fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ doktora tezİye’den halofİk...

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

TÜRKİYE’DEN HALOFİLİK ARKEBAKTERİLERİN İZOLASYONU VE

KARAKTERİZASYONU

Birgül ÖZCAN

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ANKARA

2004

Her hakkı saklıdır

Prof Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ danışmanlığında, Birgül ÖZCAN tarafından hazırlanan bu

çalışma 29/06/2004 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Biyoloji Anabilim Dalı’nda

doktora tezi olarak kabul edilmiştir.

Başkan :Prof. Dr. Şevki YAZGAN

Üye :Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ

Üye :Prof. Dr. Gülay ÖZCENGİZ

Üye :Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK

Üye :Prof. Dr. Yavuz BEYATLI

Yukarıdaki sonucu onaylarım

Prof. Dr. Metin OLGUN

Enstitü Müdürü

İÇİNDEKİLER

ÖZET............................................................................................................................ i

ABSTRACT................................................................................................................. ii

TEŞEKKÜR................................................................................................................. iii

SİMGELER DİZİNİ.................................................................................................... vi

ŞEKİLLER DİZİNİ..................................................................................................... vii

ÇİZELGELER DİZİNİ................................................................................................ x

1. GİRİŞ............................................................................................................... 1

2. KAYNAK ÖZETLERİ................................................................................... 3

2.1. Mikrobiyal Filogenetik.................................................................................. 3

2.2. Halofilik Arkelerin Taksonomisi ve Teşhisi................................................. 7

2.2.1. Halobacteriales ordosunun özellikleri...................................................... 10

2.3. Halofilik Arkelerin Habitatları ve Ekolojisi................................................. 12

2.4. Halofilik Arkelerde Ozmotik Adaptasyon.................................................... 19

2.5. Halofilik Arkelerin Yapısal, Genetik ve Fizyolojik Özellikleri................... 20

2.5.1. Polar ve nötral lipitler................................................................................ 20

2.5.2. Karotenoid ve retinal pigmentler............................................................... 22

2.5.3. Diğer yapısal özellikleri............................................................................. 23

2.5.4. Genetik yapıları......................................................................................... 23

2.5.5. Fizyolojileri............................................................................................... 24

2.6. Halofilik Arkelerin Antimikrobiyal Maddelere Duyarlılıkları..................... 25

2.7. Halofilik Arkelerin Uygulama Alanları........................................................ 25

3. MATERYAL VE YÖNTEM........................................................................ 28

3.1. Materyal........................................................................................................ 28

3.1.1. Halofilik arkeler......................................................................................... 28

3.1.2 Besiyeri ...................................................................................................... 28

3.1.3. Mikroskobik inceleme............................................................................... 29

3.1.4. Antibiyotikler............................................................................................. 29

3.1.5. İnce tabaka kromatografisi........................................................................ 29

3.1.6. Elektroforez............................................................................................... 29

3.2. Yöntem......................................................................................................... 30

iv

3.2.1. Halofilik arkelerin izolasyonu ve kültürü.................................................. 30

3.2.2. Koloni morfolojisi ve pigmentasyon......................................................... 30

3.2.3. Gram boyama ve faz-kontrast mikroskobu............................................... 31

3.2.4. Biyokimyasal testler.................................................................................. 31

3.2.5. Antibiyogram testi..................................................................................... 33

3.2.6. İnce tabaka kromatografisi........................................................................ 33

3.2.7. Protein ekstraksiyonu................................................................................ 33

3.2.7.1. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)..... 34

3.2.7.2. Proteinlerin moleküler kütlelerinin belirlenmesi.................................... 34

3.2.7.3. Benzerlik matriksi ve protein ilişkisine göre benzerlik dendogramı...... 34

3.2.8. Plazmid izolasyonu.................................................................................... 35

3.2.8.1. Agaroz Jel elektroforezi.......................................................................... 36

3.2.8.2. Plazmid büyüklüklerinin saptanması...................................................... 36

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA.......................................... 38

4.1. Halofilik Arke İzolatları............................................................................... 38

4.2. Halofilik Arke İzolatlarının Gram Reaksiyonu, Hareket ve Morfolojik

Özellikleri..................................................................................................... 39

4.3. Halofilik arke İzolatlarının Antibiyotik Duyarlılıkları................................. 56

4.4. Halofilik Arke İzolatlarının Hücre zarı Eter-Lipit Analizleri....................... 62

4.5. Halofilik Arke İzolatlarının Biyokimyasal Özellikleri................................. 69

4.6. Halofilik Arke İzolatalarının Plazmid İçerikleri........................................... 75

4.7. Halofilik Arke İzolatlarının Protein profilleri ve Benzerlik Dendogramı.... 89

KAYNAKLAR.......................................................................................................... 105

EKLER...................................................................................................................... 123

EK 1.................................................................................................................... 124

EK 2.................................................................................................................... 126

ÖZGEÇMİŞ............................................................................................................... 128

v

SİMGELER DİZİNİ

APS Amonyum Persülfat

cccDNA Kovalent bağlı dairesel deoksiribonükleik asit

dk Dakika

DNA Deoksiribonükleik Asit

EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit

FeSO4.H2O Demir sülfat

g Gram

H2O2 Hidrojen peroksit

kb Kilobaz

kDa Kilodalton

KNO3 Potasyum nitrat

L Litre

mA Miliamper

MDa Megadalton

Me-PGP Fosfatidilgliserol Fosfat-Metilester

mg Miligram

MgSO4.7H2O Magnezyum sülfat

mL Mililitre

M Molar

Na2S2O3.5H2O Sodyum tiyosülfat

RNA Ribonükleik Asit

rpm Dakikadaki dönüş sayısı

SDS Sodyum Dodesil Sülfat

SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi

SG Sehgal-Gibbons Besiyeri

TEMED Tetrametil Etilen Diamin

V Volt

µg Mikrogram

µL Mikrolitre

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1. Ribozomal küçük alt birimde bulunan 16S ve 18S rRNA dizilerine göre

oluşturulmuş filogenetik ............................................................................. 5

Şekil2.2. Halobacteriaceae familyasının 16S rRNA dizi analizlerine göre

oluşturulan filogenetik ağacı........................................................................ 8

Şekil 2.3. Halofilik arkelerde bulunan temel lipitleri................................................. 21

Şekil 4.1. %25 NaCl içeren SG agar besiyerinde 37 °C’de 7 gün geliştirilen A317

izolatı ve Haloferax mediterranei standart suşunun koloni morfolojisi..... 45

Şekil 4.2. %25 NaCl içeren SG agar besiyerinde 37 °C’de 7 gün geliştirilen A128

izolatı ve Haloferax volcanii standart suşunun koloni morfolojisi............. 46

Şekil 4.3. %25 NaCl içeren SG sıvı besiyerinde 37 °C’de 7 gün geliştirilen

halofilik arke izolatları ve standart suşun üremesi..................................... 47

Şekil 4.4. SG sıvı besiyerinde 37 °C’de 120 devir/dk.’da 6 gün geliştirilen

Halobacterium salinarum ve Natrialba asiatica standart suş hücrelerinin

faz-kontrast mikroskobik görünümleri ....................................................... 49


Haloferax volcanii ve Haloferax mediterranei standart suş hücrelerinin

faz-kontrast mikroskobik görünümleri....................................................... 50


Haloarcula vallismortis DSM 3756 ve Haloarcula marismortui

standart suş hücrelerinin Faz-kontrast mikroskobik görünümleri............... 51

Şekil 4.7. SG sıvı besiyerinde 37 °C’de 120 devir/dk.’da 6 gün geliştirilen Halococcus

morrhuae CCM 537 standart suşu ve E133 numaralı izolat hücrelerinin

faz-kontrast mikroskobik görünümleri....................................................... 52

Şekil 4.8. SG sıvı besiyerinde 37 °C’de 120 devir/dk.’da 6 gün geliştirilen E22

ve A29 numaralı izolat hücrelerinin faz-kontrast mikroskobik

görünümleri................................................................................................ 53

Şekil 4.9. SG sıvı besiyerinde 37 °C’de 120 devir/dk.’da 6 gün geliştirilen D107

ve A317 numaralı izolat hücrelerinin faz-kontrast mikroskobik

görünümleri................................................................................................ 54

vii

Şekil 4.10. SG sıvı besiyerinde 37 °C’de 120 devir/dk.’da 6 gün geliştirilen A347

ve B44A numaralı izolat hücrelerinin faz-kontrast mikroskobik

görünümleri.............................................................................................. 55

Şekil 4.11. SG agar besiyerinde 37°C’de 14 gün geliştirilen Haloferax

mediterranei ve A440 numaralı halofilik arke izolatının antibiyotik

duyarlılığı................................................................................................... 58

Şekil 4.12. SG agar besiyerinde 37°C’de 14 gün geliştirilen F89 ve A128 numaralı

halofilik arke izolatlarının antibiyotik duyarlılığı.................................... 59

Şekil 4.13. Halofilik arke izolat ve standart suşlarına ait hücre metanolizatlarının

ince tabaka kromatogramı ....................................................................... 63





Şekil 4.16. Halofilik arke izolatlarına ait hücre metanolizatlarının ince tabaka

kromatogramı............................................................................................ 66


kromatogramı........................................................................................... 67


Kromatogramı........................................................................................... 68

Şekil 4.19. Halofilik arke izolatları ve standart suşların plazmid içerikleri............... 76

Şekil 4.20. Halofilik arke izolatlarının plazmid profilleri.......................................... 77







Şekil 4.27. Halofilik arke izolat ve standart suşlarının SDS-PAGE protein

profillerine göre oluşturulan benzerlik dendogramı................................. 90

Şekil 4.28. Halofilik arke izolatlarının SDS-PAGE protein profilleri........................ 91


viii




Şekil 4.33. Halofilik arke izolat ve standart suşlarının SDS-PAGE protein

profilleri................................................................................................... 96


ix

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1. Bakteri, Arke ve Ökaryotlar arasındaki bazı temel farklılıklar............... 4

Çizelge 2.2. Halobacteriales ordosuna ait cinsler ve türler...................................... 11

Çizelge 2.3. Halobacterium, Halobaculum, Halogeometricum, Halococcus ve

Halorhabdus cinslerine ait türlerin özellikleri ....................................... 13

Çizelge 2.4. Halorubrum cinsine ait türlerin özellikleri ........................................... 14

Çizelge 2.5. Halorubrum, Haloarcula ve Halomicrobium cinsine ait türlerin

özellikleri ............................................................................................... 15

Çizelge 2.6. Haloferax ve Halosimplex cinslerine ait türlerin özellikleri................ 16

Çizelge 2.7. Halobioforma, Natronococcus, Natrinema ve Natronorubrum

cinslerine ait türlerin özellikleri ........................................................... 17

Çizelge 2.8. Natrialba, Haloterrigena, Natronomonas ve Natronobacterium cinslerine

cinslerine ait türlerin özellikleri............................................................. 18

Çizelge 4.1. Halofilik Arke izolatlarının bölge ve örneğe göre dağılımı................... 39

Çizelge 4.2. Halofilik arke izolatlarının Gram reaksiyonu, koloni morfolojisi,

pigmentasyon, hücre morfolojisi ve hareket testi sonuçları................... 40

Çizelge 4.3. Halofilik arke izolatlarının Gram reaksiyonu, mukoid koloni özelliği,

hareket ve hücre şekillerinin genel sayısal sonuçları............................. 43

Çizelge 4.4. Halofilik arkebakteri izolat ve standart suşlarının genel antibiyotik

duyarlılıkları........................................................................................... 56

Çizelge 4.5. Halofilik arke izolatlarının biyokimyasal özellikleri.............................. 70

Çizelge 4.6. Halofilik arke izolatlarının sayısal biyokimyasal (+) test sonuçları....... 73

Çizelge 4.7. Halofilik arkebakteri izolat ve suşlarının plazmid içerikleri.................. 84

Çizelge 4.8. Halofilik arke izolat ve standart suşlarının SDS-PAGE protein göre

profillerine oluşturulan benzerlik matriksi............................................. 89

x

ÖZET

Doktora Tezi

TÜRKİYE’DEN HALOFİLİK ARKEBAKTERİLERİN İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU

Birgül ÖZCAN

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ

Tuz gölü (Ankara), Acı göl (Denizli), Salda gölü (Burdur), Seyfe gölü (Kırşehir), Tuzla gölü (Kayseri) ve Bolluk gölü (Konya) olmak üzere Türkiye’nin altı farklı tuzlu bölgesinden toplanan toprak, su ve tuz kütlesi örneklerinden %25 (w/v) NaCl içeren kompleks besi yeri kullanılarak 95 adet halofilik arke izole edilmiştir. Antibiyotik duyarlılığı ve zar-eter lipit analizleri ile arke olarak tanımlanan izolatlar, hareket, pigmentasyon, Gram reaksiyonları, koloni ve hücre morfolojisi, biyokimyasal testler, elektroforetik protein profilleri ve plazmid içerikleri yönünden incelenmiştir. Buna göre izolatların %83.2’sinin hareketli, %96.8’inin Gram (-), %62’sinin çubuk ve %19’unun pleomorfik hücre morfolojisine sahip olduğu görülmüştür. İzolatların, genelde yuvarlak, düz kenarlı, konveks koloni morfolojisine sahip oldukları ve açık pembeden kırmızıya kadar değişen renk tonlarında pigmentasyon gösterdikleri bulunmuştur. Çeşitli biyokimyasal testler sonucunda halofilik arke izolatlarının tümünün katalaz ve oksidaz aktivitesine ve sadece 2 izolatın L-arjininde anaerobik üreme yeteneğine sahip oldukları tespit edilmiştir. Bunların dışındaki biyokimyasal testlerde %85.3-2.1 aralığında pozitif sonuçlar elde edilmiştir. Antibiyotik duyarlılık testi sonucuna göre tüm izolatların bazitrasin, novobiyosin ve rifampisin’e duyarlı oldukları saptanmıştır. İzolatlardan 60’nın 1-6 arasında değişen sayıda ve 1.0-36.9 kb arasında değişen farklı moleküler büyüklüklerde plazmid içerdikleri belirlenmiştir. Ayrıca izolatların tüm hücre protein profilleri SDS-PAGE ile çıkarılarak MVSP analiz programı ve UPGMA metodu kullanılarak karşılaştırılmış, benzerlik dendogramı çıkarılmıştır. Buna göre izolatlar 8 gruba ayrılmış, 10 adet izolatın standart suşlarla birlikte tek bir grup içinde toplandıkları ve bu grup içerisinde 4 izolatın diğerleri farklı gruplar oluşturduğu halde standart suşlara benzerlik oranlarının yüksek olduğu görülmüştür. 2004, 128 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Halofilik arkebakteriler, izolasyon, karakterizasyon, plazmid, SDS-PAGE, Türkiye

i

ABSTRACT

Ph. D. Thesis

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF HALOPHILIC ARCHAEBACTERIA FROM TURKEY

Birgül ÖZCAN

Ankara Universty

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology

Supervisor: Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ

Ninetyfive halophilic archaeal isolates were obtained from saline soil, brine and halit samples collected from six distinct regions of Turkey by using complex medium containing 25% NaCl (w/v). The isolates identified as archae by antibiotic suscebtibility and membrane ether-lipid analysis, were tested for motility, Gram reaction, pigmentation, cell and colony morphology, biochemical reactions, electrophoretic protein profiles and plasmid contents. The results indicated that 83,2% of the isolates were motile, 96.8% were Gram (-), 62% were rod shaped and 19% were in pleomorphic cell morphology. The most of the isolates had circular, entire and convex shaped colony morphology and their pigmentation were observed from light pink to red color. As a result of biochemical tests all halophilic archaea isolates were determined to be catalase and oxidase-positive, and only 2 isolates had anaerobic growth ability on L-argine. To other biochemical tests, the positive reactions were observed in 2.1-85.3% range. According to the antibiotic susceptibility tests, all isolates were susceptible to bacitracin, novobiocine and rifampicine. It was established that the 60 halophilic archaeal isolates contained plasmids varied in the numbers from 1 to 6 and in different molecular sizes ranged from 1 to 36.9 kb. On the other hand, whole-cell protein profiles of all isolates were obtained by SDS-PAGE, and the similarity dendograme was constructed from protein profiles by means of UPGMA method using MVSP analyses programme. Standard strains were clustured in 8 groups, and ten of our isolates were placed in the same group with standard strains while others formed distinct groups.

2004, 128 pages Key Words: Halofilik archaebacteria, isolation, characterization, plasmids, SDS- PAGE, Turkey

ii

TEŞEKKÜR

Bana bu konuda çalışma imkanı sunan ve çalışmalarım aşamasında önerileri ile beni

yönledirip destek olan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Cumhur ÇÖKMÜŞ’e;

Çalışmalarım sırasında değerli düşünce ve önerilerinden yararlandığım Tez izleme

komitesi üyeleri Sayın Prof. Dr. Gülay Özcengiz’e (Ortadoğu Teknik Üniversitesi Fen-

Edebiyat Fakültesi) ve Sayın Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK’e (Ankara Ünivesitesi Fen

Fakültesi);

Her konuda yanımda bulunarak, destek ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Doç. Dr.

Mahmut Çalışkan’a (Mustafa Kemal Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi);

Bana standart suşlar ve kaynak sağlayarak yardımcı olan ve bilgilerinden faydalandığım

Sayın Prof. Dr. Aharon OREN’e (Hebrew Universty Jerusalem İsrail);

Yardım ve desteğinden dolayı laboratuvar arkadaşım sayın Arş. Gör. Arzu ÇÖLERİ’e;

Laboratuvarında çalışma olanağı sağlayarak yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Ongun

ONARAN’a (Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi), verilerin analizi aşamasında

yardımlarını gördüğüm Sayın Yrd. Doç. Dr. İrfan KANDEMİR (Karaelmas Üniversitesi

Fen-Edebiyat Fakültesi) ve Yrd. Doç. Dr. Volkan Çevik’e (Mustafa Kemal Üniversitesi

Fen-Edebiyat Fakültesi);

Bana herkonuda destek olan ve hiçbir konuda fedakarlıklarını esirgemeyen annem,

babam ve kardeşlerime;

En içten saygı ve teşekkürlerimi sunarım.

Birgül ÖZCAN

Ankara, Haziran 2004

iii

1. GİRİŞ

Bindokuyüzotuzlu yıllarda Edward Chatton, tüm canlıları evrimsel gelişmişlik

düzeyleri, benzerlikleri ve hücre morfolojileri yönünden prokayot ve ökaryot olmak

üzere iki gruba ayırmıştır. İlerleyen zaman içerisinde ribozomal RNA dizi analizlerini

kapsayan moleküler tekniklerin de kullanılmaya başlanması ile hücresel yaşamın üç ayrı

dalda evrimleştiği kabul edilmiş ve yaşamın üçüncü formu olan Arkebakteriler (arkeler)

1970’lerin sonunda tanımlanmıştır. Böylece canlılar prokaryotik olan Bakteri ve

Arkelerle Ökaryotlar olmak üzere 3 domaine ayrılmıştır.

Tuz, günlük yaşamımızda önemli bir madde olup daha çok yemeklerde kullanılmasının

yanısıra, yiyeceklerin ve deri, et gibi ürünlerin saklanması ve korunması için de

kullanılagelmiştir. Tuzlanmış, fakat renkleri kırmızıya dönerek bozulan balık ve

derilerde, organizmaların rolü ve bu zararların önlenmesi için çıkış yollarının bulunması

amacıyla yüksek tuzlulukta yaşayan organizmalara karşı ilk bilimsel merak ortaya

çıkmıştır. Buna dönük araştırmalarda ekstrem halofilik mikroorganizmaların sorumlu

oldukları gösterilmiştir. Daha sonra bu mikroorganizmalar Arke domainine bağlı

Euryarchaeota filumuna ait Halobacteriales ordosu içerisinde toplanmıştır.

Yüksek tuzlu ortamlardan izole edilen halofilik arkebakteri (halofilik arke) izolatlarının

Halobacteriales ordosuna dahil edilebilmesi için kültürel, morfolojik, fizyolojik ve

besinsel özellikleri, antibiyotiklere duyarlılıkları, hücre zarı lipitleri, 16S rRNA dizi

analizleri, %G+C oranları, protein profilleri gibi testlerin yapılması gerekmektedir.

Canlılıkları için minimum 1.5 M NaCl’e gereksinim duyan ve tuzlalar, yüksek tuzlu

topraklar, deniz ve tuz gölleri gibi doğal ortamların yanısıra tuzlanmış ürünlerden de

izole edilebilen halofilik arkeler; çubuktan üçgene, kareye kadar değişen hücre

morfolojilerine ve katalaz ve oksidaz aktivitelerine sahip, aerobik, Gram (-),

kemoorganotrofik karakterdedirler. Ayrıca bu organizmalar, dış proton pompası olan

bakteriodopsin ve iç klor pompası olan halorodopsin pigmentlerini içermeleriyle de

diğer canlılardan farklılık gösterirler.

1

Halobacteriales ordosunun ekstrem halofilik arkeleri organik maddelerin parçalanması

ve petrolün bioremediasyonu dahil olmak üzere elektronik, gıda, tıp ve birçok

biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalarda biyoteknolojik potansiyele ve uygulamalara

sahiptirler.

Günümüzde dünyanın değişik tuzlu bölgelerinden izole edilen halofilik arke

izolatlarının tanımlanması halen devam etmekte ve bu izolatlar Halobacteriales ordosu

içerisinde yeni cins ve türler olarak yerlerini almaktadırlar. Ülkemizde ise, halofilik

arkelerin izolasyonu ve tanımlanmaları ile ilgili olarak çok sınırlı düzeyde çalışma

mevcuttur.

Tüm bu verilen bilgiler doğrultusunda bu çalışma ile, Türkiye’nin 6 farklı tuzlu

bölgesinden toplanan toprak ve su örneklerinden halofilik arkelerin izolasyon ve

karakterizasyonlarının yapılması amaçlanmış olup bu izolatların kültürel ve

biyokimyasal özellikleri, hücre morfolojileri, antibiyotik duyarlılıkları, arkeal lipit ve

plazmid içerikleri, elektroforetik tüm hücre protein profilleri incelenerek izolatların

standart halofilik arke suşları ve birbirleriyle olan benzerlik ve farklılıkları

belirlenmiştir.

2

2. KAYNAK ÖZETLERİ

2.1. Mikrobiyal Filogenetik

Genel anlamdaki bitki/hayvan ayırımı 1866 yılında resmi olarak Haeckel tarafından

değiştirilmiş olup her iki kategoriye yerleştirilmemiş olan ve hem hayvan hem de

bitkilerden ayrılan özelliklere sahip olan tek hücreli formlar da (protistler) ele alınarak

canlılar 3’e ayrılmıştır. Daha sonraları 1930 yılında Edward Chatton canlıları ökaryot ve

prokaryot olmak üzere 2 kategoriye ayırmış ancak önerisi rededilmiştir. İleri sürdüğü bu

ayırıma karşı çıkılma nedeni temelde prokaryot ve ökaryot kavramının sitolojik temele

dayalı olmasıydı. Daha sonra Coepland, bakterileri de ekleyerek canlıları 4 dala

ayırmıştır. 1969 yılında ise Whitakker, Bitki, Hayvan, Protist, Monera (bakteri)

gruplamasına Fungi (mantarlar) alemini de ekleyerek canlıları 5 dala ayırmıştır. Bu

sınıflama yakın zamana kadar en çok kabul gören yaşamın temel organizasyon şeması

olmuştur (Woese et al. 1990, Woese 1999).

Özellikle mikroorganizmalar açısından moleküler yapılar ve dizilerin, klasik fenotipik

özelliklere göre evrimsel ilişkileri daha iyi ortaya çıkardığı görülmüştür. Bundan dolayı

taksonların tanımlanmasında temel alınan organizmal→hücresel seviye, moleküler

düzeye (16S ve 18S rRNA dizi karşılaştırmaları) kaydırılmıştır. Moleküler

karşılaştırmalar sonucu dünyadaki yaşam, 1977 yılında Carl Woese tarafından 3 ana

gruba ayrılmıştır: Bakteriler, Ökaryotlar ve Arkeler. Bu sınıflandırmada herbir kategori

"Domain" olarak adlandırılmış olup herbir domain 2 ya da daha fazla alem

içermektedir. Arke, Bakteri ve Ökaryotlara bağlı farklı alemler bulunduğu için daha

esnek ve daha açıklayıcı olmalarından dolayı en üst hiyerarşi seviyesini adlandırmak

amacıyla en yüksek taksona Domain adının verilmesi önerilmiştir (Woese et al. 1990).

Çizelge 2.1.’de Bakteri, Arke ve Ökaryotlar arasındaki bazı karakteristik farklılıklar

özetlenmiştir (Krieg 2001, Madigan et al. 2000, Woese 1999). Şekil 2.1.’de ise ribozom

küçük alt biriminde bulunan 16 ve 18S rRNA dizilerinin karşılaştırılmasıyla

oluşturulmuş evrensel filogenetik ağaç verilmiştir (Woese 1999).

3

Çizelge 2.1. Bakteri, Arke ve Ökaryotlar arasındaki bazı temel farklılıklar ÖZELLİKLER BAKTERİLER ARKELER ÖKARYOTLARMoleküler Özellikler Halkasal kromozom yapısı + + − Plazmid bulunuşu + + Nadir Ribozom sedimentasyon sabiti 70 S 70 S 80 S1

Ribozomal RNA sedimentasyon sabitleri

16S, 23S, 5S 16S, 23S, 5S 18S, 28S, 5.85S, 5S

RNA polimeraz sayısı 1adet(4 alt birim)

Birkaç adet(Herbiri 8-12 alt birim)

3 adet(Herbiri 12-14 alt birim)

Trinskripsiyon faktörü (EF-2) gerekliliği

− + +

Promotör yapıları TATAAT (Pribnow) kutusu

(-10 ve -35 sekansları)

TATA kutusu (-38 ve -25 sekansları)

TATA kutusu (-30 ve -25 sekansları)

Metabolik Özellikler Azot fiksasyonu + + − Denitrifikasyon + + − Metan oluşturma − + − Klorofille fotosentez + − + Kemolitotrofik metabolizma + + − 80°C üzerindeki sıcaklıkta ve 1.5 M’ın üzerindeki tuz konsantras- yonlarında üreme

+ + −

Kimyasal Analizlere Dayalı Özellikler

PHB üretimi + + − Peptidoglikan bulunuşu +2 − − Sterol bulunuşu (hücre zarlarında) + − + Zar lipitleri Gliserole ester bağlı yağ

asitleriGliserole eter bağlı

ftanil zincirleri Gliserole ester bağlı yağ

asitleriSitolojik Özellikler Prokaryotik hücre yapısı + + − Histon proteinleri − +3 9+2 düzeninde flagella yapısı − − + Başlangıç amino asiti N-formilmetiyonin Metiyonin Metiyonin 5'CAP ve poli-A uzantısı − − + Mitoz − − + Antibiyotiklere Duyarlılık Β-laktam, kloramfenikol, streptomisin

+ − −

Siklohekzimit − − + 1: Mitokondri ve kloroplast hariç, 2: Protein yapıda hücre duvarına sahip Chlamydiae ve Planctomycet’ler hariç, 3:Bazı tRNA genleri intron proteinleri içermektedir

Bakteri, Arke ve Ökaryot domainlerine ait 37 farklı türün total genom dizilerinin ve

ortolog genlerin bulunma yüzdelerinin karşılaştırılmasıyla Bakteri ve Arkelerin

birbirlerinden çok fazla ayrılmadıkları saptanmıştır (Bansal ve Meyer 2002).

4

Yeşil bakterilerFlavobakteriler

Spiroketler BAKTERİLERMor bakteriler

Gram pozitif bakterilerSiyanobakterilerDeinokoklar

Termotogales

Ekstrem halofiller

Metanojenler ARKELER

Ekstrem termofiller

BitkilerFunguslar

HayvanlarrSilliatla

ÖKARYOTLAR

Cıvık mantarlarFlagellatlar

Mikrosporidialar

Şekil 2.1. Ribozomal küçük alt birimde bulunan 16S ve 18S rRNA dizilerine göre oluşturulmuş filogenetik ağaç (Woese 1999).

Arke domaini Crenarchaeota, Euryarchaeota ve Korarchaeota olmak üzere üç

filumdan oluşmaktadır. Crenarchaeota alemi içerisinde Thermoproteus, Pyrolobus ve

Pyrodictum gibi hiper termofilik cinsleri ve Euryarchaeota filumu içerisinde

Methanococcus, Methanobacterium gibi metanojenik ve Halobacterium, Haloferax gibi

ekstrem halofiller ve Thermoplasma cinsine ait termofilik arkeler yer almaktadır.

Korarchaeota filumu içerisinde ise henüz kültüre alınamayan ancak izolasyon, üretim

ortamı ve kültür şartları ve metabolik özelliklerinin benzerliklerinden dolayı

5

hipertermofilik olabilecekleri düşünülmektedir (Woese ve Wolfe 1985, Madigan et al.

2000, Wolfang ve Klenk 2001).

Ekstrem halofillerin gerçek bakteri olup olmadıkları sorusuna, 1970 lerin sonunda yeni

tanımlanmış olan Arke domainine ait Halobacterium salinarum ve ilgili diğer

halofillerin tanımı yapıldıktıktan sonra, cevap olumsuz olarak verilmiştir. Halofilik

arkelerin prokaryotik, ancak Bakteri sınıflamasına girmeyen canlılar olduğu

belirtilmiştir (Shand ve Perez 1999). Euryarchaeota filumunda sadece Halobacteriales

ordosu ve Halobacteriaceae familyası bulunmaktadır (Grant et al. 2001).

Halobacteriales, Euryarchaeota filumu içerisinde Methanomicrobiales/Methanosar-

cinales’e (metanojenlere) yakın bir dallanma göstermektedir (Oren 2001, Woese 1999)

(şekil 2.1.).

İlk halofilik arkelere ait bilgilere 5000 yıllık Çin eserlerinde rastlanılmış olup denizden

tuz elde edilmesi esnasında suyun kızardığı belirtilmiştir. Günümüzde bu sonucun

halofilik bakterilerden kaynaklandığı bilinmektedir. Halobacteriales ordosunun, kırmızı

halofilik arkeleriyle ilgili ilk çalışmaların büyük bir kısmı, tuzlanmış balık ve deriye

zarar veren etmenin anlaşılması amacıyla yapılmıştır. Bindoküzyüzondokuz yılında

Klebahn raporuna göre muhtemelen halobakterilerin ilk doğru tanımlamaları yapılmış

ve ilk bakteri Bacillus halobius ruber olarak isimlendirilmiştir. Bunu takiben 1922’de

tuzlanmış konserve morina balığı üzerindeki kırmızı lekelenmeye neden olan etken

Pseudomonas salinaria izole edilmiş, kültürü günümüzde mevcut olmayıp bu

organizmanın daha sonraları izole edilen H. salinarum’a muhtemelen çok benzediği

kabul edilmektedir. Peter, 1931 yılında tuzlamış balıklar üzerindeki halofilik arklerle

ilgili çalışmalara devam etmiştir. Tuzlanmış derilerin bakteriyel bozunumu olayı

1934’de Lochead tarafından belgelenmiştir. 1930’lu yıllarda solar tuzla ve tuz göllerinin

ilk mikrobiyolojik çalışmaları yapılmış ve bu tür ekosistemlerdeki kırmızı halofilik

bakterilerin önemi açıklanmıştır (Woese ve Wolfe 1985, Tindall 1992, Oren 2000).

6

2.2. Halofilik Arkelerin Taksonomisi ve Teşhisi

Halobacteriaceae familyasına ait cins ve türlerin teşhisi ve sınıflandırılması; hücre

morfolojisi, üreme özellikleri, spesifik polar lipitlerin analizine dayanan kemotak-

sonomik çalışmalar ve nükleik asit dizi verileri gibi özellikleri kapsayan polifazik bir

yaklaşıma göre yapılmaktadır (Oren et al. 1997, Oren 2001). Halofilik arkelerin

taksonomik sıralaması aşağıdaki gibidir (Brenner et al. 2001, Grant et al. 2001):

Domain...................... Archaea

Filum II..................... Euryarchaeota

Sınıf III ..................... Halobacteria

Ordo I........................ Halobacteriales

Familya I................... Halobacteriaceae

Son yıllarda 16S rDNA dizi karşılaştırmaları, pek çok yeni cinsin tanımlanmasına,

mevcut cinslerin bölünmesine ve hatta daha önce farklı cinslere yerleştirilen iki türün

bir cinste birleştirilmesine neden olan yeni bir sınıflandırmaya yol açmıştır (Kamekura

ve Seno 1993, Kamekura 1998). 16S rRNA nükleotid dizi karşılaştırmaları halofilik

arkelerin alkalifik üyelerinin farklı bir filogenetik grup oluşturmadığını ortaya

koymuştur. Günümüzde, halofilik arke üyelerinin filogenetik sınıflamasında önemli

olan 16S rRNA dizi analizleri, polar lipit kompozisyonunun önemini oldukça

azaltmıştır. Çünkü bazı tanımlayıcı glikolipitler birden fazla cinste bulunabilmekte ve

bazı cinslerin üyeleri farklı glikolipitler içerebilmektedirler (Kamekura ve Kates 1999).

Şekil 2.2.’de Halobacteriaceae ailesi üyelerinin 16S rRNA dizi analizlerine dayanılarak

yapılmış filogenetik ağacı görülmektedir.

Halobacteraiales ordosuna ait yeni bir taksonun tanımlanması ile ilgili minimum

standartlar Oren et al. (1997) tarafından belirtilmiştir. Buna göre;

• Koloni büyüklüğü, şekli ve pigmentasyon

• Hücre morfolojisi ve hareket

• Gram reaksiyonu

7

Her 100 bazdaki 10 nükleotid değişimi _________________________ Şekil2.2. Halobacteriaceae familyasının 16S rRNA dizi analizlerine göre oluşturulan filogenetik ağacı (nodlarda %75’in üzerindeki bootstrap ortalamaları veril- miştir) (Oren 2001).

8

• Minimum ve optimum NaCl ve MgCI2 konsantrasyonları

• Sıcaklık ve pH aralığı

• Nitrat varlığında anaerobik üreme yeteneği ve L-arjininde anaerobik üreme

• Karbohidratlardan asit üretimi

• Tek karbon kaynağında üreyebilme

• Katalaz ve oksidaz aktivitesi, indol üretimi ve nişasta, jelatin, kazein ve Tween

80 hidrolizi

• Antimikrobiyal maddelere duyarlılık

• Mevcut glikolipit tiplerini ve PGS’nin varlığını veya yokluğunu kapsayacak

şekilde polar lipit karakterizasyonu

• DNA’nın G+C içeriği

• 16S rRNA dizi

bilgisini içermektedir.

Mevcut cinslere ait yeni türlerin tanımlanması ve yakınlık derecelerinin saptanmasında

DNA-DNA hibridizasyonunun yanısıra DNA-16SrRNA hibridizasyonu çalışmaları da

kullanılmıştır (Ross ve Grant 1985, Gutierrez et al. 1989, Gutierrez et al. 1990). Diğer

yandan yakın suşların karşılaştırılmasında Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA

analizleri (RAPD) kullanılarak, suşların tanımlanmasında ortaya çıkan problemlerin

çözümünde güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir (Martinez-Murcia ve Rodriguez-Valera

1994, Martinez-Murcia et al. 1995). Ayrıca suşların karşılaştırılması ve doğrulamak

amacyla protein profillerinin çıkarıldığı SDS poliakrilamid jel elektroforezi kullanılan

diğer bir yöntemdir (Hesselberg ve Vreeland 1995, McGenity et al. 1998, Asker ve

Ohta 2002, Stan-Lotter et al. 2002).

Yeni bir taksonun (cins veya tür) tam ve doğru bir tanımının yapılabilmesi için, suşların

fizyolojik ve biyokimyasal karakterizasyonuyla birlikte herhangi bir kemotaksonomik

verinin de kullanılması gerektiği belirtilmektedir (Oren 2001).

Halobacteriales ordosu içerisinde günümüze kadar tanımlanmış 18 cins ve 51 tür

bulunmaktadır (çizelge 2.2.).

9

2.2.1. Halobacteriales ordosunun özellikleri

Halobacteriales ordosu, çubuk, kok, düz extrem pleomorfik hücreler, kusursuz düz kare

hücrelerden (Oren et al. 1996, Oren 1999) üçgen ve trapezoid (Takashina et al. 1990,

Horikoshi et al. 1993) şekilli hücrelere kadar çeşitli morfolojik tipler içermektedir. Bazı

suşlarda halokist olarak belirtilen yapıların varlığı rapor edilmesine rağmen (Kostrikina

et al. 1991), dinlenme evrelerinin varlığı ve spor yapıları rapor edilememiştir.

Hareketsiz veya demet şeklindeki flagellumları ile aktif hareketlidirler. Gram negatif

veya pozitif boyanabilmektedirler (Dussault 1955, Grant et al. 2001). Aerobik olup,

oksidaz ve katalaz aktiviteleri pozitif, bazı suşlar nitrat varlığında yada

bakteriyorodopsin yardımıyla anaerobik olarak üreyebilmektedirler. Ayrıca arjinin

varlığında fermentatif üreyebilen bazı suşları bulunmaktadır (Hartmann et al. 1980,

Oesterhelt 1998, Oren ve Litchfield 1999). Üremeleri için en az 1,5 M NaCl’e ihtiyaç

duymakta olup suşların çoğunluğu 3,5-4,5 M NaCl konsantrasyonunda en iyi üreme

göstemektedir (Oren 2000). Pek çok suşun koloni rengi, içerdikleri C50 ve C40

karotenoidlerinden dolayı kırmızı ve tonlarındadır. Optimum üreme sıcaklıkları 35-

50°C arasındadır. Kemoorganotrofiktirler, karbon kaynağı olarak karbohidratları veya

amino asitleri kullanırlar. Kompleks ortamlarda üremelerine rağmen bazı türler tek

karbon kaynağı içeren inorganik ortamlarda üreyebilmektedirler (Grant et al. 2001).

Fitanil (C20) veya sesterpanil (C25) yan zincirleri olan di-izoprenoid gliserol eter türevli

polar lipitleri mevcuttur (Kates 1993). Ordo üyelerinin DNA’ları genellikle bir majör ve

bir minör komponent içermektedir. Minör komponent total DNA’nın %10-30’nu

oluşturmaktadır. DNA’nın %mol G+C oranı majör komponentde 59-71 ve minör

komponentde 51-59 arasındadır (Pfeifer et al. 1988, Gutierrez et al. 1986).

Halobacteriaceae familyasının özellikleri ordonunki ile aynıdır. Familyanın cins tipi

Halobacterium’dur (Tindall 1992, Grant et al. 2001). Çizelge 2.3., 2.4., 2.5., 2.6., 2.7.

ve 2.8.’de tanımlanmış halofilik arke türlerinin özellikleri verilmiştir.

10

Çizelge 2.2. Halobacteriales ordosuna ait cinsler ve türler

FAMİLYA CİNS TÜR Halobacteriaceae HalobacteriumT Halobacterium salinarumT

Haloarcula Haloarcula vallismortisT

Haloarcula marismortui Haloarcula hispanica Haloarcula japonica Haloarcula argentinensis Haloarcula quadrata Haloarcula californiae Haloarcula sinaiensis Haloarcula aidinensis Halobaculum Halobaculum gomorrenseT

Halococcus Halococcus morrhuaeT

Halococcuss saccharolyticus Halococcus salifodinae Halococcus dombrowskii Haloferax Haloferax volcaniiT Haloferax denitrificans Haloferax gibbonsii Haloferax mediterranei Haloferax alicantei Haloferax lucentensis Haloferax alexandrinus Halogeometricum Halogeometricum borinquenseT

Halorubrum Halorubrum saccharovorumT

Halorubrum coriense Halorubrum distributum Halorubrum lacusprofundi Halorubrum sodomonse Halorubrum trapanicum Halorubrum vacuolatum Halorubrum tebenquichense Halorubrum terrestre Haloterrigena Haloterrigena turkmenicaT

Haloterrigena thermotolerans Natrialba Natrialba asiaticaT

Natrialba magadii Natrialba taiwanensis Natrialba aegytiaca Halosimplex Halosimplex carlbadanseT

Halomicrobium Halomicrobium mukohataeiT

Halorhabdus Halorhabdus utahensisT

Halobioforma Halobioforma haloterrestrisT

Natrinema Natrinema pellirubrumT

Natrinema pallidium Natronobacterium Natronobacterium gregoryiT

Natronococcus Natronococcus occultusT

Natronococcus amylolyticus Natronomonas Natronomonas pharaonisT

Natronorubrum Natronorubrum bangenseT

Natronorubrum tibetense

T= Familyanın cins tipi veya Cinsin tür tipi

11

2.3. Halofilik Arkelerin Habitatları ve Ekolojisi

Doğada halofilik arkelerin dağılımını belirleyen temel faktörler; total tuz

konsantrasyonu, tuzların iyonik kompozisyonu ve mevcut besinlerdir. Dünya üzerinde

halofilik arkeler, evaporasyon ile denizden orijinlenen ve dominant iyon kompozisyonu

Na+ ve CI- olan denizel (thalassohaline) ortamlarda ve oldukça farklı iyonik

kompozisyona sahip denizel olmayan (athalassohaline) sularda da yaşamaktadırlar.

Denizel olmayan sulardan olan İsraildeki Ölü Deniz, divalent katyonlar yönünden

zengindir ve yaklaşık olarak 1.9 M Mg+2, 0.4 M Ca+2, 1.7 M Na+ ve 0.14 M K+

içermektedir. Magadi gölü (Kenya), Wadi Naturn gölü (Mısır) gibi hiper tuzlu, yüksek

pH değerlerine sahip soda göllerinde de halofilik arkeler bol miktarda bulunmaktadırlar

(Rodriguez-Valera et al. 1979, Rodriguez-Valera 1988, Tindall 1988, Oren 1994,

Kamekura 1999). Halofilik arkelerin çoğu yüksek karotenoid içermelerinden dolayı

yüksek kommunite yoğunluğuna ulaştıkları zaman nötral ve alkali hiper tuzlu suların

kırmızı renk tonlarında gözükmelerine neden olmaktadırlar (Arahal et al. 1996, Oren ve

Rodriguez-Valera 2001, Oren 2002). Asidofilik halofilik arke tipleri henüz rapor

edilmemiştir. Ölü Deniz’in (İsrail) pH’ı yaklaşık 6.0 civarında olup bu alanın

muhtemelen halofilik arkelerin kitleler halinde üredikleri en asidik ortam olduğu

belirtilmiştir (Oren ve Gurevich 1993). Halofilik arkelerin çoğunluğu optimum olarak

35-50 ºC arasındaki ve bazen daha yüksek sıcaklıklarda üremektedirler (Shand ve perez

1999). Buna karşılık su sıcaklığı +11.5 ile 0’ın altındaki aralıklarda değişen su

sıcaklığına sahip Antartika’daki Deep Lake’den Halorubrum lacusprofundi, izole

edilmiştir ve optimum üreme sıcaklığının 31-37 ºC olduğu, ancak 4ºC gibi düşük

sıcaklıklarda üremesinin yavaşladığı belirtilmiştir (Franzmann et al. 1988). Halofilik

arkeler sulu ortamların yanı sıra tuzlu topraklardan da izole edilmişlerdir. İspanyanın

Akdeniz kıyıları (Queseda et al. 1982), Eski SSCB’in yüksek dağ ve düzlüklerindeki

(Kulicheuskaya et al. 1992, Zyvagintseva ve Tarasov 1988) çorak alanlardan da izole

edilmişlerdir. Halobacteriaceae üyeleri ayrıca, korunması için tuzlanmış yiyecek, deri

ve diğer ürünlerde de bulunabilmektedirler (Rodriguez-Valera 1988).

12

Çizelge 2.3. Halobacterium, Halobaculum, Halogeometricum, Halococcus ve Halorhabdus cinslerine ait türlerin özellikleri (Oren et al. 1995, Montalvo- Rodriguez et al. 1998, Waino et al. 2000, Grant et al. 2001, Stan-Lotter et al. 2002)

Cins→ Halobacterium Halobaculum Halogeometricum Halococcus Halorhabdus Tür→ salinarumT gomorrenseT borinquenseT morrhuaeT saccharolyticus salifodinae dombrowskii utahensis

Bazonim→ Hb. halobium P. salinaria

Sarcina morrhuae

Morfoloji Çubuk Çubuk Düz pleomorfik Kok Kok Kok Kok Pleomorfik

Hücre bü yüklüğü µm 0.5-1 x1-6 0.5-1 x 5-10 1-2 x 1-3 0.8-1.5 0.8-1.5 0.8-1.2

0.8-1.2 0.5-1 x 2-10

Hareket + − + − − − − + Gaz vezikülü D − + − − − RE RE Opt. NaCl (M) 4-5 1.5-2.5 3-3.5 3.5-4.5 4.3 3.4-4.3 3.4-4.3 4.6 NaCl aralığı (M) 3-5.2 1-2.5 1.4-5.2 2.5-5.2 2.5-5.2 2.6-5.2 2.6-5.1 1.5-5.1 Opt. Mg+2(M) 0.05-0.1 0.6-1 0.04-0.08 RE >0.2 RE 0.02-0.06

%0.05-20 MgSO4

Opt. pH 5.5-8 6-7 7 7.2 7.2 6.8-9.5 5.8-8 6.7-7.1 Opt. Üreme sıc. (ºC) 35-50 40 40 30-45 37 40 37-40 50 NO3→ NO2 redüksiyonu − + + + + + + +

NO3 gaz üretimi − − + − D − RE RE

NO3 anae-robik üreme − − + − − − RE RE

L-Arjinin anaerobik üreme

+ − − RE RE RE RE −

K. hidrat asit üretimi − + + − + + − −

Tek karbon kaynağında üreme

− − + − + RE + RE

İndol üretimi − − + + + RE RE − Nişasta hidrolizi − + − D − RE RE − Tween80 hidrolizi − − RE D − RE RE RE Jelatin hidrolizi + − + D D + + − Kazein hidrolizi + − RE − − RE RE RE Pigment Kırmızı/mor Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Majör glikolipit

S-TGD S-TeGD

S-DGD-1 − S-DGD-1 S-DGD-1 S-DGD-1 S-DGD-1 S-TGD PGS varlığı + − − − − − − −

% mol G+C

66-70,9 Mj. 57-60 Mi 70 (HPLC) 59.1(HPLC) 61-66 (TM) 59,5 (TM) 62± 1

(HPLC) 61.3 (TM) 64

İzolasyon kaynağı

Tuzlanmış inek derisi

Ölü deniz İsrail

Tuzla Puerto Rico

Ölü deniz İsrail

Tuzla İspanya

Tuz madeni Avusturya

Tuz madeni Avusturya”

Tuz gölü USA

Bazonim:eski ad/lar, Hb: Halobacterium, T:Cinsin tür tipi, +: test edilen bütün suşlar pozitif; −: test edilen bütün suşlar negatif, D: bazı suşlar pozitif; RE: rapor edilmedi; Mj: majör DNA komponenti, Mi: minör DNA komponenti, TM: Erime derecesi

13

Çizelge 2.4. Halorubrum cinsine ait türlerin özellikleri (Tomlinson ve Hochstein 1976, Franzmann et al. 1988, McGenity ve Grant 1995, Kamekura ve Dyall- Smith 1995, Grant et al. 2001, Lizama et al. 2002)

Cins→ Halorubrum

Tür→ saccharovorumT sodomonse lacusprofundi coriense distributum vacuolatum trapanicum tebenquichense

Bazonim→ Hb. saccharovorum

Hb. sodomonse

Hb. lacusprofundi

Hrb. coriense

Hb. distributum

Natro. Vacuolatum (vacuolata)

Hb. trapanicum

Morfoloji Çubuk Çubuk Çubuk Pleomorfik çubuk

Pleomorfik çubuk

Çubuk Çubuk Düzensiz disk

Hücre bü yüklüğü µm

0.6-1.2 x2.5

0.5 x2.5-5 12’e kadar 0.5-1 x

0.5-5 0.8-1 x2.5-7 0.5-0.7 x 1.5-3

0.7-1 x 1.5-3 1-2 x0.8-1.5

Hareket + + D + + − − R.E

Gaz vezikülü − − − − − + − R.E

Opt. NaCl (M) 3.5-4.5 1.7-2.5 2.5-3.5 2.2-2.7 2.5-4.3 3.5 2.5-5.2 5.2

NaCl aralığı (M) 1.5-5.2 0.5-4.3 1.5-5.2 2-5.2 1.7-5.2 2.5-5.2 RE 2.5-5.2

Opt. Mg+2(M)

>0.005 0.6-1.2 0.005 >0.005 RE >0.001 RE −

Opt. pH Nötral Nötral Nötral Nötral Nötral 9.5 Nötral R.E Opt. Üreme sıc. (ºC) 50 40 31-36 50 37-45 35-40 37 R.E

NO3→ NO2 redüksiyonu

+ ± + veya ± RE + + + +

NO3 gaz üretimi

− − − RE − − + R.E

NO3 anae-robik üreme

− − − RE − − − R.E


− − RE RE RE RE RE R.E

K. hidrat asit üretimi + + + RE + RE + −


RE − + + − RE RE +

İndol üretimi − − − − − RE − −

Nişasta hidrolizi − + − RE − − − − Tween80 hidrolizi RE − RE RE RE RE RE − Jelatin hidrolizi − − − RE − − − − Kazein hidrolizi − RE − RE RE RE RE R.E

Pigment Turuncu-kırmızı Turuncu-Kırmızı

Turuncu-kırmızı Kırmızı Turuncu-

kırmızı Parlak pembeı Kırmızı Turuncu-

kırmızı Majör glikolipit

S-DGD-3 veya S-DGD-1 S-DGD-3 S-DGD-3 S-DGD-3 S-DGD-3 − S-DGD-5 S-DGD-3

PGS varlığı + + + + + − + −

% mol G+C

71.2 (Bd) 68 (Bd) 65.3-65.8 Mj 54.6-65.3 Mi RE 63.6 Mj

54.6 Mi 62.7 (TM) 64.3 (Bd) 63.2 (TM)


Tuzla Kalifornia

Ölü deniz İsrail

Deep lake Antarktika

Tuzla, Avustralya

Tuzlu top-rak, USSR

Magadi gö-lü, Kenya

Solar tuz İtalya

Tebenquiche gölü, Şili

Bazonim:eski ad/lar, Hb: Halobacterium, Hrb:Halorubrobacterium, Natro: Natronobacterium, T:Cinsin tür tipi, +: test edilen bütün suşlar pozitif; −: test edilen bütün suşlar negatif, ±: zayıf reaksiyon, D: bazı suşlar pozitif; RE: rapor edilmedi; Mj: majör DNA komponenti, Mi: minör DNA komponenti, TM: Erime derecesi, Bd:Buoyant density

14

Çizelge 2.5. Halorubrum, Haloarcula ve Halomicrobium cinsine ait türlerin özellikleri (Gonzales et al. 1978, Torreblanca et al. 1986, Oren et al. 1990, Takashina et al. 1990, Ihara et al. 1997, Oren et al. 1999, Grant et al. 2001, Oren et al. 2002,Ventosa et al. 2004) Cins→ Halorubrum Haloarcula Halomicrobium

Tür→ terrestre vallismortisT marismortui hispanica japonica argentinensis quadrata mukohatei

Bazonim→ Hb. vallismortis

Hb. marismortui

Morfoloji Pleomorfik Pleomorfik çubuk

Düz pleomorfik

Pleomor-fik çubuk

Düz pleomor-

fik Düz

pleomorfik Düz

pleomor-fik -kare

Çubuk

Hücre bü yüklüğü µm 1-1.5x1.5-

2.5 0.6-1 x 3-5 1-2 x 2-3 0.3 x0.5-1 0.2-0.5 x

2-5 0.3 x 1 2-3 0,5 x 2

Hareket + + + + + + + + Gaz vezikülü − − − − − − − −

Opt. NaCl (M) 4.3 4.3 3.4-3.9 3.5-4.2 3.5 2.5-3 3.4-4.3 3-3.5

NaCl aralığı (M) 2.5-5.2 2.5-5.2 1.7-5.1 2.5-5.2 2.5-5 2-4.5 2.7-4.3 2.5-4.5

Opt. Mg+2(M)

RE RE >0.05-0.1 >0.005 0.08 0.1 0.1-0.5 0.003-0.3

Opt. pH 7.5 7.4-7.5 Nötral 7.0 7-7.5 Nötral 6.5-7 Nötral Opt. Üreme sıc. (ºC)

37-45 40 40-50 35-40 42-45 40 53 40


− + + + + RE + RE

NO3 gaz üretimi

− + + + + RE + RE


RE + + RE RE RE + RE


− − − RE RE RE − RE

K. hidrat asit üretimi + + + + + + + +


− + + + + RE + RE

İndol üretimi

− + − d + RE − RE

Nişasta hidrolizi

− + +d + − RE + RE Tween80 hidrolizi

RE − RE + RE RE − RE

Jelatin hidrolizi

− − − + − RE − RE

Kazein hidrolizi

− − RE D − RE − REPigment Turuncu-

kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Kırmızı Majör glikolipit S-DGD-2 TGD-2 TGD-2 TGD-2 TGD-2 TGD-2 TGD-2 S-DGD-1

DGD-1 PGS varlığı

+ + + + + + + +

% mol G+C

64.4 (Tm) 64.7 (Bd) 62.7 Mj 54.7 Mi 62.7 (Tm) 63.3

(Bd) 62 (Tm) 60.1 (Tm) 65 (Tm)

İzolasyon kaynağı Tuzlu toprak Tuz gölü,

California Ölü deniz İsrail

Tuzla İspanya

Tuzla Japonya

Tuzla toprağı Arjantin

Sina y.adası Mısır

Tuzla toprağı Arjantin

Bazonim:eski ad, Hb: Halobacterium, T:Cinsin tür tipi, +: test edilen bütün suşlar pozitif; −: test edilen bütün suşlar negatif, D: bazı suşlar pozitif; d: çelişkili sonuç, RE: rapor edilmedi; Mj: majör DNA komponenti, Mi: minör DNA komponenti, TM: Erime derecesi, Bd:Buoyant density

15

Çizelge 2.6. Haloferax ve Halosimplex cinslerine ait türlerin özellikleri (Rodriguez- Valera et al. 1983, Torreblanca et al. 1986, Tindall et al. 1989, Grant et al. 2001, Gutierrez et al. 2002, Vreeland et al. 2002, Asker ve Ohta 2002)

Cins→ Haloferax Halosimp-lex

Tür→ volcaniiT gibbonsii denitrificans mediterranei lucentensis alexandri-nus carlbadense

Bazonim→ Hb. volcanii

Hb. denitrificans

Hb. mediterranei

Morfoloji Düz pleomorfik

Pleomorfik çubuk Pleomorfik Pleomorfik Pleomorfik

çubuk Pleomorfik- çubuk Çubuk

Hücre bü yüklüğü µm 1-2 x 2-3 0.4x0.5-2.5 0.8-1 x 2-3 0.5-1 x 2-3 0.6 x 2.5 1-1.5x1.6-2 0.95 x 5.0

Hareket − + − + + − + Gaz vezikülü − − − + RE − RE

Opt. NaCl (M) 1.5-2.5 3-4 4.3 2-3 4.3 4.3 4.3

NaCl aralığı (M) 1-4.5 1.5-5.2 1.5-4.5 1-5.2 1.7-5.1 1.7-5.2 RE

Opt. Mg+2(M)

0.2 >0.02-0.04 RE 0.02-0.04 RE %4 MgSO4 %1-2w/v

Opt. pH Nötral 6.5-7 6.7 6.5 7.5 7.2 RE Opt. Üreme sıc. (ºC) 45 35-40 50 47-54 37 37 37-40


+ D + + − + RE

NO3 gaz üretimi

− D + + − RE

NO3 anae-robik üreme −d RE + + RE − −


− − − − − − −

K. hidrat asit üretimi

+ + + + + + RE


+ + + + + + +

İndol üretimi

+ + − + + RE RE

Nişasta hidrolizi

− − − + − − −

Tween 80 hidrolizi − + − + RE + RE

Jelatin hidrolizi − − + + − + −

Kazein hidrolizi − ± RE RE − − RE

Pigment Kırmızı Kırmızı Turuncu-kırmızı Açık pembe Pembe Kırmızı Pembe-

kırmızı Majör glikolipit S-DGD-1 S-DGD-1 S-DGD-1 S-DGD-1 S-DGD-1 S-DGD-1 S2-DGD

S-TeGD PGS varlığı − − − − − − −

% mol G+C

63.4 Mj T m55.3 Mi.Bd 61.8 (Tm) 64.2 (Tm) 60 (Tm) 64.5 (Tm) 59.5± 0.3

(HPLC) 64.4

(HPLC)


Ölü deniz İsrail

Tuzla İspanya

Tuzla California

Tuzla İspanya

Tuzla İspanya Tuzla, Mısır

Tuz kristaliNew

mexico Bazonim:eski ad, Hb: Halobacterium, T:Cinsin tür tipi, +: test edilen bütün suşlar pozitif; −: test edilen bütün suşlar negatif, D: bazı suşlar pozitif; d: çelişkili sonuç, RE: rapor edilmedi; Mj: majör DNA komponenti, Mi: minör DNA komponenti, TM: Erime derecesi, Bd:Buoyant density

16

Çizelge 2.7. Halobioforma, Natronococcus, Natrinema ve Natronorubrum cinslerine ait türlerin özellikleri (McGenity et al. 1998, Xu et al. 1999, Xin et al. 2000, Grant et al. 2001, Hezayen et al. 2002)

Cins→ Halobioforma Natronococcus Natrinema Natronorubrum

Tür→ haloterrestris occultusT amylolyticus pellirubrumT pallidium versiforme bangenseT tibetense

Bazonim→ Natro. nitrati-reducens

Morfoloji Çubuk, kok, pleomorfik Kok Kok Çubuk veya

pleomorfik Çubuk Pleomo-rfik Pleomorfik Pleomo-

rfik Hücre bü-yüklüğü µm

0.5-1.5x2-8 1.25-2 (çap) 1-2 1-2 0.6-1 x 1-4 0.7-1 x

1.5-6 RE RE RE

Hareket + − − − − − − − Gaz vezikülü RE − − − − − RE RE

Opt. NaCl (M) 3.4 3.4-3.8 2.5-3.4 3.4-4.3 3.4-4.3 3.4-4.3 3.8 3.4

NaCl aralığı (M) 2.2-5.2 1.4-5.2 1.4-5.2 2-4.3 2-4.3 1.5-5.2 2.1-4.3 2.1-5.1

Opt. Mg+2(M)

<0.01 <0.01 RE RE 0.15 RE RE

Opt. pH 7.5 9.5 9 7.2-7.8 7.2-7.6 6.5-7 9.5 9 Opt. Üreme sıc. (ºC) 42 35-40 40-45 RE 37-40 37-46 45 45


+ + + + + + − −

NO3 gaz üretimi + − RE − − + − −

NO3 anae-robik üreme RE − RE RE RE + − −


RE RE RE RE RE − RE RE

K. hidrat asit üretimi

+ RE RE − − + Bazen Bazen


− RE RE RE RE RE RE

İndol üretimi

+ RE RE − − + + +

Nişasta hidrolizi − − + − − şüpheli + +

Tween 80 hidrolizi

+ RE RE RE RE + − −

Jelatin hidrolizi

+ + − + + − − +

Kazein hidrolizi

+ RE RE RE RE − − −

Pigment Kırmızı Kırmızı Kırmızı Açık kırmızı-t r nc

Soluk turuncu Kırmızı Kırmızı Kırmızı

Majör glikolipit

S-TGD, TGD − − Tanımlanma

mış Tanımlanmamış

Tanımlan-mamış

− −

PGS varlığı − − − − + + − −

% mol G+C

66.9 64 Mj 55.7 Mi 63.5 69.9 Mj

60 Mi RE 64.2 59.9 60.1


Tuzlu toprak Mısır

Magadi gölü Kenya

Magadi gölü Kenya

Tuzlanmış deri

Tuzlan-mış morina balığı

Tuz gölü çin

Alkali Tuz gölü Tibet

Alkali Tuz gölü Tibet

Bazonim:eski ad, Natro: Natronobacterium, T:Cinsin tür tipi, +: test edilen bütün suşlar pozitif; −: test edilen bütün suşlar negatif, RE: rapor edilmedi; Mj: majör DNA komponenti, Mi: minör DNA komponenti

17

Çizelge 2.8. Natrialba, Haloterrigena, Natronomonas ve Natronobacterium cinslerine ait türlerin özellikleri (Kamekura ve Dyall-Smith 1995, Kamekura et al. 1997, Ventosa et al. 1999, Montalvo-Rodriguez et al. 2000, Hezayen et al. 2001) Cins→ Natrialba Haloterrigena Natronobac-

treium Natronomonas

Tür→ asiaticaT magadii taiwanensis aegyptiaca turkmenicaT thermotolerans gregoryiT pharaonisT

Bazonim→ Natro. magadii

Natro.

pharaonis

Morfoloji Çubuk Çubuk Çubuk Çubuk, kok

Kok veya oval Çubuk Çubuk Çubuk

Hücre büy-üklüğü µm 0.5-1 x1-

5 0.7-0.9 x 2-4 0.3-0.5 x1-

1.5 0.5-1 x1.5-6 1.5-2 çap 4-13 x 0.7-1 0.5-0.7x10-15 0.8 x2-3

Hareket + + + + − − − −

Gaz vezikülü − − RE RE − RE − −

Opt. NaCl (M) 3.5-4 3.5 3-5 2.5-3 RE 3-3.5 3 3.5

NaCl aralığı (M) 2-5.3 2-5.2 2-5.2 1.6-5.2 2.5-4.3 2-4.3 2-5.2 2-5.2

Opt. Mg+2(M)

>0.05 <0.01 RE RE RE 5mM <0.01 >0.01

Opt. pH 6.6-7.8 9.5 7.5-7.8 7-8 Nötral 7-7.5 9.5 9.5-10 Opt. Üre-me sıc. ºC 35-40 37-40 35-40 37-42 45 50 37 45

NO3→ NO2 redüksiyon

+ − RE RE + + − −

NO3 gaz üretimi

− − RE RE − − − −


− − RE RE − − − −


− RE RE RE RE − RE RE

K. hidrat asit üretimi D − + + + − − −


RE − RE RE RE − − −

İndol üretimi + RE RE RE − − RE RE

Nişasta hidrolizi

D − + + − − − − Tween 80 hidrolizi + RE + + RE + RE −

Jelatin hidrolizi RE + − + − + + +

Kazein hidrolizi + RE − + RE − RE −

Pigment Beyaz kırmızı Beyaz* Beyaz Kırmızı Soluk kırmızı kırmızı kırmızı Majör glikolipit − − S2DGD-1 S2DGD-1 S2DGD-1 S2DGD-1 Bilinmiyor −

PGS varlığı

RE − − − − − − −

% mol G+C

60.3-63.1 (Tm)

63 Mj.Bd 49,5 Mi.Bd

62.3 ± 0.4 61.5 ± 0.6 59.2-60.2 63.3 (HPLC) 59 61.2 Mj 51.9 Mi


Kıyı kumu Japonya

Magadi gölü Kenya



Tuzlu toprak Türkmenistan

Tuzla gölü Puerto-Rio

Tuzla Puerto Rico

Wadi naturn Mısır

Bazonim:eski ad, Natro: Natronobacterium, T:Cinsin tür tipi, +: test edilen bütün suşlar pozitif; −: test edilen bütün suşlar negatif, RE: rapor edilmedi; Mj: majör DNA komponenti, Mi: minör DNA komponenti, Bd:Buoyant density, TM: Erime derecesi, *Bazı şartlarda renkli, , D: bazı suşlar pozitif

18

Halobacteriaceae içinde tuz gereksinimi ve toleransına bağlı olarak farklı cins ve türler

arasında büyük farklılık görülür. Halobacterium cinsine ait tiplerin aksine türlerin çoğu,

özellikle Haloferax cinsine ait olanlar daha düşük tuz konsantrasyonlarında

gelişebilmektedirler (Rodriguez-Valera et al. 1985). Ortamdaki Mg+2 konsantrasyonu da

ekolojik bir öneme sahiptir. Nötrofil halofilik arkelerin çoğunluğu diğerlerine göre daha

fazla Mg+2 konsantrasyonuna (min 50-100mM) gereksinim duymaktadırlar. Suboptimal

Mg+2 konsantrasyonlarında türlere göre değişmek üzere çoğunlukla hücresel şekillerini

kaybederek canlıklarını sürdürebilmekte (Brown and Gibbons 1995) ya da

yitirmektedirler (Cohen et al. 1983). Alkalifilik üyeler ise yüksek Mg+2

konsantrasyonuna gerek duymamaktadırlar (Tindall 1988).

Halofilik arkeler yüksek tuz konsantrasyonunda yaşadıkları için bu ortamlarda

gelişebilecek predatörleri az olduğundan dolayı 107-108 hücre/ml yoğunluğa kadar

ulaşabilmektedirler. Halofilik arkelerin bakteriofajlarla lizisinin kommünite büyüklüğü

üzerinde etkili olabildiği belirtilmiştir (Oren et al. 1997). Halosinler laboratuvar

ortamında diğer halobakterilerin üremesini emgelleyen proteinlerdir. Halobakteriler

arasında oldukça yaygın olan bakteriyosin (halosin) üretiminin, hiper tuzlu akuatik

ortamlardaki rekabette katkısının önemli olmadığı gösterilmiştir (Rodriguez-Valera et

al. 1981, Meseguer et al. 1986, Torreblanca et al. 1994, Kis-Papo ve Oren 2000).

2.4. Halofilik Arkelerde Ozmotik Adaptasyon

Doygun tuz konsantrasyonunda (5.2 M NaCl) yaşayan Halobacteriales ordosu üyeleri,

ortamdaki yüksek ozmotik basınca karşı koyabilmek için stoplazmalarında başta K+ ve

Cl- olmak üzere yüksek oranlarda iyonlar biriktirmektedirler ("salt-in" stratejisi). 3.5 M

NaCl’den daha yüksek olan hücre içi tuz konsantrasyonunun (yaklaşık 5M) büyük

kısmını KCl ve daha az olmak üzere NaCl oluşturmaktadır (Kushner 1985, Hough ve

Danson 1989). Halofilik arkeler, iç ortamlarında ozmolit çözünür madde olarak dış

ortamdakinin 100 katı oranında KCl biriktirdikleri için, hücresel bileşenleri de bu tuz

konsantrasyonuna adapte olup proteinlerin stabilitesi ve fonksiyonu için bu tuz oranı

gereklidir. Halofilik arkeler, protein yapısında, diğer canlılara göre negatif yüklü amino

asit sıklığını arttırarak (%20 daha fazla) ve ortamın salting-out etkisini kompanse etmek

19

için polar olmayan amino asit miktarını azaltarak adapte olmuşlar ve halofilik enzimler

yaklaşık 1 M’ın altındaki NaCl/KCl konsantrasyonlarında hızla denatüre olmaktadırlar

(Jaenicke ve Zavodszky 1990, Danson ve Hough 1997, Sellek ve Chaudhuri 1999,

Hough ve Danson 1999, Mevarech et al. 2000, Kunte et al. 2001). H. salinarum NRC-1

proteomunun oldukça asidik karakterde olduğu (izolektrik noktası 4.9) ve diğer

canlıların proteinlerinin denatüre olduğu doygunluk derecesindeki hücre içi tuz

konsantrasyonunda stabil kaldığı belirtilmiştir. Bazı halofilik arkelerin (Natronococcus

occultus, Natronobacterium gregoryi v.b.) sitoplazmalarında yüksek tuz

konsantrasyonunun yanısıra organik ozmolit çözünür madde olarak 2-sülfo trehaloz da

saptanmıştır. Enzimatik mekanizmanın adaptasyonunda organik ozmolit

biriktirilmesinin enerjetik yönden KCl’e göre ekonomik olmadığı belirtilmiştir. Salt-in

sitoplazma stratejisiyle hücre içerisinde dışarıya göre daha yüksek oranda K+ biriktiren

halofilik arkeler, Na+ iyonlarını Na+/H+ antiport sistemi ile dışarı atmaktadırlar (Oren

2000, Oren 1999, Roeßler ve Müller 2001, Oren 2002). Potasyum ile birlikte karşıt iyon

olarak Cl- da stoplazmada yüksek oranda bulunmakta ve enerji gereksinimi olan aktif

Cl- alımının büyüme ve bölünme aşamalarında hücrelerin hacimlerini arttırmaları için

gerekli olduğu belirtilmiştir. Halofilik arkelerde Cl- alımı ile ilgi 2 sistem

tanımlanmıştır; ışıkla çalışan klor pompası rodopsin ve ışığa bağımlı olmayan transport

sistemi (Kunte et al. 2001, Müller ve Oren 2003). Ayrıca KCl’ün H. salinarum’da

DNA’da zarar oluşturan oksidatif letal faktörlere karşı organizmayı koruduğu da rapor

edilmiştir (Shahmohommadi et al. 1998).

2.5. Halofilik Arkelerin Yapısal, Genetik ve Fizyolojik Özellikleri

2.5.1. Polar ve nötral lipitler

Halobacteriales ordosu üyelerinin hücre zarlarında, gliserole eter bağlı dallanmış 20-

karbonlu (fitanil) ve bazen de 25-karbonlu (sesterpanil) zincirleri bulunmaktadır. Nötral

lipitlerden farklı olarak fosfolipit, sülfolipit ve glikolipitlerden oluşan polar lipit tipleri

suşların taksonomisinde önemli bir özellik olarak kullanılmaktadır (Torreblanca et al.

1986, Kates 1993). Ayrıca tuzlu bölgelerdeki biyomasın polar lipit kompozisyonları ile

ilgili bilgiler, doğal kommunitelerdeki mevcut halofilik arke tip veya tiplerinin

20

belirlenmesi için de kullanılmaktadır (Oren ve Gurevich 1993, Oren et al. 1996,

Litchfield et al. 2000). Polar lipitlerin karakterizasyonu ince tabaka kromatoğrafisi,

kütle spektrometresi, NMR spektroskopisi gibi yöntemler ile yapılabilmektedir (Ross et

al. 1981, Kates 1993). Halobacteriaceae üyelerinde bulunan polar lipitlerin büyük bir

kısmı C20C20 temel lipit (2,3-di-O-fitanil-sn-gliserol) yapısındadır (şekil 2.3.a).

Alkalifilik türlerin büyük bir kısmı ve bazı nötrofilik türler farklı oranlarda C25C20 (2-O-

sesterpanil-3-O-fitanil-sn-gliserol içermektedirler (şekil 2.3.b) (Kamekura ve Kates

1988, Kamekura ve Dyall-Smith 1995, Mcgenity et al. 1998, Morita et al. 1998). Bazı

halofillerde minör bileşen olarak C25C25’e (2,3-di-O-sesterpanil-sn-gliserol)

rastlanılmakta (şekil 2.3.c) (Kamekura ve Kates 1999), C40 şeklindeki bidiftanil tetraeter

yapısına bugüne kadar rastlanılmamıştır (Grant et al. 2001).

CH2OH

CH2OH

CH2OH

CH

CH

CH

CH2

CH2

CH2

O

O

O

O

O

O

Şekil 2.3. Halofilik arkelerde bulunan temel lipitler (Kates 1992).

a: C20C20, b: C25C20, c: C25C25

Tüm halofilik arkeler fosfatidil gliserol (PG) ve metil ester fosfatidil gliserofosfat (Me-

PGP) dieter türevleri içerirler. Fosfatidil gliserosülfat (PGS), nötrofilik türlerin çoğunda

mevcut iken bazı nötrofilik üyelerin yanısıra, özellikle alkalifilik üyeler PGS

içermeyişleri ile karakterize edilebilmektedirler. Halobacteriales’in farklı üyelerinde

21

di-, tri- veya tetraglikozil dieter yapısında çeşitli glikolipitler tanımlanmıştır: mannozil-

(1-2)-glukozil-gliserodieter (DGD-1), mannozil-glukozil-gliserodieter (DGD-2

tanımlanmamış), glukozil-(1-6)-glukozil-gliserodieter (DGD-4), mannozil-6-Sülfat-(1-

2)-glukozil-gliseroldieter (S-DGD-1), mannozil-2-sülfat-(1-4)-glukozil-gliseroldieter

(S-DGD-3), mannozil-2-sülfat-(1-2)-glukozil-gliseroldieter (S-DGD-5), mannozil-2,6-

bisülsat-(1-2)-glukozil-gliseroldieter (S2-DGD-1), galaktozil-(1-6)-mannozil-(1-2)-

glukozil-gliserodieter (TGD-1), glukozil-(1-6)-mannozil-(1-2)-glukozil-gliserodieter

(TGD-2), galaktozil-3-sülfat-(1-6)-mannozil-(1-2)-glukozil-gliserodieter (S-TGD-1),

galaktozil-(1-6)-mannozil-(3-1)-galaktozil-(1-2)-glukozil-gliserodieter (TeGD), galakto-

zil-3-sülfat-(1-6)-mannozil-(3-1)-(galaktozil)-(1-2)-glukozil-gliserodieter (S-TeGD)

(Hancock ve Kates 1973, Kates ve Deroo 1973, Kamekura ve Kates 1988, Trincone et

al. 1990, Kates 1993, Upasani et al. 1994, Kates 1996, Kamekura ve Kates 1999).

Halofilik arkelerin total lipit içeriklerinin yaklaşık %10’unu nötral lipitlerin oluşturduğu

rapor edilmiş olup başlıca tipleri şunlardır: C20 isoprenoid lipidlerden geranilgeraniol,

gliserolün nötral fitanil eterlerinden DL-O-fitanil-sn-gliserol ve 2,3-di-O-fitanil-sn-

gliserol, C30-isoprenoid bileşiklerinden squalen, dihidrosqualen, tetrahidrosqualen ve

dehidrosqualen (Kamekura ve Kates 1988, Oren 2001).

2.5.2. Karotenoid ve retinal pigmentler

Halobacteriales ordosunun pek çok üyesi hücre zarlarında yüksek oranda içerdikleri α-

bakterioruberin’in C50 düz-zincir türevli karotenoid pigmentlerinden ve daha düşük

miktarda içerdikleri C40 tipi karotenoid olan likopen ve β-karotenden dolayı parlak

kırmızıdan turuncuya kadar değişen renk tonlarında görülürler. Karotenoid

pigmentlerinin hücreyi iyonize radyasyon ve UV radyasyonu gibi DNA’ya zara veren

letal faktörlere karşı korudukları ve fotoreaktivasyona yardım ettikleri ileri sürülmüştür

(Wu et al. 1983, Tindall 1992).

Halofilik arkelerde 4 adet retinal pigment içeren protein tanımlanmıştır:

bakteriyorodopsin (ışıkla çalışan dış proton pompası), halorodopsin (ışıkla çalışan iç CI−

pompası) ve 2 adet alıcı rodopsin (ışığa duyarlı fototaksis olayına katılırlar). Mor

22

pigmentli bakterioyrodopsin, H. salinarum ve Halorubrum sodomonse’de bulunur

(Oesterhelt 1998, Oren 1983, Oren 2001) ve H. salinarum’daki bakteriyorodopsin

kromofor (retinal) içeren tek bir polipeptit zincirinden oluşmuş integral bir zar

proteinidir ve hücre dışına protonların ışığa bağlı translokasyonuyla transmembran

elektrokimyasal gradienti oluşturur ve ATP’nin sentezlenmesini sağlar (Kushner 1985,

Yatsunami et al. 2000).

2.5.3. Diğer yapısal özellikleri

Halobacteriales’in bir çok üyesi, çözünür oksijen miktarı düşük olan tuzlu sularda

oksijen ve ışık alımını arttıran ve yüzme olanağı sağlayan gaz vezikülleri içermek-

edirler. Bunların UV ışınlarının zararlı etkilerine karşı koruyucu kalkan oldukları belir-

tilmiştir (DasSarma 1993, Beard et al. 1997).

Diğer prokaryotik gruplarda taksonomik marker olarak kullanılan ve halofilik arkelerde

konsantrasyonları düşük olan poliaminlerin taksonomik olarak önemli olmadığı rapor

edilmiştir (Kamekura et al. 1986, Hamara et al. 1995).

Halobacteriales ordosunun non-kokkoid temsilcilerinin yüksek molekül ağırlığına sahip

glikoproteinlerden oluşmuş hücre duvarına sahip oldukları belirtilmiştir. Halococcus

türleri sülfatlı heteropolisakkarit yapısında kalın bir hücre duvarına sahiptirler. Natrono-

coccus occultus, farklı olarak tekrar eden poli L-glutamin ünitelerine sahip kalın bir

hücre duvarı içermektedir (Kushner 1985, Niemetz et al. 1997, Messner et al. 1997,

Tindall 1992, Oren 2001).

2.5.4. Genetik yapıları

Joshi et al. (1963) CsCl buoyant density satrifügasyon yöntemini kullanarak

Halobacteriaceae familyasındaki pek çok türün DNA’nın majör "FI DNA" ve minör

"FII DNA" (kromozomal DNA daki A+T’ce zengin adalar veya satellit DNA) bölgeleri

içerdiklerini belirtmişlerdir. FII fraksiyonu, total DNA’nın %11-36’lık bölümünü

oluşturmakta olup daha çok heterojen bir plazmid populasyonundan olştuğu, ancak kro-

23

mozom içerisinde de FII adalarının bulunduğu ve bunların daha çok insersiyon

sekansları olduğu ve H. salinarum’da yüksek miktarda bulunduğu, dolayısıyla yüksek

sıklıkta (10-2) meydana gelen spontan mutasyonların nedeni oldukları rapor edilmiş olup

(Pfeifer et al. 1988, Pfeifer ve Blaseio 1989, Pfeifer et al. 1989, DasSarma 1993, Ng et

al. 1998) Halobacteriales’in diğer üyelerinin daha stabil bir genoma sahip oldukları

belirtilmiştir (Lopez-Garcia et al. 1995). H. salinarum NRC-1’in genomik dizisi tam

olarak çıkarılmış olup 2Mb (2.014 kb) büyüklüğünde halkasal bir kromozom, pNRC200

(365 kb) ve pNRC100 (191 kb) şeklinde iki adet minikromozom içerdiği ve genomunun

yaklaşık 2630 adet protein geni bulundurduğu belirtilmiştir (Ng et al. 1998, Ng et al.

2000, Kennedy et al. 2001, Goo et al. 2003). Halofilik arkeler küçük molekül ağırlıklı

plazmidlerin yanısıra 100-300 kb arasında değişik plazmidler (megaplazmidler)

içermektedirler (Pfeifer et al. 1981a, Pfeifer et al. 1981b, Pfeifer et al. 1988, Ross ve

Grant 1985, Gutierrez et al. 1986, Rosenshine ve Mevarech 1989, Hackett et al. 1989,

Akhmanova et al. 1993). Plazmidlerin fonksiyonları tam olarak bilinmemesine rağmen

bazı halofilik arkelerde gaz keseciği ve bakteriyoruberin sentezi ile ilgili olabildiği rapor

edilmiştir (Pfeifer et al. 1981a, DasSarma ve Arora 1997).

2.5.5. Fizyolojileri

Halofilik arkeler aerobik heterotrofik prokoryatlar olup karbon kaynaklarının aerobik

yıkımı, glioksilat döngüsü ve sitokrom zinciri içeren elektron transport sistemi

kombinasyonu ile trikarboksilik asit döngüsü temelinde gerçekleşmektedir. Embden

Meyerhof metabolik yolu, hekzokinaz ve fosfofruktokinaz aktivitelerinin düşüklüğü ve

tuzla güçlü bir şekilde inhibe edilmeleri nedeniyle Halobacteriaceae’de işlevsel değildir

(Rawal et al. 1988). Bunun yerine muhtemelen glukozun yıkımı, fosforilasyon

aşamasının atlandığı bir modifiye Entner-Doudoroff metabolik yol ile

gerçekleştirilmektedir. Aminoasitler, şekerler ve organik asitler gibi basit bileşiklere ek

olarak bazı polimerik maddeler de halofilik arkeler tarafından yıkılabilmektedir.

Halobacteriales’in birçok türü proteaz, lipaz, DNaz ve amilaz gibi ekzoenzimleri de

üretmektedir (Izotova et al. 1983, Kushner 1985, Johnsen et al. 2001, Oren 2001). Tuza

doymuş ortamlarda oksijen çözünürlüğünün az olmasından dolayı halofilik arkelerin

çoğu anaerobik olarak üreme yeteneğine sahip olup bu amaçla fumarat, trimetilamin N-

24

oksit (TMAO), dimetilsülfoksit veya nitrat gibi alternatif elektron alıcıları, arjinin

fermentasyonu veya bakteriyorodopsin kullanırlar (Hartmann et al. 1980, Mancinelli ve

Hochstein 1986, Oren ve Trüper 1990, Oren 1991, Ruepp ve Soppa 1996, Oren ve

Litchfield 1999, Goo et al. 2003).

2.6. Halofilik Arkelerin Antimikrobiyal Maddelere Duyarlılıkları

Halofilik arkeal suşların karakterizasyonu veya karşılaştırılmasıyla ilgili taksonomik

çalışmalarda antibiyotikler ve diğer antimikrobiyal madellere duyarlılık oldukça fazla

kullanılmaktadır (Oren et al. 1997). Mürein yapıda hücre duvarına sahip olmayan

halofilik arkeler penisilin, ampisilin, sikloserin, kanamisin, neomisin, polimiksin,

karbenisillin, sefatoksim ve streptomisin gibi bakterilere spesifik antibiyotiklere

dirençlidirler. Çelişkili olmasına rağmen, yapılan çalışmaların çoğunda bu canlıların

kloramfenikol ve tetrasikline duyarlı oldukları rapor edilmiştir. Bunun dışında halofilik

arkelerin novobiosin, bazitrasin, rifampisin ile ökaryotlarda protein sentez inhibitörü

olan anizomisin ve quinolon türevlerine karşı duyarlı oldukları tespit edilmiştir (Hilpert

et al. 1981, Pecher ve Böck 1981, Bonelo et al. 1984, Böck ve Kandler 1985, Sioud et

al. 1988, Oren 1996). Ayrıca bu canlıların Streptomyces venazuale subsp.

xanthophaeus’ca üretilen halokinon ile DNA polimeraz inhibitörü olan afidikolin ve

safra tuzlarına karşı duyarlı oldukları belirtilmiştir (Oren 1990, Kamekura et al. 1988,

Oren 2001).

2.7. Halofilik Arkelerin Uygulama Alanları

Potansiyel biyoteknolojik uygulamalara sahip olan kırmızı halofilik arkelerin, tuzla-

kristalizasyon göllerinde solar ısınmayı ve evaporasyonu arttırarak tuz üretiminin

arttırılmasında kullanılabilecekleri ileri sürülmüştür (Jones et al. 81, Grant et al. 1998,

Litchfield 2002). Bakteriyorodpsinin, güneş ışığından elektrik üretimi, deniz suyundan

tuz giderimi, kimyasal ve biyosensörlerde kullanılması ve ultrahızda ışık saptanması

gibi alanlarda da potansiyel olarak kullanılabileceği rapor edilmiştir (Kushner 1985,

Hough ve Danson 1989, Margesin ve Schinner 2001).

25

Ayrıca Haloferax ve Haloarcula cinslerine ait bazı türlerin, ürettikleri ekzopolisakkarit

yoluyla vizkozite stabilizasyonunda, jelleştirme ajanı ve emülsifiyer olarak ve petrolün

mikrobiyolojik geri kazanımını artırmak için kullanılabilecekleri belirtilmiştir (Ventosa

ve Nieto 1995, Parolis et al. 1996, Margesin ve Schinner 2001). Bazı halofilik arke poli-

β-hidroksi alkonat (PHA) ürettikleri belirtilmiştir (Lillo ve Rodriguez-Valera 1990,

Hezayen et al. 2000). Yağsız katkı maddesi olarak gliserol dieter lipitlerin besin katkı

maddesi olarak kullanılabileceği ileri sürülmüştür (Post ve Collins 1982). İlaç ve

kozmetiklerin yapısında kullanılan lipozomlar’ın yapımında halofilik arkelerin

esterazlara karşı yüksek bir kimyasal stabiliteye sahip olan eter bağlı lipitleri

kullanılmaktadır. Amilaz, amiloglukozidaz, proteaz ve lipaz gibi yüksek tuzlulukta

işlevsel olan ekzoenzimleri, yüksek tuz konsantrasyonunda makromoleküllerin yıkımı

ile ilgili biyoteknolojik proseslerde kullanılabilirler (Chaga et al. 1993, Ventosa ve

Nieto 1995, Margesin ve Schinner 2001).

Düşük su aktivitesine adapte olan halofilik enzimlerin, endüstriyel organik sentezlerdeki

yüksek özgüllükleri, stereoözgüllükleri ve etkinliklerinden dolayı önemleri artmaktadır

(Hough ve Danson 1989, Danson ve Hough 1997, Sellek ve Chaudhuri 1999). Diğer

yandan hidrokarbonları parçalama yeteneğine sahip halofilik arkeler petrol kazalarında

dökülen petrolün bioremediasyonunda kullanılabilirler (Bertrand et al. 1990, Emerson

et al. 1994). İnsektisit, lindan, DDT veya triklorofenoller gibi halojenli organik

bileşiklerrin yüksek konsantrasyonlarında üreyebilen halofilik arkelerin patentli

proseslerde de kullanıldığı belirtilmiştir (Margesin ve Schinner 2001).

H. salinarum NRC-1 suşunun, lipit içermeyen protein yapısında zara sahip olan ve suya

geçirgen olmayıp gazlara geçirgen olan, yüksek oranda stabilite gösteren ve proteolitik

yıkıma dayanıklı non-toksik gaz keseciklerinin epitop düzenlenmesi amacıyla yeni bir

sistem olarak geliştirilmesi düşünülmüştür (Stuart et al. 2001).

Halosinlerin, tuzlanmış yiyeceklerin veya derilerin tabaklanması esnasında meydana

gelebilen bakteriyel bozunumun kontrolü amacıyla kullanılabilecekleri ve bunlardan

HalH7 halosininin halobakterilerdeki gibi memelilerde de benzer etkiye sahip olduğu

belirtilmiştir (Litchfield 2002). H. salinarum’daki 84 kD luk bir protein, kanser

26

hastalarının serumlarındaki insan c-myc onkogen ürününe karşı antikor elde etmek için

bir antijen olarak kullanılmış ve bu proteinin bazı kanser tiplerinin saptanmasında

kullanılabileceği belirtilmiştir (Rodriguez-Valera 1992).

27

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1. Materyal

3.1.1. Halofilik arkeler

Türkiye’den halofilik arkelerin izolasyonu amacı ile 6 farklı tuzlu bölge belirlenmiştir:

1) Tuz gölü-Şereflikoçhisar-Ankara (Anonim 1999), 2) Acıgöl-Denizli (M.T.A. derleme

rapor 1955, Yurdakulol et al. 1996), 3) Salda gölü-Burdur (Braithwaite ve Zedef 1994),

4) Seyfe gölü-Kırşehir (Eyüboğlu 1995, Sözeri 2000), 5) Tuzla gölü-Kayseri (Kibar

1999), 6) Bolluk gölü-Konya (Canik 1988, Anonim 1999). Yukarıdaki 6 farklı gölden

2000-2001 yıllarında yaz-sonbahar döneminde toprak, su ve tuz kütlesi örnekleri steril

plastik kaplar içerisine alınmış, laboratuvara bekletmeden transfer edilmiştir. Standart

halofilik arke suşu olarak kullanılan Halobacterium salinarum, Haloarcula

marismortui, Haloarcula vallismortis, Haloferax mediterranei, Haloferax volcanii ve

Natrialba asiatica Prof. Dr. Aharon Oren’den (Division of Microbial and Molecular

Biology, The Institute of Life Sciences and the Moshe Shilo Minerva center for Marine

Biochemistry, The Hebrew Universty of Jerusalem, Jerusalem, Israil), Halococcus

morrhuae CCM 537 Çek Mikroorganizma Kolleksiyonundan (Czech Collection of

Microorganisms, Masaryk Universty Brno, Çek Cumhuriyeti) ve Haloarcula

vallismortis DSM 3756 Alman Mikroorganizma Kültür Kolleksiyonu’dan temin

edilmiştir. Öbakteriyel standart suş olarak da Enterococcus faecium CDC NJ-1 Ankara

Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Bakteriyoloji Laboratuvarından temin

edilmiştir. Türkiye’den izole edilen halofilik arkebakteri izolatları ve standart suşlar

%20 gliserollü ortamda -70°C’de saklanmıştır (Xin et al. 2000).

3.1.2 Besiyeri

Tuz, toprak ve su örneklerinden halofilik arkebakterilerin izolasyonu ve standart

suşların kültürü amacıyla Sehgal-Gibbons besiyeri (SG) (Gonzalez et al. 1978,

Montalvo-Rodriguez et al. 2000) kullanılmış olup 250g/L NaCl, 20g/L MgSO4.7H2O,

28

2g/L KCl, 3g/L Sodyum sitrat, 0.023g/L FeSO4.7H2O, 7.5g/L Casamino asit, 1g/L

Yeast extract, içeren besiyerinin pH’ı 1N KOH ile 7.3’e ayarlanmıştır.

3.1.3. Mikroskobik inceleme

İzolatların hücre morfolojisi ve hareket yeteneklerinin belirlenmsi ve fotoğraf

çekimlerinde Olympus Vanox Mikroskop (faz kontrast ataçmanlı) ve Olympus Pm-10A

fotoğraf ataçmanı, Koloni morfolojisinin belirlenmesinde ise Stereo mikroskop

(Euromex Arnhem) kullanılmıştır.

3.1.4. Antibiyotikler

İzolatların duyarlılıklarını belirlemek için Norfloksasin (10µg), Tetrasiklin (30µg),

Bazitrasin (10 IU), Rifampisin (5µg), Azitromisin (15µg), Ampisilin (10µg), Neomisin

(30µg), Kloramfenikol (30µg), Penisilin G (10 IU), Vankomisin (30µg), Novobiyosin

(30µg) (OXOID) antibiyotikleri kullanılmıştır.

3.1.5. İnce tabaka kromatografisi

İnce tabaka kromatografisi için Liyofilizasyon cihazı (Edwards), metanol, toluen,

sülfürik asit, hekzan, silikajel plakaları (Merck, 60F254, 20x20, alüminyum plaka), petrol

eteri, dietil eter, dodekamolibdofosforik asit, etanol kullanılmıştır.

3.1.6. Elektroforez

Protein elektroforezi için, sodyum dodesil sülfat (SDS), merkaptoetanol, bromofenol

mavisi, akrilamid-bisakrilamid monomerleri, trizma base, amonyum per sülfat (APS),

tetra metil etilen diamin (TEMED), glisin, coomassie brillant mavisi R250 (Sigma B-

0149), molekül ağırlık standardı (Sigma MW-SDS-200) ve gliserol, izopropil alkol,

asetik asit, bütanol, hidroklorik asit (Merck) kimyasalları ile dikey elektroforez tankı,

güç kaynağı, ışıklı tabla kullanılmıştır.

29

Agaroz jel elektroforez için, Tris, Etilen diamin tetra asetik asit (EDTA), Sodyum

klorür, Tris-HCl, SDS, Sodyum asetat, bromofenol blue, etanol, RNaz A, Agaroz,

etidyum bromür ve supercoiled ccc DNA marker (Sigma D5292) ile yatay elektroforez

tankı, güç kaynağı, Ray Test görüntüleme ve analiz cihazı ve Diana Densitometrik

Analiz Programı kullanılmıştır.

3.2. Yöntem

3.2.1. Halofilik arkelerin izolasyonu ve kültürü

Tuzlu bölgelerden toplanan toprak ve tuz örnekleri steril şartlar korunarak 10-13 g

tartılmış, 50 mL steril tuz çözeltisi ile (SG besiyerinin inorganik kısmı) süspanse

edilmiştir. Süspansiyonlardan ve su örneklerinden katı ve sıvı SG ortamlarına ekim

yapılarak, sıvı ortamlar 120 rpm’de çalkalamalı olarak 37 °C’de üretilmiştir. Hem

toprak hem de sıvı örneklerinden ekim yapılan gelişmiş kültürlerden tekrar katı

ortamlara ekim yapılmıştır. İnkübasyonun yaklaşık olarak 3. gününden itibaren

besiyerlerinde pigmentsiz koloniler gözlenmiş, 10-15 gün sonra ise pembe-kırmızı

renkte koloniler gözlenmiştir. Farklı morfoloji gösteren kolonilerden seçim yapılarak

besiyerlerine tekrar ekilmiş, saf kültürler hazırlanarak saflık kontrolleri koloni

morfolojisi ve faz kontrast mikroskobisi çalışmaları ile yapılmıştır.

3.2.2. Koloni morfolojisi ve pigmentasyon

İzolatların koloni morfolojisi, pigmentasyonu ve mukoid koloni özelliği standart

kriterlere göre, katı ortamda 7 gün geliştirilmiş kültürler kullanılarak belirlenmiştir.

Koloni morfolojileri mikrometrik okülerli, 4X büyütmeli stereo mikroskop kullanılarak

yapılmış pigmentasyon ise görsel olarak belirlenmiştir.

30

3.2.3. Gram boyama ve faz-kontrast mikroskobu

Gram boyama Dussault (1955)’e göre yapılmış 7 günlük gelişmiş sıvı kültürlerden

hazırlanan preparatlar %2 asetik asitle ile fikse edilip boyama işlemi yapılarak

immersiyon objektifi ile ışık mikroskobunda incelenmiştir.

Hücre morfolojleri ve hareket 7 gün geliştirilen sıvı kültürlerden hazırlanan preparatlar

immersiyon büyütmeli faz kontrast mikroskobunda incelenerek belirlenmiştir.

3.2.4. Biyokimyasal testler

Biyokimyasal testlerde Oren et al. (1997) , Colwell et al. (1979) ve Tindall (1992)’a

göre belirlenen biyokimyasal testler yapılmıştır. Yedi günlük katı ve sıvı kültürler

kullanılmış olup testler 37 °C’ de ve sıvı ortamda 120 rpm’de yapılmıştır. Testler 5

farklı cinse ait 7 farklı Halofilik arke türü ve pozitif kontrol bakteriler kullanılarak 3

tekrarlı olarak yapılmıştır.

Katalaz aktivitesi, SG agarda geliştirilmiş 7 günlük kültür üzerine %3’lük H2O2

dökülerek belirlenmiştir (Holding ve Collee 1971, Rodriguez-Valera et al. 1983,

Franzmann et al. 1988, Takashina et al. 1990, Arda 1997, Montalvo-Rodriguez et al.

1998, Montalvo-Rodriguez et al. 2000).

Oksidaz aktivitesi, SG agarda geliştirilmiş 7 günlük kültürlerle %1 tetrametil-p-

fenilendiamin ayıracı kullanılarak saptanmıştır (Holding ve Collee 1971, Gonzalez et al.

1978, Franzmann et al. 1988, Takashina et al. 1990, Montalvo-Rodriguez et al. 2000).

Jelatin ve Tween 80 hidrolizi, Gutierrez ve Gonzalez (1972)’e göre yapılmış olup 14

günlük inkübasyon sonrası jelatin hidrolizini belirlemek için Frazier’s ayracı

kullanılmıştır.

31

Nişasta hidrolizi, %1 oranında çözünür nişasta içeren SG agarda geliştirilmiş 14 günlük

kültürler ve Lugol ayracı kullanılarak belirlenmiştir (Holding ve Collee 1971, Takashina

et al. 1990, Temiz 1994, Arda 1997, Montalvo-Rodriguez et al. 1998).

Kazein hidrolizi, %0,15 oranında Skim Milk Powder içeren SG agar besiyerinde

geliştirilmiş 14 günlük kültürler ve %1 HCI kullanılarak belirlenmiştir (Tomlinson ve

Hochstein 1976, Gonzalez et al. 1978, Arda 1997).

İndol oluşumu, %1 Tripton içeren SG sıvı besiyerinde geliştirilmiş 10 günlük kültürler

üzerine Kovac’s ayracı eklenerek tayin edilmiştir (Holding ve Collee 1971, Rodriguez-

Valera et al. 1983, Temiz 1994, Arda 1997).

Sodyum tiyosülfattan (Na2S2O3.5H2O) H2S üretimi, izolatların %0.5 sodyum tiyosülfat

ve kurşun asetat emdirilmiş kağıt şeritler içeren SG sıvı besiyerinde geliştirilmesiyle

saptanmıştır (Holding ve Collee 1971, Franzmann et al. 1988, Takashina et al. 1990,

Arda 1997).

Nitratın nitrite indirgenmesi ve gaz oluşumu, %1 oranında KNO3 içeren Durham tüpü

bulunan SG broth besiyerindeki kullanılmıştır. 10 günlük kültürlere %1 sülfanilik asit

ve %0.6 α-naftilamin ayraçları eklenmesiyle belirlenmiştir (Holding ve Collee 1971,

Tomlinson ve Hochstein 1976, Gonzalez et al. 1978, Arda 1997, Montalvo-Rodriguez

et al. 1998, Xin et al. 2000).

Şekerlerden asit üretiminin belirlenmesi amacıyla 7 farklı şeker kullanılmıştır: D(+)-

glukoz, D(-)-fruktoz, L(+)-arabinoz, D(+)-galaktoz, sükroz, D(+)-ksiloz, maltoz.

Şekerler filtre edilerek, %1 oranında olacak şekilde steril besiyerine eklenmiş 12-14

günlük inkübasyon sonrası kültürlere 1 damla fenol red damlatılarak asit üretimi

saptanmıştır (Rodriguez-Valera et al. 1983, Torreblanca et al. 1986, Oren et al. 1999,

Xin et al. 2000)

Arjinin varlığında anaerobik üremenin belirlenmesi amacıyla, 5g/L L-arjinin içeren SG

besiyeri vida kapaklı kültür tüplerine doldurularak ekim yapılmış ve 5-7 gün karanlıkta

32

inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası üremenin varlığı 600 nm’de turbidite okunarak

saptanmıştır. Kontrol için arginin içermeyen besiyerlerine ekim yapılmıştır (Oren ve

Litchfield 1999, Hartmann et al. 1980).

3.2.5. Antibiyogram testi

İzolatların antibiyotik duyarlılık testleri disk difüzyon yöntemi ile yapılmıştır (Bonelo et

al. 1984, Montalvo-Rodriguez et al. 2000). Sıvı ortamda üretilen kültürlerin

Spektrofotometrede 520 nm dalga boyunda absorbansları 0,8’e ayarlanmış

süspansiyondan steril eküvyonla SG agar yüzeyine ekim yapılmış ve antibiyotik diskleri

steril pens ile besiyeri yüzeyine yerleştirildikten sonra plaklar 37 °C’de 12-14 gün

inkübe edilmiştir.

3.2.6. İnce tabaka kromatografisi

Arkeal lipit varlığının belirlenmesi amacı ile, izolatların tüm hücre asit

metanolizatlarının ince tabaka kromatoğrafik analizi yapılmıştır (Ross et al. 1981). SG

sıvı besiyerinde üretilen kültürlerden hücre peleti santrifüjle toplanarak liyofilize edilen

pelet üzerine 3mL metanol, 3mL toluen ve 0,1 mL konsantre sülfürik asit eklenerek 50

°C’de 15-18 saat bekletilmiştir. Hücre zarı lipitlerinin ekstraktsiyonu için karışım

üzerine 1,5 mL hekzan eklenmiş ve ekstraklar silika gel plakalarına yüklenerek petrol

eteri/dietil eter (85:15) karışımında ayırımları gerçekleştirilmiştir. Plakalar,

dodekamolibdofosforik asit çözeltisi püskürtülerek lipit lekeleri görünür hale gelinceye

kadar 150 °C’de ısıtılmıştır. Lipit yapıları sarı zemin üzerinde koyu mavi renkli spotlar

halinde görünür hale gelmiştir. Standart olarak ester bağlı öbakteriyel yağ asit yapısı ile

karşılaştırmak amacıyla Enteroccus faecium CDC NJ-1 ve Tuz gölünden izole edilen

halofilik öbakteri izolatı kullanılmıştır.

3.2.7. Protein ekstraksiyonu

Toplam 95 halofilik arke izolatı ve 7 standart suşun tüm hücre SDS-PAGE analizleri

Hesselberg ve Vreeland (1995) ve Laemmli (1970)’ye göre yapılmıştır. İzolatların 37

33

°C’de 3-4 gün süreyle 3 kez çalkalamalı olarak inkübe edilmesiyle senkron kültürleri

hazırlanmıştır. Üç mL’lik sıvı kültürlerden santrifüjle toplanan peletler -70°C’de

saklanmış peletlerin üzerine SDS-örnek tamponundan (Laemmli 1970) 50µL eklenerek,

7 dakika kaynar su banyosunda tutulmuştur. Ekstraklardaki protein miktarının yarı

kantitatif tayini için spot test yapılmıştır (Esen 1978).

3.2.7.1. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)

Laemmli (1970)’e göre yapılan SDS-PAGE’de %4’lük yığma jeli ve %10’luk ayırma

jeli kullanılmış, örnekler yüklendikten sonra sırasıyla 25 ve 30 mA’de elektroforez

yürütülmüş, jel bir gece Coomassie Brillant mavisinde boyandıktan sonra dekolorize

edilmiş ve fotoğrafı çekilmiştir.

3.2.7.2. Proteinlerin moleküler kütlelerinin belirlenmesi

Molekül kütleleri hesaplanacak olan protein bantlarının Rf (oransal hız) değerleri,

standart proteinlerin Rf değerleri kullanılarak Excel programında çizilen yarı logaritmik

grafiğin kalibrasyon eğrisi aracılığı ile hesaplanmıştır.

3.2.7.3. Benzerlik matriksi ve protein ilişkisine göre benzerlik dendogramı

Bu amaçla, majör protein bantları değerlendirmeye alınmış bulunma veya bulunmama

durumuna göre bantlar "1" veya "0"şeklinde değerlendirilme yapılarak benzerlik

matriksi oluşturulmuştur.

Bu amaçla Nei ve Li (1979) tarafından geliştirilen ve aşağıda verilen Nei ve Li

Katsayısı (coefficient-NLcij) kullanılarak iki izolat arasındaki benzerlik

karşılaştırılmaları yapılmıştır.

(Nei ve Li Katsayısı) NLcij = [2N11/(2N11+N10+N01)]

N11 : i ve j bireylerinin her ikisindede bulunan bant sayısı

34

N10 : sadece i bireyinde bulunan bant sayısı

N01 : sadece j bireyinde bulunan bant sayısı

İzolatlar arasındaki protein profili benzerliklerine dayalı dendogram verileri MVSP

Version 3.1 (Multi-Variate Statistical Package) programı kullanılarak "UPGMA" analizi

ile belirlenmiştir (Sneath ve Sokal 1973).

3.2.8. Plazmid izolasyonu

SG broth besiyerinde 37 °C’de çalkalamalı olarak 4 gün geliştirilen kültürlerden 1,5 mL

alınarak 13000 devir/dk.’da 3 dakika santrifüj edilerek pelete 330 µl Tris-EDTA

(50mM:1mM, pH:8) ve 48.2 µL Tris-EDTA-1 (50mM:0.25mM, pH:8) tamponlarından

ilave edilerek karıştırılmıştır. Bunun üzerine %20’lik SDS çözeltisinden 27,6 µL

eklenerek karıştırılmış ve 37 °C’lik su banyosunda 10 dakika bekletilmiştir. Bu süre

sonunda tüpler 30 saniye yüksek devirde vortekslenmiş taze hazırlanmış 3 N NaOH

çözeltisinden 27,6 µL ilave edilerek tüpler yavaşça 10 dakika süresince alt üst

edilmiştir. Daha sonra 49,6 µL 2M Tris-HCl (2M, pH:7) çözeltisi eklenerek 5 dakika

tekrar alt üst edilerek karıştırılmıştır. Tüplere +4°C’deki 5M NaCl çözeltisinden 71.7

µLve %3 NaCl ile doyurulmuş Fenol çözeltisinden 700 µL ilave edilerek +4°C’de

15000 devir/dk.’da 15 dakika santrifüj edilmiştir. Oluşan üst faz tüplere alınarak üzerine

700 µL kloroform/izoamil alkol (24:1) çözeltisinden eklenmiş ve +4°C’de 15000

devir/dk.’da 7 dakika santrifüj edileerek üst faz tüplere alınmış ve üzerine eşit hacimde

soğuk etanol eklenmiştir. Bir gece -20°C’de bekletildikten sonra plazmid DNA 15000

devir/dk.’da 20 dakika santrifüj edilerek çöktürülmüştür. Üst faz dökülerek DNA peleti

havada kurutulmuştur. Plazmid DNA pelletleri elektroforez uygulamasından önce 20

µL Tris-EDTA-2 (10mM:1mM, pH:7.5) çözeltisi ile süspanse edilmiş ve 2 µL RNaz

stok çözeltisinden ilave edilerek 37 °C’lik su banyosunda 45 dakika inkübe edilmiştir

(Anderson ve McKay 1983, Dyall-Smith 2001).

35

3.2.8.1. Agaroz Jel elektroforezi

Plazmid DNA örneklerinin elektroforezi, yatay elektroforez tankında, %0.7’lik agaroz

jel ve Tris-Asetat tamponu kullanılarak yapılmıştır. RNaz’la 37 °C’de inkübe edilen

plazmid DNA örnekleri üzerine 2 µL bromofenol mavisi izleme boyası ilave edilerek

karıştırılmış ve mikropipet aracılığı ile 20 µL olacak şekilde kuyucuklara yüklenmiştir.

Elektroforez 120V’da sabit akımla 3.5-4 saat yürütülmüş işlem bittikten sonra jel, 0,2

µg/mL etidyum bromür içeren Tris-asetat tamponunda 1 saat bekletilmiştir. Boyama

işlemi sonrası jeller, Jel görüntüleme sistemi ile bilgisayar ortamında incelenerek

görüntüleri kaydedilmiştir (Meyers et al. 1976).

3.2.8.2. Plazmid büyüklüklerinin saptanması

Plazmidlerin büyüklüklerinin saptanmasında, 2.067-16.210 baz çifti arasında değişen 11

süpersarmal parça içerikli ccc DNA marker (Sigma D-5292) kullanılmıştır. Plazmidlerin

moleküler büyüklükleri hesaplanırken marker DNA’ların jel üzerindeki hareketi ile

büyüklüklerinin logaritmaları arasında oluşturulan doğrusal ilişkiden yararlanılmıştır.

Süpersarmal marker DNA moleküllerinin agaroz jel fotoğrafları üzerindeki göç

aralıkları ile bunlara ait büyüklüklerin logaritması alınarak eğriler oluşturulmuştur. Her

farklı jel fotoğrafı için istatistiki analizler kullanılarak eğrinin eğimi ile korelasyon

katsayısı hesaplanmış ve halofilik arke izolat ve standartlarından elde edilen plazmid

DNA’ların molekül ağırlıkları saptanmıştır (Macrina et al. 1978).

Moleküler büyüklük (W)= Antilog10[ I. (α-G)+H)]

X= Marker DNA moleküllerinin Agaroz jel üzerindeki göç aralığı (mm)

Y= Marker DNA moleküllerinin büyüklüğü (kb)

A= X1 + X2 + X3 +.......................................................................+ Xn

B= X12 + X2

2 + X32 +...................................................................+ Xn

2

C= log10Y1 + log10Y2 +log10Y3 +.............................................+log10Yn

D= (log10Y1)2 + (log10Y2)2 +(log10Y3)2 +.................................+(log10Yn)2

E= X1(log10Y1) +X2( log10Y2) +X3(log10Y3) +.........................+Xn(log10Yn)

36

G=Ortalama X=A/N

H=Ortalama Y=C/N

α= Moleküler büyüklüğü bilinmeyen plazmidin jel üzerinde göçü (mm)

Moleküler büyüklük(W)= ( )[ ]HGI +−α.

Eğrinin Eğimi (I)= ( )( )AGB

CGE..

−−

Korelasyon katsayısı(J)= ( )( )[ ] ( )[ ]AGBCHD

CGE...

.−−

−

37

UPGMA

Nei & Li's Katsayısı

Halobacter ium salinar um A263A A263BHaloar cula m ar ism or tuiHaloar cula vallism or tis DSMZ Halofer ax volcanii Natr ialba aisatica Halofer ax m editer r anei A317 A440Halococcus m or r huae CCM 5 E 133 A82 C13 C15 B19 B65A29F100F89F56A312E36C22B88C35D22F92F73E22F23F36D58AA75A182B71A87A407E20A206BA206AC37A405F42C36B54AA62AE57E49AB38BB38AB77AB77BB36A471E92BE92AA337B44AB44BD83BD83AD113A283A235A420B85A212A85F98E107D34E7D118AB53D50D91E55D25D107F84C23A43A347B74D6D19D74D108D31A137A181AA181BF4AF75AF5A138B49B45A191F30AA128

0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1

6

4

1

Şekil 4.34. Halofilik arke izolat ve standart suşlarının SDS-PAGE protein profillerine göre oluşturulan benzerlik dendogramı

2

3

5

7

8
− −−
−−

−−

−−

−

−−

−

−

Çizelge 4.8. Halofilik arke izolat ve standart suşlarının SDS-PAGE protein profillerine göre olu Hb. sal.: Halobacterium salinarum , N. asi.: Natrialba asiatica , Hf. vol.: Haloferax v Haloarcula marismortui , Haloarcula vallismortis DSM 3756, Hf. med.: Haloferax Hc. Mor: Halococcus morrhuae CCM 537

Hb. sal. A263A A263B N. asi. Hf. vol. H. mari. H.vall. Hf. med. A317 A440 Hc. mor. E133Hb. sal. 1A263A 0.8 1A263B 0.8 1 1Nat. Asi. 0.444 0.393 0.393 1Haf. vol. 0.471 0.453 0.453 0.426 1Harc. mari. 0.533 0.581 0.581 0.464 0.528 1Harc.vall. 0.523 0.537 0.537 0.525 0.448 0.746 1Haf. med. 0.3 0.323 0.323 0.393 0.377 0.484 0.507 1A317 0.323 0.438 0.438 0.414 0.436 0.5 0.493 0.813 1A440 0.426 0.413 0.413 0.491 0.444 0.508 0.529 0.603 0.585 1Hc. Morr. 0.381 0.523 0.523 0.542 0.357 0.523 0.571 0.523 0.597 0.545 1E133 0.377 0.436 0.436 0.367 0.391 0.509 0.5 0.473 0.456 0.536 0.552 1A82 0.377 0.364 0.364 0.449 0.391 0.436 0.433 0.473 0.561 0.464 0.552 0.583C13 0.456 0.475 0.475 0.34 0.36 0.339 0.313 0.407 0.426 0.533 0.484 0.423C15 0.456 0.475 0.475 0.34 0.36 0.339 0.313 0.407 0.426 0.533 0.484 0.423B19 0.566 0.509 0.509 0.408 0.391 0.436 0.4 0.473 0.421 0.536 0.483 0.458B65 0.557 0.508 0.508 0.456 0.444 0.476 0.471 0.54 0.554 0.563 0.545 0.429A29 0.302 0.255 0.255 0.327 0.217 0.218 0.4 0.327 0.246 0.321 0.345 0.25F100 0.321 0.379 0.379 0.423 0.286 0.31 0.349 0.414 0.433 0.373 0.459 0.275F89 0.321 0.379 0.379 0.423 0.286 0.31 0.349 0.414 0.433 0.373 0.459 0.275F56 0.321 0.379 0.379 0.423 0.286 0.31 0.349 0.414 0.433 0.373 0.459 0.275E36 0.444 0.464 0.464 0.36 0.255 0.357 0.459 0.429 0.517 0.561 0.441 0.367C35 0.379 0.4 0.4 0.481 0.275 0.333 0.492 0.4 0.419 0.525 0.571 0.415D22 0.255 0.246 0.246 0.314 0.167 0.281 0.387 0.386 0.271 0.31 0.4 0.32A312 0.32 0.308 0.308 0.304 0.186 0.231 0.316 0.423 0.37 0.415 0.327 0.267C22 0.351 0.373 0.373 0.377 0.24 0.203 0.281 0.475 0.492 0.433 0.419 0.346B88 0.436 0.351 0.351 0.392 0.25 0.281 0.355 0.421 0.305 0.31 0.333 0.44A75 0.377 0.4 0.4 0.245 0.217 0.145 0.233 0.145 0.14 0.25 0.241 0.333F92 0.407 0.426 0.426 0.182 0.154 0.295 0.424 0.262 0.254 0.29 0.313 0.222F73 0.361 0.381 0.381 0.14 0.185 0.286 0.412 0.222 0.215 0.313 0.333 0.25E22 0.36 0.423 0.423 0.174 0.186 0.231 0.316 0.077 0.111 0.151 0.327 0.222F23 0.345 0.367 0.367 0.259 0.196 0.233 0.369 0.267 0.194 0.23 0.349 0.34F36 0.291 0.351 0.351 0.431 0.083 0.386 0.387 0.281 0.271 0.379 0.433 0.24A87 0.259 0.286 0.286 0.2 0.34 0.286 0.328 0.25 0.276 0.211 0.339 0.327A407 0.259 0.286 0.286 0.2 0.34 0.286 0.328 0.25 0.276 0.211 0.339 0.327E20 0.235 0.34 0.34 0.128 0.227 0.302 0.31 0.189 0.218 0.259 0.357 0.304F42 0.214 0.31 0.31 0.269 0.327 0.172 0.19 0.138 0.267 0.271 0.262 0.235C36 0.339 0.459 0.459 0.327 0.346 0.262 0.303 0.262 0.381 0.419 0.313 0.296A206B 0.246 0.373 0.373 0.302 0.24 0.237 0.375 0.271 0.328 0.233 0.355 0.231A206A 0.246 0.373 0.373 0.302 0.24 0.237 0.375 0.271 0.328 0.233 0.355 0.231B38B 0.226 0.255 0.255 0.286 0.304 0.182 0.267 0.255 0.246 0.286 0.138 0.083B38A 0.226 0.255 0.255 0.286 0.304 0.182 0.267 0.255 0.246 0.286 0.138 0.083B77A 0.226 0.255 0.255 0.286 0.304 0.182 0.267 0.255 0.246 0.286 0.138 0.083B77B 0.226 0.255 0.255 0.286 0.304 0.182 0.267 0.255 0.246 0.286 0.138 0.083B36 0.237 0.361 0.361 0.255 0.231 0.295 0.303 0.164 0.19 0.258 0.313 0.37A471 0.241 0.233 0.233 0.259 0.196 0.1 0.246 0.2 0.258 0.262 0.254 0.264B54A 0.281 0.373 0.373 0.302 0.24 0.339 0.406 0.373 0.459 0.367 0.355 0.385A62A 0.339 0.393 0.393 0.364 0.192 0.361 0.485 0.262 0.349 0.355 0.438 0.444E49A 0.305 0.393 0.393 0.364 0.192 0.328 0.485 0.328 0.413 0.387 0.438 0.407E57 0.351 0.441 0.441 0.377 0.2 0.339 0.469 0.237 0.328 0.367 0.452 0.423E92B 0.345 0.333 0.333 0.444 0.196 0.367 0.431 0.367 0.355 0.393 0.381 0.264E92A 0.345 0.333 0.333 0.444 0.196 0.367 0.431 0.367 0.355 0.393 0.381 0.264D83B 0.286 0.246 0.246 0.237 0.179 0.277 0.371 0.369 0.299 0.455 0.294 0.241D83A 0.286 0.246 0.246 0.237 0.179 0.277 0.371 0.369 0.299 0.455 0.294 0.241D113 0.286 0.246 0.246 0.237 0.179 0.277 0.371 0.369 0.299 0.455 0.294 0.241F98 0.327 0.281 0.281 0.392 0.417 0.281 0.355 0.351 0.271 0.276 0.3 0.28E107 0.208 0.16 0.16 0.182 0.244 0.2 0.218 0.2 0.154 0.314 0.226 0.326A212 0.255 0.316 0.316 0.275 0.333 0.316 0.258 0.351 0.407 0.345 0.333 0.28D34 0.14 0.203 0.203 0.226 0.12 0.237 0.313 0.271 0.262 0.233 0.323 0.308

ş

m

A82

10.4230.4230.3750.4640.2920.3530.3530.3530.2860.377

0.20.2220.2690.280.250.2590.250.2220.2640.280.1630.1630.2610.2350.2960.2690.2690.1670.1670.1670.1670.1480.1510.2690.3330.3330.3460.3020.3020.2070.2070.2070.240.1860.280.269

A85 0.314 0.264 0.264 0.213 0.273 0.189 0.31 0.264 0.255 0.37 0.214 0.13A283 0.508 0.525 0.525 0.327 0.308 0.361 0.455 0.295 0.286 0.355 0.344 0.37A235 0.508 0.525 0.525 0.327 0.308 0.361 0.455 0.295 0.286 0.355 0.344 0.37B44A 0.25 0.241 0.241 0.269 0.122 0.207 0.254 0.241 0.233 0.271 0.328 0.196B44B 0.25 0.241 0.241 0.269 0.122 0.207 0.254 0.241 0.233 0.271 0.328 0.196A420 0.345 0.333 0.333 0.444 0.471 0.433 0.462 0.367 0.387 0.426 0.349 0.34B85 0.345 0.333 0.333 0.444 0.471 0.433 0.462 0.367 0.387 0.426 0.349 0.34A137 0.321 0.241 0.241 0.269 0.286 0.31 0.381 0.31 0.267 0.339 0.295 0.392A181A 0.321 0.241 0.241 0.269 0.286 0.31 0.381 0.31 0.267 0.339 0.295 0.392A181B 0.321 0.241 0.241 0.269 0.286 0.31 0.381 0.31 0.267 0.339 0.295 0.392F4A 0.321 0.241 0.241 0.269 0.286 0.31 0.381 0.31 0.267 0.339 0.295 0.392F75A 0.321 0.241 0.241 0.269 0.286 0.31 0.381 0.31 0.267 0.339 0.295 0.392B45 0.231 0.222 0.222 0.292 0.311 0.222 0.203 0.222 0.25 0.218 0.351 0.298D58A 0.464 0.379 0.379 0.423 0.204 0.276 0.317 0.276 0.267 0.271 0.262 0.235F5 0.259 0.357 0.357 0.2 0.17 0.357 0.262 0.214 0.31 0.281 0.441 0.408A138 0.421 0.441 0.441 0.302 0.32 0.339 0.406 0.271 0.328 0.3 0.452 0.423B49 0.379 0.4 0.4 0.407 0.392 0.333 0.4 0.3 0.355 0.295 0.508 0.453D50 0.2 0.192 0.192 0.261 0.233 0.231 0.281 0.269 0.222 0.453 0.109 0.311E7 0.113 0.182 0.182 0.163 0.217 0.255 0.333 0.327 0.316 0.286 0.276 0.208D118A 0.37 0.357 0.357 0.24 0.255 0.321 0.361 0.214 0.207 0.351 0.305 0.204B53 0.32 0.308 0.308 0.087 0.14 0.192 0.175 0.192 0.222 0.264 0.255 0.133D19 0.28 0.308 0.308 0.261 0.326 0.385 0.246 0.192 0.296 0.302 0.218 0.311D74 0.28 0.308 0.308 0.261 0.326 0.385 0.246 0.192 0.296 0.302 0.218 0.311D108 0.28 0.308 0.308 0.261 0.326 0.385 0.246 0.192 0.296 0.302 0.218 0.311D31 0.255 0.281 0.281 0.275 0.375 0.316 0.29 0.281 0.203 0.379 0.267 0.32E55 0.302 0.291 0.291 0.163 0.217 0.327 0.367 0.291 0.246 0.321 0.31 0.25A43 0.29 0.281 0.281 0.172 0.291 0.313 0.232 0.344 0.273 0.4 0.239 0.211A347 0.286 0.338 0.338 0.237 0.321 0.369 0.286 0.338 0.328 0.424 0.294 0.31A182 0.31 0.3 0.3 0.148 0.275 0.267 0.308 0.2 0.258 0.393 0.19 0.302B71 0.321 0.31 0.31 0.192 0.163 0.241 0.349 0.241 0.2 0.169 0.328 0.235C37 0.327 0.421 0.421 0.431 0.333 0.421 0.452 0.386 0.339 0.379 0.4 0.24A405 0.327 0.351 0.351 0.314 0.25 0.281 0.355 0.351 0.373 0.31 0.433 0.32A337 0.305 0.295 0.295 0.364 0.192 0.23 0.273 0.295 0.286 0.29 0.375 0.185D25 0.154 0.222 0.222 0.125 0.222 0.222 0.203 0.222 0.214 0.291 0.281 0.298D107 0.321 0.379 0.379 0.269 0.163 0.276 0.317 0.241 0.233 0.305 0.295 0.314F84 0.259 0.286 0.286 0.28 0.213 0.214 0.23 0.25 0.172 0.211 0.237 0.082C23 0.276 0.3 0.3 0.222 0.196 0.267 0.277 0.3 0.258 0.295 0.222 0.302D91 0.308 0.259 0.259 0.333 0.311 0.37 0.373 0.407 0.357 0.436 0.281 0.383F30A 0.246 0.305 0.305 0.264 0.24 0.339 0.281 0.305 0.262 0.233 0.258 0.231D6 0.169 0.23 0.23 0.218 0.423 0.295 0.303 0.361 0.349 0.323 0.375 0.333A191 0.231 0.222 0.222 0.292 0.4 0.37 0.339 0.296 0.393 0.4 0.246 0.383A128 0.211 0.203 0.203 0.264 0.24 0.237 0.281 0.271 0.164 0.3 0.226 0.269

B74 0.2 0.29 0.29 0.25 0.264 0.452 0.358 0.419 0.406 0.413 0.338 0.4

Hb. sal. A263A A263B N. asi. Hf. vol. H. mari. H.vall. Hf. med. A317 A440 Hc. mor. E133

0.1740.2960.2960.2350.2350.3020.3020.4310.4310.4310.4310.4310.2550.2750.3270.3460.4150.1780.2080.1630.2220.2220.2220.2220.240.2080.2110.2070.2260.1570.280.320.2590.170.2350.2040.2640.340.1920.2220.3830.231

0.255

A82

şturulan benzerlik matriksivolcanii , H. mari:mediterranei ,

C13 C15 B19 B65 A29 F100 F89 F56 E36 C35 D22 A312 C22

11 1

0.654 0.654 10.667 0.667 0.857 10.308 0.308 0.333 0.357 10.364 0.364 0.471 0.475 0.627 10.364 0.364 0.471 0.475 0.627 1 10.364 0.364 0.471 0.475 0.627 1 1 10.453 0.453 0.531 0.526 0.408 0.654 0.654 0.654 10.386 0.386 0.377 0.393 0.453 0.5 0.5 0.5 0.556 10.37 0.37 0.32 0.345 0.52 0.566 0.566 0.566 0.431 0.655 10.408 0.408 0.444 0.415 0.4 0.667 0.667 0.667 0.652 0.4 0.511 10.321 0.321 0.346 0.333 0.385 0.618 0.618 0.618 0.566 0.491 0.407 0.531 10.37 0.37 0.4 0.379 0.48 0.604 0.604 0.604 0.392 0.4 0.5 0.468 0.630.346 0.346 0.375 0.357 0.417 0.51 0.51 0.51 0.408 0.264 0.36 0.444 0.4230.172 0.172 0.259 0.258 0.407 0.316 0.316 0.316 0.291 0.373 0.357 0.353 0.414

0.2 0.2 0.179 0.219 0.357 0.339 0.339 0.339 0.316 0.393 0.448 0.415 0.40.245 0.245 0.267 0.264 0.311 0.375 0.375 0.375 0.261 0.36 0.511 0.381 0.3270.281 0.281 0.302 0.295 0.302 0.393 0.393 0.393 0.333 0.414 0.545 0.44 0.5260.296 0.296 0.32 0.345 0.4 0.528 0.528 0.528 0.431 0.473 0.5 0.468 0.4070.302 0.302 0.327 0.281 0.204 0.269 0.269 0.269 0.32 0.296 0.275 0.13 0.3020.302 0.302 0.327 0.281 0.204 0.269 0.269 0.269 0.32 0.296 0.275 0.13 0.3020.24 0.24 0.348 0.296 0.217 0.286 0.286 0.286 0.426 0.314 0.25 0.233 0.240.291 0.291 0.275 0.339 0.314 0.296 0.296 0.296 0.308 0.286 0.189 0.125 0.2180.379 0.379 0.37 0.355 0.185 0.351 0.351 0.351 0.436 0.271 0.143 0.275 0.310.393 0.393 0.385 0.367 0.308 0.4 0.4 0.4 0.34 0.281 0.259 0.286 0.2860.393 0.393 0.385 0.367 0.308 0.4 0.4 0.4 0.34 0.281 0.259 0.286 0.2860.154 0.154 0.333 0.286 0.375 0.392 0.392 0.392 0.327 0.264 0.2 0.222 0.3460.154 0.154 0.333 0.286 0.375 0.392 0.392 0.392 0.327 0.264 0.2 0.222 0.3460.154 0.154 0.333 0.286 0.375 0.392 0.392 0.392 0.327 0.264 0.2 0.222 0.3460.154 0.154 0.333 0.286 0.375 0.392 0.392 0.392 0.327 0.264 0.2 0.222 0.3460.241 0.241 0.296 0.258 0.333 0.316 0.316 0.316 0.218 0.271 0.286 0.118 0.2410.351 0.351 0.264 0.262 0.189 0.214 0.214 0.214 0.333 0.31 0.182 0.24 0.3510.25 0.25 0.269 0.3 0.231 0.436 0.436 0.436 0.453 0.386 0.296 0.327 0.4640.31 0.31 0.296 0.323 0.37 0.421 0.421 0.421 0.473 0.407 0.321 0.275 0.4480.276 0.276 0.259 0.29 0.407 0.421 0.421 0.421 0.436 0.441 0.321 0.275 0.4830.321 0.321 0.308 0.333 0.385 0.436 0.436 0.436 0.453 0.386 0.259 0.286 0.4290.211 0.211 0.264 0.328 0.377 0.321 0.321 0.321 0.296 0.379 0.291 0.2 0.3860.211 0.211 0.264 0.328 0.377 0.321 0.321 0.321 0.296 0.379 0.291 0.2 0.3860.355 0.355 0.276 0.364 0.276 0.328 0.328 0.328 0.441 0.317 0.367 0.327 0.3230.355 0.355 0.276 0.364 0.276 0.328 0.328 0.328 0.441 0.317 0.367 0.327 0.3230.355 0.355 0.276 0.364 0.276 0.328 0.328 0.328 0.441 0.317 0.367 0.327 0.3230.222 0.222 0.28 0.31 0.28 0.302 0.302 0.302 0.235 0.255 0.192 0.255 0.4070.383 0.383 0.279 0.275 0.233 0.217 0.217 0.217 0.136 0.25 0.178 0.1 0.2130.444 0.444 0.32 0.379 0.24 0.302 0.302 0.302 0.235 0.218 0.192 0.17 0.370.214 0.214 0.231 0.3 0.308 0.255 0.255 0.255 0.075 0.316 0.222 0.163 0.321

B88 A75

10.52 10.321 0.370.31 0.4290.213 0.3560.473 0.4150.308 0.280.314 0.2450.314 0.2450.167 0.3480.151 0.3140.214 0.4810.259 0.3460.259 0.346

0.2 0.2920.2 0.2920.2 0.2920.2 0.292

0.286 0.3330.291 0.3020.37 0.3460.393 0.4070.357 0.370.37 0.4620.364 0.3020.364 0.3020.233 0.310.233 0.310.233 0.310.346 0.320.311 0.2330.346 0.280.37 0.385

0.32 0.32 0.261 0.222 0.391 0.327 0.327 0.327 0.298 0.235 0.208 0.233 0.520.379 0.379 0.37 0.484 0.37 0.351 0.351 0.351 0.364 0.339 0.25 0.275 0.310.379 0.379 0.37 0.484 0.37 0.351 0.351 0.351 0.364 0.339 0.25 0.275 0.310.291 0.291 0.314 0.407 0.314 0.407 0.407 0.407 0.385 0.25 0.264 0.333 0.40.291 0.291 0.314 0.407 0.314 0.407 0.407 0.407 0.385 0.25 0.264 0.333 0.40.421 0.421 0.34 0.426 0.302 0.321 0.321 0.321 0.407 0.345 0.327 0.32 0.3160.421 0.421 0.34 0.426 0.302 0.321 0.321 0.321 0.407 0.345 0.327 0.32 0.3160.327 0.327 0.392 0.339 0.431 0.296 0.296 0.296 0.346 0.393 0.264 0.25 0.1820.327 0.327 0.392 0.339 0.431 0.296 0.296 0.296 0.346 0.393 0.264 0.25 0.1820.327 0.327 0.392 0.339 0.431 0.296 0.296 0.296 0.346 0.393 0.264 0.25 0.1820.327 0.327 0.392 0.339 0.431 0.296 0.296 0.296 0.346 0.393 0.264 0.25 0.1820.327 0.327 0.392 0.339 0.431 0.296 0.296 0.296 0.346 0.393 0.264 0.25 0.1820.196 0.196 0.255 0.255 0.213 0.2 0.2 0.2 0.083 0.308 0.204 0.136 0.1570.255 0.255 0.314 0.305 0.353 0.333 0.333 0.333 0.308 0.393 0.377 0.375 0.40.377 0.377 0.327 0.281 0.163 0.231 0.231 0.231 0.16 0.222 0.118 0.174 0.2260.25 0.25 0.346 0.3 0.192 0.182 0.182 0.182 0.264 0.351 0.222 0.163 0.2140.316 0.316 0.377 0.393 0.226 0.214 0.214 0.214 0.185 0.345 0.255 0.16 0.2110.367 0.367 0.222 0.264 0.133 0.208 0.208 0.208 0.304 0.24 0.085 0.238 0.2860.269 0.269 0.292 0.321 0.167 0.235 0.235 0.235 0.327 0.34 0.2 0.178 0.3080.415 0.415 0.408 0.386 0.204 0.231 0.231 0.231 0.28 0.296 0.196 0.217 0.2640.367 0.367 0.311 0.302 0.089 0.125 0.125 0.125 0.174 0.16 0.128 0.19 0.2040.327 0.327 0.311 0.34 0.089 0.292 0.292 0.292 0.304 0.12 0.128 0.238 0.3270.327 0.327 0.311 0.34 0.089 0.292 0.292 0.292 0.304 0.12 0.128 0.238 0.3270.327 0.327 0.311 0.34 0.089 0.292 0.292 0.292 0.304 0.12 0.128 0.238 0.3270.259 0.259 0.2 0.241 0.2 0.302 0.302 0.302 0.235 0.255 0.231 0.298 0.2960.269 0.269 0.25 0.25 0.208 0.235 0.235 0.235 0.204 0.264 0.36 0.311 0.2690.459 0.459 0.421 0.4 0.281 0.3 0.3 0.3 0.241 0.226 0.237 0.37 0.2620.419 0.419 0.379 0.364 0.207 0.295 0.295 0.295 0.339 0.286 0.2 0.327 0.3230.351 0.351 0.264 0.295 0.264 0.286 0.286 0.286 0.333 0.241 0.109 0.24 0.2460.291 0.291 0.275 0.271 0.353 0.37 0.37 0.37 0.308 0.286 0.302 0.292 0.3640.407 0.407 0.44 0.448 0.28 0.415 0.415 0.415 0.314 0.291 0.308 0.383 0.2590.333 0.333 0.28 0.31 0.4 0.34 0.34 0.34 0.275 0.4 0.269 0.255 0.370.31 0.31 0.259 0.258 0.407 0.386 0.386 0.386 0.291 0.407 0.321 0.275 0.4830.353 0.353 0.17 0.182 0.085 0.16 0.16 0.16 0.167 0.269 0.204 0.273 0.2350.291 0.291 0.314 0.339 0.157 0.296 0.296 0.296 0.346 0.321 0.151 0.25 0.2910.264 0.264 0.204 0.246 0.204 0.269 0.269 0.269 0.12 0.259 0.235 0.217 0.2640.281 0.281 0.226 0.262 0.151 0.25 0.25 0.25 0.185 0.207 0.291 0.2 0.2810.235 0.235 0.298 0.291 0.17 0.32 0.32 0.32 0.375 0.269 0.163 0.364 0.3140.179 0.179 0.308 0.433 0.231 0.291 0.291 0.291 0.264 0.175 0.259 0.245 0.1790.241 0.241 0.222 0.355 0.333 0.281 0.281 0.281 0.182 0.441 0.393 0.196 0.2410.196 0.196 0.255 0.327 0.213 0.2 0.2 0.2 0.333 0.308 0.204 0.227 0.1960.179 0.179 0.231 0.233 0.269 0.255 0.255 0.255 0.34 0.246 0.333 0.204 0.25

0.237 0.237 0.327 0.349 0.255 0.276 0.276 0.276 0.357 0.333 0.281 0.269 0.271

C13 C15 B19 B65 A29 F100 F89 F56 E36 C35 D22 A312 C22

0.333 0.3480.321 0.370.321 0.370.302 0.3140.302 0.3140.218 0.3770.218 0.3770.34 0.2750.34 0.2750.34 0.2750.34 0.2750.34 0.2750.286 0.2130.491 0.3530.235 0.1630.296 0.1920.291 0.2260.34 0.3560.16 0.2080.235 0.2860.128 0.2670.255 0.2670.255 0.2670.255 0.2670.385 0.40.24 0.250.271 0.2110.233 0.2410.255 0.4910.453 0.4310.308 0.320.269 0.280.429 0.2960.286 0.2550.302 0.3140.275 0.2450.364 0.2640.286 0.2130.222 0.4230.179 0.2220.122 0.2130.259 0.423

0.211 0.218

B88 A75

F92 F73 E22 F23 F36 A87 A407 E20 F42 C36 A206B A206A

10.839 10.431 0.566 10.475 0.557 0.68 10.429 0.517 0.511 0.473 10.218 0.211 0.174 0.333 0.118 10.218 0.211 0.174 0.333 0.118 1 10.192 0.185 0.186 0.275 0.25 0.596 0.596 10.175 0.169 0.167 0.179 0.113 0.385 0.385 0.449 10.333 0.323 0.235 0.237 0.25 0.4 0.4 0.5 0.632 10.276 0.233 0.245 0.316 0.222 0.491 0.491 0.56 0.4 0.552 10.276 0.233 0.245 0.316 0.222 0.491 0.491 0.56 0.4 0.552 1 10.222 0.107 0.222 0.226 0.2 0.327 0.327 0.435 0.471 0.444 0.5 0.50.222 0.107 0.222 0.226 0.2 0.327 0.327 0.435 0.471 0.444 0.5 0.50.222 0.107 0.222 0.226 0.2 0.327 0.327 0.435 0.471 0.444 0.5 0.50.222 0.107 0.222 0.226 0.2 0.327 0.327 0.435 0.471 0.444 0.5 0.50.167 0.226 0.353 0.339 0.214 0.436 0.436 0.385 0.456 0.467 0.414 0.4140.136 0.164 0.2 0.345 0.145 0.481 0.481 0.353 0.321 0.407 0.456 0.4560.241 0.233 0.245 0.351 0.296 0.34 0.34 0.36 0.4 0.552 0.429 0.4290.333 0.29 0.392 0.339 0.429 0.364 0.364 0.462 0.386 0.533 0.448 0.4480.333 0.29 0.353 0.339 0.429 0.291 0.291 0.462 0.316 0.533 0.483 0.4830.31 0.267 0.367 0.351 0.407 0.302 0.302 0.48 0.436 0.552 0.429 0.4290.339 0.295 0.24 0.31 0.436 0.222 0.222 0.314 0.286 0.339 0.281 0.2810.339 0.295 0.24 0.31 0.436 0.222 0.222 0.314 0.286 0.339 0.281 0.2810.375 0.424 0.255 0.349 0.433 0.203 0.203 0.357 0.295 0.375 0.387 0.3870.375 0.424 0.255 0.349 0.433 0.203 0.203 0.357 0.295 0.375 0.387 0.3870.375 0.424 0.255 0.349 0.433 0.203 0.203 0.357 0.295 0.375 0.387 0.3870.214 0.138 0.128 0.291 0.192 0.353 0.353 0.333 0.302 0.286 0.407 0.4070.122 0.196 0.1 0.208 0.178 0.409 0.409 0.195 0.261 0.245 0.255 0.2550.143 0.103 0.085 0.218 0.269 0.314 0.314 0.333 0.302 0.357 0.37 0.370.345 0.267 0.204 0.351 0.333 0.264 0.264 0.16 0.109 0.138 0.321 0.321

B38B B38A B77A

11 11 1 11 1 1

0.556 0.556 0.5560.491 0.491 0.4910.385 0.385 0.3850.407 0.407 0.4070.407 0.407 0.4070.385 0.385 0.3850.377 0.377 0.3770.377 0.377 0.3770.31 0.31 0.310.31 0.31 0.310.31 0.31 0.310.32 0.32 0.320.14 0.14 0.140.24 0.24 0.240.115 0.115 0.115

0.423 0.333 0.14 0.353 0.208 0.255 0.255 0.227 0.245 0.308 0.28 0.280.4 0.323 0.353 0.305 0.393 0.327 0.327 0.385 0.246 0.367 0.448 0.4480.4 0.323 0.353 0.305 0.393 0.327 0.327 0.385 0.246 0.367 0.448 0.448

0.351 0.339 0.25 0.286 0.415 0.269 0.269 0.327 0.333 0.316 0.327 0.3270.351 0.339 0.25 0.286 0.415 0.269 0.269 0.327 0.333 0.316 0.327 0.3270.271 0.23 0.2 0.276 0.327 0.333 0.333 0.353 0.321 0.339 0.316 0.3160.271 0.23 0.2 0.276 0.327 0.333 0.333 0.353 0.321 0.339 0.316 0.3160.281 0.271 0.208 0.214 0.226 0.269 0.269 0.286 0.296 0.351 0.291 0.2910.281 0.271 0.208 0.214 0.226 0.269 0.269 0.286 0.296 0.351 0.291 0.2910.281 0.271 0.208 0.214 0.226 0.269 0.269 0.286 0.296 0.351 0.291 0.2910.281 0.271 0.208 0.214 0.226 0.269 0.269 0.286 0.296 0.351 0.291 0.2910.281 0.271 0.208 0.214 0.226 0.269 0.269 0.286 0.296 0.351 0.291 0.2910.189 0.145 0.136 0.154 0.163 0.375 0.375 0.222 0.36 0.189 0.196 0.1960.351 0.305 0.292 0.429 0.264 0.231 0.231 0.122 0.222 0.211 0.145 0.1450.327 0.246 0.13 0.185 0.235 0.28 0.28 0.17 0.231 0.291 0.377 0.3770.31 0.267 0.245 0.211 0.185 0.34 0.34 0.32 0.218 0.379 0.357 0.3570.305 0.262 0.2 0.207 0.145 0.333 0.333 0.275 0.286 0.373 0.386 0.3860.157 0.226 0 0.24 0.17 0.261 0.261 0.186 0.208 0.392 0.327 0.3270.222 0.25 0.222 0.302 0.28 0.204 0.204 0.261 0.157 0.296 0.308 0.3080.327 0.351 0.217 0.296 0.275 0.36 0.36 0.34 0.154 0.291 0.377 0.3770.314 0.34 0.19 0.28 0.213 0.217 0.217 0.14 0.167 0.314 0.163 0.1630.157 0.189 0.095 0.24 0.213 0.304 0.304 0.326 0.417 0.392 0.286 0.2860.157 0.189 0.095 0.24 0.213 0.304 0.304 0.326 0.417 0.392 0.286 0.2860.157 0.189 0.095 0.24 0.213 0.304 0.304 0.326 0.417 0.392 0.286 0.2860.179 0.207 0.085 0.327 0.231 0.314 0.314 0.375 0.34 0.321 0.222 0.2220.296 0.357 0.356 0.415 0.4 0.286 0.286 0.348 0.157 0.259 0.346 0.3460.286 0.308 0.259 0.323 0.305 0.276 0.276 0.182 0.3 0.286 0.328 0.3280.281 0.333 0.218 0.222 0.333 0.373 0.373 0.321 0.328 0.469 0.387 0.3870.237 0.295 0.2 0.138 0.255 0.333 0.333 0.431 0.357 0.508 0.351 0.3510.316 0.305 0.208 0.393 0.226 0.423 0.423 0.367 0.185 0.281 0.4 0.40.214 0.207 0.34 0.4 0.385 0.275 0.275 0.417 0.226 0.393 0.556 0.5560.321 0.276 0.298 0.4 0.423 0.392 0.392 0.417 0.189 0.393 0.481 0.481

0.4 0.355 0.314 0.373 0.429 0.255 0.255 0.192 0.211 0.3 0.276 0.2760.264 0.291 0.091 0.308 0.245 0.375 0.375 0.4 0.12 0.189 0.314 0.3140.246 0.305 0.125 0.214 0.34 0.385 0.385 0.449 0.296 0.386 0.436 0.4360.218 0.246 0.261 0.444 0.353 0.28 0.28 0.298 0.192 0.255 0.302 0.3020.271 0.295 0.12 0.379 0.364 0.333 0.333 0.392 0.321 0.373 0.386 0.3860.151 0.109 0.091 0.269 0.286 0.375 0.375 0.4 0.16 0.34 0.353 0.3530.241 0.233 0.122 0.211 0.259 0.264 0.264 0.32 0.364 0.345 0.25 0.250.267 0.355 0.275 0.271 0.25 0.255 0.255 0.231 0.421 0.267 0.241 0.2410.226 0.255 0.182 0.192 0.286 0.292 0.292 0.222 0.24 0.302 0.235 0.2350.276 0.333 0.245 0.351 0.296 0.226 0.226 0.28 0.255 0.31 0.179 0.179

0.295 0.317 0.154 0.2 0.316 0.286 0.286 0.302 0.241 0.295 0.305 0.305

F92 F73 E22 F23 F36 A87 A407 E20 F42 C36 A206B A206A

0.348 0.348 0.3480.37 0.37 0.370.37 0.37 0.370.392 0.392 0.3920.392 0.392 0.3920.34 0.34 0.340.34 0.34 0.340.353 0.353 0.3530.353 0.353 0.3530.353 0.353 0.3530.353 0.353 0.3530.353 0.353 0.3530.17 0.17 0.170.353 0.353 0.3530.204 0.204 0.2040.269 0.269 0.2690.264 0.264 0.2640.222 0.222 0.2220.333 0.333 0.3330.204 0.204 0.2040.089 0.089 0.0890.178 0.178 0.1780.178 0.178 0.1780.178 0.178 0.1780.16 0.16 0.160.25 0.25 0.250.316 0.316 0.3160.241 0.241 0.2410.34 0.34 0.340.353 0.353 0.3530.36 0.36 0.360.28 0.28 0.280.37 0.37 0.370.213 0.213 0.2130.196 0.196 0.1960.327 0.327 0.3270.264 0.264 0.2640.383 0.383 0.3830.346 0.346 0.3460.333 0.333 0.3330.213 0.213 0.2130.346 0.346 0.346

0.291 0.291 0.291

B38B B38A B77A

B77B B36 A471 B54A A62A E49A E57 E92B E92A D83B D83A

10.556 10.491 0.644 10.385 0.517 0.561 10.407 0.5 0.441 0.69 10.407 0.433 0.407 0.655 0.9 10.385 0.483 0.386 0.679 0.931 0.862 10.377 0.407 0.345 0.456 0.441 0.441 0.456 10.377 0.407 0.345 0.456 0.441 0.441 0.456 1 10.31 0.281 0.317 0.323 0.406 0.406 0.419 0.476 0.476 10.31 0.281 0.317 0.323 0.406 0.406 0.419 0.476 0.476 1 10.31 0.281 0.317 0.323 0.406 0.406 0.419 0.476 0.476 1 10.32 0.214 0.291 0.296 0.25 0.25 0.222 0.4 0.4 0.3 0.30.14 0.286 0.25 0.298 0.286 0.204 0.298 0.25 0.25 0.34 0.340.24 0.179 0.218 0.222 0.25 0.357 0.259 0.327 0.327 0.333 0.3330.115 0.207 0.246 0.286 0.345 0.379 0.357 0.316 0.316 0.258 0.258

D113 F98 E107 A212

10.3 1

0.34 0.444 10.333 0.385 0.4 10.258 0.296 0.298 0.407

0.348 0.192 0.196 0.2 0.308 0.385 0.36 0.392 0.392 0.429 0.4290.37 0.333 0.271 0.345 0.5 0.467 0.483 0.475 0.475 0.438 0.4380.37 0.333 0.271 0.345 0.5 0.467 0.483 0.475 0.475 0.438 0.4380.392 0.246 0.286 0.327 0.351 0.351 0.364 0.464 0.464 0.426 0.4260.392 0.246 0.286 0.327 0.351 0.351 0.364 0.464 0.464 0.426 0.4260.34 0.169 0.207 0.246 0.305 0.305 0.316 0.379 0.379 0.476 0.4760.34 0.169 0.207 0.246 0.305 0.305 0.316 0.379 0.379 0.476 0.4760.353 0.351 0.321 0.255 0.351 0.316 0.327 0.357 0.357 0.197 0.1970.353 0.351 0.321 0.255 0.351 0.316 0.327 0.357 0.357 0.197 0.1970.353 0.351 0.321 0.255 0.351 0.316 0.327 0.357 0.357 0.197 0.1970.353 0.351 0.321 0.255 0.351 0.316 0.327 0.357 0.357 0.197 0.1970.353 0.351 0.321 0.255 0.351 0.316 0.327 0.357 0.357 0.197 0.1970.17 0.34 0.269 0.275 0.264 0.189 0.275 0.269 0.269 0.14 0.140.353 0.246 0.357 0.255 0.281 0.246 0.255 0.321 0.321 0.197 0.1970.204 0.364 0.333 0.302 0.218 0.218 0.226 0.296 0.296 0.136 0.1360.269 0.414 0.421 0.321 0.379 0.379 0.321 0.281 0.281 0.194 0.1940.264 0.407 0.379 0.316 0.339 0.339 0.281 0.241 0.241 0.159 0.1590.222 0.314 0.44 0.408 0.275 0.275 0.286 0.16 0.16 0.327 0.3270.333 0.222 0.377 0.385 0.296 0.333 0.269 0.34 0.34 0.31 0.310.204 0.218 0.259 0.226 0.291 0.327 0.34 0.222 0.222 0.373 0.3730.089 0.196 0.28 0.163 0.157 0.157 0.204 0.24 0.24 0.327 0.3270.178 0.235 0.2 0.408 0.314 0.275 0.327 0.24 0.24 0.218 0.2180.178 0.235 0.2 0.408 0.314 0.275 0.327 0.24 0.24 0.218 0.2180.178 0.235 0.2 0.408 0.314 0.275 0.327 0.24 0.24 0.218 0.2180.16 0.214 0.109 0.296 0.321 0.321 0.37 0.327 0.327 0.367 0.3670.25 0.333 0.34 0.308 0.333 0.296 0.308 0.264 0.264 0.379 0.3790.316 0.286 0.323 0.23 0.127 0.063 0.098 0.226 0.226 0.299 0.2990.241 0.313 0.317 0.258 0.25 0.188 0.194 0.222 0.222 0.294 0.2940.34 0.373 0.379 0.421 0.407 0.407 0.421 0.276 0.276 0.286 0.2860.353 0.456 0.464 0.4 0.421 0.386 0.364 0.214 0.214 0.164 0.1640.36 0.321 0.291 0.296 0.357 0.393 0.37 0.218 0.218 0.267 0.2670.28 0.357 0.436 0.407 0.429 0.5 0.37 0.364 0.364 0.267 0.2670.37 0.4 0.475 0.414 0.367 0.333 0.31 0.576 0.576 0.25 0.250.213 0.302 0.385 0.196 0.113 0.113 0.157 0.231 0.231 0.316 0.3160.196 0.351 0.357 0.364 0.316 0.316 0.364 0.357 0.357 0.393 0.3930.327 0.364 0.407 0.34 0.218 0.218 0.264 0.37 0.37 0.203 0.2030.264 0.441 0.345 0.386 0.305 0.237 0.316 0.414 0.414 0.381 0.3810.383 0.264 0.385 0.431 0.34 0.377 0.314 0.346 0.346 0.316 0.3160.346 0.31 0.246 0.321 0.31 0.31 0.357 0.316 0.316 0.258 0.2580.333 0.3 0.305 0.379 0.333 0.333 0.31 0.203 0.203 0.281 0.2810.213 0.264 0.308 0.314 0.302 0.302 0.275 0.269 0.269 0.211 0.2110.346 0.241 0.246 0.179 0.276 0.276 0.286 0.14 0.14 0.258 0.258

0.291 0.361 0.3 0.305 0.328 0.361 0.271 0.167 0.167 0.338 0.338

B77B B36 A471 B54A A62A E49A E57 E92B E92A D83B D83A

0.429 0.292 0.341 0.4580.438 0.429 0.327 0.3570.438 0.429 0.327 0.3570.426 0.34 0.304 0.340.426 0.34 0.304 0.340.476 0.436 0.292 0.4730.476 0.436 0.292 0.4730.197 0.189 0.13 0.1890.197 0.189 0.13 0.1890.197 0.189 0.13 0.1890.197 0.189 0.13 0.1890.197 0.189 0.13 0.1890.14 0.286 0.238 0.1630.197 0.151 0.13 0.2260.136 0.157 0.227 0.2750.194 0.222 0.128 0.1850.159 0.291 0.208 0.2180.327 0.213 0.4 0.2980.31 0.32 0.233 0.280.373 0.196 0.409 0.3140.327 0.17 0.35 0.2130.218 0.34 0.25 0.340.218 0.34 0.25 0.340.218 0.34 0.25 0.340.367 0.462 0.267 0.3080.379 0.28 0.186 0.240.299 0.305 0.385 0.3390.294 0.333 0.377 0.3670.286 0.291 0.375 0.3640.164 0.34 0.304 0.3020.267 0.308 0.178 0.4230.267 0.423 0.267 0.4230.25 0.429 0.286 0.2860.316 0.327 0.238 0.2860.393 0.302 0.348 0.340.203 0.275 0.273 0.2750.381 0.291 0.333 0.2910.316 0.367 0.143 0.2860.258 0.185 0.085 0.2590.281 0.286 0.286 0.1790.211 0.327 0.238 0.2860.258 0.111 0.085 0.148

0.338 0.175 0.2 0.211

D113 F98 E107 A212

D34 A85 A283 A235 B44A B44B A420 B85 A137 A181A

1

A181B F4A F75A B45 D58A

0.28 10.379 0.269 10.379 0.269 1 10.327 0.286 0.561 0.561 10.327 0.286 0.561 0.561 1 10.316 0.431 0.576 0.576 0.357 0.357 10.316 0.431 0.576 0.576 0.357 0.357 1 10.218 0.204 0.281 0.281 0.259 0.259 0.214 0.214 10.218 0.204 0.281 0.281 0.259 0.259 0.214 0.214 1 10.218 0.204 0.281 0.281 0.259 0.259 0.214 0.214 1 10.218 0.204 0.281 0.281 0.259 0.259 0.214 0.214 1 1 1 10.218 0.204 0.281 0.281 0.259 0.259 0.214 0.214 1 1 1 1 10.275 0.133 0.075 0.075 0.04 0.04 0.192 0.192 0.36 0.360.218 0.245 0.246 0.246 0.222 0.222 0.321 0.321 0.333 0.3330.302 0.213 0.182 0.182 0.269 0.269 0.111 0.111 0.385 0.3850.214 0.12 0.276 0.276 0.145 0.145 0.175 0.175 0.545 0.5450.246 0.118 0.271 0.271 0.143 0.143 0.207 0.207 0.5 0.50.327 0.279 0.196 0.196 0.208 0.208 0.24 0.24 0.292 0.2920.346 0.217 0.222 0.222 0.353 0.353 0.264 0.264 0.314 0.3140.302 0.383 0.291 0.291 0.154 0.154 0.37 0.37 0.192 0.1920.286 0.326 0.196 0.196 0.208 0.208 0.32 0.32 0.167 0.1670.163 0.186 0.275 0.275 0.333 0.333 0.36 0.36 0.167 0.1670.163 0.186 0.275 0.275 0.333 0.333 0.36 0.36 0.167 0.1670.163 0.186 0.275 0.275 0.333 0.333 0.36 0.36 0.167 0.1670.333 0.25 0.214 0.214 0.151 0.151 0.327 0.327 0.189 0.1890.269 0.13 0.37 0.37 0.353 0.353 0.264 0.264 0.235 0.2350.262 0.291 0.286 0.286 0.367 0.367 0.355 0.355 0.333 0.3330.226 0.286 0.281 0.281 0.295 0.295 0.286 0.286 0.361 0.3610.316 0.196 0.373 0.373 0.321 0.321 0.31 0.31 0.286 0.2860.364 0.286 0.351 0.351 0.37 0.37 0.25 0.25 0.222 0.2220.296 0.125 0.357 0.357 0.264 0.264 0.327 0.327 0.189 0.1890.333 0.25 0.393 0.393 0.226 0.226 0.255 0.255 0.264 0.2640.31 0.308 0.333 0.333 0.491 0.491 0.237 0.237 0.351 0.3510.275 0.222 0.264 0.264 0.24 0.24 0.269 0.269 0.24 0.240.364 0.204 0.386 0.386 0.37 0.37 0.107 0.107 0.296 0.2960.34 0.255 0.291 0.291 0.423 0.423 0.111 0.111 0.231 0.2310.281 0.275 0.305 0.305 0.321 0.321 0.138 0.138 0.214 0.2140.196 0.267 0.226 0.226 0.12 0.12 0.269 0.269 0.4 0.40.25 0.16 0.31 0.31 0.4 0.4 0.316 0.316 0.291 0.2910.207 0.154 0.2 0.2 0.281 0.281 0.305 0.305 0.281 0.2810.196 0.222 0.302 0.302 0.2 0.2 0.385 0.385 0.36 0.360.179 0.2 0.172 0.172 0.218 0.218 0.246 0.246 0.364 0.364

0.271 0.113 0.197 0.197 0.207 0.207 0.267 0.267 0.345 0.345

D34 A85 A283 A235 B44A B44B A420 B85 A137 A181A

1

0.36 0.36 0.36 10.333 0.333 0.333 0.28 10.385 0.385 0.385 0.333 0.2310.545 0.545 0.545 0.392 0.327

0.5 0.5 0.5 0.385 0.2860.292 0.292 0.292 0.182 0.1250.314 0.314 0.314 0.128 0.1180.192 0.192 0.192 0.292 0.2310.167 0.167 0.167 0.182 0.2080.167 0.167 0.167 0.182 0.1670.167 0.167 0.167 0.182 0.1670.167 0.167 0.167 0.182 0.1670.189 0.189 0.189 0.408 0.2260.235 0.235 0.235 0.17 0.2750.333 0.333 0.333 0.321 0.2670.361 0.361 0.361 0.281 0.230.286 0.286 0.286 0.192 0.1790.222 0.222 0.222 0.24 0.2960.189 0.189 0.189 0.245 0.3020.264 0.264 0.264 0.245 0.2640.351 0.351 0.351 0.189 0.4210.24 0.24 0.24 0.391 0.120.296 0.296 0.296 0.32 0.0740.231 0.231 0.231 0.292 0.2690.214 0.214 0.214 0.269 0.25

0.4 0.4 0.4 0.348 0.20.291 0.291 0.291 0.275 0.2550.281 0.281 0.281 0.34 0.2460.36 0.36 0.36 0.348 0.160.364 0.364 0.364 0.196 0.291

0.345 0.345 0.345 0.37 0.207

A181B F4A F75A B45 D58A

F5 A138 B49 D50 E7 D118A B53 D19 D74 D108 D31 E55 A43 A347 A182

10.528 10.556 0.877 10.261 0.204 0.24 10.163 0.154 0.151 0.356 10.28 0.34 0.37 0.478 0.408 10.217 0.327 0.28 0.333 0.356 0.565 10.217 0.204 0.24 0.333 0.311 0.348 0.286 10.217 0.204 0.24 0.333 0.311 0.348 0.286 1 10.217 0.204 0.24 0.333 0.311 0.348 0.286 1 10.118 0.222 0.255 0.298 0.2 0.314 0.213 0.511 0.5110.204 0.346 0.302 0.222 0.292 0.245 0.267 0.311 0.3110.345 0.328 0.323 0.407 0.386 0.379 0.444 0.407 0.4070.339 0.387 0.381 0.436 0.379 0.373 0.4 0.4 0.40.222 0.211 0.207 0.44 0.302 0.333 0.16 0.4 0.40.385 0.4 0.393 0.292 0.196 0.269 0.167 0.208 0.2080.275 0.37 0.4 0.383 0.28 0.471 0.213 0.255 0.2550.275 0.37 0.364 0.34 0.36 0.314 0.17 0.34 0.340.364 0.31 0.305 0.235 0.37 0.145 0.235 0.275 0.2750.333 0.314 0.308 0.409 0.255 0.333 0.227 0.318 0.3180.346 0.291 0.286 0.417 0.235 0.385 0.167 0.25 0.250.24 0.226 0.222 0.304 0.327 0.32 0.261 0.174 0.1740.333 0.316 0.31 0.32 0.151 0.259 0.28 0.36 0.360.292 0.392 0.385 0.455 0.298 0.417 0.182 0.318 0.3180.151 0.214 0.246 0.163 0.308 0.226 0.245 0.327 0.3270.145 0.241 0.305 0.235 0.333 0.145 0.157 0.275 0.2750.25 0.314 0.308 0.273 0.213 0.208 0.182 0.182 0.1820.113 0.286 0.281 0.327 0.231 0.302 0.204 0.163 0.163

0.25 0.305 0.367 0.346 0.327 0.321 0.192 0.308 0.308

F5 A138 B49 D50 E7 D118A B53 D19 D74

10.511 10.311 0.32 10.407 0.237 0.456 1

0.4 0.267 0.414 0.776 10.4 0.4 0.453 0.355 0.444 1

0.208 0.264 0.392 0.367 0.262 0.4290.255 0.346 0.44 0.407 0.4 0.3270.34 0.231 0.4 0.373 0.4 0.4360.275 0.214 0.407 0.444 0.406 0.4070.318 0.408 0.426 0.429 0.351 0.3850.25 0.302 0.275 0.3 0.426 0.50.174 0.314 0.408 0.448 0.407 0.3330.36 0.436 0.566 0.355 0.413 0.4140.318 0.408 0.255 0.321 0.351 0.3850.327 0.333 0.346 0.328 0.29 0.3160.275 0.286 0.259 0.381 0.375 0.3050.182 0.245 0.34 0.25 0.281 0.3460.163 0.333 0.269 0.164 0.258 0.316

0.308 0.316 0.364 0.406 0.492 0.467

D108 D31 E55 A43 A347 A182

B71 C37 A405 A337 D25 D107 F84 C23 D91 F30A D6 A191 A128 B74

10.453 10.377 0.462 10.386 0.214 0.571 1

0.4 0.327 0.408 0.377 10.37 0.34 0.34 0.316 0.52 10.423 0.51 0.392 0.473 0.417 0.538 10.429 0.364 0.291 0.373 0.5 0.571 0.593 10.32 0.367 0.408 0.189 0.435 0.36 0.333 0.3850.291 0.296 0.185 0.172 0.275 0.327 0.34 0.3510.175 0.25 0.357 0.3 0.264 0.14 0.291 0.203

0.2 0.163 0.245 0.264 0.261 0.28 0.167 0.2690.255 0.333 0.111 0.172 0.235 0.218 0.226 0.281

0.31 0.351 0.316 0.23 0.333 0.345 0.25 0.267

B71 C37 A405 A337 D25 D107 F84 C23

10.275 10.226 0.379 10.391 0.314 0.34 10.275 0.429 0.31 0.353 1

0.407 0.407 0.426 0.444 0.441 1

D91 F30A D6 A191 A128 B74

KAYNAKLAR

Akhmanova, A.S., Kagramanova, V. K. and Mankin, A.S. 1993. Heterogeneity of small

plasmids from halophilic archaea. J. of Bacteriol., 175 (4); 1081-1086.

Anderson, D. G. and MacKay, L. L. 1983. Simple and rapid method for isolating large

plasmid DNA from Lactic streptococci. Appl. And Environ. Microbiol., 46(3);

549-552.

Anonim. 1999. Uluslararası Önemi Olan Sulak Alanların Biyolojik ve Ekolojik Yönden

Araştırılması Projesi, Alt Proje III, Sonuç Raporu. Proje yürütücüsü Prof. Dr. Ali

Demirsoy, T.C. Çevre Bakanlığı, Çevre Koruma Genel Müd., Ankara.

Arahal, D. R., Dewhirst, F. E., Paster, B. J., Volcani, B. E. and Ventosa, A. 1996.

Phylogenetic analyses of some extremely halophilic archaea isolated from Dead

Sea water, determined on the basis of their 16 S rRNA sequences. Appl. And

Environ. Mic., 62(10); 3779-3786).

Arda, M. 1997. Temel Mikrobiyoloji. Medisan yayınevi, Ankara, ISBN:975-7774-22-7.

Asker, D. and Ohta, Y. 2002. Haloferax alexandrinus sp. nov., an exteremely halophilic

cathaxanthin-producing archaeon from a solar saltern in Alexandria (Egypt). Int.

J. Syst. and Evolut. Microbiol, 52; 729-738.

Bansal, A. K. and Meyer, T. E. 2002. Evolutionar analysis by whole-genome

comparisions. J. bacteriol., 184(8); 2260-2272.

Beard, S. J., Hayes, P. K. and Walsby, A. E. 1997. Growth competetion between

Halobacterium salinarum strain PHH1 and mutants affected in gas vesicle

synthesis. Microniology UK, 143; 467-473.

Bertrand, J. C., Almallah, M., Acquaviva, M. and Mille, G. 1990. Biodegredation of

hydrocarbons by an exremely halophilic archaebacterium. Letters in Applied

Microbiolgy, 11; 260-263.

Bonelo, G., Ventosa, A.i Megias, M. and Ruiz-Berraquero, F. 1984. The sensitivity of

halobacteria to antibiotics. FEMS Microbiol. Letters, 21; 341-345.

Böck, A. and Kandler, O. 1985. Antibiotic sensitivity of archaeabacteria In: C.R. Woese

and R. S. Wolfe (Eds), The Bacteria-a treatise on structure and function.

Archaebacteria, Academic Press Orlando, FLVol.III, 525-541.

105

Braithwaite, C. J. R. and Zedef, V. 1994. Living hydromagnesite stromatolites from

Turkey. Sedimentary Geology, 92; 1-5.

Brenner, D. J., Staley, J. T. and Krieg, N. R. 2001. Classification of prokaryotic

organisms and the concept of bacterial speciation In: Bergey’s Manual of

Systematic Bacteriology V.I, The Archaea and Deeply Branching and

Phototrophic Bacteria, Garrity, G. M. (Man. Ed.), 2nd Ed. New York, Springer,

ISBN: 0387987711.

Brown, H. J. and Gibbons, N. E. 1995. The effect of magnesium, potassium and iron on

the growth and morphology of red halophilic bacteria. Can J.Microbiol., 1; 486-

494.

Canik, B. 1988. Bozdağ-Yapalı Toprakkale dolayındaki (Cihanbeyli) sıcak ve mineralli

sular ve oluşukları. Ulusal I. Hidrojeoloji Sempozyumu, Ankara Üniv. Basımevi.

Chaga, G, Porath, J. and Illéni, T. 1993. Isolation and purification of amyloglucosidase

from Halobacterium sodomonse. Biomedical chromatography, 7; 256-261.

Cohen, S., Oren, A. and Shilo, M. 1983. The divalent cation requirement of Dead Sea

halobacteria. Arch. Microbiol., 136; 184-190.

Danson, M. and Hough, D. W. 1997. The structural basis of protein halophilicity.

Comp. Biochem. Physiol., 117A (3); 307-312.

DasSarma, S. 1993. Identification and analysis of the gas vesicle gene cluster on an

unstable plasmid of Halobacterium halobium. Experientia, 49; 482-486.

DasSarma, S. and Arora, P. 1997. Genetic analysis of the gas vesicle gene cluster in

haloarchaea. FEMS mic. Letters, 153; 1-10.

Dussault, H. P. 1955. Am improved technique for staining red halophilic bacteria. J. of

Bacteriol., 70, 484-485.

Dyall-Smith, M. 2001. The Halohandbook: Protocols for halobacterial genetics

(4.5 version, electronic publication).

Emerson, D., Chauhan, S., Oriel, P. and Breznak, J. A. 1994. Haloferax sp. D1227, a

halophilic archaeon capable of growth on aromatic compounds. Arch.

Microbiol., 161; 445-452.

Esen, A. 1978. A simple method for quantitative, semi-quantitative and qualitative

assay of protein. Anal. Biochem., 89; 264-273.

106

Eyüboğlu, Ö. 1995. Seyfe Gölü (Kırşehir) Tabiatı koruma alanının florası. Doktora tezi,

Gazi Üniv., Fen Bilimleri Ens., Ankara.

Franzmann, P.D., Stackebrandt, E., Sanderson, K., Volkman, J. K., Cameron, D. E.,

Stevenson, P. L., McMeekin, T.A. and Burton, H. R. 1988. Halobacterium

lacusprofundi sp. nov., halophilic bacterium isolated from Deep Lake,

Antarctica. System. Appl. Microbiol., 11; 20-27.

Gonzales, C., Gutierrez, C. and Ramirez, C. 1978. Halobacterium vallismortis sp. nov.,

an amylolytic and carbohydrate-metabolizing extremely halophilic bacterium.

Can. J. Microbiol., 24; 710-715.

Goo, Y. A., Yi, E. C., Baliga, N. S., Tao, W. A., Pan, M., Aebersold, R., Goodlett, D.

R., Hood, L. and Ng, W. V. 2003. Proteomic analysis of an extreme halophilic

Archaeon, Halobacterium sp. NRC-1. Molecular and Cellular Proteomics2; 506-

524.

Grant, W. D, Gemmell, R.T. and McGenity, T. J. 1998. Halobacteria: the evidence for

longevity. Extremophiles, 2; 279-287.

Grant, W. D., Kamekura, M., McGenity, T. J. and Ventosa, A. 2001. Order I.

Halobacteriales In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology V.I, The

Archaea and Deeply Branching and Phototrophic Bacteria, Garrity, G. M. (Man.

Ed.), 2nd Ed. New York, Springer, ISBN: 0387987711.

Gutierrez, C. and Gonzalez, C. 1972. Method for simultaneous detection of proteinase

and esterase activities in extremely halophilic bacteria. Appl. Microbiol., 24;

516-517.

Gutierrez, M. C., Garcia, M. T., Ventosa, A., Nieto, J. J. and Ruiz-Berraquero, F. 1986.

Occurence of megaplasmids in halobacteria. J. of Applied Bacteriology, 61; 67-

71.

Gutierrez, M. C., Ventosa, A. and Berraquero, F. 1989. DNA-DNA homology studies

among strains of Haloferax and other Halobacteria. Curr. Mic., 18; 253-256.

Gutierrez, M. C., ventosa, A. and Ruiz-Berrquero, F. 1990. deoxyribonucleic acid

relatidness among species of Haloarcula and other Halobacteria. Biochem. Cell.

Biol., 68;106-110.

107

Gutierrez, M. C., Kamekura, M., Holmes, M. L., Dyall-Smith, M. L. and Ventosa, A.

2002. Taxonomic characterization of Haloferax sp. ("H. alicantei") strain Aa 2.2:

description of Haloferax lucentensis sp. nov. Extremophiles: 6; 479-483.

Hackett, R.N. and Grant, W. D. 1989. Characterization of the small endogenous plasmid

of Halobacterium strain SB3 and its use in transformation of H. halobium. Can.

J. Microbiol., 35; 86-91.

Hamana, K., Hamana, H. and Itoh, T. 1995. Ubiqutious occurence of agmatine as the

major polyamine within extremely halophilic archaebacteria. J. Gen. Appl.

Microbiol., 41; 153-158.

Hancock, A. J. and Kates, M. 1973. Structure determination of the phophatidygycero-

phosfate (dieter analog) from Halobacterium cutirubrum. J. of lipid research, 14;

422-429.

Hartmann, R., Sickinger, H., D. and Oesterhelt, D. 1980. Anaerobic growth of

halobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 (6); 3821-3825.

Hesselberg, M. and Vreeland, R. H. 1995. Utilization of protein profiles for the

characterization of halophilic bacteria. Current Microbiolgy, 31; 158-162.

Hezayen, F. F., Rehm, B. H. A., Eberhardt, R. and Steinbüchel, A. 2000. Polymer

production by two newly isolatedremely halophilic archaea: application of a

novel corrosion-resistant bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol., 54; 319-325.

Hezayen, F. F., Rehm, B. H. A., Tindall, B. J. and Steinbüchel, A. 2001. Transfer of

Natrialba asiatica B1T to Natrialba taiwanwnsis sp. nov. and description of

Natrialba aegyptiaca sp. nov., a novel extremely halophilic, aerobic, non-

pigmented member of the Archaea from Egypt that produces extracellular

poly(glutamic acid). Int. J. Syst. and Evolut. Microbiol, 51; 1133-1142.

Hezayen, F. F., Tindall, B. J., Steinbüchel and Rehm, B. H. A. 2002. Characterization of

a novel halophilic archaeon, Halobioforma haloterrestris gen. nov., sp. nov., and

transfer of Natronobacterium nitratireducens to Halobioforma nitratireducens

comb. nov. Int. J. Syst. and Evolut. Microbiol, 52; 2271-2280.

Hilpert, R., Winter, J., Hammes, W. and Kandler, . 1981. The sensitivity of

archaebacteria to antibiotics. Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. C., 2, 11-20.

Holding, A. J. and Collee, J. G. 1971. Routine biochemical tests. Methods Microbiol.,

6A; 11-20.

108

Holmes, M. L. and Dyall-Smith, M. L. 1991. Mutations in DNA gyrase result in

novobiocin resistance in halophilic archaebacteria. J. of. Bacteriol., 173 (2); 642-

648.

Horikoshi, K., Aono, R. and Nakamura, S. 1993. The triangular halophilic

archaebacterium Haloarcula japonica strain TR-1. Experientia, 49; 497-502.

Hough, D. W. And Danson, D. J. 1999. Extremozymes. Curr. Opin. İn Chem. Biology,

3; 39-46.

Hough, D. W. and Danson, M. J. 1989. Archaebacteria: ancient organisms with

commercial potential. Letters in Applied Microbiolgy, 9; 33-39.

Ihara, K., Watanabe, S. and Tamura, T. 1997. Haloarcula argentinensis sp. nov. and

Haloarcula mukohatei sp. nov., two extremely halophilic archaea collected in

Argentina. Int. J. Syst. Bacteriol., 47 (1); 73-77.

Izotova, L. S., Strongin, A. Y., Chekulaeva, L. N., Sterkin, V. E., Ostoslavskaya, V. I.,

Lyublinskaya, L. A., Timokhina E. A. and Stepanov, V. M. 1983. Purification

and properties of serine protease from Halobacterium halobium. J. of Bact.,

155(2); 826-830.

Jaenicke, R. and Zavodszky. P. 1990. Proteins under extreme physical conditions.

FEBS, 268 (2); 344-349.

Jocklik, W. K., Wilett, H. P., Amos, D. B. and Wilfert C. M. 1992. Zinsser

Microbiology. 20th Ed., Appleton and Lange Publisher, ISBN: 0838599834.

Johnsen, U., Selig, M., Xavier, K. B., Santos, H. and Schönheit, P. 2001. Different

glycolytic pathways for glucose and fructose in the halophilic archaeon

Halococcus saccharolyticus. Arch. Microbiol., 175; 52-61.

Jones, . G., Ewing, C. M. and Melvin, M. V. 1981. Biotechnology of solar saltfield.

Hidrobiologia, 82; 391-406.

Kamekura, M., Bardocz, S., Anderson, P., Wallace, R. and Kushner, D. J. 1986.

Polyamines in moderately and extremely halophilic bacteria. Biochim. Biophys.

Acta., 880, 204-208.

Kamekura, M. and Kates, M. 1988. Lipids of halophilic archaebacteria In. F.

Rodriguez-Valera (Ed.) Halophilic Bacteria Vol. II CRC Press Boca Raton,

Florida, 25-54.

109

Kamekura, M. and Seno, Y. 1993. Partial sequence of the gene for aserine protease

from a halophilic archaeum Haloferax mediterranei R4 and nucleotid sequences

of 16S rRNA encoding genes from several halophilic archaea. Experientia, 49;

503-513.

Kamekura, M. and Dyall-Smith, M. L. 1995. Taxonomy of the family halobacteriaceae

and description of two new genera Halorubrobacterium and Natrialba. 1995. J.

gen. Appl. Microbiol., 41; 333-350.

Kamekura, M. Dyall-Smith, M. L., Upasani, V., Ventosa, A. and Kates, M. 1997.

Diversty of alkaliphilic halobacteria: Proposals for transfer of Natronobacterium

vacuolatum, Natronobacterium magadii, and Natronobacterium pharaonis to

Halorubrum, Natrialba and Natronomonas gen. nov., respectively as

Halorubrum vacuolatum comb. Nov., Natrialba magadii comb. Nov., and

Natronomonas pharaonis comb. Nov., Respectively. I. J. Syst. Bact., 47(3); 853-

857.

Kamekura, M. 1998. Diversty of extremely halophilic bacteria. Extremophiles, 2; 289-

295.

Kamekura, M. 1999. Alkaliphilic Microorganisms: J. Seckbah (ed.), Enigmatic

Microorganisms and life in extrem environments, 479-485, Kluwer Academic

Publishers, Netherland.

Kamekura, M. and Kates, M. 1999. Structural diversty of membrane lipids in members

of Halobacteriaceae. Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (6); 969-972.

Kamekura, M., Oesterhelt, D., Wallace, R., Anderson, P. and Kushner, D. J. 1988. Lysis

of halobacteria in Bacto-peptone by bile acids. App. And Environ. Mic., 54(4);

990-995.

Kates, M. 1992. archaebacterial lipids: structure, biosynthesis and function In: The

Archaebacteria: Biochemistry and Biotechnology, Danson M. J., Hough, D. W.

and Lunt, G. G. (Ed.), The Biochemical Society, Portland Press, London, ISBN:

1-85578-010-0.

Kates, M. 1993. Membrane lipids of extreme halophiles: biosynthesis, function and

evolutionary significans. İn Halophilic Bacteria, Part II. Experientia, 49; 1027-

1036. Edited by R. H. Vreeland. Basel: Birkhäuser Verlag.

110

Kates, M. 1996. Structural analysis of phospholipids and glycolipids in extremely

halophilic archaebacteria. J. of Microbiol. Methods, 25; 113-128.

Kates, M. and Deroo, P. W. 1973. Structure determination of the glycolipid sulfate from

the extreme halophile Halobacterium cutirubrum. J. of lipid research, 14; 438-

445.

Kennedy, S. P., Ng, W. V., Salzberg, S. L., Hood, L. and DasSarma, S. 2001.

Understanding the adaptation of Halobacterium species NRC-1 to its extreme

environment through compututional analysis of its genome sequence. Genome

research, 11; 1641-4650.

Kibar, M. 1999. Güncel Tuzla Gölünün Sedimentalojik İncelemesi (Sarıoğlan,

Kayseri), Doktora tezi, Jeoloji Müh. A.B.D., Ankara Üniv., Ankara.

Kis-Papo, T. and Oren, A. 2000. Halocins: are they involved in the competetion

between halobacteria in saltern ponds?. Extremophiles, 4, 35-41.

Kostrikina, N. A., Zvyagintseva, I. S. and Duda, V. I. 1991. Cytological pecularities of

some extremely halophilic soil archaeobacteria. Arch. Microbiol., 156; 344-349.

Krieg, N.R. 2001. Prokaryotik Domains In: Bergey’s Manual of Systematic

Bacteriology V.I, The Archaea and Deeply Branching and Phototrophic Bacteria,

Garrity, G. M. (Man. Ed.), 2nd Ed. New York, Springer, ISBN: 0387987711.

Kulichevskaya, I. S., Zvyagintseva, I. S., Tarasov, A. L. and Plakunov, V. K. 1992. The

extremely halophilic archaebacteria from some hypersaline ecotops.

Microbiology, 46; 51-56.

Kunte, H. J., Trüper, G. and Stan-Lotter, H. 2001 Halophilic microorganisms.

Astrobiology: The quest for the conditions of life. Gerda Horneck, Christa

Baumstark-Khan (Eds), Heidelberg: Springer-virlag, ISBN: 3-540-42101-7

Kushawa, S. C. and Kates, M. 1979. Effect of glycerol on carotenogenesis in the extrem

halophile, Halobacterium cutirubrum. Can. J. Microbiol., 25, 1288-1372.

Kushner, D. J. 1985. The Halobacteriaceae. In: C.R. Woese and R. S. Wolfe (Eds), The

Bacteria-a treatise on structure and function. Archaebacteria, Academic Press

Orlando, FLVol.III, 171-214.

Kushner, D. J. 1988. What is the “true” internal environment of halophilic and other

bacteria? Can. J. Microbiol., 34; 482-486.

111

Laemmli, U. K. 1970. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature, 227; 680-685.

Lillo, J. G. and Rodriguez-Valera, F. 1990. Effects of culture conditions on poly (β-

hydroxybutiric acid) production by Haloferax mediterranei. Appl. And Environ.

Microbiol., 56 (8); 2517-2521.

Litchfield, C. D. 2002. Halophiles. J. İndustrial microbiol. And biotechnol., 28; 21-22.

Litchfield, C. D., Irby, A., Kis-papo, T. and Oren, A. 2000. Comparisions of the polar

lipd and pigment profiles of two solar salterns located in Newark, California,

U.S.A., and Eliat, Israel. Extremophiles, 4, 259-265.

Lizama, C., Monteoliva-sanchez, M., Suarez-Garcia, A., Rosello-Mora, R., Aguilera,

M., Campos, V. and Ramos-Cormenzana, A. 2002. Halorubrum tebenquichense

sp. nov., a novel halophilic archaeon isolated from the Atacam saltern, Chile. Int.

J. Syst. And Evol. Mic., 52; 149-155.

Lopez-Garcia, P., Jean, A. S., Amilas, R. and Charlebois. R. L. 1995. Genomic stability

in the archaea Haloferax volcanii and Haloferax mediterranei. J. bacteriol.,

177(5); 1405-1408.

M.T.A. derleme rapor. 1955. Denizli Acı göl mevkiinin jeolojisi. Rapor No:2509.

Macrina, F.l., Kobcko, D. J. Jones, K. R., Ayers, D. S. and McCoven, S. M. 1978. A

multiple plasmid containing Escherichia coli strain: convenient source of size

reference plasmid molecules. Plasmid, 1; 417-420.

Madigan, M. T., Martinko, M. J. and Parker, J. 2000. Biology of Microorganisms,

Prentice Hall International, Inc., USA, 9. Edt., ISBN:0-13-085264-3.

Mancinelli, R. L. and Hochstein L. I. 1986. The occurrence of denitrification in

extremely halophilic bacteria. FEMS Microbiol. Letters, 35; 55-58.

Margesin, H. and Schinner, F. 2001. Potential of halotolerant and halophilic

microorganisms for biotechnology. Extremophiles, 5; 73-83.

Martinez-Murcia, A. J. and Rodriguez-Valera, F. 1994. Random amplified polymorfic

DNA of a group of halophilic archaeal isolates. Syst. Appl. Microbiol., 17, 395-

401.

Martinez-Murcia, A. J., Acinas, S. G. and Rodriguez-Valera, F. 1995. Evaluation of

prokaryotic diversty by restrictase digestion of 16S rDNA directly amplified

from hypersaline environmets. FEMS Mic. Ecology, 17; 247-256.

112

Matheson, A T. 1985. Ribosomes of archaebacteria In: C.R. Woese and R. S. Wolfe

(Eds), The Bacteria-a treatise on structure and function. Archaebacteria,

Academic Press Orlando, FLVol.III, 345-372.

McGenity, T. and Grant, W. D. 1995. Transfer of Halobacterium Saccharovorum,

Halobacterium sodomonse, Halobacterium trapanicum NRC 34021 and

Halobacterium lacusprofundi to the genus Halorubrum gen. nov., as

Halorubrum saccharovorum comb. nov., Halorubrum sodomonse comb. nov.,

Halorubrum trapanicum comb. nov., and Halorubrum lacusprofundi comb. nov.

McGenity, T. J., Gemmell, R. and Grant, W. D. 1998. Proposal of a new halobacterial

genus Natrinema gen. nov. with two species Natrinema gen. nov., with two

species Natrinema Pellirubrum nom. Nov. and Natrinema pallidium. Nom. Nov.

Int. J. Syst. Bact., 48; 1187-1196.

Meseguer, I., Rodriguez-Valera, F. and Ventosa, A. 1986. Antagonistic interactions

among halobacteria due to halocine production. FEMS Microbiol. Letters, 36;

177-182.

Messner, P., Allmaier, G., Schäffer, C., wugeditsch, T., Lotal, S., König, H., Niemetz, R

and Dorner, M. 1997. III. Biochemistry of S-layers. FEMS Mic. Reviews, 20;

25-46.

Mevarech, M., Frolow, F. and Gloss, L. M. 2000. Halophilic enzymes: proteins with a

grain of salt. Biophysical chem., 86; 155-164.

Meyers, D. A., Sanches, D., Elwell, L. P. and Falkow, S. 1976. Simple agaros gel

electrophoretic method for the identification and the characterization plasmid

deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol., 127(3); 1529-1537.

Montalvo-Rodriguez, R., Vreeland, R. H., Oren, A., Kessel, M., Betancourt, C. and

Lopez-Gariga, J. 1998. Halogeometricum borinquense gen. nov., sp. nov., a

novel halophilic archaeon from Puerto Rico. İnt. J. of Syst. Bacteriol., 48; 1305-

1312.

Montalvo-Rodriguez, R., Lopez-Garriga, J., Vreeland, H., Oren, A., Ventosa, A. and

Kamekura, M. 2000. Haloterrigena thermotolerans sp. nov., a halophilic

archaeon from Puerto Rico. İnt. J. Syst. and Evolut. Microbiol., 50; 1065-1071.

113

Montero, G. C., Ventosa, A., Nieto, J. J. and Ruiz-Berraquero, F. 1988. Isolation and

partial characterization of a plasmid in the extremely halophilic archaebacterium

Halococcus morrhuae CCM 537. J. of General Microbiol., 134; 2959-2963.

Morita, M., Yamaguchi, N., Eguchi, T. and Kakinuma, K. 1998. Structural diversty of

the membrane core lipids extreme halophiles. Biosci. Biotechnol. Biochem., 62;

596-598.

Müller, V. and Oren, A. 2003. Metabolism of chloride in halophilic prokaryotes.

Extremophiles, 7; 261-266

Nei, M. and Li, W. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of

restriction endonucleases. Proc.Natl.Acad.Sci.(USA), 76; 5269-5273.

Ng. W. L., Kothakota, S. and DasSarma, S. 1991. structure of the gas vesicle plasmid in

Halobacterium halobium: Inversion isomers, inverted repeats and insertion

squences. J. Bact., 173(6); 1958-1964.

Ng. W. V., Ciufo, S. A., Smith, T. M., Bumgarner, R. E., Baskin, D., Faust, J., Hall, B.,

Loretz, C,. Seto, J., Slagel, J., Hood, l. and DasSarma, S. 1998. Snapshot of a

large Dynamic replicon in a halophilic archaeon: Megaplasmid or

minichromosome?. Genome research, 8, 1131-1141.

Ng. W. V., Kennedy, S. P., ahairas, G. G., Berqu,st, B., Pan, M., Shukla, H. D., Lasky,

S. R., Baliga, N. S., Thorsson, V., Sbrogna, J., Swartzell, S., Weir, D., Hall, J.,

Dahl, T. A., Welti, R., Goo, Y. A., Leithauser, B., Keller, K., Cruz, R,. Danson,

M. J., Hough, D. W., Maddocks, D. G., Jablonski, P. E., Krebs, M. P., Angevine,

C. M., Dale, H., Isanbarger, T. A., Peck, R. F., Pohlschroder, M., Spudich, J. L.,

Jung, K. H., Alam, M., Freitas, T., Hou, S., Danielsi C. J., Dennis, P. P., Omer,

A. D., Ebhardt, H., Lowe, T. ., Liang, P., Riley, M., Hood, L. and DasSarma, S.

2000. Genome sequence of Halobacterium species NRC-1. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA., 97(22); 12176-12181.

Nıemetz, R., Kärcher, U., Knadler, O., Tindall, B. J. and König, H. 1997. The cell wall

polymer of the extremely halophilic archaeon Natronococcus occultus. Eur. J.

Biochem., 249; 905-911.

Oesterhelt, D. 1998. The structure and mechanism of the family of retinal proteins from

halophilic archaea. Current opinion in structural biology, 8; 489-500.

114

Oren, A. 1983. Halobacterium sodomonse sp. nov., a Dead sea halobacterium with an

exteremely high magnesium requirement. Int. J. Syst. Bacteriol., 33; 381-386.

Oren, A., Lau, P. P. and Fox, G. E. 1988. The taxonomic status of Halobacterium

marismortui from the Dead sea: a comparision with Halobacterium vallismortis.

Syst. Appl. Microbiol., 10; 251-258.

Oren, A. 1990. Starch counteracts the inhibitory action of bacto peptone and bile salts in

media for the growth of halobacteria. Can. J. Microbiol., 36; 299-301.

Oren, A. and Trüper, H. G. 1990. Anaerobic growth of halophilic archaeobacteria by

reduction of dimethylsulfoxide and trimethylamine N-oxide. FEMS Microbiol.

Letters, 70; 33-36.

Oren, A., Ginzburg, M., Ginzburg, M. Z., Hochstein L. I. and Volcani, B. E. 1990.

Haloarcula marismortui (volcani) sp. Nov., nom, rev., an extremely halophilic

bacterium from Dead Sea. Int. J. of Syst. Bact., 40 (2); 209-210.

Oren, A. 1991. Anaerobic growth of halophilic archaeobacteria by reduction of

fumarate. J. of General Microbiol., 137; 1387-1390.

Oren, A. and Gurevich, P. 1993. Characterization of the dominant halophilic archaea in

a bacterial bloom in the Dead Sea. FEMS microbiology Ecology, 12; 249-256.

Oren, A. 1994. The ecology of the exteremely halophilic archaea. FEMS mic. Reviews,

13, 415-440.

Oren, A. Gurevich, p. 1994. Production of D-lactate, acetate and pyruvate from glycerol

in communities of halophilic archaea in Dead sea and in saltern crystalilzer

ponds. FEMS Microbiol. Ecol., 14, 147-156.

Oren, A., Gurevich, P., Gemmel, R. T. and Teske, A. 1995. Halobaculum gomorrense

gen. nov., sp. nov., a novel extremely halophilic archaeon from dead sea. I. J.

Syst. Bact., 45(4); 747-754.

Oren, A. 1996. Sensitivity of selected members of the family Halobacteriaceae to

quinolone antimicrobial compounds. Arch. Microbiol., 165; 354-358.

Oren, A., Duker, S. and Ritter, S. 1996. The polar lipid composition of Walsby’s square

bacterium. FEMS Microbiol. Letters, 138; 135-140.

Oren, A., Bratbak, G. and Heldal, . 1997. Occurence of virus like particles in the dead

sea. Extremophiles, 1: 143-149.

115

Oren, A., Ventosa, A. and Grant, W.D. 1997. Proposed minimal standarts for

description of new taxa in the order Halobacteriales. İnt. J. of Syst. Bacteriol., 47

(1); 233-238.

Oren, A and Litchfield, D. C. 1999. A procedure for the enrichment and isolation of

Halobacterium. FEMS Microbiology Letters, 173; 353-358.

Oren, A. 1999. Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiol. And Molecul. Biology

Rev., 63(2); 334-348.

Oren, A. 1999. The enigma of square and triangular halophilic archaea. In: Enigmatic

Microorganisms and Life in Extreme Environments, 337-355. Edited by J.

Seckbah. Netherland: Kluwer academic publishers.

Oren, A., Ventosa, A., Gutierrez, M. C. and Kamekura, M. 1999. Haloarcula quadrata

sp. nov., A square, motile arcaeon isolated from a brine pool in Sinai (Egypt).

İnt. J. Syst. and Evolut. Microbiol., 49; 1149-1155.

Oren, A. 2000. Biological processes in the Dead sea as influenced by short-term and

long-term salinity changes. Arch. Hydrobiol. Spec. Issues Advanc. Limnol., 55;

531-542.

Oren, A. 2000. Life at High Salt Concentrations. In: The prokaryotes. A handbook on

the biology of Bacteria: Ecophsiology, Isolation, Identifications, Applications,

3rd. Edt., (Dwarkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. H. and

Stackebrandt, E., Eds). Springer-Verlag, New York (electronic publication).

Oren, A. 2001. The Order Halobacteriales. In: The prokaryotes. A handbook on the

biology of Bacteria: Ecophsiology, Isolation, Identifications, Applications, 3rd.

Edt., (Dwarkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. H. and

Stackebrandt, E., Eds). Springer-Verlag, New York (electronic publication).

Oren, A. and Rodriguez-Valera, F. 2001. The contribution of halophilic bacteria to the

coloration of saltern crystallizer ponds. FEMS Microbiology Ecology, 36; 123-

130.

Oren, A. 2002. Diversty of halophilic microorganisms: Environments, phylogeny,

physiology, and applications. J. Indust. Micro. And Biotech. 28, 56-63.

Oren, A. 2002. Molecular ecology of extremely halophilic arcahaea and bacteria. FEMS

Microbiol. Ecology, 39; 1-7.

116

Oren, A., Elevi, R., Watanabe, S., Ihara, K. and Corcelli, A. 2002. Halomicrobium

mukohatei gen. nov., comb. nov., and emended description of Halomicrobium

mukohatei. Int. J. Syst. and Evolut. Microbiol., 52; 1831-1835.

Parolis, H., Parolis, L. A. S., Boan, I. F., Rodriguez-Valera, F., Widmalm, G., Manca,

M. C., Jansson, P. E. and Sutherland, I. W. 1996. The structure of the

exopolysaccharide producedby the halophilic archaeon Haloferax mediterranei

strain R4 (ATCC 33500). Carbohydr. Res., 295, 147-156.

Pecher, T. and Böck, A. 1981. In vivo susceptibility of halophilic and mathanogenic

organisms to protein synthesis inhibitors. FEMS Microbiol. Letters, 10; 295-297.

Pfeifer. F., Weidinger, G. and Goebel, W. 1981a. Genetic variability in Halobacterium

halobium. J. Bacteriol., 145(1); 375-381.

Pfeifer. F., Weidinger, G. and Goebel, W. 1981b. Characterization of plasmids in

halobacteria. J. Bacteriol., 145(1); 369-374.

Pfeifer, F., Blaseio, U. And ghahraman, P. 1988. Dynamic plasmid populations in

Halobacterium halobium. J. of Bacteriology, 170 (8); 3718-3724.

Pfeifer. F and Blaseio, U. 1989. Insertion elements and deletion formation in a

halophilic archaebacterium. J. bacteriol., 171(9); 5135-5140.

Pfeifer. F., Blaseio, U. and Horne, M. 1989. Genome structure of Halobacterium

halobium: Plasmid dynamics in gas vacuole deficient mutants. Can. J. Mic., 35;

96-100.

Post, F. J. and Collins, N. F. 1982. A preliminary investigations of the membrane lipid

of Halobacterium halobium as a food additive. J. Food Biochem., 6; 25-38.

Prüß, B., Meyer, H. E. and Holldorf, A. W. 1993. Characterization of the

glyceraldehyde 3-phosphate dehyrogenase from the extremely halophilic

archaebacterium Haloarcula vallismortis. Arc. Microbiol., 160, 5-11.

Quesada, E., Ventosa, A., Rodriguez-Valera, F. and Ramos-Cormenzana. 1982. Types

and propoties of some bacteria isolated from hypersaline soils. J. Appl.

Bacteriol., 53, 155-61.

Rawal, n., Kelkar, S. M. and Altekar, W. Alternaticve routs of carbohydrate metabolism

in halophilic archaebacteria. Indian J. Biohemi Biophys., 25, 674-686.

Reese, E. R., Betts, R. F. and Gümüştop, B. 2000. Handbook of Antibiyotics. Third

edition, Lippincott Williams and Willkins, U.S.A.

117

Rodriguez-Valera, F., Ruiz-Berraquero, F. and Ramos-Cormenzana, A. 1979. Isolation

of extreme halophiles from seawater. Appl. And Environ. Microbiol., 38 (1),

164-165.

Rodriguez-Valera, F., Ruiz-Berraquero, F. and Ramos-Cormenzana, A. 1980.

Isolation of extremely halophilic bacteria able to grow in defined inorganic

media with single carbon sources. J. of General Microbiol., 119; 535-538.

Rodriguez-Valera, F., Juez, G. and Kushner, D. J. 1981. Halocins: salt-dependant

bacteriocins produced by extremely halophilic rods. Can. J. Microbiol., 28; 151-

154.

Rodriguez-Valera, F., Ruiz-Berraquero, F. and Ramos-Cormenzana, A. 1981.

Characteristics of the heterotrophic bacterial populations in hypersaline

environments of different salt concentrations. Microb. Ecol., 7; 235-243.

Rodriguez-Valera, F., Juez, G. and Kushner, D.J. 1983. Halobacterium mediterranei

spec. nov., a new carbohydrate-utilizing extreme halophile. System. Appl.

Microbiol., 4; 369-381.

Rodriguez-Valera, F., Ventosa, A., Juez, G. and Imhoff, J. F. 1985. Variation of

environmental features and micobial populations with salt concentrations in a

multi-pond saltern. Microb. Ecol., 11; 107-115.

Rodriguez-Valera, F. 1988. Characteristics and microbiyal ecology of hipersaline

environments. In: Halophilic Bacteria, F. Rodriguez-Valera (Ed.),V.I, CRC.

Press, Boca Raton, Florida, 3-30.

Rodriguez-Valera, F. 1992. Biotechnological potential of halobacteria In: The

Archaebacteria: Biochemistry and Biotechnology, Danson M. J., Hough, D. W.

and Lunt, G. G. (Ed.), The Biochemical Society, Portland Press, London, ISBN:

1-85578-010-0.

Roeßler and Müller, V. 2001. Osmoadaptation in bacteria and archaea: common

principles and differences. Environ. Microbiol., 3 (12); 743-759.

Rosenshine I. and Mevarech, M. 1989. Isolation and partial characterization of plasmids

found in three Halobacterium volcanii isolates. Can. J. Microbiol., 35; 92-95.

Ross, H. N. M., Collins, M. D., Tindall, B. J. and Grant, W. D. 1981. A rapid procedure

foe the detection of archaebacterial lipids in halophilic bacteria. J. of General

Microbiol., 123; 75-80.

118

Ross, H. N. M. and Grant, W. D. 1985. Nucleic acid studies on halophilic

archaebacteria. J. of General Micrbiol., 131; 165-173.

Ruepp, A. and Soppa, J. 1996. Fermentative arginine degredation in Halobacterium

salinarum (formerly Halobacterium halobium): Genes, genes products, and

transcripts of the arcRACB gene cluster. J. bacteriol., 178(8); 4942-4947.

Schiraldi, C., guiliano, M. and DeRosa, M. 2002. Perspectives on biotechnological

applications of archaea. Archaea, 1; 75-86.

Sellek, G. A. and Chaudhuri, J. B. 1999. Biocatalysis in organic media using enzymes

from extremophiles. Enzyme and Microbial Biotech., 25; 471-482.

Shahmohammadi, H. R., Asgarani, E., Teratı, H., Saito, T., Ohyama, Y., Gekko, K.,

Yamomoto, O. And Ide, H. 1998. protective roles of bacterioruberin and

intracellullar KCl in the resistance Halobacterium salinarum against DNA-

damaging agents. J. of Radaiation Research, 39 (4); 251-262.

Shand, R. F. and Perez, A. M. 1999. Haloarchaeal growth physiology IN: J. Seckbah

(Ed.) Enigmatic microorganisms and life in extreme environments, Kluwer

Acadamic Publisher Dordrecht, 414-424.

Sioud, M., Baldacci, G., de Rocondo, A. M. and Forterre, P. 1988. Novobiocin induces

positive supercoiling of small plasmids from halophilic archaebacteria in vivo.

Nucleic Acids Resourch, 16 (4); 1379-1391.

Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. 1973. Numerical taxonomy. Freeman, San Francisco.

Sözeri, S. 2000. Seyfe Gölü (Kırşehir) Çevresi Bitkilerine Katkılar. Türkiye Herbaloji

Dergisi, 3 (2); 19-33.

Stan-Lotter, H., Pfaffenhuemer, M., Legat, A., Busse, H. J., Radax, C. and Gruber, C.

2002. Halococcus dombrowskii sp. nov., an archaeal isolate from a permian

alpine salt deposit. Int. J. syst. And Evolut. Mic., 52; 1807-1814.

Stuart, E. S., Morshed, F, Sremac, M. and DasSarma, s. 2001. Antigen presentation

using novel particulate organelles from halophilic archaea. J. Biotech., 88; 119-

128.

Takashina, T., Hamamoto, T., Otozai, K., Grant, W. D. and Horikoshi, K. 1990.

Haloarcula japonica sp. Nov., a new triangular halophilic archaebacterium.

System. Appl. Microbiol. 13; 177-181.

119

Temiz, A. 1994. Genel mikrobiyoloji uygulama teknikleri. Şafak matbaacılık, Ankara,

ISBN: 975-95834-0-2.

Tindall, B. J. 1988. Prokaryotic life in the alkaline, saline, athalassic environment. In:

Halophilic Bacteria, F. Rodriguez-Valera (Ed.),V.I, CRC. Press, Boca Raton,

Florida, 31-67.

Tindall, B. J., Tomlinson, G. A. and Hochstein, L. I. 1989. Transfer of Halobacterium

denitrificans (Tomlinson, Jahnke, and Hochstein) to the genus Haloferax as

Haloferax denitrificans comb. Nov. Int. J. syst. Bacteriol., 39(3); 359-360.

Tindall, B. J. 1992. The family Halobacteriaceae In: The prokaryotes. A handbook on

the biology of Bacteria: Ecophsiology, Isolation, Identifications, Applications,

Balows, A., Trüper, H. G., Dworkin, M., Harder, W. and Schleifer, K. H. (Ed.),

V.I, Springer Verlag, New York, 768-808.

Tomlinson, G. A. and Hochstein, L. 1976. Halobacterium saccharovorum sp. nov., a

carbohydrate-metabolizing extremely halophilic bacterium. Can. J. Microbiol.,

22; 587-591.

Torreblanca, M., Rodriguez-Valera, F., Juez, G., Ventosa, A, Kamekura, M. and Kates,

M. 1986. Classification of non-alkaliphilic halobacteria based on numerical

taxonomy and polar lipid composition, and description of Haloarcula gen. nov.

and Haloferax gen. nov.. System. Appl. Microbiol., 8; 89-99.

Torreblanca, M., Meseguer, I. and Ventosa, A. 1994. Production of halocin is a

practically universal feature of archaeal halophilic rods. Letters in Appl.

Microbiol., 19; 201-205.

Trincone, A., Nicolaus, B., Lama, L., De Rosa, M., Gambacorta, A. and Grant, W. D.

1990. The glycolipid of Halobacterium sodomonse. J. of General Microbiol.,

136; 2327-2331.

Upasani, V. N., Desai, S. G., Moldoveanu, N. and Kates, M. 1994. Lipids of extremely

halophilic archeaobacteria from saline environments in India: a novel gljcolipid

in Natronobacterium strains. Microbiolgy, 140; 1959-1966.

Ventosa, A. and Nieto, J. J. 1995. Biotechnological applications and potentialities of

halophilic microorganisms. World J. Microbiol. Biotechnol., 11; 85-94.

120

Ventosa, A. Gutierrez, M. C., Kamekura, M. and Dyall-Smith, M. 1999. Proposal to

transfer Halococcus turcmenicus, Halobacterium trapanicum JCM 9743 and

strain GSL-11 to Haloterrigena turkmenica gen. nov, comb. nov. Int. J. of Syst.

Bacteriol., 49; 131-136.

Ventosa, A., Gutierrez, M. C., Kamekura, M., Zvyagintseva, I. S. and Oren, A. 2004.

Taxonomic study of Halorubrum distributum and proposal of Halorubrum

terrestre sp. nov. Int. J. Syst. and Evolut. Microbiol, 54; 389-392.

Vreeland, R. H., Straight, S., Krammes, J, Doughherity, K., Rosenweig, W. D. and

Kamekura, M. 2002. Halosimplex carlbadense gen. nov., sp. nov., a uniqe

halophilic archaeon with three 16S rRNA genes, that grows only in defined

medium with glycerol and acetate or pyruvate. Extremophiles, 6; 445-452.

Waino, M., Tindall, B. J. and Ingvorsen, K. 2000. Halorhabdus utahensis gen. nov., sp.

nov., an aerobic,extremely halophilic member of the Archaea from Great salt

Lake, Utah. Int. J. Syst. and Evolut. Microbiol., 50; 183-190.

Weidinger, G., Klotz, G. and Goebel, W. 1979. A large plasmid from Halobacterium

halobium carrying information for gas vacuole formation. Plasmid, 2; 377-386.

Wieland, F., Lechner, J. and Sumper, M. 1982. The cell wall glycoprotein of

Halobacterium structural, functional and biosynthetic aspects. Zbl. Bakt. Hyg. I.

Abt. Orig., C3; 161-170.

Woese, C. R. and Wolfe, R. S. 1985. The Bacteria, V.II, Academic Press, USA, ISBN:

0-12-307208-5.

Woese, C.R., Kandler, O. And Wheelis, M. L. 1990. Towards a natural system of

organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA., 87; 4576-4579.

Woese, C. R. 1999. Prokaryote Systematics. The evolulition of a science In: The

prokaryotes. A handbook on the biology of Bacteria: Ecophsiology, Isolation,

Identifications, Applications, 3rd. Edt., (Dwarkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E.,

Schleifer, K. H. and Stackebrandt, E., Eds). Springer-Verlag, New York

(electronic publication).

121

Wolfang, L. and Klenk H-P. 2001. Overview: A phylogenetic backbone and taxonomic

framework for prokaryotic systematics In: Bergey’s Manual of Systematic

Bacteriology V.I, The Archaea and Deeply Branching and Phototrophic Bacteria,

Garrity, G. M. (Man. Ed.), 2nd Ed. New York, Springer, ISBN: 0387987711.

Wu, l., Chow, K. and Mark, K. 1983. The rol of pigments in Halobacterium cutirubrum

against uv irradiation. Microbiol. Letter, 24; 85-90.

Xin, H., Itoh, T., Zhou, P., Suzuki, K., Kamekura, M. and Nakase, T. 2000. Natrinema

versiforme sp. nov., an halophilic archaeon from Aibi salt lake. İnt. J. Syst. and

Evolut. Microbiol., 50; 1297-1303.

Xu, Y., Zhou, P. and Tian, X. 1999. Characterization of two haloalkaliphilic archaea

Natronorubrum bangense gen. nov., sp. nov. and Natronorubrum tibetense gen.

nov., sp. nov. İnt. J. Syst. Bac., 49; 261-266.

Yatsunami, R., Kawakami, T. and Ohtani, H. 2000. A novel bacteriorhodopsin like

protein from Haloarcula japonica strain TR-1: gene cloning, sequencing, and

transcript analysis. Extremophiles, 4; 109-114.

Yurdakulol, E., Öncel, I., Demirörs, M., Yıldız, A. ve Yüksel Keleş. 1996. Ecological

and syntaxonomic investigation of salt marshes vegetation in the vicinity of

Burdur and Acıgöl (Denizli/Turkey).Ecologia Mediterranea XXII (1/2), 51-61.

Zillig, W., Stetter, K. O., Schnabel, R. and Thomm, M. 1985. DNA-Dependent RNA

polymerases of the archaebacteria In: C.R. Woese and R. S. Wolfe (Eds), The

Bacteria-a treatise on structure and function. Archaebacteria, Academic Press

Orlando, FLVol.III, 499-521.

Zvyagintseva, I. S. and Tarasov, A. L. 1988. Extreme halophilic bacteria from saline

soils. Microbiology, 56, 664-668.

122

E K L E R

EK 1 SDS-PAGE’inde kullanılan stoklar ve hazırlanışları

EK 2 Plazmid İzolasyonunda Kullanılan Stok solüsyonları

123

EK 1. SDS-PAGE’inde kullanılan stoklar ve hazırlanışları

Akrilamid/Bisakrilamid çözeltisi

Akrilamid 29.2 g

Bisakrilamid 0.8 g

d. su 100 mL

Yığma Jeli (%4)

Akrilamid/Bisakrilamid 0.82 mL

d. su 2.93 mL

0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 1.25 mL

APS 30 µL

TEMED 5 µL

Ayırma jeli (%10)

Akrilamid/Bisakrilamid 5.78 mL

d. su 7.13 mL

1.5 M Tris-HCl (pH 8.6) 4.33 mL

APS (%10) 86.7 µL

TEMED 8.16 µL

Yükleme Tamponu Stoğu (pH 8.3)

Trizma base 1.65g

Glisin 8 g

SDS 1.4 g

d. su 1100 mL

124

Örnek tamponu (4X)

0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 5.12 mL

Gliserol 8 mL

SDS 2 g

d. su 3 mL

Merkaptoetanol 4 mL

Bromofenol blue 2.10-4 g

Coomassie Brillant Blue boya çözeltisi

Coomassie Brillant Blue R250 1.5 g

İzopropil alkol 250 mL

Glasiyel asetik asit 100 mL

d. su 650 mL

Boya Giderme Çözeltisi

İzopropil alkol 250 mL

Glasiyel asetik asit 100 mL

d. su 650 mL

125

EK 2. Plazmid İzolasyonunda Kullanılan Stok solüsyonları

Tris(50mM)-EDTA(0.25mM)-1 (pH 8)

Trizma base 0.605 g

EDTA 9.31 g

d. su 100 mL

Tris(2M)-Cl (pH 7)

Trizma base 24.22 g

d. su 100 mL

SDS Çözeltisi (pH 8)

Trizma base (50 mM) 0.605 g

EDTA (20 mM) 0.74 g

SDS 20 g

d. su 100 mL

Tris(10 mM)-EDTA(1 mM)-2(pH 7.5)-2

Trizma base 0.121 g

EDTA 0.37 g

d. su 100 mL

RNaz A Çözeltisi

5 mL Steril distile su içinde hazırlanan 0.05 M sodyum asetat çözeltisinin pH’ı asetik

asit ile 5’e ayarlanmış ve üzerine 5 mg RNaz A ilave edilmiştir. Kaynar su içinde 5

dakika tutulduktan sonra -20°C’de saklanmıştır.

126

Tris-Asetat Tamponu (10X) (pH 8)

Trizma base 4.84 g

Sodyum asetat 4.08 g

EDTA 0.37

d. su 1000 mL

Bromofenol Mavisi Çözeltisi

Bromofenol Mavisi 0.25 g

Sükroz 40 g

d. su 100 mL

127

ÖZGEÇMİŞ

13.08.1972 Malatya’da doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Malatya’da tamamladı. 1989

yılında girdiği İnönü Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü’den

(Malatya) 1993 yılında Biyolog ünvanıyla mezun oldu. 1995 yılında Mustafa Kemal

Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda başladığı yüksek lisans

öğrenimini, "Zeytinyağı Fabrikası Atığında Üretilen Lentinus tigrinus ve Laetiporus

sulphureus Funguslarından GA3, ABA ve Sitokinin Üretimi" konulu yüksek lisans

tezini vererek, 1997 yılında tamamladı. 1998 yılında Ankara Üniversitesi Fen bilimleri

Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda doktora öğrenimine başladı.

1995 yılında Mustafa Kemal Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünde

Araştırma Görevlisi olarak göreve başlamıştır. 35. madde kapsamında doktora

öğrenimini yapmak üzere Ağustos 1999 yılından bu yana Ankara üniversitesi fen

fakültesi Biyoloji bölümünde görev yapmaktadır.

128

fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ doktora tezİye’den halofİk...

Documents