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FERNANDO MELLO FRÓES DA FONSECA
Papel da atividade física na expressão gênica das vias
proliferativas e de angiogênese na próstata e suas implicações
na prevenção da hiperplasia prostática benigna: estudo
experimental
SÃO PAULO
2017
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências
Programa de Urologia
Orientador: Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Fonseca, Fernando Mello Fróes da Papel da atividade física na expressão gênica dasvias proliferativas e de angiogênese na próstata esuas implicações na prevenção da hiperplasiaprostática benigna : estudo experimental / FernandoMello Fróes da Fonseca. -- São Paulo, 2017. Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Urologia. Orientador: Alberto Azoubel Antunes.
Descritores: 1.Hiperplasia prostática 2.Exercício3.Obesidade 4.Resistência à insulina 5.Indutores daangiogênese 6.Expressão gênica
USP/FM/DBD-470/17
Dedicatória
Dedicatória
Ao meus pais, Fernando e Janice, por me darem o amor, carinho e educação necessários para o cumprimento adequado da minha jornada nesta vida. Sei o sacrifício que fizeram para que eu pudesse usufruir de oportunidades que
vocês não tiveram. Seus valores e condutas sempre me serviram de exemplo e me motivaram a ser uma pessoa melhor.
A minha irmã Bianca, que sempre torceu pela minha felicidade e pelas
minhas conquistas. Tenha certeza que também torço por você.
A minha esposa Mariana, pelo companheirismo e paciência durante esta jornada acadêmica, cujo início coincide com nosso primeiro encontro neste
mundo. Posso dizer que me sinto um homem realizado e uma pessoa melhor ao final dessa jornada e você é a principal razão disso.
Agradecimentos
Agradecimentos
Ao meu orientador, Prof. Dr. Alberto Azoubel Antunes, pela honra em me receber como aluno, pelos constantes ensinamentos e por ter me abraçado
como parte de sua família. Sua busca por excelência me estimulou a trazer o conhecimento científico para um nível muito acima do que pensei ser capaz
de conseguir.
Ao Prof. Dr. Miguel Srougi, pela oportunidade de ser testemunha ocular de um pequeno ponto na linha de sua extraordinária história de vida, e que,
apesar do seu imenso conhecimento científico, as suas atitudes e qualidades como ser humano é o que levo de mais importante nesse período de
aprendizado.
A Profa. Dra. Sabrina Reis, pelos constantes ensinamentos e por me acolher em seu coração. Amiga e irmã que encontrei nesta vida, um dos exemplos
mais puros de bondade e caráter que já presenciei. Você é uma pessoa verdadeiramente iluminada. Nossos encontros sempre me trazem paz e
alegria.
Ao colega Dr. André Oliveira, pela parceira no desenvolvimento e execução deste projeto. Sua visão acadêmica e científica foi de grande auxílio para o
sucesso desse desafio.
Aos colegas Dr. Fábio Oliveira, Dr. Luiz Araújo, Dr. Renan Éboli, Dr. Paulo Conti, Dr. Adriano Nesrallah, Dr. Fernando Almeida, Dr. Karlo
Biolo e Dr. Marco Nunes, que, em maior ou menor grau, fizeram parte da família que me acolheu em São Paulo e o laço de amizade criado nesse
período é uma das grandes riquezas gravadas em minha alma.
Aos queridos amigos do LIM 55, Nayara, Vanessa, Ísis, Denis e Iran, chefiados pela Profa. Dra. Kátia Ramos Leite, professora por quem tenho muita admiração e carinho. A ajuda de todos vocês foi fundamental para o
meu crescimento acadêmico e pessoal.
Aos colegas da Faculdade de Educação Física da Universidade de São Paulo, especialmente a Profa. Dra. Edilamar Oliveira, Fátima, Vander,
Marcele, Katt e Ney. A realização deste estudo seria impossível sem a ajuda de vocês. A maneira como me acolheram e me ajudaram de maneira tão
Agradecimentos
altruísta é extremamente louvável e portanto expresso meu sincero agradecimento.
Aos colegas do grupo da próstata do Hospital das Clínicas da FMUSP, especialmente o Dr. Paulo Cordeiro, Dr. Mario Paranhos, Dr. Alexandre Iscaife, Dr. Elcio Nakano, Dr. Eduardo Muracca e Dr. Elias Chedid, por
compartilhar experiências e valiosos ensinamentos.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro na concessão de bolsa de doutorado sob o número
2015/02335-5 e financiamento da pesquisa sob o número 2014/08368-0.
A Deus, por me conceder as ferramentas necessárias para o meu aprimoramento espiritual.
Epígrafe
Epígrafe
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina” (Cora Coralina)
Normatização adotada
Normatização adotada
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento de
sua publicação:
Referências: adaptado de InternationalCommitteeof Medical JournalsEditors
(Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A.L.Freddi, Maria
F.Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria
Vilhena. 3ª ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviatura dos títulos e periódicos de acordo com ListofJournalsIndexed in
Index Medicus.
Sumário
Sumário
Lista de abreviaturas
Lista de tabelas
Lista de figuras
Resumo
Abstract
1. INTRODUÇÃO............................................................................... 1
1.1 Considerações gerais.................................................................... 2
1.1.1 Hiperplasia Prostática Benigna...................................................... 2
1.1.2 Síndrome metabólica..................................................................... 4
1.1.3 Síndrome metabólica e HPB.......................................................... 5
1.1.4 Atividade física e HPB................................................................... 12
1.1.5 Justificativa..................................................................................... 13
2. OBJETIVOS................................................................................... 15
3. MÉTODOS..................................................................................... 17
3.1 Tipo de estudo............................................................................... 18
3.2 Local e época................................................................................. 18
3.3 Modelo experimental...................................................................... 18
3.4 Intervenção.................................................................................... 18
3.5 Análise da expressão gênica......................................................... 26
3.6 Análise de apoptose por hibridização in situ (TUNEL)................... 27
3.7 Análise estatística.......................................................................... 28
4. RESULTADOS............................................................................... 29
4.1 Considerações iniciais................................................................... 30
4.2 Efeitos da dieta hiperlipídica.......................................................... 30
4.3 Efeitos da atividade física.............................................................. 33
4.4 Análise da expressão gênica......................................................... 35
4.5 Análise de apoptose por hibridização in situ (TUNEL)................... 37
5. DISCUSSÃO.................................................................................. 40
5.1 Modelo experimental...................................................................... 41
5.2 Consumo de oxigênio.................................................................... 44
5.3 Vias proliferativas e de angiogênese............................................. 45
5.4 Análise de apoptose...................................................................... 49
5.5 Considerações finais e perspectivas futuras................................. 50
Sumário
6. CONCLUSÕES.............................................................................. 52
7. REFERÊNCIAS.............................................................................. 54
APÊNDICES
Listas
Lista de siglas e abreviaturas
Akt Proteína quinase B
DHT Dihidrotestosterona
DM Diabetes Mellitus
FEO2 Fração expirada efluente de oxigênio
FIO2 Fração de oxigênio do ar ambiente
FGF Fator de crescimento de fibroblastos
GPER1 Receptor de estrogênio acoplado à proteína G
GSK-3 Glicogênio sintase quinase 3
HDL Lipoproteína de alta densidade
HIF-1 Fator 1 induzido por hipóxia
HOMA Modelo de avaliação da homeostase
HPB Hiperplasia prostática benigna
IGF1 Fator de crescimento semelhante a Insulina do tipo 1
IGF1R Receptor do IGF1
IGFBP Proteína ligadora do IGF1
IL Interleucina
IMC Índice de massa corporal
IRS1 Substrato do receptor de insulina
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LDLox Lipoproteína de baixa densidade oxidada
LOX-1 Receptor da lipoproteína de baixa densidade oxidada 1
MAPK Proteíno-quinase ativada por mitógenos
mTOR Proteína alvo da rapamicina em mamíferos
PF Pressão de fluxo
PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase
SM Síndrome Metabólica
STUI Sintomas do trato urinário inferior
TNF- Fator de necrose tumoral alfa
VEGF Fator de crescimento vascular endotelial
VEGFR1 Receptor de VEGF do tipo 1
VEGFR2 Receptor de VEGF do tipo 2
VO2 Consumo de oxigênio
VO2máx Consumo máximo de oxigênio
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Primers utilizados para quantificação dos genes
selecionados para estudo.................................................. 27
Tabela 2 - Dados morfométricos (resultados expressos em média) .. 32
Tabela 3 - Dados pressóricos e análise sérica (resultados
expressos em média)......................................................... 34
Tabela 4 - Parâmetros de consumo de oxigênio (resultados
expressos em média)......................................................... 35
Lista de Figuras
Figura 1 - Potenciais mecanismos relacionados a HPB/STUI com a
SM....................................................................................... 08
Figura 2 - Simplificação da via proliferativa do IGF1 na próstata........ 10
Figura 3 - Divisão esquemática dos grupos estudados....................... 20
Figura 4 - Treinamento aquático dos grupos 1 e 2.............................. 21
Figura 5 - Esteira adaptada em gaiola metabólica para mensuração
do consumo de oxigênio..................................................... 23
Figura 6 - Dissecção da próstata e separação dos lobos ventrais...... 25
Figura 7 - Dissecção da gordura retroperitoneal (A e B) e
epididimária (C)................................................................... 25
Figura 8 - Consumo semanal individual de ração (gramas)................ 31
Figura 9 - Dados morfométricos dos grupos estudados...................... 32
Figura 10 - Dados Dados de análise sérica dos grupos estudados................. 34
Figura 11 - Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos
com dieta padrão (Grupo 1 vs grupo 3)
Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do
grupo 3 (SED+DP).............................................................. 36
Figura 12 - Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos
com dieta hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4)
Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do
grupo 4 (SED+DHL)............................................................ 37
Figura 13 - Número de apoptoses a cada 10 campos de grande
aumento (HPF).................................................................... 38
Figura 14 - Lâminas de tecido prostático submetidas à hibridização in
situ (TUNEL) de ratos submetidos à atividade física e
dieta padrão (A e B), rato sedentário com dieta padrão
(C) e sedentário com dieta hiperlipídica (D)........................ 39
Resumo
Resumo
Fonseca FMF. Papel da atividade física na expressão gênica das vias proliferativas e de angiogênese na próstata e suas implicações na prevenção da hiperplasia prostática benigna: estudo experimental [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017. Introdução: O sedentarismo e obesidade têm sido descritos como fatores de risco relevantes para o desenvolvimento de hiperplasia prostática benigna (HBP). No presente trabalho investigamos o papel da atividade física nas vias proliferativas e de angiogênese da próstata e sua relação na prevenção da HPB. Métodos: Foram utilizados nesse experimento ratos machos Wistar com oito semanas de idade, divididos aleatoriamente em quatro grupos: 1. atividade física (AF) e dieta normal; 2. AF e dieta rica em gorduras; 3. Sedentários com dieta normal; 4. Sedentários e dieta rica em gorduras. Alimentos e água foram fornecidos ad libitum. Os ratos dos Grupos 1 e 2 foram submetidos a um protocolo de treinamento de natação por 10 semanas, executado cinco vezes por semana com duração de 60 minutos por dia. No final do protocolo, as glândulas prostáticas foram dissecadas, pesadas e armazenadas. Medimos os níveis de expressão gênica do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF1), do genes relacionados ao eixo proliferativo IGF1/PI3K/Akt e dos genes relacionados à hipóxia e angiogênese através do método de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e do índice apoptótico tecidual por hibridização in-situ (TUNEL). Resultados: Após 10 semanas, os grupos 1 e 2 apresentaram menor gordura visceral quando comparados aos grupos 3 (29,4 vs 37,96 gramas, p<0,05) e 4 (31,87 vs 41,96 gramas, p<0,05), respectivamente. AF diminuiu o crescimento da próstata em ratos com dieta normal (grupo 1 vs grupo 3, p<0,05), mas este achado não foi evidenciado em ratos alimentados com dieta rica em gorduras (grupo 2 vs grupo 4). Quando comparados os ratos com dieta normal (grupo 1 vs grupo 3), os genes relacionados ao IGF1, IRS1 e Akt foram subexpressos na próstata de ratos submetidos a AF (médias de 0.22, 0.04 e 0.27 respectivamente). Esses padrões de expressão também foram evidenciados quando comparamos ratos com dieta rica em gorduras (grupo 2 vs grupo 4), mas a subexpressão de IGF1 foi menos pronunciada (p<0,001). AF aumentou a expressão de genes relacionados à angiogênese (HIF-1α, VEGF, VEGFR e mTOR) quando comparamos ratos submetidos a dieta rica em gorduras (grupo 2 vs grupo 4). O índice apoptótico (número de apoptoses/10 HPF) foi maior em ratos submetidos a AF (9,0 vs 2,0, grupo 1 vs grupo 3, p=0,07), (9,0 vs 1,43, grupo 1 vs grupo 4; p<0,05). Conclusão: A atividade física inibe a expressão gênica do eixo proliferativo IGF1/Akt na próstata tanto em ratos normais quanto em ratos com dieta rica em gorduras, estimula a angiogênese em ratos com dieta rica em gorduras e estimula a apoptose prostática. Esses achados podem estar relacionados à prevenção de HPB
Descritores: hiperplasia prostática; exercício; obesidade; resistência à insulina; indutores da angiogênese; expressão gênica
Abstract
Abstract
Fonseca FMF. Role of physical activity on gene expression of proliferative and angiogenic pathways on prostate, and their implications on prevention of prostatic benign hyperplasia: experimental study [Thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2017.
Introduction: Sedentarism and obesity have been reported as relevant risk factors for the development of benign prostatic hyperplasia (BPH). In the present work we investigated the role of physical activity in proliferative and angiogenic pathways on prostate and implications for BPH prevention. Methods: Male Wistar rats with eight weeks old were used in this experiment, randomly divided into four groups: 1. physical activity (PA) and normal diet; 2. PA and high fat diet; 3. sedentary (S) and normal diet; 4. S and high fat diet. Food and water were provided ad libitum. The rats in the Groups 1 and 2 were submitted to a swimming training protocol for 10 weeks, executed five times a week with duration of 60 minutes per day. At the end of the protocol, prostate glands were dissected, weighted and stored. We measured prostatic gene expression levels of insulin-like growth factor 1 (IGF1), IGF1/PI3K/Akt proliferative axis and genes related to angiogenesis through the quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method, and apoptotic index (TUNEL). Results: After 10 weeks, groups 1 and 2 had less visceral fat when compared to the groups 3 (29,4 vs 37,96 grams; p<0,05) and 4 (31,87 vs 41,96 grams; p<0,05), respectively. According to prostate weight, PA decreased prostate growth in normal fed rats (group 1 vs group 3, p<0,05), but this finding was not shown in high fat fed rats (group 2 vs group 4). When comparing normal fed rats (group 1 vs group 3), IGF1, IRS1 and Akt genes were less expressed in prostate of rats submitted to PA (means 0.22, 0.04 and 0.27 respectively). Those patterns of expressions were also shown when we compared high fat fed rats (group 2 vs group 4), but the IGF1 downregulation was less pronounced (p<0,001). PA increased the expression of angiogenic related genes (HIF-1α, VEGF, VEGFR and mTOR) when comparing rats submitted to high fat diet. Apoptotic index (number of apoptosis per 10 HPF) was higher in rats submitted to PA (9,0 vs 2,0; group 1 vs group 3; p=0,07), (9,0 vs 1,43; group 1 vs group 4; p<0,05). Conclusion: PA seems to inhibit IGF1/Akt proliferative axis on prostate in both normal and high fat fed rats, stimulates angiogenesis in high fed rats, and increase prostatic apoptosis. These findings can be related to BPH prevention.
Descriptors: prostatic hyperplasia; exercise; obesity; insulin resistance; angiogenesis inducing agents; gene expression
1 Introdução
Introdução 2
1.1 Considerações Gerais
1.1.1 Hiperplasia Prostática Benigna
A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma doença altamente
prevalente em homens maduros, sendo encontrada em cerca de 40% dos
homens na quinta década e em até 90% dos homens na nona década de vida
1. Apesar de alguns homens com esta condição não manifestarem sintomas, a
HPB se caracteriza primordialmente pelo desenvolvimento progressivo de
sintomas relacionados ao trato urinário inferior (STUI) 2. Estes sintomas são
classificados em sintomas de armazenamento (aumento da frequência urinária,
noctúria, urgência e disúria) e sintomas de esvaziamento (hesitação,
intermitência, jato partido, jato fraco, sensação de esvaziamento incompleto e
gotejamento terminal).
O impacto da HPB sobre os STUI foi bem avaliado por estudos
populacionais norte-americanos utilizando o escore internacional de sintomas
prostáticos da Associação Americana de Urologia 3. No estudo da saúde dos
homens de Flint (Flint Men’s Health Study) os STUI de intensidade média ou
grave estiveram presentes em 26% e 42% dos homens entre 40 a 49 anos e
50 a 59 anos, respectivamente 4. Outras análises mostram que cerca de 75%
dos homens com 70 anos ou mais apresentarão pelo menos um STUI
relacionado à HPB 5. No nosso meio, uma recente análise envolvendo quase
mil homens com média de idade de 61 anos submetidos a um programa de
detecção de câncer de próstata no Hospital das Clínicas da Universidade de
Introdução 3
São Paulo demonstrou que 48% deles apresentavam STUI, de intensidade
moderada a grave, relacionados à HPB 6.
A HPB pode comprometer de forma significativa a qualidade de vida
dos homens por alterar os padrões do sono e as atividades diárias 7. Ademais,
devido a seu caráter progressivo, pode evoluir com complicações como
retenção urinária, insuficiência renal aguda, infecções urinárias de repetição,
litíase vesical e necessidade de cirurgia 8. As taxas de progressão da doença
aumentam com a idade, com a gravidade dos STUI, com o aumento do volume
prostático, com o aumento dos níveis séricos de antígeno prostático específico
e com a redução na velocidade do fluxo urinário 8, 9. Nos Estados Unidos, a
HPB é responsável por um total de 12 milhões de consultas médicas eletivas e
cerca de 120.000 cirurgias por ano 10.
Apesar de amplamente estudados, os mecanismos moleculares que
envolvem o componente glandular e estromal da próstata levando à HPB não
são adequadamente compreendidos. Durante muitos anos, a busca por
fatores etiológicos para o desenvolvimento da HPB e dos STUI se concentrou
em causas não modificáveis, incluindo predisposição genética, alterações nos
hormônios sexuais e alterações na musculatura vesical relacionadas à idade 11,
12, 13, 14. Entretanto, observações recentes indicam que distúrbios metabólicos
sistêmicos também podem contribuir de maneira importante na patogênese da
HPB 15.
Introdução 4
1.1.2 Síndrome Metabólica
A síndrome metabólica (SM) representa uma doença complexa,
descrita como a combinação de várias alterações metabólicas inter-
relacionadas, incluindo obesidade central, dislipidemia, hiperglicemia,
hipertensão arterial e resistência periférica a insulina 16, 17. A SM está
diretamente associada à doença aterosclerótica, insuficiência coronariana e
diabetes mellitus (DM) do tipo 2, acarretando um elevado custo sócio-
econômico para inúmeros países, sendo hoje considerada uma epidemia
mundial 18.
A prevalência da SM aumenta linearmente dos 20 aos 50 anos de
idade, quando então atinge um platô. Estima-se que a prevalência da SM se
encontra em 25% no Brasil e acima de 40% nos Estados Unidos 19. A síndrome
se desenvolve como resultado de hábitos alimentares inadequados e
sedentarismo, que estão associados à resistência periférica à insulina e
obesidade. A resistência à insulina ocorre quando há uma diminuição na
capacidade de resposta dos tecidos periféricos (músculos, tecido adiposo e
fígado) ao estímulo da insulina, com concomitante hiperinsulinemia e produção
de fator de crescimento semelhante a insulina do tipo 1 (IGF1) no fígado
através da estimulação do eixo somatotrópico 20. IGF1 é considerado um
potente estimulador de mitose e inibidor de apoptose em vários tecidos 21.
Obesidade central é também considerada como um componente
importante para progressão da SM. O tecido adiposo visceral secreta várias
Introdução 5
substâncias bioativas conhecidas como adipocitocinas, que por sua vez podem
induzir resistência à insulina, além de possuírem efeitos pró-inflamatórios,
criando um estado de inflamação crônica em vários tecidos do corpo. Níveis
circulantes de citocinas, incluindo leptina, fator de necrose tumoral alfa (TNF-
), interleucina (IL) 6 e 8, proteína C reativa e fibrinogênio estão tipicamente
elevados em pacientes obesos e com DM do tipo 2. Ao contrário, um hormônio
chamado adiponectina apresenta níveis séricos diminuídos em pessoas com
acúmulo de gordura visceral. A adiponectina estimula o metabolismo da glicose
e a oxidação de ácidos graxos no músculo, elevando a sensibilidade à insulina
no fígado 20, 22.
1.1.3 Síndrome Metabólica e HPB
A SM tem sido associada a um aumento do risco de desenvolvimento
de STUI e HPB em vários estudos observacionais. Dentre os 2.372 homens
que participaram do estudo NHANES III (National Health and Examination
Survey), aqueles que possuíam ao menos 3 componentes da SM
apresentavam uma elevação de 80% no risco de desenvolverem STUI quando
comparados com aqueles que não possuíam nenhum componente da
síndrome 23. Em uma coorte de 158 pacientes com STUI relacionados à HPB
foi notado que homens com algum componente da SM possuíam próstatas
com volume maior e taxas de crescimento anuais de volume prostático mais
elevadas 24.
Introdução 6
Um estudo longitudinal realizado na Universidade da Califórnia evidenciou a
relação direta entre alguns componentes da SM e o desenvolvimento de HPB e
STUI. Nesta análise, cada elevação de 1 kg/m2 no índice de massa corporal
(IMC) se correlacionou a um aumento de 0,41 ml no volume da próstata dos
indivíduos estudados. Pacientes obesos apresentaram um risco 3,5 vezes
maior de possuírem próstatas acima de 40 gramas na ressonância magnética
quando comparados a indivíduos não obesos. Neste mesmo estudo, homens
com glicemia de jejum elevada e com DM eram 2,5 e 3 vezes mais propensos
a apresentar STUI, respectivamente 25. Da mesma forma, uma análise de mais
de 16.000 espécimes de prostatectomia radical confirmou essa relação direta
entre SM e HPB. A análise multivariada revelou que cada aumento de 1 kg/m2
de IMC antes da cirurgia estava associado a um aumento de 0,45 gramas no
volume prostático total 26. Um recente estudo retrospectivo avaliando pacientes
com indicação para tratamento cirúrgico por HPB mostrou que a prevalência de
SM foi maior em pacientes com HBP do que nos controles (58 vs. 41%; p =
0,007), e em comparação com o grupo controle, os pacientes com HBP
apresentaram níveis mais altos de colesterol, LDL, insulina e índice HOMA,
mas níveis mais baixos de HDL e estradiol 27.
Apesar destas evidências clínicas, os mecanismos responsáveis por
essa relação de causa e efeito ainda precisam ser esclarecidos. Acredita-se
que vários componentes da SM podem ser responsáveis pelo desenvolvimento
de HPB nesses indivíduos, principalmente fatores relacionados à resistência
insulínica, obesidade e hipercolesterolemia. A Figura 1 resume os principais
mecanismos potenciais que relacionam a HPB com a SM 28.
Introdução 7
O aumento da resistência periférica à insulina pode influenciar o
crescimento da próstata e a piora dos STUI através do aumento do tônus do
estroma prostático por elevação da atividade simpática induzida pela
hiperinsulinemia, ou a potencial ligação da insulina diretamente no tecido
prostático e indução do seu crescimento 29, 30. A ação do IGF1 induzida pela
hiperinsulinemia tem se mostrado particularmente importante para o
crescimento da próstata e seu desenvolvimento, e alterações na via de
sinalização do IGF1 foram anteriormente descritas em linhas de células
estromais da próstata derivadas de pacientes com HBP 31. O IGF1 é uma
proteína composta por 70 aminoácidos e é produzida primariamente no fígado,
cuja biossíntese é controlada pelo hormônio do crescimento 32. Em contraste
com a insulina, o IGF1 também pode ser produzido localmente em vários
tecidos, e é considerado um hormônio com potencial função parácrina ou
autócrina, além de sua função endócrina. No caso da próstata, o IGF1
endógeno é produzido somente em células do estroma prostático, não sendo
encontrado no tecido epitelial, quando analisamos células de tecido prostático
hiperplásico 33. A ação do IGF1 na próstata é desencadeada através de sua
ligação com um receptor específico, o IGF1R, encontrado na parede de células
epiteliais da próstata. Portanto, esse hormônio habitualmente atua de forma
parácrina através da ligação do IGF1 produzido no estroma com o IGF1R
localizado no epitélio, ou então de forma endócrina, através da ligação do IGF1
sérico em seu receptor específico. O nível sérico de IGF1 biodisponível
também pode sofrer elevação em virtude da queda dos níveis séricos das
proteínas ligadoras do IGF1 (IGFBPs) secundária ao aumento da insulina
sérica. Em uma análise de 1454 homens inseridos no Prostate Cancer
Introdução 8
Prevention Trial, o nível sérico de uma das proteínas ligadoras do IFG1
(IGFBP3) se correlacionou inversamente ao risco de HPB, e a relação
IGF1/IGFBP3 estava diretamente associada ao risco de HPB, principalmente
em homens com sobrepeso 34.
Figura 1- Potenciais mecanismos relacionando a HPB/ STUI com a
SM
As principais vias de sinalização ativadas pela ligação do IGF1 com o
IGF1R na próstata e outros tipos de órgãos são a cascata de proteíno-quinase
ativada por mitógenos (MAPK) e a cascata da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)
/ proteina quinase B (Akt) 35. O IGF1R ativado é conectado à via da MAPK
através de proteínas adaptadoras do substrato do receptor de insulina (IRS1),
que ativam as quinases ERK1 e ERK2, da familia MAPK, com subsequente
fosforilação e ativação de fatores de transcrição que resultam em respostas
Introdução 9
celulares de diferenciação e proliferação 36. IRS1 também pode acoplar seu
receptor ativo à PI3K com subsequente recrutamento da Akt. Os efeitos em
cascata da ativação da via PI3K/Akt incluem proteção de apoptose e aumento
da proliferação celular devido, em parte, à fosforilação e inibição de proteínas,
tais como glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3). A fosforilação da ciclina D1 por
GSK-3 desencadeia a redistribuição de ciclina D1 a partir do núcleo para o
citoplasma, permitindo a progressão da fase G1 do ciclo celular e consequente
proliferação celular 37. A Figura 2 mostra um desenho esquemático desta via
proliferativa na próstata.
O mecanismo pelo qual a obesidade pode promover a HPB também não
é totalmente conhecido. Uma possível explicação é a de que a obesidade induz
um estado de inflamação sistêmica e estresse oxidativo, como descrito
anteriormente, e a inflamação representa um importante papel no
desenvolvimento e progressão da HPB. Estudos têm revelado que a presença
de algumas citocinas no tecido prostático estimula a produção de fatores de
crescimento e inibem a apoptose das células prostáticas 38, 39. A produção de
quimiocinas pró-inflamatórias, tais como IL-6 e IL-8, promovem a hiperplasia
das células epitetiais da próstata através da ação proliferativa direta da IL-8 ou
através da liberação de outros fatores de crescimento, como FGF-2, gerando
um processo de proliferação por inflamação crônica. Esse processo é
modulado através da ação do colesterol LDLox em seu receptor específico
(LOX-1) localizado no estroma da próstata, e aparentemente os andrógenos
inibem essa ação. Nas células prostáticas humanas in vitro, a
dihidrotestosterona atenuou a secreção de IL-8 induzida por LDLox através da
Introdução 10
supressão da expressão do receptor LOX-1 40, 41. Em estudo semelhante, um
efeito protetor da dihidrotestosterona sobre a inflamação e secreção de fatores
de crescimento também foi observado em células prostáticas humanas in vitro
42.
Figura 2- Simplificação da via proliferativa do IGF1 na próstata
A obesidade pode ainda promover uma desregulação dos hormônios
sexuais masculinos por aumento da aromatização da testosterona nos tecidos
periféricos, alterando a relação entre testosterona e estrogênio, contribuindo
Introdução 11
para a patogênese da HPB 25. Um estudo prospectivo com seguimento de 5
anos avaliou a incidência e progressão de LUTS em 780 pacientes com idade
entre 35 e 80 anos, evidenciando que um nível sérico de estradiol mais elevado
e um menor nível sérico de testosterona foram fatores preditores para maior
chance de progressão de LUTS de armazenamento e esvaziamento 43. Os
estrogênios estimulam a resposta inflamatória em células prostáticas humanas,
principalmente através da ativação do GPER1. Em estudo avaliando células
prostáticas do estroma humano, o 17β-estradiol aumentou a secreção de IL-8,
que foi diminuída com o uso de antagonista de GPER1. Já a presença de um
agonista da GPER1 induziu a secreção de IL-8 44. Adicionalmente um estudo
experimental demonstrou que a reposição de testosterona preveniu os efeitos
na próstata de inflamação, fibrose e hipóxia induzidos pela síndrome
metabólica 45.
Outro potencial mecanismo responsável pela relação entre SM e HPB
é a isquemia prostática crônica. Evidências clínicas e experimentais têm
demonstrado que a presença de fatores de risco cardiovasculares em
pacientes com HPB está associada com um aumento do índice de resistividade
das artérias periuretrais e capsulares da próstata. O aumento nesse índice de
resistividade, por sua vez, foi associado a um aumento do volume prostático
total e do volume da zona de transição da próstata 46, 47. Ademais, um estudo
experimental em coelhos submetidos a um estado de isquemia pélvica crônica
induzida por lesão endotelial das artérias ilíacas revelou um aumento na
contração da musculatura lisa prostática e mudanças estruturais na próstata 48.
Um estudo de cultura celular também demonstrou que células estromais da
Introdução 12
próstata respondem à hipóxia com o aumento da produção de diversos fatores
de crescimento, sugerindo um possível vínculo com a patogênese da HPB 49.
Estes achados convergem para a hipótese de que fatores de risco
cardiovasculares podem causar hipóxia prostática, que por sua vez estimula o
crescimento da glândula. Este crescimento pode levar a um aumento adicional
na resistência vascular, criando um ciclo vicioso.
1.1.4 Atividade física e HPB
Consensos internacionais recomendam que a obesidade seja o principal
foco de intervenção para SM. Estudos revelam que a perda de peso,
juntamente com um regime de atividade física leve ou moderada (cerca de 30
minutos por dia) reduz as taxas de triglicerídeos e eleva o colesterol HDL,
reduz a pressão arterial e a resistência à insulina 50. Considerando, portanto,
que exista uma possível relação causal entre SM e HPB, tem sido sugerido que
a prevenção da SM através de medidas comportamentais pode ter um efeito
positivo nos sintomas e na progressão da HPB.
Desta forma, diversos estudos clínicos têm apontado para um vínculo
entre altos níveis de atividade física e um menor risco de HPB/STUI. Um
desses estudos acompanhou uma coorte de 1.019 homens com idade entre 40
e 70 anos por nove anos e revelou que altos níveis de atividade física (maior
versus menor quartil) estiveram associados a um risco 50% menor de HPB 51.
Em uma análise transversal de 2.797 homens participantes do estudo NHANES
Introdução 13
III (Third National Health and Nutrition Examination Survey), todos os níveis de
atividade física moderada e intensa estiveram inversamente associados com os
STUI de forma significativa. De modo contrário, indivíduos sedentários
apresentaram um risco duas vezes maior de desenvolver STUI em relação à
indivíduos ativos 52. Finalmente, uma meta-análise revelou que indivíduos que
possuem uma rotina de atividade física regular podem apresentar menor risco
de desenvolver HPB/STUI. Através da análise de 11 estudos envolvendo
43.083 homens, os autores observaram que oito estudos mostraram uma
relação inversa, dois estudos uma relação nula e um estudo uma relação
equívoca entre atividade física e HPB/STUI. A análise conjunta dos dados
revelou que homens engajados em uma rotina de atividade física leve,
moderada ou intensa apresentaram uma redução de 25 a 30% no risco de
HPB/STUI em relação a indivíduos com um estilo de vida sedentário 53. Apesar
dessas evidências clínicas consistentes, nenhum estudo clínico randomizado
até o presente momento avaliou o papel da atividade física no desenvolvimento
de STUI ou da HPB. Além disso, os mecanismos biológicos através dos quais a
atividade física pode influenciar o desenvolvimento da HPB/STUI ainda são
desconhecidos.
1.1.5 Justificativa
Em virtude da alta prevalência da HPB na população geral, é de suma
importância o correto entendimento de fatores potencialmente modificáveis
para o seu desenvolvimento. Para isso, o primeiro passo para o conhecimento
Introdução 14
dos mecanismos pelos quais a atividade física atua no metabolismo da
próstata e de que forma a SM participa desse processo é o de criar condições
de estudo próximas do ideal através de um modelo experimental, incluindo um
modelo de atividade física e de SM.
2. Objetivos
Objetivos 16
Objetivo Primário
- Avaliar experimentalmente o papel da atividade física nas vias
moleculares de proliferação relacionadas à SM e vias de
angiogênese na próstata de ratos com dieta normal e dieta
hiperlipídica.
Objetivo Secundários
- Avaliar o papel da atividade física na apoptose de células prostáticas
de ratos com dieta normal e dieta hiperlipídica.
- Validação de modelo murino experimental de atividade física.
3. Métodos
Métodos 18
3.1 Tipo de estudo
Estudo experimental controlado.
3.2 Local e época
O estudo foi realizado no Biotério da Faculdade de Medicina da USP,
no Biotério da Faculdade de Educação Física da USP e no Laboratório de
Investigação Médica 55 da USP (LIM-55) desde o primeiro semestre de 2014.
3.3 Modelo experimental
Foram utilizados no experimento 28 ratos machos do tipo Wistar (200-
220 gramas), com 8 semanas de idade. Os animais foram condicionados por 1
semana antes do experimento com dieta padronizada e ingestão de água ad
libidum. Todos os animais foram submetidos a ciclos invertidos de 12/12 horas
de claro-escuro e condicionados a uma temperatura de 24-27ºC.
3.4 Intervenção
Os ratos foram randomizados em 4 grupos de 07 animais e alocados
em gaiolas com três a cinco animais cada. No grupo 1 e grupo 2
Métodos 19
implementamos um modelo de atividade física, e no grupo 3 e 4 os animais
foram submetidos a uma rotina sedentária (manutenção dos animais em
gaiolas com enriquecimento ambiental).
Nos grupos 1 e 2 as cobaias foram submetidas a um programa de
atividade física através de protocolo de treinamento aquático descrito
previamente na literatura (54). No grupo 1, foi oferecido aos animais a dieta
padrão AIN-93 (Pragsoluções Biociências, Jaú - SP) composta por 62% amido,
14% proteínas, 10% sacarose, 4% óleo de soja e vitaminas e minerais em
dosagem padrão durante doze semanas. No grupo 2, foi oferecida às cobaias
uma dieta hiperlipídica (Pragsoluções Biociências, Jaú - SP) composta por 36%
amido, 14% proteínas, 30% gorduras (banha de porco), 10% sacarose, 4%
óleo de soja, além de vitaminas e minerais em dosagem padrão durante as
mesmas doze semanas, com o intuito de induzir a SM.
Nos grupos 3 e 4, os animais foram submetidos a uma rotina
sedentária durante as mesmas doze semanas. Em analogia aos grupos 1 e 2,
as cobaias do grupo 3 ingeriram dieta padrão, e as do grupo 4 dieta
hiperlipídica (Figura 3).
Métodos 20
Figura 3- Divisão esquemática dos grupos estudados
As cobaias selecionadas para a rotina de atividade física foram
submetidas a sessões de treinamento aquático durante o ciclo escuro, 60
minutos por dia, 5 dias por semana, por 10 semanas consecutivas, em uma
piscina adaptada para ratos contendo água morna (30-32ºC). A duração e a
intensidade do exercício foram aumentadas gradualmente até que as cobaias
fossem capazes de realizar o exercício durante 60 minutos utilizando um peso
na cauda equivalente a 5% de seu peso corporal (Figura 4). Após esse período
de adaptação, a intensidade e duração do treinamento foram constantes até o
término do período de 10 semanas. Os animais foram pesados semanalmente
e o peso na cauda ajustado pelas variações de peso. Este protocolo de
natação foi descrito previamente como de intensidade leve a moderada e de
longa duração, com o intuito de aumentar a capacidade oxidativa muscular 54,
Métodos 21
55. Os animais selecionados para a rotina sedentária permaneceram em gaiolas
padrão durante todo o período do estudo, se movimentando livremente.
Figura 4- Treinamento aquático dos grupos 1 e 2
Na 10ª e 11ª semana de experimento, os animais foram submetidos a
adaptação em esteira de exercício e no tubo de contenção do aparelho de
mensuração da pressão arterial sistêmica não invasiva (tail-cuff).
Posteriormente, na 12ª semana do experimento, cada animal realizou o teste
de consumo máximo de oxigênio (VO2máx) através de esteira adaptada em
gaiola metabólica hermética com capacidade de mensuração da concentração
de oxigênio, com o intuito de mensurar o condicionamento físico dos animais
(Figura 5). Após 30 minutos de repouso na esteira adaptada, o consumo de
oxigênio (VO2) basal foi mensurado. O VO2 foi coletado através da análise do
gás expirado durante um protocolo de teste de exercício progressivo,
aumentando a velocidade da esteira em 3 metros por minuto a cada 3 minutos,
Métodos 22
e terminando no momento em que o VO2máx do animal foi atingido. O VO2máx
foi definido como o VO2 que não elevou mais de 5% a captação de oxigênio
mesmo após o aumento da carga de exercício. O influxo e o efluxo das
concentrações de oxigênio foram mensurados continuamente através de um
analisador apropriado (S-3A/I, Ametek, Pittsburgh, PA, USA). O VO2 foi
calculado utilizando o fluxo de oxigênio através da gaiola metabólica (PF),
definido como 6 litros/minuto, a fração expirada efluente de oxigênio (FEO2), a
fração de oxigênio do ar ambiente (FIO2) e o peso do animal, através da
fórmula descrita a seguir:
VVOO22 ((mmll//KKgg//mmiinn)) == PPFF ** ((FFIIOO22 –– FFEEOO22))//PPeessoo
Métodos 23
Figura 5- Esteira adaptada em gaiola metabólica para mensuração
do consumo de oxigênio
O VO2 de reserva foi calculado através da seguinte fórmula:
VVOO22 rreesseerrvvaa ((mmll//KKgg//mmiinn)) == VVOO22mmááxx –– VVOO22 bbaassaall
A pressão arterial sistólica também foi medida neste período através do
método tail-cuff (Kent Scientific, Torrington, CT, USA), método que consiste em
envolver um sensor na base da cauda do animal e mensurar a pressão
insuflando um cuff acoplado a um sensor até a pressão de 200 mmHg, e
Métodos 24
desinsuflando continuamente com o intuito de detectar a pressão sistólica não
invasiva no momento da detecção do pulso arterial previamente ocluído.
No dia 90 do experimento os ratos foram anestesiados com 1,2 g/kg de
uretano através de injeção intraperitoneal, submetidos a coleta de sangue e
sacrificados por decapitação. As amostras sanguíneas foram coletadas através
da saída livre do sangue da região cervical imediatamente após o sacrifício,
posteriormente centrifugadas e o soro armazenado em tubos de eppendorf a -
80ºC. Através do soro foi realizada análise da glicemia, colesterol total, LDL,
HDL, triglicerídeos, insulina, testosterona total, DHT e IGF1 pelo teste de Elisa.
Após o sacrifício e a coleta de sangue, foi realizada a extração da
próstata, seguida de dissecção e pesagem, além de dissecção e pesagem da
gordura epididimária e retroperitoneal (Figuras 6 e 7). Os lobos prostáticos
ventrais foram separados e preservados em formol para análise de apoptose
pelo método de TUNEL (Terminal dUTP Nick-End Labeling), além de
preservação em RNA-later para análise de expressão gênica da via
proliferativa de IGF1 / Akt (IGF1, IGF1R, IRS1, PI3K, MAPK e Akt), além de
expressão gênica de fatores relacionados à hipóxia e angiogênese (HIF-1α,
VEGF, VEGFR1, VEGFR2 e mTOR).
O descarte de animais seguiu a orientação da cartilha de orientação de
descarte de resíduos no sistema FMUSP-HC.
Métodos 25
Figura 6- Dissecção da próstata e separação dos lobos ventrais
Figura 7- Dissecção da gordura retroperitoneal (A e B) e epididimária (C)
Métodos 26
3.5 Análise da expressão gênica
A expressão dos genes estudados foi avaliada a partir da extração do
RNA do tecido prostático, síntese do cDNA a partir do RNA e análise posterior
do cDNA utilizando a metodologia de transcrição reversa seguida de reação
em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) (plataforma
Abi7500) utilizando-se o protocolo TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City,
CA). Experimentos iniciais de quantificação absoluta com o gene controle ß2
microglobulina (B2M) validaram o cDNA antes da realização dos experimentos
de quantificação dos genes de interesse. Para quantificação relativa dos genes
em estudo normalizamos a expressão destes em relação à expressão do gene
controle B2M. Como grupo controle, estudamos as amostras de tecido
prostático de ratos sedentários. Para calcular a expressão relativa dos genes
alvo foi utilizado o método ∆∆CT, que utiliza a seguinte fórmula: ∆∆CT = (CT do
gene alvo, amostra de próstata de rato ativo – CT do controle endógeno,
amostra de rato ativo) – (CT do gene alvo, amostra de rato sedentário – CT do
controle endógeno, amostra de rato sedentário). O número de vezes que
ocorre a mudança da expressão gênica é calculado como 2 -∆∆CT. A Tabela 1
descreve os genes estudados.
Métodos 27
Tabela 1- Primers utilizados para quantificação dos genes selecionados para estudo
Primer Ensaio Primer Ensaio
IGF1 Rn00710306_m1 HIF-1α Rn00577560_m1
IGF1R Rn00583837_m1 VEGF Rn01511601_m1
IRS1 Rn02132493_s1 VEGFR-1 (Flt-1) Rn00570815_m1
Akt Rn00690900_m1 VEGFR-2 (KDR) Rn00564986_m1
PI3K Rn00564547_m1 mTOR Rn00693900_m1
MAPK3 Rn00820922_g1 B2M Rn560865_m1
3.6 Análise de apoptose por hibridização in-situ (TUNEL)
Este ensaio foi realizado nas células da porção ventral da próstata dos
ratos dos quatro grupos, através de marcação com TdT-FragEL™ DNA
Fragmentation Detection Kit (Cat. Nº QIA33-1EA). As lâminas com tecido
prostático foram desparafinizadas e reidratadas com xileno e etanol,
permeabilizadas com Proteinase K e submetidas a inativação de peroxidases
endógenas utilizando peróxido de hidrogênio a 9% e então lavadas em TBS
(tris-buffered saline) e incubadas em solução tampão de equilíbrio em
temperatura ambiente. Posteriormente, as secções foram incubadas com a
enzima TdT (terminal deoxynucleotidyltranferase) Reaction Mixture à 37ºC por
1 hora e meia em câmara úmida. Após a lavagem com TBS, a revelação da
reação de hibridização in situ foi realizada com diaminobenzidina. As lâminas
com as células marcadas foram digitalizadas e analisadas por uma única
Métodos 28
médica patologista (Dra. Kátia Leite) e quantificadas a cada 10 campos de
grande aumento (High Power Field – HPF).
3.7 Análise estatística
As variáveis quantitativas foram resumidas através da média e desvio
padrão. Para análise estatística foi utilizado o teste t de Student para análise
univariada e ANOVA para análise multivariada, através do software SPSS 19.0.
Em toda a análise estatística foi adotado um nível de significância de 5%
(p<0,05).
4. Resultados
Resultados 30
4.1 Considerações iniciais
Durante as 12 semanas do experimento, os animais não apresentaram
intercorrências clínicas ou sintomas de doenças infecto-contagiosas. Todo o
protocolo de treinamento físico foi realizado sem interrupções. O rato 11,
pertencente ao grupo 2, faleceu na última semana do treinamento físico
durante o exercício, provavelmente por afogamento. Os órgãos abdominais
foram retirados logo após o falecimento e utilizados no estudo, entretanto não
foi possível a realização da coleta de sangue.
O consumo de ração dos ratos submetidos a dieta hiperlipídica (grupos
2 e 4) foi menor quando comparados aos ratos de dieta padrão (grupos 1 e 3),
e essa diferença foi notada durante as 12 semanas (Figura 8).
Os dados morfométricos e as análises séricas estão resumidos nas
tabelas 2 e 3.
4.2 Efeitos da Dieta Hiperlipídica
A dieta hiperlipídica administrada por 12 semanas não alterou
significativamente o ganho de peso ou a quantidade de gordura epididimária e
retroperitoneal. Os ratos submetidos à dieta hiperlipídica apresentaram
próstatas menores, sobretudo quando comparamos apenas os ratos
sedentários (1.38 vs 1.08 gramas; grupo 3 vs grupo 4; p<0,05). Essa diferença
Resultados 31
não foi evidenciada na comparação de ratos ativos (1,11 vs 1,17 gramas; grupo
1 vs grupo 2) (Tabela 2; Figura 9).
A pressão arterial sistólica foi semelhante entre os 4 subgrupos
estudados. A glicemia de jejum, os níveis séricos de insulina e o índice de
resistência periférica à insulina (índice HOMA) se elevaram em ratos com dieta
hiperlipídica quando comparados aos grupos de dieta padrão. Os níveis de
colesterol e triglicerídeos não se elevaram em virtude da dieta hiperlipídica,
pelo contrário, os maiores níveis de triglicerídeos foram observados nos ratos
sedentários de dieta padrão. Os níveis séricos de testosterona não se
alteraram em virtude da dieta hiperlipídica e a dieta hiperlipídica se
correlacionou com uma redução dos níveis de DHT e IGF1 quando
comparamos os ratos sedentários (grupo 3 vs grupo 4) (Tabela 3; Figura 10).
Figura 8- Consumo semanal individual de ração (gramas)
Resultados 32
Tabela 2- Dados morfométricos (resultados expressos em média)
AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05
Figura 9- Dados morfométricos dos grupos estudados
Grupo 1 (AF + DP)
(n=07)
Grupo 2 (AF + DHL)
(n=07)
Grupo 3 (SED + DP)
(n=07)
Grupo 4 (SED + DHL)
(n=07)
Peso Corporal (g)
Inicial
Semana 12
312,43
526,31
321,90
531,74
337,33
598,96
354,04
611,61
Ganho de Peso (g) 213,89 § £
209,84 # ‡
261,63 257,57
Gordura Epididimária (g) 14,06 § £
15,26 # ‡
19,74 20,38
Gordura Retroperitoneal (g) 15,35 £ 16,62 18,23 21,58
Peso da próstata (g) 1,11 § 1,17 1,38
† 1,08
AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. § = p < 0.05 grupo 1x3; £ = p <0.05
grupo 1x4 ; # = p < 0.05 grupo 2x3; ‡ = p <0.05 grupo 2x4; † = p <0.05 grupo 3x4.
Resultados 33
4.3 Efeitos da Atividade Física
Os ratos submetidos à atividade física ganharam menos peso quando
comparados aos animais sedentários, e a gordura abdominal (epididimária e
retroperitoneal) foi menor nos ratos ativos. A atividade física reduziu o peso da
próstata em ratos de dieta padrão (1,11 vs 1,38 gramas; grupo 1 vs grupo 3;
p<0,05), mas não exerceu influência em ratos com dieta hiperlipídica (1,17 vs
1,08 gramas; grupo 2 vs grupo 4; p>0,05) (Tabela 2; Figura 9).
A atividade física não exerceu influência na glicemia de jejum quando
comparamos os grupos sedentários paralelos (grupo 1 vs grupo 3; grupo 2 vs
grupo 4), mas a insulina sérica e o índice HOMA dos ratos ativos foi mais baixo
após as 12 semanas do estudo, sem significância estatística (grupo 1 vs grupo
3; grupo 2 vs grupo 4). Os níveis de triglicerídeos foram reduzidos pela
atividade física, sobretudo em ratos com dieta padrão (71,43 vs 111,32; grupo
1 vs grupo 3; p<0,001). O níveis séricos de DHT foram reduzidos pela atividade
física quando comparamos os ratos de dieta padrão (grupo 1 vs grupo 3), e o
nível de IGF1 se elevou em virtude da atividade física quando comparamos
ratos submetidos à dieta hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4) (Tabela 3; Figura
10).
Resultados 34
Tabela 3- Dados pressóricos e análise sérica (resultados expressos em média)
Grupo 1 (AF + DP)
(n=07) Grupo 2 (AF + DHL)
(n=07) Grupo 3 (SED + DP)
(n=07) Grupo 4 (SED + DHL)
(n=07)
PA sistólica 115,44 113,40 110,38 117,57
Glicemia 106,86 * £ 123,33
# 104,86
† 129,29
Insulina 4,15 £ 4,87 5,15 6,05
Índice HOMA 1,10 £ 1,49 1,33
† 1,96
Colesterol 63,50 * § 54,95
# 71,74
† 61,34
LDL 2,69 2,75 4,39 2,73
HDL 46,53 38,58 45,08 45,19
Triglicerídeos 71,43 § 68,08
# 111,32
† 67,11
Testosterona 0,89 0,77 0,79 0,95
DHT 0,12 § 0,15 0,21
† 0,13
IGF1 2,11 2,48 ‡ 2,65
† 1,40
AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05 grupo 1x2; § = p < 0.05
grupo 1x3; £ = p <0.05 grupo 1x4; # = p < 0.05 grupo 2x3; ‡ = p <0.05 grupo 2x4; † = p <0.05 grupo 3x4.
AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05
Figura 10- Dados de análise sérica dos grupos estudados
Resultados 35
A atividade física alterou o consumo de oxigênio basal entre os grupos
de dieta hiperlipídica (26,95 vs 20,75; grupo 2 vs grupo 4; p<0,05), e o
consumo máximo de oxigênio foi maior em ratos submetidos à atividade física,
sobretudo nos ratos do grupo 2 (65,53 vs 57,13; grupo 2 vs grupo 4; p<0,05).
O consumo de oxigênio de reserva não foi alterado pelo protocolo de
atividade física. Os dados estão resumidos na tabela 4.
Tabela 4- Parâmetros de consumo de oxigênio (resultados expressos em média)
Grupo 1 (AF +
DP)
(n=06)
Grupo 2 (AF +
DHL)
(n=05)
Grupo 3 (SED +
DP)
(n=07)
Grupo 4 (SED +
DHL)
(n=06)
VO2 basal (ml/Kg/min) 22,12 26,95 * # 21,80 20,75
VO2 máx (ml/Kg/min) 60,23 65,53 * # 56,06 57,13
VO2 reserva
(ml/Kg/min)
38,10 38,59 34,26 36,38
AF: Atividade física; SED: Sedentário; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ = p < 0.05 grupo 2x3; # = p < 0.05
grupo 2x4.
4.4 Análise da expressão gênica
Quando comparamos os animais submetidos à dieta padrão (grupo 1
vs grupo 3 ; Figura 11), a expressão gênica do IGF1 , IRS1 e Akt foi menor nas
próstatas de ratos submetidos à atividade física (0.22 , 0.04 e 0.27 vezes,
respectivamente), com padrão homogêneo de expressão. Estes padrões de
expressão gênica desencadeados pela atividade física também foram
evidenciados quando comparamos ratos que ingeriram dieta hiperlipídica
(grupo 2 vs grupo 4 ; Figura 12) , mas a subexpressão do IGF1 foi menos
pronunciada (p<0,001). A expressão gênica de PI3K e MAPK3 não foi
Resultados 36
influenciada pela atividade física tanto em ratos com dieta padrão quanto em
ratos com dieta hiperlipídica.
A atividade física se associou a uma superexpressão heterogênea de
HIF-1α, receptores de VEGF e de mTOR, além de leve subexpressão
heterogênea de VEGF, quando comparamos ratos submetidos à dieta padrão
(grupo 1 vs grupo 3; Figura 11). Quando comparamos ratos submetidos à dieta
hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4; Figura 12), a atividade física elevou a
expressão gênica de HIF-1α, VEGF, VEGFR1 e mTOR de forma homogênea.
Figura 11- Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos com
dieta padrão (Grupo 1 vs grupo 3) Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do grupo 3 (SED+DP)
Resultados 37
Figura 12- Efeitos da atividade física na expressão gênica em ratos com
dieta hiperlipídica (grupo 2 vs grupo 4) Linha de base: Média de expressão gênica dos ratos do grupo 4 (SED+DHL)
4.5 Análise de apoptoses por hibridização in situ (TUNEL)
O número de apoptoses por cada 10 campos de grande aumento (High
Power Field - HPF) identificado no processo de hibridização in situ (TUNEL) foi
maior nas próstatas de ratos submetidos à atividade física na comparação
entre ratos submetidos à dieta padrão (9,0 vs 2,0; grupo 1 vs grupo 3; p=0,07),
Resultados 38
mostrando uma diferença marginal, e entre os grupos extremos (9,00 vs 1,43;
grupo 1 vs grupo 4; p<0,05) (figuras 13 e 14). Apesar do número de apoptoses
também ter sido numericamente superior entre os animais do grupo 2 (AF +
DHL) em comparação com os grupo 3 e 4, não observamos significância
estatística (6,17 vs 2,00; grupo 1 vs grupo 3; p=0,78 6,17 vs 1,43; grupo 1 vs
grupo 4; p=0,52).
Figura 13- Número de apoptoses a cada 10 campos de grande aumento
(HPF) AF: Atividade física; SED: Sedentários; DP: Dieta padrão; DHL: Dieta hiperlipídica. ✱ p < 0.05 grupo 1x4; # p = 0.07 grupo 1x3
Resultados 39
Figura 14- Lâminas de tecido prostático submetidas à hibridização in situ
(TUNEL) de ratos submetidos à atividade física e dieta padrão (A e B), rato sedentário com dieta padrão (C) e sedentário com dieta hiperlipídica (D)
5. Discussão
Discussão 41
5.1 Modelo experimental
De uma maneira geral, os estudos experimentais necessitam de um
critério extremamente cuidadoso na escolha do modelo experimental a ser
estudado, a fim de criar o melhor ambiente possível para a análise da
intervenção desejada. Em nosso experimento, selecionamos um modelo animal
que possui um metabolismo prostático semelhante à próstata de humanos,
principalmente relacionado à HPB, e um protocolo de atividade física validado
por vários estudos, entretanto ainda desconhecido em nosso grupo de
pesquisa.
Os únicos animais que sabidamente podem desenvolver HPB
espontaneamente são o chimpanzé e o cão. A próstata do chimpanzé guarda
grande semelhança com a próstata de humanos, entretanto, chimpanzés não
são modelos experimentais úteis e o desenvolvimento de HPB se dá de forma
esporádica e em idade avançada, à semelhança dos humanos 56. Apesar de
vários estudos terem avaliado a próstata de cães, a HPB nesses animais se
desenvolve tipicamente após 8 anos de idade, limitando o estudo dessa
patologia específica. Além disso, o uso dos animais anteriormente citados
suscita questionamentos éticos relevantes 57.
Roedores têm sido classicamente utilizados como modelos
experimentais há décadas para avaliação de vários órgãos, tornando sua
utilização atrativa para o estudo da próstata, tanto pela semelhança do
metabolismo dos roedores em comparação com humanos, quanto pela
facilidade em se trabalhar com este modelo experimental. Vários estudos
anteriores utilizaram este modelo para análises da próstata e avaliações de
Discussão 42
parâmetros da síndrome metabólica. Além disso, roedores são ótimos modelos
experimentais de atividade física, tanto para protocolos de corrida em esteira
ou protocolos de treinamento aquático. Entretanto, algumas considerações
precisam ser resaltadas para análise de qualquer resultado extraído de
próstatas de roedores. A anatomia da próstata de roedores não se assemelha
à próstata de humanos, sendo a primeira dividida em quatro estruturas
lobulares distintas: lobo ventral, anterior, dorsal e lateral. Essas estruturas se
encontram em posição intraperitoneal, cobertos por uma fina cápsula
prostática, e tipicamente não causam compressão uretral quando aumentam
de volume, ao contrário da próstata de humanos, onde a uretra pode sofrer
compressão pelo aumento do volume da zona de transição 58. Atualmente é
consenso entre os autores que os lobos prostáticos de roedores não possuem
correlação embriológica ou anatômica com a próstata de humanos 59.
A linhagem de roedores escolhida levou em consideração a chance de
indução de SM e capacidade de extrapolação de dados para a espécie
humana. Optamos por estudar linhagens heterogênicas pois esses animais
possuem grande variabilidade gênica, devido aos cruzamentos aleatórios,
assim como ocorre com a espécie humana, ou seja, produzindo populações
naturais. Nos seres humanos, o rápido desenvolvimento de obesidade e SM é
mais comumente relacionado ao o aumento da ingestão calórica e falta de
atividade física, adicionado a predisposição genética. Portanto, seria de maior
interesse o estudo de um modelo de SM induzida pela maior ingestão
alimentar, ao invés do estudo de roedores com alterações genéticas. Vários
estudos prévios avaliaram a indução de SM nos roedores heterogênicos mais
utilizados em estudos experimentais, como Wistar e Sprague Dawley,
Discussão 43
entretanto alguns estudos falharam em demonstrar a indução de parâmetros
de SM em linhagens de Sprague Dawley 60. Além disso, Ratos Wistar são mais
ativos que roedores da linhagem Sprague Dawley, fato que poderia influenciar
o protocolo de atividade física.
A indução de SM tem sido classicamente realizada em roedores
através de modificações na dieta. A dieta hiperlipídica e a dieta rica em frutose
são as mais utilizadas para esse fim. Vários estudos demonstraram que a dieta
rica em frutose é capaz de induzir hiperglicemia, aumento da resistência
periférica à insulina e hipertensão arterial 61. Nosso grupo realizou um estudo
piloto em ratos Wistar que evidenciou uma baixa aceitação da dieta rica em
frutose, com importante perda de peso dos animais. De maneira semelhante, a
dieta hiperlipídica induz vários parâmetros da síndrome metabólica em ratos,
como hiperglicemia, aumento da resistência à insulina, dislipidemia e
obesidade, entretanto existe uma grande variabilidade de dietas hiperlipídicas
nos estudos publicados, com concentrações de gorduras que variam entre 30-
55% 62. A dieta escolhida para o nosso estudo se baseou em uma pesquisa
que comparou a indução da síndrome metabólica em ratos Wistar com 6
semanas de idade por um período de 12 semanas, através de várias dietas
hiperlipídicas, demonstrando que a dieta com 30% de gordura animal (banha
de porco) induziu com mais eficiência os parâmetros da síndrome, em virtude
da maior concentração de ácidos graxos saturados 63.
A dieta hiperlipídica administrada ao final do nosso estudo não
desenvolveu nos ratos todas as características clínicas da SM, elevando
apenas a glicemia e a resistência periférica à insulina. Não desencadeou
alterações significativas no perfil lipídico, pressão arterial e ganho de peso,
Discussão 44
além de proporcionar queda do IGF1 e DHT séricos, achados que não
condizem com o esperado em um modelo de SM. Entendemos que o curto
tempo de protocolo da dieta (12 semanas) pode ter influenciado os resultados,
já que alguns parâmetros da síndrome, como hipertensão arterial, não
aparecem até pelo menos 1 ano de dieta. Entretanto, outros estudos utilizando
protocolos de dieta de 12 semanas foram suficientes para desenvolver a
grande parte das características da síndrome. Talvez o fato mais relevante
para a falha em induzir a síndrome de maneira adequada tenha sido a baixa
ingesta de ração por parte dos ratos com dieta hiperlipídica em comparação
com ratos de dieta padrão, achado este que não condiz com outros estudos
que utilizaram esta ração específica 63. Em razão dessa inconsistência nos
resultados dos parâmetros da SM encontrados nos animais do nosso estudo,
optamos por não realizar comparações de expressão gênica entre ratos com
dieta hiperlipídica e dieta padrão (grupo 1 vs grupo 2; grupo 3 vs grupo 4), já
que o modelo de SM do nosso estudo não parece padronizado para realização
dessa análise comparativa. Além disso, a análise dos efeitos da atividade física
nos grupos de ratos submetidos à dieta hiperlipídica devem ser apreciados com
cautela em virtude das considerações citadas acima.
5.2 Consumo de oxigênio
O consumo basal e o consumo máximo de oxigênio são marcadores da
capacidade de metabolização do oxigênio pelos tecidos, e por isso quanto
maiores são seus valores, maior o condicionamento físico dos animais. Em
nosso estudo, os ratos ativos de dieta hiperlipídica apresentaram um maior
Discussão 45
consumo basal e maior consumo máximo de oxigênio (VO2máx), e estes
dados ajudam a validar o protocolo de atividade física implementado, aliado ao
fato dos ratos ativos terem ganhado menos peso corporal ao final do
experimento. Apesar do consumo máximo de oxigênio ter sido numericamente
maior no subgrupo de ratos ativos com dieta normal quando comparado aos
ratos sedentários (grupo 1 vs grupo 3), essa diferença não foi estatisticamente
significante. Esse resultado não é incomum em protocolos curtos de natação
de intensidade leve ou moderada, como no estudo em questão, pois
comumente o acréscimo de consumo não se eleva mais do que 10% nos ratos
ativos em relação aos sedentários, ao contrário de protocolos mais intensos,
que podem alterar em quase 30% o consumo máximo de oxigênio, tornando
mais fácil a comprovação de alguma diferença estatística significante 64. O fato
do teste de consumo se realizar em uma esteira de treino pode influenciar o
resultado quando analisamos ratos submetidos a protocolo aquático, já que
alguns ratos que são bons nadadores podem não ser bons corredores.
5.3 Vias proliferativas e de angiogênese
A atividade física suprimiu a expressão gênica de IGF1 endógeno,
IRS1 e Akt, de maneira uniforme, sem supressão gênica de PI3K, sugerindo
inibição da via proliferativa de IGF1/PI3K/Akt, já que a ativação da Akt
representa uma das fases finais da cascata de proliferação e é dependente da
ativação de PI3K. A supressão dessa via não foi acompanhada por uma queda
do IGF1 sérico, sugerindo que a supressão da via de sinalização de
Discussão 46
IGF1/PI3K/Akt foi provavelmente ocasionada pela diminuição da ação
parácrina do IGF1 produzido no estroma prostático, e não por um mecanismo
endócrino atuando diretamente no epitélio. A diminuição da insulina sérica e da
resistência periférica à insulina provocadas pela atividade física também podem
explicar parcialmente a supressão dessa via, já que receptores de insulina
presentes no epitélio da próstata também podem estimular essa via
proliferativa, ainda que em intensidade muito menor do que a estimulação
desencadeada pelo IGF1. A supressão gênica do IRS1 não se acompanhou da
supressão gênica da MAPK, podendo indicar que a atividade física não atuou
na inibição dessa via de sinalização. Entretanto, outros genes relacionados a
proteínas dessa via não foram estudados para confirmar esse achado e a
expressão heterogênea de MAPK pode ser reacional à forte supressão gênica
de IRS1.
Apesar de estudos anteriores já terem demonstrado como a via de
IGF1/PI3K/Akt pode induzir proliferação prostática, os efeitos da inibição desta
via na próstata são pouco estudados. Um estudo experimental murino
avaliando os efeitos da inibição desta via demonstrou que o uso de um inibidor
de PI3K/Akt induziu menor proliferação e maior índice de apoptose em tecido
prostático normal 65. Nosso estudo é pioneiro na avaliação dos efeitos da
atividade física nesta via proliferativa.
A atividade física associou-se a uma maior expressão gênica de fatores
de hipóxia (HIF1-α) e angiogênese (VEGF, VEGFR1 e mTOR), quando
analisamos ratos submetidos à dieta hiperlipídica. Essa diferença não foi
percebida na comparação entre ratos de dieta normal, com padrão de
expressão heterogêneo do VEGF e HIF-1α. De acordo com nosso
Discussão 47
conhecimento, este é o primeiro estudo que avalia os efeitos da atividade física
no processo de hipóxia e angiogênese de tecido prostático não tumoral. A
síndrome metabólica sabidamente pode danificar a função microvascular e
diminuir a densidade dos capilares de vários órgãos, e estudos prévios
indicaram diminuição do fluxo sanguíneo prostático e aumento da resistência
vascular em pacientes com HPB, quando comparados com pessoas sadias.
Além disso, pacientes com doenças vasculares apresentam uma maior
redução do fluxo prostático e maior gravidade dos sintomas relacionados a
HPB em relação a pacientes sem doenças vasculares 66. Recentemente,
Machado et al demonstrou que a atividade física é capaz de restaurar a função
microvascular de órgãos de ratos com SM, como músculo esquelético e pele 67,
fato que pode indicar que esse processo pode também ocorrer no tecido
prostático.
A atividade física está relacionada com a ativação de mTOR em vários
tecidos corporais, como músculo esquelético 68-70, coração 71 e cérebro 72, 73,
trazendo benefícios diversos para o correto funcionamento e longevidade
desses órgãos. A ativação de mTOR está intimamente ligada a estimulação de
fatores de angiogênese e hipóxia, como VEGF e HIF-1α, e frequentemente
esta estimulação está associada a proliferação e progressão de algumas
neoplasias 74, 75
.
O aumento da expressão de fatores de angiogênese na próstata não
necessariamente induz proliferação do tecido prostático no caso da atividade
física. Um estudo avaliando os efeitos da atividade física em um modelo murino
de câncer de próstata (C57BL/6), demonstrou que a atividade física estimulou
as vias de sinalização de MEK/MAPK e mTOR, com subsequente elevação dos
Discussão 48
níveis protéicos intratumorais de HIF-1α e VEGF, além de inibição dos níveis
de Akt, de maneira similar aos achados encontrados em nosso experimento.
Esses achados se associaram a uma hipervascularização e melhora da
perfusão tumoral. Entretanto, os ratos submetidos a atividade física mantiveram
o mesmo volume tumoral dos ratos controle, além de uma menor taxa de
envolvimento linfonodal (36%) e de metástases à distância (34%) nos ratos
ativos 76. Os achados aparentemente paradoxais encontrados nesse estudo
ainda não estão esclarecidos, mas podem indicar uma importante diferença na
forma como o HIF-1α é ativado em diferentes situações. Em condições
normais, está bem estabelecido que os tumores sólidos em geral possuem
vascularização aberrante que dificulta o fornecimento de oxigênio e a remoção
de metabólitos da glicólise, causando hipóxia tecidual e subsequente ativação
de HIF-1α. Esse processo estimula cascatas de angiogênese através da
estimulação de VEGF, em um esforço para manter o suprimento de oxigênio
intratumoral. Paradoxalmente, esse processo causa angiogênese patológica e
não produtiva, com formação de vasos aberrantes e queda na oxigenação e
perfusão, criando um ciclo vicioso com hipóxia, consequente invasão tumoral e
metástase 77. No estudo de Jones et al, a estimulação do HIF-1α induzida pela
atividade física foi associada a um desfecho oposto: melhora na perfusão e
vascularização tumoral, indicando um processo de angiogênese produtivo e
fisiológico que não está associado a um processo de indução de hipóxia
tecidual patológica como descrito anteriormente em situações de repouso,
podendo em parte explicar a menor taxa de progressão tumoral e menor índice
de metástases.
Discussão 49
De maneira semelhante, a hipóxia tecidual local também pode
desempenhar papel importante na progressão da HPB, induzida por estresse
oxidativo, achado este marcante em pacientes com síndrome metabólica,
levando à diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos e
neovascularização. Em resposta à hipóxia, células estromais prostáticas
podem estimular a produção de vários fatores de inflamação e proliferação,
como VEGF, FGF-2, FGF-7, e IL-8 78, 79. Portanto, um processo de
angiogênese produtivo e fisiológico provocado pela atividade física também
poderia prevenir hipóxia tecidual patológica em um tecido hiperplásico por
mecanismo semelhante ao encontrado no tecido neoplásico.
5.4 Análise de apoptose
A fragmentação do DNA representa uma característica essencial da
morte celular por apoptose. O ensaio de TUNEL (Terminal dUTP Nick-End
Labeling) permite identificar células em apoptose através da detecção de
fragmentos de DNA por microscopia. Os fragmentos de DNA resultantes da
quebra do DNA genômico podem ser identificados por marcação de
terminações 3’-OH livres, através de uma reação enzimática que catalisa a
incorporação de nucleotídeos marcados.
A atividade física parecer estimular o processo de apoptose celular na
próstata, achado que pode ser parcialmente explicado pela inibição da via
PI3K/Akt, já que esta via pode atuar na modulacão da proteína Bcl-2, que
regula o processo de apoptose 80. A fragmentação do DNA identificada pelo
Discussão 50
TUNEL representa uma fase tardia do processo de apoptose. Nesse caso, uma
avaliação futura das vias intrínseca e extrínseca do processo de apoptose pode
esclarecer em que momento a atividade física interfere no processo de
apoptose celular. A análise do Bcl-2 e das caspases podem ajudar a esclarecer
esse mecanismo.
5.5 Considerações finais e perspectivas futuras
Este é um trabalho original, sendo o primeiro a avaliar o papel da
atividade física na via proliferativa de IGF1/Akt e na via de angiogênese na
próstata, fato que irá auxiliar no melhor entendimento da prevenção do HPB,
principalmente em pacientes com síndrome metabólica. Os achados deste
estudo, aliado às evidências dos estudos observacionais, dão embasamento
teórico para recomendar a prática de atividade física como importante
prevenção de HPB.
O entendimento recente da importância de fatores responsáveis pela
indução de HPB em pacientes com síndrome metabólica, como a via
inflamatória, traz à tona a necessidade do estudo dos efeitos da atividade física
na modulação desta via. Há necessidade de aprimoramento do modelo
experimental de síndrome metabólica em nosso grupo de pesquisa, além da
escolha de um modelo experimental de HPB que seja adequado para o estudo
dos efeitos da síndrome metabólica e atividade física. Após estudos recentes
evidenciando o papel dos receptores de estrogênio e dos receptores de LDLox
na inflamação prostática de pacientes com síndrome metabólica,
Discussão 51
consideraremos em experimentos futuros a possibilidade de indução de
inflamação prostática com tamoxifeno, um modulador seletivo do receptor de
estrogênio, ou através da modulação do receptor de LDLox (LOX-1), para
aprofundar os estudos dos efeitos da síndrome metabólica na próstata e suas
implicações na prevenção da HPB.
6. Conclusões
Conclusões 53
A atividade física inibiu a expressão gênica do eixo proliferativo
IGF1/Akt na próstata tanto em ratos com dieta padrão quanto em ratos com
dieta hiperlipídica, e estimulou a expressão gênica de fatores de hipóxia e
angiogênese em ratos com dieta hiperlipídica.
A atividade física estimulou a apoptose de células prostáticas de ratos
com dieta padrão e dieta hiperlipídica, evidenciado pelo aumento do índice de
apoptose na hibridização in-situ (TUNEL).
O protocolo de treinamento melhorou a condição física dos animais
treinados, evidenciado pelo maior consumo máximo de oxigênio e menor
ganho de peso ao final do treinamento.
7. Referências Bibliográficas
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Apêndices
Apêndices
Aprovação do comitê de ética em pesquisa da USP
Participação em congresso
1. American Urological Association (AUA) – New Orleans, USA – 2015
MP31-17
Artigo científico submetido
The Prostate
Physical activity prevents the proliferation of prostatic tissue by inhibiting the
IGF-1/Akt pathway and stimulation of angiogenesis. an experimental study
in rats.
Apêndices
Apêndices
Apêndices
Title: Physical activity prevents the proliferation of prostatic
tissue by inhibiting the IGF-1/Akt pathway and stimulation of
angiogenesis: an experimental study in rats.
Authors: Fernando Mello Froes Fonseca 1, Andre Matos de Oliveira 1, Sabrina
Thalita Reis 1, Nayara Isabel Viana 1, Edilamar Menezes Oliveira 2, Katia
Ramos Moreira Leite 1, William Carlos Nahas 1, Miguel Srougi 1, Alberto
Azoubel Antunes 1.
Affiliations:
1 - Laboratory of Medical Research – LIM 55, Urology, University of Sao Paulo
Medical School – Sao Paulo – Brazil.
2 - School of Physical Education and Sport, University of Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brazil.
Correspondence should be addressed to F.M.F.F.:
Fernando Mello Froes Fonseca Av. Dr. Arnaldo, 455, sala 2145 – Sao Paulo – Brazil CEP: 01246-903
55-61-30617183 [email protected]
Funded by: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), number 2015/02335-5
Disclosures: None
Apêndices
Background: Sedentarism and obesity have been reported as relevant risk
factors for the development of benign prostatic hyperplasia (BPH). In the
present work we investigated the role of physical activity in proliferative and
angiogenic pathways on prostate and implications for BPH prevention.
Methods: Male Wistar rats with eight weeks old were used in this experiment,
randomly divided into four groups: 1. physical activity (PA) and normal diet; 2.
PA and high fat diet; 3. sedentary (S) and normal diet; 4. S and high fat diet.
Groups 1 and 2 were submitted to a swimming training protocol for 10 weeks.
At the end of the protocol, prostate glands were dissected. We measured
prostatic gene expression levels of insulin-like growth factor 1 (IGF-1), IGF-
1/PI3K/Akt proliferative axis and genes related to angiogenesis through the
quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method, and
apoptotic index (TUNEL). Results: After 10 weeks, groups 1 and 2 had less
visceral fat when compared to the groups 3 (29,4 vs 37,96 grams; p<0,05) and
4 (31,87 vs 41,96 grams; p<0,05), respectively. When comparing normal fed
rats (group 1 vs group 3), IGF-1, IRS1 and Akt genes were less expressed in
prostate of rats submitted to PA (means 0.22, 0.04 and 0.27 respectively).
Those patterns of expressions were also shown when we compared high fat fed
rats (group 2 vs group 4), but the IGF1 downregulation was less pronounced
(p<0,001). PA increased the expression of angiogenic related genes (HIF-1α,
VEGF, VEGFR and mTOR) when comparing rats submitted to high fat diet.
Apoptotic index (number of apoptosis per 10 HPF) was higher in rats submitted
to PA (9,0 vs 2,0; group 1 vs group 3; p=0,07), (9,0 vs 1,43; group 1 vs group 4;
p<0,05). Conclusions: PA seems to inhibit IGF-1/Akt proliferative axis on
Apêndices
prostate in both normal and high fat fed rats, stimulates angiogenesis in high
fed rats, and increase prostatic apoptosis. These findings can be related to BPH
prevention.
Key words: prostatic hyperplasia; exercise; obesity; insulin resistance;
gene expression
Apêndices
Introduction
Metabolic syndrome has been associated with an increased risk of
benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) in
several observational studies (1-4). It is believed that several components of
metabolic syndrome, such as obesity and diabetes mellitus, may be responsible
for the development of BPH, such as changes in serum concentrations of
estradiol and testosterone, the induction of cell proliferation by insulin and
insulin-like growth factor (IGF-1) in the prostatic tissue through specific
receptors, and the release of pro-inflammatory substances in the prostatic
tissue stimulated by obesity, such as ox-LDL and adiponectin (5-7). The action
of IGF-1 is particularly important for prostate growth and development, and
changes in the IGF-1 signaling pathway have been described in prostatic
stromal cell lines derived from patients with BPH (8).
In this context, the prevention of metabolic syndrome through lifestyle
changes such as physical activity may have a beneficial effect on the symptoms
and progression of BPH. Several clinical studies have pointed to an association
between high levels of physical activity and a lower risk of BPH/LUTS (9,10).
Despite consistent clinical evidence, no randomized clinical study has evaluated
the role of physical activity in the development of BPH/LUTS. Moreover, the
biological mechanisms through which physical activity may influence the
development of BPH/LUTS are unknown. Therefore, it is of utmost importance
to evaluate how physical activity influences the molecular pathways of prostatic
proliferation, such as the IGF-1/Akt proliferative pathway and angiogenesis
pathways, in addition to their influence in the process of apoptosis.
Apêndices
Materials and methods
Male 8-week-old Wistar rats (200-220 g) were used in the experiment.
The rats were randomized into 4 groups and allocated to cages with 3 to 5
animals each. In groups 1 and 2 the animals were subjected to a 12-week
program of physical activity through an aquatic training protocol previously
described in the literature (11), and in groups 3 and 4, the animals were
subjected to a sedentary routine, remaining in cages for the entire study, but
moving freely.
This swimming protocol was previously described as having mild to
moderate intensity and long duration with the aim of increasing muscular
oxidative capacity. In groups 1 and 3, the animals were fed a standard AIN-93
diet consisting of 62% starch, 14% proteins, 10% sucrose, 4% soy oil, and
vitamins and minerals at standard dosing for 12 weeks. In groups 2 and 4, the
animals were fed a high-fat diet consisting of 36% starch, 14% proteins, 30% fat
(pork lard), 10% sucrose, 4% soy oil, in addition to vitamins and minerals at
standard dosing for the same 12-week period.
At the end of the physical activity protocol, the rats were anesthetized
with 1.2 g/kg of urethane through intraperitoneal injection, blood samples were
collected, and the animals were sacrificed, with subsequent excision of the
prostate, bladder, and epididymal and retroperitoneal fat. The ventral prostatic
lobes were separated and preserved for the analysis of apoptosis using
terminal dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay, and molecular analysis (gene
expression) of IGF-1, IGF-1 receptor (IGF-1R), insulin receptor substrate
Apêndices
(IRS1), phosphoinositide 3-kinase (PI3K), protein kinase B (Akt) and mitogen-
activated protein kinase (MAPK), for the analysis of the IGF-1/Akt proliferative
pathway, and angiogenesis-related factors, including vascular endothelial
growth factor (VEGF), VEGF receptors (VEGFR1, VEGFR2), hypoxia-inducible
factor 1 (HIF-1α) and the mammalian target of rapamycin protein (mTOR).
The TUNEL assay was performed in the cells of the ventral portion of the
prostate of rats from the four groups, through labeling with the TdT-FragEL™
DNA Fragmentation Detection Kit (Cat. Nº QIA33-1EA), and quantified for
every 10 high-power fields (HPFs). The slides with prostatic tissue were
deparaffinized and rehydrated with xylene and ethanol, permeabilized,
subjected to endogenous peroxidase inactivation, and labeled with the TdT
Reaction Mixture. The labeled cells were counted.
Gene expression was evaluated through RNA extraction from prostatic
tissue, cDNA synthesis from the RNA, and subsequent analysis of the cDNA
using reverse transcription followed by quantitative real-time polymerase chain
reaction (qRT-PCR) (ABI7500 platform) using the TaqMan® protocol (Applied
Biosystems, Foster City, CA). Initial experiments of absolute quantification with
the ß2 microglobulin (B2M) control gene validated the cDNA before the
experiments for quantification of the gene of interest. For the relative
quantification of the genes under study, we normalized their expression relative
to the expression of the control gene B2M. As the control group, we studied the
prostatic tissue samples from the sedentary rats. To calculate the relative
expression of the target genes, we employed the ∆∆CT method, which uses the
following formula: ∆∆CT = (CT of the target gene, active rat prostate sample –
CT of endogenous control, active rat sample) – (CT of the target gene,
Apêndices
sedentary rat sample – CT of the endogenous control, sedentary rat sample).
The number of times when change in gene expression occurred was calculated
as 2 -∆∆CT. The primers used for quantification of the genes selected for the
study are listed in Table 1.
For statistical analysis, Student's t-test was used for univariate analysis
and ANOVA for multivariate analysis, using SPSS 19.0 software. A significance
level of 5% was adopted for all statistical analyses (p<0.05).
Results
The rats engaging in physical activity gained less weight than the
sedentary animals, and the active rats had less abdominal fat (epididymal and
retroperitoneal). Physical activity reduced the prostate weight in rats fed a
standard diet (group 1 vs group 3: 1.11 vs 1.38 g; p<0.05) but did not have an
effect on rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4: 1.17 vs 1.08 g; p>0.05).
Serum insulin and the homeostasis model assessment (HOMA) index were
lower for the active rats after the 12 weeks of the study but without statistical
significance (group 1 vs group 3; group 2 vs group 4). Triglycerides were
reduced by physical activity, especially in rats fed a standard diet (group 1 vs
group 3: 71.43 vs 111.32; p<0.001). Serum dihydrotestosterone (DHT) was
reduced with physical activity when we compare the rats fed the standard diet
(group 1 vs group 3), and serum IGF-1 increased with physical activity when we
compared the rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4). The morphological
data and serum concentrations are summarized in Tables 2 and 3.
Apêndices
When we compared to the animals fed a standard diet (group 1 vs group
3; Figure 1), the gene expression of IGF-1, IRS1 and Akt was lower in the
prostate of rats engaging in physical activity (ratios of 0.22, 0.04, and 0.27,
respectively), with a homogeneous pattern of expression. These patterns of
gene expression triggered by physical activity were also observed when we
compared to rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4; Figure 2), but the
downregulation of IGF-1 was less pronounced (p<0.001). The gene expression
of PI3K and MAPK3 was not influenced by physical activity either in rats fed a
standard diet or in rats fed a high-fat diet.
Physical activity was associated with heterogeneous overexpression of
HIF-1α, VEGF receptors and mTOR, in addition to a small heterogeneous
underexpression of VEGF, when we compared rats fed a standard diet (group 1
vs group 3; Figure 1). When we compared rats fed a high-fat diet (group 2 vs
group 4; Figure 2), physical activity increased the gene expression of HIF-1α,
VEGF, VEGF receptors, and mTOR in a homogeneous manner.
The number of apoptotic cells for each 10 HPFs identified in the in situ
hybridization method (TUNEL) was higher in the prostate of rats engaging in
physical activity, either when comparing rats fed a standard diet (group 1 vs
group 3: 9.0 vs 2.0; p=0.07), showing a marginal difference, or between the
extreme groups (group 1 vs group 4: 9.0 vs 1.43; p<0.05) (Figure 3). Although
the number of apoptotic cells was also numerically higher among animals in
group 2 (PA + HFD) compared with groups 3 and 4, we did not observe
statistical significance.
Apêndices
Discussion The main signaling pathways activated by the binding of IGF-1 to IGF-1R
in the prostate and other types of cells are the MAPK cascade and the PI3K/Akt
cascade (12). The activated IGF-1R is connected to the MAPK pathway through
IRS1 adapter proteins that activate kinases ERK1 and ERK2 of the MAPK
family, with subsequent phosphorylation and activation of transcription factors,
resulting in differentiation and proliferation cell responses (13). IRS1 can also
couple its active receptor with PI3K, with subsequent Akt recruitment. The
cascade effects of activation of the PI3K/Akt pathway include protection against
apoptosis and an increase in cell proliferation (14).
In this study, physical activity suppressed the gene expression of
endogenous IGF-1, IRS1, and Akt in a uniform manner, without suppression of
the PI3K gene, suggesting inhibition of the PI3K/Akt proliferative pathway, as
Akt activation represents one of the final phases of the proliferation cascade
and depends on PI3K activation. Suppression of this pathway was not
associated with a reduction in serum IGF-1, suggesting that suppression of the
IRS1/PI3K/Akt signaling pathway was triggered by a decrease in the paracrine
action of IGF-1 produced in the prostatic stroma, and not through an endocrine
mechanism acting directly in the epithelium. The decreases in serum insulin and
peripheral insulin resistance caused by physical activity may also partially
explain the suppression of this pathway since insulin receptors present in the
epithelium of the prostate can also stimulate this proliferative pathway to a
lesser extent than the stimulation triggered by IGF-1.
Apêndices
Physical activity was associated with overexpression of genes for
hypoxia (HIF1-α) and angiogenesis (VEGF, VEGF receptors and mTOR) in
rats fed a high-fat diet. This difference was not observed when we compared
rats fed a standard diet, in which we observed a heterogeneous expression
pattern for VEGF and HIF-1α. To the best of our knowledge, this is the first
study that evaluated the effects of physical activity on the hypoxia and
angiogenesis process in non-tumoral prostatic tissue. Metabolic syndrome
damages the microvascular function and decreases the capillary density of
several organs, and prior studies indicated a reduction in prostatic blood flow
and increase in vascular resistance in patients with BPH compared with
healthy individuals. Moreover, patients with vascular disease present a greater
reduction in prostatic flow and increased severity of BPH-related symptoms
compared with patients without vascular disease (15). Recently, Machado et
al. showed that physical activity can restore the microvascular function of
organs in rats with metabolic syndrome, such as skeletal muscle and skin (16),
a fact that may indicate that this process also occurs in prostatic tissue.
The increased expression of angiogenesis factors in the prostate does
not necessarily induce proliferation of the prostatic tissue when these factors
are stimulated by physical activity. A study evaluating the effects of physical
activity on a murine model of prostate cancer (C57BL/6) showed that physical
activity stimulated the MEK/MAPK and mTOR signaling pathways, with
subsequent elevation of the intratumoral HIF-1α and VEGF, in addition to a
reduction in Akt, similar to our findings. These findings were associated with
hypervascularization and improved tumoral perfusion. However, the rats
engaging in physical activity maintained the same tumoral volume as the
Apêndices
control rats, in addition to a lower rate of lymph node involvement (36%) and
distant metastases (34%) in the active rats (17). The seemingly paradoxical
findings in that study have still not been clarified, but they may indicate an
important difference in the way HIF-1α is activated in different situations.
Under normal conditions, solid tumors generally have an aberrant
vascularization that impairs oxygen supply and the elimination of metabolites
from glycolysis, causing tissue hypoxia and subsequent HIF-1α activation.
This process stimulates angiogenesis cascades through VEGF stimulation in
an effort to maintain the intratumoral oxygen supply. Paradoxically, this
process causes pathological nonproductive angiogenesis, with the formation
of aberrant vessels and a reduction in oxygenation and perfusion, creating a
vicious cycle of hypoxia, consequent tumoral invasion, and metastasis (18). In
the study by Jones et al., HIF-1α stimulation induced by physical activity was
associated with a reverse outcome: improved tumoral perfusion and
vascularization, indicating a productive and physiological angiogenesis
process that is not associated with the induction of pathological tissue hypoxia,
as previously described at rest, and it may partially explain the lower rate of
tumoral progression and lower index of metastases.
Likewise, local tissue hypoxia may also play an important role in BHP
progression induced by oxidative stress, a finding that is relevant in patients
with metabolic syndrome, leading to the differentiation of fibroblasts into
myofibroblasts and neovascularization. In response to hypoxia, the prostatic
stromal cells may stimulate the production of several inflammatory and
proliferative factors, such as VEGF, FGF-2, FGF-7, and IL-8 (19) (20).
Therefore, a productive and physiological angiogenesis process triggered by
Apêndices
physical activity could also prevent pathological tissue hypoxia in a hyperplastic
tissue through a mechanism similar to that found in neoplastic tissue.
Physical activity seems to stimulate the process of cell apoptosis in the
prostate, a finding that may be partially explained by the inhibition of the
PI3K/Akt pathway, as this pathway may act in the metabolism of the Bcl-2
protein (21). The DNA fragmentation identified in the TUNEL assay represents
a late stage of the apoptosis process, making it necessary to understand how
physical activity acts on the intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis in the
prostate.
Conclusions
Physical activity inhibited the gene expression of the IGF-1/AKT
proliferative axis in the prostate in rats fed a normal diet and those fed a high-fat
diet, and it stimulated hypoxia and angiogenesis genes in rats fed a high-fat
diet. These findings may help explain how lifestyle changes may prevent BPH.
Apêndices
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Apêndices
Legends
Figure 1 - Gene expression in rats fed a standard diet (group 1 vs group 3). Baseline: mean gene expression in group 3 rats.
Figure 2 - Gene expression in rats fed a high-fat diet (group 2 vs group 4). Baseline: mean gene expression in group 4 rats.
Figure 3 - Number of apoptotic cells per 10 high-power fields (HPF).
Apêndices
TABLE 1 Primers used for the quantification of the genes selected for the study
Primer Assay Primer Assay
IGF-1 Rn00710306_m1 HIF-1α Rn00577560_m1
IGF-1R Rn00583837_m1 VEGF Rn01511601_m1
IRS1 Rn02132493_s1 VEGFR1 Rn00570815_m1
Akt Rn00690900_m1 VEGFR2 Rn00564986_m1
PI3K Rn00564547_m1 mTOR Rn00693900_m1
MAPK3 Rn00820922_g1 B2M Rn560865_m1
Apêndices
TABLE 2 Morphometric data (results expressed as the mean)
Group 1 (PA + SD) (n=07)
Group 2 (PA + HFD) (n=07)
Group 3 (SED + SD) (n=07)
Group 4 (SED + HFD) (n=07)
Body Weight (g)
Inicial
Week 12
312,43
526,31
321,90
531,74
337,33
598,96
354,04
611,61
Weight gain (g) 213,89
§ £ 209,84
# ‡ 261,63 257,57
Epididymal fat (g) 14,06 § £
15,26 # ‡
19,74 20,38 Retroperitoneal fat (g) 15,35
£ 16,62 18,23 21,58
Prostate weight (g) 1,11 § 1,17 1,38
† 1,08
Bladder weight (g) 0,19 * £ 0,14
# 0,18
† 0,13
PA: physical activity; SED: sedentary; SD: standard diet; HFD: high-fat diet. * p< 0.05 group 1 vs 2; § p < 0.05 group 1 vs 3; £ p <0.05 group 1 vs 4 ; # p < 0.05 group 2 vs 3; ‡ p <0.05 group 2 vs 4; † p <0.05 group 3 vs 4.
Apêndices
TABLE 3 Blood pressure (BP) data and serum analysis (results expressed as the mean ± standard deviation).
Group 1 (PA + SD)
(n=07) Group 2 (PA + HFD)
(n=07) Group 3 (SED + SD)
(n=07) Group 4 (SED + HFD)
(n=07)
Systolic BP (mmHg) 115,44 113,40 110,38 117,57
Glycemia (mg/dL) 106,86 * £ 123,33
# 104,86
† 129,29
Insulin 4,15 £ 4,87 5,15 6,05
HOMA index 1,10 £ 1,49 1,33
† 1,96
Cholesterol 63,50 * § 54,95
# 71,74
† 61,34
LDL 2,69 2,75 4,39 2,73
HDL 46,53 38,58 45,08 45,19
Triglycerides 71,43 § 68,08
# 111,32
† 67,11
Testosterone 0,89 0,77 0,79 0,95
DHT 0,12 § 0,15 0,21
† 0,13
IGF-1 2,11 2,48 ‡ 2,65
† 1,40
PA: physical activity; SED: sedentary; SD: standard diet; HFD: high-fat diet. * p< 0.05 group 1 vs 2; § p < 0.05 group 1 vs 3; £ p <0.05 group 1 vs 4 ; # p < 0.05 group 2 vs 3; ‡ p <0.05 group 2 vs 4; † p <0.05 group 3 vs 4.
Apêndices
Apêndices
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