リキッドバイオプシーにおけるがん遺伝子卆析研究トータル ... · 2020. 10....

The world leader in serving science

リキッドバイオプシーにおけるがん遺伝子解析研究トータルソリューション

2

がん分類法の進化

• がんの分類における遺伝学的手法の増加• 遺伝的要因に基づいて定義を加えることは、臨床研究で有望な新戦略と

して期待されている。

解剖学的な手法から、遺伝学的なアプローチへ

• 乳がん• 子宮頸がん• 大腸がん• 肝臓がん• 肺がん• 卵巣がん• 膵臓がん• 前⽴腺がん• 皮膚がん• 胃がん• 甲状腺がん

• ALK• AKT1• BRAF• EGFR• ERBB2• KRAS• NRAS• MAP2K1• PIK3CA• RET• ROS1• 不明

3

リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）

課題サンプル回収で身体を傷つける

サンプリング回数等限界がある

利点複数回のサンプル摂取が

可能コスト

がんの不均⼀性に関する遺伝的情報が得られる。

組織サンプル血液サンプル

組織採取の生体検査（バイオプシー）をリキッド（液体：血液等）で代用させる技術

4

CTC, cfDNA由来の遺伝子変異

正確な希少変異解析へ

Mutations confirmed by absence from germline

Mutations confirmed by absence from germline

PIK3ca

PIK3ca

PIK3ca

PIK3ca

PIK3ca

TP53

PIK3ca

TP53PTPN11

TP53 KIT

KDR

KDR

KIT

BRAF

KIT

TP53 TP53

FGFR3KRAS

KRASKRAS

FBXW7STK11

PTPN11

RB1PTENVHL

APC

MET

PTENSMO

KRAS

FBXW7

HNF1A

AKT1

PTEN

VHL

AKT1

APCFLT3

ATMSMO

SMO

AKT1PIK3ca

RB1

BRAF

KDR

COSMIC mutationsUncategorized mutations

CTC cfDNA

1Krebs MG, et al. (2014) Molecular analysis of circulating tumour cells—biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol 11: 129–144. Krebs et al. concludes that cfDNA and CTCs are complementary templates for analysis of tumor samples. Data courtesy Cynvenio Biosystems.

5

• サンプルの安定性

• 作業標準化

• サンプル間のコンタミネーション

• 遺伝子解析に必要なサンプル入手に制限

• 頻度1%以下の変異検出

• 遺伝子変異数の増加

• 偽陽性の頻度

現在の課題

リキッドバイオプシー研究における課題

6

遺伝子解析研究の課題をワークフローで解決血液サンプル血液サンプル血液サンプル血液サンプル

回収回収回収回収

CTCの回収の回収の回収の回収

cfDNA抽出抽出抽出抽出バリアント検出バリアント検出バリアント検出バリアント検出データ解析データ解析データ解析データ解析

課題

� <1%の変異検出� 遺伝子変異数の増加� 偽陽性の頻度

� 遺伝子解析に必要なサンプル入手に制限

� <1%の変異検出� 遺伝子変異数の増加� 作業標準化


� 作業標準化� コンタミネーション

LiquidBiopsyInstrument

CTC & cfDNA

cfDNA

KingFisher™ Duo Prime™MagMAX cfDNA 抽出キット

Ion Reporter™ソフトウェア

QuantStudio 3D Digital PCR System

� サンプルの安定性

Blood Collection Kit

Ion S5 / PGMIon AmpliSeq

7

Ion Torrent LiquidBiopsy Blood Collection Kit

LiquidBiopsy Platform専用血液回収キット

・細胞を固定

・検体を96時間安定保存

・常温での保存、輸送を可能に

手順

1. 保存試薬を調整し15分以上静置。2. EDTA-2K入り採血管に採取した8ml-10mlの血液

を活性化した保存試薬へ移す

8





課題







CTC & cfDNA

cfDNA







9

サンプル回収を効率的に- Ion Torrent™ LiquidBiopsy™ Platform -

CTC回収プラットフォームIon Torrent™ LiquidBiopsy™ Instrumentおよび関連消耗品

10

LiquidBiopsy™ Platform概要

82cm

82cm

58cm

タッチパネルで簡便操作

検体ごとに独⽴しコンタミリスクを排除

・単⼀血液検体からCTCとcfDNAそれぞれが回収可能なプロトコル・抗体カクテルを用いEpCAM発現がん細胞にも、非上皮由来がん細胞にも対応・微⼩流路と抗体法を組み合わせ、CTCの高回収と高精製を実現・専用キットで採血後室温96時間まで安定的に遺伝的解析可能なCTCの回収が可能

Pumps

Graphical User Interface

Slide/Chip Tray Assembly

4検体まで同時ラン可能

・全血から標的細胞の80-100%回収・少数細胞(3-5cells)も回収可能・白血球コンタミを55cells/ml以下に・IFCをそのまま顕微鏡で観察可能・キャプチャーしたCTCを全てmolecular analysisに使用可能

特⻑

PBS

検体

Iohexol

Flow Chip断面図

特許取得済みflow chip ベンチトップ型自動回収装置

CTCをキャプチャーした抗体磁気ビーズをグリッドに回収

11

利点 Isolation Flow Cell (IFC)の構造

PBS検体Iohexol

Blood 5ml/hr

Bottom Buffer5ml/hr

Top Buffer3ml/hr Iohexol

PBS

blood

比重

重

速度3ml/hr5ml/hr5ml/hr

Winer-Jones JP, Vahidi B, Arquilevich N, Fang C, Ferguson S, et al. (2014) Circulating Tumor Cells: Clinically Relevant Molecular Access Based on a Novel CTC Flow Cell. PLoS ONE 9(1): e86717. doi:10.1371/journal.pone.0086717

CTCの回収に最適化されたシステム

12

高効率なCTC回収率と精製率 – スパイクサンプルでのデータ回収率

精製率

・CaptureしたCTCを、免染後に100%回収・80-100%の回収率・1cell/mlから回収可能・高い精製率(~80% : スパイク細胞量にも依存）・回収後のCTCはDNA抽出なしでNGS解析へ・Whole genome Amplification不要

(%)

13

cfDNA を効率的に回収 - MagMAX Cell-Free DNA Isolation -Fast

• 操作時間：30 〜45分間（マニュアルおよびオートメーション）• オートメーション

KingFisher Flex (最大24 サンプル) KingFisher Duo Prime (最大6 サンプル)

Scalable• 0.5 mL 〜 10 mL のplasmaサンプル

Specific• cfDNAを効果的に濃縮

--- MagMAX--- Q

--- MagMAX--- Q

4 mL plasma4 mL buffer ACL + carrier RNA

ProK 60oC 30 min

Add 7.2 mLincubate on ice

Load 15.2 mLvacuum

Wash x3vacuum

Elute nucleic acid(20-150 ul)56oC

10 mindrying

4 mL plasma+5 mL LiquidBiopsy solution+60 ul beads

shakingroom temp

pellet beadson magnet

Resuspendbeads in wash solution

Transfer to microfuge tube Wash 2x 1 mL wash solution

Wash 2x 1 mL 80% ETOH Dry 3-5 minutesElute DNA 50 ul

QIAamp™ Circulating Nucleic Acid Kit 所用時間 125分

MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit 所用時間 ~45分

~15 minutes10 minutes <10 minutes

35 minutes 90 minutes

spin

1/3に時間短縮

違いを生み出す2つのポイント

不要な⻑いDNAを効率的に除去

1. 当キットではProteinaseK処理の条件がマイルドなためゲノムDNAはヒストンに巻き付いたままになり、短いDNA(cfDNA)* が効率的に抽出される

2. ⻑いDNAは磁気ビーズに強く結合しており、熱処理等をかけない限りElution効率は低く、結果として当該キットのElution条件では短いDNA(cfDNA) が効率的に溶出される

14

Powerful KingFisher Technology

KingFisher Flex

KingFisher Duo Primeシングルチューブ処理⽤ 96wellプレート処理⽤

・最大6サンプルを同時処理(PCR産物の精製等は最大24サンプル）

・最大24サンプルを同時処理(PCR産物の精製等は最大96サンプル）

15





課題







CTC & cfDNA

cfDNA







16

検出をトータルサポート - Ion AmpliSeq™ Technology

• 1 Primer Poolあたりわずか10ngのDNAから解析可能• cfDNA、FFPEサンプル等、部分的に分解されたゲノム材料から目的の遺伝子領域を高効率に

増幅• 優れたプライマー設計技術により複数領域をマルチプレックスに増幅可能• サンプルDNAから結果までたった1日• cfDNA用カスタムパネルも容易にデザイン可能

ターゲットリシーケンスのためのウルトラマルチプレックスPCR→⼀反応で複数領域をまとめて増幅することができる高度PCR技術

・ FFPE 1枚からは極僅かなDNAしか取れないが、がんの生研は何回も摘出できない・・・・・・・・。・新生児の難聴診断に応用したいが赤ちゃんから採取できる血液は極僅か・・・・。

何で優れている？

どんなメリットがある？

臨床検体など、応用分野での課題に対して高い有用性

17

Ion S5, Ion S5XL overview検出をトータルサポート - Ion S5, Ion S5XL -

簡単：auto pH（pH調整）不要ガス不要－pump-driven system （エアタンク内蔵）最速：最少イニシャライゼ―ション時間、短いラン時間提供

No Water!!No NaOH!!No GAS!! Wash SolutionSequencing Reagent

CartridgeCleaning Solution

イニシャライズからランまでが４分以内のハンズオンタイムで終了

18

検出をトータルサポート - QuantStudio 3D デジタル PCR システム

� チップ1枚、1分で測定が完了

� タッチスクリーンで簡単操作

� コンパクトなサイズ

• 13.5cm x 23cm x 21cm (幅x奥行きx高さ),重量 2.4 kg

• 操作用のコンピュータ不要

貴重なサンプルを無駄にせず、常に均⼀な量で反応ができるので、再現性の⾼い定量を可能にします。

� サンプルのコンタミネーションのリスクを最⼩限に� チップ毎の個別ID番号で、サンプル管理も簡単

サンプルのロードシール（封入） PCR & 測定

本体

チップ

• 0.1%の低頻度の変異を検出• がんに特化した100以上のバリデーション済みのアッセイもご用意

19

� わずかな体細胞変異を検出

� デジタルPCRは0.1%の変異を検出します。増幅反応液分配

デジタルPCR

リアルタイムPCRリアルタイムPCRでは、10%以上変異型が存在しないと検出困難

• 希少変異(KRAS G12V )を解析• 野生型および変異型gDNAを混合して疑似サンプルを作成• TaqMan SNP Genotyping Assaysを用いて、変異解析

FAM

（変

異型

）

VIC （野生型）

FAM FAM&VIC

VIC

検出をトータルサポート - QuantStudio 3D デジタル PCR システム

A) Targeted mutation rate 10%Mutation rate detected 10.384%CI: 8.2235%–13.076%

B) Targeted mutation rate 1%Mutation rate detected 1.393%CI: 0.722%–2.507%

C) Targeted mutation rate 0.1%Mutation rate detected 0.142%CI: 0.064%–0.310%

D) Wild-type control sample

10%

0%0.1%

1%

20





課題







CTC & cfDNA

cfDNA







21

解析までトータルサポート - Ion Reporter™

シングルサンプルの解析 CNV （Copy Number Variation）解析

ペアサンプル解析

癌の体細胞変異ペアサンプル解析

遺伝性疾患のトリオ解析

融合遺伝子解析

16S rRNAメタゲノム解析 New!!

＜IonReporter™で解析できるアプリケーション＞

煩雑な操作不要。新しく次世代シーケンシングを始める方にも使いやすい

無料クラウド版とサーバー版の2種があり手軽に、低コストで実験開始

22





課題







CTC & cfDNA

cfDNA







リキッドバイオプシーにおける がん遺伝子卆析研究トータル ... · 2020. 10....

Documents

リキッドバイオプシーにおけるがん遺伝子卆析研究トータル ... · 2020. 10....