facultad de ciencias experimentales -...
TRANSCRIPT
1
UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Análisis microbiológico de productos lácteos
Facu
ltad
de C
ienc
ias
Exp
erim
enta
les
Gra
do e
n B
iolo
gía
Alumno: Alba Prieto Galera
Julio, 2018
2
Trabajo Fin de Grado
Análisis Microbiológico De Productos Lácteos
Facu
ltad
de C
ienc
ias
Exp
erim
enta
les
Gra
do e
n B
iolo
gía
UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
Alumno: Alba Prieto Galera
Julio, 2018
3
ÍNDICE
RESUMEN .......................................................................................................... 5 ABSTRACT ........................................................................................................ 5
1-INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 6
1.1 Composición de la leche ........................................................................ 6 1.2 Proceso de elaboración del queso ........................................................ 7 1.2.1 Cultivo de la leche con bacterias acido lácticas ................................. 8
1.2.2 Coagulación de la leche .................................................................... 9
1.2.3 Eliminación del suero ......................................................................... 9
1.2.4 Tratamiento de la cuajada ............................................................... 10
1.2.5 Producción de queso procesado ..................................................... 10
1.2.6 Maduración del queso ..................................................................... 10
1.3 Microorganismos en productos lácteos ............................................. 11 1.3.1 Bacilos Gram Negativos .................................................................. 11
1.3.2 Bacilos Gram positivos .................................................................... 12
1.3.3 Cocos Gram Positivos ..................................................................... 13
1.4 Fermentaciones de productos lácteos ................................................ 14 1.5 Refrigeración efecto sobre la microbiota ............................................ 14 1.6 Tratamientos térmicos a los que se somete la leche ......................... 14 2-OBJETIVOS .................................................................................................. 16 3-MATERIALES Y METODOS ......................................................................... 16 3.1 Alimentos utilizados ............................................................................. 16 3.2 Material de laboratorio .......................................................................... 16 3.3 Medios de cultivo y preparación de los mismos ................................ 18 3.3.1 Solución salina ................................................................................. 22
3.4 Procesado de los alimentos ................................................................. 22 3.5 Recuento e identificación preliminar................................................... 23 3.6 Tinción del Gram ................................................................................... 24 3.7 Prueba de la catalasa ............................................................................ 25
4
4-RESULTADOS .............................................................................................. 26
4.1 Recuento microbiano de las colonias……… ……………………………26 4.2 Características macroscópicas……………………………………………28 4.3 Tinción del Gram……………………………………………………………..30 4.4 Prueba de la catalasa………………………………………………………..31 5-DISCUSIÓN .................................................................................................. 33 6-CONCLUSIONES ......................................................................................... 34 7-BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 35
5
RESUMEN Los quesos son un derivado de los productos lácteos de vaca, oveja y cabra
constituyendo una parte muy importante en la dieta. La leche presenta un caldo de
cultivo idóneo para el desarrollo de microorganismos y pueden producir intoxicaciones
alimenticias y enfermedades. Es segregada por las glándulas mamarias de los
mamíferos con la finalidad de nutrir a su prole en los primeros estadios de vida.
El hábito de consumo de leche y derivados de productos lácteos se remonta al principio
de la evolución, de ahí radica su importancia, siendo uno de los productos alimenticios
más estudiados e importantes de todos los tiempos, para el consumo humano.
En este trabajo se pone de manifiesto la microbiota presente en diferentes muestras de
queso. Para ello se determinó la carga microbiana de los microorganismos aislados de
las diferentes muestras, en medios selectivos y no selectivos. Posteriormente se
identificaron con tinción del Gram y la prueba de la catalasa. Los resultados obtenidos
muestran que los quesos realizados con leche de oveja tienen una mayor carga
microbiana a los quesos hechos con leche de vaca.
ABSTRACT The cheeses are a derivative of the dairy products of cow, sheep and goat constituting a
very important part in the diet. Milk has a suitable breeding ground for the development
of microorganisms and can produce food poisoning and disease. It is segregated by the
mammary glands of mammals in order to nourish their offspring in the first stages of life.
The habit of consumption of milk and derivatives of dairy products goes back to the
beginning of evolution, hence its importance, being one of the most studied and
important food products of all time, for human consumption.
This paper shows the microbiota present in different cheese samples. For this purpose,
the microbial load of the microorganisms isolated from the different samples was
determined in selective and non-selective means. Later they were identified with Gram
stain and catalase test. The results show that cheeses made with sheep milk have a
greater microbial load to cheese made with cow's milk.
PALABRAS CLAVE: productos lácteos, microorganismos, microbiota, carga microbiana, quesos.
6
1-INTRODUCCIÓN En la naturaleza existen dos clases fundamentales de células: las procariotas y las
eucariotas, ambas implicadas en procesos de fermentación. Las bacterias son
procariotas, algunas de ellas intervienen en procesos fermentativos y se pueden
agrupar en dos clases, según la capacidad para generar uno o más metabolitos, estas
son bacterias homofermentativas y bacterias heterófermentativas, en ambos grupos se
encuentran ubicadas las bacterias lácticas. (Madigan y col., 2009).
En 1857 Louis Pasteur, observó unas bacterias realizando estudios sobre la
fermentación del vino, a las cuales responsabilizo de la producción de ácido láctico y de
la descomposición del mismo. Pero fue en 1889 que Weigmamn propuso el término
Bacterium acidi lactici y las definió como bacterias ácido lácticas que forman leche
ácida a partir del azúcar de la leche. (Fernandez., 2000).
En el siglo XIX, Pasteur, Koch y otros pioneros de la biología identificaron
prácticamente todos los patógenos bacterianos que se conocen en la actualidad.
(Ingraham, J.L., 1998).
1.1- Composición de la leche. La mayor parte de la leche utilizada en la elaboración del queso procede de la vaca,
aunque cualquier leche puede ser convertida en queso. El criterio clave es el contenido
en proteína y grasa (tabla 1).
Tabla 1. Composición de la leche en diferentes especies, vaca, oveja, cabra y búfala
(Alais, 1985).
7
Aproximadamente el 84% de la leche es agua. El contenido de grasa al ser insoluble en
agua, debida a las propiedades de los lípidos forma una emulsión. La cantidad de grasa
oscila entre las distintas especies debido a la alimentación que tenga cada vaca, oveja,
cabra o búfala. El azúcar de la leche es la lactosa, es un nutriente con alta energía que
da un sabor dulce. A parte, la leche contiene sales minerales como fosfatos, cloruros,
sulfatos, carbonatos, siendo sus minerales principales el calcio, sodio, potasio,
magnesio,…
1.2- Proceso de elaboración del queso.
Figura 1: Proceso de elaboración del queso.
(Bamforth, 2007).
Se puede observar en la Figura 1 que la leche es el principal ingrediente para la
elaboración de los diferentes tipos de queso.
Los quesos más suaves son los elaborados con leche de vaca y los más fuertes o
madurados son los de oveja.
8
Si se utiliza la leche cruda sin tratar, el queso conserva más su sabor y toda su grasa;
en cambio la leche pasteurizada, se somete a un elevado efecto de temperatura,
destruyéndose las bacterias, sin alterar su composición y cualidades.
Dónde se está elaborando la leche se eleva la temperatura, alrededor de 35 grados y
se añade dependiendo del tipo de queso que se quiera elaborar coagulantes de tipo
vegetal o de tipo animal (cuajo). Después de la coagulación la leche se transforma de
estado líquido a estado sólido o semisólido, debido a la aglutinación de la proteína
caseína, formándose un gel (cuajada) que además retiene agua, sales y grasas.
Una vez transcurrido el tiempo de coagulación y que la cuajada tiene la textura y la
consistencia deseada, se procede a su corte.
El último paso es la eliminación del suero de la cuajada.
Las caseínas son las proteínas que forman la estructura principal del queso y las grasas
forman micelas. De los carbohidratos, el más importante es la lactosa, gran parte es
eliminado por el suero y el resto se fermenta en ácido láctico. Otro componente
importante es el fosfato cálcico, el cual en su mayoría se halla en forma micelar, siendo
un colaborador clave en las propiedades físicas del queso.
Los ácidos grasos de cadena corta contribuyen al sabor de determinados quesos. La
complejidad de sabores de los quesos de cabra y oveja depende de estos y de otros
ácidos grasos.
1.2.1 Cultivo de la leche con bacterias acido lácticas. Las bacterias ácido lácticas constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos
cuya característica principal es la producción de ácido láctico a partir de la fermentación
de azucares, se utilizan desde hace siglos para la producción de queso o yogur.
Son bacterias Gram+, ácidotolerantes, no forman esporas, son inmóviles, cocos o
bacilos.
Las bacterias ácido lácticas transforman la lactosa de la leche en ácido láctico, lo que
modifica las proteínas de la leche (cuajan). De esta manera se modifica la textura del
producto, aunque existen otras variables como la temperatura y la composición de la
leche, que influye en las cualidades de los distintos productos resultantes. El ácido
9
láctico le confiere a la leche fermentada ese sabor ligeramente acidulado. (Djamel y
Rivera, 2016).
Las principales funciones de las bacterias lácticas en los productos lácteos son las
siguientes (Barbosa y col., 2006):
La producción de ácido láctico que provoca la disminución del pH, factor importante
para el sabor, y además coagula las caseínas, con lo cual se desarrolla la textura de
productos o quesos y leches fermentadas.
La producción de metabolitos como diacetilo, acetoína y acetaldehído, que aportan
el aroma y el sabor característicos de todos los productos lácteos fermentados.
La hidrólisis de las proteínas de la leche, función productora de los fragmentos
(péptidos) que contribuyen al sabor (particularmente en quesos maduros), los cuales
pueden tener ciertas propiedades farmacológicas.
1.2.2- Coagulación de la leche.
El gel debe ser uniforme y poseer la fuerza apropiada para retener al máximo la
caseína y grasas de la leche, además de minimizar la variación entre los niveles de
humedad.
La enzima de coagulación de la leche de mayor importancia es la quimosina con un pH
óptimo de 6.
La coagulación ocurre debido a la hidrólisis de un enlace simple de la k-caseína,
resultando en una reducida capacidad de la micela. La hidrólisis libera la región N-
terminal hidrofílica de la molécula, que en la molécula no hidrolizada tenía la función de
salir de la superficie micelar hacia el solvente estabilizándola. Consecuentemente las
micelas se agregan. (Bamforth et al., 2007).
1.2.3- Eliminación del suero.
El suero escurre rápidamente de la cuajada después de ser cortada en pequeños
trozos.
Las bacterias del ácido láctico atrapadas en la cuajada metabolizan la lactosa a ácido
láctico que difunde de la cuajada. La velocidad de la difusión, además de la velocidad a
10
la que disminuye la humedad y la lactosa, tienen un impacto sustancial en la naturaleza
del queso final.
La eliminación del suero afecta además la salida de fosfato cálcico de la matriz de la
caseína. El fosfato cálcico influye enormemente en las propiedades físicas de los
agregados de caseína, y cuanto más se elimine, el queso resultará más quebradizo. La
estructura fosfato cálcico- caseína está también afectado por el pH, que a su vez
depende de la producción de ácido láctico y de la capacidad tampón de la cuajada.
(Bamforth et al., 2007)
1.2.4- Tratamiento de la cuajada.
La cuajada se separa del suero por sedimentación y drenaje a través de alguna forma
de sistema perforado. Es importante tener suficiente fusión de las partículas de la
cuajada, y esto es afectado por el pH y las propiedades físicas de la cuajada. La fusión
comienza cuando el pH alcanza 5,8.
Se puede adicionar cloruro sódico a la cuajada, para así controlar la producción de
ácido y el sabor final. (Bamforth et al., 2007).
1.2.5- La producción de queso procesado.
El queso procesado se elabora por calentamiento y mezcla de combinaciones de
quesos y de otros ingredientes, resultando un producto suave y cremoso, de apariencia,
aroma y textura deseadas y además con los atributos físicos estimados. Los fosfatos y
citratos se unen a minerales del queso aumentando la solubilidad de las caseínas.
(Bamforth et al., 2007).
1.2.6- La maduración del queso. La mayoría de los quesos maduran durante períodos de tiempo de entre tres semanas
y más de dos años, la duración es inversamente proporcional al contenido en humedad
del queso.
Entre los cambios que ocurren están la reducción bacteriana de la lactosa a lactato (vía
glicolísis) en los quesos con ojos, los quesos madurados con mohos, y los quesos
11
madurados por flora superficial (smear) y la conversión de citrato a acetato, diacetilo y
acetoína, etc. (Bamforth et al., 2007).
1.3 Microorganismos en productos lácteos. En los derivados de los productos lácteos se pueden encontrar una gran variedad de
microorganismos, se van a clasificar según su morfología y tipo de pared celular (Gram
negativos o positivos).
La leche que no ha sido tratada con ningún tratamiento suele estar compuesta por
bacterias de los siguientes géneros: Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus,
Streptococcus, Leuconostoc, Propionibacterium, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas y
Bacillus.
1.3.1 Bacilos Gram Negativos:
- Escherichia coli: oxidasa negativos, no formadores de esporas, crecen tanto en
presencia como en ausencia de oxígeno (anaerobio facultativo).
Esta bacteria coloniza el intestino del hombre pocas horas después del
nacimiento y se le considera un microorganismo de flora normal, pero hay cepas
que pueden ser patógenas y causar daño produciendo diferentes cuadros
clínicos, entre ellos diarrea. (Rodriguez et al., 2002).
- Salmonella typhi: esta especie es el agente responsable de la fiebre tifoidea, una
infección intestinal febril, potencialmente mortal. Los microorganismos de esta
especie se diferencian del resto de las especies de Salmonella en que sólo
afectan a los seres humanos; entre los factores de virulencia se incluyen la
invasividad y una endotoxina, responsable de la elevada fiebre, típica de esta
enfermedad (Ingraham et al 1998).
- Yersinia enterocolitica: son anaerobias facultativas, oxidasa negativas y catalasa
positivas. Presentan pleomorfismo dependiendo del medio de cultivo empleado,
observándose desde cocos a bacilos cortos e incluso cadenas de cuatro o cinco
elementos.
Las cepas patógenas de Yersinia pueden dividirse en aquellas de baja
patogenicidad y alta patogenicidad. Las cepas de baja patogenicidad son
12
aquellas que pueden causar infecciones intestinales leves en humanos y no son
letales en ratones a bajas dosis de infección. Las cepas de alta patogenicidad
pueden causar infecciones sistémicas graves en humanos y son letales en
ratones a dosis de infección bajas. Estas cepas pertenecen a Y. pestis, Y.
pseudotuberculosis. (Reinés et al., 2012).
- Brucella: es un pequeño cocobacilo Gram negativo que causa una enfermedad
de los animales domésticos. Existen varias especies de Brucella, distinguibles de
acuerdo con sus antígenos superficiales, que infectan a distintos hospedadores
animales. En los seres humanos las especies más comunes son B. abortus
(preferentemente infecta a ganado vacuno), B. suis (cerdos), B. melintesis
(ovejas y cabras) y B. canis (perros). B. abortus y B. canis producen
enfermedades de tipo benigno en la especie humana, mientras que la infección
por B. suis y B. melitensis puede ser mortal. La brucelosis se transmite al ser
humano mediante un contacto directo con los animales infectados o sus
secreciones.
Otra forma de contagio muy frecuente es la que se produce al consumir leche
contaminada, ya que Brucella se concentra en las glándulas mamarias de los
animales infectados. Pero la pasteurización destruye dicha bacteria, por lo que
en aquellos países donde esta técnica de higienización se practica de forma
rutinaria se producen pocos casos (Ingraham et al., 1998)
1.3.2 Bacilos Gram positivos:
- Listeria: bacilos Gram positivos regulares no esporulados, uno de sus géneros
más representativos es Listeria monocytogenes, causante de la listeriosis, es
una enfermedad transmisible por alimentos. En adultos sanos, la listeriosis es
una enfermedad benigna, pero en niños y ancianos y enfermos
inmunocomprometidos, puede causar un tipo de meningitis (Ingraham et al.,
1998).
- Bacillus cereus: puede causar intoxicaciones alimentarias, bacilo Gram positivo,
anaerobio facultativo, que forma endosporas. Su facultad de producir esporas
resistentes al calor explica como produce las intoxicaciones que produce. El
13
microorganismo se encuentra en el suelo, en el agua y en el aparato
gastrointestinal de los animales y del ser humano, por lo que con frecuencia se
encuentra contaminando a los alimentos. Las intoxicaciones por B. cereus es
relativamente poco frecuente y causa una gastroenteritis benigna y de corta
duración (Ingraham et al., 1998)
- Lactobacillus: comprende un grupo diverso de bacterias lácticas con un elevado
número de especies. Presentan requerimientos nutricionales complejos, aunque
están ampliamente distribuidos en la naturaleza, sobre los vegetales, alimentos
fermentados, y en las mucosas de humanos y animales. También se encuentran
asociadas a otros ambientes antropogénicos como las aguas residuales.
Desempeñan un papel clave en la industria y en alimentos elaborados de forma
artesanal, incluyendo una gran variedad de productos lácteos fermentados, no
sólo porque contribuyen en la conservación de la materia prima debido a los
procesos de acidificación, sino también para contribuir a las características del
producto como textura y sabor. (Grande et al. 2016).
- Clostridium botulinum: Bacilo Gram-positivo, formadores de esporas, anaerobios
estrictos con metabolismo fermentativo. Producen amplio número de enzimas
C. tetani y C. botulinum producen las toxinas biológicas más potentes que se
conocen. (Zuñiga et al. 2017).
1.3.3 Cocos Gram positivos:
-Orden Lactobacillales: tiene dos géneros muy importantes Streptococcus y
Lactococcus.
Son bacterias anaerobias facultativas y homofermentadoras, ya que el único producto
que puede pueden producir de la fermentación de la glucosa es el ácido láctico, sin
producción de gas. Se trata de organismos catalasa negativos. La composición de la
pared celular es similar al resto de las bacterias Gram positivas, compuestas
principalmente de peptidoglicano. (Winn et al. 2008).
-Staphylococcus aureus: agente etiológico que causa muchas enfermedades. No
forman esporas. Se agrupan formando racimos, son catalasa positivos y producen
fermentación de azucares; aerobios o anaerobios facultativos e inmóviles.
14
1.4-Fermentaciones de productos lácteos. El papel de pediococos en la fermentación de productos lácteos no es tan importante
como el de otras bacterias tales como Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis o
ciertas cepas de Leuconostoc o Lactobacillus, debido, a su dificultad para utilizar la
lactosa. No obstante, la adición de otros azúcares fermentables o el desarrollo de cepas
lactosa-positivas, es de gran interés, para resolver problemas como la
sobreacidificación de los productos fermentados durante su refrigeración. Los
pediococos aparecen normalmente en os productos lácteos como parte de la población
de bacterias ácido lácticas no indicadoras. Se trata de bacterias contaminantes que
provienen del ambiente o los equipos. En el queso sólo representan sólo una pequeña
proporción de las bacterias ácido lácticas y se desarrollan en el proceso de maduración
(Holzapfel y col., 2006).
1.5- Refrigeración, efecto sobre la microbiota El objetivo principal de la refrigeración es evitar la proliferación de microorganismos
durante el tiempo de espera previo a la fabricación, por ello la temperatura que se
recomienda es <4ºC, evitando siempre la congelación de la leche, que produciría un
efecto muy negativo sobre las características físico-químicas. A esta temperatura hay
una regresión de las bacterias mesófilas productoras de ácido láctico, pero
dependiendo de la contaminación inicial, se puede desarrollar la flora psicrotrófica, en la
que predominan las especies del género Pseudomonas principalmente, pero también
Flavobacterium, Acrobacter y Enterobacter, del que forman parte los coliformes. Las
Pseudomonas se caracterizan por producir proteasas y lipasas extracelulares
termorresistentes que sobreviven a la pasteurización y que pueden dar sabores
amargos en los quesos (proteasas) y a rancio (lipasas) (Alais y col., 1985)
1.6-Tratamientos térmicos a los que se somete la leche: a) Termización.
b) La pasteurización a 72º- 74º durante 15-20seg.
c) La pasteurización a 80º-90º durante varios minutos.
15
a) Termización:
Es un tratamiento de calor de baja intensidad. El RD 1679/94 lo define como el
tratamiento entre 57º y 68ºC durante 15 segundos cuyo objetivo es destruir las
bacterias, especialmente las psicrotrofas. Con este tratamiento se eliminan la
mayoría de las formas vegetativas de las bacterias sin que prácticamente se
produzcan cambios irreversibles en las características físico-químicas de la
leche. Según P. Walstra [WALS99], después de la termización la leche se puede
guardar durante 3 o 4 días a 6-7ºC sin un incremento sustancial en el recuento
de bacterias, a condición de que no se recontamine con bacterias psicrotrofas.
(Alais y col., 1985).
La pasteurización a 72º-74º durante 15-20seg.
El objetivo de este tratamiento térmico es asegurar la destrucción de los
microorganismos patógenos. Se aconseja en la fabricación de quesos frescos y
de quesos madurados durante menos de dos meses, aunque en este último caso
puede haber excepciones en la fabricación de determinados quesos
tradicionales, como es el caso del Camembert en Francia, esta excepción está
recogida en la Directiva43/92.
b) La pasteurización a 80º-90º durante varios minutos.
En este caso, el tratamiento térmico tiene como objetivo, además de la
destrucción de los microorganismos patógenos, la precipitación de parte de las
proteínas solubles. Se utiliza en la elaboración de quesos frescos para aumentar
el rendimiento, ya que además la α-lactoalbúmina y la β-lactoglobulina tienen
gran capacidad de retener agua, lo que se traduce en un aumento del
rendimiento del 4-5%, pero no se aconseja en los quesos madurados porque las
proteínas solubles en la cuajada pueden, durante la maduración, producir
modificaciones de sabor debido a una ruptura del equilibrio normalmente
existente entre los diversos productos sápidos de la degradación y al fijar agua
hacen el desuerado más difícil. (Alais y col., 1985).
16
2-OBJETIVOS. - Cultivar y aislar los diferentes microorganismos que hay en las diferentes
muestras de queso.
- Determinar la carga microbiana de los diferentes quesos.
- Identificación macroscópica y microscópica de los organismos aislados.
- Evaluar la variabilidad de los resultados obtenidos de las diferentes sesiones.
3-MATERIALES Y MÉTODOS. 3.1. Alimentos utilizados
COMPOSICIÓN
Muestra de
queso 1
Muestra de
queso 2
Muestra de queso
3
Muestra de
queso 4
Oveja Puro Queso 1 Queso 2 Queso 3 Queso 4
Mezcla( vaca, cabra y
oveja) Queso 1 Queso 2
X X
Semicurado (vaca) Queso 1 Queso 2
X X
Azul Queso 1 Queso 2
X
X
Tabla 2: Composición y diferentes muestras de queso utilizadas para este estudio.
Se analizaron diez muestras de quesos en tres semanas diferentes, en la primera
semana se analizaron dos muestras de semicurado de vaca y una muestra de queso de
oveja.
En la segunda semana se analizaron tres muestras de queso de oveja y en la última
semana se estudiaron dos muestras de queso azul y dos muestras de queso realizado
con mezcla de vaca, oveja y cabra. 3.2. Material de Laboratorio. 1. Agua destilada
2. Gradilla
3. Probeta
17
4. Cloruro de sodio
5. Matraz Erlenmeyer de 500 ml
6. 25-30 tubos Eppendorff de 1.5 ml
7. Algodón hidrófobo
8. Papel de aluminio.
9. Báscula
10. Autoclave
11. Mechero Bunsen
12. Placas de Petri de 15ml
13. Bolsas de plástico de cierre hermético.
14. Asa de siembra triangular Digralsky
15. Pipeta de 100 microlitros
16. Caja de puntas estériles para pipeta de 100 microlitros.
17. Tubos Falcon de 50 ml.
18. Triturador homogeneizador Stomacher 80 Biomaster, Seward Ltd..
19. Estufas de cultivo reguladas a 37ºC y 30ºC.
20. Agua oxigenada 20 volumenes.
Materiales para la tinción.
1. Mechero Bunsen.
2. Asa de siembra.
3. Agua destilada.
4. Cubeta
5. Pinzas
6. Alcohol 96
7. Cristal violeta
8. Safranina
9. Lugol
10. Aceite de inmersión.
11. Portaobjetos.
12. Microscopio óptico 100x
18
3.3. Medios de cultivo utilizados y preparación de los mismos. Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe
sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos
van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Existen multitud de medios debido a la gran diversidad metabólica de los
microorganismos.
Para el análisis microbiológico de los diferentes quesos se han empleado 5 medios de
cultivo.
UN MEDIO GENERAL: crecimiento de la mayoría de los microorganismos por la
facilidad en la que crecen en ellos.
Tríptona Soja Agar (TSA): Se usa generalmente para el cultivo de todo tipo de microorganismos. Su aportación
nutritiva permite el desarrollo óptimo de un gran número de microorganismos, tanto
exigentes como no exigentes.
Composición (g/l):
-Digerido Papaínico de Soja ....................... 5,0 g
-Digerido Pancreático de Caseína ............ 15,0 g
-Cloruro sódico ........................................... 5,0 g
-Agar ......................................................... 15,0 g
-pH final: 7,3±0,2
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
Preparación: según envase, se pesan 40 gramos de TSA para un litro de solución. Al
necesitar 800ml de medio se pesan 32 gramos de TSA y a continuación se enrasa a
800ml con agua destilada.
CUATRO MEDIOS SELECTIVOS: contienen componentes inhibidores del desarrollo de
ciertos microorganismos, lo que facilita el aislamiento de ciertas especies y la
contaminación por otros microorganismos.
19
1- MRS, AGAR Cultivo y recuento de Lactobacilos, se puede emplear en productos lácteos, como en
productos alimenticios en general.
Contiene peptona, glucosa, manganeso y magnesio aportan los componentes idóneos
para el crecimiento de lactobacilos.
Composición (g/l):
-di-Amonio Hidrógeno Citrato ........................ 2,0
-Extracto de Carne ........................................ 8,0
-Extracto de Levadura ................................... 4,0
-D (+)-Glucosa ............................................. 20,0
-Magnesio Sulfato .......................................... 0,2
-Manganeso(II) Sulfato ................................ 0,05
-Peptona Bacteriológica .............................. 10,0
-di-Potasio Hidrógeno Fosfato ....................... 2,0
-Sodio Acetato ............................................... 5,0
-Tween 80 ...................................................... 1,0
-Agar ............................................................ 15,0
-pH: 6,2±0,2
Se debe almacenar entre 2-8ºC, en un lugar seco y sin darle la luz directa.
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
Preparación: según el envase, el MRSA se prepara pesando 62 g de MRSA /1l. Al
preparar diluciones de 800 ml, se pesan 49,6 gr de MRSA y se enrasa hasta 800 ml de
agua destilada.
2- Eosina Azul de Metileno (EMB) Aislamiento y detección de enterobacterias, bacterias relacionadas con bacterias del
intestino, presentan una morfología bacilar o coco-bacilar Gram - (el crecimiento de
colonias con brillo metálico en este medio indica la presencia de la especie Escherichia
coli). Su contenido es:
-Eosina Amarillenta .................................. 0,4 g/l
-Azul de Metileno ................................... 0,065g/l
20
-Lactosa ..................................................... 5,0g/l
-Peptona Bacteriológica ......................... 10,0 g/l
-di-Potasio Hidrógeno Fosfato .................. 2,0 g/l
-Sacarosa ................................................. 5,0 g/l
-Agar ....................................................... 13,5 g/l
-pH: 7,2±0,2
Se debe almacenar en un luego seco y fresco.
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
Preparación: según el envase el medio EMB se prepara con 36 g/l. Para 800 ml se
pesan 28,8g/ 800 ml.
3- Vogel –Johnson Agar (VJ)
Medio sólido, para el aislamiento y la identificación de Estafilococos, donde los demás
microorganismos son casi inhibidos. Los estafilococos reducen el telurito a teluro metal
lo que da colonias negras sobre un fondo rojo sino son fermentadoras de manitol y las
fermentadoras de manitol dan colonias negras rodeadas con un halo amarillo. La
selectividad del medio es efectiva 24 horas.
Composición (g/l):
-Extracto de Levadura ................................... 5,0
-Glicina ........................................................ 10,0
-Litio Cloruro .................................................. 5,0
-D(-)-Manita ................................................. 10,0
-di-Potasio Hidrógeno Fosfato ....................... 5,0
-Rojo de Fenol ........................................... 0,025
-Triptona ...................................................... 10,0
-Agar ............................................................ 15,0
-pH: 7,2±0,2
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
Preparación: según el envase el medio V-J se prepara 60 g/l. Para 800 ml se pesan 48
g/800 ml.
21
4-Agar Kanamacina Aesculina Azida (KAA-agar) Detección de enterococos en alimentos, aguas y otras muestras biológicas, con una
morfología Gram+.
Composición (g/l):
Sulfato de Kanamicina ................................. 0,02
Esculina ......................................................... 1,0
Azida Sódica ................................................ 0,15
Citrato férrico ................................................. 0,5
Extracto de Levadura .................................... 5,0
Cloruro de sodio ............................................ 5,0
Citrato disódico .............................................. 1,0
Triptona ....................................................... 20,0
Final pH 7,0 ± 0.2
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
Preparación: según el envase, el medio KAA se prepara con 43 g/l. Para 800 ml se
pesan 34,4 g y se enrasa hasta 800 ml con agua destilada.
Una vez preparados los medios y enrasados a 800ml se esterilizan en la autoclave.
Figura 2: Los diferentes medios se introducen en la autoclave.
Cuando finaliza el período de esterilización se atemperan los matraces a 50 grados en
el baño y se vierten los medios en las placas de Petri estériles. Cuando los medios
están solidificados se introducen en cámara fría para su posterior utilización.
22
3.3.1 Solución salina.
Se preparan dos matraces de solución salina, uno de 300ml y otro de 40ml, se necesita
cloruro de sodio y agua destilada. En el de 300ml se vierten 2,7 gr de cloruro de sodio y
se enrasa hasta 300ml con agua, y en el de 40 ml se utilizan 0,36gr de cloruro y se
enrasa con agua hasta 40ml. Seguidamente en el matraz de 40ml se reparten 0,9ml en
tubos eppendorf para realizar las diluciones seriadas de las muestras.
Los tubos de 0,9ml y el matraz de 300ml se esterilizan en la autoclave, junto con las
puntas de las micropipetas y los medios de cultivo.
Cuando esta esterilizado se guarda en cámara fría hasta su empleo.
Figura 3: Tubos eppedorf con 0,9 de solución salina.
3.4- Procesado de alimentos Por cada alimento se necesitan 5 gramos de cada muestra de queso y a continuación
se introducen en bolsas herméticas donde se añade 45 ml de solución salina estéril al
0,9% a cada una de las muestras.
A continuación, la muestra del alimento y la solución salina son procesados por el
triturador- homogenizador Stomacher 80 Biomaster, Seward Ltd.
Homogenizadas las muestras, se preparan tubos eppendorff en una gradilla para
realizar las diluciones decimales y en cada tubo se rellena de 0,9 ml de solución salina
estéril.
Para los medios selectivos (VJ, KAA, MRS, EMB) se preparan diluciones a razón cero
(solución madre) y -1. Para el medio general (TSA) se preparan diluciones seriadas a
-1,-2,-3.
Las diluciones seriadas se realizan añadiendo 100 microlitros de solución madre sobre
0,9 ml de solución salina y así sucesivamente de forma seriada.
23
Realizadas las diluciones, se procede a la siembra de la muestra. Se siembran
100microlitros de cada dilución, de la cero a -3 en TSA Y 100microlitros de las dos
primeras diluciones (0 y -1) en las placas de medios selectivos. Todo el procedimiento
se lleva a cabo en condiciones estériles, junto al mechero Bunsen y las muestras son
distribuidas uniformemente con la espátula Drigalsky.
Los recuentos bacterianos se realizan tras 24 horas incubando a 37 grados.
El medio selectivo MRS se incuba a 30 grados.
.
Figura 4: Solución madre de una muestra de queso
Figura 5: En condiciones de esterilidad se procede a la siembra de las diferentes
muestras de queso 3.5-Recuento e identificación preliminar
24
Tras 48horas de incubación se realiza el recuento y la identificación bacteriana. Se
observa la morfología y el número de colonias bacterianas, además de los cambios que
se producen en los medios.
Posteriormente las colonias con diferentes morfologías obtenidas en cada medio de
cultivo serán seleccionadas para la tinción del Gram y la prueba de la catalasa.
3.6. Tinción de Gram
Fue desarrollada por Christian Gram en 1984. Es uno de los pasos
determinantes para la identificación bacteriana, es capaz de discernir en dos
grandes grupos de eubacterias, las Gram positivas y las Gram negativas.
Para la tinción del Gram se necesitan 4 soluciones:
1- Un primer colorante: colorante básico que al contactar con las células
cargadas negativamente produce una reacción que colorea su pared, el más
utilizado es el cristal violeta.
2- Un mordiente, en este caso lugol, fija la tinción y aumenta la afinidad de las
células al colorante.
3- Agente decolorante: disolvente orgánico, como el alcohol.
4- Un colorante distinto al primero, como la safranina.
Las bacterias Gram positivas se tiñen de azul debido al cristal violeta y no perderán su
coloración, sin embargo, las Gram negativas se tiñen de rosa debido a la safranina,
todo esto es consecuencia de su envoltura celular, las primeras tienen una malla de
peptidoglicano en su parte externa mientras que las segunda es decir, las Gram
negativas recubiertas por una membrana de peptidoglicano, tienen una membrana
externa que recubre toda la célula.
Procedimiento de la tinción de Gram:
-Sobre un porta limpio se añade una gota de agua.
-Con el asa de siembra esterilizada se toma una muestra de la colonia y se
deposita sobre la gota de agua.
-Se seca la muestra y se fija con calor suave.
-Añadir cristal violeta y lo dejamos actuar 2min.
-Escurrir el exceso de colorante y cubrir con Lugol durante 2min.
25
-Lavar con agua el exceso de Lugol.
-Decolorar con alcohol de 96, 30seg.
-Lavar con agua abundantemente.
-Teñir con safranina y dejar la preparación 3min.
-Lavar con agua.
-Secar la preparación.
-Añadir gota de aceite de inmersión y observar al microscopio 100x
Figura 6: Tintes para la tinción del Gram
3.7 Prueba de la catalasa
Se realiza esta prueba a las colonias aisladas de los diferentes medios
selectivos. Está enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias, se
encarga de la descomposición de hidrógeno en agua y oxígeno. El
desprendimiento de burbujas de oxígeno es señal de que la prueba es positiva.
2H2O2 2H2O+O2
Procedimiento:
26
Se deposita una gota de agua oxigenada en un portaobjetos, a continuación, se
procede a la suspensión del microorganismo. La presencia de dicha enzima se pondría
de manifiesto cuando se desprendan burbujas.
4-RESULTADOS
4.1 Recuento microbiano de las colonias Los resultados obtenidos de los recuentos expresados en unidades formadoras de
colonias/gr (UFC/g) para las distintas muestras de queso se muestran en la tabla 3.
Para el recuento se utilizaron, las placas de Petri donde el crecimiento de colonias
estaba comprendido entre 30 y 300 para una mayor precisión en el cálculo de UCF/g.
UFC/g TSA MRSA VJ KAA EMBSemicurado 7,00*10⁴ 3,00*10⁶ X X 2,13*10⁴Oveja 6,05*10⁹ 5,45*10⁵ 3,20*10⁶ 3,15*10⁶ 4,30*10⁶Oveja 6,45*10⁹ 4,95*10⁵ 3,45*10⁶ 3,00*10⁶ 3,80*10⁶oveja,cabra y vaca 5,80*10⁶ 6,43*10⁵ X X 2,80*10⁴oveja,cabra y vaca 6,00*10⁵ 5,00*10⁴ 3,40*10⁶ 7,00*10⁴ 1,65*10⁴Queso azul 4,10*10⁴ 3,04*10⁶ 2,82*10⁵ 1,44*10⁵ 3,14*10⁵Queso azul 5,60*10⁴ 4,10*10⁶ 3,10*10⁵ 3,35*10⁵ 2,00*10⁵Semicurado 6,30*10⁴ 3,04*10⁴ 2,00*10⁴ X 2,30*10⁴Oveja 2,89*10⁹ 4,65*10⁵ 3,00*10⁶ 5,45*10⁶ 3,00*10⁶Oveja 5,64*10⁹ 5,00*10⁵ 4,02*10⁶ 3,00*10⁶ 3,80*10⁶
Tabla 3: Resultados UFC/ml para las diferentes muestras de queso.
En la tabla 3 se puede apreciar como en el medio TSA, en el cual se observa el
recuento de microorganismos mesófilos totales, las cuatro muestras de quesos de oveja
tienen un recuento de 109 UFC/g, mientras que los quesos realizados con leche de
oveja, cabra y vaca tienen 106 y 105 UFC/g respectivamente, las muestras de queso
azul tienen un recuento de 104 UFC/g y las dos muestras de semicurado tienen un
recuento de 104 UCF/g.
En el medio MRSA, específico para bacterias del ácido láctico, se observa un recuento
de 105 UCF/g en las cuatro muestras de queso de oveja, en las muestras de queso de
27
oveja, cabra y vaca un recuento de 105 y 104 UFC/g, las dos muestras de queso azul
106 UCF/g y las dos muestras de semicurado 106 y 104 UCF/g.
En el medio VJ, donde se aíslan estafilococos, se observa un recuento de 106 UCF/g en
las muestras de queso de oveja. En las muestras de oveja, cabra y vaca en una no
aparece crecimiento microbiano en este medio mientras que en la otra muestra aparece
un recuento de 106 UCF/g, las muestras de queso azul presentan un recuento de
105UCF/g y las muestras de queso semicurado, una de ellas no presenta crecimiento
microbiano mientras que la otra muestra presenta un recuento de 104UCF/g.
En el medio KAA, medio selectivo de enterococos, se observa que las muestras de
queso de oveja tienen un recuento de 106 UCF/g, las muestras de queso de oveja,
cabra y vaca una presenta un recuento de 104 UCF/g y la otra muestra no tiene
crecimiento microbiano. Las dos muestras de queso azul presentan un recuento de 105
UCF/g y las muestras de semicurado no presentan crecimiento microbiano.
Por último, en el medio EMB para enterobacterias se observa en las muestras de queso
de oveja un recuento de 106UCF/g, en las muestras de oveja, cabra y vaca 104UCF/g,
en las muestras de queso azul se aprecia un recuento de 105UCF/g, mientras que en
quesos semicurados hay un recuento de 104UCF/g.
28
Figura 7. Representación de UCF/ g en logaritmo en base 10 de las diferentes
muestras de queso.
Se puede apreciar claramente en la Figura 7 como los quesos de oveja tienen una
mayor carga microbiana de mesófilos totales (TSA) que los quesos realizados con
mezcla de vaca, oveja, cabra y los quesos azules o semicurados; además se puede ver
que las muestras de queso de oveja tienen un crecimiento más importante en todos los
medios selectivos empleados (VJ, KAA, EMB, TSA, MRSA).
Se pudo comprobar que las muestras de semicurado no tienen crecimiento microbiano
en los medios KAA y en una muestra de oveja, vaca y cabra tampoco hay crecimiento
microbiano en este medio.
Las muestras de queso azul tienen una carga microbiana muy parecida, en ambas los
crecimientos en los diferentes medios empleados tienen diferencias inapreciables.
4.2 Características macroscópicas
TSA MRSA VJ KAA EMBSemicurado blancas y pequeñas blancas y muy pequeñas X X blancasOveja blancas y pequeñas blancas y amarillas pequeñasblancas y pequeñas blancas y pequeñas con halo negro negras y brillo metálicoOveja blancas y pequeñas blancas y pequeñas blancas y pequeñas blancas y pequeñas con halo negro transparentes y centro negroOveja,cabra y vaca blancas y pequeñas blancas y diferente tamaño X X transparentes, centro negro y blancasOveja,cabra y vaca blancas y pequeñas blancas y diferente tamaño blancas y grandes blancas y pequeñas con halo negro transparentes, centro negro y blancasQueso azul blancas,pequeñas y con mucosidad blancas y muy pequeñas negras y blancas, pequeñas blancas y pequeñas con halo negro blancasQueso azul blancas y pequeñas blancas y muy pequeñas negras y pequeñas blancas y pequeñas con halo negro blancasSemicurado blancas y pequeñas blancas y pequeñas blancas y de diferente tamaño X blancasOveja blancas y pequeñas blancas y amarillas,pequeña negras y pequeñas blancas y pequeñas con halo negro negras y brillo metálicoOveja blancas y pequeñas blancas y pequeñas negras y pequeñas blancas y pequeñas con halo negro transparentes, centro negro Tabla 4: Características macroscópicas de las diferentes muestras de queso.
En TSA se puede apreciar en su mayoría colonias blancas y pequeñas, en una muestra
de queso azul también algunas colonias presentan mucosidad.
En el medio de MRSA las colonias presentas una mayor variabilidad tanto en tamaño
como en el color apareciendo algunas colonias amarillas en oveja.
En el medio VJ en una muestra de semicurado no aparece crecimiento microbiano,
mientras que en la otra muestra de semicurado sí siendo blancas y de diferente
tamaño. En las muestras de queso azul las colonias son blancas y negras y de diferente
29
tamaño, pequeñas y grandes. En las muestras de queso de oveja dos muestras
presentan colonias pequeñas y negras (como con un punto negro) y las otras dos
muestras de oveja las colonias son blancas y pequeñas. En quesos de oveja, cabra y
vaca una no presenta crecimiento en este medio y la otra tiene colonias blancas y
grandes.
En el medio KAA en las dos muestras de semicurado y en una muestra de oveja, cabra
y vaca no hay crecimiento microbiano, mientras que en todas las demás muestras de
queso las colonias blancas y pequeñas con halo negro.
En el medio EMB es donde mayor diversidad de color, tamaño y forma presentan las
colonias en semicurado y queso azul las colonias son blancas, en oveja dos de las
muestras presentan brillo metálico y colonias negras, mientras que en las otras dos
muestras de oveja son transparentes y con el centro negro. En las muestras de oveja,
cabra y vaca son transparentes, centro negro y blancas.
1- 2-
3- 4- Figura 8. Identificación macroscópica en diferentes medios de cultivo. 1-En la primera
imagen es un medio EMB con crecimiento microbiano con brillo metálico en una
30
muestra de oveja. 2- Medio KAA con colonias blancas con halo negro en una muestra
de oveja, cabra y vaca. 3- Es una placa VJ de una muestra de oveja dilución 1 con
colonias blancas de diferente tamaño. 4- medio general, dilución 4 de semicurado, con
colonias blancas y de diferente tamaño.
4.3 Tinción del Gram. Los resultados de las observaciones de las tinciones de Gram para los distintos medios
analizados y en todos los medios de cultivo empleados se muestran a continuación,
TSA MRSA VJ KAA EMBSEMICURADO Cocos+ bacilos+ y cocos+ X X bacilos-OVEJA bacilos- bacilos+ y cocos+ bacilos+ y cocos+ bacilos- cocos+ bacilos-OVEJA bacilos- y cocos+ bacilos+ y cocos+ bacilos- cocos+ bacilos-OVEJA,CABRA Y VACA bacilos- y bacilos+ bacilos+ X X bacilos- y cocos-OVEJA,CABRA Y VACA bacilos- y bacilos+ bacilos+ bacilos- cocos+ bacilos- cocos- cocos+QUESO AZUL bacilos- bacilos+ y cocos+ bacilos+ bacilos- cocos+ bacilos- y cocos-QUESO AZUL bacilos- y bacilos+ bacilos+ bacilos- cocos+ bacilos- y cocos-SEMICURADO bacilos- bacilos+ y cocos+ bacilos+ y cocos+ bacilos- y cocos+ X bacilos-OVEJA bacilos- y cocos+ bacilos+ y cocos+ bacilos- cocos+ bacilos-OVEJA bacilos- y cocos+ bacilos+ y cocos+ bacilos- cocos+ bacilos-
Tabla 5: Identificación microscópica de las diferentes muestras de queso en los
diferentes medios.
En el medio TSA se observan al microscopio en tres muestras de queso de oveja,
bacilos- y cocos+ en una de las muestras de queso de oveja bacilos-, bacilos+ y
cocos+. En semicurado una presenta cocos+ y la otra muestra bacilos-, bacilos+ y
cocos+. En las muestras de queso azul, bacilos-, bacilos+ y cocos+ y bacilos- y
bacilos+ respectivamente en cada una de las muestras. Y en quesos de oveja, cabra y
vaca bacilos gram + y bacilos gram-.
En el medio MRSA el queso de oveja presenta bacilos+ y cocos+. En queso azul y
queso de oveja, cabra y vaca las colonias son bacilos+. Y en las muestras de
semicurado bacilos gram + y cocos gram+.
En el medio VJ todas las muestras exceptuando, las muestras de semicurado y otra de
oveja, cabra y vaca todas son bacilos-. No hubo crecimiento en una muestra de
31
semicurado y la otra muestra presenta bacilos- y cocos+; tampoco hubo crecimiento en
una muestra de oveja, cabra y vaca.
En el medio KAA en las dos muestras de semicurado no hay crecimiento microbiano, ni
tampoco en una de las muestras de queso de oveja, cabra y vaca, todas las demás
muestras presentan cocos gram+.
En el medio EMB las muestras de queso de oveja y semicurado todas presentan
bacilos gram -. En queso azul bacilos gram - y cocos gram -. Y en las muestras de
queso de oveja, cabra y vaca una placa presenta bacilos gram - y cocos gram - y la otra
muestra bacilos gram -, cocos gram - y cocos gram +.
Gram - Cocos Gram +
Bacilos Gram - Cocos Gram -
Figura 9. Imagen microscópica de bacilos Gram-, cocos Gram+, bacilos Gram- y cocos
Gram-.
4.4 Prueba de la catalasa Los resultados de las pruebas de la catalasa para los distintos alimentos analizados en
los distintos medios de cultivo se pueden observar en la tabla 6.
32
TSA. TINCION DEL GRAM MRSA.TINCIÓN DEL GRAMV.J TINCIÓN DEL GRAM KAA.TINCIÓN DEL GRAM EMB.TINCIÓN DEL GRAMSEMICURADO COCOS+ catalasa+ COCOS+ catalasa- X X XOVEJA COCOS+ catalasa+ COCOS+ catalasa- X COCOS+ catalasa- XOVEJA COCOS+ catalasa+ COCOS+ catalasa- X COCOS+ catalasa- XOVEJA,CABRA Y VACA X X X X XOVEJA, CABRA Y VACA X X X COCOS+ catalasa- COCOS+ catalasa-QUESO AZUL COCOS+ catalasa- X X COCOS+ catalasa- COCOS+ catalasa-QUESO AZUL X X X COCOS+ catalasa- XSEMICURADO COCOS+ catalasa- COCOS+ catalasa- COCOS+ catalasa- X XOVEJA COCOS+ catalasa- COCOS+ catalasa- X COCOS+ catalasa- XOVEJA COCOS+ catalasa- COCOS+ catalasa- X COCOS+ catalasa- X Tabla 6: Prueba de la catalasa en los diferentes quesos.
La prueba de la catalasa determina si se puede encontrar el género Staphylococcus.
Para ello se picaron las colonias Gram+ de los diferentes medios (TSA, MRSA, V.J,
KAA, EMB).
Cuando se realiza la prueba se observan burbujas en el medio TSA de semicurado y
dos muestras de queso de oveja, determinando que son catalasas+.
Como se puede observar en la tabla las colonias de cocos+ de los medios MRSA, VJ,
KAA Y EMB todas son catalasas – y en el medio TSA, queso azul, semicurado y dos
muestras de oveja también son catalasas -.
Cocos Gram+ en medio KAA.
Figura 10: Imágenes de la prueba de la catalasa, cuando se desprenden las burbujas.
5-DISCUSIÓN.
33
En el presente estudio con diferentes muestras de queso, la microbiota láctica se
desarrolla espontáneamente en todos los quesos, obtenidos en diversos ambientes
comerciales.
Los resultados obtenidos en este estudio no difieren a los de otros investigadores como,
por ejemplo, Martín (2008) en el que afirma que los enterococos pueden aparecer en
órdenes de 10⁵ a 10⁷ UFC/ g en quesos maduros coincidiendo con los valores
obtenidos en quesos de oveja y las muestras de queso azul. Mientras que en quesos
más jóvenes como son los semicurados de vaca y los que están hechos con mezcla
tienen órdenes más bajos, concretamente de 10⁴ UFC/ g. Las variaciones en los niveles
de enterococos va a depender, principalmente del tipo de queso y estación del año en
la que se elabora, así como de los niveles de contaminación de la leche (Franz et al.,
1999; Foulquié-Moreno et al., 2006).
El proceso de elaboración del queso, su distribución, almacenamiento y transporte en
malas condiciones de refrigeración se asociaron como factores de riesgo en varios
brotes. (Parrilla et al., 1993).
Las bacterias lácticas tienen un metabolismo complejo y diverso lo que les permite
adaptarse a situaciones cambiantes, aunque las condiciones de cultivo impuestas
cuando se trabaja con ellas en el laboratorio limitan sin duda sus posibilidades
(Axelsson, 1998), sin embargo, son especies que participan activamente en la
fermentación de los quesos y de ahí que sus recuentos hayan sido relativamente altos.
Pueden aparecer bacterias que alteren el alimento o ser patógenas, como en el caso de
una de las muestras de queso de oveja, que aparece la presencia de E. coli. Su
presencia indica mala higiene en el proceso, falta de higiene de quien manipulo la
muestra o recontaminación tras el proceso de maduración del producto, posiblemente
fue lo que le pudo ocurrir a algunas muestras que mostraron recuentos excesivamente
altos en EMB, medio específico para enterobacterias y cuyos recuentos deberían ser
bajos, estudios como el de Parrilla, M. C afirman que los alimentos perecederos y que
requieren de mucha manipulación son los más involucrados, de los que sobresalen los
productos lácteos. Un gran número de estos productos se elaboran, distribuyen y
manipulan sin las debidas condiciones higiénicas. (Parrilla et al.,1993).
34
En relación con la presencia de Enterococcus, en todas las muestras de queso de
oveja, oveja, cabra y vaca y muestras de queso azul dieron positivo en casi todos los
medios de KAA, se encuentran dentro del grupo de microorganismos indicadores de la
inocuidad de los alimentos.
Los resultados obtenidos en el medio VJ, aunque muestran una alta concentración de
microorganismos difieren con los datos obtenidos por otros investigadores, en los que
las colonias obtenidas presentan cocos Gram positivos y son catalasa positiva, en
cambio la mayoría de las colonias obtenidas en este trabajo son catalasas negativas y
bacilos negativos.
6- CONCLUSIONES
• Los altos recuentos de microorganismos totales, no es un dato
significativo en alimentos como el queso.
• Se obtuvieron altos recuentos de bacterias lácticas, lo cual es normal ya
que son estas bacterias son las encargadas de la fermentación de la
leche.
• Los recuentos de enterobacterias resultaron superiores a los que se
muestran en estudios previos. Estos elevados recuentos encontrados
pueden ser debidos a una mala manipulación del producto o una
inadecuada higiene de los utensilios utilizados y corte de las distintas
muestras.
• El medio selectivo para estafilococos nos mostró altos recuentos
microbianos, sin embargo, estudios posteriores nos presentaron que no
poseían los típicos caracteres de Staphylococcus, coco Gram+ y
catalasa+, por lo que no se puede asegurar que estos quesos tuvieran
altos recuentos de estas bacterias.
• No se encuentran diferencias significativas en cuanto a la diversidad y la
concentración de microorganismos aislados en las diferentes muestras de
queso envasado, respecto a las dos muestras de queso azul.
35
7-BIBLIOGRAFÍA 1. Alais, C.H. (1985) Productos lácteos. Ciencias de la Leche. Barcelona, Ed. Reverté
S.A., p.p 143-145. 2. Allaert, C., Escolá, M. (2002). Métodos de análisis microbiológicos de los alimentos.
Díaz de Santos, Madrid, España.
3. Axelsson, L. (1998). Lactic acid bacteria: Classification and Physiology. Lactic acid
bacteria, Microbiology and functional aspects. Marcel Dekker Inc. 2, 1-72. New York,
USA.
4. Bamforth, C.W. (2007). Alimentos, Fermentación y Microorganismos. Editorial.
Acribia; S.A. p.p 181-185.
5. Barbosa, R.S., Fischer, V., Ribeiro, M.E.R., Zanela, M.B., Stumpf, M.T., Kolling, G.J.,
Júnior, J.S., Barros, L.E., do Egito, A.S. (2012). Electrophoretic characterization of
proteins and milk stability of cows submitted to feeding restriction. Pesq. Agropec.
Bras. 47: 621.
6. Chandan, R.C, Kilara, A., Shah, N.P. (2008). Microbiological Considerations Related
to Dairy Processing. En: Dairy processing and quality assurance. Ramesh, C.C.,
Arun K., Nagendra P.S., (Eds), Wilet-Blackwell. New Delhi, India. pp. 105- 134.
7. Djamel, D., Rivera, V.M. (2016). Bacterias Ácido Lácticas. Fundamentos y
Aplicaciones. Ed. Alfaomega.
8. Durango, J., Arrieta, G., Máttar, S. (2002). Epidemiología de Salmonella spp aislada
de alimentos en la costa Atlántica. Biomédica.
9. Early, R. (1998). Tecnología de los productos lácteos. Ed. Acribia, S.A. Zaragoza,
España.
10. Fernández, E.E. (2000). Microbiología e inocuidad de los alimentos. 1ra Edición.
Universidad Autónoma de Querétaro. México.
11. Foulquié- Moreno, M.R., Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E., De Vuyst, L. (2006).
The role and application of enterococci in food and health. Int. J. Food Microbiol.
106: 1-24.
12. Franz, C.M. Holzapfel, W.E. Stiles, M.E. (1999). Enterococci at the crossroads of
food safety. Int. J. Food Microbiol. 47: 1-24.
36
13. Grande, M.J., Pérez, R., Nabil, N., Lucas, R., Gálvez, A. (2016) Lactobacillus. En:
Bacterias Acido Lácticas: Fundamentos y Aplicaciones. Drider, J., Rivera, V.M.
(Eds), Alfaomega, Mexico, pp. 169.
14. Holzapfel, W.H., Franz, C.M.A.P., Ludwig, W., Back, W., Dicks, L.M.T. (2006). The
Genera Pediococcus and Tetragenococcus. En The Prokariotes (vol. 4). Bacteria:
Firmicutes, Cyanobacteria. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schelifer, K.-H.,
and Stackebrand, E. (Eds), Springer, New York. pp. 229-266.
15. Ingraham, J.L, Ingraham, C.A. (1998). Introducción a la Microbiología. Editorial
Reverté, S.A. Vol 1 y 2 p.p 217,250, 261,262, 559, 573, 677.
16. International Commission on Microbiological. Specifications for Foods.
Microorganismos en los alimentos (1980). Zaragoza. Ed. Acribia.
17. Luquet, F.M. (1991). Leche y productos lácteos. Vaca –oveja- cabra. Tomo I.
Zaragoza. Ed. Acribia S.A.
18. Macedo, M., Vola, M. (2008). Principales grupos de bacilos Gram positivos aerobios,
Temas de Bacteriología y Virología Médica. p.p.343.
19. Madigan, M.T, Martinko, J.M., Dunlap, P.V., Clark. D.P (2009). Brock. Biología de los
microorganismos. Pearson educación. 12th Edición.
20. Martín. P.A.M. (2008). Estudio Polifásico de la Diversidad Microbiana de Quesos
Artesanales Elaborados con Leche Cruda de Cabra. Departamento de
Microbiología. Facultad de Ciencias, Granada. p.p 36-37.
21. McAuley, C.M., Moore, S.C., Fegan N., Fox, E.M. (2014). Prevalence and
characterization of foodborne pathogens from Australian dairy farm environments. J.
Dairy Sci. 97(12): 7402-7412.
22. Orden de 11 de febrero de 1987 por la que se modifica la Norma General de Calidad
para la Leche UHT. Boletín Oficial de Estado44 de 22 de febrero de 1987. 4525.
23. Orden de 29 de noviembre de 1985 por la que se aprueban las Normas de Calidad
para Quesos y Quesos Fundidos destinados al mercado interior. Boletín Oficial de
Estado 292 de 6 de diciembre de 1985. 25515.
24. Panreac, Manual Básico de Microbiologia. (2003).
37
25. Parrilla, M.C., Vazquez, J.L., Saldate, E.O., Nava, L.M (1993). Brotes de
Toxiinfecciones Alimentarias de Origen Microbiano y Parásitario. Salud Pública de
México. 35(5): 456-463.
26. Pérez Escalante, J. (1993). “Bioquímica y Microbiología de la leche”. Ed. Limusa,
México.
27. Pinzón, F. (1995). Recuento Microbiano de la Leche”. Trabajo de Investigación
Universidad Javeriana, España
28. Real Decreto 1679/1994, de 22 de julio, por el que se establece las condiciones
sanitarias aplicables a la producción y comercialización de leche cruda, leche
tratada térmicamente y productos lácteos. Boletín Oficial de Estado 229 de 24 de
septiembre de 1994. 20998.
29. Reinés, M. (2012). Modulación de la estructura del lípido A como estrategia de
virulencia en Yersinia enterocolitica. Universitat De Les Illes Balears. Facultat de
Ciències. Departament de Biología. p.p.25
30. Rodriguez, G.A. (2002). Principales características y diagnóstico de los grupos
patógenos de Escherichia coli. Salud pública México. 44: 464-475.
31. Romero, C., Carbo, R. (1999). Tipificació i estudi de la maduraciódels formatges
artesans de cabra elaborats a l.Alt Urgell. Arxius de l.Escola-Superior d.Agricultura
de Barcelona, sèrie cinquenanúm. 3: 3-21.
32. Salyers, A, Whitt, D. (2002). Bacterial Patogénesis: a molecular approach. Ed. ASM
press, Washinton. Second edition.
33. Schubert, S., Rakin, A., Karch, H., Carniel, E., Heesemann, J. (1998). Prevalence of
the "High-Pathogenicity Island" of Yersinia species among Escherichia coli Strains
That Are Pathogenic to Humans. Infect. Immun. 66(2): 480.
34. Schulze-Koops, Burkhardt, H., Heesemann, J., Kirsch, T., Swoboda, B., Bull, C.,
Goodman, S., Emmrich, F. (1993). Outer Membrane Protein YadA of
Enteropathogenic Yersiniae Mediates Specific Binding to Cellular but Not Plasma
Fibronectin. Infect. Immun. 61(6): 2513-2519.
35. Vergara, C.D., Fernanda, T.M., Fabiola, E., González, C., Lasso, S.N., Ortega, M.C.
(2006). Prevalencia de Brucelosis En La Leche Cruda De Bovinos Expendida en el
Municipio de Popayán Cauca, Septiembre- Diciembre. p.p:77
38
36. Walstra, P., Geurt, T.J., Noomen, A., Jellema, A., Van Boekel, M.A.J.S. (1999). Dairy
Technology. Ed. New York, Marcel Dekker
37. Winn, W.C., Allen, S.D., Janda, W.M., Konemann, E.W., Procop, G.W. (2008).
Capítulo 13. Cocos gram positivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias
similares a Streptococcus. En: Diagnóstico Microbiológico. Koneman (Eds), Editorial
Médica Panamericana, Madrid, España pp. 215-246.
38. Zuñiga, A., Ortiz, D., Tunjano, C.J (2017). Identificación de Clostridium sspp., En
sistemas de Producción Bovina Tradicional y Silvopastoril en Predios de San Miguel
de Sema, Boyaca. p.p.16.