マイコースプログラム海外研修レポート -...
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マイコースプログラム海外研修レポート
0601-‐23-‐1715 萩本 裕樹
活動期間…2014 年 8 月 18 日～9 月 26 日
場所…Genome Damage and Stability Center(GDSC,UK)
1. 研究背景、目的及び研究方法 2. 研究結果 3. 考察 4. ビザ取得方法及び研究所への研修申し込み方法 5. 宿泊所について 6. 週末の過ごし方
１．研究背景、目的及び研究方法
今回のマイコースプログラムにおいて私はイングランドのブライトン近郊にあるサセック
ス大学の Genome Damage and Stability Center という所で約一ヵ月半学ばさせて頂きまし
た。ここでは主に DNA の修復機構に関する研究が行われており、水野先生にマンツーマンで
指導していただくという形で研修させていただきました。
水野先生とラボの方々と
以下実験内容
Ura4 reversion assay of ura4-‐sd20R in smc6 background.
Strains
YKM1227 h+ sup35 :nmt41 :rtf1 ade6-704 leu1-32 ura4sd20R J2512 h+ sup35 :nmt41 :rtf1 ade6-704 leu1-32 ura4sd20R smc6-74 J2517 h+ sup35 :nmt41 :rtf1 ade6-704 leu1-32 ura4sd20R smc6-X YKM1229 h+ sup35 :nmt41 :rtf1 ade6-704 leu1-32 R ura4sd20 J2519 h+ sup35 :nmt41 :rtf1 ade6-704 leu1-32 R ura4sd20smc6-74 J2519 h+ sup35 :nmt41 :rtf1 ade6-704 leu1-32 R ura4sd20smc6-X
以上の６種類を用いて、smc６タンパクの機能を考察する。Ｒの位置は複製フォークを停止させる位置を表す。
Wake up the strains or inoculate the strains on YEA and incubate at 30°C overnight.
Streak a small patch of the strain onto EMMA(+ura, +leu, +Thi, +5-FOA) to get single colonies and incubate at 30°C for 3 days.
Pick up 3colonies on 5-FOA plate and streak them onto EMMA(+ura, +leu, +Thi) [pause off] and EMMA(+ura, +leu) [Pause ON] and incubate at 30°C over weekend.
For pause off, inoculate a patch on the plate EMMA(+ura, +leu, +Thi) into 5 ml of EMM(+ura, +leu, +Thi). Inoculate a patch on the plate EMMA(+ura, +leu) into 5 ml of EMM(+ura, +leu) for pause ON. A patch of the strain on EMMA(+ura, +leu, +Thi) goes to EMM(+ura, +leu, +Thi), while a patch of the strain on EMMA(+ura, +leu) goes to EMM(+ura, +leu). Shake at 30°C overnight. [Tue.- Wed.]
Measure the cell density and inoculate 106 cells in 5 ml of new same medium. Final cell density is 2×105 cells/ml. See and fill table 1.
Shake at 30°C two overnight.
Measure the cell density. See and fill table 2.
Make a series of dilutions such as 1×107 cells/ml. See and fill table 3.
Make a serial dilutions 1×106, 1×105, 1×104, and 1×103 cells/ml.
Plate 100 µl of 1×107 cells/ml dilution from culture with thiamine [pause off] on EMMA(+leu, +Thi).
Plate 100 µl of 1×106 cells/ml dilution from culture without thiamine [pause ON] on EMMA(+leu, +Thi).
Plate 100 µl of 1×103 cells/ml dilution from culture with thiamine [pause off] and without thiamine [Pause ON] on EMMA(+ura, +leu, +Thi).
Incubate at 30°C for 3-4 days.
２－１．実験結果
YKM1227,J2515,J2519については以下の通り。Uraありのプレートの colonyは多すぎて数えられなかった。
右端三列は平均、標準偏差、on/offを表す。
右四列をグラフ化したもの（図①）
Strains Thiamine Culture ColoniesCells
YKM1227 Plus 1 36 1000000 0.000036 0.000048 1.08167E-‐05 Wtoff 0.000048 1.08E-‐05 42.29167YKM1227 Plus 2 57 1000000 0.000057 Wton 0.00203 0.000108YKM1227 Plus 3 51 1000000 0.000051 74off 8.93E-‐05 2.91E-‐05 15YKM1227 Minus 1 200 100000 0.002 0.00203 0.000108167 74on 0.00134 0.000399YKM1227 Minus 2 215 100000 0.00215 Xoff 2.97E-‐05 2.49E-‐05 24.04494YKM1227 Minus 3 194 100000 0.00194 Xon 0.000713 0.000499J2512 Plus 1 59 1000000 0.000059 8.93E-‐05 2.90918E-‐05J2512 Plus 2 117 1000000 0.000117J2512 Plus 3 92 1000000 0.000092J2512 Minus 1 178 100000 0.00178 0.00134 0.0003995J2512 Minus 2 124 100000 0.00124J2512 Minus 3 100 100000 0.001J2517 Plus 1 11 1000000 0.000011 2.97E-‐05 2.49466E-‐05J2517 Plus 2 58 1000000 0.000058J2517 Plus 3 20 1000000 0.00002J2517 Minus 1 52 100000 0.00052 0.000713 0.000498932J2517 Minus 2 128 100000 0.00128J2517 Minus 3 34 100000 0.00034
YKM1229,J2515,J2519については以下の通り
Uraあり
Strains Thiamine Culture Colonies Cells YKM1229 Plus 1 85 100 0.85 0.723333 0.357258 YKM1229 Plus 2 100 100 1 YKM1229 Plus 3 32 100 0.32 YKM1229 Minus 1 114 100 1.14 0.796667 0.322542 YKM1229 Minus 2 50 100 0.5 YKM1229 Minus 3 75 100 0.75 J2515 Plus 1 66 100 0.66 0.383333 0.245832 J2515 Plus 2 19 100 0.19 J2515 Plus 3 30 100 0.3 J2515 Minus 1 38 100 0.38 0.336667 0.058595 J2515 Minus 2 36 100 0.36 J2515 Minus 3 27 100 0.27 J2519 Plus 1 53 100 0.53 0.71 0.294618 J2519 Plus 2 105 100 1.05 J2519 Plus 3 55 100 0.55 J2519 Minus 1 80 100 0.8 0.696667 0.10504 J2519 Minus 2 59 100 0.59 J2519 Minus 3 70 100 0.7
Uraなし及び平均、標準偏差、on/off
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
0.0025
Wtoff Wton 74off 74on Xoff Xon
系列1
右四列をグラフ化したもの（図②）
３－１ 考察
以上より以下のことが考えられる。
Strains Thiamine Culture Colonies Cells Wtoff 3.1E-‐05 1.96E-‐05 1.300997YKM1229 Plus 1 193 8500000 2.27E-‐05 3.1E-‐05 1.96E-‐05 Wton 4.03E-‐05 8.73E-‐06YKM1229 Plus 2 169 10000000 1.69E-‐05 74off 5.82E-‐05 1.91E-‐05 1.691183YKM1229 Plus 3 171 3200000 5.34E-‐05 74on 9.85E-‐05 3.72E-‐05YKM1229 Minus 1 395 11400000 3.46E-‐05 4.03E-‐05 8.73E-‐06 Xoff 2.63E-‐05 1.46E-‐05 1.531394YKM1229 Minus 2 252 5000000 5.04E-‐05 Xon 4.03E-‐05 1.52E-‐05YKM1229 Minus 3 270 7500000 0.000036J2515 Plus 1 263 6600000 3.98E-‐05 5.82E-‐05 1.91E-‐05J2515 Plus 2 108 1900000 5.68E-‐05J2515 Plus 3 234 3000000 0.000078J2515 Minus 1 534 3800000 0.000141 9.85E-‐05 3.72E-‐05J2515 Minus 2 307 3600000 8.53E-‐05J2515 Minus 3 188 2700000 6.96E-‐05J2519 Plus 1 229 5300000 4.32E-‐05 2.63E-‐05 1.46E-‐05J2519 Plus 2 185 10500000 1.76E-‐05J2519 Plus 3 100 5500000 1.82E-‐05J2519 Minus 1 245 8000000 3.06E-‐05 4.03E-‐05 1.52E-‐05J2519 Minus 2 341 5900000 5.78E-‐05J2519 Minus 3 228 7000000 3.26E-‐05
0
0.00002
0.00004
0.00006
0.00008
0.0001
0.00012
0.00014
0.00016
Wtoff Wton 74off 74on Xoff Xon
系列1
複製のフォークの停止した後、①複製の再開または②複製再開後の errorの出る頻度または両方に smc6タンパクがどのように関与しているかを考察する。YKM1227,J2515,J2519について図①より on/offの比率を比較すると Wild type（以下Ｗｔ）では 42、smc6-74（以下 74）では 15、smc6-X（以下Ｘ）では 24 であり、有意な差が見られる。これよりＸは①②ともに影響を与え、74 はＸとＷｔの半分程度の影響を与えることがわかる。次に YKM1229,J2515,J2519についても図②より on/offの比率を比較するとＷｔでは 1.3、74 では 1.6、Ｘでは 1.5 なので有意な差は見られない。これより①については on、offで差は見られないことが分かる。 つまり smc6タンパクは②に影響を与える可能性が高い。74 についてはＸと同等であるように見えるが図①よりも offの数がもともと多いため errorを起こしやすいことがわかる。以上より smc6タンパクの機能として、②に影響を与えることが推測される。
２－２．実験内容及び結果
Mini 染色体を用いて microtuble の伸展に染色体再編成がどのような影響を与えるかについ
て調べる。正しく分裂したもの（correct）と正しく分裂をしなかったもの（incorrect）の
microtuble の長さ及び時間を計測し、有効と考えられる範囲での速度をはかることにより
spindle checkpoint が見られるか否かを判断する。Correct では spindle checkpoint は見
られず、incorrect では spindle checkpoint は見られると予想される。
図１ incorrect
図２ correct
図３
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 500 1000 1500 2000 2500
291013SAMB02-‐1 291013SAMB02-‐1-‐2 291013SAMB02-‐4 291013SAMB02-‐4-‐2 291013SAMB02-‐6 140214SAM01-‐3 140214SAM01-‐4 140214SAM01-‐6 140214SAM01-‐7
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000
291013SAMB02-‐1
291013SAMB02-‐4
291013SAMB02-‐6
081113ASAM05-‐1
081113ASAM05-‐5
130214SAM01-‐1
130214SAM01-‐1-‐2
130214SAM01-‐1-‐3
130214SAM01-‐2
130214SAM01-‐2-‐2
３－２ 考察
図１は incorrectの計測結果を表し、図２は correctの計測結果を表している。縦軸は長さ（μｍ）、横軸は時間（ｍｓ）を表している。図３はこれらをもとにそれぞれの長さが２μ
ｍを越えたあたりから観測できなくなるまでの速度を計算し、棒グラフ及びプロットにより
表したものである。プロットではサンプルが少なかったせいか有益なデータは得られなかっ
た。棒グラフにおいてもサンプルの速度の平均値を棒グラフで表し、エラーバーにより標準
偏差を表したが大きな違いがみられなかった。以上より incorrectの場合においてもこの段階においては spindle checkpoint は見られないということがわかった。
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
1 2
系列1
0
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.014
0.016
0.018
0.02
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016
系列1
４ビザの取得方法及び研究所への申し込み方法
今年度からイギリスでの研修にあたって Student Visitor Visa の取得が必須になったの
ですが、取得方法としては①渡航前に日本で事前申請する方法と②入国時に入手する方法が
あります。②の方法を利用した友人がいたのですが、入国時にビザを発行してもらえない可
能性があることと週末に旅行するたびに審査があり面倒なことなどから①の方法で取得する
ことをお勧めします。渡航予定の三か月前からオンラインで受付が開始され、まずオンライ
ンで申請フォームに記入しその後送信すると同時に面接する日時を決めます。あとは訪問す
る日時に必要書類を持っていき、簡単な質問をされ、申請が許可されれば後日郵送または手
渡しでパスポートを受け取ることができます。費用は１、2 万円で multi-visa（何回入出国
しても有効なビザ）が受け取れるのですが、申請から約三週間後に結果がわかることや申請
フォームがややこしいこと、申請センターが遠いことなどから早めに取りかかることをお勧
めします。
研究所への申し込み方法については 2013 年の冬に武田教授に海外でマイコース研修をし
たいという旨を伝え、サセックス大学の GDSC を紹介して頂いたので自分でしたことといえ
ば先方とメールで連絡をとることぐらいでした。
５宿泊所について
GDSC の技師である Sandhya の家に同回生の森さんとホームステイさせて頂きました。研究
所と市街地の間にあり、研究所からは徒歩 30 分、自転車またはバスで 10 分ほどだったので
ブライトンの街で中古の自転車を約 5000 円で購入し自転車で移動しました。食事について
は Sandhya はインド系のベジタリアンなので家での食事は果物やシリアル、野菜たっぷりの
カレーが中心で非常に健康的で美味しく頂けました。費用は 1 週間の宿泊費用（朝食つき）
が 115￡で平日一日当たりの夕飯代が 5￡だった（夕飯をお願いするか選べる）ので一週間
で 140￡でした。Sandhya もその夫 Ashwin も非常に優しく温厚な人たちでとても過ごしやす
かったです。
６週末の過ごし方
週末は金曜日も休みをいただいたりして積極的に旅行していました。マイコース期間という
ことでヨーロッパに約 40 名友人がいたので、イギリス国内のみならずフランスやイタリア
にも足を伸ばし友人と合流して旅行や食事、買い物などを楽しみました。
イタリアにて
ロンドンにて
7最後に
今回約一ヶ月間ラボに参加させて頂いて、実際に目的を持って実験をするのは初めてだった
ため大変ではあったがとても新鮮で、また水野先生からも貴重なお話を聞くこともでき自分
の将来について考えるいい機会となりました。また海外ということもあり様々な貴重な体験
をすることができて非常に有意義な期間を過ごせました。これからも機会があれば積極的に
海外研修をしたいと思います。
最後になりましたが海外の研究室を紹介していただきいろいろと相談に乗ってくださった武
田教授、現地で親切丁寧に教えてくださった水野先生、実験手技を教えてくださった松本先
生、ホームステイさせてくださった Sandhya, Ashwin その他お世話になったすべての方々には心からお礼を申し上げたいと思います。
本当にありがとうございました。