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タンパク質の分離・精製
生体材料
タンパク質の抽出
・ホモジネート
・遠心分離
分別沈殿(塩析)
脱塩
・クロマトグラフィー
・電気泳動
・限外ろ過
生体材料
・動物臓器
・動物培養細胞
・植物組織
・微生物
微生物
培養
前培養
大量培養
集菌 ホモジネート、破砕
機械破砕
超音波破砕
加圧減圧処理
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タンパク質の定量
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フェノール試薬法(Lowry法)タンパク質
(還元性基)リンモリブデン酸 リンモリブデンブルー
500から750 nmの吸光度を測定
フェノール類と反応して青色を示すフェノール試薬
(リンモリブデン酸)を用いる。
タンパク質(還元性基)
チロシン、システイン、
トリプトファンなど
・比較的感度が高い。
・特定のアミノ酸残基に依存する。
・還元性物質の影響を受ける。
ビウレット法
タンパク質(アルカリ溶液) + CuSO4 錯体形成
紫紅、青紫を呈色
540から560 nmの吸光度を測定
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紫外吸収法
1.280 nmの吸光度
トリプトファン ε278 = 5550 M-1cm-1
チロシン ε275 = 1340 M-1cm-1
フェニルアラニン
2.215, 225 nmの吸光度の差
タンパク質のペプチド結合(190-230 nm)
3.280, 205 nmの吸光度の比
色素結合法
クマシーブリリアントブルー
陽イオン型 陰イオン型中性型
470 nm(赤) 650 nm(緑) 595 nm(青)
タンパク質と結合すると陰イオン型になる。
CH2
-O3S
N
C2H5
R
C
R
N+
H2C
C2H5
SO3-
NH
OC2H5
R = H CBB R-250R = CH3 CBB G-250
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クロマトグラフィー
二相間の分配に基づく分離法
移動相
固定相
試料注入
時間または容量
t0
V0
Vr
tr
V0:ボイド容量
カラムに保持されずに出てくる
溶出容量
tr
:保持容量
:保持時間
Vr
タンパク質の分離には液体クロマト
グラフィーを用いる。
Vr = tr × f
:流速f
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N =t rσ
2
N = 16t rW
2
時間または容量
trA
N = 5.54t r
W1 /2
2
W1 /2
理論段数 W = 4 σ
:半値幅
t0
V0
VrA
trB
VrB
試料注入
保持される度合い
容量比(Capacity factor)k'
k' =Vr – V0
V0=
tr – t0t0
分離係数(Separation factor)α
α =k'(
A)k
'(B)
A B
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液体クロマトグラフィーの種類
1.イオン交換クロマトグラフィー 静電的結合
2.ゲルろ過クロマトグラフィー 分子ふるい
3.疎水性クロマトグラフィー 疎水的相互作用
4.吸着クロマトグラフィー 水素結合、ファンデル
(ヒドロキシアパタイト) ワールス力
5.逆相クロマトグラフィー 疎水的相互作用
6.アフィニティークロマトグラフィー 特異的親和性
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1.イオン交換クロマトグラフィー
pHの平衡化 試料の添加 イオン強度:低 高
陽イオン交換樹脂
陽イオン性物質
陰イオン性物質
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分取目的タンパク質の必要な基本情報
・等電点
・安定性
4 6 8 10pH
電
荷
+
-
タンパク質の電荷とpHの関係
等電点
タンパク質が安定なpH領域
例えばこの場合
pH 5 陽イオン交換体を使用
pH 8 陰イオン交換体を使用
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緩衝溶液
緩衝成分がイオン交換体に吸着されれば、pHのずれを
生じるので、そのような組み合わせはさける。
従って、
陰イオン交換体には、 型
陽イオン交換体には、 型
を用いる。
BH+ B + H+
AH A- + H+
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2.ゲルろ過クロマトグラフィー
平衡化 試料の添加 一定の緩衝液による溶出
多孔性樹脂
低分子量物質
高分子量物質 利点
固定相への吸着がないため、タンパク質が変性しにくい。
pHやイオン強度に影響されにくい。
分子ふるい
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3.疎水性クロマトグラフィー
塩濃度の違いによる溶出平衡化 試料の添加 塩強度:高 低
疎水性樹脂
疎水性物質
親水性物質
タンパク質の疎水性相互作用を利用する。
疎水性アミノ酸 W,I,P,F,L,V などが含まれるため。
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吸着脱離に関する要因
a.温度
疎水結合の強度は温度変化に大きく依存する。
b.イオン
疎水結合はイオンの種類や濃度によって大きく影響される。
アニオン 疎水結合を弱める 疎水結合を強める
SCN ->I->CLO4->NO3
->Br->Cl->CH3COO->F->SO42-
カチオン
Ba 2+>Ca2+>Mg2+>Li+>Cs+>Na+>K+>Rb+>NH4+
高濃度硫安(NH 4)2SO4によって疎水結合は強められる。
c.界面活性剤
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4.吸着クロマトグラフィー
(ヒドロキシアパタイト)
Ca10(PO4)6(OH)2 六角柱結晶
a面:酸性タンパク質が主に吸着
c面:塩基性タンパク質が主に吸着
a、c面の溶出:リン酸緩衝溶液
c面の溶出:KCl, NaCl, CaCl2, MgCl2
a面(b面は等価)
c面
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リン酸イオン濃度:
低
ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー
平衡化 試料の添加 KCl濃度:
低 高
ヒドロキシアパタイト担体
酸性タンパク質
塩基性タンパク質
高
c面の溶出 a、c面の溶出
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5.逆相クロマトグラフィー有機溶媒濃度の違いによる溶出
平衡化 試料の添加 有機溶媒濃度:低 高
疎水性担体
疎水性物質
親水性物質 固定相:オクタデシルシラン(ODS)など
移動相:水溶液、水溶液・有機溶媒混合溶液
疎水性有機化合物、ペプチド、核酸」の分離
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6.アフィニティークロマトグラフィー
生化学的な特異的親和性を利用
試料添加
目的タンパク質
不純物
目的タンパク質の
吸着
目的タンパク質の
溶出
吸着体固定化カラム
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