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Molecular and Cellular Biology News논단

1 ●● 분 자 세 포 생 물 학 뉴 스

Zebrafish (Danio rerio)

박해철고려대학교 의과대학 대학원 의학과

E-mail: [email protected]

Zebrafish는척추동물의발생및유전자기능연구에탁월

한장점을가지고있는모델동물로서인체의유전자와크기

와수가비슷하고유전자및단백질간의상동성이매우높으

며, 신경계 및 각종 기관형성 과정이 사람과 매우 유사하기

에 인체의 각종 질병연구를 위한 질환동물모델로서도 세계

적으로 활발한 연구가 이루어지고있는 동물모델이다. 지금

까지 사용되고 있는 다른 모델동물들과 비교하 을 때의

zebrafish의가장큰장점은인간과마우스와같은척추동물

로서서로간에genome structure가매우유사하여인간유

전체 기능연구 (functional

genomics)를 위한 모델동물로

서 사용될 수 있으며, 동시에

zebrafish는 선충이나 초파리

에서나 가능한, 생체 내에서의

세포생물학적인 실험이나 대규

모유전학적인연구가가능하다

는 점이다. 또한 zebrafish는

발생중의배아가투명하며체외

에서발생이이루어지기때문에

조직특이적으로형광을발현하

는 transgenic zebrafish를 이

용하면각종장기를구성하는특정세포들의형성및이동이

나분화과정을생체내에서직접관찰할수있기때문에 in

vivo imaging을이용한중추신경계형성및각종기관형성

과 분화과정 연구에 많은 장점들을 가지고 있다. 특히

zebrafish는개체의특성상유전자의돌연변이유발및이에

따른 장기형성과정의 이상과 질병의 형성과정을 쉽게 관찰

할수있으며, 국의Sanger Center에의하여현재까지대

부분의 유전자 염기서열이 밝혀짐으로서 positional

cloning을통한질병유발돌연변이유전자의확인이매우쉬

그그림림 11.. (a) 제브라피쉬는 인도 원산으로, 길이 3-4 cm 정도의 잉어과의 소형 열대관상어이다. (b-d) 대량으로 수정란을 이용할 수 있으며, 작고 투명하며 발생이 매우 빨라 유전체 대량기능분석에 적합하다. (b) 직경 0.7 mm 정도의수정란 및 6시간째 발생배. (c) E. tube 내에서 헤엄치고 있는 일주일째의 치어. (d) 바늘 끝에 올려진 2일째 발생배.

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Molecular and Cellular Biology News

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운장점을가지고있다.

이외에도동물모델로서zebrafish가가지는특징및장점

들을살펴보면, zebrafish는 마우스와비슷하게수명은 2년

정도이고생후3개월이면번식이가능하다. 계절에관계없이

암컷은 일주일 간격으로 100-500개의 알을 낳을 수 있고,

체외수정을하고발생중의배아가투명하기때문에일반해

부현미경 하에서 쉽게 발생의 모든 과정을 관찰할 수 있다.

발생이 매우 빨라 초기 세포분열은 대장균 (20분)보다도 빠

르게 15분 간격으로 진행되며, 발생 6시간째 gastrulation

이시작되어발생10시간째에마치며, 12시간이지나면눈의

형태형성이이미시작된다. 수정후24시간이지나면심장의

박동과 혈액순환을 관찰할 수 있다. zebrafish는 허파를 제

외하고는 간, 췌장, 그리고 지라, 흉선 등 면역계를 포함한

대부분의 기관을 가지며 (그림 2), 특히 돌연변이 연구에서

밝혀지는여러결과들이인간의유전질환과매우유사한것

으로밝혀지고있다. 생체내에서의유전자들의기능분석연

구를 위한 zebrafish의 장점으로는 대량으로 쉽게 얻을 수

있는수정란를이용하여DNA 및 RNA의마이크로인젝션을

통한 gene overexpression, antisense morpholino

oligonucleotide를 이용한 gene knock out/down, 생체기

능조절물질탐색을위한chemical genomics 등의연구방법

을들수있으며, 이러한방법들은저렴한경비로빠른시간

내에 다양한 유전자들의기능분석을가능하게 해주고 있다.

또한 대량의 유전학적인 연구가 가능하기 때문에 초파리의

경우처럼 saturation mutagenesis가 가능하여 zebrafish

동물모델의 연구 초기에는 세계적으로 대단위의 chemical

mutagenesis가많이진행이되어수많은mutant들이제조

되고연구되었으며, 최근에는chemical mutagenesis 이외

에도 retrovirus나 transposon을 이용한 insertional

mutagenesis, 그리고Tilling과Zinc Finger nuclease등을

이용한target specific mutagenesis 방법들도개발이되어

이용되고있다.

Zebrafish가가지는이러한장점들로인하여세계적으로

많은 연구자들에 의하여 zebrafish를 이용한 신경계, 혈관

계, 심장, 간, 면역계등의각종기관발달관련연구가이루어

지고있으며, 기초과학연구자들뿐만아니라세계적인다국

적제약회사들에의하여zebrafish 질환모델을이용한신약

개발연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 세계적인 다

국적 제약회사인 Novartis사에서는 2002년도에 2억5천만

불을 투자하여 미국의 보스턴 지역에 건립한 BioMedical

Research Institute의 초대 연구소장에 zebrafish 연구자

인 하버드대학의 Dr. Mark Fishman을 입하여 인간의

심장질환에 대한 신약개발에 zebrafish를 이용하고 있다.

이상에서언급한바와같이zebrafish가가지는동물모델로

그그림림 22.. 수정 후 5일 경과한 zebrafish 치어. 척추동물로서 포유류가 가지는 대부분의 장기들을 가지고 있으며, 또한 뇌의 구조 및 신경계의 구조가 포유류와 매우 유사함을 보여주고 있다.

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서의장점들로인하여세계적으로연구모델을 zebrafish로

전환하는연구자들이급격히증가하고있는실정이며, 특히

대규모 mutagenesis를 이용한 연구가 아니더라도 유전자

에대한생체내에서의기능연구, 생명현상의기초연구에있

어서 동물세포배양실험이나 마우스를 이용한 실험에 비하

여훨씬적은부담의연구비로서도수준높은연구결과를얻

을수있기에국내에서도zebrafish를동물모델로이용하고

있는연구실들이급격히증가하고있는실정이다. 본리뷰에

서는최근에이루어지고있는zebrafish를동물모델로이용

하고 있는 각종 연구분야들을 살펴보고 간략히 소개하고자

한다.

Heart development

심장은척추동물배아발생과정중가정먼저생성되어기

능을 시작하는 장기이다. Zebrafish의 심장은 사람과 공통

점이 많아서, 몸 전체로 산소를 공급하기 위한 cardiac

muscle이 존재하며, 혈액이 올바른 방향으로 흐를 수 있게

cardiac chamber도 존재한다. 비록사람과달리 1심방 1심

실의 형태를 가지고 있지만, zebrafish의 심장은 사람의 심

장기능과같은역할을하며, 그역할에필요한심장의형태

도기본적으로잘보존되어있다(그림3). 특히, 산소공급이

중단되면 곧 바로 사망에 이르는 사람이나 마우스에 비해

zebrafish는혈액순환이중단되어도산소의수동확산에의해

산소가 공급되어 몇 일간 생존이 가능하여 cardiovascular

defect 연구에많이사용되고있다.

Zebrafish의 심장발생과정을 살펴보면, 발생초기에는

endocardial precursor와myocardial precursor가존재하

여, 이들이 migration과, cell transformation을 통해

heart tube를형성하고, 이후 looping과 valve 형성을통해

기능적으로완전한심장으로완성된다. Zebrafish의심장발

그그림림 33.. Zebrafish 심장의 구조적 특징. (A) 수정 후 72시간이 지난 zebrafish 배아. 심장이 yolk sac의 앞부분에 존재하며, 밖으로 드러나 있어서 육안으로 손쉽게심장의 모양을 관찰할 수 있음. (B) 간단한 실체현미경으로 관찰한 심장의 모습. 심방(atrium)과 심실(ventricle), 그리고 심장을 채우고 있는 혈액을 쉽게 관찰할 수 있음. (C) Zebrafish 심장의 sagittal histological section. 심방과 심실을 연결하는 atrioventricular (AV)-canal을 볼 수 있음. (Dahme et al., 2009)

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생은 Nodal, BMP, Fgfs, Gata factor등이 관련되어 있으

며, 이들은 nkx2.5의 발현을 조절함으로서 myocardial

differentiation등에관여하는것으로알려져있다. ENU를

이용한 chemical mutagenesis를통하여 nkx2.5의발현에

이상이 생김으로서 기형의 심장이 형성되는 swirl, one-

eyed pinhead, faust, acerebellar 등과 같은 zebrafish

mutant들이 제조되어, 이들 mutant들의 연구를 통하여

endocardial differentiation 및 myocardial

differentiation에 관여하는 factor들의 발굴과 기능 분석

연구가활발하게진행되고있다.

Zebrafish 심장의 특징으로는 다른 포유류와 달리

cardiac tissue가 injury이후에 완전히 regeneration이 가

능하다고알려져있으며, 따라서심장의 regeneration을유

발하는 기전에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한

zebrafish의 심장에 특이적으로 형광을 발현하는

cmlc2:GFP transgenic zebrafish가 제조되어 심장 발생

연구에 활용되고 있으며(그림 4), heart beat rate을 쉽게

관찰하고 측정할 수 있어서 genetic, pharmacological

screening에도 다양하게 활용되고 있다 (Huang et al.,

2003). 최근에는 사람 심장의 기능적인 면과 비교하여

electrophysiological parameter를 통해 heart function

과 regeneration 기전을 이해하고자 하는 연구가 진행되고

있다(Nemtsas et al., 2010).

Immune system

최근들어zebrafish를이용한 immunology 연구가활발

히 진행되고 있으며, 이를 통하여 zebrafish가 마우스와 매

우유사한 immune system을가지고있는것으로확인되었

다(Lieschke and Trede, 2009). Zebrafish의 면역계도 T

cell과 B cell을 가지고 있으며, 이들은 마우스와 유사한

molecular pathway를 통해 조절된다. 예를 들어 V(D)J

recombination에 필요하며, adaptive immnunity와 관련

하여T cell과 B cell 생성에필요한RAG protein중 rag1과

rag2가zebrafish에도존재하며, 수정후4일까지adaptive

immunity와 관련된유전자는발현하지않다가 4일이지난

후 부터 rag1과 rag2가 발현하기 시작하여 이후 4~6주 내

에기능적으로완전한adaptive immune system이완성된

다. 그리고 ikaros와 spi family 유전자들을발현하고있는

lymphocyte-like cell, T cell receptor (TCR) gene인

TCR-α와 TCR-β가 존재하며, cell surface receptor인

CD3, CD4, CD8이T cell의생성과성숙에관여하는것으로

확인되었다. 또한 T cell의 생성과 관련된 흉선(thymus)의

경우 사람과 마찬가지로 기능과 형태가 유사하게 존재하는

것으로 알려져 있다 (Lieschke and Trede, 2009). Innate

immunity와관련된mast cell, phagocyte, macrophage,

neutrophil, dendritic cell, NK cell등이 zebrafish에서도

역시 존재하는 것으로 확인되었으며, 이들 innate

leukocyte circulation은 특히 zebrafish를 포함한 척추동

물의 innate immunity에 중요한 기능을 수행한다.

Zebrafish의 macrophage는 췌장과 이자에서 형성되고,

granulocyte중에서 neutrophil이 가장 많이 존재하며,

blood 내에는 eosinophil이 circulation하고 있다. 따라서

최근에들어서마우스및사람과유사한면역계를가지고있

으며, 동시에 transgenesis, transplantation 및 infection

의유도가용이한zebrafish를이용한면역학연구가활발히

진행되고 있으며, 연구의 범위 또한 넓어지고 있다. 최근에

는 zebrafish cdx gene의 knockdown 실험을 통해

그그림림 44.. Zebrafish의 심장에 특이적으로 형광을 발현하는 cmlc2:GFPtransgenic zebrafish의 사진. V, Ventricle; A, Atrium. 화살표는 AV-canal을 보여주고 있음. (Huang et. al., 2003)

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inflammatory bowel disease에 관한 연구 및 mutant와

transgenic을 이용하여 inflammation과 관련된

pharmacological agent를 찾는연구도활발히이루어지고

있다. 지금까지 알려진 zebrafish의 면역계의 구성 및 특징

들은아래의표에서보는바와같다(표1).

Vasculogenesis and angiogenesis

혈관은심장과더불어매우중요한기관으로서산소와노

폐물을 포함한 혈액이 흐를 수 있는 역할을 담당하고 있다.

최근에는 암세포에 혈관신생을 막아 혈액 공급을 차단함으

로서 암세포의 성장을 저해하여 암을 치료하기위한 목적으

로서혈관생성에대한연구가이루어지고있으며, 또한심혈

관계 질환에서도 혈관신생 등을 유도한 치료법이 개발되고

있어서 혈관 발생에 관한 연구의 중요성이 대두되고 있다.

Zebrafish는 사람과 유사한 혈관계를 가지고 있으며, 혈관

형성(vasculogenesis)과 혈관신생(angiogenesis)이 사람과

유사한 기전에 의하여 조절되고 있다. 특히 zebrafish 배아

는 투명하여 혈관과 혈액의 circulation을 육안으로 관찰할

표표 11.. Components and specializations of zebrafish immune systems

(Lieschke and Trede, 2009)

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수 있다는 점에서 혈관 형성 연구에 많은 도움이 되고 있으

며, 혈관계 특이적으로 형광을 발현하는 fli:EGFP

transgenic zebrafish를 이용하면 모든 혈관계 형성과정을

살아있는zebrafish에서손쉽게관찰할수있기에 fli:EGFP

transgenic zebrafish (Lawson and Weinstain, 2002)를

이용한 mutagenesis를 통하여 다수의 혈관형성 이상

mutant들이제조되었으며, 이들을이용한혈관발생연구가

활발히진행되고있다 (그림 5). 최근에는 zebrafish에이식

된사람의melanoma 세포에의하여형성된암조직에서의

혈관 신생에 관한 연구가 이루어지고 있다 (Haldi et al.,

2006).

Internal organ development

Liver, kidney, pancreas는대표적인 internal organ으

로서 각각 detoxification, urinary system, digestive &

endocrine system에중요한역할을담당하고있다. 대부분

의vertebrate에서는 internal organ의형성과정이잘보존

되어있으며, zebrafish에서도역시이들기관의발생과정과

역할이매우유사한것으로확인되었다 (그림 6). Zebrafish

의hepatogenesis는내배엽에서부터유래되어endodermal

progenitor cell specification, differentiation, hepatic

outgrowth & morphogenesis와 같이크게 3 단계과정으

로이루어지며, 수정후 5일째에기능적으로완성된 liver를

형성하고있다(Chu and Sadler, 2009).

Hepatogenesis과정에는 prox1, hhex, hnf1b, gata

family, sox17, foxa2, foxa3과같은 factor등이관여하며,

hepatic specification에 관여하는 signaling으로는 Fgfs,

BMPs, Wnt/β-catenin pathway등이알려져있다. 최근에

는Hdac 또는DNA methyltransferase (Dnmt)의mutant

에서 liver size가 작아지거나, hepatic outgrowth가 제대

로이루어지지않아hepatic apoptosis 패턴을보이고있음

이 확인됨으로서 liver development 과정에서 epigenetic

regulation이 중요한 역할을 수행하고 있음이 밝혀졌으며,

따라서 epigenetic regulation에의한hepatogenesis 조절

기전에관한연구가활발히진행되고있다.

Zebrafish pancreas에 대한 연구는 다른 internal

organ과 마찬가지로 pancreas의 형성기전에 대한 연구가

많이수행되었으며, 최근에는pancreas regeneration 조절

기전과기능적인면에서의 diabetic study가활발히진행되

고있다. Zebrafish를포함한 vertebrate의 pancreas 형성

은 regionalization, cell differentiation, morphogenesis

과정을 거쳐 이루어지며, 여기에는 retinoic acid,

그그림림 55.. Zebrafish 혈관계에 특이적으로 형광을 발현하는 fli:EGFPtransgenic zebrafish의 사진.(Lawson and Weinstein, 2002)

그그림림 66.. 수정 후 5일이 경과한 zebrafish 배아의 liver. (A) Zebrafish의liver는 swim bladder (SB)와 notochord (N)의 앞쪽에 위치하고 있음. (B)Hepatocyte에 특이적으로 붉은색의 형광단백질을 발현하는 fabp10- dsredtransgenic zebrafish. (C) Zebrafish liver의 hematoxylin 과 eosin 염색사진.

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fibroblast growth factor, Shh, BMPs와 같은 extrinsic

signaling이pancreas intrinsic transcriptional program

에 향을주는것으로알려져있다. Pancreas는 liver와마

찬가지로 내배엽 유래의 세포에서 만들어지며, digestive

enzyme을 만들어내는 exocrine compartment (acinar

cell)와 blood sugar homeostasis를 조절하는 endocrine

compartment (islet)로 구성된다. Insulin, glucagon,

somatostatin, ghrelin을 만들어내는 각각의 세포들이

zebrafish에서도 잘 보존되어 있으며, 포유동물의

pancreas와 매우 유사한 기능을 수행하고 있다. 최근에는

exocrine cell에 diphtheria toxin (elastaseA::DTA),

nitroreductase (ins::nfsB::mCherry), tetanus toxin을

발현하도록 transgenic zebrafish를 개발하여, toxin을 이

용한 cell ablation을 유도하는 기술이 확립되었으며, 이를

바탕으로 pacreatic cell이 손상된 transgenic zebrafish에

서 pancreas의 regeneration 기전에 관한 연구가 활발히

이루어지고있다(Kinkel and Prince 2009).

Zebrafish mutagenesis

Zebrafish는초파리와동일하게유전학적연구가용이하

며 번식과 생장이 빠르고 많은 개체수를 유지할 수 있어

mutagenesis를수행할수있다. 이러한mutagenesis 방법

으로는 크게 chemical mutagenesis와 insertional

mutagenesis가있으며최근zinc finger-based knockout

방법 등이 개발되어 사용되고 있다. 먼저 chemical

mutagenesis의 방법은 주로 ENU (N-ethyl-N-

nitrosourea)를 성체수컷에 처리하여 생식세포에 point

mutation을 유발시킨다음, 정상의암컷과교배하면 3세대

후에는많은수의돌연변이체를얻을수있어높은돌연변이

유발효율을가지고있다. 1990년대독일의막스프랑크연

구소와미국의하바드대학에서ENU를이용한두차례의대

규모 chemical mutagenesis가 이루어졌으며, 이를통하여

6600개이상의돌연변이체가얻어졌으며, 이들중발생과정

동안 특이적인 표현형을 나타내는 1740개의 돌연변이체가

발표되었다. 최근에는 많은 연구그룹에서 추가적인

mutagenesis를 수행하여 in situ hybridization, 항체 염

색, 행동분석, 형질전환 물고기 등의 다양한 방법을 이용하

여 관심 있는 표현형을 나타내는 돌연변이체들을 분리하고

있다(Knapik, 2000).

ENU를 이용한 chemical mutagenesis는 높은 빈도로

돌연변이를유발시킬수있으며, 특정한표현형을가진돌연

변이체를얻을수있다는장점이있지만positional cloning

에 의하여 표현형을 유발시키는 변이유전자의 확인이 어려

운단점을가지고있다. 이러한단점을극복하고자최근에는

외부 DNA를 돌연변이 유도체로 사용하는 insertional

mutagenesis가 많이 사용되고 있다. 외부 DNA가 삽입 되

는 위치에 의하여 불완전한 단백질이 생성되거나 또는

transcript의 불안정화가 유도되어 RNA 단계의 변화를 유

발할수있다. 이러한 insertional mutagenesis는돌연변이

유도체로서 pseudotyped retrovirus (Amsterdam and

Hopkins, 2006)와 초파리의 p-element와 같은 Tol2

transposon을 이용하는두가지방법으로나누어지며, 최근

에는Tol2 transposon을이용한 insertional mutagenesis

가활발히이루어지고있다 (Sivasubbu et al., 2007). 이들

insertional mutagenesis는 chemical mutagenesis에 비

하여 변이가 일어난 유전자를 손쉽게 찾을 수 있는 장점이

있지만, 대부분의 척추동물에서 전체 genome중 exon은

1~2% 만이 발현되므로 외부 유전자의 insertion에 의하여

exon 내의 돌연변이가 유발되는 확률이 매우 낮으며, 따라

서외부유전자의삽입위치에따라유전자나단백질에변화

가나타나지않는경우가많기때문에특이적인표현형을나

타내는돌연변이체의확보가어려운단점이있다(그림7).

이상의 zebrafish를 이용한 mutagenesis방법들은 모두

random mutagenesis로서 zebrafish는 ES cell이 확립되

지 않아서 마우스의 gene knock-out과 같은 target-

specific mutation의유발은수행할수없었다. 이러한단점

을극복하고원하는유전자에mutation을유발하기위하여

최근에는 TILLING (targeting induced local lesions in

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그그림림 77.. Transposable element에 의하여 둘러싸인 ubiquitous promoter-GFP reporter DNA를 synthetic transposase RNA와 함께 1-cell 단계의zebrafish 배아에 microinjection을 하면 transposase에 의하여 reporter DNA가 무작위로 zebrafish genome에 integration 되어 mutation을 유발하게 됨.(Sivasubbu et al., 2007)

그그림림 88.. Tilling을 이용한 target gene knock-out zebrafish를 제조하는 방법.(Lieschke and Currie, 2007)

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genomes)이라는mutagenesis 방법이확립되어많이사용

되고 있다 (그림 8). TILLING은 ENU를 처리하여 다수의

mutant line들을확보한후에이들로부터genomic DNA를

분리한 다음, 관심 있는 유전자에 대한 primer를 사용하여

PCR을 수행함으로서 원하는 유전자에 변이가 일어난

mutant를 찾는 방법이다. Tilling의 원리는 target 유전자

의 exon내에 point mutation이존재할경우PCR product

에서 야생형 가닥과 돌연변이체 가닥에서 염기쌍의

mismatch에 의한 bulge구조를 형성하고, 이를

endonuclease CEL-I이 인식하여 잘라낸 후, 전기 동을

이용하여 확인하는 것이다. Tilling을 이용한 mutagenesis

방법은 동시에 여러개의 target 유전자들을 대상으로

mutant screen을 수행함으로서 짧은 시간에 많은 수의

mutant들을확보할수있는장점을가지고있지만, 많은수

의 mutagenized zebrafish를 유지해야 하며, 때로는

mutant에서전혀phenotype이나타나지않는경우가나타

나는단점이있다(Lieschke and Currie, 2007).

최근에는 ZFN (zinc finger nuclease) 기술을 이용한

zebrafish target-specific knockout이개발되어사용되고

있다. ZFN은 특정 유전자의 DNA 염기서열을 자르기 위해

고안된 제한효소로서 FokI 제한효소의 DNA cleavage

domain과 target 유전자에 대한 염기서열 특이성을 가진

zinc finger DNA binding domain (zinc finger motif)이

결합된 형태를 가지고 있으며, zinc finger motif가

binding하는 염기서열 위치의 DNA를 잘라냄으로서

mutation을유발하게된다(그림9). 따라서zebrafish 배아

에 target 유전자에 특이적으로 결합하도록 고안된 ZFN

mRNA를미세주입하여 DNA break를 유도하고이러한배

아를 키워 genotyping을 통하여 mutation의 유발을 확인

함으로서 mutant를 얻게 된다 (Ekker 2008). 따라서

zebrafish가가지는 forward genetics의 장점과더불어효

율적인 reverse genetics 또한가능하게되었으며, 더욱많

은유전자의돌연변이체가만들어질것으로기대되고있다.

하지만연구자가원하는부위에서DNA를cleavage할수있

는효과적인 ZFN을만들기위해서는여러단계의실험과정

이 필요하고, 모든 유전자에 ZFN이 작용할 수 있는지의 여

부가 확인되지 않았기에 ZFN 기술이 광범위하게 적용되기

에는시간이좀더걸릴것으로생각된다.

그그림림 99.. ZFN (zinc finger nuclease) 기술을 이용한 zebrafish target gene knockout 방법 (A) ZFN의 구조 (B) ZFN을 이용한 knock-out zebrafish의 제조과정 (Ekker, 2008)

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drug discovery

오래전부터천연물질이나그로부터추출된성분들이치료

제로서엄청난가치가있음이잘알려져있으며, 세계적으로

잘 팔리는 약의 30%정도가 천연물질로부터얻은 것들이다.

하지만 천연물질의 양은 한정되어 있기에 천연물질에서 추

출한 성분의 구조를 분석함으로서 새로운 화학물질들이 만

들어져서 신약의 소재로서 사용되어 왔다. 이러한 drug

screening을 통한 신약개발은 물질을 분리하여 그 구조를

정확히 분석하는 것이 선행되어야 하며, 그 성분의 약효 활

성이있는지를 in vitro 또는 in vivo 상태에서실험하여치

료제로서의가치가 있는지를확인하여야 하고, 이후에 사람

에게 적용되어 임상실험단계를 거쳐야 하기에 많은 시간과

노력, 그리고 비용이 요구되고 있다. 특히 동물모델을 이용

한 in vivo assay는인간에게적용하기위한필수적인단계

로서치료제로서의역할을할수있는성분을찾아내는가장

중요한 단계이며, 따라서 많은 실험동물들이 in vivo

screening을 위하여 사용되고 있다. 그중에서 마우스는 유

전학적으로나, 생리적 유사성이사람과 상당히 유사하여 포

유동물모델로서가장 많이 사용되어 왔지만, 마우스를이용

한 대단위의 drug screening은 연구방법상의 한계와 엄청

난 비용의 문제로 인하여 현실적으로 어려움이 많다. 이 외

에도C.elegans나drosophila가유전학적으로가장많이연

구된 실험동물로서 screening에 사용되어 왔지만, 이들 모

델은무척추동물로서유연관계에서사람과차이가많아제

약이많이따른다.

이들 동물모델들과 비교하여 zebrafish는 drug

screening을위한 in vivo assay에서많은장점들을가지고

있다. 첫째, mouse에 비해 많은 수의 개체수를 유지하기가

쉬우며, 둘째, 통계적인 자료를 만들기가 쉬어 재현성이 뛰

어나다. 또한 embryo가 투명하기때문에 in vivo 상에서의

organogenesis를 관찰하기가 쉬우며, 쉽게 visual

screening이 가능하다. 이외에도 zebrafish 배아는 약 5

mm로 작아서 96 well plate와 같은 작은 size의 공간으로

도 assay가 가능하기 때문에 물질을 최소한으로 사용하여

저렴한 경비로 많은 수의 chemical들을 확인할 수 있는 장

점이 있다. 특히 zebrafish는 사람에 존재하는 대부분의 장

기들을가지고있으며, 다양한mutagenesis 방법을통하여

다수의 질환동물모델이개발되어있고, 또한 유전자의유사

성이 drosophila나 C.elegans에 비하여 매우 높기 때문에

최근에는 zebrafish를 이용하여 다양한 방향으로 in vivo

drug screening이진행되고있다.

【참고문헌】

1. Amsterdam A., and Hopkins N. (2006). Mutagenesisstrategies in zebrafish for identifying genesinvolved in development and disease., Trends inGenetics Vol. 22 No.9

2. Chu, J., and Sadler, K. (2009). New school in liverdevelopment: Lessons from zebrafish. Hepatology

그그림림 1100.. Zebrafish를 이용한 drug screening의모식도. Zebrafish는 많은수의 배아를 얻을 수 있으며, 발생기간이 2일로서 매우 짧고, 배아 발생이 체외에서 이루어지며, 배아가 투명하여 기관발생과정을 관찰하기가 쉽기 때문에 invivo에서의 drug screening에 많은 장점들을 가지고 있음.

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11 ●● 분 자 세 포 생 물 학 뉴 스

50, 1656-1663.3. Dahme, T., Katus, H. A. and Rottbauer, W. (2009)Disease Models & Mechanisms 2, 18-22.

4. Ekker, S.C. (2008). Zinc Finger-Based KnockoutPunches for Zebrafish Genes. ZEBRAFISH 5, 121-123.

5. Haldi M, Ton C, Seng WL, McGrath P. (2006).Human melanoma cells transplanted into zebrafishproliferate, migrate, produce melanin, form massesand stimulate angiogenesis in zebrafish.Angiogenesis 9, 139-151.

6. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J.,and Tsai, H. J. (2003). Developmental Dynamics228, 30-40.

7. Kinkel, M. D., and Prince, V. E. (2009). On thediabetic menu: Zebrafish as a model for pancreasdevelopment and function. BioEssays 31, 139-152.

8. Knapik EW. (2000) ENU mutagenesis in zebrafish -

from genes to complex diseases. MammalianGenome 11, 511-519

9. Lawson, N. D., and Weinstein, B. M. (2003).Arteries and veins: Making a difference withzebrafish. Nature reviews in genetics 3, 674-682

10. Lieschke, G. j. and Currie PD. (2007) Animalmodels of human disease: zebrafish swim intoview. NATURE REV GENETICS 8, p5.

11. Lieschke. G. J. and Trede, N. S. (2009) Fishimmunology. Current biology, 19, R678-R682.

12. Nemtsas, P., et al. Adut zebrafish heart as a modelfor human heart? An electrophysiological study.(2010) Journal of molecular and cellular cardiology48, 161-171.

13. Sivasubbu, S., Balciunas, D., Amsterdam, A., andEkker, SC. (2007) Insertional mutagenesisstrategies in zebrafish. Genome Biology 8(Suppl I),S9

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