1

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E13Técnicas de formulación y

estabilización de biomateriales

Docente a cargo: Pilar BueraColaboradores: Florencia Mazzobre, Patricio Santagapita

Desarrollo del curso

22/04: Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos.

Transiciones de fase y estado. Problemas 1 a 3.

29/04: Metodología para la caracterización de las transiciones. Problemas 4 a 8.

06/05 Procesos de congelación y liofilización. Problemas 9 a 11.

13/05: Secado por aspersión. Encapsulación. Demostraciones prácticas. Problemas 12, 13

20/05 Teórica. Isotermas de sorción de agua Problemas 14 a 18.

02/06: Estabilidad/reacciones de deterioro. RMN. Problemas 20-22.

05/06: TP. Revisión de problemas. Discusión general.

16/06 examen integrador.

•Aspectos básicos de las formulaciones paraconservación de biomoléculas y microorganismos.•Transiciones de fase y estado. •Metodología para la caracterización de lastransiciones.

1ª parte.

Ciencia de Materiales

AspectosEstructurales

Ciencia dePolímeros

Estabilidad de biomoléculas

2

Aplicaciones

Medicina Biotecnología

TecnologíaFarmacia

Biología

embriones

enzimascélulas

anticuerposliposomas

hormonas

Objetivo Objetivo

obtener biomolbiomolééculasculas conservablesconservables a a largo plazo, con actividad largo plazo, con actividad recuperablerecuperable..

Para ello:deben estar inhibidas las reacciones

químicas y biológicas que son responsables de la degradación.

Debe conservarse la estructura físicay funcionalidad

Mapa de estabilidad y aW

Opciones:

Congelación

Deshidratación

3

PeroPero……QuQuéé pasa si las pasa si las biomolbiomolééculasculas quedan quedan en ambientes restringidos de agua?en ambientes restringidos de agua?Puntos crPuntos crííticos:ticos:

•Membranas celulares

•Proteínas

En ambientes de humedad restringida las biomoléculassufren estrés causado por alteraciones en sus interacciones con el agua.agua.

La molLa moléécula de aguacula de agua es

altamente polar y noaltamente polar y no--lineal.lineal.

δ+ δ+

2δ−

4

La estructura y funcionalidad de biopolímeros está determinada en gran parte por su afinidad por el agua.

También el agua juega un papel decisivo en las estructuras celulares.

Los cambios en el estado físico del agua provocan alteraciones con distinto grado de irreversibilidad.

-El agua y la vida: mecanismos de protección en organismos vivientes en condiciones extremas de humedad y temperatura.

CCóómo se busca la solucimo se busca la solucióón?n?

1. Planteando c1. Planteando cóómo resuelve la mo resuelve la naturaleza el mantenimiento de la vida naturaleza el mantenimiento de la vida en condiciones extremas? en condiciones extremas? •Muy altas o muy bajas temperaturas

•Muy altas o muy bajas presiones

•Deshidratación

Los organismos que viven bajo condiciones des estrés hídrico o térmico tienen su bioquímica adaptada, o bien tienen los mecanismos que les permiten sobrevivir en estado de latencia hasta que las condiciones ambientales sean favorables:

Extremófilos

Criptobiotes

Anhidrobiotes

5

TardigradeTardigrade 500mm500mm

α, α -trehalosa

O

H

HO

H

HO

H

OHHH

OH

O

H

OH

H

OH

H

HO H

OH

H

O

CCéélulaslulas de de levaduralevadura3 ~ 8mm 3 ~ 8mm

ArtemiaArtemia salinasalina 0.1cm 0.1cm

O

H

HO

H

HO

H

OOHH

H

OH

H

HHO H

H OHO

OH

OH

SacarosaPlantasPlantas de la de la resurrecciresurreccióónn

PolenPolen

Plantas de la resurrección

Ej.Selaginella lepidophylla

AnhidrobiosisO

OCH2

OHOH

OH OH

OH

OH

CH2

OH

rafinosa

OCH2

OCH2OHOH

OH

OH

O

O

OCH2OH

OHOH

OH OH

OH

OH

CH2

OH

sacarosa

OCH2

β -fructofuranósidos

O

O

O

CH2OH

OHOH

OHOH

OH

OHCH2OH

α ,α- trehalosa

α-glucopiranósido

sacarosa

rafinosaβ-fructofuranósidos

SemillasSemillas

6

Lecciones de la Naturaleza:Lecciones de la Naturaleza:Solutos que acumulan organismos Solutos que acumulan organismos resistentes a la deshidrataciresistentes a la deshidratacióónn

Proteínas

Sales/aminoácidos

Azúcares

Contribuyen al ajuste osmótico

Puentes de H

Estabilización de proteínas y membranas

Medios de alta viscosidad

Capturan radicales libres

VidVidriosrios

Protector de proteínas

Protector de Protector de proteproteíínasnas

Protector de membranas

Protector de Protector de membranasmembranas

Pereira et al. Biophys J 2004

w.o. T, 200Cw.o. T, 52C

+ T 1M, 200C + T 2M, 200C

Efecto de trehalosa sobre membranas biológicas- Altas T

Totalmentehidratado

Parcialmentedeshidratado

Deshidratado

Totalmentehidratado

Parcialmentedeshidratado Deshidratado

7

DPPC en la región de estiramiento asimétrico del fosfato.

_ . _ DPPC seca ( 1258 cm-1)

--- hidratada ( 1229 cm-1)

___ seca con trehalosa ( 1227 cm-1)

Solutos protectores de biomoléculas

•Sacarosa.

•Manitol.

•Lactosa.

•Trehalosa.

•Sorbitol.

Propiedades estabilizantesde azúcares amorfos..

Inhibición de reacciones químicas

Protección de proteínas

Protección de membranas

Medios de alta viscosidad

Capacidad de interactuar por puentes H

Vidrio

No cristalino (vítreo o sobreenfriado)

}

Pasos para el desarrollo de sistemasde biomoléculas estables:

• Formulación

• Operación y control de proceso

• Evaluación de la calidad

• Estimación de la estabilidad

8

Principales aspectos:

•Características de los comp. activos del producto(proteínas, enzimas, pigmentos, membranas, microorganismos, etc.)

•Características de componentes del medio (biopolímeros, azúcares, sales, buffers)

•Proceso, equipos

•Acondicionamiento final de producto

•Estabilidad

Requerimientos:Requerimientos:

Las biomoléculas lábiles y estructuras deben ser :

• preservadas durante el proceso.

• preservadas durante su posterior almacenamiento.

• su actividad recuperable al rehidratar o descongelar.

Aspectos a considerar:

•Mecanismos involucrados

•Relación vitrificación estabilidad

Las Las transiciones de fase y estadotransiciones de fase y estado de las de las biomolbiomolééculasculas afectan su funcionalidad afectan su funcionalidad y pueden servir como y pueden servir como ííndice para ndice para predecir estabilidadpredecir estabilidad

Esencialmente corresponden a:Esencialmente corresponden a:

VitrificaciVitrificacióónn

Transiciones entTransiciones entáálpicaslpicas

9

VitrificaciVitrificacióónn

La estabilidad de muchas La estabilidad de muchas biomolbiomolééculasculasen medios congelados o deshidratados en medios congelados o deshidratados ha sido atribuida a la formaciha sido atribuida a la formacióón de n de vidrios.vidrios.

Matriz

Agua

Biomoléculas

Interacciones

VitrificaciVitrificacióón.n.

Los sLos sóólidos amorfos son materiales lidos amorfos son materiales metameta--estables estables con con alta viscosidadalta viscosidad y y baja movilidad molecularbaja movilidad molecular, , existen en un estado de existen en un estado de nono--equilibrio equilibrio yyexhiben cambios exhiben cambios dependientes del tiempodependientes del tiempo

a medida que se acercan al equilibrio.a medida que se acercan al equilibrio.Muchos cambios quMuchos cambios quíímicos y estructurales micos y estructurales ocurren muy lentamente en los sistemas ocurren muy lentamente en los sistemas vvíítreos, y no se perciben en marcos de treos, y no se perciben en marcos de tiempo prtiempo práácticos. cticos.

Vidrio (amorfo)

Demasiado quebradizo y muy alta Tm

Vidrio común

vidriosvidriosSiO2 en su estado cristalino: cuarzo

cristalcristal

10

El estudio de los El estudio de los vidriosvidrios se se realizrealizóó inicialmente en sinicialmente en sóólidos lidos inorginorgáánicos, y se desarrollnicos, y se desarrollóó en en ciencia de polciencia de políímeros, pero meros, pero sustancias como azsustancias como azúúcares cares pueden generar estructuras pueden generar estructuras vvíítreas y esttreas y estáán ampliamente n ampliamente relacionados con la estabilidad relacionados con la estabilidad de biomolde biomolééculas.culas.

El cambio en el estado fEl cambio en el estado fíísico que sufre un sico que sufre un material material amorfo vamorfo víítreotreo al pasar al estado de al pasar al estado de llííquido quido sobreenfriadosobreenfriado se conoce comose conoce comotransicitransicióón vn víítreatrea..

Esta transformaciEsta transformacióón ocurre a cierta n ocurre a cierta temperatura,temperatura, temperatura de transicitemperatura de transicióón n vvíítrea (Ttrea (Tgg),), que depende del contenido de agua que depende del contenido de agua y de las caractery de las caracteríísticas de cada sistema. sticas de cada sistema.

Los vidrios dejan de comportarse como sólidos amorfos cuando la temperaturasupera el valor de TTgg, temperatura detransición vítrea.

En este punto pierden la rigidez que los caracteriza y se tornan flexibles o gomosos.

En sistemas biológicos se le atribuye a este cambio efectos nocivos sobre su conservabilidad.

Colapso estructural por Colapso estructural por almacenamiento de muestras de almacenamiento de muestras de maltosa liofilizadas a temperaturas maltosa liofilizadas a temperaturas superiores a su Tsuperiores a su Tgg..

control Almacenada a T>Tg

11

Los diagramas temperatura/composición permiten mostrar la influencia de los solutos en las transiciones de fase del agua.

Por simplicidad solo se muestran los cambios de fase sólido/líquido, que son los que interesan en la liofilización.

Hay que considerar 2 casos:

•Sistemas en equilibrioen equilibrio con formación de eutéctico.

•Sistemas que forman vidriosforman vidrios fuera del equilibrio.Reid, 2006

Caso 1.Caso 1. Sistemas en equilibrio termodinámico que forman eutécticos. Ej.: sales, manitol

A

D

C

BE La línea DBE

determina la menor temperatura a la cual puede existir líquido

Tm

Tms

Tm es la temperatura de fusión/cristalización de agua pura (0°C) y Tms es la temperatura de crist/fusión de soluto puro.

A medida que se agrega agua al soluto o soluto al agua, las correspondientes temperaturas de fusión disminuyen (curvas AB y CB).

La curva CB corresponde a la de solubilidad.

Al enfriar una solución inicialmente a la temperatura TT y composición CC22 , en forma lenta para permanecer en permanecer en equilibrioequilibrio, disminuye la temperatura y no hay cambio de fase, permaneciendo líquida hasta TT11 que es la temperatura de cristalización correspondiente a esa composición. Se forman los primeros cristales de hielo.

T

T1

solución

Solución + soluto Solución

+ hielo

Al seguir enfriando hay menos agua en la solución, que se concentra. En el punto UU tenemos un mezcla de cristales de hielo y una solución de comp. C3

U

12

Si consideramos ahora una solución de composición CC33 a la temperatura TT, podemos ver que es necesario enfriarla hasta TT22para que se formen los primeros cristales de hielo. En este punto la solución no congelada de CC33 será idéntica a la de CC22enfriada hasta TT22. La diferencia entre ambas es la cantidad de hielo formado.

T

T2

T

solución

Solución + soluto Solución

+ hielo

Cuanto mCuanto máás s concentrada es concentrada es la solucila solucióón n inicial, menos inicial, menos cantidad de cantidad de hielo presente.hielo presente.

Reid, 2006

La realidad:La realidad:

Muchas veces el equilibrio termodinámico no se alcanza en escalas de tiempo compatibles con los experimentos, y los solutos no cristalizan, dando lugar a una prolongación de la curva ABAB.

En cierto punto, alcanzamos una T y conc. de soluto donde la cristalización de hielo está cinéticamente impedida, y corresponde a la intersección con la curva del vidrio.

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

0 0.2 0.4 60 80 100

Fracción másica de sólidos (%)

Tem

pera

tura

(°

C) Tm

Tg

Ts

solución

100

120

Curva

del v

idrio

13

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

0 0.2 0.4 60 80 100

Fracción másica de sólidos (%)

Tem

pera

tura

(°

C) Tm

Tg

Ts

solución

100

120

Curva

del v

idrio

En En loslos procesosprocesos de de deshidratacideshidratacióónn o o congelacicongelacióónn se se puedenpueden generargenerar sistemassistemasvvíítreostreos. .

La fusiLa fusióón de sn de sóólidos cristalinos, seguido lidos cristalinos, seguido por un enfriamiento rpor un enfriamiento ráápido tambipido tambiéén n genera estructuras vgenera estructuras víítreas. treas.

Sólidos amorfos y estado vítreo

Esquema de la formaciEsquema de la formacióón de n de ssóólidos amorfos o cristalinoslidos amorfos o cristalinos1. Durante la congelaci1. Durante la congelacióónn

Congelado rápido

matriz amorfa

Congelado lento

hielo

aguasoluto

Esquema de la formaciEsquema de la formacióón de n de ssóólidos amorfos o cristalinoslidos amorfos o cristalinos2. Durante la deshidrataci2. Durante la deshidratacióónn

Deshidratación rápida

Deshidratación lenta

Cristales de soluto

aguasoluto

matriz amorfa

14

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

0 0.2 0.4 60 80 100

Fracción másica de sólidos (%)

Tem

pera

tura

(°

C) Tm

Tg

Ts

solución

100

120

Vitrific

ación

Cristalización de agua

Cris

taliz

ació

n

de so

luto

s

Diagrama de estado Determinación de las temperaturas de transición de fase y estado

Propiedades térmicasDTA

DSC

TGA

Propiedades espectroscópicasRMN

IR

Raman

RSE

Propiedades eléctricasDETA

DEA

Conductividad

Propiedades mecánicasMS

DMA

DMTA

Técnicas microscópicas y análisis de imágenes

DSC Differential Scanning Calorimetry

Horno

Sensores

Referencia

Muestra

DeterminaciDeterminacióón de las n de las temperaturas de transicitemperaturas de transicióón n

DSC Differential Scanning Calorimetry

Tm = Temperatura de la muestraTR = Temperatura de la referenciaTC = Temperatura de la celda

Tm - TR = dT

Flujo de calorhacia la referenciaTm TR

TC

Flujo de calorhacia la muestra

15

Sensor-vista superior

Tanque de N2 (l)

Tanque de N2 (g)

DSC

caudalímetro

CalorimetrCalorimetríía diferencial de barrido: a diferencial de barrido: TermogramaTermograma ttíípico de un pico de un azazúúcar liofilizado (adaptado de car liofilizado (adaptado de RoosRoos, 1992)., 1992).

TRANSICITRANSICIÓÓNNVVííTREATREA

Región vítrea

Regiónsobreenfriada

Formación decristales

Fusión decristales

Temperatura/tiempo

Fluj

ode

cal

or

Transiciones de fase de un sólido amorfo

DeterminaciDeterminacióón de la n de la temperatura de transicitemperatura de transicióón n

vvíítrea por DSCtrea por DSC

Temperatura

Δcp

Τg onset

Τg endsset

Τg midpoint

Fluj

o ex

otér

mic

o de

cal

or

16

Efecto del agua:Efecto del agua:

VariaciVariacióón de n de TTgg en funcien funcióón n del contenido del contenido de agua para de agua para glucosa y glucosa y maltosa.maltosa.

TransiciTransicióón vn víítrea de mezclastrea de mezclas

AdemAdemáás del agua, otros compuestos miscibles s del agua, otros compuestos miscibles modifican la Tmodifican la Tgg de un dado componente de un dado componente

TransiciTransicióón vn víítrea de mezclastrea de mezclas

EcuaciEcuacióón de n de Gordon y Taylor:Gordon y Taylor: Relaciona Relaciona TTgg de mezclas de mezclas binarias con la fraccibinarias con la fraccióón en masa y la Tn en masa y la Tgg de los componentes de los componentes individuales. individuales.

21

2211

wkwTwkTw

gmezclaggT ⋅+

⋅⋅+⋅=

TTg mezcla g mezcla = T= Tgg observado para una mezcla binariaobservado para una mezcla binariaww11 y wy w22 = fracci= fraccióón en masa de los componentes puros n en masa de los componentes puros TTg1g1 y Ty Tg2 g2 = T= Tgg de los componentes purosde los componentes purosk = constante (representa la fuerza de interaccik = constante (representa la fuerza de interaccióón entre los n entre los componentes del sistema).componentes del sistema).

17

Ec. de Gordon y Taylor 21

2211

wkwTwkTw

gmezclaggT ⋅+

⋅⋅+⋅=

Transiciones entTransiciones entáálpicaslpicas

Agua, azúcares, lípidos Fusión Cristalización

polioles,

Almidón gelatinización retrogradación

Proteínas desnaturalización agregación

DSC Differential Scanning Calorimetry

mW

-6

-4

-2

0

min

C130 132 134 136 138 140 142 144

0 1 2 3 4 5 6 7

1

2 Exot.

Endot.

Deflección inicial

Area = calor involucrado

Flujo de calor (dh/dt) = TS - TR

dU/S

18

Ejemplos. 1. Desnaturalización de proteínas

Integral -28.76 mJ normalis. -4.23 Jg^-1

Integral -92.73 mJ normalis. -17.17 Jg^-1

Soybean

Lupines

Spelt

WheatmW2

°C50 60 70 80 90 100

^exo Vegetable Proteins (1) 13.03. 1998 10:14:32

DEMO Vers ion SystemeRTAMETTLER TOLEDO S

2. Gelatinización de almidón

Integral -36.31 mJ normalized -7.52 Jg^-1Peak 69.61 °C

Wheat

Corn

Potato

Rice

mW2

°C40 50 60 70 80

^exo Gelatinization of Starch (7) 13.03.1998 10:12:38

DEMO Vers ion Syst emeRTAMETTLER TOLEDO S

3. Fusión/crist. de lípidos

19

Extracto lipídico

-50 -25 0 25 50-1.00

-0.75

-0.50

-0.25

0.00

T (°C)

mW

Termogramas de semillas de sauce

SAUCE

0 2 4 6 8 10 12 140

20

40

60

80

100

C.A.

T g, °

C

Diagrama de estado de semillas de nim (neem o lila india)

Sacandé y col., 2002

TTéécnicas complementarias:cnicas complementarias:MicroscopMicroscopíía a

MicroestructuraMicroestructura de de sistemas amorfossistemas amorfos

20

50µm

AUTO SEQUENTIAL SWITCHING UNIT

Heating and Freezing stage

Temperaturecontrol system

N tank2

Videocamera

Optical microscope

ClausseClausse, 2006, 2006

Platina térmica

Platina térmica Sistema de control de temperatura

Tanque de N2 L

-300

-200

-100

0

100

200

300

-60 -40 -20 0 20 40Temperature (°C)

Hea

t flo

w (m

W)

Exot

herm

icEn

doth

erm

ic

+20°C

Free

zing

Icemelting

-17°C-20°C

-1°C +4°C

Unfrozenwater

Ice

ClausseClausse, 2006, 2006

masa = 28 mg; energía de congelación: 66.06 Cal/g ; energía de fusión: 78.45 Cal/g

Termogramas de agua (DSC)

Rayos X

Para analizar cristalinidad o amorficidad

TTéécnicas complementarias:cnicas complementarias:

21

Todos los solutos forman vidrios?

Dulcitol

(galacti-tol)

Sorbitol

Iditol

Maltitol

Manitol

solucisolucióón cristal n cristal

Conformaciones moleculares de polioles

cc

vv

vv

vv

cc

No deben modificar su conformación al cristalizar

Manitol y dulcitol, que tienen mayor tendencia a cristalizar, tienen mayores temperaturas de fusión y mayores ΔHf

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

0 0.2 0.4 60 80 100

Solid mass fraction (%)

Tem

pera

ture

(°C

) Tm

Tg

Ts

cg'

solution

ice+glass

glass

Tg'

ice crystal growthMaximum

Maximum ice nucleation

100

120

V

G

Max

imum

solu

tecr

ysta

l gro

wth

Maxim

umso

lute

nucl

eatio

n

Maximum ice crystallization rateice + freeze-concentrated solution

crys

talliz

ation

rate

Maxim

unso

lute

C

B E

ce

A

D

F

VitrificaciVitrificacióón n por por congelacicongelacióón n rráápida o pida o secadosecado