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FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA
LA INHIBICIÓN DE LAS E3 UBIQUITIN-LIGASAS, A
TRAVÉS DE NF-кB Y p38, PREVIENE LA ATROFIA
MUSCULAR. UTILIDAD DE LA INDOMETACINA Y EL
ALOPURINOL
Presentado por:
Beatriz Ferrando Forés
Dirigida por:
Prof. D. José Viña Ribes
Prof. Dña. Mari Carmen Gómez Cabrera
Dra. Dña. Gloria Olaso González
Programa de Doctorado en Fisología. Valencia, 2014
FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA
Prof. D. José Viña Ribes, Catedrático del Departamento de Fisiología de la Facultad de
Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia.
Prof. Dña. Mari Carmen Gómez Cabrera, Profesora Titular del Departamento de
Fisiología de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia.
Dra. Dña. Gloria Olaso González, Doctora en Químicas por la Universidad de
Valencia y Técnico Superior de Investigación en el Departamento de Fisiología de la
Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia.
CERTIFICAN:
Que Dña. Beatriz Ferrando Forés, Licenciada en Ciencias de la Actividad Física y
Deporte por la Universidad de Valencia, ha realizado bajo su dirección la presente tesis
titulada:
“LA INHIBICIÓN DE LAS E3 UBIQUITIN-LIGASAS, A TRAVÉS DE NF-кB Y
p38, PREVIENE LA ATROFIA MUSCULAR. UTILIDAD DE LA
INDOMETACINA Y EL ALOPURINOL”
Para la obtención del título de Doctora.
Y para que conste a los efectos oportunos, firman la presente certificación.
Valencia, a 4 de Abril de 2014.
Fdo. D. José Fdo. Dña. Mari. Carmen Fdo. Dña. Gloria
Viña Ribes Gómez Cabrera Olaso González
La presente Tesis Doctoral ha sido financiada por:
- Beca de realización de contratos de personal investigador en formación del
Programa VALi+d. Concedida por la Generalitat Valenciana, Conselleria
d’Educació.
- Beca para estancias de becarios y contratados predoctorales en centros de
investigación en el extranjero (2012). Concedida por la Generalitat Valenciana,
Conselleria d’Educació.
No creía que fuese tan difícil escribir los agradecimientos de una tesis doctoral,
pero llegado el momento me he dado cuenta de que no hay palabras para agradecer a
todas aquellas personas que me han acompañado, a lo largo de estos años, a recorrer
este camino lleno de esfuerzo, trabajo, dedicación, ilusión y pasión.
Primero de todo, quiero agradecérselo a mis directores de tesis, los cuales me
han ayudado a llevar a cabo este trabajo y a los que agradezco, de todo corazón, la
formación tan valiosa que me han dado. Les doy las gracias por su trabajo, pero también
por haber confiado y creído en mí.
Al Dr. José Viña, me gustaría agradecerle la oportunidad que me brindó al
aceptarme para formar parte de su gran familia científica y por la confianza que ha
depositado en mí durante todos estos años. Sin duda, sus conocimientos y su
experiencia han sido la clave de esta tesis doctoral. Gracias, también, por recordarme
que en ciencia, como en la vida, debemos saber caminar antes de aprender a correr.
A la Dra. Mari Carmen Gómez, principalmente, me gustaría darte las
GRACIAS por recibirme aquel primer día en tu despacho, sin conocerme y sin que
hubiese terminado aún la licenciatura, en el que me diste un voto de confianza, me
presentaste al Dr. Viña y me mostraste este nuevo mundo de la investigación, del cual
ya me siento parte completamente. Eres todo un ejemplo para mí y para todas aquellas
personas que disfrutan “haciendo ciencia”, por toda la dedicación y vocación
investigadora que nos transmites día a día.
A la Dra. Gloria Olaso, por todo el apoyo y la ayuda que me has brindado
durante todos estos años. No pierdas nunca esa sonrisa con la que, pacientemente, nos
recibes cada vez que nos asomamos por los despachos en busca de los jefes.
A Consuelo Borrás, Chelo, porque siempre has tenido tiempo para mí cuando te
he necesitado, por enseñarme que siempre se le puede dar una vuelta de tuerca a un
resultado sea positivo o negativo y que siempre hay que buscar el por qué del mismo.
A Ana Lloret, por ser tan cercana a nosotros, porque siempre me has escuchado
y hablado con total sinceridad. Gracias por demostrarme que con tenacidad las cosas
terminan consiguiéndose.
A Juan Gambini, por estar siempre dispuesto a ayudarnos para solucionar
cualquier problema sobre protocolos. Me dijiste que te “enfadabas” porque cada año iba
cada vez menos a “molestarte” a tu despacho, pero en realidad sabes que siempre que lo
he necesitado he llamado a tu puerta y sé que siempre la has tenido abierta para darme
buenos consejos.
Al Dr. Miguel Cerdá y a la Dra. Concha López, por dejarme un huequecito de
bancada en vuestro laboratorio y por tratarme como a una más cada vez que subía a
analizar las muestras histológicas. Miguel, te estaré siempre agradecida no solo por todo
lo que me has enseñado de histología y morfología, sino por todas las conversaciones
sobre ciencia, por tener siempre la puerta de tu despacho abierta cuando lo he
necesitado y, sobre todo, por demostrarme que era capaz de hacer cosas que no creía
poder hacer.
A la Dra. Rosario Gil, desde el primer día que me viste por el pasillo de
Patología te interesaste por mi trabajo y durante estos años has seguido preocupándote
tanto por cómo iba mi tesis como por mí. ¡Eres una gran y bellísima persona!
A mis compañeros de laboratorio, con los que he compartido muchísimas horas
de bancada, risas y buen rollo en los últimos casi 5 años.
Empezando por el grupo Ejercicio:
Fréderic, tú me presentaste a mis compañeros de fatiga NF-κB y p38, con
paciencia me enseñaste a planificar experimentos, a leer y entender los protocolos y,
sobre todo, a ser precisa y rigurosa en mi trabajo. Sin duda, tuve una gran suerte de que
te cruzaras en mi camino, has sido un gran maestro y mejor persona. A Fabían, por
ocuparte de mí y enseñarme a manejarme en el laboratorio hasta la llegada de Fred. A
Vladimir y Rebeca, porque sin vosotros el laboratorio no hubiese sido lo mismo. A
Helios, vaya dos, a la par con el TFM y ahora con la tesis, ¡mucho ánimo! Ya mismo
iniciamos nuestra nueva etapa investigadora como postdocs. A Thomas, un gran
científico y mejor amigo, sé que llegarás tan lejos como te propongas. A Helena,
Andrea, Frederic S. gracias por estos últimos años en el lab, no perdáis nunca ese buen
rollo que tenéis y recordad que “yendo solos llegareis rápido, pero si lo hacéis en buena
compañía llegareis lejos”. Finalmente y, en especial, agradecerle a Carlos, un futuro
gran médico, todas las horas (muchas) y ayuda prestada en el montaje de jaulas,
suspensión de ratones y en la medición de las fibras (creo que sin ti me hubiese vuelto
loca con tanto azul y marrón). Sin olvidarme de toda las incidencias informáticas que
me has solucionado. Sé que lo sabes, pero no dudes nunca que aquí tienes una amiga
para lo que necesites.
Siguiendo con el grupo de Envejecimiento, agradecer todos esos buenos
momentos, tanto en el laboratorio como fuera de él, a Vicent, Mariya, Rubén, Khira,
Marta, Cristina, Lucía y Mar (nuestra mami, tanto para cuidarnos como para
regañarnos, cuando nos lo merecemos, pero siempre con cariño).
Y finalmente, al grupo de Alzheimer: Paloma, empápate de todos los
conocimientos de tus “compis” seguro que llegarás a buen puerto. Tanja me has
demostrado ser una gran compañera de trabajo y una gran amiga. Gracias, también, por
las múltiples ayudas con el inglés durante estos años. Esther, nuestra postdoc, te estaré
eternamente agradecida por compartir conmigo toda tu experiencia en el laboratorio y
por tus grandes y valiosísimos consejos tanto en lo experimental como en lo personal.
Durante estos años, para mí, te has convertido en un pilar dentro del laboratorio y una
amiga fuera de él, gracias de corazón.
A Consuelo porque, aunque nos hayas “abandonado” temporalmente, has
seguido formando parte de esta gran familia científica. Gracias por estar siempre
dispuesta a ayudarme en mis primeros años en el laboratorio, por tu ayuda con el GSH,
GSSG y MDA cuando para mí aún eran casi unos desconocidos. No sabes la alegría que
me da volver a verte por el laboratorio.
A Javier, nuestro eficaz técnico, siempre tan atento y dispuesto a solucionarnos
de la manera más eficiente cualquier problema.
A Marilyn, por tener tanta paciencia con todos nosotros, porque somos muy
cansinos y cada dos por tres estamos delante de tu mesa hablando más alto de la cuenta,
por no perder nunca la sonrisa al pedirnos amablemente que bajemos el volumen. Y sin
olvidarme de tu inestimable ayuda con el inglés, gracias.
A Mika, Elisa, Enrique, Ernesto, Ana, Sara, Analissa, Nuno y Graça, por
todos los momentos compartidos y porque vuestra estancia en Valencia ha dejado, sin
duda, una huella inolvidable en mí.
A los compañeros del CIBERER: Dr. Federico Pallardó, José Luis, Ana,
Gema, Isa, Marta y Santi.
A las chicas de Anatomía Patológica: Lisandra, Amparo, Maria, Beatriz y
Lara, porque durante estos años siempre que he necesitado un rayito de sol sabía que
podía subir a la 1E y con vosotras todos los nubarrones, experimentales o no,
desaparecían. En especial a Teresa, gracias por enseñarme la técnica de
inmunohistoquímica y por socorrerme las primeras veces que no me atrevía sola con la
“olla exprés”; aunque tu aportación más valiosa ha sido, sin duda, en el ámbito personal,
contigo podían desaparecer hasta las peores tormentas, gracias por estar siempre ahí.
A Jose Benavent, por tu paciencia al enseñarme a procesar las muestras para la
histología y por involucrarte tanto en mi trabajo, ingeniando nuevos métodos, para que
todo el trabajo saliese a la perfección (creo que si contamos las vueltas iniciales que les
dimos a esos sóleos para incluirlos en parafina nadie se lo cree).
Gran parte del tiempo invertido en esta tesis doctoral se ha realizado en el
animalario, gracias a las veterinarias Inma, por implicarte tanto en el estudio de las
ratas y estar siempre dispuesta a enseñarnos, y Ana, por estar presente y ayudarnos
tantísimo en todos los sacrificios. Agradecer también a todos los técnicos del animalario
Pili, Ana, Eli y Rafa, por ayudarme con los procedimientos con los animales día a día
durante estos años.
Al Dr. Luis Such y al Dr. Alberola, por todos los ánimos, ayuda y consejos que
me habéis brindado durante todos estos años y en especial en la recta final de la tesis.
Al Dr. Carlos Hermenegildo, por todos los consejos que me has ofrecido
durante estos años. A la Dra. Susana Novella, al Dr. Pascual Medina y la Dra. Gloria
Segarra todo un ejemplo de dedicación, y al resto del grupo L.In.C.E., en especial a
Carlos, Dani, Ana y Xavi, porque los experimentos en agosto fueron mucho más
llevaderos sabiendo que estábais al otro lado del pasillo y porque siempre se puede
contar con vosotros.
A Javier Miranda y Elena Monsalve, por despertar en mí esa pasión por la
Fisiología durante la Licenciatura. Javier, gracias por recomendarme acudir a Mari
Carmen cuando te dije que quería iniciarme en la investigación en fisiología, no podrías
haberme dado un mejor consejo, gracias.
A Gabriel Brizuela, porque nunca olvidaré mis inicios científicos en
biomecánica durante 5º de FCAFE. Gracias por abrirme los ojos y hacerme ver que la
fisiología me apasionaba tanto como la biomecánica. Sin lugar a dudas, tú eres el
“culpable” de que emprendiese este camino, me diste el empujón que necesitaba para
hablar con Javier y cinco años más tarde termino mi periodo predoctoral con la defensa
de esta tesis. Eres una gran persona, dispuesta a ayudar a todos los que te rodean y a
luchar por lo que crees, gracias por estar siempre ahí.
A las “secres” del departamento de Fisiología: Mari, Elena y Eva, por toda
vuestra ayuda y eficiencia con la burocracia, los papeles y demás procesos en los que os
he necesitado. Mari, al fin entregué todos los papeles, pasé todas las comisiones, pero
sabes que volveré a tu mesa a preguntarte por el siguiente paso.
A Inma Cerisuelo, por esos “buenos días” con los que me recibes al entrar en el
laboratorio (ya te dije cuanto eché de menos escucharlo durante mi estancia en Rennes),
por todas las conversaciones, ánimos y palabras de apoyo que me has dado durante
estos años. No pierdas nunca esa alegría, vitalidad y energía que nos transmites.
I would like to thank to the “Laboratoire Mouvement, Sport, Santé (MS2)” of
the University Rennes 2 for the kind treatment during my three months there. Specially,
I want to thank to Dra. Arlette Delamarche, it was a pleasure for me to have the
opportunity to work in your laboratory. Luz, for being so nice to me and treat me with
so much love from the first day I arrived to the laboratory. Amelie, by being aware of
me and making me feel part of the laboratory. In general, all the people that shared with
me my stay at Rennes, certainly your sweetie and attempts to teach me French during
the lunch time made more enjoyable my days in the laboratory.
Fred, you repeat acknowledgment, but this is dedicated to Elodie, and all your
friends for making me so nice my stay at Rennes, I'll never forget my debut in King
Ball.
To my training partners in Rennes, Lucy, Solène, Thibault, Jade, Marine, and
Geoffrey, thank you for making my stay wonderful. Thanks, specially, to Marc,
for all the help that you lent me, you are a great coach and a wonderful person
and France, a great friend, without you my stay at Rennes had not been the
same. Thanks for “opening me the doors of your home”. I will wait for you in
Spain.
A todos mis amigos, sin excluir a ninguno, pero en especial a Ana, Cris, Marta,
Silvia, Amaya, Clara, Daniela, Ester y Adrián (Pauni), porque a pesar de la distancia
siempre habéis estado a mi lado, gracias por vuestra infinita comprensión al no
dedicaros todo el tiempo que merecíais durante esta etapa.
A Fernando, simplemente por estar SIEMPRE ahí, no sabría sintetizar en una
frase todo lo que me has apoyado en todo, muchísimas gracias por todo lo que hemos
vivido a lo largo de tantos años.
A Gonzalo, no sé si eres consciente que siempre has estado a mi lado a la hora
de decidir qué camino tomar en mi carrera investigadora, gracias por escucharme
siempre.
A Joan, por ser tan bueno y cuidarme tanto, si diesen el premio al mejor
compañero de piso te lo llevabas de calle. Gracias, porque de tanto escucharme hablar
de mis ratones y sus tratamientos, el alopurinol, la xantina oxidasa, NF-кB y p38,
llegaron a formar parte de tu vocabulario. Gracias, también, por las incidencias
informáticas y las noches que te has peleado con mi Tablet.
A mi entrenador, José Peiró, por hacerme ver la ciencia desde otro punto de
vista, por su apoyo, comprensión y por aguantar más de una “oleada” al salir del
laboratorio. A Inma Huerta por quedarte conmigo en el gym cuando llegaba a horas
intempestivas a entrenar; a Javier Ginés y a mis compañeros de entrenamiento y
amigos de las pistas, porque de alguna forma u otra todos habéis acabado sufriendo mi
tesis (ganándome a pulso algún que otro apodo relacionado con mis animalitos, que
mejor no nombraré). Gracias por animarme siempre a seguir adelante.
Familia López-Grueso, Manoli, Manolo, Sergio y Bea, por preocuparos tanto
por mí, por apoyarme y darme tantos ánimos durante la realización de esta tesis. Y
sobre todo, por hacerme sentir como un miembro más de la familia. Gracias, de
corazón, por ese cariño andalú que me hacéis llegar desde Las Navas.
Gracies a la meua família, als meus tios: Mari Tere, Mª José i Miguel, per estar
sempre al meu costat recolzant-me en tot allò que faig, i en especial a la meua tia
Beatriz, mai oblidaré el dia que vaig decidir entrar en aquest laboratori, en una de les
nostres últimes converses en la que et contava il·lusionada i amb una mica de por tot el
que m’havien explicat que faria i tu m’animaves per a començar aquesta aventura, se
que estaries orgullosa. Als meus cosins: Miguel Angel, Núria, Leyre (gràcies per la
magnífica portada), a Isaac, Sara i els cosins polítics, gracies a tots per mostrar tant
d’interès en la meua tesis, a pesar de no saber ben be el que estava fent en tant de ratolí,
el vostre suport i els vostres ànims han fet possible aquesta tesis doctoral. A Kiara, la
nostra xiqueta, per perdonar-me no compartir més moments, en els teus primers mesos
de vida, durant la recta final de la tesis, t’ho recompensaré. Als meus iaios, pel vostre
carinyo i la vostra comprensió, per preocupar-vos sempre de com anava la tesis i com
estaven els ratolinets i les ratetes, per entendre que no pogués anar a Benicarló molts
caps de setmana que tenia experiments; gracies per ensenyar-me tantes coses, entre elles
que si tens passió per la feina que fas acaba per importar-te poc les hores de més que li
dediques.
A Raúl, mi Dr. Enreas, por demostrarme, desde mí llegada al laboratorio, que
eres un gran compañero de bancada y un gran amigo. Por contagiarme esa pasión por la
ciencia, la curiosidad y el afán de descubrir, saber y aprender que te caracterizan.
Gracias por acompañarme en este viaje en la montaña rusa denominada Tesis Doctoral,
por disfrutar conmigo de todas las alegrías y por secarme los “lagrimones” y animarme
a seguir en los malos momentos. Gracias por permitirme compartir tu vida con la mía.
Finalment, GRÀCIES, a la meua germana, Cristina (sempre seràs la meua
Enana), i als meus pares, Pepe i Eugenia, per creure en mi, per recolzar-me i donar-me
suport en tot allò que faig. Perquè sempre m’heu acompanyat i empentat cap endavant
en cadascuna de les aventures en les que m’he embarcat. Per animar-me i ajudar-me
sempre a lluitar pels meus somnis i per ensenyar-me que “voler es poder” i que tot
esforç te la seua recompensa. GRÀCIES PER SER ELS PILARS DE LA MEUA
VIDA.
Lo que caracteriza al hombre de ciencia no es
la posesión del conocimiento o de verdades
irrefutables, sino la búsqueda desinteresada e
incesante de la verdad.
(Karl Popper)
ÍNDICE GENERAL
Índice general
III
RESUMEN/ABSTRACT
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................. 1
1.1. Radicales libres ..................................................................................... 3
1.1.1. Génesis de radicales libres ..................................................... 3
1.1.1.1. Sistema hipoxantina/xantina oxidasa ............................. 5
1.2. Defensa antioxidante ............................................................................ 14
1.2.1. Antioxidantes enzimáticos ..................................................... 15
1.2.1.1. Superóxido dismutasa .................................................... 15
1.2.1.2. Catalasa .......................................................................... 16
1.2.2. Antioxidantes no enzimáticos ................................................ 17
1.2.2.1. Alopurinol ...................................................................... 17
1.2.2.2. Papel del alopurinol en la protección del músculo
esquelético .................................................................................. 21
1.3. Estrés oxidativo .................................................................................... 27
1.3.1. Estrés oxidativo y daño a biomoléculas ................................. 27
1.3.1.1. Daño oxidativo a lípidos ................................................ 27
1.3.1.2. Daño oxidativo a proteínas ............................................ 28
1.3.2.3. Daño oxidativo al DNA ................................................. 29
1.3.1.4. Daño oxidativo a glúcidos ............................................. 30
1.3.2. Indicadores de estrés oxidativo .............................................. 30
1.4. Atrofia muscular ................................................................................... 31
1.5. Atrofia muscular durante la inmovilización o inactividad muscular .... 34
1.5.1. Modelo de inducción de atrofia muscular en animales:
suspensión de miembros posteriores .............................................. 35
1.5.2. Vías de señalización comunes en la atrofia inducida por
inactividad muscular ....................................................................... 38
1.5.3. Inmovilización y estrés oxidativo .......................................... 43
Índice general
IV
1.5.3.1. Efecto de la inmovilización sobre el estrés
oxidativo en el músculo esquelético ........................................... 44
1.5.3.2. Producción y fuentes de radicales libres ........................ 46
1.5.3.3. Papel de la vía ERO/MAPKinasa p38 en el
músculo esquelético .................................................................... 48
1.5.3.4. Evolución de la defensa antioxidante
enzimática y no enzimática ........................................................ 49
1.5.4. Inmovilización y sistema ubiquitin-proteasoma:
Papel de las E3 ubiquitin-ligasas ..................................................... 50
1.5.5. Inmovilización y la vía molecular IGF-1/Akt ....................... 55
1.5.6. Descripción del factor de transcripción nuclear kappaB
(NF-кB) ............................................................................................ 57
1.5.6.1. Translocación de NF-кB al núcleo ................................. 58
1.5.6.2. Vías de activación de NF-кB ......................................... 60
1.5.6.3. Efecto de la inmovilización sobre NF-кB ...................... 64
1.6. Relación entre los 4 sistemas de regulación muscular durante la
inmovilización o suspensión ........................................................................ 66
1.6.1. Relación entre estrés oxidativo y la vía IGF/Akt .................. 66
1.6.2. Relación entre estrés oxidativo y NF-кB ............................... 67
1.6.3. Interacción entre las vías y su relación con el
sistema-ubiquitin-proteasoma durante la inmovilización
o suspensión. Resumen .................................................................... 69
1.7. Atrofia muscular durante la diabetes .................................................... 73
1.7.1. Tipos de diabetes mellitus ..................................................... 73
1.7.1.1. Diabetes tipo 1 ............................................................. 74
1.7.1.2. Diabetes tipo 2 ............................................................. 75
1.7.1.3. Diabetes gestacional .................................................... 75
1.7.2. Modelo experimental en la diabetes:
inducción química por estreptozotocina .......................................... 76
1.7.3. Estrés oxidativo y su papel en las complicaciones asociadas
a la diabetes ...................................................................................... 77
Índice general
V
1.7.4. Complicaciones músculoesqueléticas en la
Diabetes Mellitus ............................................................................. 78
1.7.5. Mecanismos moleculares implicados en la
atrofia muscular en la diabetes mellitus .......................................... 81
2. OBJETIVOS/AIMS ............................................................................... 85
3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................. 91
3.1. Materiales ............................................................................................. 93
3.1.1. Animales de experimentación ................................ 93
3.1.1.1. Ratas Wistar macho ..................................................... 94
3.1.1.2. Ratones wild-type y muscle IKKα
knockout hembra y macho ......................................... 96
3.1.1.3. Ratones wild-type C57BL/6J macho .............. 98
3.1.1.4. Ratas Wistar Ham macho .............................. 101
3.1.2. Aparatos .............................................................. 103
3.1.3. Material de laboratorio ......................................... 105
3.1.4. Reactivos ............................................................. 106
3.1.5. Kits de ensayo por inmunoabsorción ligado
a enzimas....................................................................... 110
3.2. Métodos ................................................................................................ 111
3.2.1. Modelo de suspensión de las extremidades
Posteriores para roedores, adaptación de
Morey-Holton y Globus .................................................. 111
3.2.2. Determinación de la actividad de la
Xantina Oxidasa ............................................................ 113
3.2.3. Determinación de MDA por HPLC ........................ 115
3.2.4. Extracción y separación de proteínas de la fracción
citosólica y nuclear del músculo esquelético ................... 118
3.2.5. Extracción de proteínas totales del músculo
esquelético .................................................................... 118
Índice general
VI
3.2.6. Método para determinar la concentración de
Proteínas ....................................................................... 119
3.2.6.1. Método de Lowry ........................................................ 119
3.2.6.2. Método de Bradford ..................................................... 121
3.2.7. Análisis por Western Blotting ............................................... 122
3.2.7.1 Separación electroforética de las proteínas ................... 123
3.2.7.2. Transferencia de las proteínas a la membrana ............. 123
3.2.7.3. Separación electroforética de las proteínas .................. 124
3.2.7.4. Anticuerpos primarios y secundarios........................... 124
3.2.7.5. Interpretación y cuantificación de los resultados......... 125
3.2.8. Proteínas carboniladas ........................................................... 125
3.2.9. Aislamiento de RNA de tejido músculo esquelético ............. 126
3.2.10. Cuantificación de la concentración de RNA........................ 129
3.2.11. Retrotranscripción-Amplificación del RNA
(RT-PCR) en tiempo real ................................................................. 130
3.2.11.1. Síntesis de cDNA: Retrotranscripción (RT) .............. 130
3.2.11.2. Amplificación cuantitativa del RNA
(RT-PCR en tiempo real) .......................................................... 132
3.2.12. Determinación de la concentración plasmática
de glucosa mediante el método de Trinder ...................................... 137
3.2.13. Determinación de la actividad de NF-кBp65 en
extractos nucleares de músculo sóleo .............................................. 139
3.2.14. Determinación de las concentraciones
plasmáticas de 6-keto prostaglandinas F1α ..................................... 143
3.2.15. Determinación de la concentración muscular de IL-6 ......... 147
3.2.16. Determinación de las concentraciones plasmáticas
de insulina ........................................................................................ 151
3.2.17. Determinación de las concentraciones plasmáticas
de fructosamina ................................................................................ 155
3.2.18. Inclusión de muestras para el estudio histológico ............... 158
3.2.19. Corte sobre bloque de parafina ............................................ 160
3.2.20. Estudio de la atrofia muscular:
Técnicas morfológicas e inmunohistoquímicas ............................... 161
3.2.20.1. Tinción de Reticulina de Gomori .............................. 161
Índice general
VII
3.2.20.2 Tinción de Hematoxilina-Eosina ................................ 163
3.2.20.3. Reacción del ácido periódico de Schiff (PAS) .......... 165
3.2.20.4. Estudio inmunohistoquímico ..................................... 167
3.2.21. Valoración de los resultados histológicos ............................ 170
3.3. Análisis estadístico de los resultados ................................................... 172
4. RESULTS ............................................................................................... 173
4.1. Study No. 1: Effect of 14 days of hindlimb unloading in skeletal
Muscle atrophy in male Wistar rats. Prevention by allopurinol .................. 175
4.1.1. Allopurinol prevents soleus muscle atrophy
after 14 days of hindlimb unloading in rats ..................................... 175
4.1.2. Hindlimb unloading increases plasma and
soleus muscle XO activity. Prevention by allopurinol .................... 179
4.1.3. Effect of unloading and allopurinol administration
on protein levels of soleus muscle antioxidant enzymes ................. 180
4.1.4. Effect of unloading and allopurinol administration
on plasma levels of MDA ................................................................ 181
4.1.5. Effect of unloading and allopurinol administration
on soleus muscle and plasma protein carbonylation ........................ 182
4.1.6. Effect of unloading and allopurinol treatment on
the activation of p38-MAPK ........................................................... 183
4.1.7. Effect of unloading and allopurinol treatment on
the activation of NF-кBp65 ............................................................. 184
4.1.8. Effect of unloading and allopurinol treatment on
the MAFbx and MuRF-1 mRNA levels in soleus muscle ............... 186
4.1.9. Summary ................................................................................ 187
4.2. Study No. 2: Effect of 14 days of hindlimb unloading in muscle
Atrophy in mIKKα KO and wild-type mice ................................................ 188
4.2.1 mIKKα deficient mice are protected from soleus
muscle atrophy after 14 days of hindlimb unloading ...................... 188
Índice general
VIII
4.2.2. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on the protein
levels of antioxidant enzymes in gastrocnemius muscle ................. 192
3.2.3. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in
plasma MDA levels ......................................................................... 193
4.2.4. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in
the activation of p38-MAPK ........................................................... 194
4.2.5. Effect of unloading and deficiency of mIKKα
on the activation of NF-кBp65 in skeletal muscle ........................... 195
4.2.6. Effect of unloading and deficiency of mIKKα
in the activation of Akt in skeletal muscle ....................................... 196
4.2.7. Effect of unloading and deficiency of mIKKα
on MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b levels in soleus muscle ................ 197
4.2.8. Summary ................................................................................ 199
4.3. Study No. 3: Effect of 14 days of hindlimb unloading in skeletal
muscle atrophyin male C57BL/6J mice.Prevention by allopurinol
and indomethacin ......................................................................................... 200
4.3.1. Allopurinol and indomethacin prevent soleus muscle
atrophy after 14 days of hindlimb unloading in mice ...................... 200
4.3.2. Hindlimb unloading induces plasma and liver
muscle XO activation. Prevention by allopurinol ............................ 204
4.3.3. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin
administration on protein levels of soleus muscle antioxidant
enzymes ........................................................................................... 205
4.3.4. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin
administration on plasma MDA levels ............................................ 206
4.3.5. Hindlimb unloading activates plasma 6-keto prostaglandin
F1α. Prevention by allopurinol and indomethacin ........................... 207
4.3.6. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin
administration on IL-6 levels in gastrocnemius muscle .................. 208
4.3.7. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin
treatment on the activation of p38-MAPK ..................................... 209
4.3.8. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin
treatment on the activation of NF-кBp65 ........................................ 210
Índice general
IX
4.3.9. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin
treatment on the activation of Akt in skeletal muscle ...................... 212
4.3.10. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin treatment
on the MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b levels in soleus muscle .......... 213
4.3.11. Summary .............................................................................. 215
4.4. Study No. 4: Effect of α-galacto-oligosaccharides (OGT) in skeletal
muscle atrophy induced by streptozotocin in rats ....................................... 216
4.4.1. Effect of streptozotocin-induced diabetes and OGT
administration on hematological parameters ................................... 216
4.4.2. OGT prevents soleus muscle atrophy in
streptozotocin-diabetic rats .............................................................. 217
4.4.3. Effect of T1DM and OGT administration on protein
levels of soleus muscle antioxidant enzymes .................................. 218
4.4.4. Effect of T1DM and OGT administration on the
activation of p38-MAPK ................................................................. 219
4.4.5. Effect of T1DM and OGT administration on the
expression of NF-кBp65 .................................................................. 220
4.4.6. Summary ................................................................................ 221
5. DISCUSSION ......................................................................................... 223
5.1. Justification of the study ....................................................................... 225
5.2. Limitations of the study ........................................................................ 225
5.3. Soleus muscle atrophy associated to 14 days of
hindlimb unloading protocol ....................................................................... 226
5.4. Oxidative stress is involved in muscle atrophy associated to
hindlimb unloading ...................................................................................... 229
Índice general
X
5.5. Redox sensitive signaling pathways involved in muscle
atrophy associated to hindlimb unloading ................................................... 233
5.6. Inflammatory parameters are involved in muscle atrophy
associated to hindlimb unloading ................................................................ 238
5.7. Soleus muscle atrophy associated STZ-induced diabetes type1. ......... 243
6. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS ................................................... 247
7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................... 253
8. ANEXO ................................................................................................... 291
ÍNDICE DE FIGURAS
Índice de figuras
XIII
1. INTRODUCCIÓN
Figura 1.1. Formas reducidas y oxidadas de la XOR ................................. 6
Figura 1.2. Esquema de la degradación de las purinas ............................... 7
Figura 1.3. Esquema de la inhibición de la xantina oxidasa
por el alopurinol. ......................................................................................... 19
Figura 1.4. Vías por las que se producen ERO en el músculo
esquelético durante periodos de inactividad ................................................ 45
Figura 1.5. Vía de degradación de proteínas por el sistema
ubiquitin-proteasoma ................................................................................... 51
Figura 1.6. Vía molecular IGF-1/Akt ......................................................... 57
Figura 1.7. Vía canónica de activación de NF-кB ...................................... 61
Figura 1.8. Vía no canónica de activación de NF-кB ................................. 62
Figura 1.9. Vía atípica de activación de NF-кB ......................................... 63
Figura 1.10. Vías moleculares que modulan la hipertrofia y
la atrofia muscular. ...................................................................................... 72
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 3.1 Rata Wistar y Ratón C57BL/6J durante el protocolo
de suspensión ............................................................................................... 112
Figura 3.2. Esquema aislamiento de RNA de tejido músculo
Esquelético .................................................................................................. 126
Figura 3.3 Modelo de amplificación de PCR a tiempo real ....................... 134
Figura 3.4. Etapas del ELISA. .................................................................... 143
Figura 3.5. Etapas del ELISA ..................................................................... 151
Figura 3.6. Esquema de la inclusión en parafina de una muestra
de sóleo previamente fijada ......................................................................... 160
Figura 3.7. Esquema del montaje de la imagen del corte
transversal del sóleo completo ..................................................................... 170
Figura 3.8. Imágenes de la medición del tamaño de las fibras tipo I ......... 171
Índice de figuras
XIV
4. RESULTS
Figure 4.1. Reticulin staining, staining of periodic acid-Schiff and
quantitative analyses of the cross-sectional area and the minimum
diameter of type I fibers in the soleus muscle of rats .................................. 176-177
Figure 4.2. Soleus muscle to body mass ratio, western blot and
densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain
in soleus muscle of rats. .............................................................................. 178
Figure 4.3. Results of XO activity in plasma and soleus muscle of rats .... 179
Figure 4.4. Results of Cu,ZnSOD and Catalase in soleus muscle of rats ... 180
Figure 4.5. Results of MDA levels in plasma in rats .................................. 181
Figure 4.6. Results of soleus muscle carbonylated proteins of rats ............ 182
Figure 4.7. Results of cytosolic p-p38-MAPK in soleus muscle of rats..... 183
Figure 4.8. Results of cytosolic phosphorylation NF-кBp65 in soleus
muscle of rats .............................................................................................. 184
Figure 4.9. Results of nuclear translocation of NF-кBp65 and
relative NF-кBp65 activity in soleus muscle of rats .................................... 185
Figure 4.10. Results of MAFbx and MuRF1 mRNA levels in soleus
muscle of rats ............................................................................................... 186
Figure 4.11. Summary of the Study No. 1: Effect of allopurinol in the
cell signaling pathway involved in the muscle atrophy induced by 14
days of hindlimb unloading in male Wistar rats .......................................... 187
Figure 4.12. Hematoxylin and eosin staining, myosin staining
specific of slow myosin heavy chain and the quantitative analyses
of the cross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber
in the soleus of male mice ........................................................................... 189-190
Figure 4.13. Western blot and densitometric analysis of slow skeletal
muscle myosin heavy chain in gastrocnemius of male mice. ...................... 191
Figure 4.14. Results of MnSOD and Cu,ZnSOD in gastrocnemius
muscle of male mice .................................................................................... 192
Figure 4.15. Results of MDA levels in plasma of male and female mice .. 193
Figure 4.16. Results of cytosolic p38-MAPK in gastrocnemius
muscle of male mice. ................................................................................... 194
Índice de figuras
XV
Figure 4.17. Results of phosphorylation of NF-кBp65 in the
cytosolic fraction of gastrocnemius muscle of male mice ........................... 195
Figure 4.18. Results of cytosolic Akt in gastrocnemius muscle
of male mice ................................................................................................ 196
Figure 4.19. Results of MAFbx, MuRF1, and Cbl-b mRNA
levels in soleus muscle of male and female mice ........................................ 197-198
Figure 4.20. Summary of the Study No. 2: Effect of 14 days of
hindlimb unloading in wild-type and mIKKα KO mice ............................. 199
Figure 4.21.Hematoxylin and eosin staining, myosin staining
specificof slow myosin heavy chain and the quantitative analyses
of thecross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber
in soleus muscle of mice. ............................................................................. 201-202
Figure 4.22. Soleus muscle to body mass ratio in soleus muscle of mice.
And Western blot and densitometric analysis of slow skeletal muscle
myosin heavy chain in gastrocnemius of mice ........................................... 203
Figure 4.23. Results of XO activity in plasma and liver of mice ............... 204
Figure 4.24. Results of MnSOD and Cu,ZnSOD in soleus muscle
of mice ......................................................................................................... 205
Figure 4.25. Results of plasma MDA levels mice ...................................... 206
Figure 4.26. Results of 6-ketoPGC1α concentration in plasma of mice .... 207
Figure 4.27. Results of IL-6 concentration in gastrocnemius muscle
of mice ......................................................................................................... 208
Figure 4.28. Results of phosphorylated p38 in gastrocnemius muscle
of mice. ........................................................................................................ 209
Figure 4.29. Results of phosphorylated NF-кBp65 in gastrocnemius
of mice ......................................................................................................... 210
Figure 4.30. Results of relative NF-кBp65 activity in gastrocnemius
muscle of mice. ............................................................................................ 211
Figure 4.31. Results of phosphorylation Akt in gastrocnemius muscle
of mice ......................................................................................................... 212
Figure 4.32. Results of MAFbx, MuRF1, and Cbl-b mRNA levels in
soleus muscle of mice .................................................................................. 213-214
Figure 4.33. Summary of the Study No. 3: Effect of 14 days of hindlimb
unloading in male wild-type C57BL/6J mice .............................................. 215
Índice de figuras
XVI
Figure 4.34 Results of tibialis anterior and gastrocnemius muscle
weight ......................................................................................................... 217
Figure 4.35. Results of MnSOD and Cu,ZnSOD in tibialis anterior
Muscle ......................................................................................................... 218
Figure 4.36. Results of cytosolic phosphorylation p38 in tibialis
anterior muscle ............................................................................................ 219
Figure 4.37. Results of cytosolic phosphorylation NF-кBp65 in tibialis
anterior muscle .......................................................................................... 220
Figure 4.38. Summary of the Study nº 4: Effects of
α-galacto-oligosaccharides (OGT) in streptozotocin-diabetic rats .............. 221
5. DISCUSSION
Figure 5.1. Positive and negative regulation of
NF-кB by COX-2, roles of prostaglandins .................................................. 240
ÍNDICE DE TABLAS
Índice de tablas
XIX
1. INTRODUCCIÓN
Tabla 1.1. Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno ................................ 4
Tabla 1.2. Tipos de SOD y localización celular mayoritaria....................... 16
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Tabla 3.1. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión
en ratas Wistar. Número de animales por grupo ......................................... 94
Tabla 3.2. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión
en ratones mIKKα KO. Número de animales por grupo ............................. 97
Tabla 3.3. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión
en ratones C57BL/6J Número de animales por grupo ................................. 99
Tabla 3.4. Diseño del estudio sobre el efecto de la diabetes
en ratas Wistar Ham. Número de animales por grupo ................................. 101
Tabla 3.5. Relación de anticuerpos ............................................................. 109
Tabla 3.6. Relación de anticuerpos primarios ............................................ 109
Tabla 3.7. Reactivos y volumen para la RT ............................................... 131
Tabla 3.8. Condiciones de los ciclos térmicos ............................................ 132
Tabla3.9. Secuencia de los primers utilizados en la RT-PCR .................... 135
Tabla 3.10. Volúmenes, por muestra, de la reacción. ................................. 135
Tabla 3.11. Condiciones del termociclador para la RT-PCR ..................... 136
Tabla 3.12. Volúmenes, para cada una de las condiciones
de la reacción. .............................................................................................. 138
Tabla 3.13. Volúmenes, para cada una de las condiciones
de la reacción ............................................................................................... 142
Tabla 3.14. Volúmenes, para cada una de las condiciones
de la reacción ............................................................................................... 146
Tabla 3.15. Volúmenes, para cada una de las condiciones
de la reacción ............................................................................................... 150
Tabla 3.16. Volúmenes, para cada una de las condiciones
de la reacción ............................................................................................... 154
Tabla 3.17. Volúmenes, para cada una de las condiciones
de la reacción ............................................................................................... 158
Índice de tablas
XX
Tabla 3.18. Relación de anticuerpo primario.............................................. 168
4. RESULTS
Table 4.1. Fasting glucose, fasting insulin and fructosamin
concentrations in plasma. ............................................................................ 216
ABREVIATURAS
Abreviaturas
XXIII
NOMENCLATURA
ABREVIATURA
NOMENCLATURE
4-Hidroxinonenal 4-HNE 4-Hydroxynonenal
Angstrom Å Angstrom
Ácido araquidónico AA Arachidonic acid
Absorbancia Abs Absorbance
Acetato sódico AcONa Sodium acetate
Acetilcolinesterasa AChE Acetylcholinesterase
Adenosín-5´-difosfato ADP Adenosin-5’-diphosphate
Proteína kinasa B Akt (PKB) Protein Kinase B
4-hidroxipirazolo (3,4-d)
pirimidina. Alopurinol
4 hydroxy pyrazolo (3,4-d)
pyrimidine
Adenosín-5´-monofosfato AMP Adenosin-5’-monophosphate
Análisis de la varianza ANOVA Analysis of variance
Proteína activadora 1 AP-1 Activator protein 1
Persulfato de amonio APS Ammonium persulphate
Adenosín-5´-trifosfato ATP Adenosin-5’-triphosphate
Blanco B White
Proteína x asociada a Bcl-2 Bax Protein X associated to Bcl-2
Célula B del linfoma 2 Bcl-2 B-cell lymphoma 2.
Proteína del linfoma 3 de células
B codificadas Bcl-3
B-cell lymphoma 3-encoded
protein
Linfoma de células B-extra largas Bcl-xL B-cell lymphoma-extra large
Mediador de la muerte celular
que interactúa con Bcl-2 Bim
BCL-2-interacting mediator of
cell death
Máxima unión Bo Maximal binding
Boletín Oficial del Estado BOE Official Bulletin of the State
Albúmina de suero bovino BSA Bovine Serum Albumin
Kinasa dependiente de ciclina 2 CDK-2 Cyclin-dependent kinase 2
Creatin kinasa CK Creatin kinase
Proteinas Skp1-Cullin1-F-box Complejo SCF Skp1, Cullins, F-box proteins
Ciclooxigenasa-1 y -2 COX-1 and -2 Cyclooxygenase-1 and -2
Área de la sección transversal CSA Cross sectional area
Ciclo umbral Ct Thresold cycle
Cu/Zn Superóxido Dismutasa Cu,ZnSOD Cu/Zn Superoxide dismutase
Diaminobenzidina
tetrahidroclorhídrica DAB
diaminobenzidine
tetrahydrochloride
Radioabsorciometría de doble
energía DEXA
Dual energy x-ray
absorptiometry
Ácido desoxirribonucleico DNA Deoxyribonucleic acid
2,4-dinitrofenilhidracina DNPH 2,4-dinitrophenylhydrazine
Deoxinucleótidos dNTPs Deoxynucleotides
Desoxicolato DOC Deoxycholate
DL-Ditiotreitol DTT DL-Dithiothreitol
Enzima ubiquitina de activación E1 Ubiquitin-activating enzyme
Enzima ubiquitina transportador
o de conjugación E2 Ubiquitin-conjugating enzyme
Abreviaturas
XXIV
Enzima Ubiquitin-ligasa E3 Ubiquitin-ligase enzyme
Extensor largo de los dedos EDL Extensor digitorum longus
Ácido etilendiaminotetraacético EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
Inmunoensayo enzimático EIA Enzyme immunoassay
Factor de iniciación eucariota de
la elongación 3 subunidad F eIF3-F
Eukaryotic translation initiation
factor 3 subunit F
Ensayo por inmunoabsorción
ligado a enzimas ELISA
Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay
Electromiografía EMG Electromyography
Óxido nítrico sintasa endotelial eNOS Endothelial nitric oxide
synthase Kinasas activadas por señales
extracelulares 1 y 2. Erk1/2MAPK
Kinases activated by
extracellular signals 1 and 2.
Especies reactivas de nitrógeno ERN Reactive nitrogen species
Especies reactivas del oxígeno ERO Reactive oxygen species
Dinucléotido de flavinadenina FAD Flavin adenine dinucleotide
Administración de alimentos y
medicamentos FDA Food and Drug Administration
Superóxido dismutasas
dependientes de hierro FeSOD Iron superoxide dismutase
Factor de transcripción FoxO-1 FoxO-1 Forkhead box protein O1
Transportador de glucosa GLUT2 Glucose transporter type 4
Transportadora de glucosa tipo 4 GLUT4 Glucose transporter type 4
Glucosa Oxidasa GOD Glucose oxidase
Aspartato amino transferasa GOT Glutamic oxaloacetic
transaminase
Glutatión peroxidasa GPx Glutathione peroxidase
Glutatión reducido GSH Reduced Glutathione
Glutatión oxidado GSSG Oxidized glutathione
Cromatografía líquida de alta
resolución HPLC
High-performance liquid
chromatography
Enzima peroxidasa de rábano HRP Horseradish peroxidase enzyme
Hipoxantina HX Hipoxanthine
Proteína inhibidora de apoptosis IAP Inhibitor apoptosis protein
Insuficiencia cardiaca crónica ICC Chronic cardiac insufficiency
Diabetes mellitus insulino
dependiente IDDM
Insulin dependent diabetes
mellitus
Factor de crecimiento insulínico
tipo 1 IGF-1 Insulin-like growth factor-1
Receptor tirosina kinasa del
receptor IGFR
Insulin-like growth factor-
1receptor
Inmunoglobulina M IgM Immunoglobulin M
IкΒ kinasas IKK IкΒ kinase
Interleuquina- 1 IL-1 Interleukine-1
Interleuquina- 6 IL-6 Interleukine-6
Interleuquina- 8 IL-8 Interleukine-8
Óxido nítrico sintasa inducible iNOS Inducible nitric oxide synthase
Receptor de insulina tirosin
kinasa IRS Insulin receptor tyrosine kinase
Abreviaturas
XXV
Inhibidor de кB IкB кB inhibitor
Kinasa c-Jun N-terminal JNK c-Jun N-Terminal Kinase
JunD proto-oncogen JunD JunD proto-oncogene
Kilodalton kDa Kilodalton
Factor Krüppel KLF15 Krüppel-like factor
Lipopolisacárido LPS Lipopolysaccharide
Mili amperios mA Milliamperes
Atrogina-1 MAFbx Muscle atrophy F-Box
Proteinas kinasas activadas por
mitogenos. MAPK
Mitogen-activated protein
kinase
Creatin kinasa muscular MCK Muscle creatin kinase
Malondialdehído MDA Malondialdehyde
Cadena pesada de la miosina MHC Miosin heavy chain
Agua ultrapurificada Milli-Q Ultra-purified water
Cadena ligera de la miosina MLC Miosin light chain
Manganeso superóxido dismutasa MnSOD Manganese Superoxide
Dismutase
RNA mensajero mRNA Messenger RNA
Transcriptasa reversa
MultiScribeTM MsRT
MultiScribe TM Reverse
Transcriptase
Diana de la rapamicina en
mamíferos mTOR
Mammalian target of
rapamycin
Nuevo Gen Realmente
Interesante Finger-1 muscular MuRF-1
Muscle Really Interesting New
Gene Finger-1
Proteína de diferenciación
miogénica MyoD
Myogenic differentiation
protein
N-acetil-L-cisteína NAC N-acetyl-L-cysteine
Nicotinamida adenina
dinucleótido NAD+ Nicotine Adenine Dinucleotide
Nicotinamida adenína
dinucleótido NADH
Reduced Nicotine Adenine
Dinucleotide
Factor Nuclear kappa B NF-кB Nuclear factor kappa B
Diabetes mellitus no insulino
dependiente NIDDM
Noninsulin-dependent diabetes
mellitus
Kinasa inductor de NF-кB NIK NF-кB-inducing kinase
Secuencia de localización nuclear NLS Nuclear Localization Sequence
Óxido nítrico sintasa neuronal nNOS Neuronal nitric oxide synthase
Óxido nítrico sintasa NOS Nitric oxide synthase
Antinflamatorios no esteroideos NSAID Nonsteroidal anti-inflammatory
drugs
unión no específica NSB Non-specific binding
α-galacto-oligosaccharidos OGT α-galacto-oligosaccharide
Inhibidor de la kinasa
dependiente de ciclina 1A p21Cip1
Cyclin-dependent kinase
inhibitor 1A
Protein kinasa activada por
estrés. p38 MAPK
Stress mitogen-activated
protein kinase
Gel de poliacrilamida PAGE Polyacrylamide gel
4-aminoantipirina PAP 4-aminoantipyrine
Abreviaturas
XXVI
Ácido periódico de Schiff PAS Periodic acid Schiff
Tampón fosfato salino-Tween PBS-T Phosphate buffered saline-
Tween
Pirrolidina ditiocarbamato PDTC Pyrrolidine dithiocarbamate
Polifluoruro de vinildeno PDVF Polyvinylidene fluoride
Prostaglandinas PGs Prostaglandins
Fosfatidilinositol-3-kinasa PI3K Phosphoinositide 3-kinase
Acetato de forbol miristato PMA Phorbol myristate acetate
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride
2-amino-4-hidroxipteridina Pterina 2-amino-4-hydroxy-pteridine
Regulado en el desarrollo y en las
respuestas al daño del DNA 1 REDD1
Regulated in development and
DNA damage responses 1
Dominio de homología a Rel RHD Rel homology domain
Resonancia magnética nuclear RMN Nuclear magnetic resonance
Retrotranscripción RT Retrotranscription
Amplificación cuantitativa del
RNA RT-PCR
Reverse transcription
polymerase chain reaction
Desviación típica S.D. Standard deviation
Dodecilsulfato sódico SDS Sodium dodecyl sulfate
superóxido dismutasa SOD Superoxide dismutase
estreptozotocina STZ Streptozotocine
actividad total TA Total activity
dominio de transactivación
C-terminal TAD
C-terminal transactivation
domain
ácido tiobarbitúrico TBA Thio-barbituric acid
ácido tricloroacético TCA Trichloroacetic acid
factores de crecimiento
transformante β TGF-β Transforming growth factor β
Factor de crecimiento
transformante β TGF-β Transforming growth factor β
3,3´,5,5´-tetrametillbenzidina TMB 3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine
Factor de necrosis tumoral α TNF-α Tumour-necrosis factor-α
Receptor 1 de TNF TNFR1 TNF receptor-1
Unidades arbitrarias U.A. Arbitrary Units
Voltios V Volt
Volumen/volumen v/v Volume/volume
Virus de inmunodeficiencia
humana adquirida VIH
Human immunodeficiency
virus
Silvestre WT Wild-type
xantina deshidrogenasa XDH xanthine dehydrogenase
xantina oxidasa XO Xanthine oxidase
xantina oxidorreductasa XOR la xanthine oxidoreductase
RESUMEN/ABSTRACT
Resumen
XXIX
RESUMEN
La atrofia del músculo esquelético se produce como consecuencia de múltiples
enfermedades y condiciones crónicas. Así mismo, reduce las opciones de tratamiento y
los resultados clínicos positivos, comprometiendo la calidad de vida por un aumento de
la morbilidad y la mortalidad. La producción de unos niveles mínimos de fuerza
muscular es un requisito para la realización de actividades de la vida diaria tales como
levantarse de una silla o subir escaleras. Una persona joven sana es capaz de desarrollar
este tipo de actividades sin ninguna dificultad, sin embargo tras un periodo de
inactividad largo que implique una pérdida de masa muscular este tipo de actividades
conllevan una elevada dificultad.
Tanto factores sistémicos como locales pueden iniciar la atrofia muscular. Los
factores sistémicos incluyen el aumento de la miostatina y los glucocorticoides, o la
falta de las hormonas anabólicas como la insulina o el factor-1 de crecimiento similar a
la insulina. Los factores locales incluyen la inactividad muscular, el reposo en cama,
inmovilización de miembros, la denervación muscular, distrofias musculares y el
envejecimiento muscular.
El fenómeno de pérdida de masa muscular está relacionado con el estrés
oxidativo y la inflamación en varias condiciones: inmovilización de las extremidades,
suspensión de miembros posteriores, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y sepsis.
Diversos autores han sugerido que la administración de antioxidantes protege el
músculo esquelético durante la suspensión. Sin embargo, los mecanismos moleculares
implicados en esta protección siguen siendo un tema de debate.
El objetivo principal de esta tesis doctoral es determinar los mecanismos
moleculares implicados en la pérdida de masa muscular tras un modelo de suspensión
de miembros posteriores en roedores y su posible prevención con tratamientos
farmacológicos, tales como la indometacina y el alopurinol. Este objetivo está basado en
las evidencias previas, encontradas por nuestro grupo de investigación, de la
implicación de la enzima xantina oxidasa en la generación de radicales libres en la
atrofia muscular.
Resumen
XXX
Para llevarlo a cabo hemos estudiado la principal vía de señalización sensible a
estrés oxidativo activada por mitógenos, p38MAPK, y la cascada inflamatoria de NF-
кB en la atrofia del músculo esquelético. Además, estudiamos la expresión de tres
conocidas E3 ubiquitin-ligasas musculares implicadas en la proteólisis: MAFbx, MuRF-
1 y Cbl-b. La pérdida de masa muscular durante la inactividad muscular es causada
tanto por la apoptosis de mionúcleos como por un desequilibrio entre la degradación y
la síntesis de proteínas; por esta razón hemos analizado Akt, una proteína quinasa que
desempeña un papel clave en múltiples procesos celulares, tales como metabolismo de
la glucosa y la síntesis de proteínas musculares.
Para la consecución de los objetivos de esta tesis se han llevado a cabo tres
estudios consecutivos relacionados. En el primer estudio, ratas Wistar macho sometidas
durante 14 días a un protocolo de suspensión de miembros posteriores, con o sin
tratamiento con alopurinol, se compararon con los controles. En el segundo estudio, se
utilizaron ratones silvestres y deficientes en IKKα en el músculo esquelético. En este
estudio asignamos aleatoriamente los animales al grupo control o al suspendido de las
extremidades posteriores. Por último, en el tercer estudio, ratones macho C57BL/6J,
sometidos a un protocolo de suspensión de miembros posteriores, con o sin los
siguientes tratamientos: indometacina, alopurinol o indometacina más alopurinol, se
compararon con los controles que deambulan libremente.
Nuestros resultados muestran que la suspensión de las extremidades posteriores
indujo una activación de la XO, un aumento del estrés oxidativo y de la inflamación,
tanto en el plasma como en el músculo esquelético. El estrés oxidativo activa las vías de
señalización p38 MAPK y NF-кB que conducen a la activación de las E3 ubiquitina
ligasas MAFbx y MuRF-1. La inhibición de la XO, con alopurinol, en ratas, y la
supresión IKKα en el músculo esquelético previene parcialmente la atrofia del músculo
sóleo. En relación a la vía de síntesis de proteínas, Akt, fue restaurada con el tratamiento
con alopurinol y parcialmente en los ratones KO mIKKα, por la inhibición de la E3
ubiquitin-ligasa Cbl-b.
El tratamiento que previno de forma más efectiva el proceso de atrofia muscular
fue la combinación de la indometacina más alopurinol. Esto está mediado por la
inhibición de la las vías p38-MAFbx y NF-кB-MuRF-1. Nuestros datos señalan un
beneficio potencial de la administración de indometacina junto con el alopurinol, para
Resumen
XXXI
astronautas, pacientes encamados durante periodos prolongados de inmovilización de
miembros, así como en la sarcopenia y la caquexia.
Por otro lado la atrofia del músculo esquelético es una de las complicaciones más
comunes en la diabetes. En este caso también existe un aumento de la degradación de
proteínas, así como una disminución de la síntesis de las mismas. Actualmente hay al
menos tres sistemas diferentes que han demostrado estar involucrados en la degradación
de proteínas: el sistema lisosomal, la activación de Ca2+ citosólico y el sistema ubiquitin
proteasoma. Un tema controvertido y que ha desatado mucho interés es el posible papel
de los radicales libres en la fisiopatología de la diabetes. Así pues, Oberley en 1988 ya
correlacionó el estrés oxidativo con la diabetes. La mayoría de los autores postulan el
papel del estrés oxidativo en el desarrollo de las complicaciones diabéticas debido al
daño tisular que producen los radicales libres. Sin embargo, existen algunos autores que
implican a los radicales libres no tan sólo en las complicaciones del diabético, sino
también en la misma etiología de la enfermedad. Esto se extrae a partir del estudio de
varios fármacos inductores de diabetes en animales de experimentación, como la
estreptozotocina y el aloxano, que destruyen selectivamente los islotes de Langerhans
pancreáticos por un mecanismo oxidante, y del hecho que su acción puede ser inhibida
por la administración de antioxidantes. No obstante, aunque se ha señalado
anteriormente que el estrés oxidativo juega un papel importante en la patología de la
diabetes y sus complicaciones, la información sobre el papel del estrés oxidativo en el
músculo esquelético en la diabetes y cómo prevenirla es muy limitada.
El objetivo de esta segunda parte de la tesis doctoral fue determinar los
mecanismos moleculares implicados en la pérdida de masa muscular en la diabetes
experimental inducida con estreptozotocina y su posible prevención con la
administración de α-galacto-oligosacáridos.
Para la consecución de los objetivos, se utilizaron ratas Wistar Ham macho
divididas en tres grupos experimentales: controles, ratas diabéticas (inducida por
estreptozotocina) y ratas diabéticas tratadas con α-galacto-oligosacáridos. Así mismo,
estudiamos el papel del estrés oxidativo asociado a la diabetes experimental inducida
con estreptozotocina sobre la masa músculo-esquelética en ratas. Así como el papel de
p38 y de NF-кB en la pérdida de masa muscular en un modelo de diabetes experimental.
Resumen
XXXII
Los resultados que obtuvimos de este estudio demuestran que el estrés oxidativo
asociado a la diabetes inducida por estreptozotocina en ratas produce una pérdida
significativa de la masa muscular, debida, en parte, tanto a la fosforilación de p38 como
a la activación de NF-кB. El tratamiento con α-galacto-oligosacáridos previene el estrés
oxidativo y la fosforilación de p38 sin que se observe una prevención significativa en la
pérdida de masa muscular.
Abstract
XXXIII
ABSTRACT
Skeletal muscle atrophy is a debilitating consequence of multiple chronic
diseases and conditions. It reduces treatment options and positive clinical outcomes as
well as compromising quality of life and increasing morbidity and mortality. The
generation of critical levels of power are a prerequisite to perform simple tasks of daily
life, such as rising from a chair or climbing stairs. For a young healthy person these
activities can be performed easily, however after a prolonged period of forced inactivity
a loss of muscle mass occurs. Then simple tasks become increasingly difficult.
Both systemic and local factors can initiate muscle atrophy. Systemic factors
include increased myostatin and glucocorticoids; or a lack of anabolic hormones, such
as insulin or insulin-like growth factor-1. Local factors include muscle inactivity, bed
rest, limb immobilization, muscle denervation or muscular dystrophies, and muscle
ageing.
Recently it has been shown that muscle atrophy is linked to reactive oxygen
species production and an inflammation state when limbs are immobilized, during
hindlimb-unloading, in chronic obstructive pulmonary disease, and sepsis. Several
authors have suggested that administration of antioxidants protects skeletal muscle
during unloading. However, the molecular mechanisms involved in this protection
remain a topic of debate.
The major aim of this doctoral thesis was to determine the molecular
mechanisms involved in the loss of muscle mass induced by hindlimb unloading in
rodents and its possible prevention with drug treatments, such as indomethacin and
allopurinol. This objective is based on previous evidence found by our research group,
which shows the involvement of the xanthine oxidase enzyme in the generation of free
radicals in muscle atrophy.
For this purpose we have studied the main redox sensitive signaling p38
mitogen-activated protein kinase (MAPK) and the inflammatory cascade of NF-кB
involved in skeletal muscle atrophy. Furthermore we studied the expression of two well-
known muscle specific E3 ubiquitin ligases involved in proteolysis, MAFbx and MuRF-
Abstract
XXXIV
1. The loss of muscle mass during muscular inactivity is caused by both apoptosis of
myonuclei and by an imbalance between protein degradation and synthesis. For this
reason, we analysed Akt, a protein kinase that plays a key role in multiple cellular
processes, such as glucose metabolism and muscular protein synthesis, by inhibition of
the E3 ubiquitin-ligase Cbl-b.
To carry out the objectives of this thesis, we conducted three related consecutive
studies. In the first study, male Wistar rats conditioned by 14 days of hindlimb
unloading, with or without the allopurinol treatment, were compared with freely
ambulating controls. In the second study, were used female and male wild-type and
mIKKα KO mice randomly assigned to the control or hindlimb unloading groups.
Finally, in the third study, male C57BL/6J mice, conditioned by 14 days of hindlimb
unloading, with or without, indomethacin, allopurinol or indomethacin plus allopurinol
treatments, were compared with freely ambulating controls.
Our results show that the hindlimb unloading induced XO activation, increased
oxidative stress and inflammation, both in plasma and skeletal muscle. Oxidative stress
signaling activated p38 MAPK and NF-кB pathways that lead to activation of the E3
ubiquitin ligases MAFbx and MuRF-1. XO inhibition, by allopurinol, in rats, and the
suppression IKKα in skeletal muscle partially prevents the atrophy of the soleus muscle.
The protein synthesis pathway, Akt, was restored by treatment with allopurinol and
partly, in the KO mIKKα mice, by inhibiting the E3 ubiquitin ligase Cbl-b.
The most effective treatment to prevent the muscular atrophy process was the
combination of allopurinol plus indomethacin. This is mediated by inhibition of the p38
and NF-кB MAFbx-MuRF-1 pathways. Our data point out the potential benefit of
allopurinol and indomethacin administration for the bedridden, astronauts, limb
immobilization and sarcopenic and cachexia patients.
Furthermore skeletal muscle atrophy is one of the most common complications
in diabetes. In this case, there is also an increase in protein degradation and decreased in
its synthesis. Currently, there are at least three different systems which have proved to
be involved in protein degradation: the lysosomal system, activation of cytosolic Ca2+
and the ubiquitin proteasome system. A controversial topic that has triggered a lot of
interest is the possible role of free radicals in the pathophysiology of diabetes. Thus,
Abstract
XXXV
Oberley in 1988 correlated oxidative stress with diabetes. Most authors suggest the role
of oxidative stress in the development of diabetic complications due to tissue damage
produced by free radicals. However, some authors associate free radicals in not only
diabetic complications, but also in the etiology of diabetes itself. This is concluded from
a study of various drugs inducing diabetes in experimental animals, such as
streptozotocin and alloxan which selectively destroy pancreatic Langerhans islets by an
oxidative mechanism, and their action can be inhibited by the administration of
antioxidants. However, although it has previously been indicated that oxidative stress
plays an important role in the pathology of diabetes and its complications, the
information about the role of oxidative stress in skeletal muscle in diabetes, and how to
prevent it, is very limited.
To achieve our objectives, male Wistar Ham rats were randomly divided into
three groups as controls, diabetic rats (induced by streptozotocin) and diabetic rats
treated with α-galacto-oligosaccharides. Additionally, we studied the role of oxidative
stress associated with experimental diabetes induced by streptozotocin on skeletal
muscle mass in rats. We also studied the role of p38 and NF-кB in the loss of muscle
mass in a model of experimental diabetes.
The results obtained from this study show that oxidative stress associated with
streptozotocin-induced diabetes in rats produces a significant loss of muscle mass, due
in part to both the phosphorylation of p38 and activation of NF-кB. Treatment with α-
galacto-oligosaccharides prevents oxidative stress and phosphorylation of p38 but
significant prevention of loss of muscle mass was not observed.
INTRODUCCIÓN
Introducción
3
1.1. Radicales libres
Un radical libre es aquella especie química que contiene uno o más electrones
desapareados en su capa de valencia. Un compuesto se puede transformar en un radical
libre de diferentes formas: ganando un electrón, perdiendo un electrón o por fusión
homolítica simétrica de una unión covalente. La presencia de este tipo de electrones
hace que estas especies presenten una gran reactividad. Se caracterizan por su gran
poder oxidante y porque su vida media es normalmente muy corta, aunque varía según
el tipo de radical libre.
Estas moléculas son capaces de dañar estructuras esenciales para el desarrollo de
la vida, tales como (ácido desoxirribonucleico) DNA, proteínas, carbohidratos y lípidos
(Sies, 1983, Halliwell, 1985). Además, los radicales libres intervienen en procesos
fisiopatológicos como algunos cánceres, diabetes (Takada, 1982, Okamoto, 1985),
patologías cardiovasculares (Byers and Bowman, 1993), procesos reumáticos (Wolf SP,
1986), patologías gastroentéricas y afecciones broncopulmonares (Slade R, 1983), así
como en procesos neurodegenerativos como la Enfermedad de Alzheimer (Cross et al.,
1987). También están implicados en procesos fisiológicos como en el envejecimiento
(Harman, 1956) y el daño causado por el ejercicio físico (Davies et al., 1982a, Sastre et
al., 1992), entre otros.
1.1.1. Génesis de radicales libres
Los radicales libres pueden producirse a través de diversos procesos químicos
tanto dentro como fuera del organismo. Por lo que, atendiendo al origen de su
producción, podemos clasificarlos en radicales libres que proceden de fuentes
endógenas y exógenas (Freeman and Crapo, 1982).
En cuanto a las fuentes endógenas, la formación de cierta tasa de radicales libres
en las células es un proceso normal e inevitable (Slater, 1984) ya sea como producto de
desecho de una reacción química dada o como producto con una función bioquímica en
el organismo. Algunos ejemplos de estos procesos son: el transporte de electrones a lo
largo de la cadena respiratoria mitocondrial, la reacción de Fenton-Haber-Weiss, la
activación de los leucocitos, reacciones enzimáticas (como la catalizada por la xantina
Introducción
4
oxidasa), el metabolismo de los xenobióticos, los sistemas de transporte electrónico del
retículo endoplásmico, en los fagocitos activados y en microsomas o peroxisomas.
En los sistemas biológicos, los radicales libres son habitualmente moléculas de
oxígeno o moléculas formadas en parte por éste, lo cual hace que a este conjunto de
radicales libres se les denomine especies reactivas del oxígeno (ERO). Asimismo,
existen radicales libres nitrogenados o especies reactivas de nitrógeno (ERN) o radicales
libres centrados en otras moléculas, como el azufre (ver tabla 1.1).
Por otro lado, las fuentes exógenas más importantes en la generación de ERO
son: muchos agentes antineoplásicos como la adriamicina, bleomicina, daunorrubicina y
algunos antibióticos (Doroshow and Hochstein, 1982), la irradiación de los organismos
debido a las radiaciones electromagnéticas (rayos X y ) o debido a radiaciones de
partículas (electrones, protones, neutrones, deuterones y partículas y ) (Bielsky and
Gebieki, 1977) o los factores ambientales, como contaminantes aéreos fotoquímicos,
hiperoxia, pesticidas, humo del tabaco, solventes, anestésicos e hidrocarburos
aromáticos (Mason, 1982).
ESPECIE SÍMBOLO
Radical Superóxido O2•-
Radical hidroperóxido HO2
Peróxido de hidrógeno H2O2
Radical hidroxilo HO•
Radical alcóxido RO•
Radical peróxilo ROO•
Ozono O3
Óxido nítrico NO•
Dióxido de nitrógeno NO2
Anión peroxinitrito ONOO-
Tabla 1.1. Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno.
Introducción
5
Dado que el sistema hipoxantina/xantina oxidasa es una fuente endógena de
radicales libres que juega un papel central en este trabajo, hemos creído conveniente
dedicarle más espacio que al resto, describiendo sus propiedades y características en
varios apartados.
1.1.1.1. Sistema hipoxantina/xantina oxidasa
La xantina oxidasa (XO) y la xantina deshidrogenasa (XDH) son formas
interconvertibles de la misma enzima, conocida como la xantina oxidorreductasa (XOR)
descrita originalmente como una aldehído oxidasa (Schardinger, 1902). Esta enzima
está ampliamente distribuida en diferentes especies de distinta complejidad, desde
organismos tan sencillos como las bacterias, hongos o insectos, hasta los mamíferos
más evolucionados como el hombre (Krenitsky et al., 1974, Parks, 1986), (Ichida et al.,
1993), (Glatigny and Scazzocchio, 1995). En los mamíferos se encuentra identificada
dentro de varios tejidos, incluyendo el hígado, intestino, pulmón, riñón, corazón, y
cerebro, así como el plasma. La función de la XOR, en las distintas especies, es
catalizar la hidroxilación de una amplia gama de sustratos como purinas, pirimidinas,
pterinas y aldehídos.
a) Estructura y formas de la xantina oxidorreductasa
La XOR es una molibdoflavoenzima compleja versátil, cuya forma activa de la
enzima es un homodímero de 290 kDa de peso molecular, donde cada uno de los
monómeros, de 145 kDa, actúa de forma independiente en la catálisis. Cada monómero
contiene 4 centros redox: un dominio intermedio con 1 molécula de dinucléotido de
flavinadenina (FAD) de 20 kDa, un dominio N-terminal, de 20 kDa, con 2 centros ferro-
sulfurados (Fe2-S2), un dominio C-terminal, de 85 kDa, que contiene 1 molécula de
molibdopterina con un átomo de molibdeno como cofactor y el sitio de unión al sustrato
(Bray, 1975, Hille and Massey, 1981).
La XOR posee en las distintas especies un peso molecular y una estructura
similar de los centros de oxidación-reducción (Hille and Nishino, 1995).
Introducción
6
La hidroxilación de la xantina se lleva a cabo en el centro de molibdopterina, la
disposición geométrica y los potenciales de oxidación-reducción de los grupos Fe/S y
del cofactor de molibdopterina indican que los electrones se transfieren desde el mismo
a los dos grupos Fe/S mediante un proceso termodinámicamente favorable. Como las
distancias entre los centros y el cofactor de molibdopterina son menores de 14 Å, el
mecanismo más probable por el que se transportan los electrones es el tunneling (Page
et al., 1999).
Como hemos comentado anteriormente existen dos formas funcionalmente
distintas de la XOR (Figura 1.1), ya que es sintetizada como xantina deshidrogenasa
(XDH, EC 1.1.1204) y se mantiene mayoritariamente como tal en la célula, pero puede
convertirse rápidamente en la forma oxidasa (XO, EC 1.1.3.22) de forma reversible o
irreversible mediante oxidación de los residuos sulfhidrilo o mediante proteólisis.
Ambas formas enzimáticas son el producto del mismo gen, tienen un tamaño
similar, el mismo número de subunidades y requieren los mismos cofactores (Hille and
Nishino, 1995). Además, las dos formas catalizan reacciones con un sustrato similar
pero, como veremos en el siguiente apartado, el aceptor de electrones durante la
reacción es distinto.
Figura 1.1. Formas reducidas y oxidadas de la XOR.
Introducción
7
b) Vías metabólicas en las que intervine
En 1963 Berne y Gerlach, independientemente, observaron en órganos aislados
que los productos de degradación de los nucleótidos de adenina se acumulaban durante
la hipoxia y uno de los productos liberados desde la célula era la hipoxantina (HX)
(Berne, 1963, Gerlach E, 1963). En los mamíferos, la enzima XOR cataliza la
hidroxilación de HX a xantina y esta a su vez para dar lugar a ácido úrico (Ver Figura
1.2).
Como hemos introducido en el apartado anterior, la XDH y la XO utilizan
distintos aceptores de electrones, ya que la XDH, que es la predominante en condiciones
fisiológicas, puede utilizar tanto el oxígeno como la nicotinamida adenina dinucleótido
(NAD+) como aceptor de electrones, aunque tiene preferencia por este último, para
producir NADH y urato. Además, puede ser transformada en XO, que es dependiente de
oxígeno, lo que origina radical O2• y/o H2O2 y urato (Parks and Granger, 1986).
Así pues, la XO se relaciona con diversos procesos patológicos y produce un
daño oxidativo a los tejidos y, en cambio, la XDH puede ser un importante componente
de la defensa del organismo contra el daño provocado por las ERO a través de la acción
del ácido úrico, descrito como un potente antioxidante (Becker, 1993). En tejidos sanos,
entre un 10 y un 30% de la actividad total de la enzima procede de la forma oxidasa
(Chambers et al., 1985).
Figura 1.2. Esquema de la degradación de las purinas.
Introducción
8
Esta enzima es la única del organismo capaz de sintetizar ácido úrico. En el ser
humano y los primates, hasta hace poco tiempo, se pensaba que éste era el último
escalón en la degradación de las purinas (ver figura 1.2), mientras que en otros
mamíferos la vía de degradación de éstas seguía a alantoína, ácido alantoico, ácido
glioxílico y finalmente ácido oxálico. La enzima responsable de que continúe esta
reacción es la uricasa, la cual no se expresa en el hombre y hace que la concentración de
ácido úrico en plasma sea 10 veces mayor que la concentración en las especies que sí la
expresan (Cutler, 1984).
Otra reacción que es catalizada por la XOR es la oxidación de NADH en
presencia de oxígeno produciendo O2•- (Nakamura, 1991). Esta actividad NADH se
considera que puede ser relevante en cuanto a la producción de ERO in vivo. Un hecho
que podría dar protagonismo a la actividad NADH oxidasa in vivo es el de que la
isquemia aumenta la concentración citosólica de NADH. Dicho aumento incrementa la
actividad de la NADH oxidasa de la XOR, lo cual podría aumentar la producción de
ERO por esta vía. Así mismo, la producción de O2•- por esta vía depende linealmente de
la concentración de oxígeno en un rango que va desde la del tejido isquémico a la del
tejido normóxico, no mostrando evidencia de saturación (Harris and Massey, 1997).
La XDH produce dos moléculas de O2•- y una de H2O2 por cada molécula de
NADH oxidada. La oxidación del NADH y su consiguiente producción de O2•- es
claramente más rápida por parte de la XDH que de la XO tanto en humanos como en
vacas (Sanders et al., 1997).
Por otra parte, se sabe que la enzima XOR cataliza la reducción de nitrato a
nitrito en condiciones anaeróbicas (Fridovich and Handler, 1962) y en la misma línea se
ha describió que la XO cataliza también la reducción del nitrito para la formación de
NO• en condiciones de hipoxia (Millar et al., 1997). Algunos estudios han visto que en
casos de isquemia en algunos tejidos, como el corazón, se produce óxido nítrico a través
de una vía diferente a la óxido nítrico sintasa (NOS), a partir de nitrito, sobretodo en
situación de acidosis (Samouilov et al., 1998).
Introducción
9
Tanto la xantina como el NADH pueden ceder electrones en la reacción, aunque
la xantina es la más eficiente. Cuando la xantina es el sustrato reductor el nitrito se une
al sitio molibdeno, mientras que cuando el reductor es el NADH se une al FAD, el cual
transfiere los electrones al sitio molibdeno, donde está el nitrito (Li et al., 2001).
Así como un exceso de NADH no tiene efecto inhibitorio en la reacción, un
exceso de xantina provoca la inhibición de la misma, probablemente por la unión de la
xantina al sitio molibdeno, bloqueando la unión del nitrito (Li et al., 2001).
Además, se ha demostrado que el pH ácido favorece la reacción, por lo que en
condiciones anaeróbicas o hipóxicas la enzima XO cataliza la formación de NO•, dando
lugar a dos moléculas de NO• por cada molécula de NADH, el cual cede dos electrones
que reducen cada uno una molécula de nitrito. En caso de ser la xantina el sustrato
reductor, por cada molécula de xantina oxidada se produce una molécula de NO•
(Godber et al., 2000), si bien otros autores refieren que son dos las moléculas de nitrito
reducidas por cada molécula de xantina oxidada (Li et al., 2001).
Tanto la XO como la XDH pueden formar NO•, siendo esta última 50 veces más
eficiente que la forma oxidasa (Godber et al., 2000), lo cual hay que considerar teniendo
en cuenta que in vivo la concentración intracelular de XDH es la forma predominante de
la XOR. Así, la formación de NO• por esta vía puede alcanzar los niveles que alcanza la
formación de NO• a través de la NOS. Si se tiene en cuenta que la NOS en condiciones
de hipoxia y acidosis se desnaturaliza, primero reversiblemente para luego hacerlo de
forma irreversible, la formación de NO• a través de la XOR puede tener gran
importancia. Inicialmente el NO• formado se acumularía durante el período isquémico,
provocando una vasodilatación compensatoria, mientras que en la fase de reperfusión,
éste podría reaccionar con el anión superóxido para formar peroxinitrito, el cual produce
nitración (nitrosilación) de proteínas y daño celular (Beckman et al., 1990).
Finalmente, podríamos destacar la importancia del efecto que adquiere la XO en
el estudio de los tejidos dañados por la acción de las especies reactivas del oxígeno,
pues si bien el radical O2•- es comparativamente inocuo por sí solo, su toxicidad se
incrementa mucho en presencia de hierro libre, ya sea por la formación de radical
hidroxilo (OH•), radicales ferrilos o radicales perferrilos. Ya que la liberación del hierro
de la ferritina, que puede ocurrir por 2 mecanismos: uno O2•- dependiente, responsable
Introducción
10
del 80% de esta separación, mientras que el otro es independiente de O2 (Harrison,
2002).
c) Distribución orgánica, celular y transporte de la enzima
Su actividad está ampliamente distribuida, aunque no tiene igual expresión en
todos los tejidos, puesto que los niveles más altos se encuentran en hígado e intestino.
Sin embargo, hay muchas diferencias entre especies ejemplificadas por el amplio rango
de niveles encontrados en sangre (Parks and Granger, 1986) y corazón (de Jong et al.,
1990, Werns and Lucchesi, 1990). Muchos autores han obtenido evidencias de la
localización tisular de la enzima mediante el empleo de técnicas inmunológicas usando
anticuerpos anti-XOR. De esta forma se han detectado XO humana en hepatocitos,
sobre todo en región periportal, y células de Kupffer en el hígado, en enterocitos y en
células Goblet del yeyuno y en la glándula mamaria (Linder et al., 1999). Además, la
enzima ha sido encontrada en el endotelio capilar del yeyuno, células endoteliales del
músculo esquelético y riñón, macrófagos y mastocitos (Hellsten-Westing, 1993). Así
como en las células epiteliales del tracto biliar, lo que sugiere secreción de XOR hacia
la bilis.
La localización subcelular de XOR también ha sido objeto de debate. Jarasch y
colaboradores informaron de que la enzima era citosólica y que se encontraba
exclusivamente en las células endoteliales de tejido bovino (Jarasch et al., 1981). Sin
embargo, estudios posteriores mostraron actividad enzimática de la XOR en los
peroxisomas de hepatocitos de rata (Angermüller et al., 1987, Dikov et al., 1988), pero
estos hallazgos fueron puestos en duda por Ichikawa, que concluyó que la enzima no se
asocia a ningún orgánulo intracelular y que está ubicada tanto en el citosol como en la
superficie externa de membrana celular (Ichikawa et al., 1992), con una concentración
mayor alrededor del núcleo, lo cual puede significar una localización estratégica para la
activación de factores de transcripción nucleares (como, por ejemplo, NF-кB) a través
de los radicales libres que produce la enzima (Rouquette et al., 1998).
Además, estos autores han demostrado la presencia de la XOR en la cara externa
de la membrana celular, en la que muestra una distribución polarizada, de forma que se
concentra en la superficie que tiene contacto con células vecinas; lo cual, podría
favorecer también la transmisión de señales entre células a través de los radicales libres
formados por la enzima.
Introducción
11
El conocimiento de la unión de la enzima a la superficie celular está respaldada
por la demostración, tanto de la enzima como de las consecuencias de su actividad, en
tejidos que originalmente presentan poca actividad XOR, de forma que tras aumentar la
liberación de esta enzima en otros órganos, éstos presentan un incremento de daño
producido por la XOR transportada a través de la sangre (Terada et al., 1992). Así pues,
la XOR liberada desde órganos isquémicos es capaz de producir efectos en órganos a
distancia, como el pulmón (Weinbroum, 1995).
Por otra parte, la unión de la XO a la superficie celular influye en las
propiedades catalíticas, en la capacidad de producir agentes oxidantes y en la estabilidad
de la propia XOR (Radi et al., 1997). La enzima sufre un proceso similar cuando es
liberada al plasma, lo que origina un cambio en sus propiedades. La XOR, antes de ser
liberada por las células, contiene cierta actividad XDH y al liberarse al plasma se
convierte inmediatamente en XO (Tan et al., 1993). Por lo tanto, tanto la liberación de
la enzima a la circulación como la subsiguiente unión a las células promueven la
producción de ERO.
Así mismo, además de circular por el plasma de forma libre, la enzima circula
también formando inmunocomplejos. De hecho, la actividad XO en plasma humano es
escasamente detectable en condiciones normales (Giler, 1975), esto se debe, en parte, a
que la XOR humana forma inmunocomplejos con los anticuerpos de inmunoglobulina
M (IgM), siendo el 3% de estos anti-XOR (Benboubetra et al., 1997).
d) Procesos en los que tiene una participación relevante
Hace unos 30 años, Granger y colaboradores se centraron en la importancia
fisiológica y patológica de la XOR, proponiendo la implicación de las ERO derivadas
de la XOR en las lesiones producidas durante la isquemia-reperfusión (Granger, 1981,
Granger, 1986.). Su hipótesis ayudó a estimular el estudio de la XOR como una fuente
de ERO, no sólo en muchos estados patológicos, sino también en la transducción de
señales en general.
Derivado de la capacidad de la forma oxidasa de la enzima para generar especies
reactivas del oxígeno, la XOR ha sido estudiada como mecanismo implicado en el daño
tisular en diversas formas de isquemia, lesiones vasculares y en la insuficiencia cardiaca
crónica, en el infarto de miocardio, la hipertensión, la aterosclerosis (Hellsten-Westing,
Introducción
12
1993, Jeroudi et al., 1994) y muchas otras patologías (White et al., 1996). A la vez que
se ha propuesto su actividad como un papel clave en la respuesta inflamatoria, ya que se
ha atribuido a las especies reactivas de oxígeno, derivadas de la XO, la capacidad de
actuar como mediadores inflamatorios de las vías de transducción de señal y la
expresión génica proinflamatoria (Bulkley, 1993, Bulkley, 1994, Meneshian and
Bulkley, 2002). La inducción de la síntesis de XOR en respuesta a citoquinas
inflamatorias liberadas en enfermedades que evolucionan con respuesta inflamatoria y
estrés oxidativo sugiere la posibilidad de monitorizar su evolución no solo en los
momentos iniciales, primeras 6-12 h, sino también en las etapas más avanzadas.
La isquemia-reperfusión se considera un importante factor en la regulación de la
enzima, habiéndose demostrado que ésta provoca un aumento de la actividad de la
XOR, así como, un aumento en los niveles mRNA (Hassoun et al., 1994, Terada et al.,
1997) y de la expresión de la proteína in vivo (Hassoun et al., 1998) e in vitro (Terada et
al., 1997).
Durante el proceso de isquemia los niveles celulares de adenosín-5´-trifosfato
(ATP) disminuyen, tanto por el descenso en su producción como por su rápida de
fosforilación a adenosín-5’-difosfato (ADP), el cual es degradado vía adenosina e
inosina a HX.
Debido a la depleción del ATP se produce una desregulación de los canales
dependientes del mismo y un aumento del Ca2+ intracelular. Como consecuencia de este
incremento, se produce la activación de las proteasas dependientes de Ca2+ responsables
de la conversión de la XDH en XO (Della Corte and Stirpe, 1968).
Durante la reperfusión, debido a la acumulación del sustrato y de la xantina
oxidasa en los tejidos isquémicos, se inicia una cascada de reacciones cuyo resultado es
un gran aumento en la formación de radicales libres.
En un principio se pensó que el único papel fisiológico para la XOR era su
participación en el catabolismo de las purinas. Sin embargo, se han estudiado otras
funciones de la enzima. En este sentido, se han sugerido varias hipótesis y entre ellas se
encuentran las que destacan su papel en la inmovilización del hierro (Biemond et al.,
1986) y en la regulación del tono vascular (Hong et al., 1989). Otra posibilidad es que la
XO funcione como mediador en los procesos inmunológicos debido a la capacidad del
Introducción
13
radical superóxido generado por la enzima para actuar como agente quimiotáctico
atrayendo los neutrófilos (Petrone et al., 1980, McCord, 1986).
Finalmente, se ha comprobado, también, que los neutrófilos en un cultivo de
células endoteliales son capaces de mediar la conversión de la XDH a XO vía contacto
celular (Phan et al., 1989).
Introducción
14
1.2. Defensa antioxidante
El organismo de los seres vivos ha evolucionado en presencia de sustancias
oxidantes, por lo que ha ido desarrollado una serie de mecanismos de defensa diseñados
para protegerse de estas sustancias tan reactivas denominadas radicales libres. Halliwell
en 1996, definió antioxidante como “cualquier sustancia que en bajas concentraciones,
comparada con el sustrato oxidable, disminuye significativamente o inhibe la oxidación
de este sustrato” (Sies, 1993, Halliwell and Gutteridge, 1995, Halliwell, 1996).
Los niveles de antioxidantes pueden inducirse frente a un estrés oxidativo y
pueden ser utilizados como marcadores de este estrés. Además, pueden actuar de las
siguientes formas:
Previniendo la formación de ERO
Interceptando el ataque de ERO
Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas
menos reactivas
Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de
ERO
Facilitando la reparación del daño causado por ERO y, por último
Manteniendo un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes.
Bajo el punto de vista de la fisiología celular, los podemos dividir en
antioxidantes primarios, secundarios y terciarios.
Los antioxidantes primarios previenen la formación de nuevas especies de
radicales libres. Estos antioxidantes actúan por conversión de los radicales libres
existentes en moléculas menos dañinas, o impidiendo su formación desde otras
moléculas. Dentro de este grupo se incluye a la superóxido dismutasa (SOD), la
glutatión peroxidasa (GPx), la catalasa y las proteínas ligadoras de metales (ferritina y
ceruloplasmina) que limitan la disponibilidad de hierro necesario para la formación del
radical OH (Halliwell and Gutteridge, 1989).
Introducción
15
Los antioxidantes secundarios son protectores no enzimáticos o captadores de
radicales libres que intervienen cuando hay superproducción de radicales libres y los
sistemas enzimáticos están desbordados, previniendo así las reacciones en cadena. En
este grupo se incluyen el glutatión, la vitamina E, la vitamina C, el ácido úrico, la
bilirrubina y la albúmina (Halliwell and Gutteridge, 1990b).
Los antioxidantes terciarios son los que reparan biomoléculas dañadas por los
radicales libres. Entre ellos se encuentran los sistemas proteolíticos intracelulares, que
actúan degradando proteínas dañadas oxidativamente, evitando de este modo su
acumulación (Davies et al., 1987b, Pacifici and Davies, 1991). También podemos
destacar las enzimas reparadoras de DNA, la metionina sulfóxido reductasa y la
fosfolipasa A2 que corta los fosfolípidos oxidados de la membrana (Sevanian et al.,
1985).
Otra forma de clasificar los antioxidantes, muy utilizada en la literatura, es desde
un punto de vista bioquímico. Así, podríamos clasificarlos en antioxidantes enzimáticos
y antioxidantes no enzimáticos.
1.2.1. Antioxidantes enzimáticos
Los más utilizados son los que miden enzimas antioxidantes, como la SOD y la
catalasa, en los que nos hemos centrado en la presente tesis doctoral, sin embargo,
existen otros importantes como la GPx.
1.2.1.1. Superóxido dismutasa
Bajo este nombre se incluye a una familia de metaloproteínas ampliamente
distribuida en la naturaleza, presente en todas las células que utilizan en su metabolismo
el oxígeno, e incluso en algunas bacterias anaeróbicas estrictas y facultativas (Hassan
and Fridovich, 1977).
Su actividad fue descrita por primera vez por McCord y Fridovich en 1969
(McCord and Fridovich, 1969). La SOD constituye la primera defensa natural contra el
radical superóxido, ya que lo transforma en peróxido de hidrógeno, constituyendo el
primer medio natural de defensa (McCord, 1974, McCord et al., 1974).
Introducción
16
Hay descritas cuatro formas diferentes de superóxido dismutasas (Fridovich,
1974) según el grupo prostético metálico ligado al enzima (tabla 1.2). En los mamíferos
coexisten dos de ellas: una enzima mitocondrial, dependiente de manganeso (MnSOD)
y una enzima citosólica, dependiente de cobre y zinc (Cu,ZnSOD).
Cabe destacar que el radical superóxido es inestable en medio acuoso y dismuta
espontáneamente formando H2O2. Sin embargo, la velocidad de dismutación espontánea
no enzimática es relativamente baja (a pH fisiológico, está alrededor 2x105 M-1s-1). La
catálisis de la reacción de dismutación, llevada a cabo por la enzima SOD, incrementa
esta velocidad del orden de 10.000 veces.
ENZIMA GRUPO PROSTÉTICO LOCALIZACIÓN
CELULAR
Cu,ZnSOD Cu, Zn Citosol y Núcleo
MnSOD Mn Matriz mitocondrial
y Citosol
MnSOD Mn Bacterias
FeSOD Fe Bacterias
Tabla 1.2. Tipos de SOD y localización celular mayoritaria
1.2.1.2. Catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos, cuya función
es la descomposición del H2O2, dando lugar a agua y oxígeno (Chance et al., 1979), tal
y como se muestra en la siguiente reacción:
También es capaz de catalizar ciertas reacciones de peroxidación en presencia de
H2O2, actuando sobre algunos alcoholes, aldehídos y ácidos orgánicos como sustratos
(Chance et al., 1979).
SOD O2
- + O2- + 2H+ H2O2 + O2
H2O2 + AH2 2 H2O + A Catalasa
2 H2O2 Catalasa 2 H2O + O2
Introducción
17
El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos
organismos vivos y tiene, entre otras, una función protectora contra microorganismos
patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse
rápidamente en compuestos menos peligrosos.
La catalasa se distribuye en toda la célula, aunque se encuentra en grandes
concentraciones en los peroxisomas (Tolbert and Essner, 1981) y en las mitocondrias
(Halliwell, 1989). Posteriormente, se demostró cierta actividad de esta enzima en el
citosol (Rodriguez et al., 2000). Además, al igual que la SOD y la GPx, la catalasa
abunda más en los músculos lentos (compuesto por fibras tipo II y metabolismo
oxidativo) que en los rápidos (compuesto por tipo I y metabolismo glucolítico) (Powers,
1994).
1.2.2. Antioxidantes no enzimáticos
Entre los diversos antioxidantes no enzimáticos encontramos el glutatión, el
ácido úrico, la melatonina, el ácido α-lipoico, los carotenoides, los flavonoides,
oligoelementos como el zinc y el selenio, coenzimas y cofactores como el ácido fólico,
proteínas como la albúmina y vitaminas B1, B2, B6, B12, C y E, entre otros. En este
apartado del trabajo vamos a comentar con más detalle el alopurinol por su importancia
en nuestro estudio.
1.2.2.1. Alopurinol
El alopurinol, [1H-pirazolo (3,4-d) pirimidina-4-ol] fue uno de los mayores
hallazgos del programa de descubrimiento de fármacos de Burroughs Wellcome, que
comenzó en 1940 y culminó con la obtención del Premio Nobel de Fisiología y
Medicina de Gertrude B. Elion y George H. Hitchings, compartido con el científico
británico James W. Black, de "descubrimientos de los principios importantes para los
tratamientos farmacológicos".
El alopurinol es un análogo estructural de la base púrica natural HX, cuyo peso
molecular es 136.11 kDa y que actúa como un inhibidor de la XO, la enzima
responsable de la conversión de HX a xantina y de xantina a ácido úrico, el producto
Introducción
18
final de catabolismo de las purinas (ver apartado 1.1.1.1 b). Por tanto, se puede
considerar que actúa sobre el catabolismo de las purinas sin modificar su biosíntesis. La
inhibición de la enzima XO por este fármaco es efectiva tanto in vivo como in vitro
(Elion et al., 1966). Además, ninguno de los compuestos inhibidores de la XO
posteriores superaba su eficacia y su tolerancia in vivo, por lo que en 1966 fue aprobado
por la Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de la gota y sigue
siendo uno de los pilares en el tratamiento de la hiperuricemia primaria y secundaria. El
alopurinol inhibe la XO formando un complejo reversible con el molibdeno e
interfiriendo así en la interacción de las purinas con la enzima, de forma que no puede
realizarse la oxidación de éstas (Massey et al., 1989). El paso previo a la inhibición es la
metabolización del alopurinol a oxipurinol (aloxantina) para la posterior unión de ésta al
sitio activo de la XO (Massey et al., 1989). A bajas concentraciones el alopurinol es un
sustrato y un inhibidor competitivo de la enzima; en concentraciones más altas se
convierte en un inhibidor no competitivo. El oxipurinol es un inhibidor no competitivo
de la enzima y la formación de este compuesto, junto con su larga persistencia en los
tejidos, es responsable de gran parte de la actividad farmacológica del alopurinol.
Como resultado de la inhibición de la enzima, las concentraciones séricas de HX
y xantina, en pacientes que reciben alopurinol para el tratamiento de la hiperuricemia,
están en el rango de 0.3 a 0.4 mg/dl, siendo los niveles normales, aproximadamente, de
0.15 mg/dl. Cuando los niveles de urato descienden por debajo de 2 mg/dl, por altas
dosis de alopurinol, se les asocia niveles máximos de purinas de 0.9 mg/dl. La
eliminación renal de la HX y xantina es, al menos, 10 veces mayor que la del ácido
úrico, siendo muy poco frecuente la cristaluria por xantinas.
Introducción
19
XO
XO
Aloxantina Alopurinol
Hipoxantina Xantina Ácido Úrico
XO
NH
NNH
N
O
NH
NH
NH
N
O
O
NH
NH
NH
HN
O
O
O
N
NNH
HN
O
NH
NNH
HN
O
O
Figura 1.3. Esquema de la inhibición de la xantina oxidasa por el alopurinol
La acción del alopurinol difiere de otros agentes uricosúricos que disminuyen los
niveles de ácido úrico en suero aumentando su excreción urinaria, éste reduce ambos, el
ácido úrico en suero y en orina, inhibiendo su formación (Elion, 1989).
En cuanto a la farmacocinética, el alopurinol se absorbe rápidamente por el
tracto intestinal en un 90% aproximadamente, alcanzando concentraciones plasmáticas
máximas entre los 30 y 60 minutos tras su administración oral. En cambio, el oxipurinol
tiene una biodisponibilidad menor y sus niveles plasmáticos presentan un pico a las 3
horas. El alopurinol tiene una vida media relativamente corta en el plasma (2-3 horas),
mientras que la vida media del oxipurinol es mucho más larga (entre 14 y 30 horas)
debido a la reabsorción renal (Pea, 2005). Alrededor de un 20% del alopurinol ingerido
se elimina por las heces. La inhibición de la XO tras una sola dosis, de 300 mg diaria, es
eficaz durante un periodo de unas 24 horas (Murrell and Rapeport, 1986).
Las reacciones adversas más frecuentes en el tratamiento con alopurinol son
molestias gastrointestinales, reacciones de hiperensibilidad y erupciones en la piel,
aunque su incidencia es menor al 1%. Estos efectos generalmente ocurren en personas
con una deficiencia en la función renal, a los cuales no se reduce la dosis de alopurinol.
El alopurinol puede aumentar los efectos de la ciclofosfamida e inhibe el metabolismo
de los anticoagulantes orales y el probenecid. También se han observado algunos casos
O2 -
H2O
2
O2 -
H2O
2
Introducción
20
de hepatotoxicidad reversible en los pacientes que tomaban alopurinol. Los síntomas de
la toxicidad del alopurinol incluyen fiebre, sarpullidos, vasculitis, eosinofilia y el
empeoramiento de la función renal, lo que puede conducir a un desenlace fatal,
especialmente en pacientes ancianos con insuficiencia renal que toman diuréticos
tiazídicos (Pea, 2005, Rott and Agudelo, 2003, Terkeltaub, 2003, Bieber and
Terkeltaub, 2004, Schlesinger, 2004).
El alopurinol y el oxipurinol son eliminados por los riñones; por lo tanto, los
cambios en la función renal tienen un efecto profundo en la dosificación. Al reducir la
concentración de ácido úrico en plasma por debajo de su límite de solubilidad, el
alopurinol facilita la disolución de tofos (cristales de ácido úrico en los tejidos,
generalmente alrededor de las articulaciones) y previene el desarrollo y la progresión de
la artritis gotosa crónica (Pea, 2005, Rott and Agudelo, 2003, Terkeltaub, 2003, Bieber
and Terkeltaub, 2004, Schlesinger, 2004). La formación de cálculos de ácido úrico
desaparece gradualmente con la terapia, lo que impide el desarrollo de la nefropatía.
Además de la gota y la hiperuricemia, existen numerosas aplicaciones
terapéuticas potenciales, tanto para el alopurinol como para el oxipurinol.
En el apartado 1.1.1.1.d hemos comentado que la XO juega un papel importante
en distintos tejidos en situaciones de isquemia-reperfusión (como en el miocardio,
hígado, riñón, pulmón, y otros órganos), en el síndrome de lisis tumoral, durante shock
circulatorio, en enfermedades vasculares (como la hipertensión, la hipercolesterolemia,
la aterosclerosis y la diabetes), en enfermedades inflamatorias (como la colitis, artritis
reumatoide, neumonía, pancreatitis, nefritis, peritonitis y dermatitis, entre otras), en el
síndrome de dificultad respiratoria aguda, en la enfermedad pulmonar obstructiva
crónica, en la insuficiencia cardiaca crónica, etc. El alopurinol y su metabolito el
oxipurinol activo mostraron efectos beneficiosos en el tratamiento de estas condiciones,
tanto en modelos experimentales animales y en ensayos clínicos humanos a pequeña
escala (citado en (Pacher et al., 2006)).
Cabe destacar la acción antioxidante del alopurinol, puesto que neutraliza
directamente los radicales libres derivados del sistema hipoxantina/xantina oxidasa,
previniendo los efectos del estrés oxidativo producido por estas especias reactivas. Los
estudios en animales muestran que en dosis de hasta 50 mg/kg de alopurinol se
comporta como un captador de radicales libres con propiedades antioxidantes
Introducción
21
intrínsecas (George and Struthers, 2009). Así como también se ha demostrado su
eficacia en su acción antiinflamatoria, no como agente intiinflamatorio, aunque existen
controversias en si lo es en sí mismo o por inhibir la acción proinflamatoria de la
xantina oxidasa (Pacher et al., 2006).
1.2.2.2. Papel del alopurinol en la protección del músculo esquelético
a) Papel del alopurinol en el daño muscular asociado al ejercicio agotador
En 1954 se publicó el primer trabajo en el que se demostró la presencia de ERO
en el músculo esquelético mediante resonancias magnéticas nucleares (RMN)
(Commoner et al., 1954). Sin embargo, su importancia biológica no fue evidente hasta
años más tarde cuando se identificó la relación entre la función muscular y la biología
de las ERO. En 1978 se asoció el ejercicio físico con el aumento de la peroxidación
lipídica (Dillard et al., 1978). Dos años más tarde Koren y colaboradores mostraron que
las ERO aumentan en el músculo esquelético como consecuencia de la contracción
muscular (Koren et al., 1980). En el año 1982, el grupo de Lester Packer publicó el que
se considera el trabajo más influyente en el área y en el que demuestran que el
contenido de ERO aumenta entre 2 y 3 veces en los músculos de animales ejercitados
hasta el agotamiento y que éstos se relacionan con la fatiga muscular (Davies et al.,
1982a).
El interés en la posibilidad de que las ERO pudiesen estar implicadas en el daño
muscular que ocurre tras el ejercicio físico agotador se gestó con la observación de que
la miopatía asociada a la deficiencia de vitamina E en animales se precipitaba por
ejercicio físico (Allen et al., 1975). En el año 1982 se relacionaron por primera vez las
ERO producidas durante el ejercicio agotador con el daño tisular en animales de
experimentación (Davies et al., 1982b). Un año más tarde se demostró que la deficiencia
de vitamina E provoca una reducción significativa de la resistencia aeróbica
(Quintanilha and Packer, 1983) y que ésta a su vez potencia el daño muscular que se
produce en condiciones de estrés en estudios tanto in vivo como in vitro (Jackson et al.,
1983, Jackson, 1987).
Introducción
22
Son muchos los trabajos más recientes en los que se han relacionado las ERO
producidas durante la contracción muscular de elevada intensidad con el daño muscular
(Zerba et al., 1990, McArdle et al., 1999). Estas evidencias han fundamentado el uso de
antioxidantes (la vitamina C y E han sido de las más utilizadas) en la prevención del
daño muscular asociado al ejercicio (McGinley et al., 2009).
En concreto, en nuestro grupo de investigación hemos utilizado el alopurinol en
diversos modelos animales y humanos para prevenir el daño muscular asociado al
ejercicio físico. En los estudios iniciales comprobamos que la administración de
alopurinol disminuía la oxidación de glutatión, la peroxidación lipídica, así como los
aumentos en los niveles de enzimas de daño muscular, creatin kinasa (CK) y aspartato
amino transferasa (GOT), tanto en humanos como en animales de experimentación
ejercitados hasta el agotamiento (Viña et al., 2000a, Viña et al., 2000b). En estudios
posteriores realizados con ciclistas profesionales y con maratonianos, confirmamos la
prevención del daño muscular asociado al ejercicio con la administración de 300 mg de
alopurinol durante la competición (Gómez-Cabrera et al., 2003, Gomez-Cabrera et al.,
2006). Otros grupos de investigación han encontrado un efecto protector de la
administración de alopurinol, sobre el daño muscular, en otras especialidades deportivas
tales como participantes en la Copa América (Barrios et al., 2011).
Así mismo, nuestro grupo ha evidenciado que el estrés oxidativo asociado al
ejercicio físico hasta el agotamiento activa vías de señalización como las MAPKinasas y
la cascada inflamatoria de NF-кB en el músculo esquelético, las cuales son inhibidas
con la administración de alopurinol previamente a la realización de este tipo de ejercicio
(Gomez-Cabrera et al., 2005). Estos resultados han sido parcialmente corroborados
recientemente (Wadley et al., 2013).
Al observar que la administración de alopurinol tiene un efecto positivo en la
prevención del daño muscular, su uso se ha extendido a otras condiciones en las que el
daño o atrofia muscular se encuentra mediado por estrés oxidativo, como las que se
describen a continuación.
b) Papel del alopurinol en el tratamiento de la sarcopenia primaria y
secundaria
La sarcopenia es un síndrome geriátrico caracterizado por una pérdida
progresiva y generalizada de la fuerza y de la masa muscular esquelética que se
Introducción
23
acompaña con un aumento del riesgo de eventos adversos tales como la discapacidad,
baja calidad de vida y la muerte (Cruz-Jentoft et al., 2010, Rosenberg, 1989). La
sarcopenia puede ser clasificada como primaria (relacionada con la edad) cuando no
existe una evidente causa que la explique que no sea el envejecimiento per se. Se
clasifica como secundaria cuando una o más causas son las responsables. En este
sentido la sarcopenia secundaria puede estar relacionada con una baja actividad física
(estilo de vida sedentario, inmovilización, condiciones de gravedad 0), con patologías
(fallo orgánico avanzado, enfermedades inflamatorias o endocrinas) o con aspectos
nutricionales (inadecuada ingesta de proteínas, mala absorción, desórdenes
gastrointestinales) (Cruz-Jentoft et al., 2010).
Uso del alopurinol en la sarcopenia primaria
Como veremos a continuación, el proceso de envejecimiento está asociado con
la reducción de la masa muscular, la fuerza máxima y con el descenso en la capacidad
del sistema neuromuscular para producir fuerza explosiva. Entre los factores implicados
en la pérdida de funcionalidad del músculo esquelético podemos destacar: alteraciones
en la síntesis y degradación de proteínas, inflamación, alteraciones hormonales y
disfunción mitocondrial (Cruz-Jentoft et al., 2011). La mayor parte de estas alteraciones
se relacionan con el estrés oxidativo (Sies, 1985, Sies and Cadenas, 1985).
Diversos grupos de investigación, incluyendo el nuestro (Aranda et al., 2007),
han observado un aumento de la actividad XO en los músculos de animales viejos
(Lambertucci et al. 2007; Hofer et al. 2008; Ryan et al. 2011a). Estos estudios han
relacionado este aumento de la actividad XO, con el estrés oxidativo, el descenso de la
masa muscular (Hofer et al. 2008), de la máxima velocidad aeróbica (Lambertucci et al.
2007), así como de la fuerza muscular (Ryan et al. 2011a).
En esta misma línea, recientemente, en un estudio realizado en personas mayores
se examinó la asociación entre el uso de alopurinol y los resultados funcionales en el
test de Barthel después de la rehabilitación en 3,593 pacientes ingresados, de los cuales
un 3% (102 pacientes) eran tratados con alopurinol. Los resultados mostraron
puntuaciones en el Barthel más altas en el grupo tratado con alopurinol (4.7 puntos)
frente al no tratado (3.6 puntos), lo que sugiere que los pacientes tratados eran más
independientes y tenían mayor funcionalidad a la hora de desempeñar tareas de la vida
Introducción
24
cotidiana (Beveridge et al., 2013). Estos resultados sugieren que el uso de alopurinol se
asocia con un mayor grado de mejora en la función, medida por el índice de Barthel
durante la rehabilitación en una población de pacientes viejos.
Uso del alopurinol en la sarcopenia secundaria
En relación a la sarcopenia secundaria existen evidencias de que el tratamiento
con alopurinol puede mejorarla. El primer estudio en el que se administró alopurinol
como agente anticancerígeno se demostró que su uso inducía drásticamente la apoptosis
en células de cáncer de próstata en humanos (Yasuda et al., 2008). Posteriormente, se ha
usado para disminuir los altos niveles de ácido úrico producidos por ciertos
medicamentos usados durante el tratamiento del cáncer. Recientemente, se ha empezado
a administrar alopurinol para el tratamiento de la caquexia asociada al cáncer. Springer
y colaboradores demostraron, mediante la inducción de una cachexia experimental por
inyección de células cancerosas de hepatoma en animales de experimentación, que la
inhibición de la actividad de la XO redujo significativamente los niveles de estrés
oxidativo y de la actividad del sistema ubiquitin proteasoma. Ello derivó en la
conservación de la masa muscular y, por tanto, en la reducción de la caquexia en los
animales que desarrollaron tumores tratados con alopurinol u oxipurinol frente a los no
tratados (Springer et al., 2012, Springer et al., 2013).
Como hemos comentado anteriormente, la atrofia muscular puede ocurrir en
ausencia de enfermedad durante periodos prolongados de actividad muscular reducida
(Booth, 1982), como estilos de vida sedentarios, sujetos encamados, la inmovilización
de miembros, la descarga del diafragma a través de la ventilación mecánica, o los vuelos
espaciales (Powers et al., 2005, Cruz-Jentoft et al., 2010). En estas condiciones también
se ha demostrado la relevancia del estrés oxidativo en la pérdida de masa muscular y, en
concreto, el papel de la XO. En 1998 Kondo midió la actividad de la XO en el músculo
sóleo de ratas inmovilizadas durante 12 días. En este estudio se comprobó que la XO
aumentaba 2.3 veces en los soleos inmovilizados, los cuales mostraron un descenso del
51% de su peso respecto a los músculos controles. También midieron parámetros de
estrés oxidativo y la actividad de las enzimas antioxidantes, cuyas modificaciones
concordaban con la activación de la XO (Kondo et al., 1993c). Posteriormente,
Matuszczak y colaboradores demostraron la eficacia del alopurinol en la prevención del
Introducción
25
daño muscular durante la suspensión de las extremidades posteriores en ratones.
Aunque, en este estudio, la inhibición de la XO no disminuyó la atrofia causada por la
inmovilización, sí que previno la pérdida de la fuerza muscular (Matuszczak et al.,
2004).
Así mismo, existe una relación entre la insuficiencia cardiaca crónica (ICC) y la
insuficiencia respiratoria con el agotamiento muscular. Se ha demostrado que pacientes
con insuficiencia respiratoria, insuficiencia cardiaca o una combinación de ambas,
tenían significativamente menos fuerza tanto en los músculos esqueléticos como en los
respiratorios. Sin embargo, la fuerza y la resistencia no parecen ser afectados de la
misma forma en estos músculos (Hamilton et al., 1995). Se postula que esta disfunción
de la musculatura se debe a cambios estructurales y funcionales en la vasculatura
periférica, que provocan una disminución de la perfusión del músculo esquelético en
reposo, durante el ejercicio físico y en el envejecimiento (Wahren et al., 1974, Beere et
al., 1999, Dinenno et al., 2001, Lawrenson et al., 2003, Poole et al., 2003, Proctor et al.,
2003).
Otros estudios han relacionado la actividad de la XO con el aumento del estrés
oxidativo en la ICC, lo que condujo a usar el alopurinol para prevenir o paliar el daño
cardiovascular con resultados muy positivos. En uno de estos estudios sobre ICC
inducida, el alopurinol indujo una disminución en el consumo de oxígeno del miocardio
y un aumento en la contractilidad cardíaca, así como en la eficiencia mecánica en
reposo (Ekelund et al., 1999).
Por lo que un tema que ha tenido un gran auge recientemente es la posibilidad
que el tratamiento con alopurinol restablezca la disminución energética que se
desarrolla en pacientes con fallo cardiaco crónico.
Estos estudios buscan disminuir, con la administración de alopurinol, el estrés
oxidativo (producción de peróxido de hidrógeno) ocasionado por la actividad de la XO,
que reduce la sensibilidad del calcio, lo que limita la contracción del miocardio (Ukai et
al., 2001). Sin embargo, Ukay observó que el alopurinol no tiene efectos sobre la
función contráctil del ventrículo izquierdo o en su capacidad de respuesta β-adrenérgica
en animales en situación basal. Aunque estos mismos autores observaron que, en
animales con fallo inducido, en la frecuencia cardiaca, el alopurinol sí disminuye la
disfunción contráctil del ventrículo izquierdo, mejora la capacidad de respuesta β-
adrenérgica y mejora su respuesta sistólica y diastólica al ejercicio.
Introducción
26
Así mismo, la administración de alopurinol mejora la función endotelial vascular
en personas mayores y en pacientes con ICC (Kao et al., 2011, George et al., 2006,
Doehner et al., 2002), por un menor estrés oxidativo a nivel muscular y vascular
(George et al., 2006, George and Struthers, 2009), con lo que se podría repercutir
positivamente en la perfusión músculoesquelética (Wray et al., 2009). Además, el
alopurinol aumenta la eficiencia energética muscular, por una mejor disponibilidad del
ATP y su hidrólisis, como se ha visto en varios estudios que analizan la actividad de la
enzima CK, especialmente la isoforma miofibrilar cardiaca (Hou et al., 2006, Ekelund et
al., 1999). Esto se debe a que dicha enzima se ve especialmente afectada por los ERO,
por lo que al inhibir la XO, como fuente generadora de estrés oxidativo, con el
alopurinol se consigue incrementar la síntesis de ATP a través de la PC y ADP por
acción de la CK (Cappola et al., 2001, Hou et al., 2006, Naumova et al., 2006).
Introducción
27
1.3. Estrés oxidativo
Todas las células aeróbicas están expuestas al daño de estos radicales libres.
Cuando la capacidad de los mecanismos antioxidantes se ve superada por las agresiones
oxidativas se da la situación denominada “estrés oxidativo” que, en mayor o menor
grado, puede llegar a producir lesiones celulares reversibles o irreversibles. Por tanto,
podemos definir el estrés oxidativo como una alteración del equilibrio entre las especies
prooxidantes y las antioxidantes, a favor de las primeras (Sies and Cadenas, 1985, Sies,
1985).
Así pues, el estrés oxidativo puede originarse por un exceso de sustancias pro-
oxidantes, una deficiencia de agentes oxidantes, o por ambos factores a la vez. En estas
circunstancias, está indicado proteger al organismo incrementando su capacidad
antioxidante, es decir, aumentando la capacidad defensiva de la célula mediante la
administración de antioxidantes, ya sea en forma de fármacos, o como complementos
dietéticos (Ames, 1983).
1.3.1. Estrés oxidativo y daño a biomoléculas
El estrés oxidativo, debido a la dificultad existente para detectar directamente los
radicales libres, se puede conocer mediante la medición de los productos de las
reacciones oxidativas (daño oxidativo a lípidos, oxidación del DNA, oxidación de
proteínas, daño oxidativo a glúcidos).
1.3.1.1. Daño oxidativo a lípidos
De los principales tipos de biomoléculas, los lípidos y, sobre todo, los ácidos
grasos poliinsaturados, son los más susceptibles de ser atacados por radicales libres
(Cheeseman and Slater, 1993), siendo el HO, ROO, RO y el alquílico (R) los
principales generadores de daño oxidativo a lípidos.
El proceso de ataque oxidativo a lípidos, denominado peroxidación lipídica,
comienza cuando un radical libre ataca a un carbono de la cadena alifática de un ácido
graso, se desprende un átomo de hidrógeno y se forma un radical alquílico (Krinsky,
Introducción
28
1994, Halliwell, 1994). Esta reacción se produce preferentemente en los carbonos
contiguos a enlaces dobles de los ácidos grasos poliinsaturados, ya que los radicales
formados se pueden estabilizar por resonancia con el enlace doble. Los radicales
peróxido pueden reaccionar con cadenas laterales de otros ácidos grasos
poliinsaturados, con lo que se propaga la reacción en cadena radicalaria (Halliwell,
1994).
De esta manera, un sólo ataque por un radical libre da lugar a la formación de un
gran número de productos de oxidación, sobre todo aldehídos como malondialdehído
(MDA) y 4-hidroxinonenal (4-HNE), e hidrocarburos de cadena corta como etano y
pentano (Cheeseman and Slater, 1993, Freeman and Crapo, 1982, Halliwell, 1991,
Halliwell, 1994). Muchos de los aldehídos formados reaccionan rápidamente con los
componentes celulares causando mutaciones en el DNA y produciendo daños
estructurales y funcionales al reaccionar con proteínas (Krinsky, 1994). La peroxidación
lipídica se considera un factor muy importante en el envejecimiento de células aeróbicas
(Lippman, 1985). El daño oxidativo a los lípidos de membrana constituye, muy
probablemente, un factor importante en la disminución de la fluidez de las membranas
(Shigenaga et al., 1994).
1.3.1.2. Daño oxidativo a proteínas
Todos los aminoácidos presentes en las proteínas tienen residuos susceptibles de
ser atacados por los radicales libres, sobre todo por el radical hidroxilo (Stadman,
1992). Dentro de los aminoácidos la tirosina, la fenilalanina, el triptófano, la histidina,
la metionina y la cisteína son los que más procesos oxidativos sufren (Davies et al.,
1987a). Esta oxidación puede dar lugar a un cambio conformacional de la proteína y,
por tanto, a una pérdida o modificación de su función biológica.
En los procesos de daño oxidativo a proteínas, algunos aminoácidos como lisina,
prolina y arginina, se oxidan dando lugar a grupos carbonilo, de modo que el contenido
en carbonilos de las proteínas se puede emplear como un indicador de daño oxidativo a
las mismas (Stadman, 1992). Otros aminoácidos como histidina, cisteína y metionina,
también sufren daño oxidativo, pero no forman derivados de tipo carbonilo (Stadman,
1992). Este daño oxidativo suele ser irreversible y puede conducir a la desnaturalización
de la proteína (Dean et al., 1993).
Introducción
29
1.3.1.3. Daño oxidativo al DNA
El DNA también es susceptible al daño oxidativo en todos sus componentes,
puesto que el oxígeno es capaz de adicionarse a las bases o al azúcar del DNA
formándose radical peroxil.
Podemos encontrar más de veinte subproductos tras un ataque oxidativo al
DNA. Entre ellos, la oxidación de la 2-desoxiguanosina a 8-hidroxi 2-desoxiguanosina
es una de las lesiones más frecuentes y reviste gran importancia por su alto efecto
mutagénico, ya que durante la replicación producirá transversiones de purinas (Kasai
and Nishimura, 1984, Shibutani et al., 1992).
El daño oxidativo asociado a proteínas y al DNA no debe ser considerado de
manera independiente. La acumulación de formas inactivas de enzimas reparadoras
puede aumentar la acumulación de daño oxidativo en el DNA, por lo que se pueden
potenciar uno a otro. Cuando la replicación del DNA dañado tiene lugar antes de la
reparación o cuando un DNA dañado se repara de manera incorrecta, tiene lugar una
mutación (Breen and Murphy, 1995, Halliwell and Auroma, 1991). Por ello, las lesiones
oxidativas al DNA parecen estar implicadas no sólo en el envejecimiento celular, sino
también en la patogénesis de las enfermedades asociadas a la edad avanzada.
El DNA mitocondrial sufre mucho más daño oxidativo que el nuclear (Richter et
al., 1988), ya que presenta ciertos rasgos que le hacen especialmente susceptible de ser
atacado por agentes oxidantes: carece de histonas que puedan recibir el ataque en su
lugar (Donald and Johns, 1995); el sistema de reparación es menos efectivo (Suter and
Richter, 1999, Shen et al., 1995) y, por último, se encuentra muy cerca de la cadena de
transporte mitocondrial, uno de los sistemas principales de producción de especies
reactivas del oxígeno (Giulivi and Davies, 1993). Otro factor distintivo del DNA
mitocondrial es que no posee intrones, de manera que la modificación de cualquier base
afecta usualmente a una zona de DNA codificante (Ames et al., 1993, Linnane et al.,
1989) y su repercusión suele ser, por tanto, más importante.
Introducción
30
1.3.1.4. Daño oxidativo a glúcidos
Los glúcidos reaccionan con facilidad con el HO•. Los monosacáridos y
disacáridos resisten la acción de los radicales libres de oxígeno. La glucosa constituye
un captador del radical superóxido, al retenerlo e impedir su acción sobre otras
moléculas. La manosa y el manitol son eliminadores del radical hidroxilo. Por ello, se
ha observado que diversos polisacáridos actúan como agentes protectores celulares
(Albertini et al., 1996).
El daño oxidativo a los glúcidos reviste importancia cuando se trata de
polisacáridos de función estructural, ya que los polisacáridos son despolimerizados por
los radicales libres (Borel et al., 1988) dando lugar a procesos degenerativos. Un caso
especial es el del ácido hialurónico cuya función estructural reside en mantener la
viscosidad del fluido sinovial. Se ha observado que la SOD es capaz de proteger frente a
la despolimerización del ácido hialurónico en el líquido sinovial (McCord, 1974). Los
proteoglicanos están sujetos a rotura oxidativa de forma similar (Greenwald and Moy,
1980).
1.3.2. Indicadores de estrés oxidativo
Dada la importancia del daño que el estrés oxidativo puede producir en las
células y en el organismo, en los últimos años se ha intentado encontrar índices que nos
permitan medirlo. Entre los indicadores propuestos, uno de los más relevantes es el
cociente glutatión oxidado/glutatión reducido (GSSG/GSH) característico de estrés
oxidativo, de modo que un aumento en la concentración de glutatión oxidado produce
una alteración del estado redox celular (Sies, 1986).
Además, como indicadores de daño oxidativo a lípidos, el MDA y el 4-HNE son
los más empleados, aunque también se pueden considerar los niveles de pentano y de
etano. Por otro lado, la 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina es un indicador de daño oxidativo
al DNA y los grupos carbonilo y la 2-oxohistidina se utilizan como marcadores de daño
oxidativo en proteínas (Hageman et al., 1992), etc.
Introducción
31
1.4. Atrofia muscular
El músculo esquelético es un tejido que compone aproximadamente el 40-45%
del peso corporal. Los músculos varían en forma y tamaño y cumplen diversas
funciones como el control postural, la producción de movimiento, o el favorecimiento
del retorno venoso. Así mismo, el músculo esquelético juega un papel central en todo el
organismo por su identificación como órgano secretor, puesto que las citoquinas
producidas, expresadas y liberadas por las fibras musculares pueden tener efectos
autocrinos, paracrinos o endocrinos, pasando a denominarse mioquinas, las cuales
también pueden ejercer sus efectos dentro del propio músculo (Pedersen and Febbraio,
2012). Otro ejemplo de que el músculo esquelético se comunica con otros órganos,
como el tejido adiposo, hígado, páncreas, huesos y cerebro, es que sirve como depósito
de aminoácidos, jugando un papel central en el metabolismo de las proteínas de todo el
organismo en ausencia de absorción de aminoácidos en el intestino y por proporcionar
precursores de la gluconeogénesis hepática (Wolfe, 2006).
Al igual que otros tejidos, el músculo esquelético mantiene su masa y la
funcionalidad mediante el equilibrio de la velocidad de síntesis y la degradación
muscular. Sin embargo, la alteración de este intrincado equilibrio origina caquexia y
atrofia muscular como miopatías y distrofias, que no sólo afectan negativamente a los
músculos esqueléticos, sino que también promueven el catabolismo corporal. En varias
enfermedades crónicas, como el cáncer, la pérdida de masa muscular sostenida
finalmente culmina en insuficiencia respiratoria, morbilidad, e incluso, mortalidad, sin
intervenciones terapéuticas disponibles.
El músculo esquelético puede sufrir una rápida y profunda atrofia en respuesta a
diversas condiciones medioambientales o patológicas. La atrofia muscular está presente
en numerosas patologías tales como el cáncer, la sepsis, la uremia, y la diabetes
(Hasselgren and Fischer, 1997, Jagoe and Goldberg, 2001). Por otra parte, la atrofia
muscular también puede ocurrir en la ausencia de la enfermedad durante periodos
prolongados de actividad muscular reducida (Booth, 1982), como estilos de vida
sedentarios, o el descenso de la actividad física que provoca una disminución de la masa
muscular que, a su vez, conlleva una disminución del volumen y fuerza de la misma
Introducción
32
(Powers et al., 2005). De hecho, está bien establecido que situaciones de desuso o
inactividad muscular, como lo son el descanso prolongado en cama (sujetos
encamados), la inmovilización de miembros, la descarga del diafragma a través de la
ventilación mecánica, o en los vuelos espaciales pueden producir atrofia muscular en los
seres humanos.
Esto mismo ocurre en enfermedades relacionadas con la caquexia, una condición
caracterizada por la pérdida de peso pronunciado, debilidad muscular, anemia,
resistencia a la insulina y la fatiga extrema en personas que no están tratando
activamente de perder peso. Este síndrome de la enfermedad está estrechamente
asociado con el cáncer y otras enfermedades infecciosas como la tuberculosis, el sida y
algunos desórdenes autoinmunes como la diabetes tipo 1, elevados niveles de TNF-α,
factor de necrosis tumoral, en sangre. A diferencia de la inanición simple, donde la
pérdida de peso se deriva principalmente de la disminución de las reservas de grasa pero
el contenido de proteína del músculo esquelético se conserva, en la caquexia se produce
perdida tanto de masa grasa como magra (Morley et al., 2006).
Así mismo, un tema con una elevada relevancia socio-económica y muy
investigado en la actualidad es la sarcopenia senil (Rosenberg, 1997), ya que el
envejecimiento es uno de los factores que mejor explican la reducción de la fuerza y
masa muscular con la edad. La rápida pérdida de masa muscular tiene serias
implicaciones para la calidad de vida e independencia de las personas mayores, ya que
en la vida cotidiana se requieren unos niveles mínimos de fuerza para realizar cualquier
acción como subir escaleras o sentarse en una silla. En este caso, el efecto en el músculo
esquelético es similar al de los casos descritos anteriormente en individuos jóvenes.
El proceso de envejecimiento está asociado no sólo con la reducción de la fuerza
máxima, sino también con el descenso en la capacidad del sistema neuromuscular para
producir la fuerza explosiva. Esta disminución es incluso más drástica que la observada
en la producción de fuerza máxima para el mismo grupo muscular y llega a ser
aproximadamente de un 3.5% de pérdida al año entre los 65 y 84 años (Young and
Skelton, 1994).
Introducción
33
La sarcopenia senil engloba multitud de factores que contribuyen a las
alteraciones musculares asociadas a la edad: pérdida de motoneuronas, alteración
hormonal, efectos inflamatorios y alteraciones en la ingesta calórica (proteica) (Doherty,
2003).
Por otra parte, con el envejecimiento se observa una mayor disminución de la
proporción del área ocupada por las fibras musculares de contracción rápida (% área II/I
y % área fibras tipo II) en comparación con las que ocupan las fibras musculares de
contracción lenta (tipo I) (Orlander et al., 1978).
Otro factor que conlleva atrofia y disminución de la masa muscular es la
denervación muscular, ya que cuando un músculo pierde su inervación deja de recibir
las señales necesarias para mantener el tamaño muscular normal.
El mismo efecto observamos en los procesos de atrofia por suspensión de
miembros posteriores en animales, pacientes encamados, o microgravedad durante
vuelos espaciales. Al ser el objetivo principal de esta tesis, la comprensión de los
mecanismos moleculares que regulan la pérdida de masa muscular en estas condiciones
de inmovilización, desuso e inactividad muscular, dichos procesos se describen con más
detenimiento en puntos subsiguientes.
Introducción
34
1.5. Atrofia muscular durante la inmovilización o inactividad
muscular
Durante los vuelos espaciales los músculos más afectados son los posturales
puesto que mantienen nuestro cuerpo en posición vertical en un entorno de gravedad.
Hay estudios que demuestran que después de un vuelo espacial de 2 semanas la masa
muscular se ve disminuida hasta un 20% (Williams et al., 2009). Biopsias musculares
efectuadas a astronautas tras un vuelo espacial indican un cambio fenotípico de las
fibras tipo I a fibras tipo II (Nisoli et al., 2003), con lo que podemos afirmar que en este
tipo de musculatura se experimenta una mayor pérdida de fibras lentas (Nisoli et al.,
2003, Buckey, 2006).
En concordancia con la atrofia, los músculos también pierden fuerza, ya que
durante un vuelo espacial de seis meses de duración se puede llegar a producir una
pérdida de un 50% de la fuerza explosiva (Buckey, 2006).
Otras investigaciones centradas en la inmovilización y la atrofia muscular
asociada estudian casos de sujetos sanos encamados, con una de sus extremidades
inferiores en suspensión. Estos estudios evidencian una disminución del 4.7 ± 0.9% en
la masa magra del cuádriceps en comparación con el basal, en un periodo de 14 días,
determinada por análisis de radioabsorciometría de doble energía (DEXA). En otros
estudios en los que se ha aumentado el tiempo de inmovilización a 20 y 23 días
observaron una reducción del 10% en el área de la sección transversal (CSA) de los
músculos flexores de la rodilla (isquiotibiales) (Funato et al., 1997), de los extensores
(cuádriceps) (Funato et al., 1997, Kawakami et al., 2000), así como, en los flexores
plantares y el sóleo (Seynnes et al., 2008) medido mediante RMN Finalmente, en
sujetos encamados durante 28 días se ha observado una pérdida de 0.4 ± 0.1 kg de masa
muscular (Paddon-Jones et al., 2004).
Se sabe que el tipo de fibras que predomina en el músculo esquelético
condiciona su mayor o menor grado de atrofia, ya que se ha observado, después de 6
semanas de reposo en cama, una disminución de diámetro de las fibras de tipo I, sin
observar cambios en las fibras de tipo IIa o IIx (Berg et al., 1997, Ferretti, 1997). Por
Introducción
35
otro lado, se ha descrito que la reducción de la masa muscular durante vuelos espaciales
se debe principalmente a la atrofia de las fibras tipo I y IIa (Allen et al., 1996, Fitts et
al., 2000, Baldwin and Haddad, 2001). Así mismo, Borina observó que, tras 5 semanas
de encamación, una disminución del 31% en el diámetro de las fibras de tipo I y sólo el
21% de las fibras de tipo IIa (Borina et al., 2010).
Así mismo, otros estudios muestran una gran reducción en la fuerza muscular,
medida con distintos métodos.
Con tan solo dos semanas de inmovilización se ha comprobado la fuerza
isométrica se reduce en un 27 ± 3% en comparación con los datos basales obtenidos
previos a la inmovilización (Jones et al., 2004).
Mediante el uso de un dinamómetro especial aplicable a los movimientos el
grupo de Funato comprobó que la disminución de la masa muscular iba asociada a la
atenuación de la potencia muscular, considerablemente mayor en las extremidades
inferiores (-19.8 y -43.6% para la flexión y extensión de la rodilla) que en las
superiores, donde las diferencias no fueron significativas (aproximadamente -5% para
flexión y extensión del codo). La fuerza isométrica máxima también se vio reducida en
los músculos flexores y extensores de rodilla en un -18.9 y -26.8% respectivamente,
resultando en una disminución en la tensión específica (-12.3 a aproximadamente -
22.1%). Concluyendo que los potenciales de excitación neuronal para generar la tensión
muscular máxima o potencia también pueden estar influidos por la ingravidez (Funato
et al., 1997).
Seynnes y sus colaboradores encontraron una disminución de un 16% en la
actividad eléctrica (EMG) producida por los sóleos después de 23 días de
inmovilización, además de una disminución de 36% en la rigidez del tendón, que se
correlacionan con los cambios en la eficacia neuromuscular en cuanto al
aprovechamiento máximo de la fuerza de los tendones (Seynnes et al., 2008).
1.5.1. Modelo de inducción de atrofia muscular en animales: suspensión de
miembros posteriores
Debido a la dificultad de la investigación acerca de los mecanismos responsables
de la atrofia muscular por inmovilización en los seres humanos, se han desarrollado
Introducción
36
modelos animales para mimetizar las distintas condiciones en las que se produce la
atrofia muscular por inactividad.
Los primeros estudios utilizaban la inmovilización mediante férulas de yeso,
estos estudios encontraron una considerable pérdida de masa muscular durante los
periodos de inactividad muscular. En sus estudios, Kondo utilizó esta técnica e
inmovilizó los tobillos de las ratas en posición extendida durante 7 días (Kondo et al.,
1991, Kondo et al., 1993a, Kondo et al., 1993b).
Sin embargo, actualmente el modelo más utilizado, en ratas, para crear una
posición de inactividad es el protocolo no invasivo de suspensión de miembros
posteriores de Morey-Holton y Globus (Morey-Holton and Globus, 2002). En este
protocolo el periodo de inmovilización suele ser de 14 días, lo que produce una atrofia,
aproximadamente, del 50 % en el músculo sóleo (Servais et al., 2007, Oishi et al., 2008)
y aproximadamente de un 25 % en el gastrocnemio (Hofer et al., 2008). Así mismo, Siu,
tras 14 días de suspensión, obtuvo una disminución de masa muscular del 12% en ratas
jóvenes (Siu et al., 2008). No obstante, otros autores lo han utilizado durante periodos
de tiempo más prolongados, como Lawler que mantuvo a las ratas suspendidas de las
extremidades posteriores durante 28 días (Lawler et al., 2003).
Posteriormente se ha propuesto un modelo de inmovilización en ratones basado
en la inmovilización de la pata en una posición flexionada con una argolla durante 14
días, en el cual se ha observado una atrofia del 33% en el tibial anterior y de un 12 % en
el gastrocnemio (Caron et al., 2009).
A pesar de utilizar distintos protocolos de inmovilización y duración de los
mismos, todos estos estudios confirmaron una disminución de la masa muscular,
medida en el peso del músculo, al compararlos con los músculos de sus
correspondientes grupos control.
Estos estudios muestran resultados en los que la atrofia muscular es mucho más
significativa en músculos de contracción lenta, es decir, en los que predominan las
fibras de tipo I (como es el caso del sóleo) frente a los obtenidos en músculos rápidos,
compuestos por fibras tipo II (gastrocnemio).
Introducción
37
En estudios en los que se examinó la pérdida de masa muscular en diferentes
tipos de músculos observaron que la inmovilización en animales inducía un 50% de
atrofia en los músculos en los que predominan las fibras de contracción lenta, es decir
las de tipo I, y entre un 15 y 20% en los músculos en los que predominan las fibras tipo
II (Thomason and Booth, 1990b). Posteriormente, Desplanches llevó a cabo un estudio
usando el protocolo de suspensión de miembros posteriores, en el que halló una gran
pérdida de masa muscular en dos músculos antigravitatorios lentos como son el sóleo y
el aductor largo, conocidos ambos por mostrar tanto la atrofia como la transición de
fibras de tipo lento a rápido después de la suspensión (Desplanches et al., 2004,
Thomason and Booth, 1990b).
Así mismo, se ha demostrado que con la inmovilización de las extremidades esta
atrofia muscular se produce tanto por una disminución en la síntesis de proteína
muscular y como a un aumento en la degradación proteica (Booth and Seider, 1979,
Thomason et al., 1989). La tasa de síntesis de proteínas disminuye rápidamente al inicio
de la descarga muscular. Esta disminución en la síntesis de proteína muscular alcanza
un nuevo nivel de estado estacionario a las 48 horas (Thomason et al., 1989). Además,
la disminución de la síntesis de proteínas es seguida por un gran y rápido aumento de la
proteólisis, por lo que ambos procesos son los que conducen en última instancia a la
atrofia muscular.
Estos procesos de proteólisis y reducción de síntesis proteica durante la
suspensión de miembros posteriores derivan en una disminución del peso y de la masa
muscular. Reid y sus colaboradores observaron una disminución del 44% en el peso de
los soleos y de un 38% en el CSA del mismo en un periodo de 12 días de suspensión de
miembros posteriores en ratones (Matuszczak et al., 2004). Estos resultados coinciden
con otros estudios realizados en ratas, en los que 14 días de suspensión produjeron una
disminución del 34 y 24% en la masa del sóleo y del músculo plantar, siendo la pérdida
del 47 y 24% si se aumentaba el tiempo de suspensión a 28 días (Miller et al., 2001).
Aunque la técnica para evaluar la fuerza máxima es diferente de los utilizados en
los seres humanos, el modelo de suspensión de miembros posteriores en roedores parece
tener efectos más drásticos que los modelos de inactividad utilizados en los seres
humanos. De hecho, Pottle y Gosselin observaron una disminución del 30% en la fuerza
máxima desarrollada por el músculo sóleo de ratas después de 7 días de inactividad. Así
Introducción
38
mismo, se observó que 10 días de suspensión (Pottle and Gosselin, 2000) producen una
disminución similar en el músculo sóleo de los ratones, pero sin cambiar la fuerza
máxima desarrollada el gastrocnemio (Wenke et al., 2010). Cuando el período de
suspensión se extiende a dos semanas, la reducción se hace más significativa,
pudiéndose obtener una reducción de la fuerza máxima alrededor de 50-60% en el
músculo sóleo de ratas (Riley et al., 2005).
1.5.2. Vías de señalización comunes en la atrofia inducida por inactividad
muscular
Como se ha comentado anteriormente, la atrofia del músculo esquelético se
caracteriza por una disminución en el contenido de proteína, diámetro de la fibra, la
producción de fuerza y la resistencia a la fatiga. Los diferentes tipos de condiciones que
producen atrofia implican diferentes tipos de factores desencadenantes moleculares y
vías de señalización para la pérdida de masa muscular. En este apartado de tesis nos
centraremos en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en gran
parte de las situaciones en las que se produce una atrofia muscular. Se finalizará con la
descripción de aquellos mecanismos concretos de atrofia por desuso o inactividad
muscular (suspensión de miembros posteriores en animales, pacientes encamados, o
microgravedad durante vuelos espaciales).
Miostatina: Proteína perteneciente a la familia de los factores de crecimiento
transformante beta (TGF-β), conocida como reguladora negativa del crecimiento
muscular (Lee, 2004). Similares a otros miembros de la familia TGF-β, la miostatina se
secreta como una proteína precursora que se escinde para generar un ligando maduro
que transmite las señales a través de un receptor de tipo II para la activación de factores
de transcripción Smad (Dominique, 2006).
Se ha observado que ratones knockout de esta proteína produce músculos
marcadamente agrandados como resultado de la hipertrofia y la hiperplasia (Grobet et
al., 2003). Así mismo, la activación sistémica de este regulador conduce a la pérdida de
masa muscular en ratones (Zimmers TA, 2002).
Introducción
39
Estudios de Se- Jin Lee y sus colaboradores han demostrado que los músculos de
los ratones knockout de miostatina pesan alrededor de 100-200 % más que sus ratones
controles, exhibiendo tanto hipertrofia de la fibra como hiperplasia, mientras que la
sobreexpresión de la miostatina sistémica causa hasta 50% de pérdida de la masa
muscular esquelética, provocando caquexia severa (Lee, 2004). Además, el tratamiento
de células musculares cultivadas con miostatina recombinante produce una pérdida de
proteínas y una reducción de la tasa de síntesis de las mismas (Jackman and Kandarian,
2004). Posteriormente, se demostró que la miostatina modula estos efectos en los
músculos a través de varios mecanismos. Durante la diferenciación miogénica, la
miostatina puede inhibir la proliferación mediante la modulación de los niveles de
CDK-2 (kinasa dependiente de ciclina 2) y p21Cip1 (Inhibidor de la kinasa dependiente
de ciclina 1A), además de poder reprimir la diferenciación terminal por la regulación
negativa de MyoD, proteína de diferenciación miogénica (Langley, 2002).
Por otra parte, la expresión de miostatina se incrementa en algunas condiciones
crónicas como en pacientes infectados con virus de la inmunodeficiencia humana
adquirida (VIH) (Gonzalez-Cadavid et al., 1998), el envejecimiento o la osteoartritis.
Además, también se ha observado su incremento en otros tipos de atrofia muscular
como la inducida durante la suspensión de miembros posteriores y la exposición a la
microgravedad (Carlson CJ, 1999, Lalani R, 2000, Ma et al., 2003). O, incluso, en una
condición de caquexia inducida en ratones inyectados con células CHO, las cuales
expresaron altos niveles de miostatina. En este estudio se demostró que la miostatina
puede actuar sobre MyoD pero, además, también tiene la capacidad de inducir la
expresión Forkhead box protein O1 (FoxO-1) que conduce a la producción
concomitante de la ubiquitin-ligasa Muscle atrophy F-Box (MAFbx, también conocida
como atrogina-1) que aumenta la actividad proteasomal (Ghosh et al., 1998). De hecho,
los tratamientos con miostatina inactivan la vía IGF1-PI3K-Akt y activa FoxO1, lo que
permite el aumento de expresión de MAFbx. Esta diafonía entre las dos vías no requiere
la activación de NF-кB, cuya inhibición no impide la regulación positiva de MAFbx
(McFarlane, 2006).
Todo ello que indica que la miostatina puede contribuir a la atrofia de tipo
caquexia. Es importante destacar, sin embargo, que los ratones con hipertrofia muscular
debido a la supresión del gen de miostatina desarrollan una atrofia muscular igual o
Introducción
40
mayor que los ratones de wild-type en respuesta a la suspensión de miembros
posteriores (McMahon et al., 2003). Este hallazgo indica que la atrofia inducida por
suspensión no sólo requiere la expresión de miostatina, si no que actúan otras vías de
señalización conjuntamente.
Glucocorticoides: Los niveles de glucocorticoides se incrementan en muchas
condiciones patológicas asociadas con la pérdida de músculo, además el glucocorticoide
sintético dexametasona es ampliamente utilizado para inducir la proteólisis muscular, ya
sea in vivo (Hasselgren, 1999) o en un cultivo celular (Thompson MG, 1999). En el
músculo esquelético, los glucocorticoides disminuyen la tasa de síntesis de proteínas y
aumentan la tasa de degradación de las mismas (Goldberg et al., 1980, Mayer et al.,
1976, Tomas FM, 1979).
Concretamente, el tratamiento con glucocorticoides induce la expresión de
MAFbx y Muscle RING Finger-1 (MuRF-1) promoviendo la pérdida de masa muscular
en cultivo celular e in vivo (Bodine, 2001, Clarke, 2007, Sacheck, 2004, Sandri, 2004,
Schakman, 2008). Por el contrario, la adrenalectomía, o el tratamiento con un
antagonista de receptor de glucocorticoides, atenúa la pérdida de músculo en algunas
enfermedades (Schakman, 2008, Menconi, 2007). Los mecanismos de la atrofia
muscular mediados por glucocorticoides es la siguiente: una vez en el núcleo, el
receptor de glucocorticoides activa la expresión de dos genes diana, que codifica el gen
Regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1) y Krüppel-like
factor 15 (KLF15) (Shimizu, 2011). REDD1 inhibe la actividad de mammalian target of
rapamycin (mTOR). KLF15 participa en el catabolismo muscular a través de la
regulación transcripcional de FoxO1, MAFbx y MuRF-1. Por otra parte, KLF15 afecta
negativamente a través de la regulación positiva de mTOR.
Así mismo, se sabe que tanto la atrofia por inactividad muscular como la
caquexia llevan asociado un incremento de los niveles de glucocorticoides circulantes,
así como, un aumento en la capacidad de unión de los corticosteroides durante la
inactividad muscular. (Jackman and Kandarian, 2004).
Sin embargo, cuando los animales adrenalectomizados se sometieron a
suspensión de miembros posteriores, con o sin tratamiento de cortisol, igualmente
sufrieron atrofia muscular (Jaspers and Tischler, 1986). En este mismo sentido es
importante destacar que el tratamiento con un inhibidor de los glucocorticoides, RU-
Introducción
41
38486, en ratas suspendidas, no inhibió la atrofia por inactividad muscular (Tischler,
1994). Por lo tanto, los glucocorticoides no parecen ser necesarios para la atrofia por
inactividad muscular. En el caso de caquexia, los glucocorticoides parecen ser un factor
que contribuye a la pérdida de masa muscular, en parte porque las ratas tratadas con
RU-38486 demostraron una reducción de la proteólisis, aunque la pérdida de proteínas
no era completamente atenuada (Hall-Angerås, 1990, Zamir, 1993).
TNF-α y otras citoquinas: Existe una amplia literatura sobre el papel de las
citoquinas en la caquexia que demuestra que TNF-α y otras citoquinas como la IL-1 se
incrementan en estas condiciones. La administración de TNF-α pueden inducir
caquexia, y el bloqueo de TNF-α en ratas, ya sea en cáncer o sepsis, evita la pérdida de
masa muscular. El tratamiento único con TNF-α también conduce a la degradación
creciente de proteínas en células musculares en cultivo (Jackman and Kandarian, 2004).
Así mismo, TNF-α y las citoquinas pro-inflamatorias también causan resistencia
a la insulina y la supresión de la vía IGF1-Akt (de Alvaro, 2004, Dogra et al., 2007,
Hirosumi et al., 2002). Por lo tanto, la fosforilación de Akt siempre debe ser explorada
cuando se perturba la vía NF-кB, ya que la inhibición de Akt puede contribuir
sustancialmente a la atrofia muscular.
Así mismo, hay estudios en los que no se encontraron diferencia en los niveles
de proteína de TNF-α los niveles de proteína en los músculos, de los miembros
posteriores, suspendidos (Hunter RB, 2002). Por lo tanto, las citoquinas son factores
desencadenantes clave en la pérdida de masa muscular en la caquexia, pero se sabe que
en periodos de inactividad muscular es un tema que presenta muchas controversias. Una
razón probable de que las citoquinas están involucradas con la caquexia, pero no
parecen estar implicados en la atrofia por desuso es que este último es un fenómeno
local mientras que el primero implica desencadenantes sistémicos (Jackman and
Kandarian, 2004).
Por otra parte, se sabe que varios sistemas proteolíticos contribuyen a la
degradación de las proteínas musculares. Las proteasas más investigadas en el músculo
esquelético son las proteasas lisosomales, proteasas activadas por el Ca2+ (es decir,
calpaínas) y el sistema ubiquitin-proteasoma.
Introducción
42
Aunque las proteasas lisosomales se activan en el músculo esquelético sometido
a una atrofia por inmovilización, la importancia de estas proteasas parece limitada
(Furuno and Goldberg, 1986, Hasselgren et al., 2002, Purintrapiban et al., 2003). Por el
contrario, existe una fuerte evidencia que indica que tanto la calpaína como el sistema
ubiquitin-proteasoma juegan un papel fundamental en el desajuste proteico muscular
durante la atrofia muscular (Furuno and Goldberg, 1986, Ikemoto et al., 2001,
Purintrapiban et al., 2003). Por otra parte, nuevas evidencias revelan que otra proteasa,
la caspasa-3, puede contribuir también en distintas formas de atrofia muscular (Du et al.,
2004).
Calpaínas: Las calpaínas (calpaínas I y II) son proteasas cisteínicas
dependientes de Ca2+ que se activan en el músculo esquelético durante periodos de
inactividad (Goll et al., 2003). Aunque las calpaínas no degradan directamente la actina
y la miosina, liberan las proteínas del sarcómero mediante la ruptura de las proteínas del
citoesqueleto (titina, nebulina) encargadas de sostener los elementos contráctiles.
La actividad de la calpaína está regulada por varios factores, incluyendo los
niveles citosólicos de calcio y la concentración de la calpastatina inhibidora de la
calpaína endógena (Goll et al., 2003). Por lo tanto, la actividad de la calpaína aumenta
mediante cualquier factor que eleve las concentraciones de calcio citosólico y/o
disminuya los niveles de calpastatina (Goll et al., 2003). En este sentido, se conoce que
la inactividad muscular está asociada con la sobrecarga de calcio y la activación de
calpaína (Kourie, 1998). Aunque el mecanismo responsable de esta sobrecarga de calcio
producida por la inactividad todavía se desconoce, se ha argumentado que el estrés
oxidativo podría jugar un papel relevante en el trastorno iónico celular (Kondo et al.,
1994). Una explicación biológica para esta teoría es que la formación de aldehídos
reactivos mediada por la oxidación (4-hydroxy-2, 3-trans-nonenal) reduce la actividad
de Ca2+ ATPasa en la membrana plasmática (Sommerburg et al., 1998). Por ello, se
deduce que una disminución en la actividad de Ca2+ ATPasa en la membrana, inducida
por el estrés oxidativo, retrasaría la eliminación de Ca2+ de las células y promovería su
acumulación intracelular. Sin embargo, se desconoce todavía si este mecanismo es el
único responsable de la sobrecarga de calcio en el músculo debida a la inactividad.
Introducción
43
La caspasa-3: Numerosas vías de señalización pueden desencadenar la
activación de un grupo de proteasas denominado caspasas (Primeau et al.,
2002). Colectivamente, las caspasas son endoproteasas que degradan las proteínas y, en
algunos casos, causan la muerte celular programada (apoptosis). En la célula, las
caspasas se expresan como precursores inactivos, procaspasas y la activación de las
caspasas puede dar lugar a acontecimientos que conducen a la degradación de proteínas
y la apoptosis.
La vía mitocondrial de activación de la caspasa-3 es compleja y puede ser
iniciada por numerosas señales de interacción, incluyendo las ERO (Leeuwenburgh,
2003). Estas últimas pueden conducir a la liberación mitocondrial de citocromo C,
resultando en la activación de la caspasa-9 y la posterior activación de la caspasa-3
(Leeuwenburgh, 2003).
Hemos descrito distintas vías de señalización que actúan en diversas condiciones
en las que se induce una atrofia muscular, pero que no se han visto implicadas durante
la inactividad muscular. Por ello, a continuación vamos a centrarnos en aquellas vías
moleculares implicadas concretamente en la atrofia muscular por inmovilización o
suspensión de miembros posteriores como lo son el estrés oxidativo, la actividad del
sistema ubiquitin-proteasoma, la supresión de la vía IGF/Akt y la inflamación inducida
por la vía molecular del factor de trascripción nuclear NF-кB. Puesto que, la alteración
de estas vías induce una atrofia más acentuada en los músculos de contracción lenta, es
decir, los que están compuestos en su mayoría por fibras tipo I, también denominadas
fibras rojas por su elevado contenido de mioglobina, más que en los de contracción
rápida o tipo II.
1.5.3. Inmovilización y estrés oxidativo
En este apartado encontraremos un breve resumen del papel que el estrés
oxidativo juega en la atrofia muscular por inactividad. El enfoque planteado presenta
primero un listado de conceptos bien definidos con referencia a importantes vías
proteolíticas que conducen a la atrofia muscular por inmovilización.
Introducción
44
A continuación se exponen las posibles fuentes oxidantes implicadas en el estrés
oxidativo vinculado a la atrofia muscular y se comenta como afecta todo ello a la
actividad de las enzimas antioxidantes.
1.5.3.1. Efecto de la inmovilización sobre el estrés oxidativo en el músculo
esquelético
El aumento de actividad de las ERO y el estrés oxidativo están estrechamente
asociados con la pérdida de masa muscular en diversos estados catabólicos que incluyen
el cáncer (Tisdale, 2000), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Clanton et al.,
1999), la insuficiencia cardiaca congestiva (Anker and Rauchhaus, 1999), la sarcopenia
senil (Spiers et al., 2000), y la inmovilización (Kondo et al., 1991).
Se puede tender a pensar que la producción de ERO es mínima en periodos de
inactividad muscular y que el daño oxidativo no está presente. Sin embargo, cada vez
hay más pruebas que implican al estrés oxidativo como un importante regulador de las
vías que conducen a la atrofia muscular durante estos periodos.
Muchos estudios han ratificado que se produce un daño oxidativo y un deterioro
muscular durante los períodos de inactividad física (Kondo et al., 1993b, Kondo et al.,
1994, Lawler et al., 2003, Servais et al., 2007), como ocurre en los largos periodos de
inmovilización, durante una lesión muscular, largos reposos en cama, exposiciones a
vuelos espaciales, denervación muscular o en el proceso de envejecimiento (Booth and
Zwetsloot, 2010). Estas situaciones se caracterizan por desencadenar un elevado estrés
oxidativo.
La atrofia por suspensión, como veremos en puntos posteriores, actúa en la
regulación positiva de Cu,ZnSOD y resulta perjudicial debido a una concomitante
disminución de la catalasa, glutatión peroxidasa, y, posiblemente, de MnSOD, sistemas
que normalmente actúan para contrarrestar el aumento de las ERO.
El tratamiento de las células musculares con H2O2 conduce al aumento de la
degradación de las proteínas, disminución de la expresión de miosina, y el aumento de
la expresión de los componentes de la vía proteolítica ubiquitin-proteasoma (Jackman
and Kandarian, 2004). Se sugiere que dichos componentes son objetivos
transcripcionales de la señalización de ERO en miotubos cultivados. Por otra parte, se
Introducción
45
ha observado que las EROs inducen a la activación de la vías de señalización NF-кB,
asociada a la pérdida de proteínas (Li and Reid, 2000). Por lo tanto, parece posible que
el aumento de las ERO pueda desencadenar la vía de señalización NF-кB, como
veremos en apartados posteriores.
En la actualidad, no se sabe con exactitud que vías de producción de radicales
libres son las responsables de este daño oxidativo. Sin embargo, parece lógico que el
estrés oxidativo en el músculo esquelético inactivo pueda deberse a la interacción de al
menos cinco vías diferentes de producción de oxidantes (Kondo et al., 1991): 1) la
generación de ERO por la vía de la XO, 2) la producción de NO a través de NOS, 3) la
formación de ERO por el aumento de los niveles celulares de hierro reactivo, 4) la
NADPH oxidasa, y 5) la producción mitocondrial de radicales superóxido (Ver figura
1.4.).
Figura 1.4. Vías por las que se producen ERO en el músculo esquelético durante
periodos de inactividad. Extraído de (Powers et al., 2005)
Otras publicaciones demuestran que la atrofia muscular inducida por la
inmovilización aumenta los niveles de ácido tiobarbitúrico (TBARS) y la peroxidación
de lípidos, a la vez que disminuye el ratio GSH/GSSG (Kondo et al., 1993c, Sen, 1992).
Introducción
46
1.5.3.2. Producción y fuentes de radicales libres
A continuación, comentaremos brevemente las posibles fuentes oxidantes
implicadas en la atrofia muscular:
Óxido nítrico: La producción endógena de NO- a través de las NOS puede dar
lugar a la formación de varias ERN, incluyendo el ONOO-.
La producción de ONOO- y otras ERN está relacionada con el daño celular
debido a la peroxidación de lípidos y al aumento de la nitrosilación de
proteínas. Existen tres isoformas de ERN (Stamler and Meissner, 2001):
1) ERN inducible (iNOS), que es independiente de calcio.
2) ERN endotelial (eNOS), que se activa por el calcio.
3) ERN neuronal (nNOS), que es también activada por el calcio. Ambos, nNOS
y eNOS, se expresan en el músculo esquelético (Kobzik et al., 1994).
Por otra parte, además de por la activación de calcio, la actividad de NOS
también se ve influida por la fosforilación de proteínas de choque térmico. La evidencia
indica que la actividad de NOS es mayor en el músculo esquelético inmovilizado,
resultando una mayor producción de NO- (Kondo et al., 1991).
Hierro reactivo: Los metales de transición como el hierro y el cobre pueden
participar en las reacciones químicas que producen ERO (Halliwell B, 1999). Por
ejemplo, en la presencia de Fe2+, el H2O2 se convierte en el radical hidroxilo altamente
reactivo (OH-) a través de la reacción Fenton:
Fe2+ + H2O2 Complejos intermedios Fe3+ + HO• + HO-
Además, los catalizadores metálicos pueden también contribuir a la formación
de radicales hidroxilo a través de la reacción Haber-Weiss:
O2•- + H2O2 O2 + HO• + HO-
En las células sanas, el hierro está estrechamente ligado a la proteína ferritina de
fijación de hierro. El hierro unido a la ferritina normalmente no participa en las
reacciones de Fenton o de Haber-Weiss. Sin embargo, la liberación de hierro desde la
Introducción
47
ferritina o hemo-proteínas puede dar lugar a la formación de compuestos de hierro de
bajo peso molecular (es decir, hierro reactivo) que son capaces de participar en las ya
citadas reacciones de producción de radicales.
En este sentido, tanto el H2O2 como los radicales superóxido, han demostrado
promover la liberación de hierro de la ferritina, de la misma manera que la hemo-
oxigenasa-1 es capaz de liberar hierro unido a hemo-proteínas (Halliwell B, 1999). En
cualquier caso, un aumento de los niveles celulares de hierro reactivo es un
contribuyente potencial al daño celular oxidativo. En referencia al estrés oxidativo
mediado por el hierro en el músculo esquelético, la inmovilización del sóleo de las ratas
ha demostrado facilitar el aumento de los niveles de hierro muscular (Kondo et al.,
1992a, Kondo et al., 1992b). Este aumento de hierro en el músculo se asoció con la
elevada peroxidación de lípidos en el músculo inmovilizado. La administración
sistémica de un quelante del hierro disminuyó el estrés oxidativo asociado con la
inmovilización del músculo (Kondo et al., 1992b).
NAD(P)H-oxidasa: Una nueva evidencia indica que una NAD(P)H oxidasa no-
fagocítica y no-mitocondrial se encuentran en el músculo esquelético tanto de humanos
como de roedores. Las NAD(P)H oxidasas son enzimas asociadas a la membrana que
catalizan la reducción de oxígeno molecular utilizando NADH o NAD(P)H como
donadores de electrones. Numerosos factores pueden aumentar la actividad de
NAD(P)H-oxidasa en las células, incluyendo la vía C-ERK1/2 proteín-kinasa. La
inactividad del músculo esquelético tiene como resultado un aumento de la
concentración de calcio intracelular, por lo que parece evidente que la actividad de
NAD(P)H oxidasa aumentaría, resultando una elevada producción de superóxido. Sin
embargo, en la actualidad no está claro si la inactividad del músculo esquelético tiene
como resultado un aumento de la NAD(P)H oxidasa (Javesghani et al., 2002).
Producción mitocondrial de ERO: Está perfectamente detallado que el
transporte de electrones a lo largo de la cadena de transporte resulta en la formación de
radicales superóxido. De hecho, se estima que en niveles fisiológicos de oxígeno, 0.15%
del total de oxígeno reducido en las mitocondrias podría formar radicales superóxido
(St-Pierre et al., 2002). Por lo tanto, la posible implicación de la mitocondria en la
producción de radicales en el músculo por inmovilización ha sido ampliamente
estudiada.
Introducción
48
Xantina oxidasa: Ya se ha descrito anteriormente de forma extensa y precisa
como la XO se relaciona con diversos procesos patológicos y produce un daño
oxidativo a los tejidos, ya que su acumulación inicia una cascada de reacciones cuyo
resultado es un gran aumento en la formación de radicales libres (ver apartado 1.1.1.1).
Por lo que solo recordaremos que la XO se produce en las células a través de la
oxidación de sulfidrilos o de la proteólisis de XDH mediante las proteasas activadas por
el calcio (calpaína) (Hellsten et al., 1997). En presencia de oxígeno y sustratos purina
(HX, xantina), la XO cataliza la formación de radicales superóxido y ácido úrico. El
radical superóxido puede suponer la formación de otras especies reactivas más
dañinas. Por ejemplo, la producción de superóxido mediante la vía de la XO puede
reaccionar con el NO- para formar el altamente reactivo y biológicamente dañino,
ONOO- (Halliwell B, 1999). Kondo y colaboradores señalaron la XO como la principal
fuente de producción de ROS en los músculos atrofiados (Kondo et al. 1993a). Así
mismo Matuszczak observó que la administración de alopurinol en ratones tenía efectos
protectores durante la suspensión de las extremidades posteriores (Matuszczak et al.
2004).
1.5.3.3. Papel de la vía ERO/MAPKinasa p38 en el músculo esquelético
Este aumento de la actividad de las ERO dentro de las fibras del músculo
esquelético activa los factores de transcripción sensibles a redox y de proteínas kinasas,
incluyendo NF-кB, AP-1, MAPKinasa p38, ERK1/2, y JNK (Garg and Aggarwal,
2002).
La MAPK p38 ha sido identificada como una posible mediadora de la
señalización del catabolismo en el músculo esquelético (Tracey, 2002). Ya que se ha
demostrado su implicación en distintas situaciones de atrofia muscular. Por ejemplo, se
observó un aumento de la fosforilación de p38 en los músculos atróficos de pacientes
tetrapléjicos con miopatía aguda y en los músculos de personas con atrofia muscular
neurogénica (Di Giovanni et al., 2004). Así mismo, con un protocolo de suspensión de
miembros posteriores, durante 10 días, observaron un aumento de 128 % en la
fosforilación de p38 al mismo tiempo que se redujo el contenido de p38 total en el
músculo sóleo de las ratas inmovilizados (Childs et al., 2003).
Introducción
49
Otras condiciones caquéxicas en el que se ha demostrado la fosforilación de p38
en el músculo esquelético incluyen la diabetes tipo 2 (Koistinen et al., 2003) y el
proceso de envejecimiento (Williamson et al., 2003).
El papel en la regulación del catabolismo muscular por parte de p38 viene con su
relación con la ubiquin-ligasa MAFbx. Ya que se ha demostrado que la inducción de la
fosforilación de p38, aumenta la expresión de MAFbx en el músculo esquelético (Li et
al., 2005). En este mismo estudio se demuestra que la inhibición de p38 inactiva la
expresión de MAFbx, dejando en manifiesto la relación p38/MAFbx (Li et al., 2005).
1.5.3.4. Evolución de la defensa antioxidante enzimática y no enzimática
Otro punto a tener en cuenta es la modificación de las actividades enzimáticas
antioxidantes inducidas por la inmovilización.
En la actualidad se han publicado diversos estudios en los que se han evaluado
los cambios de las enzimas antioxidantes en el tejido muscular de animales en respuesta
a la suspensión de miembros posteriores. Algunos estudios han demostrado que la
suspensión de miembros posteriores causa un ligero descenso en la actividad de la
MnSOD (Lawler et al., 2003), mientras que la actividad de la Cu,ZnSOD aumenta
significativamente (Lawler et al., 2003, Kondo et al., 1993b, Servais et al., 2007). Por el
contrario, la catalasa y la GPx, enzimas antioxidantes que eliminan los peróxidos, se
reducen de manera significativa (Lawler et al., 2003).
Girten y sus colaboradores describieron una disminución en la actividad de la
catalasa y la forma total de SOD después de 14 días de suspensión. Sin embargo, no se
encontraron modificaciones en el Cu,Zn-citosólico y las isoformas Mn-mitocondriales
de SOD, la GPx no se midió (Girten et al., 1989).
Por el contrario Kondo et al. (Kondo et al., 1993b, Kondo et al., 1993c)
informaron de una respuesta más compleja tras ocho días de inmovilización. La GPx y
la catalasa no se modificaron, mientras que la isoforma Cu,ZnSOD se incrementó un
41%.
Introducción
50
Por ello, podemos deducir que la respuesta de todo el espectro de enzimas
antioxidantes a la inmovilización muscular no ha sido completamente definida. Ya que,
como hemos observado, existen pocos estudios y con respuestas muy dispares sobre los
efectos de la suspensión de miembros posteriores en la capacidad de los antioxidantes
no enzimáticos. Es muy probable que uno de los motivos sean las diferencias existentes
entre los distintos modelos de suspensión utilizados.
1.5.4. Inmovilización y sistema ubiquitin-proteasoma: Papel de las E3
ubiquitin-ligasas
El proteosoma es un complejo enzimático multicatalítico de gran tamaño
presente en la cara citosólica de la membrana plasmática y en el núcleo. Es uno de los
medios que emplean las células para controlar la función de las proteínas modulando el
balance entre síntesis y degradación de las mismas. El proteasoma es el sistema más
importante de degradación de proteínas en el músculo esquelético, así como en la
mayoría de los tejidos (Rock et al., 1994), ya que se estima que es el responsable de la
degradación del 80-90% de las proteínas celulares incluyendo reguladores del ciclo
celular, factores de transcripción, proteínas anormales o dañadas, oncogenes y genes
supresores de tumores, (Ciechanover and Schwartz, 1998).
La ubiquitinación de proteínas es un mecanismo de etiquetado, como lo son la
fosforilación o la glicosilación. Para que una proteína sea degradada por el proteasoma
tiene que ser marcada por unión covalente de una cadena de poliubiquitina, que requiere
la actividad de tres clases de enzimas (Pickart and Cohen, 2004, Glickman and
Ciechanover, 2002).
La primera enzima que actúa es la enzima ubiquitina de activación (E1) que, en
un proceso que requiere gasto de ATP, activa una ubiquitina formando un enlace
tioéster entre su cisteína del sitio activo y el extremo C-terminal de la ubiquitina. Para
que la activación sea completa E1 tiene que unirse de forma no covalente a una segunda
molécula de ubiquitina. Esta ubiquitina activada es transferida, desde la enzima E1, a
otra cisteína localizada en el centro activo de las enzimas transportadoras o de
conjugación de ubiquitina, denominadas E2, pasando el enlace tioester a estas últimas.
La enzima E2 transfiere la molécula de ubiquitina a la E3, la enzima clave en este
Introducción
51
sistema, que posee su propia actividad catalítica y es responsable de la transferencia
final de la ubiquitina a un sustrato formando un enlace isopéptídico entre la proteína
diana y la ubiquitina.
Finalmente las proteínas ubiquitinadas sufren degradación en el proteasoma 26S.
Una cadena de cinco moléculas de ubiquitinas unidas al sustrato de proteína que va a ser
degradada es suficiente para que el complejo sea reconocido por el proteasoma 26S.
El proteasoma 26S está formado por los extremos 19S que escinden la cadena de
ubiquitinación y utilizan ATPasas para que la proteína se alinee y sea inyectado en el
centro del proteasoma que corresponde al núcleo 20S, compuesto de cuatro
subunidades, donde se digiere el sustrato y se degrada a pequeños péptidos. Los
péptidos son degradados a aminoácidos (entre 3 y 25 residuos de aminoácidos) por
peptidasas en el citoplasma o utilizados en la presentación de antígenos (Reid, 2005).
Figura 1.5. Vía de degradación de proteínas por el sistema ubiquitin-proteasoma.
Adaptado de (Lecker et al., 2006)
Se sabe que el sistema de ubiquitin-proteasoma degrada las principales proteínas
contráctiles del músculo esquelético y juega un papel importante en la pérdida de masa
muscular.
El genoma humano codifica más de 650 ubiquitin ligasas (Lee and Goldberg,
2011), que están implicadas en la regulación precisa de diferentes procesos celulares.
Las distintas E3 ubiquitin-ligasas existentes ofrecen una especificidad y selectividad a la
hora de marcar ciertos grupos de proteínas, es decir, las E3 ubiquitin-ligasas que marcan
las proteínas para ser degradadas varían entre los distintos tipos de tejidos.
Introducción
52
Concretamente, estudios experimentales en los que los animales fueron
sometidos a suspensión de miembros posteriores y en sujetos encamados o en situación
de ingravidez muestran un aumento en la expresión de mRNA de las E3 ubiquitin-
ligasas, de las subunidades de proteasoma 20S (Taillandier et al., 1996, Urso et al.,
2006), así como, un incremento de proteínas ubiquitinadas (Ikemoto et al., 2001), lo que
demuestra la contribución significativa del sistema ubiquitin-proteasoma en la atrofia
muscular inducida por suspensión.
Entre las E3 ubiquitin-ligasas conocidas, sólo unas pocas son especificas del
músculo esquelético y se expresan comúnmente en, al menos, 13 condiciones que
inducen atrofia muscular, como la caquexia cancerosa y reumatoide, sepsis, diabetes,
sarcopenia, inmovilización, denervación, virus VIH, fallo renal, etc. (Foletta et al.,
2011). Los estudios pioneros para identificar las ubiquitin-ligasas implicadas en la
atrofia muscular fueron realizadas por estudios independientes de expresión génica de
Alfred L. Goldberg y David J. Glass (Bodine et al., 2001a, Gomes et al., 2001). Estos
estudios permitieron identificar las E3 ubiquitin-ligasas que se expresan comúnmente en
todos estos procesos de pérdida o atrofia de masa muscular, a las que denominaros
atrogenes (Sacheck et al., 2007).
Dos de estas E3 ubiquitin-ligasas especificas del músculo esquelético son,
MAFbx, también conocida como atrogina-1, y un nuevo gen denominado MuRF-1. La
capacidad de las E3 ubiquitin-ligasas de reconocer su sustrato depende de la secuencia
de aminoácidos y/o dominios estructurales y fosforilados específicos. MAFbx está
constituída por un dominio F-box, que caracteriza una clase de proteínas que cumplen
función de E3 ubiquitin-ligasas, llamadas complejo SCF (proteína Skp1, proteína Cal,
proteína Ring Fingers y proteína F-Box) (Sandri, 2008, Glickman and Ciechanover,
2002). En cambio, la familia de proteínas MuRF-1 contiene un dominio Zn2+ unido a un
dominio RING en su extremo NH2-terminal.
Entre los sustratos que son marcados por MAFbx se incluyen el factor de
iniciación de la elongación 3 subunidad 5 (eIF3-F) y los factores reguladores
miogénicos MyoD y miogenina, por lo que su degradación afecta a la traducción de
proteínas y, por lo tanto, la síntesis de las mismas, además de la diferenciación de
mioblastos, (Lagirand-Cantaloube et al., 2008, Li et al., 2004, Tintignac et al., 2005). El
aumento de la expresión de eIF3-F está relacionado con la hipertrofia del músculo
Introducción
53
esquelético, en contra la disminución de sus niveles deriva en atrofia muscular
(Lagirand-Cantaloube et al., 2008). La interacción de MAFbx y MyoD se produce en el
núcleo. La sobreexpresión de los MAFbx y la subsiguiente poliubiquitination de MyoD
produce una inhibición de la diferenciación y formación de los miotubos en el músculo
esquelético (Lagirand-Cantaloube et al., 2009). Además, se ha observado que en
animales knockdown de MAFbx se revierte la proteólisis de MyoD inhibiéndose la
atrofia muscular (Lagirand-Cantaloube et al., 2009). Estos resultados confirmaron que
MyoD es un sustrato regulado por MAFbx. De la misma forma, MAFbx regula la
expresión de miogenina en los procesos de atrofia muscular inducida por dexametasona
(Jogo et al., 2009). Estos estudios demuestran que estos factores de transcripción
miogénica son una diana de la E3 ubiquitin-ligasa MAFbx, sugiriendo su implicación en
la regulación de la diferenciación de mioblastos.
En cambio MuRF-1 está implicado en la degradación de proteínas estructurales,
ya que marca proteínas como la troponina I, la titina (Centner et al., 2001) o la cadena
pesada de la miosina (MHC) después de un tratamiento con dexametasona. Además,
MuRF-1 ubiquitina la miosina unida a la proteína C y la cadena ligera de la miosina 1 y
2 (MLC1 y MLC2) en condiciones de denervación y ayuno (Cohen et al., 2009). Estos
dos últimos estudios identificaron estas proteínas in vivo utilizando ratones transgénicos
knockout de MuRF-1, mientras que otros estudios de ubiquitinación in vitro han
confirmado la depleción selectiva de cadenas pesadas de miosina (Fielitz et al., 2007),
así como, una forma oxidada de la creatin kinasa (Zhao et al., 2007). Así mismo,
también se ha descrito la relación de la E3 ubiquitin-ligasa MuRF-1 con varias proteínas
asociadas con la producción de glucosa y el metabolismo del glucógeno (Hirner et al.,
2008).
Estos estudios sugieren que distintas vías metabólicas pueden activar la
sobreexpresión de MAFbx y MuRF-1, y que estas E3 ubiquitin-ligasas actúan por
separado sobre diferentes proteínas. La activación de MAFbx está más relacionado con
la inhibición de la síntesis proteica y el crecimiento muscular, mientras que la activación
de MuRF-1 induce el aumento de la degradación de proteínas, probablemente afectando
al metabolismo muscular.
Introducción
54
Por otro lado, hay que destacar que aunque estas E3 ubiquitin-ligasas actúan en
distintas situaciones en las que se induce una atrofia muscular, no actúan de igual
manera en todas ellas. Del mismo modo, se han utilizado distintos y numerosos
inhibidores para bloquear la expresión de MAFbx y/o MuRF-1, y en consecuencia,
paliar la atrofia del músculo esquelético, observándose que ningún inhibidor es eficaz
para todos los procesos de atrofia.
En relación a la sobreexpresión de las E3 ubiquitin-ligasas, MAFbx y MuRF-1,
en periodos de inmovilización hay que destacar aumentos en sus niveles de mRNA en la
suspensión de miembros posteriores en ratas (Lomonosova et al., 2012, Lomonosova et
al., 2011, Kline et al., 2007, Krawiec et al., 2005, Servais et al., 2007, Nordquist et al.,
2007) y ratones (Okamoto et al., 2011, Caron et al., 2009, Caron et al., 2011), así como
en personas encamadas o en situaciones de ingravidez (Chen et al., 2007, Gustafsson et
al., 2010, Jones et al., 2004, Sakuma et al., 2009, Salanova et al., 2008).
A lo largo de este apartado se ha detallado la importancia de MAFbx y MuRF-1
en distintas situaciones que inducen atrofia muscular, entre estas condiciones se
encuentran las de desuso muscular, es decir, la inmovilización, los vuelos espaciales,
largos periodos de reposo en cama y, el modelo de experimentación en animales, la
suspensión. No obstante, se ha descrito una nueva E3 ubiquitin-ligasa sugerida como la
principal responsable de la atrofia muscular inducida por suspensión o microgravedad.
Cbl-b es otra ubiquitin-ligasa con un dominio RING, descrita como un regulador
negativo del receptor tirosin kinasa (IRS), que a su vez media la activación del factor de
crecimiento insulínico tipo 1, también conocido como somatomedina C, o IGF-1
(insulin-like growth factor-1) (Keane et al., 1995, Latres et al., 2005).
Como veremos a continuación la supresión IGF-1 inhibe la síntesis de proteínas
en el músculo esquelético inactivando vía PI3K/Akt. Teniendo en cuenta que los
estudios realizados demuestran que la suspensión de miembros posteriores induce un
aumento en la expresión de la E3 ubiquitin-ligasa Cbl-b, regulando negativamente la
activación de IGF-1 en el sistema músculo esquelético, estos datos demuestran que la
atrofia muscular inducida por la suspensión de miembros posteriores es producida, en
parte, por la activación de Cbl-b que inhibe la síntesis de proteínas en el músculo
esquelético (Nakao et al., 2009).
Introducción
55
1.5.5. Inmovilización y la vía molecular IGF-1/Akt
Como hemos descrito al inicio del apartado de atrofia muscular, el músculo
esquelético mantiene su masa y la funcionalidad mediante el equilibrio de la velocidad
de síntesis y la degradación muscular, por ello, la pérdida de masa muscular en distintas
situaciones de atrofia no sólo se induce por la activación de las vías de señalización
proteolíticas, si no que las vías relacionadas en la síntesis proteica también se ven
implicadas.
Una de las vías que participa activamente en el proceso de aumento de la masa
muscular, denominada hipertrofia, es la que se inicia con la activación de IGF-1, que
resulta en la iniciación de la síntesis de proteínas (Bodine et al., 2001b, Rommel et al.,
2001). La activación de la vía se inicia con IGF-1 que activa el receptor IGFR, una
tirosina kinasa del receptor. Posteriormente, el IGFR recluta el sustrato receptor de
insulina (IRS-1), lo que activa dos vías de señalización: la vía de Ras-Raf-MEK-ERK y
de la vía PI3K-Akt (Moelling et al., 2002).
Hay estudios que confirman que la expresión de IGF-1 es suficiente para inducir
la hipertrofia en cultivos de células musculares (Vandenburgh et al., 1991). Sin embargo
otros estudios demuestran que para que hay una inducción de la hipertrofia vía IGF-1 es
necesario la actividad de fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K), una kinasa de lípidos que
mediante una serie de fosforilaciones termina activando Akt, también conocida como
proteína kinasa B (PKB), mediante la fosforilación de su serina 473, que induce la
síntesis de proteínas, la transcripción génica y la proliferación celular, a la vez que
bloquea la apoptosis (Matsui et al., 2003).
Finalmente, la activación de PI3K/Akt puede derivar en la activación de mTOR
y p70S6K, que parecen tener una importante función en distintas señales y rutas de
crecimiento y síntesis de proteínas (Hara et al., 1998).
Como hemos comentado, durante la hipertrofia del músculo esquelético se
produce la fosforilación de Akt, a la vez que aumenta la cantidad relativa de proteína en
el músculo (Bodine et al., 2001b). La importancia de la activación de esta proteína, para
la hipertrofia muscular, queda demostrada en estudios que muestran que el bloqueo de
Akt a través de un regulador negativo de la proteína inhíbe la hipertrofia mediada por
IGF-1 in vitro (Rommel et al., 2001). Otros estudios muestran como la activación de
Introducción
56
Akt es suficiente para inducir hipertrofia en las células musculares, sugiriendo que se
requiere la expresión de Akt para que la vía IGF-1/PI3K induzca la hipertrofia del
músculo (Rommel et al., 2001, Takahashi et al., 2002).
Por otro lado, se ha demostrado que la vía IGF-1/Akt no sólo aumenta la síntesis
de proteínas si no que media en la atrofia muscular previniendo la inducción de las E3
ubiquitin-ligasas, puesto que la fosforilación de la serina 473 de Akt bloquea la
translocación de la familia de factores de transcripción FoxO al núcleo impidiendo la
regulación de genes inductores de atrofia muscular como MAFbx (Sandri et al., 2004,
Stitt et al., 2004).
Durante la suspensión de miembros posteriores en roedores se ha observado una
desregularización de la vía IGF/Akt viéndose disminuida la expresión de IGF-1 desde
los primeros días, mientras que la activación de Akt se vio reducida en estados más
avanzados de la inmovilización (Nakao et al., 2009, Han et al., 2007).
Introducción
57
Figura 1.6. Vía molecular IGF-1/Akt
1.5.6. Descripción del factor de transcripción nuclear kappaB (NF- кB)
NF- кB fue descrito por primera vez en 1986 por Sen y Baltimor como un factor
que regulaba la formación de la variedad kappa de la cadena ligera de la
inmunoglobulina en células B (Sen and Baltimore, 1986). Actualmente, se sabe que NF-
кB es un factor de transcripción nuclear dimérico de expresión ubicua implicado en la
regulación de diversos procesos celulares (citado en (Karin and Lin, 2002)). NF-кB
comprende toda una familia de factores de transcripción eucarióticos que incluyen
proteínas conservadas desde la Drosophila melanogaster hasta humanos (Morisato and
Anderson, 1995). En los mamíferos la familia NF-кB/Rel consta de cinco miembros:
P65 (también denominado Rel A), Rel B, c-Rel, que contienen un dominio de
Introducción
58
transactivación C-terminal (TAD), P50 (cuyo precursor es p105) y P52 (cuyo precursor
es p100), que contienen un dominio de repetición de anquirinas en su extremo C-
terminal en lugar del dominio TAD y por lo tanto no pueden activar la expresión del
gen diana como un homodímero (Napetschnig and Wu, 2013).
Estas cinco subunidades se encuentran unidas de dos en dos formando tanto
homodímeros como heterodímeros, exceptuando a la subunidad RelB que sólo forma
heterodímeros, siendo los más frecuentes P50/P65 (citado en (Ghosh and Karin, 2002)).
Referente a su estructura todos los miembros de la familia NF-кB presentan un
dominio N-terminal común llamado RHD (Rel homology domain). Este dominio está
formado por aproximadamente 300 aminoácidos y es el responsable de la dimerización
entre los distintos miembros de la familia NF-кB (Hoffmann et al., 2006), de la
asociación con el inhibidor IкB y de la unión con los motivos кB del DNA. Además,
este dominio es donde se encuentran las secuencias de localización nuclear llamada
NLS (Nuclear Localization Sequence) (Baeuerle and Henkel, 1994).
En situación basal estas formas se mantienen en las células inactivas por una
proteína inhibidora a la que se encuentran unidas en el citoplasma, IкB, del que existen
diversas isoformas, siendo la principal IкBα. Pero dado que la composición de los
dímeros de NF-кB pueden variar dependiendo del tipo celular y que responde a una
gran cantidad de estímulos inductores de distinta índole, hacen que activen una multitud
de genes implicados en diversos procesos celulares tales como la regulación de la
respuesta inmune, la apoptosis, la inflamación, la proliferación, la diferenciación, la
migración, la adhesión celular, la angiogénesis, oncogénesis y el desarrollo, entre otros
(Lawrence and Fong, 2010, Li and Stark, 2002, Pahl, 1999). De hecho, se considera a
NF-кB como un mediador central en la respuesta inmune humana además de un
regulador de la respuesta al estrés.
1.5.6.1. Translocación de NF-кB al núcleo
Como hemos comentado NF-кB se encuentra retenido en el citoplasma por IкB.
En mamíferos se han descrito seis isoformas de esta proteína inhibidora IкB: IкBα,
IкBβ, IкBε, IкBγ, IкBδ, y Bcl-3 (B-cell lymphoma 3-encoded protein). Todas ellas
tienen una estructura tridimensional y se distinguen por el número de repeticiones de los
Introducción
59
dominios de anquirina responsables de la interacción con el dímero de NF-кB
(Baeuerle, 1998). Siendo IкBα e IкBβ las isoformas más comunes, puesto que se
encuentran prácticamente en todos los tipos celulares y que, por ello, regulan la mayor
parte de los efectos de NF-кB.
El proceso de separación de IкB requiere su fosforilación. Una vez fosforilado,
IкBα se poliubiquitiniza en los residuos de lisina 21 y 22, degradándose en el
proteosoma 26S (Chen et al., 1995, DiDonato et al., 1996, Hayden and Ghosh, 2004,
Scherer et al., 1995). Sin embargo, IкBα también puede separarse de NF-кB al ser
fosforilado en el residuo de tirosina 42 (Bui et al., 2001, Gallagher et al., 2007, Takada
et al., 2003). Esta fosforilación induce la activación de NF-кB, pero no implica una
degradación de IкBα en el proteasoma, por lo que no implica la disminución de los
niveles del inhibidor (Imbert et al., 1996).
La fosforilación de las proteínas de la familia IкB requiere la activación
catalítica de unas serina-treonina kinasas llamadas IкΒ kinasas (IKKs). El complejo
IKK está compuesto por tres subunidades, dos de ellas catalíticas, con actividad kinasa,
que son IKKα (que fosforila los residuos S32 y S36 de IкB) e IKKβ (que fosforila los
residuos S23 y S19 de IкB-β) y una reguladora, conocida como el modulador esencial
(NEMO/IKKγ) sin actividad kinasa, pero necesaria para la formación del complejo.
Estas moléculas se activan por diversos agentes, como factores de crecimiento,
citoquinas inflamatorias, como el TNF-α, EROs y productos virales, que fosforilan dos
residuos de serina que se encuentran en el loop de activación (las Ser 177 y 181 para
IKKβ, y las Ser 176 y 180 para IKKα) (Schomer-Miller et al., 2006).
Las IKKs tienen diferente distribución celular, mientras IKKβ se encuentra
solamente en el citosol, IKKα, gracias a su secuencia NLS en el dominio kinasa, puede
localizarse tanto en el citosol como en el núcleo (Yamamoto et al., 2003, Scotto
d'Abusco et al., 2010). IKKα, en el núcleo, puede unirse a un promotor asociado al sitio
кB, lo que conlleva al aumento de la transcripción de los genes dependientes de кB.
Una vez liberado NF-кB de su inhibidor, IкB, se translocan al núcleo los
dímeros y se unen a los motivos кB (GGGRNNYYCC), donde R representa bases
púricas, Y representa bases pirimidínicas, N representa cualquier base, así mismo, G y
C representan guanina y citosina) dentro de los promotores de los genes diana regulando
su transcripción mediante la unión de co-activadores o co-represores (Magnani et al.,
Introducción
60
2000).
La activación de NF-кB como ya se ha dicho anteriormente viene determinada
por muchos estímulos, pero el más conocido es la acción del TNF-α. En este caso la
activación de NF- кB, se encarga de inhibir la señal apoptótica mediada por éste. En
ausencia de NF-кB, TNF-α es capaz de activar la cascada de proteasas específicas de la
apoptosis (caspasas).
1.5.6.2. Vías de activación de NF-кB
Vía canónica o clásica de activación de NF-кB: Es la forma más común de
activación. Se inicia en respuesta a citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α, IL-1, la
deprivación de glucosa o el estrés oxidativo (citado en (Hayden and Ghosh, 2004)). Su
activación depende de la fosforilación en los residuos Ser181 y Ser180, de las kinasas
IKKα e IKKβ respectivamente. Como se ha comentado anteriormente, el complejo IKK
activo fosforila IкBα en las Ser32 y Ser36 marcándolas para su poliubiquitinación y
posterior degradación en el proteasoma 26S. Por otro lado, la activación de IKKα e
IKKβ provoca la fosforilación de p105, el cual, tras un procesamiento proteolítico da
lugar a la forma madura p50 (citado en (Perkins, 2007)). Una vez liberado de su
inhibidor, la NLS de p65 queda expuesta, se transloca al núcleo y se une al DNA,
activando la expresión de determinados genes diana como Bcl-2, Bcl-xL, Bax, IAPs,
Bim, MnSOD, IкBα. (Karin and Ben-Neriah, 2000).
Introducción
61
Figura 1.7. Vía canónica de activación de NF-кB
Vía no canónica de activación de NF-кB: Esta vía se caracteriza por ser
independiente de IкB. En este caso se produce la activación de homodímeros IKKα a
través de una kinasa llamada NIK (NF-кB-inducing kinase) (citado en (Häcker and
Karin, 2006, Scheidereit, 2006, Sun, 2011). A su vez, IKKα fosforila los residuos
específicos de serina del extremo C-terminal de las repeticiones de anquirina
(Scheidereit, 2006) de p100 que hace que sea reconocido por el proteasoma y lo degrade
parcialmente, dejando RelB intacto (Amir et al., 2004, Vallabhapurapu and Karin,
2009). Finalmente, el heterodímero p52/RelB se transloca al activando la regulación
transcripcional de diferentes genes como ciclooxigenasa-2 (Cox-2), ciclina D, MnSOD
y Bcl-xL (Holley et al., 2010, Jacque et al., 2005, Zhang et al., 2007b).
Introducción
62
Figura 1.8. Vía no canónica de activación de NF-кB
Vía atípica de activación de NF-кB: La activación de esta vía no está clara, se
sabe que es independiente de IKK y se activa por la fosforilación de IкBα en su Tyr42 y
con la posterior activación de p65/p50 (Bender et al., 1998, Kato et al., 2003). Una vez
fosforilado, IкBα se separa del heterodímero p65/p50, permitiendo que el complejo NF-
кB entre en el núcleo y active la expresión de diversos genes como Bcl-3 y Bcl-xL (Bui
et al., 2001).
Introducción
63
Figura 1.9. Vía atípica de activación de NF-кB
Tal y como hemos visto, la regulación de la NF-кB se produce a través de la
actividad de los componentes básicos de la señalización de NF-кB: la kinasa IкB (IKK),
las proteínas IкB.
No obstante, NF-кB también puede regularse mediante múltiples modificaciones
post-traduccionales directamente a través de sus subunidades. Estas modificaciones
reguladoras, que incluyen la fosforilación, ubiquitinación, acetilación, sumoilación y
nitrosilación, pueden variar dependiendo de la naturaleza del estímulo inductor de NF-
кB. Estas modificaciones pueden tener consecuencias diferentes, e incluso éstas
consecuencias pueden ser antagonistas funcionales dependiendo del contexto (Perkins,
2006).
A modo de ejemplo, podríamos resaltar que puede producirse la fosforilación de
distintas serinas de p65 por parte de la vía ERK/MAPKinasas en respuesta a varios
estímulos como, por ejemplo, TNF-α (Vermeulen et al., 2003). Así mismo, se sabe que
la MAPK p38 puede regular la actividad transcripcional de NF-кB, no sólo a través de
la fosforilación sino a través de la acetilación de p65 (Saha et al., 2007).
Introducción
64
1.5.6.3. Efecto de la inmovilización sobre NF- кB
El papel de la NF-кB en la atrofia del músculo esquelético está ganando cada
vez un mayor interés principalmente porque NF-кB se activa en respuesta a numerosas
moléculas inflamatorias que causan la pérdida de la masa muscular (deDuve and
Baudhuin, 1966, Reid and Li, 2001b). Se han descrito distintos estudios que demuestran
la importancia de la vía de NF-кB en el músculo esquelético en situaciones de desuso
muscular, inmovilización o denervación, así como en enfermedades sistémicas como el
cáncer, la insuficiencia cardíaca crónica y la lesión pulmonar aguda séptica (Jackman et
al., 2013). La atrofia muscular debido a la mayoría de estos factores desencadenantes se
asocia con la expresión de la actividad transcripcional de NF-кB.
Con el fin de determinar el rol de la vía de NF-кB en la atrofia, se han sobre
expresado o eliminado (knockout) las formas de estas proteínas y luego han evaluado el
efecto sobre la progresión de la atrofia.
Concretamente, en el modelo de atrofia de suspensión de miembros posteriores o
inmovilización la actividad de NF-кB aumenta en el sóleo entre 4 a 10 veces, pero la
supresión de IKKα, IKKβ o IкBα inhibe el aumento de dicha actividad (Van Gammeren
et al., 2009, Senf et al., 2008, Judge et al., 2007). Demostrando que cada una de estas
kinasas son suficientes para producir una atrofia significativa en las fibras musculares
de rata y ratón y que la supresión de cualquiera de las dos, IKKα o IKKβ, previene en
un 50 % la atrofia en el músculo sóleo de ratas sometidas a suspensión de miembros
posteriores (Van Gammeren et al., 2009).
En otro estudio Hunter y colaboradores proporcionaron datos que demuestran
que la suspensión de miembros posteriores en ratas desencadena atrofia muscular por la
activación de la vía no canónica de NF-кB que requiere la activación de IKKα (Hunter
et al., 2002).
Por otro lado, Bar-Shai comparó un grupo de ratas jóvenes (6 meses de edad)
con ratas viejas. En ellas comprobó que en ambos grupos se inducía el factor de
transcripción NF-кB durante la suspensión de miembros posteriores y que no había
diferencias en la cinética y el patrón de activación de NF-кB entre los dos grupos. Sin
embargo, observó que NF-кB podía inducirse por distintas vías durante la
inmovilización, siendo la vía no canónica de NF-кB la primera que se activaba.
Introducción
65
Seguidamente, la vía canónica de activación de NF-кB (complejo p65/p50 con la
degradación IкBα) era la predominante durante el periodo de inmovilización. Siendo la
activación de esta vía más prominente en los músculos de los animales viejos en
comparación con los jóvenes (Bar-Shai et al., 2008).
Hay que resaltar que, aunque se ha sugerido la activación de esta vía de
transducción de señales como posible causa de la distrofia muscular, los mecanismos
musculares que conducen a un incremento de la expresión de estas moléculas en la
distrofia muscular siguen siendo desconocidos.
Sin embargo, hay pruebas que apoyan tres mecanismos posibles:
1) La activación de NF-кB podría aumentar la actividad del ubiquitin-
proteasoma (Reid and Li, 2001b, Llovera et al., 1997).
2) Podría conducir a un aumento de la expresión de varias moléculas
inflamatorias como la IL-1β, TNF-α, moléculas de adhesión celular y la matriz
metaloproteinasa-9, que podría, directa o indirectamente, promover la pérdida de masa
muscular (Reid and Li, 2001b, Senftleben et al., 2001).
3) Se ha demostrado que interfiere en el proceso de diferenciación del músculo
esquelético necesario para la reparación de tejidos dañados (Guttridge et al., 2000,
Mares-Perlman et al., 2000).
Introducción
66
1.6. Relación entre los 4 sistemas de regulación muscular durante
la inmovilización o suspensión
1.6.1. Relación entre estrés oxidativo y la vía IGF/Akt
Como hemos comentado en el apartado 1.5.5. la vía de señalización IGF1/Akt
juega un papel importante en la regulación del crecimiento del músculo esquelético.
De manera similar a otras vías, el estrés oxidativo puede regular positiva o
negativamente la señalización de IGF-1 (Papaconstantinou, 2009). Bajos niveles de
ERO endógenas puede inducir la fosforilación en los residuos de tirosina específicos del
receptor de insulina, facilitando de este modo la señalización de IGF-1. De hecho, la
cadena de IRβ contiene múltiples sitios para la fosforilación de tirosina que son
objetivos sensibles de las ERO, tales como H2O2 (Bashan et al., 2009). En este sentido,
las ERO pueden participar en la activación de los efectos metabólicos, de forma similar
a la insulina, mediante la estimulación del transporte de glucosa en el músculo
esquelético durante el ejercicio (Coderre et al., 1995, Lund et al., 1995), ya que
estimulan la contracción del músculo esquelético y el transporte de glucosa hasta 50
veces más durante el ejercicio máximo en los seres humanos (Katz et al., 1986). Por lo
tanto, la vía propuesta en la que las ERO median la estimulación del transporte de
glucosa está relacionada con la contracción del músculo esquelético, que aumenta la
producción de aniones superóxido a través de la respiración mitocondrial. El anión
superóxido se convierte rápidamente en H2O2 por la SOD, dando lugar a la activación
directa de la MAPK transportadora de glucosa 4 (GLUT4) que se transloca a la
membrana plasmática e induce un aumento en el transporte de glucosa (Katz, 2007).
Por el contrario, altos niveles de ERO inhiben la cascada de señalización
IGF/Akt. Así mismo, esta regulación negativa de IGF-1 induce cascadas de señalización
relacionadas con la resistencia a la insulina y sus secuelas patológicas (Bashan et al.,
2009).
En el caso anterior se ha visto que bajas concentraciones de H2O2 inducen la
captación de glucosa en el músculo, por el contrario, otros estudios demostraron que en
altas concentraciones de importancia toxicológica, el H2O2 regula negativamente los
Introducción
67
niveles de mRNA de IGF-1 en la diferenciación de mioblastos C2C12 (Handayaningsih
et al., 2011, Sestili et al., 2009). Concretamente, Sestili observó que el estrés oxidativo
disminuyó significativamente los niveles de expresión de mRNA de IGF-1 (Sestili et
al., 2009) y que los antioxidantes solubles celulares, como la creatina, impiden la
inhibición de esta vía, por parte de las ERO. Además, se sabe que la creatina induce la
hipertrofia en la diferenciación de mioblastos a través de la vía de IGF-1 (Louis et al.,
2004).
Estos resultados sugieren que, aunque las ERO pueden activar la vía de
señalización de IGF-1, también hay una regulación negativa de IGF-1 cuando los
niveles de ERO adquieren unos valores tóxicos (Barbieri and Sestili, 2012). Por lo
tanto, podemos decir que las ERO regulan la acción de IGF-1 a través de una variedad
de mecanismos y que los efectos dependen, probablemente, de la concentración de las
ERO.
De este modo, las ERO juegan un papel crucial en la regulación y en la
señalización de IGF-1 y su efecto en las células musculares. Sin embargo, se necesitan
estudios adicionales para comprender mejor la importancia fisiológica de estas
interacciones.
1.6.2. Relación entre estrés oxidativo y NF-кB
A lo largo de este apartado se ha sugerido el estrés oxidativo y el aumento
anormal del nivel de moléculas pro-inflamatorias como el TNF-α y IL-1β, como los
principales mecanismos desencadenantes de las distintas vías moleculares que conducen
a una pérdida de masa muscular por inmovilización. A continuación, vamos a tratar de
explicar su relación e interacción que desencadenan la pérdida de masa muscular.
Hay estudios que demuestran que el estrés oxidativo aumenta los niveles de
TNF-α lo que implica un aumento de la pérdida del contenido de proteínas musculares
(Reid and Li, 2001b). El TNF-α activa al factor de transcripción nuclear NF-кB, que,
como ya hemos visto anteriormente, aumenta la proteólisis en el músculo esquelético
(Llovera et al., 1997).
En este sentido, Reid propone que el TNF-α puede actuar directamente sobre las
células musculares para estimular la pérdida de proteínas, acción mediada por NF-кB.
Introducción
68
Los pasos intermedios en la señalización de TNF-α/NF-кB incluyen la
estimulación del receptor tipo 1 de TNF-α (TNFR1) y un aumento de las ERO a través
de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Como ya se ha descrito, NF-кB
aumenta la actividad de las E3 ubiquitin-ligasas, que acelera la degradación regulada de
proteínas musculares y promueve la debilidad muscular (Reid and Li, 2001b).
En los últimos años, se ha avanzado mucho en la comprensión de cómo se activa
NF-кB mediante citoquinas inflamatorias, con el objetivo de explorar los posibles
mecanismos que conducen a la regulación de NF-кB mediante el estrés oxidativo.
La evidencia de que el nivel de ERO puede ser capaz de regular la vía de NF-кB
se comprobó al exponer distintos tipos de células a H2O2. En ciertos tipos de células,
como las células T, miotubos L6, MCF-7 de mama humana y células pre-B3 y 70Z, el
H2O2 ha demostrado ser un eficaz activador de la vía de NF-кB (Sen and Packer, 1996,
Schreck et al., 1991, Manna et al., 1998).
Otras vías de investigación sugieren que el estrés oxidativo es un intermediario
común y crítico de diferentes señales para activar NF-кB. Esta conclusión está basada
principalmente en la inhibición de la activación de NF-кB por una variedad de
antioxidantes y por la sobreexpresión de enzimas antioxidantes (Schreck et al., 1992).
En diversos estudios se han utilizado estas enzimas para bloquear la activación
de NF-кB, aunque en muchos casos el grado de inhibición parece variar dependiendo
del tipo de célula y del estímulo (Schreck et al., 1992, Suzuki et al., 1994). Por ejemplo,
se ha demostrado que el antioxidante pirrolidinaditiocarbamato (PDTC) tiene un efecto
inhibidor sobre TNF-α, IL-1, acetato de forbol miristato (PMA), lipopolisacarido (LPS),
análogos de aminoácidos y péptidos β-amiloide en células Jurkat T, células HeLa,
70Z/3 de las células y neuronas primarias. Sin embargo, se destaca la sensibilidad a
PDTC descrita en células endoteliales transformadas durante la activación de NF-кB
mediante TNF-α, ya que dicha sensibilidad no se percibe en células endoteliales
primarias (Bowie, 1997).
Introducción
69
En este sentido, se podría considerar la N-acetil-L-cisteína (NAC) como un
inhibidor para la activación de NF-кB inducida por TNF-α en células Jurkat y HeLa,
aunque en ningún caso inhibiría la activación provocada por el ácido ocadaico en las
células Jurkat (Suzuki et al., 1994).
Otro posible mecanismo inhibidor de la activación de NF-кB por TNF-α, LPS,
PMA, y H2O2 es la sobreexpresión de MnSOD o GPx. Este mismo mecanismo ha
demostrado inhibir la actividad de la AP-1, la activación de JNK y la apoptosis inducida
por TNF-α. Por último, la participación del estrés oxidativo como mecanismo de
inhibición se deriva de evidentes niveles elevados de ERO en la señalización de NF-кB
en respuesta al TNF-α, IL-1, PMA, LPS, luz ultravioleta y radiaciones ionizantes
(Schreck et al., 1992).
1.6.3. Interacción entre las vías y su relación con el sistema-ubiquitin-
proteasoma durante la inmovilización o suspensión. Resumen
En los apartados anteriores hemos observado que durante la inactividad
muscular se ven implicadas distintas fuentes de radicales libres que producen un
aumento de las ERO en el músculo esquelético, así como una disminución de las
enzimas antioxidantes, lo que produce el aumento del estrés oxidativo en el músculo
esquelético, que induce atrofia de la masa muscular (ver apartado 1.5.3.1).
El estrés oxidativo está relacionado con la regulación de las vías de IGF-1/Akt y
NF-кB, que a su vez regulan tanto la síntesis como la degradación de proteínas en el
músculo esquelético a través de diferentes vías que describiremos a continuación (ver
figura 1.10).
Durante la suspensión de miembros posteriores, la activación de Akt se
encuentra disminuida (Nakao et al., 2009), pudiendo ser, en parte, por los elevados
niveles de estrés oxidativo o por la actividad de la E3 ubiquitin-ligasa Cbl-b, ya que
Cbl-b regula negativamente la vía de señalización de IGF-1/Akt en el músculo
esquelético en condiciones de suspensión de miembros posteriores en roedores. Nakao y
sus colaboradores observaron que la expresión de Cbl-b produce una degradación del
receptor de insulina IRS-1, que deriva en la pérdida de masa muscular; por el contrario
Introducción
70
el restablecimiento de la vía de IGF-1, por la supresión de Cbl-b, mantenía la masa
muscular (Nakao et al., 2009) (Ver Figura 1.10).
En el músculo esquelético Akt induce la síntesis de proteínas, la transcripción
génica y la proliferación celular, vía mTOR y p70S6K (Apartado 1.5.5.) y, además,
bloquea la apoptosis (Matsui et al., 2003).
Por otro lado, Akt inhibe la degradación de proteínas por impedir la activación
de los factores de transcripción de la familia FoxO (Manning and Cantley, 2007). El
bloqueo de FoxO, mediante la activación de Akt, inhibe la sobreexpresión de las E3
ubiquitin-ligasas MAFbx y MuRF-1 (Lee et al., 2004, Sandri et al., 2004, Stitt et al.,
2004) (Ver Figura 1.10).
La familia FoxO en el músculo esquelético se compone de tres isoformas:
FoxO1, FoxO3 y FoxO4. Akt fosforila proteínas FoxO promoviendo su exportación
desde el núcleo al citoplasma. En distintos modelos de atrofia muscular, la reducción de
la actividad de Akt disminuyó los niveles de FoxO fosforilado en el citoplasma y
provocó un significativo aumento de FoxO en el núcleo (citado en (Calnan and Brunet,
2008)).
Se sabe que la translocación y la actividad de los miembros de FoxO regulan la
sobreexpresión de MAFbx y MuRF-1. Además, FoxO3 es suficiente para promover la
expresión de MAFbx y la atrofia muscular en los músculos esqueléticos in vivo (Sandri
et al., 2004). Así mismo, se ha observado en ratones transgénicos que sobreexpresan
FoxO1 que la masa muscular estaba notablemente reducida, lo que produjo una atrofia
de las fibras musculares (Kamei et al., 2004, Southgate et al., 2007). Por el contrario, la
reducción de la expresión de RNA de FoxO inhibe la expresión de MAFbx durante la
atrofia y la pérdida de masa muscular (Liu et al., 2007, Sandri, 2004).
Por otro lado, se ha demostrado que la ubiquitin-ligasa MuRF-1 puede activarse
por la sobreexpresión del factor de transcripción NF-кB, que se activa por ciertas
citoquinas circulantes con carácter caquéctico, como el TNF-α (Cai et al., 2004, Dogra
et al., 2007, Ladner et al., 2003) (Ver Figura 1.10).
Cai y colaboradores demostraron que la activación de MuRF-1 requiere la
implicación de la vía IKKβ/NF-кB y que es suficiente para inducir la atrofia muscular,
ya que la sobreexpresión de NF-кB en ratones transgénicos, que sobreexpresaban IKKβ,
Introducción
71
provocó un aumento significativo en la expresión de MuRF-1 (Cai et al., 2004). Estos
resultados fueron confirmados por Mourkioti y colaboradores que mediante la supresión
de IKKβ, en ratones knockout, impedían específicamente el aumento de la expresión
muscular de MuRF-1 durante la inducción de atrofia por denervación (Mourkioti et al.,
2006). Estos dos estudios sugieren que la activación de NF-кB está implicada en la
atrofia muscular, induciendo el aumento de la expresión de la ubiquitin-ligasa MuRF-1
en el tejido muscular (Cai et al., 2004, (Mourkioti et al., 2006).
Así mismo, se sabe que la vía de señalización de Akt-FoxO interactúa con el
sistema de IKK-NF-кB durante el desarrollo de la atrofia muscular (Reed et al., 2011).
Ya que IKK puede bloquear la activación de AKT, inhibiendo la síntesis de proteínas e
impidiendo que inhiba la activación de FoxO, que, como hemos visto anteriormente,
activa las E3 ubiquitin-ligasas MAFbx y MuRF-1 (Ver Figura 1.10). Esto fue
comprobado por Mourkioti en sus ratones knockout de IKKβ, en los que además de
observar la prevención de la atrofia muscular descubrió una hiperfosforilación de Akt
(Mourkioti et al., 2006). Otro estudio realizado en dos modelos transgénicos de ratones
knockout de IKKα e IKKβ, observaron que cuando se inhibe cualquiera de las dos
subunidades se altera la fosforilación de Akt (Reed et al., 2011).
Estos resultados ponen de manifiesto la relevancia de la diafonía entre las dos
vías, y que se necesitan más estudios para dilucidar las contribuciones respectivas de las
vías IKK/NF-кB y Akt/FoxO en la atrofia muscular.
Por otra parte, la activación de la ubiquitin-ligasa MAFbx se induce de manera
independiente de la vía de NF-кB (Cai et al., 2004). Sin embargo, MAFbx sí parece
estar regulada por la MAPK p38. Como hemos comentado en el apartado 1.5.5.3,
MAPK p38 es una potente kinasa reguladora del catabalismo muscular durante la
inmovilización muscular. Se ha demostrado que la inducción de la fosforilación de p38,
mediada por estrés oxidativo, aumenta la expresión de MAFbx (Li et al., 2005) (Ver
Figura 1.10). Sin embargo los mecanismos por los cuales se regulan no parecen ser
claros, postulando Li y sus colaboradores que podría ser a través de FoxO. En este
mismo estudio se demuestra que la inhibición de p38 inactiva la expresión de MAFbx,
dejando en manifiesto la relación p38/MAFbx (Li et al., 2005).
Introducción
72
Así mismo, de forma indirecta p38 puede regular la activación de MuRF-1 ya
que puede activar directamente la activación transcripcional de NF-кB forforilando
directamente p65, con su consecuente translocación al núcleo (Ver Figura 1.10).
La activación de NF-кB es dependiente de la actividad de la MAPK p38 durante
la diferenciación miogénica de mioblastos en el músculo esquelético sin la implicación
de IкB (Baeza-Raja and Muñoz-Cánoves, 2004, Ji et al., 2010). Además, se ha
postulado que esta activación de debe a la fosforilación en la Ser 276 de NF-кB por
parte de p38 (Ji et al., 2010).
Figura 1.10. Vías moleculares que modulan la hipertrofia y la atrofia muscular.
Introducción
73
1.7. Atrofia muscular durante la diabetes
La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica crónica, caracterizada por
una deficiencia en la secreción o acción de la insulina, una de las hormonas
responsables de regular la concentración de glucosa en sangre. Por ello, uno de los
síntomas que determina la diabetes es la elevación de la concentración de glucosa
circulante, es decir, la hiperglucemia, lo que origina una intolerancia a la glucosa.
Desde el punto de vista diagnóstico, se considera que un paciente presenta
diabetes si el valor de la glucosa plasmática en ayuno nocturno es mayor de 7.0 mmol/L
(126 mg/dl) y/o cuando presenta concentraciones de glucosa plasmática por encima de
11.0 mmol/L (200 mg/dL) 2 horas después de ingerir 75 g de glucosa en 375 mL de
agua (Diagnosis and Mellitus, 2003, Genuth et al., 2003).
Otros síntomas que presenta la diabetes incluyen polidipsia, polifagia, poliuria,
visión borrosa y caquexia (Citado en (Giovanni Mantovani, 2007)). El retardo de
crecimiento y mayor susceptibilidad a ciertas infecciones puede también acompañar a la
hiperglucemia crónica. Las consecuencias agudas con riesgo vital de una diabetes no
controlada, son hiperglucemia con cetoacidosis o un síndrome hiperosmolar no
cetósico.
La diabetes es la enfermedad endocrina más frecuente y con un alto índice de
prevalencia, siendo una de las primeras causas de morbilidad y mortalidad a nivel
mundial. Esto hace que la diabetes mellitus sea una enfermedad con un gran interés
socioeconómico.
1.7.1. Tipos de diabetes mellitus
Hemos comentado que la diabetes se desarrolla cuando el páncreas presenta una
insuficiencia en la producción de insulina o cuando el organismo es incapaz de
utilizarla. Teniendo en cuenta estas dos posibles causas, podemos distinguir tres tipos
distintos de diabetes: la diabetes tipo 1, la tipo 2 y la diabetes gestacional. La gran
mayoría de las personas con diabetes corresponden a dos categorías etiopatogénicas,
Introducción
74
diabetes tipo 1 o tipo 2; siendo la de tipo 2 la categoría de mayor prevalencia, cuya
causa es la combinación de la resistencia a la acción de la insulina y una respuesta
secretoria compensatoria de insulina inadecuada. En la diabetes tipo 1, en cambio, la
causa es una deficiencia absoluta de secreción de insulina. Finalmente, la diabetes
gestacional comienza o se detecta durante el embarazo y puede derivar en diabetes tipo
2.
1.7.1.1. Diabetes tipo 1:
La diabetes tipo 1 resulta de la destrucción autoinmune del 90% de las células β,
productoras de insulina, de los islotes de Langerhans en el páncreas (Alberti and
Zimmet, 1998). Por lo que estas células no producen insulina o lo hacen en cantidad
insuficiente, provocando una insuficiencia absoluta de insulina. Una vez iniciado el
proceso de destrucción no puede detenerse, además, las personas que no tienen diabetes
poseen un mecanismo de anti-apoptosis y regeneración de células β que en las personas
diabéticas está inactivo.
La insulina es una hormona anabólica y anticatabólica, por lo que su deficiencia
induce un menor consumo periférico de glucosa, un estado de excesiva gluconeogénesis
renal y hepática, un incremento de la proteólisis en el músculo y de la lipolisis. Para las
personas con diabetes tipo 1 la insulina es vital para evitar la cetoacidosis, derivada del
aumento de la lipólisis a partir de ácidos grasos libres, el coma o la muerte, debiendo
administrarse insulina diariamente, con el fin de controlar los niveles de glucosa en
sangre.
La enfermedad puede desencadenarse a cualquier edad, siendo más incidente en
niños o adolescentes (Fajans and Bell, 2011, Onkamo et al., 1999, Patterson et al.,
2009), cuya prevalencia va en aumento, mientras que en edades adultas aumenta más
lentamente, se mantiene o disminuye según los estudios analizados (Feltbower et al.,
2003, Harjutsalo et al., 2008). Entre las causas que pueden desencadenar la diabetes tipo
1 encontramos la predisposición genética, que suele ser la base sobre la que actúan otros
factores como los ambientales (Ma and Chan, 2009) (anticuerpos virales, hábitos
alimentarios, como la deficiencia de la vitamina D (Grant, 2008), la obesidad infantil
(Fourlanos et al., 2008), la exposición temprana a proteínas de la leche de vaca (Cavallo
et al., 1996), el estrés, crecimiento acelerado en la pubertad, exposición limitada a
Introducción
75
microorganismos en la infancia (Wills-Karp et al., 2001) y la contaminación)
desencadenando, finalmente, una respuesta inmunitaria en las células β.
1.7.1.2. Diabetes tipo 2
La diabetes tipo 2 se caracteriza por resistencia a la acción de la insulina y una
deficiencia relativa de la insulina, pudiendo ser cualquiera de las dos la característica
predominante (Alberti and Zimmet, 1998)
La resistencia a la insulina significa que para mantener los valores normales de
glucemia es necesaria una secreción incrementada de insulina para intentar
compensarla, ya que puede ser debida a una disfunción de los receptores de la insulina.
A pesar de que, últimamente, se diagnostica más frecuentemente en edades
tempranas (niños y adolescentes), la diabetes mellitus tipo 2 se desarrolla más
lentamente y, principalmente, en adultos y ancianos, pudiendo ser tratada inicialmente
con dieta y antidiabéticos orales (Fajans and Bell, 2011).
El factor exógeno más importante en la diabetes tipo 2 es, a menudo, el resultado
del exceso de peso corporal y la inactividad física en personas genéticamente
predispuestas (Poulsen et al., 1999). Los individuos con este tipo de diabetes no
necesitan insulina exógena, ya que el tratamiento de los pacientes va dirigido a la
reducción de peso mediante dieta, seguido de tratamiento con antidiabéticos, sólo en
caso de no conseguir controlar la hiperglucemia sería necesaria el uso de insulina.
1.7.1.3. Diabetes gestacional
La diabetes mellitus gestacional es una intolerancia a la glucosa que comienza o
se detecta durante el embarazo y puede persistir tras el mismo. Se produce por el efecto
contrainsular del lactógeno placentario, hormona que incrementa la resistencia a la
insulina. Suele producirse en mujeres susceptibles por factores genéticos latentes o
exógenos (antecedentes de diabetes mellitus 2 en la familia, obesidad abdominal,
síndrome de ovario poliquístico o mayor edad gestacional).
Introducción
76
1.7.2. Modelo experimental en la diabetes: inducción química por
estreptozotocina
Existen distintos modelos experimentales que permiten investigar los
mecanismos moleculares implicados en las complicaciones diabéticas. Entre ellos
encontramos el uso de animales que padecen diabetes de forma espontánea,
modificaciones genéticas, la cirugía, ya en 1889, Von Mering y Minkowski indujeron
diabetes experimental en perros mediante la extirpación quirúrgica del páncreas (Von
Mering JV, 1889), el uso de virus o productos químicos.
El uso de agentes químicos para producir diabetes, permite realizar estudios
detallados de los eventos bioquímicos y morfológicos que ocurren durante y después de
la inducción de un estado diabético. Existen varias clases de agentes químicos. Un
primer grupo son sustancias con citotoxicidad específica que destruyen a las células β
del páncreas y causan un estado de deficiencia primaria de insulina. Seguidamente,
tenemos los agentes que actúan sobre las células β pero no las destruyen y un tercer
grupo que incrementa los requerimientos endógenos de insulina, debilitan al páncreas y
como consecuencia se produce la diabetes. Los agentes más utilizados son la aloxano y
la estreptozotocina. Estos compuestos en dosis diabetogénicas actúan específicamente
sobre las células β (Kadota, 1950).
La estreptozotocina (STZ) (2-deoxy-2-[3-(methyl1-3-nitrosoureido)-D-
glucopiranosa] es una sustancia relativamente selectiva para las células β que, en ciertas
especies, causa diabetes permanentemente. La fijación a la membrana, a semejanza con
la aloxano, es el primer evento en el proceso patológico. Algunas evidencias indican
que la toxicidad de la estreptozotocina esta medida por el reconocimiento específico de
algunos receptores sobre la célula β (Rakieten et al., 1963). Se cree que provoca un
descenso en los niveles del dinucleótido de nicotinamida y NAD, ya que puede
disminuir tanto su síntesis como incrementar su hidrólisis y su función es proteger a los
animales contra la citotoxicidad provocada, en este caso, por la STZ.
La STZ (se sintetiza por el Streptomycetes achromogenes), y se utiliza para
inducir la diabetes mellitus tipo 1 (insulino-dependiente-IDDM) como la tipo 2 (no
insulinodependiente, NIDDM), según el momento de la inyección, la dosis empleada o
su frecuencia de inyección. Una dosis intravenosa de STZ (de 49 a 60 mg/kg) en ratas
Introducción
77
adultas puede inducir diabetes tipo 1 (Ganda et al., 1976), pero es posible utilizar dosis
mayores. La STZ también puede administrarse por vía intraperitoneal en una dosis
similar o mayor cuando se inyectan 50 mg/kg de STZ por vía intravenosa en ratas, 2
semanas después, la glucosa sanguínea alcanza valores de 15 mmol/L, pudiendo
considerar entonces, que la rata presenta diabetes. La STZ altera primero la oxidación
de la glucosa para ser captada por las células, para después disminuir la biosíntesis y
secreción de insulina. Las células β del páncreas captan la STZ a través del
transportador de glucosa GLUT2, por lo que, cuando se reduce la expresión de este
transportador, se previene la acción diabetogénica de la STZ. Este fármaco ocasiona
cambios intracelulares en las células beta, fragmentación y alcalinización del DNA e
incluso puede producir la muerte (Elsner et al., 2000).
A pesar de que la administración de estreptozotocina causa en el animal de
experimentación un estado similar al visto en pacientes con diabetes tipo 1
(hiperglucemia, polidipsia, polifagia, poliuria, así como la mayoría de las
complicaciones asociadas a la diabetes como son las cardiomiopatías, neuropatías,
disfunciones coronarias, alteraciones hepáticas, traqueales, del tejido conectivo, etc.), al
igual que otros modelos, los efectos nunca serán exactamente al iguales a los de la
enfermedad humana. Además, en algunos animales la hiperglucemia puede revertir
espontáneamente al cabo de unas semanas.
1.7.3. Estrés oxidativo y su papel en las complicaciones asociadas a la
diabetes
Con el tiempo, la diabetes puede aumentar el riesgo de problemas relacionados
con la salud como retinopatía, fallo renal, neuropatía, amputación de miembros
inferiores, neuropatía diabética que causa síntomas gastrointestinales, genitourinarios y
cardiovasculares (DeCoster, 2001). Aunque la diabetes no se puede curar, la
enfermedad puede ser controlada por las estrategias no farmacológicas y
farmacológicas, donde las mejoras en el control glucémico son factores importantes en
el retraso de la aparición y progresión de las complicaciones relacionadas con la
diabetes (DCCT-Research-Group, 1993, UKPDS-Group., 1998). Además, la
hipertensión y las alteraciones en el metabolismo lipoproteico son hallazgos frecuentes
en las personas con diabetes.
Introducción
78
El estrés oxidativo contribuye al desarrollo y progresión de la diabetes y sus
complicaciones (Ceriello, 2000, Baynes, 1991). Ya que la diabetes suele ir acompañada
de un deterioro en las defensas antioxidantes (Halliwell and Gutteridge, 1990a,
McLennan et al., 1991) y una mayor producción de radicales libres (Baynes and Thorpe,
1999, Young et al., 1995). Estos niveles excesivamente altos de radicales libres son los
que producen daño a las proteínas celulares, lípidos de membrana y ácidos nucleicos, y,
finalmente, la muerte celular.
Se han estudiado distintos mecanismos para explicar la formación de estas ERO.
Estos mecanismos incluyen la oxidación de la glucosa, la glicación no enzimática de
proteínas y la degradación oxidativa posterior de las proteínas glicosiladas, alteraciones
de la vía del sorbitol, alteraciones de los sistemas antioxidantes, daño tisular producido
por procesos de isquemia reperfusión, procesos inflamatorios y alteraciones del
metabolismo. Baynes y colaboradores en 1991 postularon que el estrés oxidativo es el
nexo de unión de todas las vías propuestas en la patogénesis de las complicaciones de la
diabetes (Baynes, 1991).
Sin embargo, existen algunos autores que implican a los radicales libres no tan
sólo en las complicaciones del diabético, sino también en la misma etiología de la
diabetes (Wolff, 1993). Esto se extrae a partir del estudio de varios fármacos inductores
de diabetes en animales de experimentación, como la estreptozotocina y el aloxano, que
destruyen selectivamente los islotes de Langerhans pancreáticos por un mecanismo
oxidante, y su acción puede ser inhibida por la administración de antioxidantes (ver
apartado 1.8.2) (Wolff, 1993, Oberley, 1988).
1.7.4. Complicaciones músculoesqueléticas en la Diabetes Mellitus
La insulina una de las principales hormonas anabólicas y anticatabólicas en el
ser humano. Los principales efectos metabólicos de la insulina afectan al músculo, al
tejido adiposo y al hígado (Zierath et al., 2000)
En el músculo esquelético, la insulina estimula la captación de glucosa, que se
dirige hacia la síntesis de glucógeno. La insulina también facilita la captación
transcelular de ácidos grasos no esterificados en el músculo esquelético, en el hígado y
en el tejido adiposo, estimulando la síntesis de triglicéridos en estos tejidos. Además, la
insulina estimula la captación y el transporte de aminoácidos en el músculo y su
Introducción
79
incorporación a proteínas (síntesis proteica). Por lo que, al existir en la diabetes una
falta de esta hormona en pacientes con diabetes mellitus, disminuye la síntesis de
proteínas y la protección frente al catabolismo de las mismas.
Como comentamos en el apartado de atrofia muscular (ver punto 1.4), la
diabetes mellitus es una de las diversas patologías en las que se produce pérdida de
masa muscular. Estas complicaciones músculoesqueléticas suelen ser más frecuentes en
pacientes con diabetes tipo 1, pero también se observan en pacientes con diabetes tipo 2.
Al igual que en el modelo de inmovilización, la atrofia muscular en la diabetes
se caracteriza por un aumento en la degradación de proteínas musculares y una
disminución en la producción de las mismas (Smith et al., 1989).
Esto ha sido confirmado en estudios en los que la inducción de diabetes,
mediante la administración de estreptozotocina a animales de experimentación, produce
una disminución en el tamaño de los músculos en comparación con los de las ratas del
grupo control, a las que se les inyectaba una sustancia vehículo (Price et al., 1996).
Posteriormente, se confirmó que los músculos gastrocnemios de las ratas
insulinodependientes mostraron una pérdida, significativa, del 20% de su peso,
producida por una mayor tasa global en la degradación de proteínas (+40%) comparado
con los animales del grupo control, sin que hubiesen diferencias en la ingesta
alimentaria (Lecker et al., 2004).
Además, se sabe que esta pérdida de masa muscular no es específica para ningún
tipo de fibra, debido a que tanto el músculo extensor largo de los dedos (EDL) y el
sóleo (músculos de fibras de tipo I), como el gastrocnemio (compuesto
mayoritariamente de fibras tipo II) disminuyen en tamaño en ratas diabéticas. Sin
embargo, sí se observó un menor contenido de proteínas musculares (normalizado con
el contenido de DNA) en los EDL y el sóleo de las ratas diabéticas en comparación con
los valores del grupo control (Price et al., 1996).
En un estudio clínico realizado con 2675 pacientes entre 70 y 79 años, se
comparó la pérdida de masa grasa y muscular entre aquellos pacientes que presentaban
una diabetes tipo 2 respecto a los no diabéticos. Para ello se midió el CSA del muslo
mediante tomografía computarizada al inicio del estudio y a los 6 años. Los resultados
Introducción
80
mostraron que la pérdida de masa muscular era dos veces mayor en las mujeres mayores
con diabetes frente a las no diabéticas. Estos resultados siguieron siendo significativos
después de realizar los pertinentes ajustes según la edad, sexo, raza, el índice de masa
corporal basal, el cambio de peso intencionado y el cambio de peso con el tiempo. Por
otro lado, se observó que la masa grasa aumento en ambos grupos (Park et al., 2009).
Otro estudio calculó la pérdida de masa muscular en referencia al índice de
músculo esquelético (relación de la masa muscular esquelética estimada al peso
corporal total expresada como un porcentaje) y el índice de masa muscular (la relación
de la masa del músculo esquelético al cuadrado de la altura del cuerpo en kilogramos
por metro cuadrado). Este estudio, realizado en pacientes diabéticos tipo 1 y tipo 2,
indistintamente, demostró que ambos índices disminuían considerablemente con el
desarrollo de la diabetes, además, se evidenció que la pérdida de masa muscular estaba
directamente asociada con el desarrollo de resistencia a la insulina y que la protección
frente al desarrollo de la resistencia a la insulina aumentaba la masa muscular, incluso
por encima de los niveles medios (Srikanthan and Karlamangla, 2011).
Otros estudios han ido más allá y han demostrado que en varones jóvenes
diagnosticados con diabetes tipo 1 existe una reducción de tamaño de la fibra muscular,
antes de recibir tratamiento con insulina (Jakobsen and Reske-Nielsen, 1986). Además,
otro grupo de pacientes, diagnosticados en una fase temprana de la diabetes, hallaron
una atrofia en las fibras musculares, producida por la interrupción de las líneas Z, así
como, otras anormalidades morfológicas en la mitocondria (Reske-Nielsen et al., 1977).
Tal y como vimos en la atrofia muscular por inmovilización, la pérdida de masa
muscular en la diabetes, también, va acompañada con una pérdida en la capacidad de
generación de fuerza muscular. Park midió en personas mayores, entre 70 y 79 años,
con o sin diabetes tipo 2 o sin patología, la fuerza de presión o agarre del tren superior
mediante un dinamómetro isométrico y la fuerza de los músculos extensores de la
rodilla con un dinamómetro isocinético. Sus resultados muestran que los hombres con
diabetes tipo 2 diagnosticada tenían menor fuerza muscular en comparación con los no
diabéticos (Park et al., 2006, Park et al., 2007).
Introducción
81
Estos estudios coinciden con otros realizados en pacientes con diabetes tipo 1, en
los que se observaron que tenían una disminución del 21 % en la fuerza de los músculos
dorsales y flexores plantares del tobillo, así mismo, encontraron una disminución del
16% en los extensores de la rodilla y un 17% en los extensores de la misma. En cuanto a
la fuerza en la musculatura flexo-extensora de la muñeca no encontraron diferencias
(Andersen et al., 1997, Andersen et al., 1996).
1.7.5. Mecanismos moleculares implicados en la atrofia muscular en la
diabetes mellitus
Los efectos de la diabetes tipo 1 en el metabolismo de proteínas parecen estar
claros, en donde la privación de la insulina provoca un profundo incremento en el
catabolismo, especialmente en el músculo esquelético (Karakelides et al., 2007),
producido por la falta de la hormona que impide la captación y el transporte de
aminoácidos en el músculo y su incorporación a proteínas (síntesis proteica) (Charlton
and Nair, 1998). Sin embargo los mecanismos en la diabetes tipo 2 no parecen estar tan
claros (Denne et al., 1995, Pereira et al., 2008).
Ya hemos descrito anteriormente (ver apartado 1.5.4) que el sistema ubiquitin-
proteasoma es uno de los mecanismos más importantes en la regulación de la
degradación de proteínas. Así mismo, se ha demostrado que la insulina e IGF-1 son
claves para las vías de síntesis de proteínas, por la activación de la cascada IGF/Akt., así
como, por reducir la actividad del proteasoma, por inhibición de la expresión de las
ubiquitin-ligasas (Tisdale, 2005). Ya que, como veremos a continuación la degradación
de proteínas musculares en la diabetes es debida, en parte, por el aumento de la
actividad del proteasoma (Merforth et al., 1999). Así mismo, se ha observado que IGF-1
inhibe la activación de NF-кB inducida por TNF-α, mecanismo por el cual podría
atenuar la activación de la vía ubiquitin-proteasoma (Vallée et al., 2003).
Por otro lado, la hiperglucemia está asociada con niveles elevados de factores
proinflamatorios, citoquinas, el aumento de la producción de radicales libres, y por lo
general un estado inflamatorio crónico en pacientes diabéticos (citado en (Engström et
al., 2003), por lo que la degradación de proteínas musculares en la diabetes podría estar
regulada por estas distintas vías moleculares.
Introducción
82
Como hemos visto, se ha sugerido al estrés oxidativo como un regulador clave
de la señalización celular que conduce a un aumento de la proteolisis y la atrofia
muscular. Aunque se sabe que el estrés oxidativo juega un papel importante en la
patología y complicaciones de la diabetes (Atalay M., 2002, Kennedy and Lyons, 1997)
y que, además, está implicado en pérdida de masa muscular en distintas situaciones de
atrofia (ver apartado 1.5.3), los conocimientos actuales sobre el papel del estrés
oxidativo a perder el músculo esquelético en la diabetes es muy limitado.
La hiperglucemia provoca un desequilibrio prooxidante / antioxidante, ya que
induce un descenso de los niveles de antioxidantes frente a un aumento de los radicales
libres. En lo que se refiere al metabolismo del músculo esquelético, se ha demostrado
que el estrés oxidativo afecta a la expresión de los genes implicados en la síntesis de
proteínas (Li et al., 1998) y que los radicales libres, como H2O2, in vitro inhiben la
expresión de proteínas musculares en la miogénesis (Zhou et al., 2001). Por otra parte,
se ha observado que la administración de antioxidantes evitan la pérdida de miosina en
el músculo esquelético (Zhou et al., 2001).
En ratas con diabetes tipo 1 inducida por STZ observaron en el músculo
gastrocnemio un aumento de los compuestos prooxidantes, como el GSSG, frente a una
reducción de los antioxidantes como el GSH y la superóxido dismutasa (Brocca et al.,
2008). Además, se ha demostrado que los radicales libres, como el H2O2, afectan a la
expresión de genes sensibles a procesos redox implicados en la diferenciación
miogénica (Guttridge et al., 1999) en cultivo celular en ratas diabéticas (Aragno et al.,
2004) producido por una concomitante disminución en los genes asociados con el
crecimiento muscular (Jund, MyoD, miogenina, MCK, MhcIIB, MLC1-3) (Aragno et
al., 2004).
Russell demostró, en otro estudio, que la hiperglucemia puede causar la
degradación de proteínas y suprimir la síntesis de proteínas en miotubos in vitro por la
activación de las caspasas -3/-8 y la fosforilación de p38. (Russell et al., 2009). La
relación entre la diabetes, el aumento de la fosforilación de p38 y la degradación de
proteínas en el músculo esquelético se observó posteriormente en pacientes diabéticos
tipo 2 (Koistinen et al., 2003).
Introducción
83
Por otro lado, se sabe que la activación de la vía MAPK p38, inducida por la
resistencia a la insulina, está asociada con la inflamación y el aumento de los niveles de
citoquinas inflamatorias tales como el TNF-α (de Alvaro, 2004, Lim et al., 2006).
En concreto, la inflamación inducida por la hiperglucemia parece requerir la
activación NF-кB (Frost and Lang, 2008, Hunter RB, 2002), cuya vía canónica de
activación implica TNF-α (ver apartado 1.6.1), por lo que se ha postulado que la
producción de ERO es el mecanismo mediante el cual TNF-α podría dañar los músculos
esqueléticos y regular la expresión génica a través de la activación de factores de
transcripción redox-sensibles como el NF-кB (Reid and Li, 2001a).
Se ha observado el aumento de la activación de NF-кB en la patología de la
diabetes en diversos tejidos tales como el endotelial, el endotelio de la retina y las
células β pancreáticas cuando se exponen a condiciones hiperglucémicas (Melloul,
2008, Ortis et al., 2008, Yerneni et al., 1999). El primer estudio que caracterizó la
activación de NF-кB inducido por la diabetes y la composición de las proteínas
musculares se realizó en ratas (Frier et al., 2008). Frier asoció la atrofia del músculo
esquelético en la diabetes inducida por STZ con atrofia del músculo esquelético, ya que
las ratas tratadas con STZ mostraron mayor contenido de NF-кBp65 en el músculo
esquelético y una en concomitante reducción de la masa muscular (Frier et al., 2008).
Recientemente, Kelleher y colaboradores observaron que la STZ incrementó el
contenido de p65 de una manera específica de músculo, pero que este aumento no está
asociado con la fosforilación de IKK ni la degradación IкB, demostrando que NF-кB
p65 podía ser activado por otra vía no clásica en la diabetes mellitus (Kelleher et al.,
2010).
Así mismo, el sistema ubiquitin-proteasoma parece estar notablemente
influenciado por el estrés oxidativo (Fernandes et al., 2008, Zhang et al., 2008), ya que,
tanto el estrés oxidativo como NF-кB, contribuyen a la miopatía diabética por la
regulación positiva de las ubiquitin-ligasas MAFbx y MuRF-1, en ratas diabéticas por
STZ (Marfella et al., 2006).
Introducción
84
Finalmente, visto que la pérdida de la masa muscular en la diabetes implicada, el
estrés oxidativo y la activación de las vías de IGF/Akt, TNF-α/NF-кB y p38. No es de
extrañar, por su relación ya descrita (ver figura 1.10, apartado 1.6.3), que el sistema
ubiquitin proteasoma tenga un rol importante en la atrofia muscular en la patología de la
diabetes, lo cual fue demostrado por Marfella y sus colaboradores al observar que en la
diabetes tanto el estrés oxidativo como NF-кB regulan por medio de las E3 ubiquitin-
ligasas la hipertrofia y la atrofia muscular, modulando su masa (Marfella et al., 2006).
OBJETIVOS/AIMS
Objetivos
87
El OBJETIVO GENERAL de esta tesis doctoral es estudiar los mecanismos
moleculares implicados en la pérdida de masa muscular tras un modelo de suspensión
de miembros posteriores en roedores, y su posible prevención con tratamientos
farmacológicos tales como la indometacina y el alopurinol.
Los OBJETIVOS CONCRETOS son:
1. Estudiar el papel de los radicales libres derivados de la XO, así como de la
inflamación, en la pérdida de masa muscular tras un protocolo de suspensión
de miembros posteriores. Para ello trataremos con alopurinol, indometacina o
alopurinol junto con indometacina a roedores sometidos a un protocolo de
suspensión.
2. Estudiar el efecto de la suspensión de miembros posteriores y de los distintos
tratamientos propuestos sobre la masa muscular, el área de sección transversal
y los cambios histológicos y morfológicos en las fibras musculares.
3. Estudiar la implicación de la vía de señalización sensible a estrés oxidativo
(p38 MAPKinasa-MAFbx) e inflamatoria (NF-кB-MuRF1-MHCI) en la
pérdida de masa muscular inducida por suspensión de miembros posteriores,
así como el efecto de los distintos tipos de tratamientos propuestos.
4. Estudiar la implicación de Akt y Cbl-b en la pérdida de masa muscular
inducida por suspensión de miembros posteriores así como el efecto de los
distintos tipos de tratamientos propuestos.
5. Estudiar el efecto de la deleción específica de IKKα, en músculo esquelético,
en la pérdida de masa muscular inducida por suspensión de miembros
posteriores en ratones.
Objetivos
88
Respecto a los experimentos realizados durante mi estancia predoctoral, el
OBJETIVO GENERAL de dicho estudio fue determinar los mecanismos moleculares
implicados en la pérdida de masa muscular en la diabetes experimental inducida con
estreptozotocina y su posible prevención con la administración de α-galacto-
oligosacaridos.
Los OBJETIVOS CONCRETOS fueron:
6. Estudiar el papel del estrés oxidativo asociado a la diabetes experimental
inducida con estreptozotocina sobre la masa músculo-esquelética en ratas.
7. Estudiar el papel de p38 y de NF-кB en la pérdida de masa muscular en un
modelo de diabetes experimental.
8. Estudiar el efecto de la administración de α-galacto-oligosacáridos en la
prevención de la atrofia muscular en dicho modelo.
Aims
89
The OVERALL AIM of this doctoral thesis is to study the molecular
mechanisms involved in the loss of muscle mass induced by hindlimb unloading and its
possible prevention with drug treatments.
The SPECIFIC AIMS are:
1. To study the role of free radicals derived from XO, as well as the
inflammation in the loss of muscle mass after a hindlimb unloading protocol.
In order to do this we will administrer allopurinol, indomethacin or
allopurinol plus indomethacin to rodents subjected to a hindlimb unloading
protocol.
2. To study the effect of hindlimb unloading and the proposed treatments on
muscle mass, cross-sectional area, and the histological and morphological
changes in muscle fibers.
3. To study the involvement of the p38 MAPKinase-MAFbx signaling pathway,
which is sensitive to oxidative stress, and the inflammatory NF-кB-MuRF1-
MHCI pathway in unloading-induced loss of muscle mass as well as the
effect of the different proposed treatments.
4. To study the involvement of Akt and Cbl-b in muscle mass loss induced by
hindlimb unloading, as well as the effect of the different proposed treatments.
5. To study the effect of the specific deletion of IKKα in skeletal muscle in
muscle wasting induced in hindlimb unloaded mice
Aims
90
Regarding the work during my predoctoral stay, the GENERAL AIM of our
study was to determine the molecular mechanisms involved in muscle wasting in
streptozotocin-induced experimental diabetes and its possible prevention by α-galacto-
oligosaccharides administration.
The SPECIFIC AIMS were:
6. To study the role of oxidative stress associated with experimental
streptozotocin-induced diabetes on skeletal muscle mass in rats.
7. To study the role of p38 and NF-кB in the loss of muscle mass in a model of
experimental diabetes.
8. To study the effect of the administration of α-galacto-oligosaccharides in the
prevention of muscle atrophy in this model.
MATERIALES
Y
MÉTODOS
Materiales y Métodos
93
3.1. MATERIALES
3.1.1. Animales de experimentación
Todos los protocolos experimentales realizados en las Facultades de Farmacia y
Medicina de la Universidad de Valencia, que describimos en este apartado, fueron
realizados de acuerdo con lo establecido en el Real Decreto 1201/2005, de 10 de
octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines
científicos (BOE 21 de octubre de 2005). El Comité de Ética en Investigación de la
Universidad de Valencia aprobó el procedimiento experimental llevado a cabo en la
presente tesis doctoral.
Así mismo, los protocolos experimentales realizados en el "Laboratoire
Mouvement, Sport, Santé" de la Universidad Rennes 2, Francia, fueron realizados de
acuerdo con lo establecido en el decreto 2001-486, de 6 de junio 2001, sobre protección
de los animales utilizados para experimentaciones científicas (BOE 6 de junio 2001). El
Comité Rennais de Ética para la experimentación animal aprobó el procedimiento
experimental llevado a cabo en la presente tesis doctoral.
Materiales y Métodos
94
3.1.1.1. Ratas Wistar macho
En el primer estudio que se realizó en la presente tesis doctoral se utilizaron
ratas de 3 meses de edad y de 340 ±40 g de peso. Los animales se mantuvieron en el
animalario de la Facultad de Farmacia, bajo condiciones constantes de temperatura (23
± 1ºC), humedad relativa (60%) y ciclos de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y
la comida fue siempre libre, siendo la dieta pienso estándar comercializado por
PANLAB S.L. cuyo valor calórico es de 3100 kcal/Kg.
a) Estudio nº1: Efecto de 14 días de suspensión en ratas Wistar macho.
Efecto del tratamiento con alopurinol
Los animales fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos experimentales
(Ver Tabla 3.1).
Grupo control.
Grupo control tratado con alopurinol. El alopurinol fue suministrado durante
14 días por vía oral, disuelto en el agua que bebían los animales, a una dosis
de 50 mg/kg de peso/día.
Grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no invasivo de
Morey-Holton y Globus (2002).
Grupo suspendido (Morey-Holton and Globus, 2002) tratado con alopurinol.
La suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el tratamiento con
alopurinol (dosis de 50 mg/kg de peso/día).
A los animales se les controló diariamente la ingesta de agua, ajustando la
concentración de alopurinol a la cantidad de agua que consumían.
Control Agua 9
Control Alopurinol 9
Suspendido Agua 7
Suspendido Alopurinol 7
Tabla 3.1. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión en ratas Wistar.
Número de animales por grupo.
Materiales y Métodos
95
b) Sacrificio de los animales. Extracción y conservación de muestras
Transcurridos los 14 días de suspensión de los miembros posteriores, los
animales fueron anestesiados con una inyección de Pentobarbital sódico (50 mg/kg de
peso). Posteriormente se procedió a la apertura de la cavidad abdominal accediéndose a
la vena cava inferior mediante una jeringa de 5 mL, para obtener la sangre.
Parte de la sangre se depositó en un tubo seco a temperatura ambiente,
transcurridos aproximadamente 30 minutos (necesarios para que se active la formación
de un coágulo) se centrifugó a 2000x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El
resto de la sangre se depositó en tubos con heparina o ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA), seguidamente se centrifugaron a temperatura ambiente a 1500x rpm, durante
15 minutos. El suero y el plasma se recogieron en alícuotas y se almacenaron a -20ºC
para posteriormente realizar la medición fluorimétrica de la XO, el análisis de MDA por
HPLC y estrés oxidativo por Western Blotting.
Los tejidos recogidos fueron:
Músculo sóleo.
Músculo gastrocnemio.
Músculo tibial anterior.
Músculo Extensor largo de los dedos (EDL).
Todos ellos, una vez recogidos fueron pesados, colocados en un tubo Eppendorf
y sumergidos en nitrógeno líquido, posteriormente se conservaron a una temperatura de
-80°C.
En el caso de los sóleos, el derecho se dividió en dos porciones, la primera
porción se destinó a medir en extracto citosólico la fosforilación de la MAP Kinasa p38,
la vía de NF-кB y estrés oxidativo mediante Western Blotting, y en extracto nuclear la
activación y expresión de NF-кBp65 mediante kit ELISA y Western Blotting
respectivamente; la segunda porción se depositó con trizol para medir RNA mensajero
(mRNA). En cuanto al sóleo de la pata izquierda, se fijó en formol al 4% para realizar
los estudios histológicos.
Materiales y Métodos
96
3.1.1.2. Ratones wild-type y muscle IKKα knockout hembra y
macho
El segundo estudio fue realizado con animales hembras y machos de 3 meses de
edad: 18 wild-type (WT) y 26 ratones que carecen de IKKα en el músculo esquelético
(mIKKα KO) de 21 ± 2.5 g de peso las hembras y 29 ± 2.5 g los machos. Los ratones se
recibieron desde el laboratorio de la Dra. Melek Canan Arkan de la Technical
University of Munich.
Tras estabularlos se mantuvieron en el animalario de la Facultad de Medicina,
bajo condiciones constantes de temperatura (23 ± 1ºC), humedad relativa (60%) y ciclos
de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y la comida fue siempre libre, siendo la
dieta pienso estándar comercializado por PANLAB S.L. cuyo valor calórico es de 3100
kcal/Kg.
a) Estudio Nº 2: Efecto de 14 días de suspensión en ratones WT y
mIKKα KO
Los animales, de cada grupo, fueron divididos aleatoriamente en dos grupos
experimentales (Ver Tabla 3.2).
Hembras WT grupo control.
Hembras mIKKα KO grupo control.
Hembras WT grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no
invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).
Hembras mIKKα KO grupo suspendido durante 14 días siguiendo el
protocolo no invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).
Machos WT grupo control.
Machos mIKKα KO grupo control.
Machos WT grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no
invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).
Machos mIKKα KO grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo
no invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).
Materiales y Métodos
97
Hembras WT grupo control 5
Hembras mIKKα KO grupo control 5
Hembras WT grupo suspendido 7
Hembras mIKKα KO grupo suspendido 7
Machos WT grupo control 4
Machos mIKKα KO grupo control 4
Machos WT grupo suspendido 6
Machos mIKKα KO grupo suspendido 6
Tabla 3.2. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión en ratones mIKKα KO.
Número de animales por grupo.
b) Sacrificio de los animales. Extracción y conservación de muestras
Transcurridos los 14 días de suspensión de los miembros posteriores, los
animales fueron anestesiados con un vaporizador de isoflurano. Posteriormente se
procedió a la apertura de la cavidad abdominal accediéndose a la vena cava inferior
mediante una jeringa de 2.5 mL para obtener la sangre.
Parte de la sangre se depositó en tubos de Heparina y EDTA. Posteriormente se
centrifugaron a temperatura ambiente a 1500x rpm, durante 15 minutos. El plasma se
recogió en alícuotas y fue almacenado a -20ºC para posteriormente realizar el análisis de
MDA por HPLC y estrés oxidativo por Western Blotting.
Los tejidos recogidos fueron:
Músculo gastrocnemio.
Músculo sóleo.
Los órganos recogidos fueron:
Corazón.
Pulmones.
Hígado.
Riñones.
Cerebro (hipocampo, cerebelo, corteza).
Materiales y Métodos
98
Todos ellos, una vez recogidos fueron pesados, colocados en un tubo Eppendorf
y sumergidos en nitrógeno líquido, posteriormente se conservaron a una temperatura de
-80°C.
En el caso de los sóleos, el derecho se destinó a medir mRNA. En cuanto al
sóleo de la pata izquierda, se depositó en formol al 4% para realizar los estudios
histológicos.
Los gastrocnemios se destinaron a medir en extracto citosólico la fosforilación
de la MAP Kinasa p38, la vía de NF-KappaB y el estrés oxidativo mediante Western
Blotting.
3.1.1.3. Ratones wild-type C57BL/6J macho
El tercer estudio fue realizado con animales de 3 meses de edad y de alrededor
de 31 ± 4 g de peso. Los ratones se mantuvieron en el animalario de la Facultad de
Medicina, bajo condiciones constantes de temperatura (23 ± 1ºC), humedad relativa
(60%) y ciclos de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y la comida fue siempre
libre, siendo la dieta pienso estándar comercializado por PANLAB S.L. cuyo valor
calórico es de 3100 kcal/Kg.
a) Estudio Nº3: Efecto de 14 días de suspensión en ratones C57BL/6J
macho. Efecto del tratamiento con alopurinol e indometacina
Los animales fueron divididos aleatoriamente en ocho grupos experimentales
(Ver Tabla 3.3).
Grupo control.
Grupo control tratado con indometacina. La indometacina fue administrada
durante 14 días por vía oral, disuelta en el agua que bebían los animales a una
dosis de 0.6 mg/kg de peso/día.
Grupo control tratado con alopurinol. El alopurinol fue suministrado durante
14 días por vía oral, disuelto en el agua que bebían los animales, a una dosis
de 50 mg/kg de peso/día.
Grupo control tratado con indometacina y alopurinol, a dosis idénticas que los
grupos anteriores.
Materiales y Métodos
99
Grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no invasivo de
Morey-Holton y Globus (2002).
Grupo suspendido (Morey-Holton y Globus, 2002), tratado con indometacina.
La suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el tratamiento con
indometacina (0.6 mg/kg de peso/día).
Grupo suspendido (Morey-Holton y Globus, 2002), tratado con alopurinol. La
suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el tratamiento con
alopurinol (dosis de 50 mg/kg de peso/día).
Grupo suspendido (Morey-Holton y Globus, 2002), tratado con alopurinol e
indometacina. La suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el
tratamiento con indometacina y alopurinol (dosis idénticas que los grupos
anteriores).
A los animales se les controló diariamente la ingesta de agua, ajustando la
concentración de alopurinol e indometacina a la cantidad de agua que consumían.
Control Agua 12
Control Indometacina 12
Control Alopurinol 12
Control Indometacina + Alopurinol 12
Suspendido Agua 12
Suspendido Indometacina 12
Suspendido Alopurinol 12
Suspendido Indometacina + Alopurinol 12
Tabla 3.3. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión en ratones C57BL/6J.
Número de animales por grupo
b) Sacrificio de los animales, extracción y conservación de muestras
Transcurridos los 14 días de suspensión de los miembros posteriores, los
animales fueron anestesiados con un vaporizador de isoflurano. Posteriormente se
Materiales y Métodos
100
procedió a la apertura de la cavidad abdominal accediéndose a la vena cava inferior
mediante una jeringa de 2.5 mL para obtener la sangre.
Parte de la sangre se depositó en tubos de Heparina y EDTA. Posteriormente se
centrifugaron a temperatura ambiente a 1500x rpm, durante 15 minutos. El plasma se
recogió en alícuotas y fue almacenado a -20ºC para, posteriormente, realizar la
medición fluorimétrica de la XO, el análisis de MDA por HPLC, la medición
espectrofotométrica de parámetros inflamatorios (kit ELISA) y estrés oxidativo por
Western Blotting.
Los tejidos recogidos fueron:
Músculo sóleo.
Músculo gastrocnemio.
Los órganos recogidos fueron:
Corazón.
Pulmones.
Hígado.
Riñones.
Cerebro (hipocampo, cerebelo, corteza).
Todos ellos, una vez recogidos fueron pesados, colocados en un tubo Eppendorf
y sumergidos en nitrógeno líquido, posteriormente se conservaron a una temperatura de
-80°C.
Siete animales de cada grupo se destinaron para medir el mRNA en el sóleo
derecho, mientras que el de la pata izquierda se depositó en formol al 4% para realizar
los estudios histológicos.
En los sóleos de los cinco ratones restantes se midió en extracto total de los
músculos sóleos la fosforilación de la MAP Kinasa p38, NF-кBp65 y estrés oxidativo
mediante Western Blotting. Los gastrocnemios de los ratones se destinaron a la
medición de la activación de NF-кBp65 en extracto nuclea mediante kit de ELISA.
Materiales y Métodos
101
3.1.1.4. Ratas Wistar Ham macho
Este estudio se llevó a cabo durante mi estancia en el laboratorio “Mouvement,
Sport, Santé” EA1274” de la universidad de Rennes 2, Francia. Se utilizaron ratas
macho de la cepa Wistar Ham (Herlan Laboratory) de 2 meses de edad, y de 313 ± 40 g
de peso. Las ratas se mantuvieron en el animalario del IFR 140 de la Universidad
Rennes 1 bajo condiciones constantes de temperatura (23 ± 1ºC), humedad relativa
(60%) y ciclos de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y la comida fueron siempre
libre, siendo la dieta libre de soja comercializada por HERSTELLER cuyo valor
calórico es de 3100 kcal/Kg.
a) Estudio Nº4: Estudio de la diabetes experimental inducida con
estreptozotocina en ratas Wistar Ham macho. Efecto del tratamiento con α-
galacto-oligosaccharidos (OGT)
Los animales fueron divididos aleatoriamente en tres grupos experimentales (Ver Tabla
3.4).
Grupo control (Ratas sanas).
Grupo Diabético.
Grupo Diabético suplementado, durante ocho semanas, con α-galacto-
oligosacárido (20mg/kg de peso/día de OGT), proporcionado por la compañía
Triballat.
Grupo control 9
Grupo Diabético (STZ) 8
Grupo Diabético (STZ) + OGT 8
Tabla 3.4. Diseño del estudio sobre el efecto de la diabetes en ratas Wistar Ham
Número de animales por grupo.
Materiales y Métodos
102
b) Diabetización de las ratas
La inducción de la diabetes se realizó después de una semana de familiarización
de los animales. La diabetización se indujo por una única inyección intraperitoneal de
estreptozotocina (STZ) (45 mg/kg de peso del animal disuelto en tampón citrato sódico
0.1 M a pH 4.5) de acuerdo con la técnica ya validada en el laboratorio M2S de Rennes
(Le Douairon et al., 2010). El método se basa en la destrucción selectiva de los islotes
de Langerhans ya que un tratamiento con estreptozotocina produce daños irreversibles
en su morfología y permeabilidad (Oztürk et al., 1996). Esta dosis indujo a las ratas una
hiperglucemia crónica y diabetes. Al grupo control se le administró como vehículo un
máximo de 800 µL de tampón citrato sódico 0.1 M a pH 4.5.
A los 5-7 días de la administración de estreptozotocina las ratas presentaban un
cuadro clínico propio de la diabetes, con poliuria, polidipsia y pérdida de peso. Se
comprobó este cuadro con parámetros bioquímicos como la medida de la glucosuria,
con tiras reactivas múltiples. Todos los animales que presentaron una glucosuria
superior a 250 mg/dL se incluyeron en el grupo de ratas diabéticas y en el grupo de ratas
tratadas con OGT.
c) Sacrificio de los animales. Extracción y conservación de muestras
Transcurridas 8 semanas desde la inducción de la diabetes, periodo de
suplementación, se mantuvieron a los animales en ayunas durante 24 horas antes de su
sacrificio. Los animales fueron anestesiados con una inyección de ketamina (90 mg/kg)
y xilacina (6 mg/kg).
Se extrajo una muestra de sangre del seno retro-orbital. La sangre se recogió en
tubos de EDTA al 5% (30 μL/2 mL de sangre) y se centrifugó a 1400x g durante 10
minutos a 4°C. El plasma se almacenó en alícuotas a -80°C para el posterior análisis de
las concentraciones de glucosa mediante el método de Trinder (Trinder, 1969) (una
variante del método de la glucosa oxidasa), y las concentraciones de insulina y
fructosamina por el método de ELISA.
Materiales y Métodos
103
Los tejidos recogidos fueron:
Músculo sóleo.
Músculo gastrocnemio.
Músculo tibial anterior.
Todos ellos, una vez recogidos fueron pesados, colocados en un tubo Eppendorf
y sumergidos en nitrógeno líquido, posteriormente se conservaron a una temperatura de
-80°C.
En el caso de los músculos, el tibial anterior, se destinó a medir en extracto
citosólico la fosforilación de la MAP Kinasa p38, TNF-α, NF-KappaB y estrés
oxidativo mediante Western Blotting.
3.1.2. Aparatos
Agitador magnético: Marca Stuart, modelo Hotplate Stirrer SB162-3.
Artisan(TM) Link Pro for Special Stains Diagnostics: Marca Dako.
Autoclave: Marca SELECTA, microclave.
Autoclave o SAS: Marca SELECTA, modelo Autester-G.
Balanza de precisión: Marca SARTORIUS, modelo TECATOR 6110.
Balanza: Marca SARTORIUS (Portable), modelo PT 1200.
Baño termostatizado: Marca Stuart, modelo SBH130D.
Campana de flujo laminar vertical: Marca CRUMA S.A., modelo 1100-
GA.
Campana de flujo laminar vertical: Marca BURDINOLA, modelo OR-ST
1200.
Campana DNA/RNA UV- Cleaner: Marca Biosan, modelo UVC/T-M-AR.
Centrífuga a baja velocidad: De la firma SORVALL, modelo GLC-1.
Centrifuga refigerada a alta velocidad: Marca HERAEUS, modelo
Sepatech Biofuge 17 RS.
Centro de inclusión de tejidos: Marca Leica, modelo EG 1150H.
Materiales y Métodos
104
Cromatografía líquida de alta eficacia: Modelo LC, Shimadzu.
- Autoinyector SHIMADZU, modelo SIL-10AD vp
- Bomba marca SHIMADZU, modelo LC-10 AD.
- Columna TEKNOLROMA de fase reversa, modelo Spherisorb C18 cuya
dimensiones son 15 x 0.46 cm y de un tamaño de partícula de 5 μm.
- Controlador del equipo CBM-10 A.
- Detector UV SHIMADZU, modelo SPD-10 AV.
- Ordenador IBM XT modelo 486 con el programa de integración
CLASSLC10.
Equipo de anestesia o sedación: Marca CIBERTEC con vaporizador de
Isoflorano.
Espectrofotómetro termostatizado: Marca CECIL, modelo CE 3021 Serie
3000.
Fluorímetro: Marca Perkin Elmer, Modelo LS 50B.
Fuentes de alimentación para la electroforesis: Marca SIGMA, modelo PS
250-2, y marca BIORAD, modelo 200/2.0 PowerSupply.
Homogenizador: Marca Ika-Werk, modelo Janke y Kunkel, RW 20 DZM.
Lava-biberones: Modelo Lancer, casa comercial Matachana.
Lavador automático de placas ELISA (HYDROFLEX, TECAN).
Lava-racks: ModeloDynajet New SMITH, Pacific Rack Washer. Se utiliza
detergente alcalino.
Microcentrífuga a baja velocidad: Marca Sigma, modelo 1-14.
Microscopio óptico: Marca Leica, modelo DMD 108.
Microtomo: Marca Leica, modelo RM 2245.
Nanodrop: Marca Thermo Scientific, modelo 2000.
pH-metro: Marca CRISON, modelo GLP 21, con un electrodo Inglod
incorporado.
Placa fría: Leica EG1150 C.
Procesador de tejidos al vacío: Marca Leica ASP 300s.
Refrigerador con congelador: Marca LG
Rotador: Mini-rocker Shaker MR-1 de Biosan.
Materiales y Métodos
105
Sistema de Análisis de Imágenes: Marca FUJIFILM, modelo LAS-1000
plus.
Sistema de Análisis de Imágenes: Marca Health Care, modelo Image Quant
Las 4000 H.C.
Sistema de detección de secuencias: MARCA Applied Biosystems (Foster
City, CA), ABI PRISM 7900HT Fast Real-Time PCR System.
Sistema de purificación de agua: Marca MILLIPORE, modelos Milli-Q y
Milli-RO.
Termociclador: Marca Biorad, modelo iCyder Iqtm Multi-Color. Real-Time
PCR Detection System
Termociclador: Marca Eppendorf. Modelo Vapo. Protect. Mastercycler pro-
S.
Ultracongelador -80°C: REVCO Ultima II
Vórtex: Mezclador de control de velocidad variable entre 200 y 2500x rpm.
Marca Stuart. Modelo SA8.
3.1.3. Material de laboratorio
Cubetas de electroforesis: Marca BIORAD, modelo Mini-PROTEAN 3
Cell.
Cubetas de electrotransferencia: Marca BIORAD, modelo Mini Trans-Blot
Cell.
Diverso material de vidrio, plástico y/o polipropileno (tubos, botes, pipetas,
cubreobjetos, probetas, etc.).
Gradillas.
Guantes de látex.
Jeringuillas estériles de un solo uso.
Juego de extracción de sangre (compresor, agujas, vacutainer).
Material Quirúrgico: Marca LAWTON, modelo HIBC-CODE.
Micropipetas semiautomaticas de 1000, 200 y 10 μL (Thermo Scientific).
Micropipeta multicanal de 50, 300 μL (Thermo Scientific).
Pinzas.
Pipetas Pasteur.
Materiales y Métodos
106
Placas Petri.
Portaobjetos con Poly-L-lisina.
Tubos Eppendorf de 1.5 mL.
Tubos de extracción de sangre con Heparina y EDTA.
3.1.4. Reactivos
a) Reactivos de uso común.
Ácido acético glacial.
Ácido clorhídrico.
Ácido sulfuroso.
AcONa: acetato sódico.
Acrilamida-Bisacrilamida.
Agua ultrapurificada (Milli-Q).
Albúmina de suero bovino (BSA).
Alcohol clorhídrico.
Alcohol etílico.
Alcohol metílico.
Alopurinol.
Alumbre de potasio o amónico.
Alumbre férrico.
Amoniaco.
APS: persulfato de amonio.
Azul de Coomassie.
Bicarbonato de sodio.
Bradford.
Desoxicolato de sodio (C24H39NaO4).
Diaminobenzidinatetrahidroclorhídrica (DAB).
Diluyente de anticuerpo primario: DAKO AntibodyDiluentEnvision.
Dinitrofenilhidrazona (DNP-hidrazona).
DNPH: 2,4-dinitrofenilhidracina.
Materiales y Métodos
107
DNP-hidrazona: dinitrofenilhidrazona.
DTT: DL-Ditiotreitol (C4H10O2S2).
EDTA: ácido etilendiaminatetracético.
Eosina Amarillenta.
Epitroperetrievalsolution (10x) con detergente, Dako.
Folin-Ciocalteau.
Formaldehído.
Fucsina.
Glicina.
H2O2: Peróxido de hidrógeno.
Hematoxilina de Harris.
Hidróxido potásico.
Indometacina.
Inhibidor de proteasas.
Isoflo®, Veterinaria Esteve.
Isoxantopterina.
K3PO4: Fosfato de Potasio Tribásico.
KH2PO4:Fosfato monopotasico.
Lowry.
Luminol.
Membrana de Nitrocelulosa.
Membrana de PDVF.
Mercaptoetanol.
Metabisulfato sódico anhidro.
Metabisulfito potásico.
Metabisulfito sódico.
Na2HPO4: Fosfato disódico.
Na4P2O7: Pirofosfato de sodio.
NaCl: Cloruro sódico.
NaF: Floruro sódico.
NaOH: Hidróxido de sodio.
AgNO3: Nitrato de plata.
Materiales y Métodos
108
Nonidet-P40 (Sigma).
Ortovanadato de sodio.
Óxido rojo de mercurio.
Papel de filtro.
Parafina.
Permanganato potásico.
Plata amoniacal.
PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo.
Poly-L-lisina.
Pterina (2-amino-4-hidroxipteridina).
Sacarosa.
SDS: Dodecilsulfato sódico (C12H25NaO4S).
Sigmacote, Sigma.
TBA: Ácido tiobarbitúrico.
TEMED.
Tris.
Tween.
Xilol.
b) Tampones de uso común
El pH de los tampones y las soluciones utilizadas en este trabajo estuvo siempre
comprendido entre 7.2 y 7.4, rango que no afecta a la viabilidad ni a la función celular.
El agua utilizada fue siempre agua ultrapurificada (Milli-Q). La composición de los
distintos tampones se encuentra detallada en cada uno de los métodos en los que han
sido utilizados, los cuales se describen en los apartados posteriores.
Materiales y Métodos
109
c) Anticuerpos utilizados en la técnicaWestern Blotting
Anticuerpo Peso Molecular Dilución Casa Comercial
MnSOD 25kDa 1:5000 AssayDesing
Cu,ZnSOD 28 kDa 1:5000 AssayDesing
Catalasa 61kDa 1:5000 Sigma
α-actina 42kDa 1:700 Sigma
P38 43 kDa 1:1000 CellSignaling
p-P38 43 kDa 1:1000 CellSignaling
NF-кBp65 65 kDa 1:1000 CellSignaling
p-NF-кBp65 80 kDa 1:1000 CellSignaling
TNF-α 17 kDa 1:1000 Santa Cruz
MHC I 220 kDa 1:10000 Millipore
AKT 60 kDa 1:1000 CellSignaling
p-AKT 60 kDa 1:1000 CellSignaling
Secundario Anti-rabbit 1:2500 CellSignaling
Secundario Anti-mouse 1:2000 Calbiochem
Secundario Anti-goat 1:2000 Santa Cruz
Tabla 3.5. Relación de anticuerpos
d) Anticuerpos utilizados en la técnica inmuno-histológica
Anticuerpo Dilución Casa Comercial
MHC I 1/4000 Sigma
Secundario universal
biotinilado Dako
Estreptavidina conjugada
con peroxidasa Dako
Tabla 3.6. Relación de anticuerpos primarios
Materiales y Métodos
110
3.1.5. Kits de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
Para el análisis de las concentraciones plasmáticas de 6-keto prostaglandinas
F1α, Glucosa, Fructosamina e insulina, así como de las concentraciones de la citoquina
IL-6 y la actividad de NF-кBp65 en el músculo esquelético se utilizaron distintos kits
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) los cuales se detallan en el apartado de
métodos, al igual que los reactivos utilizados en cada uno de ellos.
Las referencias de los distintos kits son las siguientes:
Activación de NF-кBp65: TransAM™ NF-кBp65; Active Motif (Ref. 40096).
Determinación de 6-keto prostaglandinas F1α: Cayman Chemical 6-keto
Prostaglandin F1α EIA Kit (Item Number 515211).
Determinación IL-6: RayBio, Mouse IL-6 ELISA (Cat#: ELM-IL6-001C).
Determinación de la Fructosamina: a MyBioSource, Rat fructosamine ELISA
kit Ref. MBS704663
Determinación de la insulina: SPI-Bio rat insulin enzyme immunoassay kit
(catalogue #A05105).
Materiales y Métodos
111
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Modelo de suspensión de las extremidades
posteriores para roedores, adaptación de Morey-Holton y
Globus
Para la inmovilización de los animales se adaptó el protocolo de suspensión de
las extremidades posteriores para roedores de Morey-Holton y Globus, 2002 (Morey-
Holton and Globus, 2002). Este protocolo fue aprobado por la NASA y el Comité de
Cuidado de Animales para la simulación del vuelo espacial.
El material necesario para la suspensión de las extremidades posteriores de los
animales fue el siguiente: 1) un tubo inmovilizador, 2) cinta adhesiva, esparadrapo o
similar, 3) anillas de acero inoxidable, 4) quitavueltas o artefacto similar (utilizamos el
de los artículos de pesca acorde al peso del animal), 5) filamento de alambre, 6)
Alcohol, 7) una jaula para suspender a los animales, y 8) un cajón con viruta que se
situó debajo de la jaula para recoger la orina.
Antes de iniciar la suspensión de los miembros se prepararon las tiras adhesivas
y los filamentos de alambre. El ancho de las tiras adhesivas se ajustó a la anchura de la
cola de los animales, y su longitud fue la necesaria para cubrir alrededor de dos tercios
de la longitud de la cola, teniendo en cuenta que al colocarla enrollada debía
superponerse sobre la mitad del ancho de la tira anterior, ya que además la cola es
crítica para la termorregulación en los roedores.
El procedimiento mediante el cual se llevó a cabo la suspensión fue el siguiente:
la rata o el ratón se colocó dentro del tubo de inmovilización con la ayuda de una
segunda persona que ayudó a mantenerla dentro del mismo. Se podría haber anestesiado
a los animales, pero se desestimó la opción porque la anestesia puede comprometer la
capacidad de los animales para adaptarse a la suspensión.
Se limpió la cola con alcohol, eliminando cualquier posible resto de piel sucia o
muerta. La cinta adhesiva, previamente cortada y preparada, se pegó al inicio la cola, en
la base, justo debajo de la línea del pelo. La cinta adhesiva se presionó ligeramente
Materiales y Métodos
112
sobre la cola para que se adhiriese a lo largo de la superficie de la misma, y se fue
enrollando dando la vuelta a la cola, superponiendo la mitad de la segunda vuelta sobre
la anterior. La cinta debía estar lo suficientemente apretada para que no se desprendiese
de la cola, pero a la vez no debía alterar la circulación normal de la misma. Una vez
desplegadas dos vueltas de cinta adhesiva, se coloca la anilla entre la tira y la cola y se
termina de desplegar una tercera vuelta, dejando colocada y pegada la anilla junto a la
cola de la rata.
El siguiente paso fue anclar la pieza giratoria que colgaba del dispositivo de
suspensión en la parte superior de la jaula. Esta pieza permitía que los animales se
desplazasen sobre un eje x-y y rotar 360° de tal manera que tuviesen acceso a todas las
áreas de la jaula, al agua y a la comida. El dispositivo de suspensión, ubicado en la parte
superior de la jaula, se debe poder deslizar a lo largo de las dos barras paralelas de la
jaula. El sistema giratorio fue diseñado para impartir la mínima resistencia con la
intención de que el animal pudiera moverse fácilmente y sin esfuerzo, usando sus
extremidades anteriores. El cuerpo de los animales tenía un ángulo de 30° desde el suelo
de la jaula, lo que permitía que sus miembros posteriores no tocasen la reja del suelo.
Además se comprobó, extendiendo manualmente las extremidades posteriores, que las
uñas de las patas no tocasen la reja o las paredes de la jaula. El ángulo y la altura de las
ratas revisado y ajustado diariamente.
Figura 3.1 Rata Wistar y Ratón C57BL/6J durante el protocolo de suspensión.
Los animales eran inspeccionados dos veces al día por la veterinaria y por
nosotros mismos para asegurar su salud.
Durante las inspecciones se observaron los siguientes aspectos: el estado de la
cola, color de la misma y si se aflojaba la cinta adhesiva, el aspecto general así como la
Materiales y Métodos
113
actividad del animal. Durante los primeros días de la suspensión, pudimos observar
porfirina alrededor de la nariz y los ojos en el grupo de las ratas suspendidas, que
comenzó a desaparecer al tercer o cuarto día de suspensión.
3.2.2. Determinación de la actividad de la Xantina Oxidasa
Se siguió el método fluorimétrico descrito por Beckman y cols. (1989). Este
método está basado en la monitorización fluorimétrica de la formación de
isoxantopterina a partir de pterina (Beckman et al., 1989).
a) Reactivos
Tampón fosfato 50 mM., EDTA 0.1 mM., pH 7.4.
Pterina (2-amino-4-hidroxipteridina) 1 mM. Se pesan entre 3 y 4 mg. de
pterina y se resuspenden inicialmente en 100 µM. de NaOH 1 M. Una vez
disuelta se le añade el agua necesaria para alcanzar una concentración de
1mM. Esta solución es estable durante 1 ó 2 días a temperatura ambiente.
Isoxantopterina 1 mM. Se pesan entre 3 y 4 mg. de isoxantopterina y se
resuspenden inicialmente en 100 µM. de NaOH 1 M. Una vez disuelta se le
añade el agua necesaria para alcanzar una concentración de 1 mM. A partir de
esta solución se diluye hasta alcanzar una concentración de 10 µM. La
concentración exacta de isoxantopterina se determina
espectrofotométricamente a 336 nm., debiendo encontrarse entre 8 y 13 µM.
Esta solución se ha de preparar y valorar diariamente.
Alopurinol 1 mM en agua Milli-Q. Esta solución se realiza directamente a 1
mM. Para conseguir una perfecta disolución es necesario prepararla en
agitación y calentándose. Una vez disuelta se separan alícuotas que se pueden
conservar congeladas.
Materiales y Métodos
114
b) Procedimiento
La variación de la fluorescencia generada por la formación de isoxantopterina se
mide a 345 nm. de excitación y 390 nm. de emisión. Todo el proceso se realiza con el
fluorímetro termostatizado a 37ºC.
Añadimos en una cubeta de cuarzo de 25 µL de muestra y tampón fosfato 50
mM., EDTA 0.1 mM., pH 7.4, hasta un volumen final de 2 mL, este valor constituye el
blanco. Posteriormente se añaden 20 µL de una solución de pterina 1 mM y se sigue la
emisión de fluorescencia durante 2 minutos. El cambio de fluorescencia, nos indica la
actividad de la xantina oxidasa. Añadimos 20 µL más de una solución de alopurinol 1
mM y se sigue la emisión de fluorescencia durante un minuto. No debe variar la
fluorescencia, pues el alopurinol inhibe la xantina oxidasa. A continuación realizamos
una medida puntual de la fluorescencia antes y después de añadir 20 μL de
isoxantopterina, cuya concentración se ha determinado previamente. De esta manera
obtendremos el incremento de fluorescencia debido a la isoxantopterina. Este
procedimiento se utiliza como patrón interno en la determinación.
c) Cálculos
La unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que cataliza la
formación de 1 μM de isoxantopterina por minuto. En el plasma la expresamos en
unidades por litro de plasma.
Para calcular la actividad de la XO se realiza el siguiente cálculo:
Siendo:
F/min. la variación de fluorescencia observada por minuto tras añadir la
pterina.
Isoxantopterinala concentración de isoxantopterina.
Materiales y Métodos
115
Fisoxantopterina es el incremento inmediato de fluorescencia que se
produce tras añadir la isoxantoptrina.
V final: el volumen de la cubeta una vez añadida la disolución de pterina
(2.02 ml.).
V muestra: es el volumen de muestra añadido (0.025 ml.).
3.2.3. Determinación de MDA por HPLC
a) Reactivos
Tampón de AcONa 2 M pH 3.5 + TBA 0.2%.Se guarda protegido de la luz a
4ºC.
Tampón KH2PO4 50mM pH 6.8. Guardado a 4ºC.
Tampón KH2PO4 50 mM pH 3.5. Guardado a 4ºC.
b) Procedimiento
1. A 500 μL de tampón AcONa 2 M pH 3.5 + TBA 0.2% se le añadieron 20 μL
de muestra de plasma o patrón.
2. Las muestras se incubaron durante 60 minutos a una temperatura de 95ºC. En
esta etapa se produjo la hidrólisis de los lipoperóxidos y la consiguiente
liberación de moléculas de malondialdehído (MDA) que se conjugan con 2
moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA); por lo tanto, estrictamente se
denomina el aducto MDA – TBA2 como índice de peroxidación lipídica.
3. Después de la incubación las muestras se guardaron en hielo.
4. Se añadió 500 μL del tampón KH2PO4 50 mM pH 6.8 a cada muestra y se
agitó.
5. Las muestras fueron centrifugadas durante 5 minutos a 13000x rpm a 4ºC.
6. Se tomaron 200 μL de sobrenadante y fueron añadidos 200 μL de tampón
KH2PO4 50 mM pH 3.5 y se agitó.
7. Fueron tomados 200-300 μL de sobrenadante y se colocaron en un vial para
realizar el análisis por HPLC.
Materiales y Métodos
116
En las muestras hemolizadas se retiró la hemoglobina, ya hubiese interferido en
el análisis; para ello antes de preparar las muestras se realizó el siguiente procedimiento:
1. Se tomaron unos 100 μL (50 μL) de plasma y se añadió 100 μL (50 μL) de
una solución formada por dos partes de cloroformo y una de isopropanol.
2. Se pasó por el vórtex durante 2 minutos y se dejó reposar unos 5 minutos;
posteriormente se centrifugó durante 10 minutos a 10000x rpm a 4ºC.
3. Se recogieron 75 μL (35.5 μL) del sobrenadante y se añadieron 75 μL (35.5
μL) de la solución formada por cloroformo e isopropanol.
4. Se pasó por el vórtex durante 2 minutos y dejó reposar unos 5 minutos;
después se centrifugó durante 10 minutos a 10000x rpm a 4ºC.
5. Del sobrenadante cogimos 20 μL y los añadimos a 500 μL de tampón AcONa
2 M pH 3.5 + TBA 0.2%, siguiendo, de este modo, el protocolo descrito (ver
protocolo).
c) Preparación de las fases móviles
Preparación de la fase A:
La composición de la fase A era la siguiente: KH2PO4 50 mM pH 6.8 /
acetonitrilo (83/17). Para prepararla se procedió del siguiente modo:
1. Se pesaron 13.6 g de KH2PO4 y disolvieron en unos 1800 mL de agua.
2. Ajustamos el de esta disolución hasta 6.8 con KOH 1M o, en su lugar,
disoluciones de KOH de distinta concentración (≈ 14.5 mL KOH 20%).
3. Cuando el pH estuvo ajustado a 6.8 ajustamos el volumen con agua hasta
2000 mL.
4. A esos 2 litros de disolución se le añadieron 410 mL de acetonitrilo. Esta
solución debía homogenizarse bien.
5. Una vez preparada la fase móvil fue necesario filtrarla y desgasificarla. Para
ello, se podía utilizar helio o el baño de ultrasonidos. En ambos casos el
tratamiento de desgasificación debía durar unos 20 minutos.
Materiales y Métodos
117
Preparación de la fase B:
Esta fase estaba constituida por una mezcla de acetonitrilo/agua (70/30). Para
prepararla, a 1400 mL de acetonitilo debieron añadírsele 600 mL de agua,
homogenizarla y desgasificarla como en el caso anterior.
Preparación de la fase C:
Para prepararla a 1000 mL de agua debieron añadirse unos 200 µL de
acetonitrilo; después de homogenizar la solución se desgasificó. La fase C no siempre
es necesaria llevarla a cabo, se utiliza únicamente para lavar el sistema cuando este iba
a estar varios días sin utilizarse.
Las fases se colocaron finamente en las botellas de vidrio topacio que
usualmente utilizamos para tal fin.
d) Preparación de los patrones
1. Preparamos una madre de MDA-bis (410 µL/500 mL de agua Milli-Q).
2. Hicimos una disolución ½ de la madre, así obtuvimos 5mM de MDA-bis.
3. Se prepararon los patrones:
A. 50 nmol/mL (se diluyó 1/100 5 mM de MDA).
B. 25 nmol/mL (se diluyó ½ 50 nmol/mL).
C. 12.5 nmol/mL (se diluyó ½ 25 nmol/mL).
D. 5 nmol/mL (se diluyó 1/5 25 nmol/mL).
E. 2.5 nmol/mL (se diluyó ½ 5 nmol/mL).
F. 1.25 nmol/mL (se diluyó ½ 2.5 nmol/mL).
G. Blanco (25 µL de agua + 500 µL de tampón AcOH 2M pH 3.5 + TBA
0.2%).
e) Condiciones cromatográficas
Flujo: 1.2 mL/min.
Detección: detección mediante detector uv-vis a 532 nm.
Columna: C-18 Spherisorb de 15 cm y 5 µm de diámetro de partícula.
Materiales y Métodos
118
3.2.4. Extracción y separación de proteínas de la fracción
citosólica y nuclear del músculo esquelético
Los fragmentos de tejido muscular extraído de los animales fueron tratados y
preparados para analizarse mediante la técnica Western Blotting. Para ello se tuvieron
que extraer fracciones nucleares y citosólicas siguiendo el protocolo modificado de
Dignam y sus colaboradores (Dignam et al., 1983) detallado a continuación:
Los fragmentos de tejido muscular (40-50 mg) se homogeneizaron en 100
μL/mg en una solución amortiguadora de lisis 1% Nonidet-P40, 50 mM NaCl, 10 mM
Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, sacarosa 0.25 M, 30 mM de pirofosfato de sodio, 100 de
sodio microM ortovanadato, 50 mM NaF, 0.25% de sodio Desoxicolato, 5 μL de
inhibidor de proteasas por mL de tampón, 100 μM de ortovanadato de sodio.
Las muestras se centrifugaron a 1500x g durante 10 minutos a 4°C. El
sobrenadante, la fracción citosólica, fue recogido y congelado a -80°C hasta su análisis.
Seguidamente se resuspendió el pellet nuclear con 400 μL del siguiente tampón:
10 mM TRIS (pH 7.5), 0.25 M Sacarosa, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA, 30 mM
Pirofosfato Sódico, 1% Nonidet P-40, 0.25 % Sodiumdeoxicolato, 5 μL x mL de
tampón de inhibidores de proteasas, 100 μM Ortovanadato de Sodio.
Después se vortearon durante 15 segundos y se sonicaron un total de 4 veces
durante 15 segundos en hielo y se dejó reposar en hielo 30 minutos. Pasado este tiempo
se centrifugó durante 15 minutos a 14000x rpm a 4°C, se recogió el sobrenadante,
fracción nuclear, y se congeló a -80°C, hasta su análisis.
3.2.5. Extracción de proteínas totales del músculo esquelético
Debido a la escasez de la muestra, en el caso de los sóleos de los ratones
analizados por Western Blotting los músculos enteros fueron tratados y preparados para
extraer proteínas totales siguiendo el siguiente protocolo:
Los fragmentos de tejido muscular se homogeneizaron en una solución
amortiguadora de lisis Tris 10 mM pH 7.5, 0.25 M Sacarosa, 50 mM NaCl, 5mM
EDTA, 30 mM Pirofosfato Sódico, 1% Nonidet-P40, 100 µM Ortovanadato de sodio,
50 mM Fluoruro de sodio, 0.25% sodio desoxicolato, 5 µL por mL de tampón del
Materiales y Métodos
119
cocktail de inhibidores de proteasas, en una proporción de 200 µL de tampón por cada
20 mg de tejido congelado.
Posteriormente los homogenados se sonicaron 5 segundos en hielo, a baja
intensidad, y se dejaron reposar 30 minutos en hielo para facilitar la ruptura tisular.
Pasado este tiempo, se centrifugaron 12 minutos a 12000x g a 4ºC, se recogió el
sobrenadante y se congeló a -80°C hasta su análisis.
3.2.6. Método para determinar la concentración de proteínas
3.2.6.1. Método de Lowry
a) Fundamento
En algunas técnicas utilizadas los resultados se expresan en función de la
cantidad de proteína, proceso necesario, a su vez, para conocer la cantidad exacta que se
carga en las electroforesis SDS-PAGE. Para la cuantificación de las proteínas de las
muestras se ha utilizado el método de Lowry (Peterson, 1977, Lowry et al., 1951). El
reactivo de Lowry contiene dodecilsulfato sódico, que facilita la disolución de las
proteínas parcialmente insolubles, y tartrato cúprico alcalino, que se une a las proteínas.
Por su parte el reactivo de Folin contiene fenol, que al interaccionar con el tartrato da
lugar a un compuesto de color azul.
El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de
las proteínas. A la muestra se añaden los reactivos mencionados previamente, que
forman un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad del color
proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.
b) Preparación de los reactivos
Agua Milli-Q
Reactivo de Lowry: se prepara añadiendo 40 mL de agua Milli-Q a la botella
del reactivo comercial LowryReagent, Powder de la casa Sigma-Aldrich, en
polvo (0.15% Deoxycholate (DOC), ácido tricloroacético (TCA)).
Reactivo Folin-Ciocalteau (18 mL) se encuentra en botella de vidrio ámbar
previstas para la solución de trabajo. A este reactivo se le añaden 90 mL de
agua Milli-Q.
Materiales y Métodos
120
Homogenado de tejido (muestra problema)
Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA), con a las
concentraciones de 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.125, 0.78125, 0.396, 0.195
mg/mL además del blanco, con agua Milli-Q.
c) Procedimiento
Se añadió en cada Eppendorf 10 µL de muestra o patrón + 490 µL de H2O Milli-
Q + 500 µL de Lowry. A continuación se incubó durante 20 minutos en una situación
de total oscuridad. Posteriormente se añadieron 250 µL de Folin y se dejaron las
muestras a oscuras durante 30 minutos más. Finalmente medimos en el
espectofotómetro a 660 nm con microcubetas para espectofotómetro.
Hay que tener en cuenta que, debido a la gran cantidad de proteínas que
contienen los diferentes tejidos, se deberá realizar previamente diluciones de las
muestras. En el caso de las muestras citosólicas se utilizó una dilución 1/5, en el caso de
las muestras del extracto nuclear la dilución fue ½ y 1/6 en las de plasma.
d) Cálculos
Los cálculos consistieron en realizar una recta patrón de concentración de
proteínas realizada con BSA e interpolar en esa recta los valores de absorbancia
obtenidos de las muestras tratadas igual que la recta patrón, para así hallar la
concentración de proteínas de la muestra.
Abs = Abs muestra – Abs blanco
Materiales y Métodos
121
3.2.6.2. Método de Bradford
a) Fundamento
Se utiliza el “Bradford Reagent” de la firma BIO-RAD siguiendo el protocolo de
Bradford (Bradford, 1976), este reactivo contiene ácido fosfórico, metanol y también
azul de Comassie.
El método está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant
blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas en muestras
complejas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente
arginina) y aromáticos. La interacción proteína-colorante es estabilizada por
interacciones iónicas y sobre todo por interacciones hidrofóbicas.
Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de
absorción del colorante desde 465 nm (en condiciones ácidas) a 595 nm (cuando se
desprotona al unirse a una proteína), por lo que el cambio en la absorbancia a 595 nm es
proporcional a la concentración de proteína en la muestra.
b) Reactivos
Agua milli-Q.
Bradford Reagent (BIO-RAD).
BSA: Para realizar la recta patrón, idéntica a la descrita en el apartado del
método de Lowry.
c) Protocolo
Se realiza una recta patrón de BSA, para posteriormente interpolar nuestras
muestras de concentración desconocida. Para ello, hay que preparar una serie de
Eppendorfs que contengan las siguientes concentraciones de albumina (BSA): 50, 25,
12.5, 6, 3, 1.5, 0.75, 0.37, 0.19 mg/mL.
- Una vez tengamos nuestra recta patrón, esta se trata como otra muestra más.
- Preparamos las solución Bradford al 20% (dilución 1/5 con agua Milli-Q)
teniéndose en cuenta que necesitamos 1mL x muestra.
Materiales y Métodos
122
- Poner 1 mL de la solución Bradford en cada cubeta (Medir todos los blancos a
595 nm).
- Añadir 2 μL de muestra en las cubetas y dejar en oscuridad 15 minutos.
- Medir absorbancia a 595 nm. Y relativizar cada muestra con su blanco.
Al igual que en el método Lowry, se deberá realizar previamente diluciones de
las muestras. En el caso de las muestras citosólicas se utilizó una dilución 1/5, en el caso
de las muestras del extracto nuclear la dilución fue ½ y 1/6 en las de plasma.
d) Cálculos
La absorbancia de la muestra llamada “blanco” debe restarse a las muestras
problema y a los patrones.
ΔAbs = Abs muestra o patrón – Abs blanco
El resultado se expresa en una gráfica de absorbancia en función de la
concentración de nuestros patrones. Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se
obtiene una línea recta que pasa cerca del origen.
Una vez obtenida las absorbancias de todas nuestras muestras. Se realiza una
recta de regresión lineal con los datos de la recta patrón para interpolar en esta los datos
de las muestras de las que desconocemos su concentración.
3.2.7. Análisis por Western Blotting
La técnica del Western Blotting fue descrita por primera vez por Harry Towbin
en 1979 (Towbin H. Staehelin T., 1979). El término blotting hace referencia a la
transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su
posterior detección en la superficie de la misma.
La identificación de proteínas se basa en la especificidad de la unión antígeno-
anticuerpo. Esta unión permite la detección de una única proteína dentro de una muestra
compleja proveniente, en este caso, de un extracto proteico de músculo esquelético o
plasma.
Materiales y Métodos
123
3.2.7.1. Separación electroforética de las proteínas
La separación de las proteínas mediante una electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE) previa, seguida de una transferencia a una membrana de
nitrocelulosa, en las que las proteínas quedan retenidas y expuestas para facilitar el
reconocimiento por el anticuerpo.
Para ello, tras medir la concentración de proteínas de las muestras
homogeneizadas, por los métodos descritos anteriormente, se calcula el volumen de
muestra que hay que poner para que en el pocillo haya entre 30 y 60 μg de proteínas. El
doble de dicho volumen se diluyó 1:1 con “SDS Sample Buffer”, tampón de carga con
mercaptoetanol (para romper los enlaces disulfuro) y un detergente SDS (dodecyl
sulfate) para cargar negativamente las proteínas. Posteriormente las proteínas de la
muestra se desnaturalizaron calentándolas a 95oC durante 5 minutos (para romper los
enlaces de hidrógeno).
Una vez tratadas las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida de 1.5
mm, el espesor del gel varía según el porcentaje de acrilamida añadida y depende del
peso molecular de las proteínas que se quieran estudiar. Por ejemplo, para la
preparación del “Running Gel” al 12% es necesario disolver los reactivos en el siguiente
orden: Agua, Tris 1.5M pH 8.8, Acrilamida-Bisacrilamida al 40%, SDS al 10%, Tris-
TEMED, APS al 10%. Y para la preparación del “Stacking Gel” al 4.5%: Agua, Tris 0.5
M pH 6.3, Acrilamida-Bisacrilamida al 40%, SDS al 10%, Tris-TEMED y APS al 10%.
Se colocó en una cubeta horizontal (BIO RAD Mini-PROTEAN Tetra cell) y se
aplicó un voltaje constante de 100 V durante 2 horas en tampón Tris-Glicina (25 mM
Tris, 200 mM Glicina, 0,1% SDS, pH 8.3).
3.2.7.2. Transferencia de las proteínas a la membrana
Una vez separadas las proteínas, se procedió a la transferencia de éstas desde el
gel de poliacrilamiada a una membrana de nitrocelulosa (Schelider&Schuel, USA) en
condiciones de humedad y sometiendo al soporte de transferencia a un amperaje
constante de 240 mA durante 1 hora y 30 minutos a 4ºC en un tampón de transferencia
(25 mM Tris, 192 mM Glicina pH 8.3, metanol 20%).
Materiales y Métodos
124
Tras la transferencia el gel se tiñe con azul de Coomassie (1.25 g coomassie R-
250, 250 mL etanol, 50 mL ácido acético y 200 mL de agua; luego se destiñe con 500
mL, 200 mL de ácido acético y 1200 mL de agua).
3.2.7.3. Separación electroforética de las proteínas
La membrana se sumerge en tampón de bloqueo con leche desnatada en polvo o
BSA al 5% p/v en TBS-TWEEN (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6, Tween 0.1%)
durante mínimo 1 hora. Así se consigue bloquear los sitios de unión de la membrana y
reducir la posterior unión inespecífica de anticuerpos a las proteínas.
3.2.7.4. Anticuerpos primarios y secundarios
Los anticuerpos primarios utilizados, que aparecen en la tabla del apartado 3.1.3,
fueron diluidos con leche o BSA al 5% en TBS-TWEEN, se dejaron incubando
overnight en la cámara fría (4ºC). Tras la incubación con el anticuerpo primario, se
realizan 3 lavados de 5 minutos con TBS-TWEEN para eliminar el exceso de anticuerpo
que haya podido quedar en la membrana y se incuba con el anticuerpo secundario anti-
mouse 1:2000 para y anti-rabbit 1:2500 según lo requiera cada anticuerpo que están
conjugados con la enzima peroxidasa de rábano (HRP), proteína que cataliza la
oxidación de los sustratos por el peróxido de hidrógeno. Se incuban las membranas
durante 60 minutos a temperatura ambiente y agitación constante.
Finalmente se hacen 3 lavados con TBS-TWEEN de 5 minutos.
En último lugar añadimos el sustrato (luminol: ECL Western Blot Detection
Reagents, GE Healthcare, UK), 1 mL/membrana y se revelan las membranas mediante
un digitalizador de imagen (Fujifilm LAS-100) que recoge la señal de
quimioluminiscencia emitida en el transcurso de la reacción en el software Image
Reader Las-1000 Pro v2.3 acoplado a una cámara oscura Intelligent Dark Box II
(Fujifilm).
Materiales y Métodos
125
3.2.7.5. Interpretación y cuantificación de los resultados
La cuantificación relativa de la expresión de proteínas mediante un programa de
densitometría digital (Image Gauge versión 4.0. Fujifilm).
Los valores de las proteínas estudiadas se expresaron en función de los valores
de expresión de α-actina en los extractos citosólicos, mientras que en los nucleares se
realizó en función de la tinción de la membrana en rojo ponceau.
3.2.8. Proteínas carboniladas
Los fragmentos de tejido muscular (40-50 mg) se homogeneizaron en 100 μL /
mg en un músculo solución amortiguadora de lisis (tampón fosfato 50 mM, 0.1 mM
EDTA, pH 7.4, 0.5 M de sacarosa, DTT 1 mM, PMSF 1 mM). Las muestras se
centrifugaron a 12.000x g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante fue recogido y
congelado a -20°C hasta su análisis. Las muestras de plasma recogidas durante el
sacrificio no se hayan sometidas a ningún tratamiento previo al análisis. Los grupos
carbonilo presentes en los extractos citosólicos o plasma se derivatizaron con 2.4-
dinitrofenilhidrazona (DNP-hidrazona) por reacción, con 2.4-dinitrofenilhidracina
(DNPH).
a) Derivatización de las muestras.
1. Se añaden 10 µL de 1X DNPH a cada muestra.
2. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3. Se añade 7.5 μL de la solución de neutralización.
4. Se añade 1-1.5 μL de 2-mercaptoetanol (5%v/v).
La determinación de los grupos carbonilo en proteínas se lleva a cabo por
Western Blotting, técnica descrita anteriormente, utilizando un anticuerpo primario
específico para el DNP-hidrazona (anti-dinitrofenilhidrazona, IntergenCompany).
Materiales y Métodos
126
b) Procedimiento
Una vez obtenida la membrana, tras la transferencia, se realiza una incubación
de BSA al 1% en PBS-TWEEN (7.20 g NaCl, 0.44 g K3PO4, 1.54 g Na2HPO4,
0.1%Tween por litro de agua Milli-Q). Se realizan 3 lavados de 5 minutos con 10 mL
de PBS-T. Se incuban las membranas durante 60 minutos con el anticuerpo primario en
una dilución 1:150 en BSA al 1% PBS-T. Posteriormente, se realizan 3 lavados de 5
minutos con 10 mL de PBS-T y se incuban de nuevo, 60 minutos, las membranas, con
el anticuerpo secundario proporcionado por el kit llamado 2º Antibody stock (dilución
1:300 en BSA al 1%/PBS-T). Finalmente, se realizan 3 lavados de 5 minutos con 10 mL
de PBS-T.
3.2.9. Aislamiento de RNA de tejido músculo esquelético
El aislamiento de RNA a partir de tejido de músculo esquelético de rata y ratón
se realizó con el RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit de Qiagen.
El protocolo del kit integra pasos de digestión con proteinasa K y DNasa libre de
RNasas durante el aislamiento de RNA para descomponer las proteínas y el DNA
genómico. Esto, junto a la utilización de una membrana de sílice en las columnas de
RNeasy spin proporciona una capacidad de unión de 100 μg RNA.
Figura 3.2. Esquema aislamiento de RNA de tejido músculo esquelético
Materiales y Métodos
127
a) Procedimiento
Todo el proceso se realiza en un área estéril dedicada para extracción de RNA
y con material estéril, únicamente destinado al trabajo con RNA.
Para la extracción usaremos el KIT de Qiagen RNeasy Fibrous tissue Mini
KIT #74704 con múltiples modificaciones del protocolo de este Kit que
hemos optimizado en nuestro laboratorio.
Partiremos de un fragmento congelado de músculo de 10-20 mg de peso.
b) Reactivos
Tampón RLT: Contiene tiocianato de guanidina.
Tampón RW1: Contiene etanol y una pequeña cantidad de tiocianato de
guanidina.
Tampoón RPE.
Agua libre de RNasas.
DNasa I: contiene deoxinibonucleico.
Proteinasa K.
Set DNasa libre de RNasas:
- DNasa libre de RNasas (lipofilizada).
- Tampón RDD.
- Agua libre de RNasas.
Previamente:
Reconstituir RPE con etanol puro (44 mL etanol)
Resuspender la DNasa con 550 µL de agua libre de RNasas del Kit. Para ello
se pincha la tapa del bote de la DNAsa y se introduce el agua con una
jeringuilla. Disolverlo dando vueltas al bote lentamente.
En Eppendorfs libres de RNasas, hacer alícuotas de la DNasa reconstituida
teniendo en cuenta que para cada muestra usaremos 10 µL. Guardar a -20oC.
Cada vez que usamos el Kit:
Preparamos el RLT que vamos a usar: dilución 10 µL/1 mL (10 µL de β-
mercaptoetanol / 990 µL de RLT).
El β-mercaptoetanol inhibe las RNAasas, evita que se oxide la muestra ya que
es un agente reductor.
Materiales y Métodos
128
a) Homogenización del tejido muscular
1. Pesar entre10-15 mg de músculo (pesar en frio sin descongelar).
2. Añadimos 300 µL de RLT con β-mercaptoetanol.
3. Homogeneizar a potencia máxima (Tissue Terror) subiendo y bajando el
émbolo entre 10 y 15 veces. Se homogeiniza sin hielo.
4. Dejamos los homogenados a temperatura ambiente 1 minuto.
b) Aplicación del Kit para extraer RNA
5. Añadimos a cada homogenado 590 µL de agua libre de RNasas del Kit, ya
que el RLT es tan fuerte que podría afectar a la proteinasa K.
6. Se le añade 10 µL de proteinasa K.
7. Resuspendemos 10 veces pipeteando.
8. Lo dejamos en el baño seco a 55oC 1 hora, cada 10 minutos lo agitamos 10
veces. (La proteinasa K actúa degradándolo todo excepto el RNA).
9. Mientras preparamos 50 mL de etanol puro.
10. Atemperar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
11. Centrifugamos: 3 minutos a 13.000x rpm a 22oC.
12. Recogemos el sobrenadante (evitando el contacto con el pellet) y lo
transferimos a un tubo Eppendorf. Desechamos el pellet.
13. Diluimos el sobrenadante añadiendo al mismo 600 µL de Etanol puro y lo
movemos lentamente para mezclarlo.
14. Cogemos los tubos de 2 mL + columna rosa y rotulamos.
15. Echamos en la columna 700 µL del sobrenadante. No tocar el filtro de la
columna. Este proceso se realizará en dos tandas de 700 µL.
16. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22oC. El RNA queda retenido
en la columna y tiramos lo que queda en el tubo de 2 mL. Repetir la segunda
tanda.
17. Añadimos 350 µL de RW1 en el centro de la columna.
18. Preparamos la DNasa para cada muestra: 70 µL de buffer RDD (a 4oC)+10µL
de DNasa (a -20oC). La dejamos preparada para evitar que se seque la
columna después del centrifugarlo).
19. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22oC.
Materiales y Métodos
129
20. Ponemos 80 µL de la DNasa preparada para cada muestra. Añadirlo en el
centro de la columna, pero sin llegar a tocar la membrana.
21. Dejamos que actúe la DNasa durante 15 minutos a temperatura ambiente.
22. Añadimos 350 µL de RW1 encima de la DNasa, para darle otro lavado.
23. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22oC.
24. Añadimos 500 µL RPE, también para lavar.
25. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22oC.
26. Añadimos 500 µL RPE, también para lavar.
27. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22o C.
28. Pasamos la columna a otro tubo y hacemos un centrifugado en seco: 2
minutos a 13.000x rpm a 22oC.
29. Elusión: ponemos la columna en un Eppendorf rotulado y echamos 30 µL de
agua libre de RNasas, dejando que actúe 10 minutos. Evitar que se queden
gotas de agua en el escalón previo a la columna.
30. Centrifugamos: 1 minuto a 13.000x rpm a 22oC.
31. Mientras se centrifuga cogemos una cajita con hielo.
32. Recogemos el tubo con los 30 µL. en caso de tener una muestra limitante (10
mg) es importante volver a eludir de nuevo con otros 20 µL de agua libre de
RNasas. El RNA diluido se deja sin alicuotar para emergencias.
33. Alicuotar el RNA en tubos Eppendorf estériles. Dejar en hielo.
3.2.10. Cuantificación de la concentración de RNA
Utilizamos el Thermo Scientific NanoDrop 2000, un espectrofotómetro de
amplio espectro (220-270 nm) micro volumen, que permite la retención de volúmenes
de muestras tan pequeñas como 0.5 mL con alta precisión y reproducibilidad mediante
métodos de tensión superficial.
Inicialmente se determina el blanco con agua libre de nucleasas y posteriormente
se introduce 1 µL de la muestra. Los cálculos de la concentración de RNA los realiza el
software automáticamente midiendo la absorbancia a 260nm. Posteriormente la mide a
280 nm para calcular la pureza del RNA realizando el cociente entre ambas
absorbancias: 260/280 nm, de forma que valores comprendidos entre 1.8 y 2.0 indican
que se obtuvo un RNA de buena calidad.
Las medidas se pueden exportar directamente a un ordenador en formato Excel.
Materiales y Métodos
130
3.2.11. Retrotranscripción-Amplificación del RNA (RT-PCR) en
tiempo real
En la actualidad, existen varios métodos de determinación de la expresión del
mRNA, como el Northern Blotting, la hibridación in situ, los ensayos basados en la
protección frente a las RNAsas, arrays de DNA complementario (cDNA) y
retrotranscripción-amplificación (RT-PCR) del mRNA.
Nosotros empleamos la RT-PCR para determinar la expresión del mRNA, que
consta básicamente de dos pasos:
3.2.11.1. Síntesis de cDNA: Retrotranscripción (RT)
Consiste en la obtención de una copia de DNA (cDNA) a partir de un RNA
mensajero (mRNA), el proceso inverso de la transcripción. Para ello son necesarias unas
DNA polimerasas particulares, llamadas transcriptasas inversas o retrotranscriptasas.
Las enzimas utilizadas proceden de algunos retrovirus, virus que presentan RNA como
genoma, en vez de DNA. Para poder expresar sus proteínas, han de pasar la información
a DNA.
La transcriptasa inversa utilizada en esta tesis es MultiScribe™ Reverse
Transcriptase (Applied Biosystems). Para la obtención del cDNA se llevó a cabo una
transcripción reversa usando el High-Capacity cDNA Transcription kits for 200 and
1000 Reactions (Applied Biosystems) y las condiciones recomendadas por el fabricante.
a) Reactivos
- 10X RT Buffer: específico del enzima, le permite ser activa y llevar a cabo su
función.
- 25X dNTPs (100 mM): solución de desoxinucleótidos trifosfato necesarios para
la síntesis de cDNA.
- 10X RT Random Primers: puntos de anclaje que servirán a la retrotranscriptasa
para iniciar la síntesis.
- Enzima MultiScribe TM Reverse Transcriptase (MsRT): reconoce el RNA
molde y tiene la actividad DNA polimerasa.
Materiales y Métodos
131
- Inhibidor de RNAsas.
- Agua libre de RNAsas.
b) Procedimiento
- Preparar, sobre hielo, el 2X RT Master Mix con los reactivos y sus cantidades
indicadas a continuación. Preparar de forma proporcional al número de muestras
que se tengan, teniendo en cuenta que el volumen final será de 10 μL por
muestra.
Volumen por muestra
10X Buffer 2 µL
25X dNTPsMix (100 mM) 0.8 µL
10X RandomPrimers 2 µL
Enzima MultiScibe Transcriptasa Inversa 1 µL
Inhibidor de RNAasas 1 µL
Agua libre de nucleasas 3.2 µL
Volumen final 10 µL
Tabla 3.7. Reactivos y volumen para la RT
1. Mezclar suavemente y dejar sobre hielo.
2. Preparar la reacción de la retrotranscipción.
- Pipetear 10 µL de 2X RT Master Mix en cada pocillo que vayamos a usar
de la placa de 96 pocillos.
- Añadir 10 µL de RNA (entre 1 y 3 µg/μL) y mezclar suavemente.
3. Sellar la placa para que no se contamine.
4. Centrifugar la placa para eliminar las posibles burbujas de aire que puedan
quedar en los pocillos.
Materiales y Métodos
132
5. Llevar al termociclador, el perfil de temperaturas será:
25ºC ..................................... 10 min.
37ºC ..................................... 120 min.
85ºC ..................................... 5 min.
4ºC ....................................... ∞
Tabla 3.8. Condiciones de los ciclos térmicos
3.2.11.2. Amplificación cuantitativa del RNA (RT-PCR en
tiempo real)
Una vez sintetizado el cDNA (mediante la RT) lo amplificamos por medio de la
reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés,
Polymerase Chain Reaction, técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary
Mullis (Mullis K, 1986), que permite amplificar de forma selectiva secuencias
específicas de DNA.
Basada en la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo
real (RT-PCR) permitió posteriormente la cuantificación de ácidos nucleicos con gran
exactitud y fiabilidad.
El método de PCR está basado en la síntesis de una hebra complementaria de
DNA, utilizando una cadena simple como molde. La PCR utiliza dos fragmentos cortos
de DNA (oligonucleótidos) como primers de la síntesis. Estos primers se unen
específicamente a secuencias que flanquean la región a amplificar, uno en cada una de
las cadenas del DNA.
Los requerimientos de la reacción son deoxinucleótidos (dNTPs) que
proporcionan tanto la energía como las unidades de la síntesis, una polimerasa de DNA,
primers, el DNA molde y un tampón que contenga magnesio.
Materiales y Métodos
133
El proceso básico se desarrolla en tres pasos que se repiten sucesivas veces,
según el gen a amplificar:
- Desnaturalización: separación de las cadenas complementarias del DNA.
- Unión o annealing: unión de los primers específicos a sus secuencias
complementarias. La temperatura de unión es característica de cada pareja de
primers.
- Extensión: síntesis de la hebra complementaria a partir del primer respectivo.
La repetición de este ciclo un determinado número de veces produce un aumento
exponencial de la cantidad de la región diana del DNA, que viene dado por la expresión
2n (siendo n el número de ciclos) hasta que se llega a un punto en que disminuye la
eficiencia de la enzima, y la reacción deja de ser exponencial.
a) Fundamento RT-PCR
La RT-PCR se basa en la detección y cuantificación simultánea de la
fluorescencia emitida por los productos de PCR que se acumulan durante el proceso de
amplificación. Es decir, permite ver y analizar a tiempo real la amplificación del DNA
molde.
Es actualmente el método más sensible y exacto para la detección de niveles de
mRNA, tanto en células como en tejido.
La sustancia fluorescente utilizada en nuestros experimentos es SYBR Green, el
cual se une preferentemente al DNA de doble cadena recién sintetizado en cada ciclo y
emite una fluorescencia proporcional a la concentración de DNA. La fluorescencia de
cada tubo se mide en cada ciclo, y la señal aparece claramente a partir de un número
determinado de ciclos, dependiendo de la concentración de partida. La señal es medible
por espectrofotómetro cuando sobrepasa el valor de detección límite del aparato, es
decir, cuando sobrepasa el ruido de fondo. A partir de este momento se dobla de ciclo
en ciclo.
En el caso de la PCR cuantitativa, el parámetro de medida de la expresión de un
determinado gen no es la fluorescencia, sino el ciclo en el que la amplificación
comienza a ser exponencial. Este ciclo se denomina ciclo umbral (thresold cycle, Ct),
Materiales y Métodos
134
pues es a partir del cual la amplificación empieza a ser realmente apreciable. De este
modo, los valores de ciclo umbral decrecerán linealmente conforme aumenta la cantidad
de cDNA de partida, puesto que cuanto más copias de mRNA de partida del gen
estudiado haya más cDNA se obtendrá en la retrotranscripción, y antes comenzará la
amplificación a ser exponencial.
Figura 3.3 Modelo de amplificación de PCR a tiempo real
Así pues, realizando una curva estándar de cantidades de mRNA de partida
conocidas, este método permite la cuantificación relativa de la expresión de un gen en
función de la expresión de un gen de expresión constitutiva, es decir, que no varía según
diferentes condiciones. La cuantificación absoluta supone el conocimiento del número
exacto de copias de mRNA de partida empleado para la realización de la curva estándar.
Otro método para determinar la expresión a partir de las curvas de amplificación
obtenidas consiste en la comparación de Ct. Como hemos señalado, cuanto más mRNA
de partida hay, menor es el Ct. obtenido. Este método se asemeja al método de la curva
estándar, pero utiliza fórmulas aritméticas cuya resolución conduce a la cuantificación
relativa de la expresión de un determinado gen.
b) Primers:
Los primers, u oligonucleótidos, utilizados para la amplificación de fragmentos
específicos de los genes se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific GmbH (Ulm,
Alemania). Los primers específicos usados en nuestros experimentos se muestran en la
tabla3.9.
Materiales y Métodos
135
Primers sentido Primers antisentido
Rata
MAFbx 5’- GCCTGAACTACGATGTTGCAG - 3’ 3’- GCTGGTCTTCAAGAACTTTC - 5’
MuRF1 5’- AGGTGCCTACTTGCTCCTTGT - 3’ 3’ - GCTGTTTCCACAAGCTTGGTC - 5’
Cyclophilin 5’- GTGGCAAGTCCATCTACGGAG - 3’ 3’- CCACAGTCGGAGATGGTGATC-5’
Ratón
MAFbx 5’ - GCAAACACTGCCACATTCTCTC - 3’ 5’ - CTTGAGGGGAAAGTGAGACG - 3’
MuRF1 5’ - ACCTGCTGGTGGAAAACATC - 3’ 3’ – CTTCGTGTTCCTTGCACATC -5’
Cbl-b 5’-GAGCCTCGCAGGACTATGAC-3’ 5’-CTGGCCACTTCCACGTTATT-3’
Cyclophilin 5’- AGCATGTGGTCTTTGGGAAGGTG -3’ 3’ – CTTCTTGCTGGTCTTGCCATTCC – 5’
Tabla3.9. Secuencia de los primers utilizados en la RT-PCR
c) Procedimiento
La PCR en tiempo real se realizó con el sistema de detección 7900HT Fast Real-
Time PCR System (Applied Biosystems), por duplicado en un volumen total de
reacción de 20 μL y con los pertinentes controles negativos (uno sin cDNA y otro sin
enzima Transcriptasa) con el kit Maxima™ SYBR green/ROX qPCR Master Mix
(Fermentas, Madrid, España).
Ajustamos los volúmenes de la reacción inicialmente propuestos por el kit (25
µL) a un volumen final de 20 µL, puesto que nuestro sistema lo recomienda.
Maxima SYBER Green/ROX qPCR Master Mix (2X) .......................... 10 µL
Primer sentido ......................................................................................... 0.3 µM
Primer antisentido ................................................................................... 0.3 µM
DNA molde ............................................................................................ 1 µL (≤500 ng)
Agua libre de RNAasas ........................................................................... Hasta 20 µL
Tabla 3.10. Volúmenes, por muestra, de la reacción.
d) Condiciones de amplificación
Usamos el diseño general de la placa, en el software SDS2.4 en un monitor
conectado al sistema de detección 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied
Biosystems) y programamos el termociclador con perfil térmico característico de los
primers usados. Al final de cada reacción, se realizó un análisis de la curva de fusión
para confirmar que sólo los productos específicos fueron amplificados.
Materiales y Métodos
136
El protocolo de ciclado térmico fue el mostrado en la tabla 3.9.
Paso Tiempo Temperatura Nº de ciclos
Desnaturalización
inicial 10 minutos 95ºC 1
Desnaturalización 10 segundos 95ºC 40ciclos
Unión/Extensión 60 segundos 60ºC
Curva de fusión 15 segundos 95ºC
1 15 segundos 60ºC
Tabla 3.11. Condiciones del termociclador para la RT-PCR
e) Cálculos
El ciclo umbral (Ct) se convirtió en una expresión génica relativa mediante el
uso de una curva estándar construida de muestras agrupadas. Para cada muestra, la
expresión del gen diana se normalizó con el contenido de mRNA de ciclofilina.
La fórmula logarítmica utilizada para transformar los valores de Ct tanto para los
genes estudiados y el control endógeno fue:
𝐸𝑥𝑝𝑜 =(𝐶𝑡 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜)
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Para que las eficiencias sean similares, las pendientes de ambas rectas deben ser
similares, puesto que la eficiencia de la reacción de amplificación viene dada por la
siguiente ecuación:
Eficiencia = [10(-1/pendiente)] – 1
Para una pendiente de –3.322 obtenemos una eficiencia del 100%, lo cual
significa que el aumento de un ciclo de amplificación durante la fase exponencial de la
reacción supone exactamente la duplicación del material amplificado. Una reacción de
amplificación debe tener una eficiencia lo más cercana al 100% para estar optimizada.
Materiales y Métodos
137
3.2.12. Determinación de la concentración plasmática de glucosa
mediante el método de Trinder
La cuantificación de glucosa se llevó a cabo empleando un kit enzimático de la
casa comercial Biolabo®, que utiliza el método de la glucosa oxidasa modificada por
Trinder (Trinder, 1969) para medir su concentración plasmática.
Este método está basado en la capacidad de la Glucosa Oxidasa (GOD) para
catalizar la oxidación de la glucosa a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno (H2O2).
Glucosa + O2
+ H2O Ac. Glucónico + H
2O
2
El peróxido de hidrógeno liberado, en presencia de Peroxidasa (POD), reacciona
con el cloro-4-fenol y 4-Amino-antipirina (PAP), por la reacción de Trinder, para
formar un complejo de quinoneimina roja, que absorbe entre a 500 nm.
H2O
2 + PAP + Fenol Quinona+ 4 H
2O
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa
presente en la muestra; es, por tanto, un método colorimétrico.
a) Reactivos
Vial R1: Reactivo de trabajo
Tampón fosfato ...................................... 150 mmol/L
Glucosa oxidasa (GOD) ..................... ≥20 000 UI/L
Peroxidasa (POD)................................ ≥1000 UI/L
4-Amino-antipirina (PAP) .................. 0.8 mmol/L
Cloro-4-fenol ....................................... 2 mmol/L
Vial R2: Estándar
Glucosa ................................................ 100 mg/dL (5.6 mmol/L)
b) Muestras
Las muestras utilizadas fueron de plasma recogidas en tubos de EDTA.
GO
D
POD
Materiales y Métodos
138
c) Procedimiento
El primer paso para las determinaciones de glucosa fue pipetear en tubos
eppendorf marcados como: blanco, estándar y muestras 10 μL de agua Milli-Q, 10 μL
de estándar de glucosa y 10 μL de cada una de las muestras de plasma respectivamente,
posteriormente se les añadió a cada uno de los tubos 1 mL del reactivo. La mezcla
resultante se vorteó y se incubó durante 10 minutos en un bloque de baño seco a 37ºC.
La absorbancia de la mezcla resultante se leyó en el espectrofotómetro a 500 nm
(ver tabla 3.12).
Blanco Estándar Muestra
Reactivo 1 mL 1 mL 1 mL
Agua Milli-Q 10 μL - -
Estándar - 10 μL
Muestra - - 10 μL
Incubar 10 minutos a 37ºC ó 20 monitos a temperatura ambiente
Leer las absorbancias a 500 nm contra el blanco del reactivo
La coloración es estable 15-20 minutos a 37ºC, y luego decrece lentamente
Tabla 3.12. Volúmenes, para cada una de las condiciones, de la reacción.
d) Cálculos
Los valores de glucosa se obtuvieron por comparación de absorbancias con el
estándar de glucosa de 100 mg/dL, según la siguiente fórmula:
Resultado = x concentración del estándar
Previamente se realizó el promedio de las lecturas duplicadas para cada
estándar y la muestra y se restó la media de la densidad óptica estándar cero.
Abs (Muestra)
Abs (Estándar)
Materiales y Métodos
139
3.2.13. Determinación de la actividad de NF-кBp65 en extractos
nucleares de músculo sóleo.
a) Fundamento del ELISA
La unión de NF-кB al ADN se determinó por un kit de ELISA (TransAM,
Active Motif). Esta técnica es una alternativa a la técnica de retardo en gel. Tiene la
ventaja de ser más sensible y no requieren el uso de radioisótopos. El kit contiene una
placa de 96 pocillos revestida con oligonucleótidos que contienen la secuencia de
consenso de NF-кBp65. La forma activa de NF-кB de cada una de las muestras
introducidas en cada pocillo se une específicamente a este oligonucleótido.
Seguidamente se añade un anticuerpo primario para reconocer el apítopo de NF-кB p65
sólo cuando está unido al ADN. Posteriormente se añade un anticuerpo secundario
marcado con HRP que proporciona una señal quimioluminiscente medible y
proporcional a la actividad de NF-кBp65.
b) Reactivos o componentes del kit
- Placa de ensayo de 96 pocillos.
- Anticuerpo NF-кBp65.
- Anticuerpo de HRP conjugado anti-conejo.
- Oligonucleótido wild-type AM20.
- Oligonucleótido mutado AM20.
- Control positivo de extracto nuclear.
- Dithiothreitol (DTT) (1M).
- Coctel inhibidor de proteasas.
- DNA de esperma de arenque.
- Tampón de lisado.
Materiales y Métodos
140
- Tampón de lavado concentrado (20x).
- Tampón de unión AM3.
- Tampón de unión de los anticuerpos AM2.
- Solución de revelado.
- Tampón de reacción.
- Reactivo quimioluminiscente.
- Solución de parada.
- Sellador de placas.
c) Protocolo de homogeneización
El protocolo para realizar los homogenados y separar los extractos nucleares
utilizados en este análisis se han detallado anteriormente en el apartado 3.2.4.
d) Procedimiento
Antes de iniciar el protocolo se debe reconstituir los diferentes tampones:
1.- El tampón de lisis (22.5 µL / pocillo).
- 0.11 µL de DTT.
- 0.23 µL de cóctel inhibidor proteasas.
- 22.2 µL de tampón de lisis AM2.
2.- Tampón de unión (33.8 µL / pocillo).
- 0.07 µL de DTT.
- 0.34 µL de ADN de esperma de arenque.
- 33.4 µL de tampón de unión AM3.
3.- Tampón de lavado 1X (2.025 mL / pocillo).
- 2.025 ml de agua Milli-Q.
- 225 µL de tampón de lavado 10X.
Materiales y Métodos
141
4.-Tampón de unión de los anticuerpos 1X (175 µL / pocillo).
- 202.5 µL de agua Milli-Q.
- 22.5 µL de tampón de unión de los anticuerpos 10X.
- 50 µL de anticuerpo primario o secundario.
5.-Solución quimioluminiscente (56.2 µL / pocillo).
- 37,5 µL de tampón de reacción.
- 18.7 µL reactivo quimioluminiscente.
6.- Realizar una recta patrón de rango entre 0.5 y 0 ng / µL de NF-кB p65 a
partir de una solución de 100 ng / µL, realizando as diluciones pertinentes para
obtener: 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312, 0.0156 y 0.008 ng / µL con el tampón
de lisis.
Siguiendo las instrucciones del fabricante se realizaron los pasos descritos a
continuación (Tabla 3.13).
El primer paso fue la unión a la secuencia consenso de NF-кB, para ello se
añadió a cada pocillo 30 µL de tampón de unión, posteriormente se añadieron 20 µL de
la recta patrón en los pocillos correspondientes y 20 µL de tampón de lisis en los
pocillos que marcan el blanco. Así mismo, en los pocillos correspondientes a las
muestras se añadió 20 mg del extracto nuclear en una solución de 20 µL (Ver tabla
3.13).
Se cubrió la placa con un sellador de placas y se incubó durante una hora a
temperatura ambiente sobre una plataforma giratoria a 100x rpm. Finalizado el periodo
de incubación se procedió a lavar 3 veces con 200 µL de tampón de lavado en el lavador
automático de placas ELISA (Hydroflex, TECAN).
Seguidamente se procedió a la fijación de los anticuerpos primario y secundario.
Se añadieron 100 µL de tampón que contenía el anticuerpo primario y se incubó 1 hora
a temperatura ambiente sin agitación. Después se realizaron 3 lavados con 200 µL de
tampón de lavado.
Posteriormente se añadieron 100 µL de tampón que contenía el anticuerpo
secundario conjugado con HRP y se incubó 1 hora a temperatura ambiente sin
agitación. Durante este paso preparamos la solución quimioluminiscente, para
Materiales y Métodos
142
mantenerla a temperatura ambiente hasta el revelado. Pasada la hora de incubación se
realizaron 4 lavados con 200 µL de tampón de lavado.
Y finalmente, se realizó el revelado añadiendo 100 µL de solución
quimioluminiscente a cada pocillo y se incubaron durante 3 minutos. Finalmente se
añadieron 100 µL de solución de parado y se leyó la absorbancia a una longitud
longitud de onda de 450 nm en el lector de placas Spectra Max plus 284 (Molecular
Devices) acoplado a un ordenador con el software SoftMax Pro 4.3 LS (Molecular
Devices).
PROTOCOLO DEL INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
Blanco Control positivo Muestra/Estándar
Tampón de unión 30 µL 30 µL 30 µL
Tampón de lisis 20 µL - -
Muestra/estándar - - 20 µL
Control positivo - 20 µL -
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 1 hora
Tampón de lavado Lavar la placa 3 veces con 200 μL
Anticuerpo
primario 100 μL 100 μL 100 μL
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 1 hora
Lavar la placa 3 veces con 200 μL
HRP conjugado 100 μL 100 μL 100 μL
Incubar la placa a temperatura ambiente 1 hora
Tampón de lavado Lavar la placa 4 veces con 200 μL
Solución
quimioluminiscente 100 μL 100 μL 100 μL
Incubar la placa a temperatura ambiente 3 minutos
Solución de parada 100 μL 100 μL 100 μL
Leer la placa a una longitud de onda de 450 nm
Tabla 3.13. Volúmenes, para cada una de las condiciones, de la reacción.
Materiales y Métodos
143
d) Cálculos
Los datos obtenidos tras la lectura en el Microplate Spectrophotometer se
determinaron interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones
conocidas. Los valores se expresaron como pg/mg de proteína. Previamente se realizó el
promedio de las lecturas duplicadas para cada estándar y la muestra y se restó la media
de la densidad óptica estándar cero.
3.2.14. Determinación de las concentraciones plasmáticas de 6-
keto prostaglandinas F1α
a) Fundamento del ELISA
La técnica del ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) se basa en el
uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados
resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. El kit de la marca
comercial Cayman Chemical está basado en un ELISA competitivo, donde el
componente marcado es el antígeno. En este caso el antígeno marcado con una enzima
queda insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) cuando se une al anticuerpo.
La reacción antígeno anticuerpo es fácilmente revelada mediante la adición del
substrato específico cuya reacción con la enzima producirá un color observable y
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro. El principio del ensayo se
resume en la figura 3.4.
Figura 3.4. Etapas del ELISA.
Materiales y Métodos
144
La enzima utilizada en el ensayo es la acetilcolinesterasa (AChE). Los ensayos
están basados en la competición entre el antígeno de la muestra y el antígeno conjugado
con la AChE (antígeno-tracer). Como la concentración del antígeno-tracer es constante,
y la del antígeno de la muestra varía, la densidad óptica medida será inversamente
proporcional a la concentración del antígeno problema en la muestra, ya que a mayor
concentración de antígeno en la muestra será menor la cantidad de antígeno-tracer con
AChE que se una al anticuerpo.
Absorbancia ∝[antígeno-tracer unido] ∝[1/antígeno]
Donde el antígeno en este caso es 6-keto PGF1α
La bioquímica de la AChE se basa en la hidrólisis de la acetilcolina a tiocolina,
la cual por una reacción no enzimática convierte el ácido 5.5-ditiobis-2-nitrobenzoico en
ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, compuesto que presenta una fuerte absorbancia a 410 nm.
La determinación de PGl2 fue realizada siguiendo las instrucciones del kit de
enzimo-inmunoensayo 6-ketoProstaglandin F1α EIA Kit (Cayman Chemical).
b) Reactivos o componentes del kit
- Placa de Elisa con anticuerpo anti-conejo y bloqueados con proteína.
- Antisuero 6-keto Prostaglandin F1α EIA.
- 6-keto Prostaglandin F1α AChE Tracer.
- 6-keto Prostaglandin F1α EIA estándar.
- Tampón EIA concentrado (10x).
- Tampón de lavado concentrado (400x).
- Polisorbato 20.
- Ellman’s Reagent.
- Marcador EIA tracer.
- Marcador antisuero EIA.
Materiales y Métodos
145
c) Procedimiento
Antes de iniciar el protocolo se debe reconstituir los diferentes tampones:
1.- Para la preparación del Tampón EIA concentrado (10x) disolver el vial en 90
mL de agua Milli-Q.
2.- El tampón de lavado concentrado (400x) se diluyó en 2 L de agua Milli-Q y 1
mL de polisorbato 20.
3.- Reconstituir el vial de 6-ketoProstaglandin F1α EIA estándar (100 ng/mL)
con el Tampón EIA ya reconstituido y, a partir de este, preparar la curva patrón
con concentraciones (pg/mL) que indica el kit (1000 pg/mL, 400 pg/mL, 160
pg/mL, 64 pg/mL, 25.6 pg/mL, 10.2 pg/mL, 4.1 pg/mL y 1.6 pg/mL).
4.- Reconstituir el 6-ketoProstaglandin F1α AChE Tracer con 6 mL de Tampón
EIA ya reconstituido.
5.- Reconstituir el Antisuero 6-ketoProstaglandin F1α EIA con 6 mL de Tampón
EIA ya reconstituido.
Las muestras utilizadas fueron de plasma recogido en tubos de EDTA, cada una
ellas se midió por duplicado siguiendo las instrucciones del fabricante, por lo que se
realizaron los pasos descritos a continuación (Tabla 3.14).
Se añadió a cada pocillo: 50 µL de antisuero, 50 µL de antígeno-tracer y 50 µL
de muestra con el antígeno problema o con la curva de calibrado con concentraciones de
antígeno conocidas (6-ketoProstaglandin F1α EIA estándar). Paralelamente se reservó
una fila de pocillos para realizar los blancos correspondientes, así mismo se añadió 100
µL y 50 µL de tampón EIA a los pocillos de unión no específica (NSB) y de máxima
unión (Bo) respectivamente
Una vez completada la placa se incubó durante 18 horas a 4ºC.
Materiales y Métodos
146
Antes de proceder al lavado de la placa hay que reconstituir el Ellman’s
Reagent, compuesto por la acetilcolina y el ácido 5.5-ditiobis-2-nitrobenzoico, con 20
mL de agua Milli-Q (hay que tener en cuenta que hay que usarlo el mismo día en que se
reconstituye y que hay que protegerlo de la luz cuando no se esté utilizando).
Una vez reconstituido el último reactivo, se lavó la placa 5 veces con el tampón
de lavado en el lavador automático de placas ELISA (Hydroflex, TECAN).
Posteriormente se añadieron 200 µL de Ellman’s Reagent a todos los pocillos, 5 µL de
Tracer a los pocillos de actividad total (TA) y se dejó incubar la placa 90 minutos en
oscuridad en un agitador orbital.
Finalmente se midió la absorbancia de la placa a λ= 420 nm en el lector de
placas Spectra Max plus 284 (Molecular Devices) acoplado a un ordenador con el
software SoftMax Pro 4.3 LS (Molecular Devices).
PROTOCOLO DEL INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
Blanco NSB Bo Muestra/Estándar TA
Tampón EIA - 100 µL 50 µL - -
Muestra/Estándar - - - 50 µL -
Tracer - 50 µL 50 µL 50 µL -
Antisuero - - 50 µL 50 µL -
Incubar la placa a 4oC, durante 18horas
Tampón de lavado Lavar la placa 5 veces con 300 μL
Ellman’s Reagent 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL
Tracer - - - - 5 µL
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 90 min.
Leer la placa a una longitud de onda de 420 nm
Tabla 3.14. Volúmenes, para cada una de las condiciones, de la reacción.
Materiales y Métodos
147
d) Cálculos
Los datos obtenidos tras la lectura en el Microplate Spectrophotometer se
determinaron interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones
conocidas. Los valores se expresarom como pg/mg de proteína. Previamente se realizó
el promedio de las lecturas duplicadas para cada estándar y la muestra y se restó la
media de la densidad óptica estándar cero.
3.2.15. Determinación de la concentración muscular de IL-6
a) Fundamento del ELISA
El kit RayBio ratón IL-6 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) se
basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Este
inmunoensayo, concretamente, se usa para la determinación cuantitativa de IL-6 en
tejidos homogenados de ratón. Se emplea un anticuerpo específico para IL-6 de ratón
que recubre cada uno de los 96 pocillos de la placa. La IL-6 presente en los patrones o
recta estándar y las muestras se une al anticuerpo inmovilizado del fondo de los
pocillos. Posteriormente se añade el anticuerpo biotinilado de ratón, seguido de la
estreptavidina conjugada con HRP. Finalmente la reacción antígeno anticuerpo se revela
añadiendo una solución de sustrato TMB y se desarrolla el color cuya reacción
producirá un color observable y cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro a
450 nm.
b) Reactivos o componentes del kit
- Placa de Elisa de 96 pocillos con anticuerpo anti-ratón de IL-6.
- Tampón de lavado concentrado (20x).
- 2 viales de IL-6 recombinante estándar de ratón.
- Tampón diluyente para las muestras (5x).
- Tampón diluyente del ensayo (5x).
- Anticuerpo biotinilado anti-ratón.
Materiales y Métodos
148
- Anticuerpo de estreptavidina conjugado con HRP (200x).
- Reactivo de sustrato TMB: 12 ml de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en
solución tamponada.
- Solución de parada 8 ml de ácido sulfúrico 0,2 M.
- Tampón de homogenado.
c) Protocolo de homogeneización
El protocolo para homogeneizar los músculos gastrocnemios y obtener los
extractos de proteínas totales utilizados en este análisis se han detallado anteriormente
en el apartado 3.2.5.
d) Procedimiento
Antes de iniciar el protocolo se debe reconstituir los diferentes tampones:
1.- El tampón de lavado concentrado (20x) se diluyó 20 mL con agua Milli-Q
hasta obtener 400 mL.
2.- El tampón de dilución de las muestras y el tampón de dilución del ensayo se
diluyeron 5 veces con agua Milli-Q.
3.- Reconstituir el vial de IL-6 recombinante estándar agregando 640 μL de
tampón de dilución de muestras 1x para obtener una concentración de 50 ng/mL de IL-
6. Posteriormente se añadieron 8 μL de IL-6 reconstituida a 658.8 μL de tampón de
dilución de muestras en un epperdorf, obteniendo una concentración de 600 pg/mL
como punto de partida de los estándares de IL-6. Finalmente se prepararó la recta patrón
con concentraciones (pg/mL) que indica el kit (200 pg/mL, 66.7 pg/mL, 22.2 pg/mL,
7.4 pg/mL 2.5 pg/mL, 0.82 pg/mL y 0 pg/mL) diluyendo en tampón de dilución de
muestras.
Materiales y Métodos
149
4.-Reconstituir el anticuerpo biotinilado con 100 μl del diluyente de ensayo 1x,
para obtener una solución concentrada. El anticuerpo biotinilado concentrado se diluyó
80 veces con el tampón de dilución de ensayo 1x justo antes de ser utilizado en el
procedimiento del ensayo.
5.- La estreptavidina conjugada con HRP fue diluida 200 veces con tampón de
dilución de ensayo 1x.
Siguiendo con las instrucciones del fabricante se dejaron todos los reactivos y
las muestras a temperatura ambiente y se realizó el procedimiento descrito a
continuación (tabla 3.15). Inicialmente se añadió a cada pocillo correspondiente 100 µL
de muestra (usando aproximadamente 250 µg/mL de proteínas totales) o de curva
estándar, se cubrió la placa y se incubó durante 2 horas y media a temperatura ambiente
en un agitador orbital.
Finalizado el tiempo de incubación, se lavó la placa 4 veces con 300 µL de
tampón de lavado en el lavador automático de placas ELISA (Hydroflex, TECAN).
Posteriormente se añadieron 100 µL de anticuerpo biotinilados en todos los pocillos. Y
se volvió a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital.
Después, se realizaron 4 lavados como la vez anterior.
Seguidamente se añadieron 100 µL de estreptavidina conjugada con HRP y se
dejó incubar durante 45 minutos en un agitador orbital. Se volvió a realizar otro lavado
y se añadió 100 µL de reactivo de sustrato TMB y se incubó 30 minutos a en oscuridad
en un agitador orbital.
Finalmente se agregaron 50 µL de la solución de parada y se midió la
absorbancia de la placa a λ= 450 nm en el lector de placas Spectra Max plus 284
(Molecular Devices) acoplado a un ordenador con el software SoftMax Pro 4.3 LS
(Molecular Devices).
Materiales y Métodos
150
PROTOCOLO DEL INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
Muestra/Estándar Blanco
Muestra/Estándar 100 µL -
Tampón diluyente
para muestras - 100 µL
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 2.5
horas.
Tampón de lavado Lavar la placa 4 veces con 300 μL
Anticuerpo
Biotinilado 100 µL 100 µL
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 1 hora.
Lavar la placa 4 veces con 300 μL
Estreptavidina
conjugada con HRP 100 µL 100 µL
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 45 min.
Lavar la placa 4 veces con 300 μL
TMB 100 µL 100 µL
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 30 min.
Solución de parada 50 µL 50 µL
Leer la placa a una longitud de onda de 450 nm
Tabla 3.15. Volúmenes, para cada una de las condiciones, de la reacción.
d) Cálculos
Los datos obtenidos tras la lectura en el Microplate Spectrophotometer se
determinan interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones
conocidas. Los valores se relativizaron con la concentración de proteínas de los
extractos totales del musculo y se expresan como µg/mg proteína. Previamente se
realizó el promedio de las lecturas duplicadas para cada estándar y la muestra y se restó
la media de la densidad óptica estándar cero.
Materiales y Métodos
151
3.2.16. Determinación de las concentraciones plasmáticas de
insulina
a) Fundamento del ELISA
Este inmunoensayo enzimático (EIA), de la marca SPI-Bio, se basa en la
competencia entre la insulina de rata no marcada y la acetilcolinesterasa (AChE)
vinculada a la insulina de rata (trazador).
El complejo anti-suero de cobaya-rata insulina (insulina libre o trazador) se
une al anticuerpo de cabra anti-cobaya que está unido a la placa.
La placa se lava a continuación y el reactivo de Ellman (sustrato enzimático
para la AChE y el cromógeno) se añade a los pocillos.
El trazador AChE actúa sobre el reactivo de Ellman para formar un
compuesto de color amarillo. La intensidad del color, que se determina por
espectrofotometría, es proporcional a la cantidad de trazador unido a la placa y es
inversamente proporcional a la cantidad de insulina de rata presente en el pocillo
durante la incubación inmunológica. El principio del ensayo se resume en la figura 3.5.
Figura 3.5. Etapas del ELISA
Materiales y Métodos
152
b) Reactivos o componentes del kit
- Una placa de 96 pocillos de microtitulación, pre-recubiertos con IgG de cabra
anti-cobaya, listo para ser utilizado después de la descongelación.
- Un vial de trazador de insulina de rata, liofilizado.
- Dos viales de estándar de insulina de rata, liofilizados.
- Un vial de antisuero de insulina de rata, liofilizado.
- Un vial de tampón de EIA, liofilizado.
- Un vial de tampón de lavado concentrado, líquido.
- Un vial de Tween 20, líquido.
- Dos viales de muestra de control de calidad, liofilizados.
- Dos viales de reactivo de Ellman, liofilizados.
- Una hoja de cubierta.
c) Procedimiento
Antes de iniciar el protocolo se debe reconstituir los diferentes tampones:
1.- EIA búfer: Reconstituir un vial con 50 mL de agua Milli-Q y mezclar por
inversión.
2.- Estándar insulina de rata: Reconstituir el vial con 1 mL de agua Milli-Q.
Mezclar bien mediante inversión suave. La concentración de la primera muestra
estándar es 10 ng / mL. Preparar siete tubos eppendorf (para las siete diluciones
del estándar) y añadir 500 µL de tampón EIA en cada tubo. Realizar las
diluciones pertinentes para obtener las concentraciones de la recta estándar
siguientes: 10 (S1), 5 (S2), 2.5 (S3), 1.25 (S4), 0.63 (S5), 0.31 (S6), 0.16 (S7) y
0.08 ng / mL (S8).
Materiales y Métodos
153
3.- Control de Calidad: Reconstituir un vial con 1 mL de agua Milli-Q. Mezclar
por inversión suave.
4.-Trazador de insulina de rata-AChE: Reconstituir un vial con 5 mL de tampón
de EIA. Mezclar mediante inversión suave.
5.- Antisuero de insulina de rata: Reconstituir un vial con 5 mL de tampón de
EIA. Mezclar mediante inversión suave.
6.-El tampón de lavado: Diluir 1 mL de solución de lavado concentrado a 400
mL con agua Milli-Q. Añadir 200µL de Tween 20 (Utilizar un agitador
magnético para mezclar los contenidos).
7.- Reactivo de Ellman: Cinco minutos antes de su uso, reconstituir con 50 mL
de agua Milli-Q. El contenido del tubo debe mezclarse ser completamente.
Mantener en oscuridad.
Las muestras utilizadas fueron de plasma recogido en tubos de EDTA, cada una
ellas se midió por duplicado siguiendo las instrucciones del fabricante, por lo que se
realizaron los pasos descritos a continuación (Tabla 3.16).
El primer paso fue enjuagar cada pocillo cinco veces con el tampón de lavado
(300 µl / pocillo). Justo antes de la distribución de reactivos y muestras, se eliminó el
tampón de los pocillos invirtiendo la placa y sacudiendo las últimas gotas.
Seguidamente, y después de que los reactivos habiesen alcanzado la temperatura
ambiente, se procedió a distribuir los reactivos y las muestras en la placa. La primera
columna de dejó vacía para el blanco del reactivo de Ellman.
Se depositaron 100 µL de EIA buffer en los pocillos de unión no específica
(NSB) y 50 µL en los de máxima unión (Bo).
Seguidamente se dispensaron 50 µL de cada una de las ocho diluciones de la
curva estándar (S1 a S8) en los pocillos correspondientes. El siguiente paso fue pipetear
50 µL de los controles de calidad y de las muestras en sus pocillos.
Materiales y Métodos
154
Finalmente de dispensaron 50 µL de trazador AChE de rata en todos los
pocillos, excepto en los pocillos del blanco (B) y 50 µL de antisuero de insulina de rata
en todos los pocillos, excepto en los pocillos del B y NSB.
Una vez distribuidos los anticuerpos en la placa se cubrió y se incubó durante 18
horas a 4°C.
Pasado el tiempo de incubación se reconstituyó el tampón de lavado y el reactivo
de Ellman y se vació la placa y se procedió a realizar 5 lavados con 300 µL/pocillo de
tampón de lavado.
Rápidamente se dispensaron 200 µL de reactivo de Ellman a los 96 pocillos y se
incubó la placa en oscuridad a temperatura ambiente en un agitador orbital.
La placa se leyó a 405 y 414 nm, cuando la máxima unión en los pocillos (Bo)
alcanzó una absorbancia de 0.2-0.8 unidades.
PROTOCOLO DEL INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
Blanco NSB Bo Muestra/Estándar
Tampón EIA - 100 µL 50 µL -
Muestra/Estándar - - - 50 µL
Trazador - 50 µL 50 µL 50 µL
Antisuero - - 50 µL 50 µL
Incubar la placa a 4oC, durante 18horas
Tampón de lavado Lavar la placa 5 veces con 300 μL
Tampón de Ellman 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL
Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente
en oscuridad.
Leer la placa a una longitud de onda de entre 405 y 414 nm
Tabla 3.16. Volúmenes, para cada una de las condiciones, de la reacción.
d) Cálculos
Los datos obtenidos tras la lectura en el Microplate Spectrophotometer se
determinan interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones
conocidas.
Materiales y Métodos
155
3.2.17. Determinación de las concentraciones plasmáticas de
fructosamina
a) Fundamento del ELISA
Para la determinación cuantitativa de la concentración de fructosamina en
plasma de las ratas diabéticas se utilizó el kit de la casa comercial MyBioSource anti-
fructosamina.
Este ensayo emplea la técnica de inmunoensayo enzimático cuantitativo. El kit
contiene una placa de 96 pocillos revestida con el anticuerpo específico para la
fructosamina; en los que se pipetearán las muestras y los estándares, momento en el que
la fructosamina presente en las muestras y patrones se unirán al anticuerpo inmovilizado
de la placa.
Después de la eliminación de las sustancias no unidas, se añade un anticuerpo
específico conjugado con biotina a los pocillos. Después del lavado, se añadió avidina
conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) a los pocillos.
Después de un lavado para eliminar cualquier reactivo de avidina-enzima no unido, se
añade una solución de sustrato a los pocillos y se desarrolla el color en proporción a la
cantidad de fructosamina unida en el paso inicial. El desarrollo del color se detiene y se
mide la intensidad del color.
El rango de detección del kit es entre 31,25 nmol/mL - 2000 nmol/mL.
b) Reactivos o componentes del kit
- Placa de ensayo.
- Estándar (secado por congelación).
- Biotina-anticuerpo (100 x concentrado).
- HRP-avidina (100 x concentrado).
- Diluyente de biotina-anticuerpo.
- Diluyente de avidina-HRP.
- Diluyente de Muestra.
Materiales y Métodos
156
- Tampón de lavado (25 x concentrado).
- Sustrato TMB.
- Solución de parada.
c) Procedimiento
Antes de iniciar el protocolo se debe reconstituir los diferentes tampones:
1.- Anticuerpo de Biotina (1x): Centrifugar el vial antes de abrirlo.
El anticuerpo de Biotina requiere una dilución de 100 veces. Por lo que se
añadió 10 μL de anticuerpo de biotina a 990 µL de diluyente de anticuerpo de
biotina.
2.- HRP- Avidina (1x): Centrifugar el vial antes de abrirlo.
La avidina-HRP requiere una dilución de 100 veces. Ser añadió 10 μL de
avidina-HRP a 990 µL de diluyente de avidina - HRP.
3. Buffer de lavado (1x): Atemperar a temperatura ambiente y mezclar
suavemente hasta que los cristales se han disuelto completamente. Diluir 20 mL
de Buffer de Lavado Concentrado (25x) en agua Milli-Q para preparar 500 mL
de tampón de lavado (1x).
4. -Estándar: Centrifugar el vial estándar en 6000 – 10000x rpm durante 30
segundos. Reconstituir el estándar con 1.0 mL de disolvente de muestras. Esta
reconstitución produce una solución madre de 2.000 nmol / mL. Mezclar durante
un mínimo de 15 minutos con agitación suave antes de hacer diluciones.
Pipetear 250 µL de diluyente de la muestra en cada tubo (S0 -S6). Utilizar la
solución madre para producir una serie de diluciones ½, para obtener las
concentraciones de 2000, 1000, 500, 250, 125,62.5, 31.25 nmol/mL. El diluyente
de muestra sirve como el patrón cero (0 nmol / mL).
Materiales y Métodos
157
Las muestras utilizadas fueron de plasma recogido en tubos de EDTA. Para el
ensayo se realizó una dilución de las mismas de 1/5 con el diluyente de muestras. Cada
una de las muestras se midió por duplicado siguiendo las instrucciones del fabricante,
por lo que se realizaron los pasos descritos a continuación (Tabla 3.17).
Antes de iniciar el ensayo hay que dejar todos reactivos y muestras a
temperatura ambiente, así como centrifugar la muestra de nuevo después de la
descongelación antes del ensayo.
El primer paso realizado fue añadir 100 μL del estándar y la muestra por pocillo.
Se cubrió la placa y se incubó durante 2 horas a 37°C. Pasado el tiempo de incubación
se eliminó el líquido de los pocillos, sin proceder a lavarlos.
Seguidamente se añadió 100 μL de anticuerpo de biotina (1x) a cada pocillo. Se
volvió a cubrir la placa y se incubó durante 1 hora a 37°C.
Se volvió a aspirar cada uno de los pocillos, se realizaron 3 lavados con 200 μL
de tampón de lavado y se dejó reposar la placa durante 2 minutos.
El siguiente paso fue añadir 100 μL de avidina-HRP (1x) a cada pocillo. Se
volvió a cubrir la placa y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación se
realizaron 5 lavados con 200 μL de tampón de lavado y se añadieron 90 μL de sustrato
TMB a cada pocillo. Y se volvió a incubar durante 15-30 minutos a 37°C en oscuridad.
Finalmenre se añadieron 50 μL de solución de parada a cada pocillo, se mezcló
bien y se determinó la densidad óptica de cada pocillo pasados 5 minutos, utilizando un
lector de microplacas ajustado a 450 nm. Después se volvió a medir a 540 nm y se
restaron estas lecturas a las de 450 nm para corregir las imperfecciones ópticas en la
placa, ya que las lecturas realizadas directamente a 450 nm sin corrección pueden ser
mayores y menos precisas.
Materiales y Métodos
158
PROTOCOLO DEL INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO
Muestra/Estándar
Muestra/Estándar 200 µL
Desechar el líquido de cada uno de los pocillos
Anticuerpo Biotina(1x) 100 µL
Tampón de lavado Lavar la placa 3 veces con 200 µL
Avidina-HRP(1x) 100 µL
Tampón de lavado Lavar la placa 5 veces con 200 μL
Incubar la placa 1 hora a 37ºC
Sustrato TMB 90 µL
Incubar la placa 15-30 min. A 37ºC en oscuridad
Solución de parada 50 µL
Esperar 5 minutos
Leer la placa a una longitud de onda de 450 nm
Leer la placa a una longitud de onda de 540 nm
Tabla 3.17. Volúmenes, para cada una de las condiciones, de la reacción.
d) Cálculos
Los datos obtenidos tras la lectura en el Microplate Spectrophotometer se
determinan interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones
conocidas. Previamente se realizó el promedio de las lecturas duplicadas para cada
estándar y la muestra y se restó la media de la densidad óptica estándar cero.
3.2.18. Inclusión de muestras para el estudio histológico
El análisis histológico se realizó sobre muestras de tejido de músculo esquelético
fijadas, por inmersión, en formaldehído al 4 % para mantener las estructuras celulares y
moleculares.
Tras la fijación se procedió a incluir el músculo sóleo en parafina para
posteriormente obtener secciones. La parafina es una mezcla de hidrocarburos
saturados, sólida a temperatura ambiente y con un punto de fusión entre en torno a los
Materiales y Métodos
159
60°C, según su composición. La parafina no es miscible con agua, mientras que todos
los tejidos están formados principalmente por agua. Esto implica que para que la
parafina líquida pudiese penetrar completamente en el tejido el agua del músculo fue
sustituida por un solvente orgánico mediante la deshidratación del sóleo en etanol, de
gradación creciente hasta etanol de 100°. Posteriormente se procedió al aclaramiento,
donde se transfirió al xilol, miscible tanto con el etanol de 100° como con la parafina.
Por último se procedió a la inclusión del sóleo, al músculo se le realizaron tres
pases por parafina licuada para favorecer una buena impregnación. Tras el
embebimiento completo de la muestra se vertió parafina líquida en un molde, se
introdujo el sóleo en posición vertical para, que a la hora de cortar, poder obtener cortes
transversales del músculo, y se dejó solidificar mediante enfriamiento lento a
temperatura ambiente sobre una plataforma a unos 10º-15ºC.
Materiales y Métodos
160
El protocolo de inclusión en parafina fue el siguiente:
Figura 3.6. Esquema de la inclusión en parafina de una muestra de sóleo previamente fijada.
Parafina líquida en molde Encastramiento del sóleo en vertical y enfriamiento
Estufa a 60ºC
Materiales y Métodos
161
3.2.19. Corte sobre bloque de parafina
Posteriormente se desbastaron los bloques y se dejaron en hielo para ser cortados
secciones de 5 micras en un microtomo de rotación. Para facilitar el estiramiento de las
secciones histológicas se colocaron sobre agua con etanol y finalmente por un baño de
agua caliente a 50ºC, gracias a las fuerzas de tensión superficial que se generan en la
lámina de parafina y el tejido al hacerla flotar sobre el líquido. Finalmente se colocaron
sobre portaobjetos con Poly-L-lisina.
Una vez montados los cortes sobre portaobjetos, y antes de iniciar su proceso de
coloración, las preparaciones son secadas meticulosamente para evitar su
desprendimiento. La desecación se realizó dejando las muestras en una estufa a 37ºC,
hasta el día siguiente.
3.2.20. Estudio de la atrofia muscular: Técnicas morfológicas e
inmunohistoquímicas
Para el estudio del tamaño del área de la sección transversal del sóleo de rata y
ratón se realizaron técnicas convencionales de morfología: Reticulina de Gomori y
Hematoxilina-Eosina, respectivamente; para el estudio del tamaño de las fibras tipo II
en rata se realizó la reacción del ácido periódico de Schiff (PAS); para el estudio del
tamaño de las fibras tipo I en ratón se realizó un estudio inmunohistoquímico utilizando
la técnica de la Avidina-biotina-peroxidasa con un anticuerpo primario de cadena
pesada de miosina de las fibras tipo I.
3.2.20.1. Tinción de Reticulina de Gomori
a) Fundamento
Se trata de una técnica de impregnación argéntica en dos tiempos que utiliza
como base fuerte el hidróxido potásico y como agente reductor el formol. Antes de la
impregnación se realiza una oxidación con permanganato potásico al 1% seguida de
blanqueamiento con metabisulfito potásico al 2% y un mordentaje con alumbre férrico
al 2%.
Materiales y Métodos
162
Se utilizan cortes en parafina, congelación o en celoidina.
b) Reactivos
- Solución acuosa de permanganato potásico al 1%.
- Solución acuosa de metabilsufato potásico al 2%.
- Solución acuosa de alumbre férrico al 2% preparada antes de usar.
- Complejo de plata amoniacal diluido, durante tiempo limitado, en un
volumen igual de agua destilada. Se toman 10 mL de una solución de nitrato
de plata al 10%, se añaden 2 mL de hidróxido potásico al 10%; el
precipitado que se forma se disuelve con amoníaco concentrado, después se
añade nitrato de plata hasta que empiece a formarse de nuevo el precipitado;
diluir con agua a partes iguales.
- Formol al 10%.
- Solución acuosa de hiposulfito al 2%.
c) Procedimiento
1. Desparafinar, no colodionar, hidratar.
2. Oxidar durante 1 ó 2 minutos con el permanganato potásico.
3. Lavar con agua corriente.
4. Blanquear con metabisulfito.
5. Lavar con abundante agua corriente.
6. Tratar con una solución de alumbre férrico durante 1 minuto.
7. Lavar con agua corriente durante 5 minutos.
8. Lavar dos veces con agua destilada.
9. Tratar durante un minuto con el complejo argéntico.
10. Lavar con agua destilada, como máximo 10 segundos.
11. Reducir con formol.
12. Lavar con agua corriente.
Materiales y Métodos
163
13. Pasar rápidamente por la solución de hiposulfito.
14. Lavar con abundante agua corriente.
15. Deshidratar y montar.
d) Resultados
- Fibras reticulares .......................................................... Negro
- Fibras colágenas ............................................................ Amarillento
Observaciones: El caso de un viraje con el oro, como el método Ramón y Cajal,
las fibras colágenas muestran una tonalidad más purpúrea.
Hay que resaltar que el resultado óptimo de este método depende del lavado que
precede a la reducción por el formol, debiendo determinarse empíricamente la duración
de este lavado.
3.2.20.2. Tinción de Hematoxilina-Eosina
a) Fundamento
Esta técnica tiñe en conjunto los tejidos, en concreto de matices rosados y rojos
que provoca la coloración de la eosina sobre el citoplasma y el tejido conjuntivo, a lo
que se une la excelente definición nuclear originada por la hematoxilina de teñidos de
tonos morados.
b) Reactivos
Hematoxilina de Harris
- Hematoxilina (cristalizada) ................................................. 1 g
- Etanol absoluto .................................................................... 10 mL
Disolver calentando suavemente:
- Alumbre de potasio o amónico ............................................ 20 g
- Agua Milli-Q ........................................................................ 200 mL
Materiales y Métodos
164
Disolver en caliente. Añadir la solución de hematoxilina y llevar a ebullición.
Cuando comienza a hervir se añade:
- Óxido rojo de mercurio ....................................................... 0.5 g
Dejar disolver el óxido removiendo lentamente hasta que la solución adquiera color
púrpura.
Sumergir inmediatamente en agua fría. Cuando la solución se haya enfriado, filtrar
y añadir:
- Ácido acético glacial ........................................................... 10 mL
Observaciones: Filtrar de nuevo antes de usarla. Almacenar en frasco opaco bien
cerrado.
Eosina
Disolver:
- Eosina Amarillenta .............................................................. 1 g
- Agua .................................................................................... 100 mL
Añadir:
- Ácido acético glacial ........................................................... 1 mL
Observaciones: Está comprobado que el empleo de agua corriente provoca una
coloración más profunda de las estructuras eosinófilas. En este caso debe añadirse a
la solución de eosina algunas gotas de formaldehído puro para garantizar la
conservación.
- Alcohol clorhídrico al 0.5 %
- Bicarbonato de sodio o de litio al 1%
- Agua acética
c) Procedimiento
1. Desparafinar e hidratar las secciones
2. (3 pases de 5 minutos por xiloles y 4 pases de 5 minutos por alcoholes)
3. Teñir con hematoxilina de 3 a 5 minutos
Materiales y Métodos
165
4. Lavar en agua corriente y diferenciar con alcohol clorhídrico al 0.5%
5. Neutralizar con Bicarbonato de sodio o carbonato de litio al 1%
6. Lavar abundantemente con agua corriente durante 5 minutos.
7. Lavar con agua Milli-Q y teñir con eosina durante 2-3 minutos.
8. Lavar en agua acética al 1%, lavar con agua Milli-Q.
9. Deshidratar en 3 pases de 5 minutos en alcoholes, aclarar con 3 pases de 5
minutos en xiloles
10. Cubrir con entelan.
d) Resultados
- Núcleos ................................................................................ Azul/negro
- Eritrocitos ............................................................................ Naranja a rosa
- Restantes estructuras ............................................................ Rosado a rojo
3.2.20.3. Reacción del ácido periódico de Schiff (PAS) (Hotchkiss,
McManus y Lille, 1948)
a) Fundamento
Esta tinción sirve para demostrar la presencia de glucógeno en las células, por
ello la utilizamos para teñir y medir las fibras tipo II caracterizadas por ser más
dependientes de la glucolisis anaerobia como fuente de energía que las de tipo I; por lo
que poseen una mayor actividad de las enzimas glucolíticas.
La técnica consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico para
incrementar el número de los grupos carbonilos (aldehídos o cetonas) presentes en ellos,
de forma que puedan ser demostrado posteriormente mediante el reactivo de Schiff. Los
hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados en una
proporción aproximada de uno por molécula de monosacárido. Precisamente por ello es
necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos grupos, que sólo pueden ser
detectados por el reactivo de Schiff si se encuentran situados en carbonos contiguos y
delimitados por grupos alcohólicos o amino.
Materiales y Métodos
166
Para los grupos aldehídos que aparecen en posición 1.2 glicol estas condiciones
se cumplen exclusivamente tras la oxidación de los correspondientes radicales
hidroxilos.
El agente oxidante es generalmente el ácido periódico, aunque en alguna
variante puede utilizarse el ácido crómico.
Reactivo de Schiff:
Se obtiene a partir de la fucsina básica la cual es tratada con ácido sulfuroso, que
hace desaparecer un doble enlace existente en el centro de la molécula, lo que origina
que se trasmute a una sustancia incolora ácido sulfofucsínico o reactivo de Schiff.
Cuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehídicos contiguos
flanqueados por los correspondientes radicales OH, aparece de nuevo el doble enlace
(grupo cromóforo) y, con él, la coloración rojo fucsia característica.
Mediante estudios de espectrofotometría se ha podido concluir que, para un
correcto desarrollo de la reacción, es necesario que ambos grupos aldehídos se
encuentren a una distancia cifrada entre 1 y 1.1 nm, similar a la que separa a los dos
radicales bencénicos de la fucsina.
b) Reactivos
- Ácido periódico .................................................................... al 0.5%
- Reactivo de Shiff
Puede adquirirse comercialmente o fabricarse según el procedimiento:
- Fuscina básica ................................................ 1 g
- Agua Milli-Q ................................................... 200 mL
Llevar hasta ebullición el agua Milli-Q y añadir la fucsina. Disolver y enfriar a
50ºC, filtrar y añadir:
- Metabisulfato sódico anhidro ............................................... 1 g
Dejar en reposo 24 horas (la solución debe tomar un color rosa pálido) y filtrar
a través de carbón activado, lo cual debe decolorarla.
Almacenar en refrigerador.
Materiales y Métodos
167
- Baño de ácido sulfuroso
- Ácido clorhídrico 1N ...................................... 5 mL
- Metabisulfito sódico 10% ............................... 6 mL
- AguaMilli-Q .................................................... 100 mL
- Hematoxilina de Harris.
c) Procedimiento
1. Desparafinar e hidratar
2. Ácido periódico al 0.5%, 5 minutos
3. Lavado en agua Milli-Q.
4. Reactivo de Shiff, de 15 a 30 minutos.
5. Aclarar en tres cambios de baño sulfuroso, 2 minutos en cada uno.
6. Lavar en agua corriente durante 5 minutos.
7. Hematoxilina da Harris, de 30 a 60 segundos.
8. Lavar en agua corriente durante 5 minutos.
9. Deshidratar, aclarar y montar.
d) Resultados
- Núcleos ............................................................................. Azul
- Material PAS positivo ....................................................... Magenta (fucsina)
3.2.20.4. Estudio inmunohistoquímico
Las técnicas inmunohistoquímicas son técnicas de inmunolocalización que
utilizan una enzima como trazador del marcaje. Por este motivo, el lugar de la reacción
antígeno-anticuerpo se visualiza añadiendo al final de la reacción el sustrato de la
enzima más una sustancia denominada cromógeno. El producto originado al actuar la
enzima sobre el sustrato interacciona a su vez sobre el cromógeno y da lugar a un
precipitado insoluble y coloreado, al igual que ocurre en todas las reacciones
histoenzimológicas. Como trazadores pueden emplearse distintos tipos de enzimas.
Materiales y Métodos
168
En esta tesis en las secciones incluidas en parafina se realizó el estudio
inmunohistoquímico empleando la técnica de la Avidina-biotina-peroxidasa (ABC), con
algunas modificaciones. El anticuerpo utilizado ha sido de la cadena pesada de miosina
de las fibras tipo I (Tabla 3.18.).
Anticuerpo Dilución Tampón Pretratamiento Casa comercial
MHC I 1/4000 Citrato 1/10 Autoclave SIGMA
Tabla 3.18. Relación de anticuerpo primario.
a) Fundamento
La técnica de la Avidina-biotina-peroxidasa se trata de una serie de
procedimientos técnicos muy sensibles que utilizan anticuerpo marcados y se basan en
la gran afinidad que entre sí poseen las moléculas de biotina y las de avidina, de forma
que se genera un fuerte enlace no inmune.
Aunque tanto la avidina como la biotina pueden unirse a anticuerpos o
moléculas enzimáticas, es la biotina la que normalmente se conjuga con los primeros.
En todos los métodos inmunoenzimáticos que utilizan el procedimiento de
avidina y biotina para poner de manifiesto una reacción antígeno-anticuerpo, es posible
realizar el marcaje con biotina del anticuerpo primario (técnica directa) o, lo que es
mucho más habitual, del anticuerpo secundario (técnica indirecta).
La fase no inmunológica del proceso puede implicar:
a) Realizar una unión del anticuerpo biotinilado con avidina sin marcar para
ligar a continuación el complejo con una enzima también biotinilada (método puente
avidina-biotina).
b) Aplicar un complejo de avidina y trazador enzimático biotinilado que
contenga lugares de unión libres en la avidina para que se produzca la fijación sobre el
anticuerpo primario o secundario biotinilado (método de complejo avidina-biotina o
ABC, el cual ha sido utilizado en la presente tesis).
En todas las variantes puede unirse un gran número de moléculas de biotina a un
anticuerpo único, por lo que la proporción trazador/anticuerpo es muy elevada; esto
hace que la sensibilidad de este tipo de métodos sea muy alta y permite que el
anticuerpo primario pueda emplearse muy diluido.
Materiales y Métodos
169
b) El protocolo
1. Calentar los cortes en estufa (60ºC)
2. Desparafinar con xilol (3 pasos de 10 minutos)
3. Hidratar con alcoholes graduales (90º, 80º, 70º, 5 minutos cada pase).
Lavar con agua Milli-Q
4. Tratar con autoclave para producir el desenmascaramiento antigénico, en
tampón citrato (1/10) (Epitrope retrieval solution 10X) 3 minutos a 1.5 atm.
Dejar enfriar las muestras entre 20 y 40 minutos, por inmersión de la cubeta
en agua fría.
Lavar con agua Milli-Q.
5. Inhibir de la actividad peroxidasa endógena (metanol + H2O2 3%) 20
minutos en oscuridad.
Lavar con agua Milli-Q.
6. Cerclar las preparaciones con sigmacote rodeando el corte, para la
retención de líquidos.
7. Cubrir los cortes con el anticuerpo primario diluido en diluyente
comercializado (DAKO Antibody Diluent Envision). Incubación una hora.
Lavar con agua Milli-Q
8. Cubrir los cortes con anticuerpo secundario universal biotinilado.
Incubación 20 minutos.
Lavar con agua Milli-Q.
9. Cubrir los cortes con estreptavidina conjugada con peroxidasa, que tiene
avidez con la biotina. Incubación 20 minutos.
Lavar con agua Milli-Q.
10. Revelar con diaminobenzidina tetrahidroclorhídrica (DAB) entre 1 y 5
minutos.
Lavar en agua Milli-Q.
11. Contrastar con hematoxilina de Harris, 30 segundos.
Materiales y Métodos
170
12. Lavar en agua corriente.
13. Deshidratar con alcoholes graduales (70º, 80º, 90º, pases de 5 minutos) y
xiloles (3 pases de 5 minutos)
14. Montar los cubreobjetos con entelan.
3.2.21. Valoración de los resultados histológicos
Los tejidos procesados se observaron en el fotomicroscopio óptico, LEICA
DMD 108. Para la medición del área transversal del sóleo en las muestras de rata se
capturaron imágenes al 4x (fotografías de 2048 x 1536 pixeles), en cambio para su
medición en las muestras de ratón solamente se requirió una fotografía.
Para medir el diámetro menor de las fibras tipo I en los sóleos de ratón se
capturó un barrido ordenado de imágenes al 20x de todo el corte transversal del sóleo
(fotografías de 2048 x 1536 pixeles).
Todas las fotografías se montaron con la función photomerge del programa
Adobe Photoshop, obteniendo una única imagen de 22-38 Megapixeles a 20x del corte
transversal del sóleo (ver figura 3.7.).
Figura 3.7. Esquema del montaje de la imagen del corte transversal del sóleo completo.
Materiales y Métodos
171
Finalmente el programa utilizado para cuantificar los resultados histológicos fue
el software Image Pro.Plus.6 de Media Cybernetics.
Figura 3.8. Imágenes de la medición del tamaño de las fibras tipo I.
Materiales y Métodos
172
3.3 Análisis estadístico de los resultados
Los resultados se expresan mediante la media aritmética y la desviación estándar
de la media (S.D.) del número de ensayos o determinaciones en cada experimento. La
normalidad de la distribución de las variables se analizó mediante el test de Normalidad.
Para la comparación de los distintos grupos experimentales se aplicó el método
de análisis de la varianza, mediante el test ANOVA de uno o dos factores. Cuando se
encontró un efecto en la interacción, la prueba post hoc Bonferroni’s fue realizada para
determinar donde se encontraban las diferencias significativas.
Los datos que no cumplieron con la distribución normal fueron analizados con la
prueba no paramétrica de un ANOVA de un factor de Rangos y las comparaciones se
realizaron con la prueba post hoc Fisher LSD o Turkey para identificar diferencias
significativas.
Los niveles de alfa para la significación estadística fueron p<0.05. Se utilizó el
programa Sigma Stat 3.5 para los análisis estadísticos.
RESULTS
Results
175
The results obtained during the development of this thesis are presented below
divided into four parts, which coincide with the experiments and the different groups of
animals described in the Materials and Methods section.
After each section it has been included a summary, in order to get an overview
and stand out the physiological relevance of the results presented.
4.1. Study No. 1: Effect of 14 days of hindlimb unloading in
skeletal muscle atrophy in male Wistar rats. Prevention by allopurinol.
As it has been described in the materials and methods sections, the experimental
groups used in the next study and their respective abbreviations are:
Control with water: CW
Control with allopurinol: CA
Hindlimb unloading with water: UW
Hindlimb unloading with allopurinol: UA
4.1.1. Allopurinol prevents soleus muscle atrophy after 14 days of hindlimb
unloading in rats.
We used different methods to determine the role of XO in the hindlimb
unloading-induced soleus muscle atrophy.
Hindlimb suspension for 14 days caused a significant decrease in the cross
sectional area of soleus muscle. Administration of allopurinol significantly prevented
this decrement (Figure 4.1, panels A and B).
In the same way, we found a significant decrease in the minimum diameter of
the type I muscle fibers. Allopurinol partially prevented this reduction in the size of the
individual myofibers (Figure 4.1, panels C and D).
Results
176
A
B
CW CA
UA UW
Results
177
Figure 4.1. (A) Reticulin staining (Original magnification, 4x. Scale bar, 1 mm). (C) Staining of periodic
acid-Schiff (type II fibers were deeply stained, while type I were lightly stained. Original magnification,
20x. Scale bar, 100.00 µm). Panel B and D represent the quantitative analyses of the cross-sectional area
and the minimum diameter of type I fibers in the soleus muscle of the different experimental groups: CW
(n = 3), CA (n = 3), UW (n = 3), and UA (n = 3). A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
C
D
Results
178
Moreover, soleus muscle to body mass ratio was significantly reduced after 14
days of unloading (-49%, p<0.001). This muscle atrophy was reduced to only 30% in
the allopurinol treated animals (p<0.01 vs unloaded group with water). Allopurinol did
not affect soleus muscle mass in the control group (Figure 4.2, panel A). We further
tested the effect of inhibiting XO in the maintenance of muscle integrity by determining
the protein content of an important component of the sarcomere, the slow MHC protein.
Figure 4.2, panel B, shows that after unloading there was a significant decrease in the
protein content of MHC in soleus muscle. In this case we did not find a prevention after
treatment with allopurinol.
Figure 4.2. (A) Soleus muscle to body mass ratio. Values are mean (±SD) in CW (n = 9), CA (n = 9),
UW (n = 7), and UA (n = 7). (B) Western blot and densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin
heavy chain in soleus muscle of CW (n = 3), CA (n = 3), UW (n = 3), and UA (n = 3) groups in rats. A
two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant
differences.
A
B
Results
179
4.1.2. Hindlimb unloading increases plasma and soleus muscle XO activity.
Prevention by allopurinol.
Rat plasma (Figure 4.3A) and soleus muscle (Figure 4.3B) XO activity increased
significantly after 2 weeks of hindlimb unloading. As expected, treatment with
allopurinol completely inhibited XO activation both in plasma and in skeletal muscle.
Figure 4.3. Mean (±SD) results of XO activity in plasma (A) and soleus muscle (B) of CW (n=9), CA
(n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
A
Results
180
4.1.3. Effect of unloading and allopurinol administration on protein levels of
soleus muscle antioxidant enzymes.
Hindlimb unloading increased the protein levels of the cytosolic Cu,ZnSOD
(+43.9%) in the soleus muscle of the rats (Figure 4.4A). Catalase protein levels were
also elevated (+39%, p<0.01) in the soleus muscle of the unloaded animals (Figure
4.4B). Treatment with allopurinol did not prevent the unloading-induced increase of
these antioxidant enzymes.
Figure 4.4. Mean (±SD) results of Cu,ZnSOD (A) and Catalase (B) in soleus muscle of CW (n=9), CA
(n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
181
4.1.4. Effect of unloading and allopurinol administration on plasma levels of
MDA.
Having established that there is a difference in the induction of the antioxidant
enzymes in the various groups studied, we determined whether these differences were
also translated into differences in oxidative damage to biomolecules such as lipids.
To assess oxidative damage in our study, we determined lipid peroxidation
levels (like MDA). Plasma MDA levels were determined by using the HPLC technique.
Figure 4.5 shows significant differences between the control and unloaded with water
groups. The increment in plasma peroxidation is partially inhibited in the unloaded with
allopurinol group. Surprisingly control with allopurinol treatment showed statistically
significant increased MDA levels.
Figure 4.5. Mean (±SD) results of MDA levels in plasma of CW (n=9), CA (n=9), UW (n=7), and UA
(n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify
statistically significant differences.
Results
182
4.1.5. Effect of unloading and allopurinol administration on soleus muscle
and plasma protein carbonylation.
In this case, we wanted to measure other oxidative damage to biomolecules such
as proteins.
As shown in Figure 4.6, hindlimb unloading caused a significant increase in
skeletal muscle carbonylation of proteins. A protein(s) with a molecular weight of 65
kDa was significantly carbonylated in the muscle of unloaded rats (Figure 4.6A). We
also determined plasma protein carbonylation in our animals. Figure 4.6B shows a
significant increase in the carbonylation of low-molecular weight proteins (less than 50
kDa) in the samples of the unloaded animals that received water. A trend for allopurinol
prevention of protein oxidation was found although it did not reach statistical
significance either in the soleus or in plasma samples.
Figure 4.6. Mean (±SD) results of soleus muscle carbonylated proteins (A) of CW (n=9), CA (n=9), UW
(n=7), and UA (n=7) groups in rats. Panel B represents carbonylation of low-molecular weight protein
(less than 50 kDa) in plasma of the same animals. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
65kDa
50kDa
B
Ponceau
Results
183
4.1.6. Effect of unloading and allopurinol treatment on the activation of
p38-MAPK
We tested whether XO-derived ROS were involved in the activation of p38-
MAPK in soleus muscle. We found that phosphorylation of p38-MAPKinase increases
in the soleus muscle of the unloaded animals (Figure 4.7). Allopurinol treatment
completely prevented the p38 phosphorylation. Total p38 protein levels were unaltered
in the different experimental groups.
Figure 4.7. Mean (±SD) results of cytosolic p-p38-MAPK in soleus muscle of CW (n=9), CA (n=9), UW
(n=7), and UA (n=7) groups in rats. Activation levels were expressed as the ratio between phosphorylated
and total protein content. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to
identify statistically significant differences.
Results
184
4.1.7. Effect of unloading and allopurinol treatment on the activation of NF-
кB p65
We wanted to see if the XO-derived ROS induced the activation of the
inflammatory transcription factor NF-кB. We found that the phosphorylation NF-кBp65
was increased (+352%, p<0.001) in the cytosolic fractions of the soleus in the unloaded
animals. Allopurinol administration decreased by 178% this activation (Figure 4.8).
Figure 4.8. Mean (±SD) results of cytosolic phosphorylation NF-кBp65 in soleus muscle of CW (n=9),
CA (n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
185
In view of this result we measured the p65 protein levels in the nuclear fraction
of the soleus muscle; we observed that both NF-кBp65 protein content and NF-кB
activity (determined by ELISA) were increased after 14 days of hindlimb unloading
(Figure 4.9A and 4.9B, respectively). Allopurinol treatment reduced NF-кB activity
without a concomitant prevention of p65 nuclear translocation. We also found a striking
significant increase in the p65 nuclear protein levels in the control animals treated with
allopurinol.
Figure 4.9. Mean (±SD) results of nuclear translocation of NF-кBp65 (A) and relative NF-кBp65 activity
(B) in soleus muscle of CW (n=9), CA (n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor
ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
The content of α-actin, a housekeeping protein marker in muscle, was not altered
in the various treatment groups of rats (data not shown).
A
B
Results
186
4.1.8. Effect of unloading and allopurinol treatment on the MAFbx and
MuRF-1 mRNA levels in soleus muscle
Finally to identify the mechanism by which allopurinol prevents the loss of
muscle mass after hindlimb unloading we determined the expression, in soleus muscle,
of two well-known muscle specific E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx and MuRF-1
(Foletta et al., 2011). As shown in Figure 4.10A we found a very significant increase in
MAFbx mRNA expression in the soleus muscle of the unloaded animals and a
significant prevention after treatment with allopurinol. Regarding MuRF-1, our results
show that hindlimb unloading induced its expression in the soleus muscle. However,
although a tendency was found (p=0.086), we found no prevention after allopurinol
treatment.
Figure 4.10. Mean (±SD) results of MAFbx (A) and MuRF1 (B) mRNA levels in soleus muscle of CW
(n=9), CA (n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc
Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
187
4.1.9. Summary
Collectively, as summarized in figure 4.11, our data suggest that XO-induced
oxidative stress is involved in the activation of the p38 MAPK-MAFbx pathway in
unloading-induced skeletal muscle atrophy. We have found that allopurinol treatment
completely prevents the activation of XO but partially prevents the protein
carbonylation, and the loss of muscle mass in soleus muscle, during unloading. Two of
the main oxidative-stress signaling cascades, NF-кB and p38-MAPK, are activated after
14 days of hindlimb unloading. This activation lead to the increase in the mRNA
expression of the proteolytic E3 ubiquitin ligase MAFbx, and MuRF1, in soleus muscle.
Allopurinol treatment significantly prevents the activation of the p38 MAPK-MAFbx
pathway. However, we have found that NF-кB, but not MuRF-1, was inhibited with the
allopurinol treatment (red arrow).
Figure 4.11. Summary of the Study No. 1: Effect of allopurinol in the cell signaling pathway involved in
the muscle atrophy induced by 14 days of hindlimb unloading in male Wistar rats. Allopurinol prevents
the loss of muscle mass during hindlimb unloading via inhibition of p38-MAPK and the E3 ubiquitin
ligase Atrogin1/MAFbx.
Results
188
4.2. Study No. 2: Effect of 14 days of hindlimb unloading in
muscle atrophy in mIKKα KO and wild-type mice.
After the paradoxical results obtained in the first study, where NF-кB, but not
MuRF-1, was inhibited with the allopurinol treatment, we decided to analyze
specifically the role of NF-кB during hindlimb unloading. Therefore, in this new study
we changed the experimental animals from rats to mice, since these can be genetically
engineered. We used, wild-type and an IKKα muscle-specific knockout mice, one of
two of the upstream proteins that regulate NF-кB-dependent transactivation during
atrophy.
As it has been described in the Materials and Methods section of the Thesis, the
experimental groups used in the following study and their respective abbreviations are:
Control wild-type mice: C-WT
Hindlimb Unloading wild-type mice: U-WT
Control mIKKα KO: C-KO
Hindlimb Unloading mIKKα KO: U-KO
4.2.1. mIKKα deficient mice are protected from soleus muscle atrophy after
14 days of hindlimb unloading.
We measured the cross sectional area of soleus muscle after a protocol of
hindlimb suspension for 14 days. We found a significant decrease in the cross sectional
area (-46%, p<0.001) (Figure 4.12, panels A and B) and a in the minimum diameter of
type I fibers (-65%, p<0.05) (Figure 4.12, panels C and D) in the soleus muscle of the
wild-type mice. However, in deficient mIKKα mice this effect was partially inhibited by
51% (p<0.05) and 15% (p<0.05) respectively.
Results
189
A
Results
190
Figure 4.12. (A) Hematoxylin and eosin staining (Original magnification, 4x. Scale bar, 100.00 µm). (C)
Myosin staining specific of slow myosin heavy chain (type I fibers were deeply stained, while type II
were lightly stained). (Original magnification 20x. Scale bar, 100.00 µm). Panel B and D represent the
quantitative analyses of the cross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber in the soleus in
different groups: C-WT (n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) of male mice. A two-factor
ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
C
D
Results
191
We determined the maintenance of muscle integrity by measuring the protein
content of the slow MHC (Figure 4.13). We found that, after unloading, there was a
significant decrease in the MHC in the gastrocnemius muscle of the WT animals. In this
case, we found a significant prevention of this decrement in the mIKK KO group.
Figure 4.13. Western blot and densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain in
gastrocnemius of C-WT (n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice. A two-
factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant
differences.
Results
192
4.2.2. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on the protein levels of
antioxidant enzymes in gastrocnemius muscle.
The cytosolic protein levels of MnSOD were decreased (-31%, p<0.01) in the
gastrocnemius muscle of the unloaded animals (Figure 4.14A). MnSOD levels were
restored in the mIKKα KO mice. Figure 4.14B shows that the suspension did not induce
changes in the levels of Cu,ZnSOD.
Figure 4.14. Mean (±SD) results of MnSOD (A) and Cu,ZnSOD (B) in gastrocnemius muscle of C-WT
(n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice. A two-factor ANOVA and post
hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
A
Results
193
3.2.3. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in plasma MDA levels
Having established that there is a difference in oxidative stress in the various
groups studied, we determined whether these differences were also translated into
differences in oxidative damage to biomolecules such as lipids. To assess oxidative
damage in our study, we determined lipid peroxidation levels (MDA). Figure 4.15
shows an increase, without significant differences, between the control and unloaded
wild-type groups, nevertheless we found a significant difference in the MDA levels
between the wild-type and the mIKK KO unloaded groups.
Figure 4.15. Mean (±SD) results of MDA levels in plasma of C-WT (n=9), U-WT (n=9), C-KO (n=13),
and U-KO (n =13) groups in male and female mice. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences
Results
194
4.2.4. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in the activation of p38-
MAPK
We tested whether IKKα is involved in the activation of p38-MAPK in
gastrocnemius muscle. We observed that phosphorylation of p38-MAPKinase only
increased a 12% in the cytosolic fractions of the gastrocnemius muscle in the unloaded
WT animals. However, these increments did not reach statistical significance (Figure
4.16). mIKKα KO animals showed a decrease in the phosphorylation of p38 compared
with the control and unloaded WT mice. Total p38 protein levels were unaltered in the
different experimental groups.
Figure 4.16. Mean (±SD) results of cytosolic p38-MAPK in gastrocnemius muscle of C-WT (n=4), U-
WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice. Activation levels were expressed as the
ratio between phosphorylated and total protein content. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
195
4.2.5. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on the activation of NF-
кBp65 in skeletal muscle
We wanted to determine whether the suppression of IKKα, but not IKKβ,
inhibited the activation of the downstream transcription factor NF-кBp65. We found
that the phosphorylation NF-кBp65 was increased (+67%, p<0.05) in the cytosolic
fractions of gastrocnemius muscle in the unloaded WT mice but not in mIKKα KO ones
(Figure 4.17).
Figure 4.17. Mean (±SD) results of phosphorylation of NF-кBp65 in the cytosolic fraction of
gastrocnemius muscle of C-WT (n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice.
Activation levels were expressed as the ratio between phosphorylated and total protein content. A two-
factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant
differences.
Results
196
4.2.6. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in the activation of Akt
in skeletal muscle
The cytosolic protein levels of phosphorylated Akt were decreased (-38%,
p<0.05) in the gastrocnemius muscle of the unloaded animals (Figure 4.18). We found
that Akt phosphorylation was not affected by unloading in the mIKKα KO mice.
Figure 4.18. Mean (±SD) results of cytosolic Akt in gastrocnemius muscle of C-WT (n=4), U-WT (n=4),
C-KO (n=6), and U-KO (n=6) groups in male mice. Activation levels were expressed as the ratio between
phosphorylated and total protein content. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons
were used to identify statistically significant differences.
The content of α-actin, a housekeeping protein marker in muscle, was not altered
in the different treatment groups (data not shown).
Results
197
4.2.7. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on MAFbx, MuRF-1,
and Cbl-b levels in soleus muscle
Finally, to identify the mechanism by which the deficiency of mIKKα prevents
the loss of muscle mass after hindlimb unloading, we determined the expression, in
soleus muscle, of two well-known muscle specific E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx
and MuRF-1 (Foletta et al., 2011) which act as key mediators of proteolysis in muscle
atrophy and loss of muscle function.
Figure 4.19A shows a trend to increase in MAFbx mRNA expression (p=0.053)
in unloaded wild-type mice, this increase was significant in the unloaded mIKKα KO
mice. On the other hand, we found a significant increase in MuRF1 mRNA expression
in the soleus muscle of the unloaded animals and a prevention in the mIKK KO
unloaded mice (Figure 4.19B).
We measured the expression of Cbl-b, another RING-type ubiquitin ligase
required for the loss of muscle mass in response to unloading in vivo. Figure 4.19C
shows that Cbl-b mRNA expression is increased in the soleus of the unloaded WT
animals. This activation is significantly prevented in the mIKK KO unloaded group.
Results
198
Figure 4.19. Mean (±SD) results of MAFbx (A), MuRF1 (B), and Cbl-b (C) mRNA levels in soleus
muscle of C-WT (n=9), U-WT (n=9), C-KO (n=13), and U-KO (n =13) groups in male and female mice.
A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically
significant differences.
C
Results
199
4.2.8. Summary
Collectively, as summarized in figure 4.20, our data suggest that IKKα is
involved in the activation of the NF-кB-MuRF1 pathway in muscle atrophy induced by
hindlimg unloading. We have found that the deletion of mIKKα, during unloading,
partially prevents the decrease in the myosin content. We measured two of the main
oxidative-stress signalling pathways, NF-кB and p38-MAPK; only the first one was
activated after 14 days of hindlimb unloading; p38-MAPK was not significantly
activated.
This activation led to the increase in the mRNA expression of the proteolytic E3
ubiquitin ligase MAFbx, and MuRF1, in soleus muscle. Deletion of mIKKα
significantly prevents the activation of the NF-кB-MuRF-1 pathway but not MAFbx
one (red arrow).
On the other hand, we can see that unloading induces the expression of the
ubiquitin ligase Cbl-b in skeletal muscle. Cbl-b induces impaired protein synthesis,
resulting in inhibition of Akt phosphorylation, leading to muscle atrophy.
Figure 4.20. Summary of the Study No. 2: Effect of 14 days of hindlimb unloading in wild-type and
mIKKα KO mice. Deficiency of mIKKα prevents the loss of muscle mass during hindlimb unloading via
inhibition of NF-кB p65 and the E3 ubiquitin ligases MuRF-1 and Cbl-b.
Results
200
4.3. Study No. 3: Effect of 14 days of hindlimb unloading in
skeletal muscle atrophy in male C57BL/6J mice. Prevention by
allopurinol and indomethacin.
After demonstrating that independent inhibition of XO, and the inflammatory
pathway of NF-кBp65 have positive effects on the maintenance of muscle mass during
periods of suspension, we decided to test whether inhibition of these two pathways
together produced a synergistic effect in preventing muscle atrophy. We treated the
mice with allopurinol, used in the first study, and with indomethacin, a non-steroidal
anti-inflammatory drug.
As it has been described in the Materials and Methods section, the experimental
groups used in the following study and their respective abbreviations are:
Control with water: CW
Control with indomethacin: CI
Control with allopurinol: CA
Control with indomethacin and allopurinol: CIA
Hindlimb unloading with water: UW
Hindlimb unloading with indomethacin: UI
Hindlimb unloading with allopurinol: UA
Hindlimb unloading with indomethacin plus allopurinol: UIA
4.3.1. Allopurinol and indomethacin prevent soleus muscle atrophy after 14
days of hindlimb unloading in mice.
We used different methods to determine the role of XO and inflammatory
parameters in the hindlimb unloading-induced soleus muscle atrophy.
The hindlimb unloading for 14 days caused a significant decrease in the cross
sectional area of soleus muscle (-41%; p<0.001). This muscle atrophy was reduced to
only 10% in the allopurinol plus indomethacin treated animals (p<0.01 vs unloaded
group with water (Figure 4.21, panels A and B)).
In the same way, we found a significant decrease of the minimum diameter of
the type I muscle fibers. Indomethacin plus allopurinol treatment partially prevented
this reduction in the size of the individual myofibers (Figure 4.21, panels C and D).
Results
201
A
B
Results
202
Figure 4.21. (A) Hematoxylin and eosin staining (Original magnification, 4x. Scale bar, 100.00 µm). (C)
Myosin staining specific of slow myosin heavy chain (type I fibers were deeply stained, while type II
were lightly stained). (Original magnification 20x. Scale bar, 100.00 µm). Panel B and D represent
quantitative analyses of the cross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber in soleus
muscle of the different groups: CW (n=7), CI (n=7), CA (n=7), CIA (n=7), UW (n=7), UI (n=7), UA
(n=7) and UIA (n=7). A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to
identify statistically significant differences.
D
C
Results
203
Moreover, soleus muscle to body mass ratio was significantly reduced after 14
days of unloading (-34%, p<0.001). In this case we found only a partial prevention after
the treatments (Figure 22A). We further tested the maintenance of muscle integrity by
determining the protein content of an important component of the sarcomere, the slow
MHC protein. Figure 4.22, panel B, shows that after unloading there was a significant
decrease in the protein content of MHC in soleus muscle. Administration of allopurinol,
and the combined treatment (allopurinol with indomethacin), significantly prevented
this decrement.
Figure 4.22. (A) Soleus muscle to body mass ratio in soleus muscle of CW (n=7), CI (n=7), CA (n=7),
CIA (n=7), UW (n=7), UI (n=7), UA (n=7) and UIA (n=7) groups in mice. A two-factor ANOVA and
post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences. (B) Western blot and
densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain in gastrocnemius of CW (n=5), UW
(n=5), UI (n=5), UA (n=5) and UIA (n=5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc
Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
A
B
Results
204
4.3.2. Hindlimb unloading induces plasma and liver muscle XO activation.
Prevention by allopurinol.
Mice plasma (Figure 4.23A) and liver (Figure 4.23B) XO activity increased
significantly after 2 weeks of hindlimb unloading. As expected, treatment with
allopurinol completely inhibited XO activation both in plasma and liver.
Figure 4.23. Mean (±SD) results of XO activity in plasma (A) and liver (B) of CW (n=3), CA (n=3), UW
(n=3) and UA (n=3) groups in mice. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were
used to identify statistically significant differences.
A
B
Results
205
4.3.3. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin administration
on protein levels of soleus muscle antioxidant enzymes.
As shown in Figure 4.24, hindlimb unloading caused a trend to decrease the
protein levels of the MnSOD in the soleus muscle (only -10%), but not in the groups
unloaded treated with allopurinol and indomethacin with allopurinol. Figure 4.24B
shows that the unloading does not produce changes in the levels of Cu,ZnSOD.
Figure 4.24. Mean (±SD) results of MnSOD (A) and Cu,ZnSOD (B) in soleus muscle of CW (n=5), UW
(n=5), UA (n=5), and UIA (n =5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
B
A
Results
206
4.3.4. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin administration
on plasma MDA levels.
To assess oxidative damage in our study, we determined lipid peroxidation
levels (MDA) in plasma. Figure 4.25 shows statistically significant differences between
the control and unloaded with water groups, this increase in plasma peroxidation is
partially inhibited in allopurinol treated groups. Only the treatment that combined
allopurinol with indomethacin had a significant inhibition in the MDA increments
induced by hindlimb unloading.
Figure 4.25. Mean (±SD) results of plasma MDA levels of CW (n=7), CI (n=7), CA (n=3), CIA (n=7),
UW (n=7), UI (n=7), UA (n=3) and UIA (n=7) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc
Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
207
4.3.5. Hindlimb unloading activates plasma 6-keto prostaglandin F1α.
Prevention by allopurinol and indomethacin.
We tested whether muscular inactivity induced an increase in the concentration
of 6-keto prostaglandin F1α. Our results show that it was elevated significantly after 2
weeks of hindlimb unloading. Treatment with allopurinol and allopurinol plus
indomethacin completely prevented this increase but not the indomethacin
administration alone (Figure 4.26).
Figure 4.26. Mean (±SD) results of 6-ketoPGF1α concentration in plasma of CW (n=7), CI (n=7), CA
(n=3), CIA (n=7), UW (n=7), UI (n=7), UA (n=3) and UIA (n=7) groups in mice. A two-factor ANOVA
and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
208
4.3.6. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin administration
on IL-6 levels in gastrocnemius muscle.
Muscle concentration of IL-6 was decreased during 14 days of hindlimb
unloading. Both, allopurinol treatment and the combined treatment, indomethacin with
allopurinol, inhibited significantly this increament while indomethacin administration
alone only partially prevented it (Figure 4.27).
Figure 4.27. Mean (±SD) results of IL-6 concentration in gastrocnemius muscle of CW (n=7), UW (n=7),
UI (n=7), UA (n=3) and UIA (n=7) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
209
4.3.7. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin treatment on
the activation of p38-MAPK
When we wanted to see the effect of the treatments in the activation of p38-
MAPK in gastrocnemius muscle we found that it did not take place during the hindlimb
unloading in any group. We can see in the Figure 4.28 that phosphorylation and total
p38 protein levels are unaltered in the different experimental groups.
Figure 4.28. Mean (±SD) results of phosphorylated p38 in gastrocnemius muscle of CW (n=5), UW
(n=5), UA (n=5) and UIA (n=5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
210
4.3.8. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin treatment on
the activation of NF-кBp65
We demonstrated in the previous studies that hindlimb unloading induced the
activation of the inflammatory transcription factor NF-кBp65, in this case we wanted to
see if the administration of indomethacin with allopurinol inhibits this activation. We
found a trend to increase in the phosphorylation NF-кBp65 (+79%) in gastrocnemius of
the unloaded animals. Allopurinol plus indomethacin administration decreased this
activation (Figure 4.29).
Figure 4.29. Mean (±SD) results of phosphorylated NF-кBp65 in gastrocnemius of CW (n=5), UW
(n=5), UI (n=5), UA (n=5) and UIA (n=5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc
Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
211
In view of this result we measured p65 subunit in the nuclear fraction of
gastrocnemius muscle; we observed that NF-кBp65 activity was increased after 14 days
of hindlimb unloading (+44%), (Figure 4.30). The treatments reduced partially NF-
кBp65 activity.
Figure 4.30. Mean (±SD) results of relative NF-кB p65 activity in gastrocnemius muscle of CW (n=6),
UW (n=6), UI (n=6) UA (n=5) and UIA (n=6) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc
Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
212
4.3.9. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin treatment on
the activation of Akt in skeletal muscle
The cytosolic protein levels of phosphorylated Akt was not significantly
decreased (-36%) in the gastrocnemius muscle of the unloaded animals (Figure 4.31).
We observed that Akt phosphorylation significantly increased in unloaded with
allopurinol treated mice (+93%, p<0.001). Indomethacin administration had no effect on
Akt activation after the declines by the unloading. While the indomethacin plus
allopurinol treatment partially restored Akt levels after hindlimb unloading protocol.
Figure 4.31. Mean (±SD) results of phosphorylation Akt in gastrocnemius muscle of CW (n=6), UW
(n=6), UA (n=6) and UIA (n=6) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s
comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
213
4.3.10. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin treatment on
the MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b levels in soleus muscle
To finally identify the mechanism by which allopurinol prevents the loss of
muscle mass after hindlimb unloading we determined the expression, in soleus muscle,
of two well-known muscle specific E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx and MuRF-1
(Foletta et al., 2011) which act as key mediators of proteolysis in muscle atrophic and
loss of muscle function. As shown in Figure 4.32 we found a very significant increase in
both MAFbx (Panel A) and MuRF1 (Panel B) mRNA expression in the soleus muscle
of the unloaded animals. Regarding the prevention of increase mRNA expression only
the treatment of indomethacin with allopurinol had a significant effect.
At last, we measured the expression of Cbl-b, another RING-type ubiquitin
ligase required for the loss of muscle mass in response to unloading in vivo. In the
Figure 4.32C, we can see that Cbl-b mRNA expression is increased of soleus of the
unloaded animals. Allopurinol administration partially prevents this increase, while
indomethacin with allopurinol administration has a greater effect on the prevention of
Cbl-b mRNA expression during hindlimb unloading (Figure 4.32, panel C).
A
Results
214
Figure 4.32. Mean (±SD) results of MAFbx (A), MuRF1 (B), and Cbl-b mRNA levels in soleus muscle
of CW (n=6), CI (n=6), CA (n=6), CIA (n=6), UW (n=6), UI (n=6), UA (n=6) and UIA (n=6) groups in
mice. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically
significant differences.
B
C
Results
215
4.3.11. Summary
Collectively, as summarized in figure 4.33, our data suggest that XO-induced
oxidative stress and inflammatory parameters are involved in unloaded muscle atrophy.
We have found that allopurinol with indomethacin treatment, during unloading,
completely prevents the activation of XO and inflammatory pathways, restoring anti-
inflammatory parameters, the myosin content, and partially prevents the loss of muscle
mass in soleus muscle. We measured two of the main oxidative-stress signalling
pathways, NF-кB and p38-MAPK; strangely only the first was activated after 14 days of
hindlimb unloading; p38-MAPK was not significantly activated.
On the other hand, we can see that unloading induces ubiquitin ligase Cbl-b in
skeletal muscle. Cbl-b induces impaired protein synthesis leading to muscle atrophy.
Nevertheless we found increased the mRNA expression of the proteolytic E3
ubiquitin ligase MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b in soleus muscle. Indomethacin with
allopurinol treatment significantly prevents the activation of the p38 MAPK-MAFbx
and NF-кB-MuRF-1 pathways and Cbl-b mRNA expression.
Figure 4.33. Summary of the Study No. 3: Effect of 14 days of hindlimb unloading in male wild-type
C57BL/6J mice. Prevention by allopurinol and indomethacin. Allopurinol and indomethacin prevent the
loss of muscle mass during hindlimb unloading via inhibition of the E3 ubiquitin ligases
Atrogin1/MAFbx, MuRF-1 and Cbl-b.
Results
216
4.4. Study No. 4: Effect of α-galacto-oligosaccharides (OGT) in
skeletal muscle atrophy induced by streptozotocin in rats.
4.4.1. Effect of streptozotocin-induced diabetes and OGT administration on
hematological parameters.
We wanted to verify the induction of type 1 diabetes mellitus (T1DM) to the rats
by the streptozotocin injection. We found that relative to the control group, STZ rats
exhibited hyperglycemia, insulin deficiency and a trend to raise plasma fructosamin
level, a marker of glycated proteins (Table 4.1). We found that the treatment with OGT
decreased significantly only the plasma fructosamin values.
Control STZ-treated STZ-treated + OGT
Fasting glucose (mmol/L) 1.91±0.56 6.98±0.81* 7.10±0.72#
Fasting insulin (mU/L) 0.88±0.46 0.10±0.07* 0.07±0.03#
Fructosamin (µg/L) 181±30 341±145* 119±97$
Table 4.1. Mean (±SD) results of fasting glucose, fasting insulin and fructosamin concentrations in
plasma of control rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor
ANOVA and post hoc Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences;
*: p<0.05 vs control group (trends for fructosamin: p=0.12), #: p<0.05 vs control group, $: p<0.05 vs
STZ-Treated group.
Results
217
4.4.2. OGT prevents skeletal muscle atrophy in streptozotocin-diabetic rats
We wanted to observe the effect of streptozotocin-induced T1DM in muscle
atrophy.
In the Figure 4.34 (Panel A) we can see that relative to the control group, STZ
rats exhibited skeletal muscle atrophy, determined by measuring tibialis anterior and
gastrocnemius muscle weight. However, the OGT supplementation partially prevented
the decrease in skeletal muscle mass.
Figure 4.34 Mean (±SD) results of (A) tibialis anterior and (B) gastrocnemius muscle weight of control
rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor ANOVA and post
hoc Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences.
A
B
Results
218
4.4.3. Effect of T1DM and OGT administration on protein levels of skeletal
muscle antioxidant enzymes.
T1DM decreased significantly the protein levels of the cytosolic MnSOD in the
tibialis anterior of the rats (-38.5%; p<0.01) (Figure 4.35A). Treatment with OGT
partially prevented the diabetes-induced decrease by 25.5%. Figure 4.35B shows that
T1DM did not produce changes in the levels of Cu,ZnSOD.
Figure 4.35. Mean (±SD) results of MnSOD (A) and Cu,ZnSOD (B) in tibialis anterior muscle of control
rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor ANOVA and post
hoc Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences.
A
B
Results
219
4.4.4. Effect of T1DM and OGT administration on the activation of p38-
MAPK
We found a significant increase in the phosphorylation of p38-MAPKinase in
the tibialis anterior muscle of the unloaded animals. Allopurinol treatment completely
prevented the p38 phosporylation. Total p38 protein levels were unaltered in the
different experimental groups.
Figure 4.36. Mean (±SD) results of cytosolic phosphorylation p38 in tibialis anterior muscle of control
rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). Activation levels were
expressed as the ratio between phosphorylated and total protein content. A one-factor ANOVA and post
hoc Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
220
4.4.5. Effect of T1DM and OGT administration on the expression of NF-
кBp65
We wanted to determine whether the induction of diabetes induced the activation
of the inflammatory pathway of NF-кBp65, and the possible effect of OGT
administration. We found that the NF-кBp65 content had a trend to increase (+38.7%;
p=0.08) in the cytosolic fractions of tibialis anterior of the diabetic animals. Treatment
with OGT did not prevent this increment (only -15.4%).
Figure 4.37. Mean (±SD) results of cytosolic NF-кBp65 content in tibialis anterior muscle of control rats
(n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor ANOVA and post hoc
Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences.
Results
221
4.4.6. Summary
Collectively, as summarized in figure 4.38, our data suggest that oxidative stress
is involved in STZ-induced muscle atrophy. We have found that GOT treatment
completely prevents the activation of p38, partially prevents the decrease of antioxidant
enzyme, but has no effect on the loss of muscle mass in tibialis anterior and
gastrocnemius muscles.
Figure 4.38. Summary of the Study nº 4: Effects of α-galacto-oligosaccharides (OGT) in streptozotocin-
diabetic rats. OGT treatment prevents p38 activation and oxidative stress in STZ-induced diabetes but the
loss of muscle mass is not prevented.
DISCUSSION
Discussion
225
5.1. Justification of the study
The generation of critical levels of power are a prerequisite to perform simple
tasks of daily living, such as rising from a chair or climbing stairs. For a young healthy
person these activities can be performed easily, however after a prolonged period of
forced inactivity (such as during the recovery of a sport injury, cast immobilization or
bed rest period after an operation) and in chronic diseases (such as diabetes) a loss of
muscle mass occurs. Then, simple tasks become increasingly difficult. In these situations
the loss of muscle mass has serious implications for independent living, quality of life,
and undoubtedly for the recovery for the sport practice.
Recently it has been shown that muscle atrophy may be triggered by ROS and
antioxidant treatments partially inhibit the weakness caused by limb immobilization.
This study is justified because there is great scientific and social interest to
determine which behaviours can lead to the maintenance of the muscle mass in young
immobilized and diabetic subjects. We expect that the results we have obtained in this
doctoral thesis can be used in both theoretical (to foster the knowledge of the atrophic
process) and practical applications, in the field of rehabilitation, Sport Sciences, and
Performance.
5.2. Limitations of the study
Although there are several different aspects that we try to cover in this
investigation, we are also aware of the limitations presented.
One limitation of our study is that muscle atrophy induced in our model should
be extrapolated to conditions such as of bed rest, weightlessness and space flight, and
not to the cast immobilization, although the molecular mechanisms involved are similar
(Powers et al., 2005).
Another limitation that we encountered on the model used is that the most
atrophied muscle is the soleus, which gives us a small amount of sample for the
experiments.
Regarding the limitations of the study in relation to the pharmacologic
treatments, we are aware that despite the allopurinol and indomethacin dose was
adjusted daily according to water consumption and rodents' weight, we have not
administrated to every animal the exact dose that we initially estimated.
Discussion
226
Furthermore due to our experience with the use of allopurinol to inhibit XO in
various studies, we knew a priori that the dose used in this study was not going to cause
any toxic effect in the rodents (Gomez-Cabrera et al., 2005, Gomez-Cabrera et al., 2008,
Romagnoli et al., 2010). However, it has been described previously that a low dose of
indomethacin could inhibit cancer cachexia, whereas a high dose might be toxic in
different organs, lead to gastrointestinal haemorrhage and, elevated mortality in mice
and rats (Gelin et al., 1991, Zhou et al., 2003, Egan et al., 2004, Granado et al., 2007).
Therefore, we decided to use a low indomethacin dose to inhibit the NF-кB pathway and
the muscle atrophy described in other models. However, this dose (0.6mg/kg/day)
proved to be toxic in our model and led to renal failure in mice that took it. Recently the
administration of allopurinol has been described as an important anti-inflammatory in
many diseases, including renal failure (Goicoechea et al., 2010, Thurston et al., 2013,
Bhasin et al., 2014). In fact, we have found that administration of allopurinol and its
combination with indomethacin prevented renal fairlure in mice.
5.3. Soleus muscle atrophy associated to 14 days of hindlimb
unloading protocol.
A growing body of experimental data attributes to oxidative stress and
inflammation the loss of muscle mass in both human and animal models during muscle
immobilization. In our study, young rats and mice were submitted to hindlimb
unloading during 14 days to induce skeletal muscle atrophy. Four different strategies
were tested to prevent the loss of muscle mass: allopurinol (inhibitor of XO),
indomethacin (anti-inflammatory, inhibitor of NF-кB), indomethacin plus allopurinol
administration, and a mIKKα knockout mice model.
It has been reported that type I muscle fibers atrophy is more severe than other
fiber types during hindlimb unloading (Jaspers and Tischler, 1984, Thomason and
Booth, 1990a, Talmadge et al., 1996). It is well known that the soleus muscle is mainly
composed of type I muscle fibers. This is the reason why we focused the analysis in
soleus muscle.
After unloading we found a significant decrease in the cross sectional area of the
antigravitatory soleus muscle in rats (Figure 4.1; panels A and B) and mice (Figure 4.12
and 4.21; panels A and B). Thus, we studied the minimum diameter of the individual
Discussion
227
type I myofibers and, we observed a significant decrement in their size after hindlimb
suspension (Figures 4.1, 4.12 and 4.21, Panels C and D). Our results are in agreement
with those reported by different research groups both in rats (Zhang et al., 2007a,
Boonyarom et al., 2009, Zhang et al., 2010) and in mice (Matuszczak et al., 2004),
confirming the histochemical observation that the area of muscle mass and the diameter
of type I fibers, are decreased after 14 days of hindlimb unloading.
In the first study, the treatment with allopurinol significantly prevented skeletal
muscle atrophy after hindlimb unloading in rats. We found a significant prevention
(+43%) in the decrement of the CSA and in the diameter of type I fibers (+18%) (Figure
4.1).
In the second study we used muscle deficient IKKα mice to further examine the
role of IKKα/NF-кB in unloading-induced muscle atrophy. We found that the muscle
specific suppression of IKKα prevents (+50%) the reduction in the CSA and the
decrement in type I fibers diameter (+15%) during hindlimb unloading (Figure 4.12).
These results are in agreement with previous studies, using DNA injection and
electroporation experiments, showing that both IKKα and IKKβ are necessary and
sufficient to induce muscle atrophy (Van Gammeren et al., 2009).
Finally, we confirmed in the third study, with mice, that allopurinol partially
prevented CSA and type I fibers reduction in soleus muscle after hindlimb unloading (-
41% and -24% respectively) (Figure 4.21), confirming the beneficial effects of
allopurinol administration in both rats and mice. We found a partial prevention with the
indomethacin treatment in the CSA, but the effect of the indomethacin administration
was less effective than allopurinol (+6%). However, the major protection was found
with indomethacin plus allopurinol treatment that prevented in 30% and 10% the CSA
and type I myofibers decrement respectively (Figure 4.21).
We also confirmed the atrophy weighing the soleus muscles in all the
experimental groups. The relative muscle weights evidently decreased in the soleus
muscles after the unloading protocol both in rats (-49%) and mice (-34%) (Figures 4.2
and 4.22, panel A). In the first study, we found an approximately 20% prevention in the
unloading-induced rat’s soleus muscle atrophy under allopurinol treatment measured by
Discussion
228
the weight of soleus muscle. Matuszczak et al. published that administration of
allopurinol had protective effects during hindlimb unloading (Matuszczak et al., 2004).
However, as in our case with the same doses, allopurinol did not prevent the loss of
soleus weight in mice. In the rat’s study we can consider that the higher dose of
allopurinol used in rats could explain the differences between mice and rats results.
Although in the study done by Matuszczak et al. in mice, as in our studies in rats and
mice the allopurinol dose was 50 mg/kg. If we take into account the differences in the
surface area between rats and mice, the amount of allopurinol results in 300 mg/m2 in
our rat study. While the administered dose in mice corresponds to 150 mg/m2 of
allopurinol. Body surface area has been recommended as the main basis for drug
dosage, because the rate of metabolism or redistribution of a drug is proportional to the
metabolic rate, which reflects heat losses that are generally proportional to the surface
area (Lack and Stuart-Taylor, 1997).
In the third study we have shown that neither allopurinol nor indomethacin alone
prevent the fall in the soleus muscle weight after 14 days of unloading. However,
coadministration of indomethacin plus allopurinol had a significant effect in preventing
the loss of soleus muscle weight in mice (Figure 4.22 panel A). Anti-inflammatories
have been previously used in different situations of muscle wasting, as cancer cachexia
or sepsis (Hitt et al., 2005, McCarthy et al., 2004, Ruff and Secrist, 1984, Zhou et al.,
2003), and they have been effective even when administered at low doses. Muscle
atrophy, resulting from loss of contractile proteins, is one well-recognized cause of such
functional impairment. We tested the effect of our treatments in the maintenance of
muscle integrity by determining the protein content of an important component of the
sarcomere, the slow MHC protein. It has been suggested that of the myofibrillar
proteins implicated in mediating muscle atrophy and the wasting state, MHC is a
preferred substrate that can be inhibited at the RNA level or degraded through a
ubiquitin associated proteolytic process (Acharyya et al., 2004). We found that after
unloading there was a dramatic decrease in the protein content of MHC in rats (Figure
4.2, Panel B) In this case, we found only a partial prevention after treatment with
allopurinol.
In mice, we observed a similar decrement in the MHC content which was
completely restored in mIKKα KO mice (Figure 4.13). With the treatments with
Discussion
229
allopurinol and indomethacin plus allopurinol in the third study we observed a
restoration of this MHC content loss (4.22, panel B).
As a summary, in this doctoral thesis we have shown that two different
treatments, allopurinol and indomethacin, partially prevent skeletal muscle atrophy in
rodents after 14 days of hindlimb unloading. We have found a synergistic benefit with
the coadministration of indomethacin plus allopurinol in the preservation of muscle
mass after hindlimb unloading, proving that more than one pathway is involved in the
muscle atrophy during this condition.
5.4. Oxidative stress is involved in muscle atrophy associated to
hindlimb unloading.
Historically, it was believed that ROS production is low in noncontracting
skeletal muscle and oxidative injury is not present (Powers et al., 2005). However,
numerous studies have demonstrated that oxidative injury occurs during periods of
disuse in locomotor skeletal muscles (Kondo et al., 1992a, Kondo et al., 1992b, Kondo
et al., 1993b, Kondo et al., 1993c, Kondo et al., 1994, Lawler et al., 2003) and in the
unloaded diaphragm during prolonged mechanical ventilation (Shanely et al., 2002,
Zergeroglu et al., 2003).
The source(s) of ROS production in the unloading models is still a subject of
debate. Kondo et al. described several potential sources of ROS involved in oxidative
stress-induced muscle atrophy during muscular inactivity (Kondo et al., 1991) (see
section 1.5.3.1). Based on this study different strategies have been developed to prevent
disuse muscle atrophy by the administration of exogenous antioxidants. Interestingly,
rodents supplemented with vitamin E (Appell et al. 1997; Servais et al. 2007), Bowman-
Birk inhibitor concentrate (soy protein with antioxidant properties) (Arbogast et al.
2007), aminoguanidine (Chowdhury et al., 2009), resveratrol (Jackson et al. 2010),
diferuloylmethane (curcumin), cysteine (Ikemoto et al., 2002), and N-acetylcysteine
(NAC) (Farid et al., 2005) (three non-specific antioxidants) during a period of hindlimb
unloading, exhibit less oxidative damage and muscle atrophy, suggesting that ROS
contribute to the inactivity-related skeletal muscle atrophy.
Discussion
230
In their pioneer work, Kondo and co-workers in 1991 described that XO is one
of the sources of free radicals acting on skeletal muscle during inactivity periods
(Kondo et al., 1991). Two years later this group confirmed that to XO is the main source
of ROS production in the atrophied muscles (Kondo et al. 1993a). Matuszczak and co-
workers found that administration of allopurinol in mice had protective effects during
hindlimb unloading (Matuszczak et al. 2004). In this study a substantial prevention in
the contractile dysfunction in soleus muscles was reported. More recently the group of
Powers showed that XO is involved in mechanical ventilation-induced oxidative injury
and contractile dysfunction in the diaphragm (Whidden et al., 2009). Respiratory
muscle weakness produced by mechanical ventilation occurs due to diaphragmatic
contractile dysfunction and atrophy and is directly linked to oxidative stress (Betters et
al., 2004).
However, the molecular mechanisms involved in the XO-mediated skeletal
muscle atrophy are not well understood. We have previously reported that inhibition of
XO with allopurinol prevents exercise-induced oxidative stress in skeletal muscle by
inhibiting the MAPK–NF-кB signalling pathways (Gomez-Cabrera et al. 2003; Gomez-
Cabrera et al. 2005). Thus, our aim was to determine the mechanism by which XO-
derived ROS cause unloading induced muscle atrophy and its possible prevention by
allopurinol and/ or indomethacin.
We found a significant increase in plasma and soleus muscle XO activity
associated to hindlimb unloading that was prevented completely by allopurinol in rats
(Figure 4.3). The same effect was observed in the mice’s study, where plasma and liver
XO activity was increased during hindlimb unloading and completely prevented with
allopurinol (Figure 4.23). These results are important, because they confirm that
treatment with allopurinol was effective.
The term oxidative stress was first defined in 1985 as “a disturbance in the pro-
oxidant-antioxidant balance in favor of the former” (Sies and Cadenas, 1985, Sies,
1985.). For this reason we measured the expression of the antioxidant enzymes. In the
first study we observed that unloading significantly increased activity of CuZnSOD in
soleus muscle of rats. Allopurinol administration did not modulate the skeletal muscle
antioxidant levels (Figure 4.4, panel A).
Discussion
231
These data agree with that obtained by Kondo (Kondo et al., 1993b) and later
confirmed by Lawler (2003) who, using a 28 days hindlimb unloading protocol,
observed a large increase, of CuZnSOD (+71.2%), in rat soleus. Nevertheless, Girten
described a reduction in the antioxidant enzyme activity for total SOD following 14
days of hindlimb unloading (Girten et al., 1989). In our second and third study in mice
we did not find differences in the expression of this protein after the unloading.
We also measured the expression of catalase. It increased significantly during
the unloading protocol, but allopurinol treatment had no effect on its expression (Figure
4.4, panel B). Servais and co-workers found similar data since in their study catalase
underwent a significant increase in the group of rats suspended that vitamin E failed to
prevent (Servais et al., 2007).
In the second study in mice we observed that the skeletal muscle levels of
MnSOD were significantly decreased in the unloading group. Their protein levels were
restored in gastrocnemius muscle in mIKKα KO mice (Figure 4.14, panel A). Contrary
to what we got in rats, that unloading did not induce changes in CuZnSOD expression
levels (Figure 4.14 and 4.24, panels B).
In the third study we found a trend to decrease MnSOD, restored with
allopurinol and indomethacin plus allopurinol treatments (Figure 4.24, panel A).
Regarding CuZnSOD we obtained similar results, the levels of this enzyme were not
changed after unloading (Figure 4.24, panel B).
According with our results, studies in which the unloading was maintained for
28 days, the authors found a small decrease in the activity of MnSOD in the
immobilized soleus (Lawler et al., 2003) or no changes in the expression of CuZnSOD
after hindlimb suspension for 14 days (Chen et al., 2008).
Furthermore there are limited and controversial data in the literature concerning
antioxidant enzymes and skeletal muscle disuse. With these data we can only suggest
that the muscle is adapting to oxidative stress.
In this PhD thesis we have evaluated systemic and muscular oxidative damage.
We determine the MDA levels in plasma by using HPLC. MDA measurement with this
method is very specific and sensitive, and distinguishes between malondialdehyde and
Discussion
232
other aldehydes which can react with TBA (thiobarbituric acid) (Bermejo et al., 1997).
For this reason we chose this parameter to study lipid peroxidation in our model.
In the rat study MDA in plasma was significantly increased after unloading (See
figure 4.5) and this was not prevented by allopurinol. Surprisingly, in this case, we
found that allopurinol treatment in the control group showed statistically increased
MDA levels. This could have occurred due to administration of oral antioxidants in
conditions without an additional oxidative damage (i.e. increased XO activity). This
could be counterproductive in this case because of an inhibition of the formation of uric
acid, a potent antioxidant (Becker, 1993).
In the second study we only found a trend to increase in the MDA levels in the
wild type unloaded mice group, without significant differences with the control wild
type group. However, we found a significant difference in the MDA levels between the
wild type and the mIKK KO unloaded groups (See Figure 4.15).
In the third study, lipid peroxidation was significantly increased in the unloaded
with water group compared with its control. Neither indomethacin nor allopurinol
prevented the MDA increments during unloading. However, the combination of
indomethacin plus allopurinol induced a significant inhibition of the MDA increments
induced by hindlimb unloading (See Figure 4.25).
Regarding to protein carbonylation we found a significant increase in the plasma
and soleus protein oxidation in the unloaded animals (See Figure 4.6) in the rat study.
This was not prevented by allopurinol.
Our MDA data in soleus are in accordance with the results previously observed
(Lawler et al., 2003) in which muscle atrophy increases the lipid peroxidation and
protein oxidation. Interestingly, the level of lipid peroxidation was studied in soleus,
gastrocnemius, tibialis anterior, and EDL muscle and was found to be linearly related to
the percentage of muscle atrophy (Desaphy et al., 2010). These data suggest the
existence of a correlation between an indirect index of ROS production and muscle
atrophy. However, it may be that lipid and protein damage might follow muscle atrophy
or occur in parallel, and holding a proportion.
Discussion
233
The failure of allopurinol to completely blunt the oxidative stress in skeletal
muscle using different unloading models has been previously reported (Matuszczak et
al., 2004, Whidden et al., 2009). In this PhD thesis we demonstrate that the oral co-
administration of an anti-inflammatory, indomethacin, with an XO inhibitor,
allopurinol, can prevent significantly plasma lipid peroxidation when compared to the
unloaded group that drink water and water with indomethacin or allopurinol alone.
These results suggest that lipid peroxidation induced by hindlimb unloading is mediated
by several different pathways.
5.5. Redox sensitive signaling pathways involved in muscle
atrophy associated to hindlimb unloading.
Generally, the activation of NF-кB, activator protein-1 (AP-1), p53, Foxo, and
p38 MAPK pathways lead to skeletal muscle atrophy (Guttridge, 2004). On the other
hand, activation of PI3K/Akt pathway that occurs in response loading and growth
factors such as insulin and IGF prevents the loss of skeletal muscle mass (McKinnell
and Rudnicki, 2004).
p38 is a stress-activated protein kinase that responds to a variety of stimuli,
including oxidative stress and TNF-α (Obata et al., 2000). MAPKs are important in the
cellular mechanisms of the atrophic process, and p38MAPK has been identified as a
potential regulator of muscle catabolism (Tracey, 2002, Li et al., 2005, Powers et al.,
2005). Thus, we determined the phosphorylation of p38 MAPK in the cytosol of the
soleus muscle samples. In our first study with rats, we found a significant increase of p-
p38 in the soleus of the unloaded animals that was prevented by allopurinol
administration (Figure 4.7). Our results are consistent with those reported by Childs et
al. (Childs et al., 2003) which found a 128% increase of p38 phosphorylation after 10
days of hindlimb immobilization in rats. This was associated with a 38% decrease in
soleus muscle mass over the same period. One year later Di Giovanni found that p38
phosphorylation was elevated in atrophic muscles of patients with acute quadriplegic
myopathy and with neurogenic muscle atrophy (Di Giovanni et al., 2004). Other
procatabolic conditions in which constitutive phosphorylation of skeletal muscle p38
has been shown to be elevated include Type 2 diabetes (Koistinen et al., 2003) and
Discussion
234
aging (Williamson et al., 2003). Our results suggest that XO-derived ROS increased p38
MAPK phosphorylation contributing, in part, to the loss of muscle mass.
Paradoxically, when we measured the phosphorylation of p38 in the soleus of
WT and mIKK KO mice (second and third study) we did not find an increase in p-p38
after 14 days of hindlimb unloading (Figures 4.16 and 4.28). Other authors have
reported differences in the activation of cell signaling pathways between mice and rats.
For instance Hunter and co-workers did not find differences in the activation of p38 in
mice soleus muscle after 7 days of suspension (Hunter et al., 2002). This result raises
the question of whether there is a problem with animal models in research, that we will
discus at the end of the document.
A very relevant link between oxidative stress and muscle disuse atrophy
involves the redox regulation of the NF-кB family of transcriptional activators, that is
pivotal for various cellular processes ranging from inflammation to proliferation and
apoptosis (Hayden and Ghosh, 2004). Since this discovery, genetic and pharmacological
studies have provided accumulating evidence about the role of NF-кB in primary
muscle diseases (Peterson and Guttridge, 2008, Li et al., 2008, Bakkar and Guttridge,
2010, Peterson et al., 2011, Jackman et al., 2013).
Li and colleagues described the importance of the activation of NF-кB in muscle
atrophy pointing to 1) its ability to activate the ubiquitin-proteasome pathway, 2)
inductotion of inflammatory molecules, 3) interference with the differentiation process
required for regeneration of skeletal muscle, 4) blocking of myogenic differentiation
process (Li et al., 2008).
For these reasons, we tested whether XO-derived ROS were involved in the
activation of NF-кB signalling pathway in soleus muscle.
In the first study in rats, we found that both cytosolic p65 protein content (NF-
кB subunit) and NF-кB nuclear activity increased after 14 days of hindlimb unloading
(Figure 4.8 and Figure 4.9B, respectively). Allopurinol treatment partially reduced NF-
кB activity without concomitant prevention of p65 nuclear translocation (Figure 4.9A).
We also found a striking significant increase of p65 nuclear protein levels in control
animals treated with allopurinol.
Discussion
235
Although we found a clear activation of the NF-кB pathway in the soleus muscle
in the unloaded rats, treatment with allopurinol only partially prevented the cytosolic
phosphorylation and the nuclear activity of NF-кBp65. However, the translocation to
the nucleus of the p65 subunit was not prevented by treatment with allopurinol.
Sizemore et al. demonstrated that the α and β IKK subunits have distinct roles in the
regulation of the p65-p50 heterodimer. Whereas IKKβ is required for both NF-кB
translocation and p65 phosphorylation, IKKα is required solely for the phosphorylation
and activation of the p65 subunit, for this reason we decided to analyze specifically the
role of IKKα and NF-кB during hindlimb unloading (Sizemore et al., 2002).
In the second study with the mIKKα KO mice we measured the phosphorylation
of the p65 subunit and, we found that NF-кBp65 phosphorylation increases during
hindlimb unloading in the wild type group. However, in the mIKKα KO mice, this
activation was prevented (Figure 4.17).
In the third study we decided to use a specific inhibitor of NF-кB in combination
with allopurinol to mimic pharmacologically the study number two. Many authors show
that indomethacin can inhibit the loss of muscle mass by modulating the expression and
activity of NF-кB (Ruff and Secrist, 1984, Zhou et al., 2003, Hitt et al., 2005, Lin et al.,
2010). The inhibitory effects of indomethacin on NF-кB activation may be one of this
mechanisms with antiinflammatory actions (Hu et al., 2001). We have demonstrated
that hindlimb unloading can activate NF-кB signalling pathway in mice skeletal muscle.
We have found a tendency to increase in the cytosolic content of p-p65 subunit after 14
days of hindlimb unloading. We consider that this effect is not statistically significantly
because it was determined in gastrocnemius muscle (composed mostly by fibers type II)
which is known to be less atrophied during suspension than the postural soleus muscle.
We found a slight effect on the inhibition of NF-кB by indomethacin, probably due to
the low dose administered (0.6mg/kg body weight / day) orally (See figure 4.29). These
results coincide with those described previously by Zhou et al. who observed that the
very low dose of indomethacin induced only a partial decrease in the activation of NF-
кB, delaying muscle atrophy in cancer cachexia (Zhou et al., 2003).
The administration of allopurinol had the same effect that we found in the first
study with rats, a partial inhibition of p-p65. However, the administration of
Discussion
236
indomethacin plus allopurinol inhibited completely the cytosolic phosphorylation of
NF-кBp65 (See figure 4.29), suggesting that may coexist two different activation
pathways of NF-кB in the unloading atrophy model. When we measured the nuclear
activation of NF-кB we found that the three treatments partially prevented it after
hindlimb unloading, without a synergistic effect in the administration of allopurinol plus
indomethacin (see figure 4.30).
We have described previously that the Akt/mTOR pathway is up-regulated
during hypertrophy and down-regulated during muscle atrophy. Muscle unloading
might cause Akt decline or inactivation. Akt activates downstream targets to mediate
protein synthesis, but muscle disuse reduces Akt activation below control levels
(Bodine, 2001). Confirming the results previously reported by other studies (Kachaeva
and Shenkman, 2012, Lomonosova et al., 2012), after hindlimb suspension we found a
significant decrease in skeletal muscle Akt activation in mice (See figures 4.18 and
4.31).
Regarding the second study, we have to point out that both IKKα and IKKβ can
inhibit the phosphorylation of Akt (Reed et al., 2011). Our results show that during the
hindlimb unloading mIKKα KO mice partially maintain basal levels of p-Akt, restoring
the inhibited protein synthesis in wild type mice during unloading (Figure 4.18).
In the third study, our results show that treatment with indomethacin does not
restore the decrease in p-Akt during unloading. This result can be understood
considering previously published data reporting that phosphorylation of Akt is
diminished by indomethacin treatment in vitro (Niu et al., 2012, Zheng et al., 2014). We
can also observe that treatment with allopurinol significantly increased p-Akt during the
hindlimb unloading. Previously it has been shown that allopurinol enhanced the effects
of NAC in restoring phosphorylation of Akt in diabetic rats (Wang et al., 2011). Finally,
the administration of indomethacin plus allopurinol restores basal levels of p-Akt,
without the significant increase observed in the unloaded group treated with allopurinol
alone, probably due to the inhibitory effect of indomethacin on the activation of Akt.
To identify the mechanism by which the treatments prevent the loss of muscle
mass after hindlimb unloading through the activation of p38 and NF-кB and the
inhibition of IGF / Akt pathways, we determined the expression of two well know
Discussion
237
targets genes of these pathways: MAFbx and MuRF-1. They have been previously
described as muscle specific E3 ubiquitin ligases involved in several in vivo models of
skeletal muscle atrophy, including fasting, diabetes, cancer, renal failure, hindlimb
suspension, immobilization, denervation, sepsis, and lipopolysaccharide administration
(Bodine et al., 2001a, Dehoux et al., 2003).
It was described previously that the activation of ubiquitin ligases MuRF1 and
MAFbx in skeletal muscle were mediated by p38 and NF-кB, respectively (Cai et al.,
2004, Glass, 2005, Li et al., 2005). On the other hand, it is known that, under muscle
wasting conditions, such as disuse, diabetes and fasting, Akt is necessary to inhibit
upregulation of the atrophy markers MuRF1 and MAFbx, via inhibition of Foxo (Lee et
al., 2004, Sandri et al., 2004, Stitt et al., 2004).
In the first study we found that hindlimb unloading induced the expression of
MAFbx and MuRF-1 in soleus muscle (Figures 4.10, panels A and B). Increments of
MAFbx and MuRF 1 are associated with immobilization-induced increases of
proteasome dependent proteolysis. Treatments such as vitamin E (Servais et al., 2007)
and resistance exercise (Haddad et al., 2006) blunt the induction of the atrogenes
following unloading. In our case, allopurinol treatment only prevented the
overexpression of p38/MAFbx pathway, without preventing MuRF-1 activation (Derbre
et al., 2012). These data suggest the MAFbx and MuRF-1 genes are the downstream
targets of p38 MAPK and NF-кB signaling and, that we need other treatments to inhibit
NF-кB/MuRF-1 pathway and have a more effective prevention of muscle atrophy.
In the second study, we found that hindlimb unloading induced the expression of
MAFbx and MuRF-1 in mice soleus muscle (Figure 4.19, panels A and B). As
expected, a significant prevention in the activation of the IKKα/NF-кB/MuRF-1patway
was found in the mIKKα KO animals.
Several studies indicate that decreased IGF-1/PI3K/Akt signaling pathway
increases the expression of MAFbx and MuRF-1, resulting in muscle atrophy.
Moreover, it has been recently found by Nakao et al that a new ubiquitin-ligase, Cbl-b,
has a role in the downregulation of IGF-1/Akt signaling in skeletal muscle under
unloading conditions (Nakao et al., 2009). Thus, we measured Cbl-b expression and we
Discussion
238
found that Cbl-b mRNA expression is increased in the soleus of the unloaded wild type
animals but this increment is partially prevented in the mIKK KO unloaded group
(Figure 4.19, panel C). Our study does not identify the mechanism by which the lack of
IKKα decreases Cbl-b mRNA levels. The Cbl-b was described as a gene highly
sensitive to mechanical stress (unloading) (Nikawa et al., 2004, Ogawa et al., 2006). We
observed previously that our mIKKα KO mice were more protected against oxidative
stress induced during the suspension as they kept the levels of the antioxidant enzyme
MnSOD and had less oxidative damage to lipids (lower levels of MDA) compared to
unloaded wild type mice. This is why we hypothesize that this safeguard that had the
mIKKα KO mice versus the wild-type would cause the decreased expression of Cbl-b.
Finally, in the third study our results showed that unloaded mice had high
MAFbx, MuRF-1 and Cbl-b mRNA levels. Treatment with indomethacin and
allopurinol did not significantly prevent these increments (Figure 4.32). However, the
coadministration of indomethacin plus allopurinol had a synergistic effect between the
two treatments, and it was able to reduce significantly the mRNA expression of the
three ubiquitin-ligases, MAFbx, MuRF-1 and Cbl-b, decreasing muscle protein
unloaded-breakdown.
5.6. Inflammatory parameters are involved in muscle atrophy
associated to hindlimb unloading.
Numerous studies have demonstrated that inflammatory cytokines can cause
atrophic changes in cultured myotubes, and in vivo studies have demonstrated that
activation of inflammatory signaling pathways are fundamental for the atrophy process
(Zamir et al., 1994, Acharyya et al., 2004, Doyle et al., 2011). However, the catabolic
effects of inflammation in vivo do not depend exclusively on direct cytokine action on
skeletal muscle (Braun et al., 2011).
The transcription factor NF-кB is the central mediator of inflammatory
responses and immune function. NF-кB is a mediator of the cytokine TNF-α which
plays an important role in skeletal muscle atrophy. In addition, NF-кB has been shown
to control the induced transcription of the cyclooxygenase-2 (COX-2) gene (Schmedtje
et al., 1997, Jobin et al., 1998). Cyclooxygenase-1 and -2 (COX-1 and COX-2) catalyze
Discussion
239
the conversion of arachidonic acid (AA) and O2 to generate prostaglandins (PGs).
Whereas COX-1 is constitutively expressed, COX-2 is inducible expressed in most
mammalian cells. COX-2 plays a major role in inflammatory processes, and its
expression has been correlated with several diseases associated with inflammation
(Eberhart et al., 1994, Dubois et al., 1998).
As mentioned previously (Dumais et al., 1998, Straus et al., 2000), NF-кB can
up-regulate COX-2 expression. Additionally, recent evidence indicates that COX-2
activity may also affect NF-кB. NF-кB transactivation is increased by PGE2, resulting
in an overexpression of inflammatory genes, such as IL-8. When there are more
cyclopentenone prostaglandins than PGE2, the first ones inhibit the IKK
phosphorylation and consequently the NF-кB activation.
Finally, the inflammation is reduced by a negative feedback cycle reducing NF-
кB activity by decreased COX-2 gene expression (Figure 5.1).
Figure 5.1. Positive and negative regulation of NF-кB by COX-2, roles of prostaglandins.
Adapted of (Poligone and Baldwin, 2001)
Discussion
240
Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) inhibit COX-2 expression and
reduce prostaglandin synthesis too (Aeberhard et al., 1995). It is known that some anti-
inflammatory agents (e.g. salicylates, dexamethasone, indomethacin) can diminish
muscle inflammation by inhibiting NF-кB via COX-2 suppression (Pizza et al., 1998).
In our study we used the indomethacin administration as an anti-inflammatory
agent. To verify that the effect of indomethacin in NF-кB inhibition had successfully
occurred, we measured the plasmatic prostaglandin levels (See figure 4.26). We found
that plasmatic prostaglandin levels were elevated significantly after 2 weeks of hindlimb
unloading. Treatment with allopurinol and indomethacin plus allopurinol completely
inhibited this increase but not the indomethacin administration alone (Figure 4.26). This
was an unexpected result that could be explain if we take into account that the
indomethacin treatment possibly induced certain level of renal toxicity. We observed
intracellular edema and signs of inflammation in the renal cortex in the indomethacin
treated animals. Regarding the results obtained on the effect of the allopurinol
administration on the prostaglandin levels it is important to mention that allopurinol
prevents kidney diseases (Siu et al., 2006, Goicoechea et al., 2010, Thurston et al.,
2013, Bose et al., 2014). Moreover we would like to point out that administration of
allopurinol has been highlighted as an important anti-inflammatory in many diseases,
including renal failure (Goicoechea et al., 2010, Thurston et al., 2013, Bhasin et al.,
2014). Therefore, we can see that both the administration of allopurinol and its
combination with indomethacin reduces prostaglandin synthesis by inhibiting COX-2.
This suggests that NF-кB activation may be decreased through the COX-2 inhibition
(Egan et al., 2004, Granado et al., 2007).
During the last decade, skeletal muscle has been identified as a both endocrine
and paracrine organ secreting the cytokines called miokines. IL-6 is a pleiotropic
cytokine associated with the control and coordination of immune responses (Serrano et
al., 2008) and it is mainly produced by the adipose tissue and skeletal muscle (Glund
and Krook, 2008). A conventional view has attributed an inflammatory role to IL-6, by
mediating the activation of anti-inflammatory pathways on target cells. High plasma
concentrations of IL-6 have been found in pathological conditions such as sarcopenia in
the elderly, cachexia, and insulin resistance (Kern et al., 2001, Baltgalvis et al., 2008).
Chronic IL-6 administration directly to skeletal muscle induces atrophy (Haddad et al.,
Discussion
241
2005). Transgenic mice over-expressing IL-6 at high levels in all tissues and in the
system also demonstrate muscle atrophy (Tsujinaka et al., 1995). However, this role of
IL-6 has been recently questioned. In the last years a growing body of experimental data
indicates the involvement of IL-6 as an anti-inflammatory molecule that plays an
important role in the regulation of muscle cells. Notably, the beneficial function of local
and transiently produced IL-6 is opposed to the known muscle-wasting effect of infused
IL-6 or high systemic levels of IL-6 in cachexic conditions (Haddad et al., 2005,
Tisdale, 2005). IL-6 is also a muscle mitogen that can activate cell proliferation in
skeletal muscle (Cantini et al., 1995), including satellite cells (Hawke and Garry, 2001).
Years ago it was confirmed that both human primary myoblasts and murine
C2C12 myogenic cells produce IL-6. (Bartoccioni et al., 1994, De Rossi et al., 2000).
Later it was shown that IL-6 increased in response to hypertrophic stimulus such as
contracting muscle fibers (i.e. during exercise (Pedersen and Fischer, 2007)) and
workload (Jonsdottir et al., 2000, Keller et al., 2001, Carson et al., 2002, Penkowa et al.,
2003, Hiscock et al., 2004) inducing satellite cell activation and stimulating an increase
in muscle mass. Subsequently it has been shown that IL-6 induces satellite cell
proliferation (Kurosaka and Machida, 2013). Other studies have shown that IL-6
regulates muscle growth, as the IL-6 deficient knockout mice muscle decreases the
growth of muscle fibers (Serrano et al., 2008, Washington et al., 2011). Additionally the
deficiency of IL-6 causes problems in the proliferation and migration of satellite cells,
causing the same effect in myoblasts, precluding subsequent myonuclear accumulation
in the existing myofibers (Serrano et al., 2008).
It has been shown that muscle IL-6 expression is increased during recovery from
disuse atrophy (Childs et al., 2003). After induction of muscle atrophy by hindlimb
unloading for 10 days in wild type and IL-6 knockout mice, Washington et al. used four
different periods of recovery (0, 1, 7, 14 days). Their results showed the same atrophy in
both groups after 10 days of unloading. However, mice lacking IL-6 had attenuated
recovery in the gastrocnemius muscle mass. This was related to the initial suppression
of muscle IGF-1 expression and associated Akt/mTOR activation and to the STAT3
(Serrano et al., 2008).
Taking this background into account to find a marked inflammation (measured
at the level of prostaglandins) we decided to measure the muscle IL-6 levels in our mice
following 14 days of unloading and the effect of the different treatments.
Discussion
242
Our results agree with those obtained in studies describing the IL-6 as an anti-
inflammatory miokine. We found that soleus muscle concentration of IL-6 was
decreased during 14 days of hindlimb unloading. Both, allopurinol treatment and the
combined treatment, indomethacin plus allopurinol, inhibited significantly this increase,
while indomethacin administration alone prevented it only partially (Figure 4.27).
We are aware of the discrepancies in the results found between the rat and
mouse models. Apart from all the comments on this regard that we have included in
"limitations of the study", we consider that we should open a debate to highlight the
existing problem that the scientific community have with the experimental models
(Jelnes et al., 2007, Byrnes et al., 2010). Several researchers believe that the results
from animal experiments cannot be applied to humans because of the biological
differences between the species and because the results in animal experiments often
depend on the type of animal model (Croce, 1999, Sandercock and Roberts, 2002,
Macleod M, 2005). For instance, it has been shown that genomic responses in mouse
models poorly mimic human inflammatory diseases (Seok et al., 2013). Therefore we
consider that it is convenient to perform human clinical trials before extrapolating the
data obtained in this doctoral thesis to humans.
Discussion
243
5.7. Skeltal muscle atrophy associated to STZ-induced type 1
diabetes.
Oligosaccharides are regarded as prebiotics (Gibson and Roberfroid, 1995,
Gibson, 2010). Prebiotics are defined as “non-digestible dietary ingredients that
beneficially affect the host by selectively stimulating the growth and/or activity of one
or a limited number of bacteria in the colon, thus improving host health” (Gibson and
Roberfroid, 1995). In the most recently updated definition, “a dietary prebiotic is a
selectively fermented ingredient that results in specific changes in the composition
and/or activity of the gastrointestinal microbiota, thus conferring benefit(s) upon host
health” (Gibson et al., 2010). Oligosaccharides have been reported to decrease the
incidence of chronic diseases such as insulin resistance, diabetes mellitus, hypertension,
and metabolic syndrome (Alvarez-Sala Walther et al., 1996, Cani et al., 2007).
Moreover, recently it has been tested the role of oligosaccharides in the
prevention of muscle atrophy in type 2 diabetes (Xu et al., 2011, Lin et al., 2011, Li et
al., 2012). We wanted to test the effects of an α-galacto-oligosaccharide (OGT) in the
prevention of muscle atrophy in STZ-diabetic rats.
In our study the diabetes was confirmed by the increment of fasting glucose and
fructosamine plasmatic levels in STZ-induced diabetic rats relative to the control group
(Table 4.1). In addition, we found lower fasting insulin levels in diabetic animals. As
insulin is the major regulator of muscle insulin uptake, it could give us an idea of that
was disrupted the insulin-stimulated glucose uptake into muscle too (Jensen et al.,
2011).
We found that the treatment with OGT decreased significantly only the plasma
fructosamin values. It indicates that hyperglycemia was lasted all the experiment and
was associated with a pro-oxidant state, inasmuch as fructosamin level is considered as
a marker of glycated proteins (Poli et al., 1987), and that OGT treatment can prevents it.
Since the late 80's to the present it has been confirmed that muscle atrophy in
STZ-induced type 1 diabetes is characterized by an increase in muscle protein
degradation and a decrease in its synthesis (Smith et al., 1989) leading to a reduction in
muscle size (Price et al., 1996, Lecker et al., 2004). Several researchers have found that
Discussion
244
rodents supplemented with vitamin E and dehydroepiandrosterone (multifunctional
steroid secreted by the adrenal gland and brain with antioxidant properties) (Aragno et
al., 2002, Aragno et al., 2004), and submitted to exercise training (Chen et al., 2011),
exhibit less oxidative damage and muscle atrophy in STZ-diabetes models.
In our study, we weighed the anterior tibial and gastrocnemius muscles. We
found a significant decrease in their weights (44.2% and 42.1%). That were prevented
significantly by 12.5% and 15.3% respectively after administration of GOT (Figure
4.34).
Hyperglycemia, which occurs in STZ-induced diabetes, is associated with
oxisative stress (Bonnefont-Rousselot et al., 2000). In diabetes the oxidative injury is
mainly attributable to increased production of ROS and changes of the antioxidant
defense systems (Chang et al., 1993, Baynes and Thorpe, 1999). Superoxide dismutase
(SOD) is a crucial enzymatic defense system with an antioxidant role conferred, that
plays an important role in controlling the oxidation level of constitutive cellular
components (Brocca et al., 2008). For these reasons we measured the two forms of
superoxide dismutase in the atrophied muscle. We found that T1DM decreased
significantly the protein levels of the MnSOD in the tibialis anterior of the rats (-38.5%;
p<0.01) (Figure 4.35A). Treatment with OGT partially prevented this decrement (-
25.5%). On the other hand, Figure 4.35B shows that T1DM did not produce changes in
the levels of CuZnSOD. Suggesting that mitochondria have a great involvement in
skeletal muscle atrophy in this model.
The relationship between diabetes, phosphorylation of p38, and protein
degradation in skeletal muscle was observed in type 2 diabetic patients (Koistinen et al.,
2003). It was proposed that direct exposure of mammalian skeletal muscle to an
oxidative stress disturbs the insulin signaling pathway via the stimulation of p38 MAPK
(Henriksen et al., 2011). Also, it has been described the increased phosphorylation of p-
38 in skeletal muscle of STZ-diabetic rats (Hsu et al., 2013). Our study shows that in
skeletal muscle, STZ treatment up-regulates p38 MAPK phosphorylation. Interestingly,
OGT treatment prevents p38 MAPK activation (Figure 4.36).
Discussion
245
It can give us an idea that OGT supplementation partially prevents the loss of
muscle mass due to T1DM, maybe by limiting oxidative stress and p38 pathway
activation.
Finally, type 1 diabetes is an autoimmune inflammatory disease of the pancreatic
islets (Dixon et al., 2001). Several important pathophysiological development of
complications associated with this disease (hyperglycemia, hyperlipidemia, formation
and accumulation of advanced glycation end products, oxidative stress) and the
progressive and simultaneous decline of antioxidant defense mechanisms factors may
lead to the activation of NF-кB (El-Serag and Everhart, 2002, El-Serag et al., 2004).
Previously, it was confirmed that muscles from STZ-injected rats display
increased NF-кBp65 content without activation of the canonical pathway (Frier et al.,
2008, Kelleher et al., 2010).
Our results show that the NF-кBp65 content increased 38.7% (p=0.08) in the
cytosolic fractions of tibialis anterior of the diabetic animals, but the treatment with
OGT did not prevent this increment (-15.4%) (Figure 4.37).
Dr. Delamarche’s group demonstrated previously that the same α-galacto-
oligosaccharide combined with soy isoflavones supplementation normalized muscle
glucose level without restoring glycogen content and exhibited antioxidant and anti-
inflammatory properties in vivo in streptozotocin-induced diabetic rats. (Malardé et al.,
2013). Displaying these results we can hypothesize that the administration of the soy-
isoflavones plus the OGT could have a greater effect in preventing muscle atrophy in
STZ-induced diabetes.
CONCLUSIONES/CONCLUSIONS
Conclusiones
249
Los estudios realizados y los resultados descritos anteriormente permiten extraer
las siguientes conclusiones:
1. La actividad de la XO aumenta tras aplicar un protocolo de suspensión de
miembros posteriores tanto en ratas como ratones. Este aumento se previene
completamente mediante la administración de alopurinol.
2. La suspensión de miembros posteriores induce una disminución del mediador
inflamatorio IL-6 en el músculo esquelético y un aumento periférico de la 6-keto
prostaglandina F1α. Los tratamientos más efectivos para restituirlos son el
alopurinol y la indometacina más alopurinol.
3. El protocolo de suspensión de miembros posteriores induce una significativa
atrofia muscular (disminución del peso de los soleos, del CSA, del tamaño de las
fibras y del contenido de miosina). Los tratamientos con alopurinol,
indometacina, así como la supresión muscular de IKKα previene parcialmente
dicha atrofia muscular, siendo el tratamiento más efectivo la coadministración
de indometacina más alopurinol.
4. La suspensión de miembros posteriores origina la activación de dos cascadas de
señalización (p38-MAFbx) y (NF-кB-MuRF1-MHC1). El tratamiento con
alopurinol inhibe la primera vía, observándose incongruencias en la inhibición
de la vía NF-кB-MuRF1-MHC1, en ratas. No obstante, en ratones, el
tratamiento más efectivo para inhibir ambas vías fue la administración de
indometacina más alopurinol. La supresión muscular de IKKα inhibe
significativamente la vía dependiente de NF-кB.
5. La suspensión de miembros posteriores aumenta la expresión de la E3 ubiquitin-
ligasa Cbl-b, provocando una disminución de Akt. Los tratamientos con
alopurinol e indometacina más alopurinol restituyen dicha vía de síntesis
proteica, mientras que en los ratones mIKKα KO se revierte parcialmente.
6. El estrés oxidativo asociado a la diabetes inducida por estreptozotocina en ratas
produce una significativa pérdida de masa muscular.
7. Tanto la fosforilación de p38, como de NF-кB aumenta en el músculo atrofiado
en ratas diabéticas.
Conclusiones
250
8. La administración de α-galacto-oligosacáridos previene la disminución de la
enzima antioxidante MnSOD, así como la fosforilación de p38, sin observarse
una prevención significativa en la pérdida de masa muscular de las ratas
diabéticas.
Conclusions
251
Studies carried out and the results described above lead to the following
conclusions:
1. Rat and mouse XO activity is increased after a hindlimb unloading protocol.
Allopurinol administration prevents this increase.
2. Hindlimb unloading protocols induce a decrease in IL-6 skeletal muscle and an
increase of 6-keto prostaglandin F1α. Allopurinol and the combination of
indomethacin and allopurinol are the most effective treatments to restitute their
initial levels.
3. Hindlimb unloading protocols induce a significant muscle atrophy (decrease of
soleus weight, CSA, fiber size and myosin content). Treatment with allopurinol
and indomethacin, as well as muscle suppression of IKKα partially prevent this
atrophy, the coadministration of allopurinol and indomethacin being the most
effective treatment.
4. Hindlimb unloading protocol activate two signaling pathways: p38-MAFbx and
NF-кB-MuRF1-MHC1. Allopurinol treatment inhibits the former, although
some inconsistencies were found in the inhibition of the NF-кB-MuRF1-MHC1
pathway in rats. In any case, in mice, the coadministration of allopurinol and
indomethacin was the most effective treatment to inhibit the NF-кB dependent
pathway.
5. Hindlimb unloading protocol increase E3 ubiquitin ligase Cbl-b, thereby
decreasing Akt. The treatments with allopurinol and the coadministration of
allopurinol and indomethacin restore this protein synthesis pathway, while it is
partially reverted in mIKKα KO mice.
6. Oxidative stress associated to diabetes induced by streptozotocine in rats
produces a significant loss of muscle mass.
7. Both phosphorylation of p38 and NF-кB are increased in the atrophied muscle in
diabetic rats.
Conclusions
252
8. α-galacto-oligosaccharides administration prevents the reduction of the MnSOD
antioxidant enzyme, as well as the p38 phosphorylation, but a significant
prevention of muscle mass loss is not observed in diabetic rats.
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ANEXO
Inhibition of Xanthine Oxidase by Allopurinol PreventsSkeletal Muscle Atrophy: Role of p38 MAPKinase and E3Ubiquitin LigasesFrederic Derbre2., Beatriz Ferrando1., Mari Carmen Gomez-Cabrera1., Fabian Sanchis-Gomar1,
Vladimir E. Martinez-Bello1, Gloria Olaso-Gonzalez1, Ana Diaz3, Arlette Gratas-Delamarche1,
Miguel Cerda4, Jose Vina1*
1 Department of Physiology, University of Valencia, Fundacion Investigacion Hospital Clinico Universitario/INCLIVA, Valencia, Spain, 2 Laboratory ‘‘Movement Sport and
Health Sciences’’, University Rennes 2-ENS Cachan, Rennes, France, 3 UCIM, Faculty of Medicine, University of Valencia, Valencia, Spain, 4 Department of Pathology,
University of Valencia, Valencia, Spain
Abstract
Alterations in muscle play an important role in common diseases and conditions. Reactive oxygen species (ROS) aregenerated during hindlimb unloading due, at least in part, to the activation of xanthine oxidase (XO). The major aim of thisstudy was to determine the mechanism by which XO activation causes unloading-induced muscle atrophy in rats, and itspossible prevention by allopurinol, a well-known inhibitor of this enzyme. For this purpose we studied one of the mainredox sensitive signalling cascades involved in skeletal muscle atrophy i.e. p38 MAPKinase, and the expression of two wellknown muscle specific E3 ubiquitin ligases involved in proteolysis, the Muscle atrophy F-Box (MAFbx; also known as atrogin-1) and Muscle RING (Really Interesting New Gene) Finger-1 (MuRF-1). We found that hindlimb unloading induced asignificant increase in XO activity and in the protein expression of the antioxidant enzymes CuZnSOD and Catalase inskeletal muscle. The most relevant new fact reported in this paper is that inhibition of XO with allopurinol, a drug widelyused in clinical practice, prevents soleus muscle atrophy by ,20% after hindlimb unloading. This was associated with theinhibition of the p38 MAPK-MAFbx pathway. Our data suggest that XO was involved in the loss of muscle mass via theactivation of the p38MAPK-MAFbx pathway in unloaded muscle atrophy. Thus, allopurinol may have clinical benefits tocombat skeletal muscle atrophy in bedridden, astronauts, sarcopenic, and cachexic patients.
Citation: Derbre F, Ferrando B, Gomez-Cabrera MC, Sanchis-Gomar F, Martinez-Bello VE, et al. (2012) Inhibition of Xanthine Oxidase by Allopurinol PreventsSkeletal Muscle Atrophy: Role of p38 MAPKinase and E3 Ubiquitin Ligases. PLoS ONE 7(10): e46668. doi:10.1371/journal.pone.0046668
Editor: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada
Received March 28, 2012; Accepted September 4, 2012; Published October 5, 2012
Copyright: � 2012 Derbre et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This work is supported by grants SAF2010-19498, from the Spanish Ministry of Education and Science; PROMETEO/2010/074 from the Consellerıa deEducacion de la Generalitat Valenciana. ISCIII2006-RED13-027 from the ‘‘Red Tematica de Investigacion Cooperativa en Envejecimiento y Fragilidad (RETICEF)’’, EUFunded COSTB35 and DPS2008- 06968 from Spanish Ministry of Innovation and Science. The studies have also been co-financed by FEDER funds from theEuropean Union. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: [email protected]
. These authors contributed equally to this work.
Introduction
Skeletal muscle atrophy is a debilitating consequence of multiple
chronic diseases and conditions. It reduces treatment options and
positive clinical outcomes as well as compromising quality of life
and increasing morbidity and mortality [1]. Both systemic and
local factors can initiate muscle atrophy. Systemic factors include
increased myostatin and glucocorticoids; or a lack of anabolic
hormones such as insulin or insulin-like growth factor-1 [2]. Local
factors include muscle inactivity, muscle denervation or muscular
dystrophies, and muscle ageing [3].
Muscle atrophy and weakness are linked to oxidative stress in
several conditions: limb immobilization [4], hindlimb-unloading
[5,6,7,8,9], chronic obstructive pulmonary disease [10] and sepsis
[11]. Numerous cellular sites of ROS production exist in skeletal
muscle, including NAD(P)H oxidase, nitric oxide synthase, heme
oxygenase-1, mitochondria, and XO. The involvement of each of
these oxidant sources in chronic ROS overproduction during
muscular inactivity remains a topic of debate. Xanthine oxidore-
ductase (XOR) is an intracellular enzyme involved in purine
catabolism. This enzyme catalyzes the reduction of hypoxanthine
and xanthine to uric acid [12]. XOR exists in two interconvertible
forms, xanthine dehydrogenase (XDH) and XO. In the oxidase
form, molecular oxygen is used as the electron acceptor and
hypoxanthine and xanthine are reduced to uric acid and
superoxide. During activating conditions, XDH can be converted
to XO via sulfhydryl oxidation or proteolytic cleavage. McCord et
al. found that XO plays an essential role in ischemia-reperfusion
injury [13]. Moreover, XO is a source of oxidant production in
immobilized rats [14], in hindlimb unloading [8], in mechanical
ventilation-induced diaphragmatic contractile dysfunction [15],
and in cachexia [16]. However, the molecular mechanism(s) by
which this enzyme elicits skeletal muscle atrophy remains
unknown.
Allopurinol is a well-known inhibitor of XOR widely used in
clinical practice [17]. We have previously reported that allopurinol
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prevents muscle oxidative damage during exhaustive physical
exercise by inhibiting the MAPKinase/NF-kB cell signalling
pathways [18,19]. P38 MAPK mediates oxidative stress-sensitive
cell signalling pathways and it has been suggested that chronic
ROS overproduction plays a role in its activation during muscular
inactivity [20,21].
The loss in muscle mass during muscular inactivity is caused by
both apoptosis of myonuclei [22] and by an imbalance between
protein synthesis and degradation [23]. The discovery of two
muscle-specific E3 ubiquitin ligases, Muscle atrophy F-Box
(MAFbx; also known as atrogin-1) and Muscle RING (Really
Interesting New Gene) Finger-1 (MuRF-1), prompted renewed
expectation in identifying muscle-specific targets for therapeutic
manipulation. MAFbx and MuRF-1 belong to the ubiquitin
proteasome pathway, the primary pathway involved in intracel-
lular protein degradation in skeletal muscle [24]. MAFbx and
MuRF-1 regulate the degradation of key proteins involved in
striated muscle growth and differentiation, including MyoD,
calcineurin, troponin-I, titin and myosin heavy and light chains
[25,26].
The major aim of this study was to determine the mechanism(s)
by which XO activation causes unloading-induced muscle atrophy
and its possible prevention by allopurinol.
We have found that in unloaded muscles, XO activates the p38
MAPK which leads to the activation of the E3 ubiquitin ligases
MAFbx. Both mechanisms trigger massive degradation of muscle
proteins that is significantly prevented by allopurinol administra-
tion.
Results
Soleus muscle atrophyWe used different methods to determine the role of XO in the
hindlimb unloading-induced soleus muscle atrophy. Hindlimb
suspension for 14 days caused a significant decrease in the cross-
sectional area of soleus muscle. Administration of allopurinol
significantly prevented this decrement (Figure 1, panels A and B).
Moreover, soleus muscle to body mass ratio was significantly
reduced after 14 days of unloading (49%, p,0.001). This muscle
atrophy was reduced to only 30% in the allopurinol treated
animals (p,0.01 vs unloaded group with water) (Figure 1, panel
C). We further tested the effect of inhibiting XO in the
maintenance of muscle integrity by determining the protein
content of an important component of the sarcomere, the slow
Myosin Heavy Chain (MHC) protein. Figure 1, panel D, shows
that after unloading there was a significant decrease in the protein
content of MHC in soleus muscle. In this case we found only a
partial prevention after treatment with allopurinol.
XO activityRat plasma (Figure 2A) and soleus muscle (Figure 2B) XO
activity increased significantly after two weeks of hindlimb
unloading. As expected, treatment with allopurinol completely
inhibited XO activation both in plasma and in skeletal muscle.
Oxidative stressAs shown in Figure 3, hindlimb unloading caused a significant
increase in skeletal muscle oxidative stress evidenced by carbon-
ylation of soleus proteins. A protein(s) with a molecular weight of
65 kDa was significantly carbonylated in the muscle of unloaded
rats (Figure 3A). We also determined plasma protein carbonylation
in our animals. Figure 3B shows a significant increase in the
carbonylation of low-molecular weight proteins (less than 50 kDa)
in the samples of the unloaded animals that received water. A
trend for allopurinol prevention of protein oxidation was found
although it did not reach statistical significance either in the soleus
or in plasma.
Antioxidant enzymesHindlimb unloading increased the protein levels of the cytosolic
CuZnSOD in the soleus muscle of the rats (Figure 4A). Catalase
protein levels were also elevated in the soleus muscle of the
unloaded animals (Figure 4B). Treatment with allopurinol did not
prevent the unloading-induced increase of these antioxidant
enzymes.
p38 MAPKp38 MAPK plays an important role in the coordination of the
cellular responses to many stress stimuli, including oxidative stress
[27]. Thus, we tested whether XO-derived ROS were involved in
the activation of p38 MAPK in soleus muscle. Figure 5 shows a
significant increase in the phosporylation of p38 MAPKinase in
the soleus muscle of the unloaded animals. Allopurinol treatment
completely prevented the p38 phosporylation. Total p38 protein
levels were unaltered in the different experimental groups. The
content of a-actin, a housekeeping protein marker in muscle, was
not altered in the various treatment groups of rats (data not
shown).
E3 ubiquitin ligases MAFbx and MuRF-1To finally identify the mechanism by which allopurinol prevents
the loss of muscle mass after hindlimb unloading, we determined
the expression, in soleus muscle, of two well-known muscle specific
E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx and MuRF-1 [28]. As shown
in Figure 6 we found a very significant increase in MAFbx mRNA
expression in the soleus muscle of the unloaded animals and a
significant prevention after treatment with allopurinol. It has been
previously shown that p38 activity stimulates the expression of
MAFbx [21]. Thus, our results are consistent with the idea that
XO-derived radicals activate p38 and subsequently MAFbx
ubiquitin ligase. This triggers protein degradation and muscle
mass loss. All this is prevented by allopurinol. Regarding MuRF-1,
our results show that hindlimb unloading induced its expression in
the soleus muscle. However, although a tendency was found
(p = 0.09), we find no prevention after allopurinol treatment (data
not shown).
Discussion
XO is involved in the oxidative stress and soleus muscleatrophy associated to hindlimb unloading
Alterations in muscle play an important role in the most
common diseases and conditions. For instance heart disease and
cancer (two of the most prevalent chronic diseases) are often
associated with rapid and extensive loss of muscle mass, strength,
and metabolic function [29]. This loss of muscle mass is an
important determinant of survival. Preservation of skeletal muscle
is also critical during aging. Sarcopenia, the loss of muscle mass
and strength that occurs with aging, is a widespread syndrome that
has a devastating effect on quality of life and ultimately survival
[30]. Here we demonstrate that treatment with allopurinol
significantly prevents skeletal muscle atrophy after hindlimb
unloading in rats. We found a remarkable decrease in the cross-
sectional area of the rat’s soleus muscle after unloading and a
significant prevention after treatment with allopurinol (Figure 1,
panel A and B). We also measured the soleus muscle atrophy by
weighting the muscles, and we found a 20% prevention in the
unloading-induced soleus atrophy under allopurinol treatment
Xanthine Oxidase Is Involved in Muscle Atrophy
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(p,0.01) (Figure 1, panel C). We further tested the effect of
inhibiting XO in the maintenance of muscle integrity by
determining the protein content of an important component of
the sarcomere, the slow MHC protein. Figure 1, panel D, shows
that after unloading there was a dramatic decrease in the protein
content of MHC. In this case, we found only a partial prevention
after treatment with allopurinol.
Eighteen years ago, Kondo and co-workers observed that
muscle atrophy caused by hindlimb unloading was associated with
an increase in lipid peroxidation and oxidized glutathione in rat
skeletal muscle [4]. This first study was followed by substantial
investigations in rodents confirming that muscular inactivity
induces oxidative stress in skeletal muscle [31,32]. Although the
role of oxidative stress in muscle atrophy has been recently
questioned in the hindlimb unloading animal model [33], several
researchers have found that rodents supplemented with vitamin E
[9,34], Bowman-Birk inhibitor concentrate (soy protein with
antioxidant properties) [6], and resveratrol [7], exhibit less
oxidative damage and muscle atrophy in muscle disuse models
(including hindlimg unloading). However, the source(s) of ROS
production in the unloading models is still a subject of debate. In
the pioneer work by Kondo and co-workers the authors pointed to
XO as the main source of ROS production in the atrophied
muscles [4]. Several years later Matuszczak et al. found that
administration of allopurinol to mice had protective effects during
hindlimb unloading [8]. Although, contrary to our results, the XO
inhibitor did not decrease the atrophy caused by prolonged
unloading, it blunted the contractile dysfunction in soleus muscles.
Figure 1. Allopurinol prevents soleus muscle atrophy after 14 days of hindlimb unloading in rats. (A) The reticulin staining (Originalmagnification, 46) shows a significant decrease in the soleus muscle cross-sectional area after hindlimb unloading. Allopurinol partially prevents it(Scale bar, 1 mm). (B) Quantitative analyses were used to confirm histological findings, by comparing the cross-sectional area of the different groups:control rats with water (CW) (n = 3), control rats with allopurinol (CA) (n = 3), unloading rats with water (UW) (n = 3) and unloading rats with allopurinol(UA) (n = 3). (C) Soleus muscle to body mass ratio. Values are mean (6SD) in CW (n = 9), CA (n = 9), UW (n = 7), and UA (n = 7). (D) Western blot anddensitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain in CW (n = 3), CA (n = 3), UW (n = 3), and UA (n = 3). A two-factor ANOVA and posthoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g001
Xanthine Oxidase Is Involved in Muscle Atrophy
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We consider that it is possible that the higher dose of allopurinol
used in our study could explain the differences between
Matuszczak’s data and ours. Although in both studies the drug
dose was 50 mg.Kg21, if we take into account the differences in
the surface area between rats and mice, we administered 300 mg/
m2 of allopurinol in our rat study while they administered
150 mg/m2 of allopurinol in their mice study. Body surface area
has been recommended as the main basis for drug dosage, because
the rate of metabolism or redistribution of a drug is proportional to
the metabolic rate, which reflects heat losses that are generally
Figure 2. Hindlimb unloading activates plasma and soleus muscle XO. Prevention by allopurinol. Mean (6SD) results of XO activity inplasma (A) and soleus (B) of control with water (CW) (n = 9), control with allopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) and unloaded withallopurinol (UA) (n = 7) rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g002
Figure 3. Effect of unloading and allopurinol treatment on soleus muscle and plasma protein carbonylation. Mean (6SD) results ofsoleus muscle carbonylated proteins (A) of control with water (CW) (n = 9), control with allopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) andunloaded with allopurinol (UA) (n = 7) rats. Figure B represents carbonylation of low-molecular weight protein (less than 50 kDa) in plasma of thesame animals. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g003
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proportional to the surface area [35]. More recently the group of
Powers [15] showed that XO is involved in mechanical
ventilation-induced oxidative injury and contractile dysfunction
in the diaphragm. Respiratory muscle weakness produced by
mechanical ventilation is due to diaphragmatic contractile
dysfunction and atrophy and is directly linked to oxidative stress
[36]. However, the molecular mechanisms involved in the XO-
Figure 4. Effect of unloading and allopurinol treatment on the protein levels of soleus muscle antioxidant enzymes. Mean (6SD)results of CuZnSOD (A) and Catalase (B) protein levels in soleus muscle of control with water (CW) (n = 9), control with allopurinol (CA) (n = 9),unloaded with water (UW) (n = 7) and unloaded with allopurinol (UA) (n = 7) rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons wereused to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g004
Figure 5. Effect of unloading and allopurinol treatment on theactivation of p38 MAPK. Mean (6SD) results of cytosolic p38 MAPKin soleus muscle of control with water (CW) (n = 9), control withallopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) and unloadedwith allopurinol (UA) (n = 7) rats. Activation levels were expressed as theratio between phosphorylated and total protein content. A two-factorANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identifysignificant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g005
Figure 6. Effect of unloading and allopurinol treatment on theMAFbx levels in soleus muscle. Mean (6SD) results of MAFbxmRNA levels in soleus muscle of control with water (CW) (n = 9), controlwith allopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) andunloaded with allopurinol (UA) (n = 7) rats. A two-factor ANOVA andpost hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significantdifferences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g006
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mediated skeletal muscle atrophy are not well understood. We
have previously reported that inhibition of XO with allopurinol
prevents the exercise-induced oxidative stress in skeletal muscle by
inhibiting the MAPK/NF-kB signalling pathways [18,37]. Thus,
we aimed at determining the mechanism by which XO activation
causes unloading-induced muscle atrophy and its possible preven-
tion by allopurinol. We found a significant increase in plasma and
soleus muscle XO activity associated to hindlimb unloading that
was prevented completely by allopurinol treatment (See Figure 2).
It is generally accepted that the Ca+2-activated proteases
participate in the conversion of XDH into XO [13]. Kondo and
co-workers reported an increase of intracellular Ca+2 in atrophic
muscles using electron probe X-ray microanalysis [38]. Thus, the
increased intracellular Ca+2 might enhance the enzyme conversion
in the atrophied muscle through the activation of proteases [4].
We did not find a significant prevention of the protein oxidation
induced by hindlimb unloading after allopurinol administration.
Figure 3 shows a significant increase in the protein carbonylation
in the plasma and soleus muscle in the unloaded animals. A trend
for allopurinol prevention of protein oxidation was found although
it did not reach statistical significance. The failure of allopurinol
(or oxypurinol) to completely blunt the oxidative stress in skeletal
muscle using different unloading models has been previously
reported [8,15].
A complex cytoprotective system that includes antioxidant
enzymes is recruited against free radical damage. As previously
observed by different research groups, unloading induced the
expression of the antioxidant enzymes catalase and CuZnSOD in
soleus muscle [8,9]. These responses suggest that the muscle is
adapting to oxidative stress. Allopurinol administration did not
modulate the skeletal muscle antioxidant enzymes levels (See
Figure 4). Thus, our data support the idea that XO is not the only
source of ROS production in skeletal muscle during hindlimb
unloading.
Role of XO-derived ROS in the activation of thep38MAPK-E3 ubiquitin ligases signalling pathway duringhindlimb unloading
p38 is a stress-activated protein kinase that responds to a variety
of stimuli, including oxidative stress and TNF-a [39], and has been
identified as a likely mediator of catabolic signaling in skeletal
muscle [3,21]. Thus, we determined the phosphorylation of p38
MAPK in the soleus muscle samples. We found a significant
increase in p-p38 in the soleus of the unloaded animals that was
prevented by allopurinol administration (See Figure 5). Our results
are consistent with those reported by Childs et al. [40] which
found a 128% increase in p38 phosphorylation after 10 days of
hindlimb immobilization in rats. This was associated with a 38%
decrease in soleus muscle mass over the same period. One year
later Di Giovanni et al. [41] found that p38 phosphorylation was
elevated in atrophic muscles of patients with acute quadriplegic
myopathy and with neurogenic muscle atrophy. Other procata-
bolic conditions in which constitutive phosphorylation of skeletal
muscle p38 has been shown to be elevated include Type 2 diabetes
[42] and aging [43].
To identify the final mechanism by which allopurinol prevents
the loss of muscle mass after hindlimb unloading, we determined
the expression of two well known muscle specific E3 ubiquitin
ligases involved in several in vivo models of skeletal muscle atrophy,
MAFbx and MuRF-1 [28]. MAFbx and/or MuRF-1 mRNA are
up-regulated following immobilisation in humans, hibernating
squirrels, mice and rats [28]. The increases in MAFbx and MuRF-
1 are associated with immobilisation-induced increases in protea-
some dependent proteolysis. Treatments such as vitamin E [9] and
resistance exercise [44] blunt the induction of the atrogenes
following limb unloading.
Reid and co-workers showed in 2005 that p38 signalling
promotes skeletal muscle atrophy through the expression of
MAFbx in myotubes [21] but this was never tested in whole
muscle in vivo. Figure 6 shows a very significant increase in MAFbx
mRNA expression in the skeletal muscle of the unloaded animals
and a partial prevention after treatment with allopurinol. Our data
suggest that MAFbx gene is a downstream target of p38 MAPK
signaling. This is consistent with the concept that pathologic
elevation of p38 activity favours protein degradation and muscle
atrophy. Our study does not identify the mechanism by which p38
increases MAFbx mRNA levels. It has been previously hypoth-
esized that p38 MAPK can contribute to the activation of Foxo
(forkhead-type) transcription factors that have been identified as an
essential regulator of MAFbx in skeletal muscle [21,45].
Novel potential atrogenes have been identified using microarray
analysis [46]. In 2009 it was shown that induction of Cbl-b (a
RING-type ubiquitin ligase) in vivo was required for the loss of
muscle mass in response to unloading [47]. Thus, apart from
MuRF-1 and MAFbx, this ubiquitin ligase should be also properly
studied in future experimental designs.
Collectively, our data suggest that XO is involved in the
activation of the p38MAPK-MAFbx pathway in unloaded muscle
atrophy. We have shown that allopurinol treatment, during
unloading, completely prevents the activation of XO and partially
prevents the loss of muscle mass in soleus muscle. One of the main
oxidative-stress signalling cascades, p38-MAPKinase, is activated
after 14 days of hindlimb unloading. This activation coincides with
the increase in the mRNA expression of the proteolytic E3
ubiquitin ligases MuRF-1 and MAFbx in soleus muscle. Allopu-
rinol treatment significantly prevents the activation of the p38
Figure 7. Allopurinol prevents the loss of muscle mass duringhindlimb unloading via inhibition of p38 MAPK and the E3ubiquitin ligase Atrogin1/MAFbx.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g007
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MAPK-MAFbx pathway but not MuRF-1 one. A schematic
interpretation of our results is in Figure 7.
Recent findings show that inhibition of XO reduces oxidative
stress and improves skeletal muscle function in response to
electrically-stimulation in aged mice [48]. Hyperuricaemia has
been observed to be a negative prognostic marker in end-stage
cancer patients [49]. Moreover, elevated uric acid levels, resulting
from up-regulated XO activity, have been shown to have
predictive value for mortality in chronic heart failure [50]. Our
data support the idea that XO is not the only source of ROS
production in the skeletal muscle during hindlimb unloading, but
point out the potential benefit of allopurinol administration for
bedridden, astronauts, sarcopenic and cachexic patients.
Materials and Methods
Animal care and protocolThe experimental protocol was approved by the Committee on
Ethics in Research of the Faculty of Medicine, University of
Valencia.
Thirty-two young male Wistar rats (,300 g) were housed in a
temperature-controlled room (2462uC) with a light-dark cycle
(12:12 h). After one week of acclimation, the rats were assigned
randomly to one of four experimental conditions: freely ambulat-
ing with water (CW) (n = 9); freely ambulating treated with
allopurinol (CA) (n = 9); hindlimb unloaded with water (UW)
(n = 7); or hindlimb unloaded treated with allopurinol (UA) (n = 7).
Allopurinol (Sigma Chemical, St. Louis, MO) was administered
to the animals via the drinking water. An initial concentration of
25.6 mg.dl21 was adjusted daily to achieve a target of
50 mg.kg21.day21 as calculated for each animal based on daily
water intake. After a 48 h allopurinol pre-treatment, hindlimb
unloading was accomplished using the method of Morey-Holton
and Globus, a standard model used to unload antigravity muscles
[51]. In brief, ElastoplastH tape was wrapped along the long axis of
each animal’s tail. A metal clip on the tape was attached to a nylon
monofilament line via a stainless steel swivel. The distal end of the
nylon line was attached to an overhead support and was shortened
to suspend the animal in a 45u head-down tilt position. The swivel
enabled the animal to explore the cage (360u range of motion) and
obtain food and water freely. Animals were observed daily for
changes in appearance and activity. Each animal was weighed;
food, water, and allopurinol intakes were recorded; and the angle
of hindlimb suspension was adjusted if necessary. After 14 days of
conditioning, each animal was deeply anesthetized while hind-
limb-suspended. The animal then was removed from the
suspension device. Blood was obtained by venous puncture into
heparin-containing tubes. Soleus muscles were excised, weighed,
frozen in liquid nitrogen, and stored at 280uC until analysis. Rats
were then euthanized by an overdose of the anaesthetic.
Xanthine oxidase activityXO activity was measured in plasma and soleus muscle by the
fluorimetric method described in Beckman et al. [52]. Briefly,
isoxantopterine formation from pterine was followed fluorome-
trically as previously described (excitation at 345 nm and emission
at 390 nm) [53].
ImmunoblottingAliquots of muscle lysates (40–120 mg of proteins) were resolved
on 12.5% and 15% SDS-PAGE gels depending on the molecular
weight of the protein of interest [54]. Proteins were then
transferred to nitrocellulose membranes, which were incubated
overnight at 4uC with appropriate primary antibodies: anti-
CuZnSOD (1:5000, NovusBio), anti-Catalase (1:5000, Sigma
Aldrich, Missouri), anti-a-actin (1:700, Sigma Aldrich), anti-p38
MAPK, anti-Phospho-p38 MAPK (1:1000, Cell Signaling), and
anti-MHC (1:10000, Chemicon Millipore). Thereafter, mem-
branes were incubated with a secondary antibody for 1 h at room
temperature. Specific proteins were visualized by using the
enhanced chemiluminescence procedure as specified by the
manufacturer (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Autora-
diographic signals were assessed by using a scanning densitometer
(BioRad, Hercules, CA).
HistologyThe soleus muscle samples were formalin-fixed and paraffin-
embedded in blocks. Nine serial transverse sections of 5 mm were
obtained from each sample using a LEICA RM 2245 microtome
and were mounted on glass slides, three cuts in each. The cuts
were performed in the wider part of the soleus muscle.
Subsequently, the sections were stained using the Gomori method
for the reticulin stain. All the histological sections were visualized
using a LEICA DMD 108 light microscopy. These samples were
used to measure the cross-sectional areas of each muscle,
determined per field using the Img.Pro.Plus.6 software from
captured images at 46.
RNA isolation, reverse transcription and PCRTotal RNA was isolated with the RNeasyH Fibrous Tissue Mini
Kit (Quiagen, Madrid, Spain) following the manufacturer’s
instructions and the final pellets were resuspended in 20 mL of
nuclease-free H2O. The purity of the samples was assessed
determining the 260/280 nm ratio, which was always above 1.9.
We synthesized cDNA from 1 mg of RNA using random hexamer
primers and the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
(Applied Biosystems, Madrid, Spain). Reverse transcription
conditions comprised an initial incubation step at 25uC for
10 minutes to allow random hexamers annealing, followed by
cDNA synthesis at 37uC for 120 minutes, and final inactivation
step for 5 minutes at 95uC. Real-time PCR was performed with an
ABI 7900 sequence-detection system (Applied Biosystems, Madrid,
Spain). Primers for amplifying specific fragments of the genes were
obtained from Thermo Fisher Scientific GmbH (Ulm, Germany).
The specific primers used in our experiments are shown in Table 1.
Real-time PCR was performed in duplicate in a total reaction
volume of 20 mL using MaximaTM SYBR green/ROX qPCR
Master Mix (Fermentas, Madrid, Spain). The thermal cycling
protocol was as follows: initial denaturation for 10 minutes at
95uC was followed by 40 cycles of 10 seconds at 95uC, 10 s at
62uC and 10 s at 72uC. The fluorescence signal was measured at
the end of each extension step at 72uC. At the end of each
reaction, a melting curve analysis was performed to confirm that
only the specific products were amplified. The threshold cycle (Ct)
was converted to a relative gene expression by using a standard
curve. For each sample, the expression of the target gene was
normalized with the cyclophilin mRNA content.
Protein carbonylationOxidative modification of total proteins in plasma and skeletal
muscle fractions were assessed by immunoblot detection of protein
carbonyl groups using the ‘OxyBlot’ protein oxidation kit
(Intergen) as previously described [55]. Approximately 20 mg of
total protein was loaded onto gels and electrophoretically
separated. Antibody anti-dinitrophenylhydrazone was purchased
from Intergen Company (Purchase, NY). The procedure to
quantify total protein carbonyls with the OxyBlot kit was
densitometry of the blotting and of the Ponceau red staining (data
Xanthine Oxidase Is Involved in Muscle Atrophy
PLOS ONE | www.plosone.org 7 October 2012 | Volume 7 | Issue 10 | e46668
not shown), followed by finding the ratio between the total density
in the oxyblot and the total density in the Ponceau red staining.
Specific proteins were visualised by using the enhanced chemilu-
minescence (ECL) procedure as specified by the manufacturer
(Amersham). Autoradiographic signals were assessed using a
BioRad scanning densitometer.
StatisticsResults are expressed as means 6 SDs. Normality of
distribution was checked with the Kolmogorov test, and homo-
geneity of variance was tested by Levene’s statistics. To test for
statistically significant differences between the groups, two-way
ANOVA was used. When significant F-ratios were observed, a
Bonferroni multiple comparison’s test was applied to test
individual means. Statistical significance was assumed at p,0.05.
Acknowledgments
The authors thank to Dr. Dominique Desplanches for useful discussions on
hindlimb unloading protocols that helped them to design the unloading
cages for rats.
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: JV AG-D. Performed the
experiments: FD BF MCG-C GO-G FS-G AD. Analyzed the data: VEM-
B. Contributed reagents/materials/analysis tools: MC. Wrote the paper:
JV MCG-C.
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Table 1. Primer sequences used for real-time PCR.
Sense Anti-sense
MAFbx 59- GCCTGAACTACGATGTTGCAG - 39 39- GCTGGTCTTCAAGAACTTTC - 59
MuRF1 59- AGGTGCCTACTTGCTCCTTGT - 39 39 - GCTGTTTCCACAAGCTTGGTC - 59
Cyclophilin 59- GTGGCAAGTCCATCTACGGAG - 39 39- CCACAGTCGGAGATGGTGATC-59
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