 7, 3',4'. O íon fragmentário em mtz 162 (Espectro 27, p. 68; Figura 28,
p. 113) confirmou o padrão de substituição do anel B. A substância foi então
caracterizada como sendo a cabreuvina, a qual havia sido isolada das sementes
de Calopogonium mucunoides [109].
No espectro de RMN de 1 H (Espectro 25, p. 66; Tabela 16, p.
112) da substância .§ observou-se um singleto em 7,860, atribuído à H-2; a
presença de um singleto em 6,380, característico de H-8, e dois dubletos em
7,400 e 6,688 com (J=8,8 Hz, 2H), indicaram, respectivamente, o padrão penta
substituido para o anel A e p-substituido para o anel B. Observou-se a absorção
de prótons referentes à duas metoxilas aromáticas (3,780 e 3,910) e um
hidrogênio hidroxílico em 6,200. O íon fragmentário em m/z 132 (Espectro 28, p.
68; Figura 29, p. 114) definiu a presença de uma metoxila na posição para do
anel B. A definição das posições de substituição da metoxila e da hidroxila, foi
feita com base no espectro de NOE diff. (Espectro 26, p. 67) , onde foi possível
observar um efeito NOE nos sinais de H-3'tH-5' quando os hidrogênios
metoxílicos em 3,780 foram irradiados. A irradiação na metoxila em 3,910 não
exerceu nenhum efeito no sinal de H-8, indicando que a mesma deve estar
localizada entre as hidroxilas. Tais inferências confirmam as posições das
metoxilas nas posições 6 e 4', que são relativa a isoflavona irisolidona [110]
previamente isolada do caule de Pericopsi mooniana [111] e Podocarpus amarus
[110] .
112
Hidrogênios J(ppm)
cabreuvina (!) Hidrogênios J(ppm)
H-2 7,90 (1 H, s) irisolidona (!J
H-5 8,84 (1 H, d, J=8,9 Hz) H-2 7,86 (1 H, s)
H-6 6,94 (1 H, dd, J=8,9 e 2,4 Hz) H-8 6,38 (1 H, s)
H-8 6,80 (1 H, d, J= 2,4 Hz) H-2'tH-6' 7,40 (2H, d, J=8,8 Hz)
H-2' 7,15 (1H, d, J=1,9 Hz) H-5'tH-3' 6,86 (2H, d, J=8,8 Hz)
H-5' 6,86 (1 H; d; J=8,3 Hz) C5-0H 12,55 (1 H, s)
H-6' 7,00 (1 H, dd, J=8,3 e 1,9 Hz) C7-0H 6,2 (1 H, sI)
ArOCH3 3,86 (3H , s) C-6-0CH3 3,91 (3H, s)
ArOCH3 3,85 (1 H, s) C-4'-OCH3 3,78 (3H, s)
ArOCH3 3,84 (1 H, s) Tabela 16: Dados de RMN-1H (300MHz, CDCh) da irisolidona~)
c:: z CO ::t (fl <" ~CO '" ~.
P- ::ir ., c- o '"
Tabela 15: Dados de RMN-1 H (200MHz, CDCI3) da cabreuvina ~) .
c- oa '" ~-4 Ul .,,, o ~, rn "O ~ o ., c (") Õ 1> J>
MeO
312 [M+] (2)
Rearranjo 1,4
O~+ MeO 7
'OC-H II
151 (12) O
I MeO l+
l~::( . C~
150 (6) ~o
Me°uol: 122 (11)
+aO
~ c~O 119 (15)
OMe
l: MeO
OMe
297 (3)
Retro Diers Alder
1 Hc=c--Q-oJ:
OMe
162 (5)
j
HC::C--Q-0+ OMe
147 (18)
Figura 28: Interpretação do -espectro de massas obtido para a cabreuvina @ .
113
0+ OMe
HO
MeO
l~
OMe 314 [M+] (66)
~
Retro Diers Alder
H°Y'f°l +
Meo~c OH "O
182 (1)
HC=C-Q-O:r
132 (4)
~
HO
O
271 (40)
/ OMe
299 (100)
Retro Diers Alder
HOyyO
+O~C" OH O
167 (4)
-
OMe
HO
J0O
h+ O
OH
139 (33)
Figura 29: Interpretação do espectro de massas obtido para a irisolidona @.
114
115
11.2 - D. Lignanas Furofurânicas
Uma das maiores subclasses de Iignanas são as do tipo
furofurânicas. Elas estão amplamente distribuídas na natureza, e tem como
característica básica a presença do sistema 3,7-dioxabiciclo [3.3.0] octano [109 -
110]. Em A. angustifo/ia haviam sido isolados o pinoresinol , a eudesmina e o
filigenol [37 - 38] .
o anel furofurânico deste tipo de lignana (Figura 30)
apresenta sempre junção do tipo eis, devido a menor tensão envolvida quando
comparado a possibilidade trans. Dessa forma, a configuração nos carbonos da
posição 8 e 8', pode ser (S) (S) ou (R) (R), sendo a última a mais comum para a
maioria das lignanas furofurânicas naturais [112] .
EM {:po N O
Figura 30: Esqueleto carbônico das lignanas furofurânicas
Os substituíntes dos anéis alifáticos ocupam geralmente as
posições pseudo equatoriais e/ou pseudo axiais. Na ausência de outros grupos
funcionais nos anéis heterocíclicos, as possibilidades de isomeria podem resultar
em três possibilidades configuracionais (Figura 31): pseudo diequatoriais (ª),
pseudo equatorial/pseudo axial (forma epimérica) (Q) e pseudo diaxial (~) [113].
.. 8.-"A' ... 'dA' (yA'
At O MO A,N ª b c
Figura 31: Possibilidades isoméricas para lignanas furofurânicas
116 A espectroscopia de RMN-1 H, tem sido a principal técninca
para a diagnose da estereoquímica relativa deste tipo de lignanas. As estruturas
simétricas ª e ~ (Figura 31), podem ser definidas a partir dos deslocamentos
químicos dos hidrogênios 7 e T . No caso de epímeros, a quebra da simetria,
provoca o desdobramento dos sinais dos hidrogênios presentes no anel
furofurânico, aumentando a complexidade do espectro [114]. Segundo Becker e
Beroza [115], representantes da série pseudo diequatoriais podem ser
identificados pela absorção dos prótons oxibenzílicos em aproximadamente 4,75 8
(d, 4Hz), o que foi observado para as lignanas § (Espectro 29, p. 69; Tabela 17,
p. 117) e L (Espectro 30, p. 70; Tabela 17, p. 117). No caso de representantes
pseudo diaxiais, os mesmos hidrogênios absorvem em 4,908 [116 - 117].
(x0:e ~ OH
f~""~ I: 8 6 8
6
lQ/'l.... 9 ,.... " ° I
4'~ 2
t-K) J ª OMe
(x~e ~ 0Me
g/0"'Z.,,'" ~ I 5
U I 6
lQ<,,' I""'''). 4'~ 2
MeO J 7 OMe
Os deslocamentos químicos dos hidrogênios aromáticos,
indicam a presença de anéis do tipo guaiacílico ( 4-hidroxi-3-metoxibenzílico) para
a substância § , e veratrilico (3,4-dimetoxibenzílico) para a substância L. Estes
padrões de substituição foram confirmado pela espectroscopia de massas
(Espectros 31 e 32, p. 71 ; Figuras 32, p. 118 e 33, p. 119), através da análise
dos íons moleculares e, mais especificamente, dos íons tropílios.
Baseando-se nos dados descritos acima e na literatura
pesquisada, as substâncias § e L foram identificadas respectivamente como
sendo pinoresinol [118] e eudesmina [113] .
117
Hidrogênios 8 (ppm)
pinoresinol ~ eudesmina 1. H-7, H-7' 4,73 (d, J= 4,2 Hz, 1 H) 4,69 (d, J=4,2 Hz, 1 H)
H-8, H-8' 3,09 (m, 2H) 3,05 (m, 2H)
H-9 ax, H-9'ax # #
H-9 eq, H-9' eq 4,24 (dd, J=9,1 e 6,8 Hz, 2H) 4,20 (dd, J=9,0 e 6,9 Hz, 2H)
Ar-OMe 3,87 (s, 3H); 3,89 (s, 3H) 3,81 (s, 3H); 3,82 (s, 3H)
3,83 (s, 3H); 3,86 (s, 3H)
H-Ar 6,78 - 6,90 (m, 6H) 6,74 - 6,84 (m, 6H)
#- Os sinais de tais hidrogênios encontram-se encobertos pelos sinais das metoxilas aromáticas.
Tabela 17: Dados de RMN-1H (200 MHz, CDCI3) do pinoresinol ~) e eudesmina (1.).
HO
J:OH
7 )j'U r)O HO~ M+ 358 (18)
OMe
OMe 205 (12)
+
OH
HO OMe
@ YOMe
OH
137 (46)
+ GuCH-C H=C H 2
163 (22)
+
HO OMe
o
1 +
GuCHOl"
152 (27)
1
GuCO+
151 (100)
1 @ ~OMe
OH
123 (8)
Figura 32: Interpretação do espectro de massas obtido para o pinoresinol (ID.
118
+
OH
Jff'CMJ~
o ~ I CMe
rIJO MeO~ M+ 386 (29)
OMe
JfV~~ (yV V.f) ·
(yV V.)"O \\ •
+ VeCH=O=CH2
III
VeC("i/CH 2
O +.
180 (3)
! Ve+
137 (7)
1
@J 77 (21)
+ ArCH=CH-CH20H
194 (9)
+ ArCH-CH=CH2
177 (67)
® ,?,OMe
OMe
151 (65)
ve}j 219 (11)
VeCOCH2CH2+
193 (4)
Jv~' veJ..o)
Ve CHO+ 166 (38)
1 VeCO+
165 (100)
Meo-Q OMe
137 (7)
I: O
'1220 (4) Ve
Figura 33: Interpretação do espectro de massas obtido para a eudesmina (Z).
119
120 11.2 - D. Lignanas Tetraidrofurânicas
Com base nos espectros de RMN-1H (Espectro 33, p. 72),
RMN-13C (Espectro 34, p. 73), massas (Espectro 38, p. 77) e dados descritos na
literatura [37, 38, 119], a lignana -ª foi identificada como (+)-Iariciresinol ,
anteriormente descrita em A. angustifolia [37]. A lignana ª foi identificada com
base nos seus espectros de RMN-1H (Espectro 35, p. 74), HOMO-COSY 1H_1H
(Espectro 36, p. 75), RMN-13C (Espectro 37, p. 76), IV (Espectro 40, p. 78) e
massas, como sendo o 9' -O-acetil-Iariciresinol.
Os espectro de RMN-1H (Espectros 33, p. 72 e 35, p. 74;
Tabela 18, p. 122) de ambas as substâncias apresentaram deslocamentos
químicos característicos para este tipo de lignana tetraidrofurânica de ocorrência
natural e também resultantes da hidrogenólise parcial de lignanas furofurânicas
[113, 121-122].
OMe OMe
OH OH
g.
6" 6"
HO-Q'~" -O 8 5'("("'7 'O
HO~ ~
OMe OMe
121
Nestas duas lignanas tetraidrofurânicas, pode-se observar
nitidamente os duplo-dubletos referentes aos dois hidrogênios do carbono 9 (H-9a
e H-9P). OS hidrogênios H-9' não puderam ser observados no espectro da
substância !t por estar absorvendo na mesma região das metoxilas aromáticas
(3,830), entretanto, no caso do produto monoacetilado~, estes apareceram sob a
forma de duplo-dubletos (4,100 e 4,280), devido ao efeito de desproteção exercido
pelo grupamento acetila. Os hidrogênios H-7 também mostraram diferenças, pois
em ª foi possível observá-los como duplo-dubletos (2,47 e 2,880), enquanto na
lignana ~, estes absorveram na região de 2,44 - 2,790, junto com os H-8 e 8', sob
a forma de multipleto. Estas atribuições foram confirmadas pela análise do
espectro de RMN HOMO - COSY 1 H_1 H (Espectro 36, p. 75).
A RMN de 13C também forneceu informações precisas quanto
a estereoquímica relativa das lignanas isoladas [122]. Foi possível definir a
orientação pseudo-axial do anel aromático ligado ao C-T das duas lignanas
tetraidrofuranas isoladas, através do sinal em 82,6 +/- 0,3 ppm neste carbono,
(Espectros 34, p. 73 e 37, p. 76; Tábela 19, p. 123). Na lignana ª, o
posicionamento do grupamento acetila em C-9' foi feito com base na análise do
espectro de RMN-13C (Espectro 37, p. 76, Tabela 19, p. 123). Fonseca e
colaboradores [37, 38] estudaram extensivamente a aplicação deste tipo de
espectrometria em lignana tetrahidrofurânicas, e verificaram que a presença de
uma acetila no C-9' provoca uma desproteção de aproximadamente 2-3 ppm,
enquanto que o C-8' é protegido de aproximadamente 3,50 pelo efeito yexercido
pela carbonila, quando comparado a lignana não acetilada.
O grau e o padrão de substituição nos anéis aromáticos foram
deduzidos através dos dados observados nos espectros de massas (Espectros
39, p. 77 e 40, p. 78; Figura 34, p. 124) e por RMN de 1H e de 13C,
respectivamente.
Considerando que o acetato de etila foi utilizado nas etapas
de purificação, é possível que tal substância seja produto da acetilação do
lariciresi nol.
122
Hidrogênios 8 (ppm)
larícíresínol (!l) 9'-O-acefíl-larícíresínol (!V 7-H 2,47 (1 H, dd, J= 13,3, 10,9 Hz) 2,44 - 2,79 (3H, m )
7-H 2,88 (1 H, dd, J= 13,2, 4,8 Hz) 2,44 - 2,79 (3H , m )
T-H 4,73 (1 H, d, J= 6,6 Hz) 4,69 (1 H, d, J= 6,4 Hz)
8-H 2,34 (1H, m) 2,44 - 2,79 (3H , m )
8'-H 2,66 (1 H, m) 2,44 - 2,79 (3H, m )
9-Ha 3,97 (1 H, dd, J= 8,5, 6,5 Hz) 3.99 (1 H, dd, J= 8,6 e 6,2 Hz)
9-Hp 3,68 (1 H, dd, J= 8,5, 6,1 Hz) 3,66 (1 H, dd, J= 8,6 e 6,2 Hz)
9'-Ha 3,83 (1H , m) 4,10 (1H, dd, J= 11,3 e 7,3 Hz)
9'-HP # 4,28 (1 H, dd, J= 11 ,3 e 6,9 Hz)
Ar-H 6,60-6,81 (6H, m ) 6,58 - 6,83 (6H, m)
Ar-OMe 3,81 (3H, s) 3,81 (3H, s)
Ar-OMe 3,83 (3H, s) 3,83 (3H, s)
Ar-OH 6,26 (1 H, sD 5,51 (1 H, sI)
Ar-OH 6,17 (1 H, sD 5,43 (1 H, sI)
COCH3 - 1,94 (3H, s)
# - Os sinais referentes a estes hidrogênios estão encobertos pelos sinais das metoxilas aromáticas.
Tabela 18: Dados de RMN-1H do lariciresinol (300MHz, CDCI3) ~) e do 9'-O-acetil-lariciresinol (200MHz, CDCI3) ~) .
123
Carbonos o (ppm)
lariciresinol (IV 9'-O-acefil-lariciresinol (!V
C-1 134,8 134,2
C-2 111,4 111,2
C-3 146,7a 146,5°
C-4 144,0 143,9
C-5 114,4 114,4
C-6 121,0 121,0
C-7 33,1 33,2
C-8 42,4 42,4
C-9 72,7 72,7
C-1' 132,2 131,8
C-2' 108,4 108,3
C-3' 146,6a 146,5° I
C-4' 145,0 145,1
C-5' 114,2 114,1
C-6' 118,6 118,9
C-T 82,6 83,0
C-8' 52,5 48,9
C-9' 60,4 62,6
Ar-OMe 55,8 557c ,
Ar-OMe 55,8 556c ,
COCH3 - 170,9
COCH3 - 20,8
Valores na mesma coluna, marcados com a mesma letra podem ser permutados
Tabela 19: Dados de RMN-13C do lariciresinol (75MHz, CDCI3) @ e do 9'-O-acetil-lariciresinol
(50MHz, CDCI3) @.
BiB LiOTECA INSTITUTO DE QUíMICA
Unlvelsidade de São Paulo
o l: OMe
OH
178 (4)
\
O~ +
OMe
I O JQ ....... ,
HO ~ [M+] 404 (19)
OMe
0 ... ··'· 'o
HO~
JQ,Ji
I O HO ~
OMe I
OMe /
205 (22)
!
OMe
OH
151 (54)
~ rêl Y'OMe
OH
123 (8)
OHl +
II . I . OMe
342 (5)
1
rE» Y<OMe
HO
137 (100)
Figura 34: Proposta de fragmentação para o 9'-O-acetil-lariciresinol ~).
124
125
CONSIDERAÇÕES FtNAIS
o estudo fitoquímico realizado com o caule adulto de
Araucaria angustifolia confirmou o acúmulo das lignanas pinoresinol, eudesmina e
lariciresinol, anteriormente descrito na literatura [36 - 38] , enquanto a lignana
secoisolariciresinol e outras análogas não foram detectadas neste estudo. No
entanto, foram isolados dois derivados do benzaldeído (p-hidroxibenzaldeído e
vanilina), um fenilpropanóide (coniferaldeído) e dois isoflavonóides, sendo inédita
tais ocorrências em espécies da família Araucariaceae. O acúmulo de
benzaldeídos não é muito comum. Admite-se que estes podem ser produtos da 13-
oxidação dos respectivos ácidos cinâmicos substituídos [123]; a formação de
derivados do ácido benzóico, através da degradação da cadeia lateral de
fenilpropanóides, foi constatada em culturas de células de Vanilla planifolia [124 ,
125], onde a adição dos ácidos cinâmicos e ferúlicos aumentavam a produção
dos ácidos p-hidroxibenzóico e vanílico respectivamente [123].
Foram obtidos calos a partir de caules de plântulas estioladas
no meio básico MS, suplementado com complexo vitamínico de Nitsch e Nitsch,
uréia, glutamina, arginina, ácido cítrico e mioinositol , contendo ANA e K como
reguladores de crescimento. Os calos obtidos foram analisados após duas
transferências, revelando o acúmulo dos isômeros E e Z do p-cumarato de
octadecila e dos isômeros E e Z do ferulato de octadecila. Dentre os metabólitos
secundários de A. angustifolia , tanto os flavonóides quanto as lignanas
compartilham das mesmas etapas biossintéticas preliminares, tendo como
precursores os ácidos p-cumárico e ferúlico. Na via biossintética que conduz aos
flavonóides, os ácidos cinâmicos são inicialmente convertidos à ésteres de
coenzima-A, os quais sofrem seguidas reações de condensação de Claisen com
o malonil Co-A para, após diversas etapas, formar a respectiva chalcona.
126
Na biossíntese de lignanas, os ésteres de coenzima-A são
reduzidos aos respectivos aldeídos e álcoois cinamílicos que sofrem as reações
de acoplamento oxidativo produzindo diversos tipos de estruturas.
No caso de sistemas desdiferenciados o metabolismo
primário está bastante ativo, pois as células encontram-se em constante processo
de crescimento e divisão celular, levando ao detrimento do metabolismo
secundário [126].
A análise dos metabólitos presentes no caule adulto e nos
calos mostrou que ambos os tecidos são capazes de expressar as etapas
biossintéticas resultando no acúmulo de fenilpropanóides. Entretanto, as células
cultivadas nas condições descritas, não foram efetivas na dimerização de tais
precursores levando a formação de lignanas. Através da administração de
precursores marcados, como o ácido p-cumárico, ácido ferúlico e alcool
coniferílico nos calos obtidos ou através de reações imunológicas, seria possível
avaliar a semelhança entre o metabolismo de A angustifolia e Forsythia
intermedia.
É possível que os ácidos p-cumárico e ferúlico estejam sendo
consumidos na síntese dos ésteres graxos, os quais podem fazer parte da
constituição tanto suberina quanto paredes celulares, deixando de estar
disponível para a biossíntese de lignóides. Considerando que tais ácidos inibem a
germinação em diversas espécies [107] , eles também poderiam estar inibindo o
próprio crescimento celular na condição de cultura "in vitro" testada explicando o
lento crescimento das cuJturas
127
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