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FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA
JULIA ROSANA PEREIRA TAVARES CASTANHEIRA
EFEITOS DA VITAMINA C NO ESTRESSE OXIDATIVO E
CONTROLE GLICÊMICO NA DOENÇA DE CHAGAS
EM MODELO MURINO
MARÍLIA-SP
2016
Julia Rosana Pereira Tavares Castanheira
Efeitos da vitamina C no estresse oxidativo e controle glicêmico na doença de Chagas em
modelo murino
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento” da Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do título de Mestre. Área de conhecimento: Saúde e Envelhecimento. Orientadora: Profa. Dra. Luciamáre Perinetti Alves Martins Coorientadora: Profa Dra. Elane de Fátima Taipeiro
MARÍLIA-SP
2016
Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília
Castanheira, Julia Rosana Pereira Tavares. Efeitos da vitamina C no estresse oxidativo e controle glicêmico na doença de Chagas em modelo murino / Julia Rosana Pereira Tavares Castanheira. - - Marília, 2016. 89f. Orientadora: Profa. Dra. Luciamáre Perinetti Alves Martins. Coorientadora: Profa Dra. Elane de Fátima Taipeiro. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília.
1. Ácido ascórbico. 2. Doença de Chagas. 3. Antioxidantes. 4. Glucose. 5. Estresse oxidativo. 6. Óxido nítrico.
C346e
Julia Rosana Pereira Tavares Castanheira
Efeitos da vitamina C no estresse oxidativo e controle glicêmico na doença de Chagas em
modelo murino
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento” da Faculdade de Medicina de Marília para obtenção do título de mestre. Área de conhecimento: Saúde e Envelhecimento.
Comissão Examinadora:
Profa. Dra. Luciamáre Perinetti Alves Martins
Faculdade de Medicina de Marília
Prof. Dr. Rinaldo Henrique Aguillar da Silva
Faculdade de Medicina de Marília
Profa. Dra. Patrícia de Souza Rossignoli
Universidade Estadual Paulista - Unesp de Marília
Data da Aprovação:___________________________
À Deus, por estar sempre presente na minha vida!
Me abençoando e dando forças para perseverar!
A minha querida irmã Aurinha, que mesmo não
estando mais entre nós, continua sendo meu maior
exemplo de amor, dedicação, carinho e paciência...
Você sempre estará no meu coração e no meu
pensamento! Muitas saudades... Com amor...
AGRADECIMENTOS Ao meu Senhor Jesus Cristo, o amado da minha alma, autor da minha fé e minha esperança!
Ao meu querido marido Júlio, por estar sempre presente, incentivando e apoiando com
paciência e compreensão nos momentos difíceis. Agradeço a Deus por tê-lo em minha vida!
Aos meus amados filhos Mateus e Tiago, presentes de Deus e meus maiores incentivadores.
Essa conquista é nossa!
Aos meus pais, Arnon e Áurea, que me ensinaram o caminho em que deveria andar, no Temor
do Senhor, desde pequena. Pela dedicação, carinho e apoio constante durante a minha vida.
À todos os meus queridos familiares, em especial meus irmãos Silvia e João Henrique.
À Profª Drª Luciamáre Perinetti Alves Martins, minha orientadora e amiga. Sem sua presença,
apoio, incentivo e paciência não conseguiria esse conquista. O prêmio é nosso!! Obrigada pela
oportunidade de aprendizado, por sua dedicação, profissionalismo, competência, compreensão
e amizade.
A Profª Drª Elane de Fátima Taipeiro (in memoriam), co-orientadora pelos ensinamentos,
auxílio, dedicação, paciência, amizade e fundamental apoio durante todos os momentos desse
trabalho. Destacando a ajuda técnica viabilizando a execução dos experimentos.
A sua ausência tão repentina e inesperada é uma perda irreparável!! Fica um grande exemplo
de dedicação e competência!
Aos Professores Dr. Agnaldo Bruno Chies e Regildo Márcio Gonçalves da Silva por
importante contribuição no desenvolvimento desta pesquisa.
Aos membros da banca examinadora, Profº Dr. Rinaldo Henrique Aguillar da Silva e Profª
Drª Patrícia de Souza Rossignoli pela disponibilidade e atenção, gentilmente contribuindo
para finalização desse trabalho.
Ao Profº Dr Altino Luiz Silva Therezo pela viabilização e auxílio nas análises histológicas.
Ao Profº Dr Sebastião Carvalho por todo o acompanhamento na realização das análises
estatísticas.
Aos acadêmicos do curso de medicina, Hamilton Rocha Júnior , Victhor Z. Wajsman e Yoichi
Konno pela colaboração com o cuidado e tratamento com os animais, fase inicial e primordial
dessa pesquisa. Vocês foram demais!!
À todos os amigos do laboratório de Parasitologia da Famema: Profº Dr. Roberto Castanho,
Andréia, Rosângela, Maurício e Leo, por esse tempo que passamos juntos, pelo
companheirismo e ajuda constantes.
Aos professores do Curso do Mestrado Acadêmico da Famema, pela dedicação e valiosos
ensinamentos; aos colegas de turma, em especial à Michelly pelo companherismo e amizade e
aos secretários, Amauri e Fabrício pelo apoio e grande ajuda.
À minha amiga-irmã Ligia, pela presença constante, apoio, companheirismo e carinho. Voce é
mais que especial!
Ao meu amigo-irmão Wilson, pelo incentivo constante em todos esses anos de grande
amizade. Valeu por tudo, amigo!
À Dani amiga-filha, ao Luiz e Airton, pelo apoio constante, compreensão e amizade.
À Priscila, do laboratório de Farmacologia da Famema, pela ajuda e carinho.
À Vanessa, a Cris e ao Carlos pela ajuda sem igual na diagramação.
Enfim, agradeço a todos que me ajudaram de uma forma ou de outra, não somente durante
esse trabalho, mas em toda a minha vida.
Minha sincera gratidão!
“Confie no Senhor de todo o seu coração e
não se apóie na sua própria inteligência.
Lembre-se de Deus em tudo o que fizer e Ele
lhe mostrará o caminho certo”.
Provérbios 3: 5-6
RESUMO
Introdução: A doença de Chagas (DC) é uma doença parasitária causada pelo protozoário
flagelado Trypanosoma cruzi. A evolução da DC compreende a fase aguda e a crônica, sendo
que, nesta última, acontecem manifestações da doença nas formas cardíacas e digestivas. A
atividade inflamatória desempenha papel fundamental, aumentando a concentração dos
radicais livres no organismo, sendo necessários compostos antioxidantes para diminuir o
estresse oxidativo minimizando as seqüelas da doença. A vitamina C é um antioxidante
hidrossolúvel que pode neutralizar os radicais livres, mas é discutível seu efeito anti/pro
oxidante e anti/pro - inflamatório. Pesquisas mostram que a suplementação com a vitamina C
pode, nesta patologia, interferir sobre o controle glicêmico do organismo. Objetivo: Avaliar o
efeito da suplementação da vitamina C no processo inflamatório, nas defesas antioxidantes e
no controle glicêmico durante a evolução da doença de Chagas. Métodos: 144 camundongos
“Swiss” machos foram divididos em 12 lotes de 12 animais. Os lotes INFA/C, INFC/C,
INFA/A e INFC/A foram infectados com a cepa QM2 de T. cruzi, e os lotes NINFA/C,
NINFC/C, NINFA/A e NINFC/A não foram infectados.Os lotes INFA/C, INFC/C, NINFA/C
e NINFC/C receberam a água suplementada com a vitamina C e os outros receberam água
sem suplementação.Os grupos INFA/C,INFA/A, NINFA/C e NINFA/A receberam tratamento
por 60 dias, fase aguda e os grupos INFC/C,INFC/A,NINFC/C e NINFC/A receberam
tratamento por 180 dias, fase crônica. Foram realizados estudos da parasitemia,
histopatológico e testes bioquímicos. Resultados e conclusões: Os resultados obtidos nesta
pesquisa mostraram que a forma de suplementação com a vitamina C foi eficaz em sua
concentração plasmática. A parasitemia do grupo INFA/C foi menor que do grupo INFA/A
até o 43º dia pós- infecção, porém sem diferença estatisticamente significativa. No
histopatológico os animais do grupo INFA/C e INFC/C apresentaram maior infecção e
inflamação tecidual nas fases aguda e crônica. Observou-se a influência da vitamina C na
síntese do NO, aumentando a sua biodisponibilidade, e como conseqüência a sua
concentração nos grupos suplementados. Em relação ao estresse oxidativo observou-se que
na fase aguda a vitamina C não aumentou a GSH nos grupos suplementados, porém
potencializou a defesa antioxidante determinada pelos GS embora não tenha sido observado
aumento estatisticamente significativo da FRAP. Todavia na fase crônica observou-se que a
diminuição do GSH e FRAP nos grupos infectados está relacionada com a progressão da
doença de Chagas. A glicemia e a insulina foram menores nos grupos infectados no início da
infecção, com diferenças estatisticamente significativas, entretanto no grupo não infectado e
suplementado foi observado níveis de insulina menores quando comparado aos demais
grupos, bem como menor deposição de glicogênio hepático. Os resultados demonstraram
oscilações do metabolismo da glicose que podem ser observados no índice de sensibilidade a
insulina (QUICKI) com aumento da hemoglobina glicada no grupo NINFA/C e no glicogênio
hepático, que diminuiu no INFA/C, ambas as alterações estatisticamente significativas em
relação ao NINFA/A.
Palavras-chave: Ácido ascórbico. Doença de Chagas. Antioxidantes. Glucose. Estresse
oxidativo. Óxido nítrico.
ABSTRACT
Introduction: Chagas disease (DC) is a parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi, a
flagellate protozoan. The evolution of DC comprises acute and chronic phases, and in the
latter, the manifestations of the disease occur in cardiac and digestive forms. The
inflammatory activity plays a key role in increasing the concentration of free radicals in the
body, and antioxidants compounds were required to reduce oxidative stress minimizing the
sequelae of the disease. Vitamin C is a water-soluble antioxidant that can neutralize free
radicals, but it is debatable its anti/pro oxidant and anti/ pro - inflammatory effect. Researches
show that supplementation with vitamin C can interfere with body glycemic control in this
pathology. Objective: Evaluate the effect of vitamin C supplementation in inflammatory
processes, antioxidant defenses and blood glucose control during the evolution of Chagas’
disease. Method: 144 male "Swiss" mice were divided into 12 groups of 12 animals. The
groups INFA/C, INFC/C, INFA/A and INFC/A were infected with T. cruzi QM2 strain, and
groups NINFA/C, NINFC/C, NINFA/A and NINFC/A were not infected. The groups
INFA/C, INFC/C, NINFA/C and NINFC/C received water supplemented with vitamin C and
the others groups received water without supplementation. To study the acute phase, the
groups INFA/C, INFA/A, NINFA/C and NINFA/A received the treatment for 60 days, and to
study the chronic phase, the groups INFC/C, INFC/A, NINFC/C and NINFC/A received the
treatment for 180 days. Parasitemia, histopathological studies and biochemical tests were
performed. Results and conclusions: The results showed that the form of vitamin C
supplementation was effective in plasma concentrations. The parasitaemia of INFA/C group
was lower than the group INFA/A until 43º days post-infection, although no statistically
significant difference. In the histopathological study, animals of groups INFA/C and INFC/C
showed higher infection and tissue inflammation in acute and chronic phases. There was
observed the influence of vitamin C in the synthesis of NO, increasing their bioavailability, as
result of its concentration in the supplemented groups. In relation to oxidative stress, it was
observed that in the acute phase, vitamin C did not increase GSH in the supplemented groups,
but enhanced the antioxidant defense determined by GS although it was not observed
statistically significant increase in FRAP. However, in chronic phase it was observed that
decrease in GSH and FRAP in infected groups was related to the progression of Chagas’
disease. Blood glucose and insulin were lower in groups infected in early phase of the
infection, with differences statistically significant, however in the supplemented and not
infected group was observed lower insulin levels when compared to other groups, as well as
less deposition of liver glycogen. The results showed glucose metabolism oscillations that can
be observed in the insulin sensitivity index (QUICKI) with increased of glycated hemoglobin
in NINFA/C group and in liver glycogen, which decreased in the INFA/C, both changes were
statistically significant from the NINFA/A.
Key-words: Acid ascorbic. Chagas’ disease. Antioxidants. Glucose. Oxidative stress. Nitric
oxide.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura1-Representação esquemática do ciclo de vida do protozoário flagelado
Trypanosoma cruzi...............................................................................................................
20
Figura 2-Reação de oxidação do ácido ascórbico em ácido dehidroascórbico.................... 22
Figura 3 - Cinética da atividade antioxidante da solução de vitamina C em 12 horas......... 30
Figura 4- Curva parasitêmica pela média logarítmica do nº de tripomastigotas/5µl de
sangue do grupo INFA/C e INFA/A durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi do 8º
ao 61º dia..............................................................................................................................
39
Figura 5- Fotos de cortes histológicos realizados pela técnica de Hematoxilina- Eosina
em camundongos experimentalmente infectados pela cepa QM2 de T. cruzi e tratados
com vitamina C durante a fase aguda da doença de Chagas................................................
42
Figura 6- Fotos de cortes histológicos realizados pela técnica de Hematoxilina- Eosina
em camundongos experimentalmente infectados pela cepa QM2 de T. cruzi durante a
fase crônica da doença de Chagas, sendo A, B e C em animais tratados com vitamina C
e D, E e F tratados com água................................................................................................
45
Figura 7- Evolução da produção de óxido nítrico (NO) na fase aguda (15, 30 e 60 dias) e
na fase crônica (180 dias) .................................................................................................
48
Figura 8- Valores médios e desvio padrão para as determinações das concentrações de
vitamina C no plasma entre os grupos experimentais da fase aguda. .................................
51
Figura 9- Valores médios e desvio padrão para as determinações das concentrações de
vitamina C no plasma entre os grupos experimentais na fase crônica................................
51
Figura 10- Valores médios e desvio padrão para as determinações de Glutationa
reduzida (GSH) entre os grupos experimentais da fase aguda.............................................
52
Figura 11- Valores médios e desvio padrão para as determinações de Glutationa
reduzida (GSH) entre os grupos experimentais na fase crônica...........................................
52
Figura 12- Valores médios e desvio padrão para as determinações da Capacidade
antioxidante do plasma (FRAP) entre os grupos experimentais da fase aguda...................
53
Figura 13- Valores médios e desvio padrão para as determinações da Capacidade
antioxidante do plasma (FRAP) entre os grupos experimentais na fase
crônica..................................................................................................................................
53
Figura 14- Valores médios e desvio padrão para as determinações da Contribuição da
vitamina C à Capacidade antioxidante do plasma (FRAP) entre os grupos experimentais
na fase aguda........................................................................................................................
54
Figura 15- Valores médios e desvio padrão para as determinações da Contribuição da
vitamina C à Capacidade antioxidante do plasma (FRAP) entre os grupos experimentais
na fase crônica......................................................................................................................
54
Figura 16- Valores médios e desvio padrão para as determinações dos grupamentos
sulfidrilas totais (GS) entre os grupos experimentais na fase aguda....................................
55
Figura 17- Valores médios e desvio padrão para as determinações dos grupamentos
sulfidrilas totais (GS) entre os grupos experimentais na fase crônica..................................
55
Figura 18- Determinações da glicemia na evolução da fase aguda (15, 30 e 60 dias) e na
fase crônica (180 dias) .........................................................................................................
59
Figura 19- Determinações das concentrações de insulina na evolução da fase aguda (15,
30 e 60 dias) e na fase crônica (180 dias) ...........................................................................
59
Figura 20- Determinações do índice de sensibilidade à insulina (QUICKI) na evolução
da fase aguda (15, 30 e 60 dias) e na fase crônica (180 dias) .............................................
61
Figura 21-Valores médios e desvio padrão das concentrações de Glicogênio hepático
entre os grupos experimentais da fase aguda. .....................................................................
62
Figura 22- Valores médios e desvio padrão das determinações de Glicogênio hepático
entre os grupos experimentais na fase crônica.....................................................................
62
Figura 23- Valores médios e desvio padrão das determinações de Hemoglobina glicada
para os grupos experimentais na fase aguda........................................................................
63
Figura 24- Valores médios e desvio padrão das determinações de Hemoglobina glicada
para os grupos experimentais na fase crônica......................................................................
63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Identificação dos grupos estudados nas fases aguda e crônica............................ 28
Tabela 2- Distribuição dos lotes em grupos estudados e o número de animais analisados
em cada grupo nos períodos das fases aguda e crônica.......................................................
29
Tabela 3-Taxa de mortalidade na fase aguda e crônica....................................................... 38
Tabela 4- Estudo da parasitemia durante a fase aguda apresentada pela parasitemia
média e média logaritmica dos grupos infectados INFA/C e INFA/A................................
39
Tabela 5- Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas
e fígado durante a fase aguda em camundongos experimentalmente infectados pelo
Trypanosoma cruzi QM2 tratados com vitamina C (INFA/C) e com água (INFA/A)........
41
Tabela 6- Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas
e fígado durante a fase aguda em camundongos não infectados pelo Trypanosoma cruzi
e tratados com vitamina C (NINFA/C) e com água
(NINFA/A)...........................................................................................................................
41
Tabela 7- Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas
e fígado durante a fase crônica em camundongos experimentalmente infectados pelo
Trypanosoma cruzi QM2 tratados com vitamina C (INFC/C) e com água
(INFC/A)..............................................................................................................................
43
Tabela 8- Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas
e fígado durante a fase crônica em camundongos não infectados pelo Trypanosoma cruzi
e tratados com vitamina C (NINFC/C) e com água
(NINFC/A)...........................................................................................................................
44
Tabela 9- Valores médios, desvio padrão e análise estatística da concentração de NO no
15º, 30º e 60º dias pós-infecção nos grupos experimentais da fase aguda ..........................
47
Tabela 10- Valores médios, desvio padrão e análise estatística da concentração de NO
no 180º dias pós-infecção nos grupos experimentais da fase crônica..................................
47
Tabela 11- Valores médios, desvio padrão e análise estatística, mostrando as
comparações significantes dos parâmetos bioquímicos determinados na fase aguda nos
diferentes grupos experimentais infectados pela cepa QM2 do Trypanosoma cruzi...........
49
Tabela 12- Valores médios, desvio padrão e análise estatística, mostrando as
comparações significantes dos parâmetos bioquímicos determinados na fase crônica nos
diferentes grupos experimentais infectados pela cepa QM2 do Trypanosoma
cruzi......................................................................................................................................
50
Tabela 13- Valores médios de glicemia, insulina, hemoglobina glicada e glicogênio no
15º, 30º e 60º dias.................................................................................................................
57
Tabela 14- Valores médios de glicemia, insulina, hemoglobina glicada e glicogênio no
180º dia (final da fase crônica) ............................................................................................
58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CAT Enzima catalase CO2 Dióxido de Carbono Cu+ Íon cobre CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais DC Doença de Chagas DM2 Diabetes Mellitus DNA Ácido Desoxirribonucléico DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
Capacidade doadora de H+ para o radical estável dpi Dias pós infecção ERN Espécies reativas de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigênio Fe2+ Íon ferroso Fe3+ Íon férrico FRAP Ferric – Reducing Ability of Plasm
(Habilidade Plasmática de Reduzir o sal férrico) GPX Glutationona peroxidase GS Grupamentos Sulfidrila GSH Glutationa reduzida GSSH Glutationa oxidada Hb Hemoglobina HO2���� radical hidroperoxila IL Interleucina INF Interferon
INFA/A Infectados agudo tratado com água INFA/C Infectados agudo suplementado com vitamina C INFC/A Infectados crônico tratado com água INFC/C Infectados crônico suplementado com vitamina C QUICKI Quantitative Insulin Sensitivity Check Index NINFA/A Não infectado agudo tratado com água NINFA/C Não infectado agudo suplementado com vitamina C NINFC/A Não infectado crônico tratado com água NINFC/C Não infectado crônico suplementado com vitamina C NO Óxido Nítrico NO2 Nitrato NO3 Nitrito NO2���� Dióxido de Nitrogênio NK Natural Killer O2���� Superóxido OH���� Hidroxila SOD Enzima superóxido dismutase TGF Fator de crescimento tumoral TNF Fator de necrose tumoral Th Linfócito T auxiliador (LT Helper)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 26
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................ 26
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 26
2.2.1 Determinar o efeito da suplementação com vitamina C no processo inflamatório
desencadeado pelo T. cruzi por meio da parasitemia, análise histopatológica e concentração
do óxido nítrico (NO). .......................................................................................................... 26
2.2.2 Determinar a concentração da vitamina C, glutationa reduzida (GSH), capacidade
antioxidante do plasma (FRAP) e grupamentos sulfídrilas totais do plasma (GS) como
defesa antioxidante do sangue em função da suplementação com vitamina C na infecção
pelo T. cruzi. ......................................................................................................................... 26
2.2.3 Determinar a influencia da vitamina C nas concentrações de glicemia, insulinemia,
hemoglobina glicada e glicogênio hepático e sua possível ação na multiplicação do T. cruzi.
.............................................................................................................................................. 26
3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 27
3.1 Animais utilizados .......................................................................................................... 27
3.2 Infecção dos animais ...................................................................................................... 27
3.3 Identificação dos grupos ................................................................................................. 27
3.4 Distribuição dos grupos .................................................................................................. 28
3.5 Forma de Tratamento...................................................................................................... 29
3.5.1 Cálculo da suplementação da água com vitamina C ............................................... 29
3.5.2 Demonstração da estabilidade da atividade antioxidante da vitamina C na água de
suplementação .................................................................................................................. 30
3.6 Estudo da parasitemia ..................................................................................................... 31
3.7 Estudo histopatológico e bioquímico ............................................................................. 31
3.7.1 Análise histopatológica ........................................................................................... 31
3.7.2 Análises Bioquímicas .............................................................................................. 32
4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................. 37
5 RESULTADOS .................................................................................................................... 38
5.1. Os resultados obtidos para verificar o efeito da vitamina C na mortalidade e no
processo inflamatório desencadeado pela infecção do T. cruzi estão apresentados abaixo. 38
5.1.1 Taxa de mortalidade ................................................................................................ 38
5.1.2 Determinação da parasitemia................................................................................... 38
5.1.3 Estudo histopatológico ............................................................................................ 40
5.1.4 Determinação das concentrações plasmáticas de óxido nítrico total (NO) ............. 46
5.2 Determinação da dinâmica da defesa antioxidante do sangue em função da
suplementação com vitamina C na infecção pelo T. cruzi ................................................... 48
5.2.1 Os resultados das análises bioquímicas obtidos para as fases aguda e crônica estão
apresentados nas Tabela 11 e 12 e Figuras de 8 a 17 respectivamente. .......................... 48
5.3. Determinação da influencia da vitamina C no controle glicêmico e sua possível ação na
multiplicação do T.cruzi ...................................................................................................... 56
5.3.1 Determinação da glicemia, insulina, hemoglobina glicada e glicogênio hepático .. 56
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 64
6.1 Efeitos da suplementação com vitamina C no processo inflamatório desencadeado pelo
T. cruzi .................................................................................................................................. 64
6.2 Avaliação da dinâmica da defesa antioxidante do sangue em função da suplementação
com vitamina C na infecção pelo T. cruzi. ........................................................................... 67
6.3 Influencia da vitamina C no controle glicêmico e sua possível ação na multiplicação do
T. cruzi .................................................................................................................................. 71
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 75
8 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 76
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 77
19
1 INTRODUÇÃO
Os países em desenvolvimento, assim como os emergentes, têm apresentado um
crescimento nas áreas sociais e da saúde, o que tem contribuído para o aumento da
longevidade de sua população, estimando-se que em 2025 a população de idosos atinja quase
2 bilhões de indivíduos. Considerando que o idoso pode apresentar alterações imunológicas,
prevê-se um aumento de doenças crônicas como as infecciosas, inflamatórias e neoplasias.1
Portanto, a morbidade em geral e as doenças infecciosas crônicas vêm acompanhando
tal situação, na qual podemos incluir a doença de Chagas.2
A doença de Chagas (DC) foi descoberta pelo médico sanitarista Carlos Chagas em
19093 e, ainda hoje, se constitui em uma endemia preocupante, uma vez que 16 a 18 milhões
de indivíduos podem estar acometidos na América Latina.2 No Brasil, aproximadamente, três
milhões de indivíduos encontram-se na fase crônica da doença.4
Por ser uma doença do continente americano é também denominada tripanossomíase
americana, sendo causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, que pode acometer
homens, animais domésticos e selvagens, como hospedeiros definitivos e principais
reservatórios. A transmissão vetorial se dá por insetos hematófagos da família Reduviide e
subfamília Triatominae, popularmente conhecida como “barbeiros”. Atualmente, no Brasil a
principal espécie transmissora, Triatoma infestans está sob controle. Porém, existem outros
mecanismos de transmissão como a transfusão sanguínea, oral (alimentos contaminados) e
congênita.2,5
A infecção vetorial ocorre quando o barbeiro realiza a hematofagia e elimina em suas
fezes as formas tripomastigotas metacíclicas que penetram pelo local da picada e interagem
com células fagocitárias da pele ou mucosa. Neste local, intracelularmente, ocorre a
transformação dos tripomastigotas em amastigotas e inicia-se o processo de multiplicação por
meio de divisão binária. Em seguida, ocorre a diferenciação dos amastigotas em
tripomastigotas, que, rompendo a membrana da célula hospedeira, são liberados caindo na
corrente sanguínea.5 As formas tripomastigotas não possuem capacidade de divisão celular,
mas são altamente infectantes, capazes de parasitar diferentes tipos celulares, incluindo
macrófagos, células musculares lisas e estriadas, inclusive fibroblastos.6
20
Figura 1 – Representação esquemática do ciclo de vida do protozoário flagelado
Trypanosoma cruzi
A fase aguda da doença é caracterizada por intensa multiplicação e invasão de células,
sendo geralmente assintomática. No entanto, alguns indivíduos podem apresentar
sintomatologia como: chagoma de inoculação ou sinal Romanã, febre, adenopatia
generalizada, edema, hepatoesplenomegalia, miocardite e meningoencefalite nos casos
severos.7 Esse período se estende de 6 a 8 semanas, apresenta uma elevada parasitemia em
que o parasita pode ser encontrado nas formas tripomastigotas circulantes no sangue e formas
amastigotas nos tecidos de órgãos acometidos.8,9
Nesses órgãos atingidos a presença dos parasitas e a ruptura dos ninhos de amastigotas
promovem um quadro inflamatório com predomínio de células mononucleares próximas das
células parasitadas rompidas. A inflamação tende a diminuir após a fase aguda.10
O parasitismo intenso observado na fase aguda é controlado pela resposta imune contra
o T. cruzi levando a fase crônica com baixo parasitismo. Na fase crônica cerca de 70% dos
pacientes não apresentam sintomas clínicos, sendo conhecida como forma indeterminada.
Contudo, aproximadamente 30% desenvolvem sintomatologia em um período que varia de 10
a 30 anos após a infecção, apresentando principalmente as formas clínicas cardíacas e
digestivas podendo apresentar cardiomegalia, megaesôfago e/ou megacólon; com lesões
irreversíveis desencadeadas pela atividade inflamatória.11,12
21
Como resposta imune no hospedeiro vertebrado observa-se ativação de células B
levando a produção de níveis substanciais de anticorpos e ativação de linfócitos T CD4+ e
CD8+.13 Também há ativação inespecífica de células natural killer (NK) células dendríticas
(DC) e macrófagos que desempenham um papel fundamental na resistência à infecção14, com
a produção de citocinas pró-inflamatórias como interferon-δ (IFN-δ); interleucina 12 (IL-12) e
o fator de necrose tumoral-α (TNF-α). O IFN-δ tem um papel importante na ativação de
macrófagos, quando produzirão elevados níveis de óxido nítrico (NO) que irão controlar a
replicação do parasita.15
No sangue periférico também foi demonstrado que a infecção crônica induz um estado
pró-inflamatório com produção de citocinas do tipo Th1. Além disso, ocorre a supressão de
citocinas com atividade anti-inflamatória do tipo Th2, como IL-4 e IL-10.16,17,18 As citocinas
produzidas então estimulam a liberação de outros mediadores inflamatórios como espécies
reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN).19 Sendo assim, os
processos inflamatórios promovem o aumento da concentração dos radicais livres, uma vez
que no organismo, os mesmos são produzidos naturalmente através de processos metabólicos
oxidativos20.
Radicais livres são átomos e moléculas que têm um ou mais elétrons isolados, ou seja,
não pareados na sua última órbita, livres para se ligar a qualquer outro elétron, sendo por isso,
extremamente reativos, os quais podem ser gerados por fontes exógenas ou endógenas 21,22, 23
Os principais radicais livres observados nesses processos são: superóxido (O2•), hidroxila
(OH•), radical hidroperoxila (HO2•), óxido nítrico (NO•) e o dióxido de nitrogênio
(NO2•).21,22 O radical hidroxila é o mais reativo promovendo lesões nas moléculas celulares e
o peróxido de hidrogênio pode atravessar a membrana nuclear e danificar o DNA. 23,24
A doença de Chagas, sendo uma doença inflamatória induz as células fagocitárias,
principalmente neutrófilos e macrófagos a produzir os radicais superóxidos (O2•) e óxido
nítrico (NO•) como parte do mecanismo de defesa imunológica, a fim de eliminar o parasita.
Essa produção torna-se excessiva provocando lesões nos tecidos. 22
Pesquisas atuais têm demonstrado que o aumento do estresse oxidativo acompanha a
avanço da doença de Chagas 25,26,27 e que tem sido eficaz o uso de elementos antioxidantes,
podendo influenciar na evolução da doença.27
Quando as ERO e ERN são produzidas em excesso, ou por longos períodos, podem
exercer efeitos tóxicos que danificam as células e tecidos, resultando na disfunção dos
processos fisiológicos.28 O estresse oxidativo ocorre quando as defesas antioxidantes
endógenas tornam-se insuficientes frente à excessiva produção de ERO e ERN, ficando os
22
componentes celulares desprotegidos, podendo causar perturbações nos mecanismos de
sinalização celular normal.29 As EROs podem oxidar proteínas, lipídios e DNA, podendo
atingir qualquer componente celular, porém a membrana é um dos mais suscetíveis em
decorrência da lipoperoxidação.20,24,28 Para combater esses radicais livres, principalmente em
condições inflamatórias, e diminuir o estresse oxidativo o organismo necessita utilizar
compostos antioxidantes, na tentativa de minimizar as seqüelas da doença.26,30,31,32.
Os sistemas biológicos utilizam moléculas e enzimas como antioxidantes que podem
ser endógenos enzimáticos como a glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido
dismutase (SOD) e não enzimáticos como a glutationa (GSH). Além desses, o organismo
utiliza aqueles provenientes da dieta como: α – tocoferol (vitamina E), β caroteno (pro-
vitamina A) , ácido ascórbico (vitamina C) e compostos fenólicos (flavonóides).26
A vitamina C, ou ácido ascórbico, é um nutriente essencial ao organismo, pois
apresenta inúmeras propriedades fisiológicas. Os humanos não podem sintetizar o ácido
ascórbico, sendo necessário obtê-lo a partir da dieta e a sua deficiência leva ao
desenvolvimento do escorbuto. Ela se apresenta sob duas formas: ácido ascórbico (AA) ou
ascorbato que é a forma reduzida e o ácido dehidroascórbico (DHA), que é a forma oxidada.
A síntese do DHA a partir do AA ocorre através da reação de oxidação, onde dois elétrons
são removidos, dando origem primeiro ao radical ascorbil e posteriormente ao ácido
dehidroascórbico (DHA). Ambas as formas reduzidas e oxidadas são transportadas através
das membranas celulares; porém a forma reduzida é fisiologicamente mais ativa e é mais
encontrada no plasma e tecido. 29,33,34,35
Figura 2 – Reação de oxidação do ácido ascórbico em ácido dehidroascórbico.
Adaptado de Levine et al., 1999.
A vitamina C ou ascorbato é um antioxidante dietético hidrossolúvel, sendo um
potente agente redutor, pois pode doar elétrons a serem sequestrados por uma variedade de
23
espécies oxidantes e de radicais livres reativos. A vitamina C sequestra de forma eficaz os
radicais hidroxila, peroxila e superóxidos.36
Entretanto, o ascorbato pode atuar como pró-oxidante potencializando a reação de
Fenton, na qual a presença de metais transição Fe2+ e Cu1+ reagem com o peróxido de
hidrogênio levando a formação de radical hidroxila.29,37
Várias pesquisas têm sido realizadas para verificar o efeito pró-oxidante 34,38,39 e anti-
próinflamatório 40,41 da vitamina C, uma vez que as propriedades antioxidantes estão bem
estabelecidas.36,42,43. Estudos de revisão de Carr e Frei38 investigaram o papel da vitamina C em 44
pesquisas e mostraram que em 38 havia uma redução dos marcadores oxidativos, em 14 não
foram observados qualquer alteração e em apenas seis demonstrou-se aumento ao dano
oxidativo após suplementação com vitamina C.
Da mesma forma, Duarte e Lunec 39 após revisarem alguns estudos sobre os efeitos da
vitamina C observaram que a maioria apresentou uma redução no dano oxidativo ao DNA ou
efeito nulo enquanto apenas alguns estudos apresentaram aumento nas lesões.
Estudos de Padayatti et al 34 mostraram que a intervenção da vitamina C não
apresentou mudança nos marcadores de oxidação ou benefício clínico sugerindo que o
ascorbato pode agir como antioxidante ou pró-oxidante dependendo de sua dosagem e
concentração.
Jialal e Singh 40 avaliaram a vitamina C, e efeitos sob biomarcadores de inflamação e
mostraram que a suplementação venosa com vitamina C melhora a vasoreatividade na
disfunção endotelial, o que não foi confirmado na suplementação oral. Mikirova et al. 41
concluiram que altas doses intravenosas de ascorbato podem reduzir a inflamação em
pacientes com câncer.
Neste contexto, pesquisas de Fisher e Naughton 44 relataram que a elevada ingestão de
ácido ascórbico, acima do recomendado, pode ser prejudicial em pacientes que sofrem de
condições inflamatórias crônicas.
Mação et al.27 administraram 500 mg de vitamina C e 800 UI de vitamina E em
pacientes crônicos portadores da doença de Chagas por um período de seis meses, e
mostraram que o estresse oxidativo foi controlado no miocárdio, possivelmente pela ação
antioxidante das vitaminas.
Tavares 35, ao investigar as funções de vitamina C também relatou ações antioxidantes
e pró-oxidantes, as quais são determinadas principalmente pela concentração local da
vitamina, a presença ou ausência de metais de transição e pelo potencial redox da célula.
24
De acordo com Nightingale et al.45 a terapia oral com vitamina C também pode
aumentar a biodisponibilidade de NO, concordando com pesquisas de Jackson et al. 46 os
quais relataram que fisiologicamente, o aumento da concentração do NO só ocorreria em altas
concentrações de ácido ascórbico.
Tal efeito pode ser importante na doença de Chagas, pois estudos de Ribeiro et al.47
mostraram que altas concentrações de NO causaram maiores danos ao DNA das células
cardíacas e esplênicas. Para Arantes et al.,48 o NO seria o mediador final dos danos neuronais
da doença de Chagas aguda.
Pesquisas experimentais realizadas anteriormente pelo nosso grupo demonstraram que
a suplementação com vitamina C não foi capaz de proteger contra o estresse oxidativo,
promovendo o aumento do processo inflamatório, causando maior dano aos tecidos, tanto na
fase aguda quanto na crônica da doença de Chagas, bem como o aumento da peroxidação
lipídica, inferindo que a vitamina C agiu como pró-oxidante e pró-inflamatório para estes
animais.49,50,51
A infecção pelo T. cruzi produz uma resposta inflamatória que pode influenciar
diversos processos, entre eles a resistência à insulina, sugerindo que alguns parâmetros
metabólicos possam estar alterados no hospedeiro. Neste sentido, em humanos, há evidências
de comprometimento funcional e anatômico do pâncreas, tanto na fase aguda quanto na
crônica.52,53,54 Além disso, estudos anteriores demonstraram que pacientes chagásicos
apresentaram níveis elevados de glicose no sangue e uma predisposição alta para o
desenvolvimento de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) em comparação com indivíduos
saudáveis.55,56 Porém outros estudos não demonstraram maior prevalência de Diabetes
Mellitus ou alterações em teste de tolerância oral à glicose em chagásicos,57,58,59 ou no índice
de resistência à insulina.60
Em modelo murino, Tanowitz et al.61 demonstraram que ratos diabéticos infectados
com T. cruzi apresentavam aumento da parasitemia. Por sua vez, Nagajyothi et al.62,63
relataram que camundongos infectados com T. cruzi apresentavam hipoglicemia, apesar dos
níveis aumentados de glucagon. Coombs et al.64 também monstraram que níveis de insulina
diminuíram na fase aguda da infecção pelo T. cruzi em ratos, como resposta para níveis muito
baixos de glicose neste período da doença; o qual em muitos casos é fator preditivo de
mortalidade.
A suplementação com vitamina C pode influenciar o controle glicêmico do organismo,
sendo que alguns estudos 65,66 relataram que níveis plasmáticos elevados de ácido ascórbico
25
retardaram a resposta da insulina às variações nos níveis de glicose de indivíduos
normoglicêmicos prolongando a hiperglicemia prandial.67 Por outro lado, a interelação entre
estes fatores são complexos, uma vez que as concentrações de vitamina C no organismo não
dependem apenas da ingestão, mas também da glicemia e concentrações de insulina
plasmática.68
Embora, no senso comum, a suplementação antioxidante tenha benefício, o que tem
tornado seu uso indiscriminado, as evidências obtidas com suplementação de vitamina C
sugerem cautela. Portanto, este trabalho propõe-se a avaliar a ação da vitamina C, na
dosagem equivalente a 500 mg de ácido ascórbico/dia, nos processos inflamatórios, na defesa
antioxidante e no controle glicêmico de camundongos sadios e infectados experimentalmente
com a cepa QM2 de T. cruzi na fase aguda e crônica da doença de Chagas.
26
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito da suplementação da vitamina C nos processos inflamatórios, nas
defesas antioxidantes e no controle glicêmico, durante a evolução da doença de Chagas
experimental.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Determinar o efeito da suplementação com vitamina C no processo inflamatório
desencadeado pelo T. cruzi por meio da parasitemia, análise histopatológica e concentração
do óxido nítrico (NO).
2.2.2 Determinar a concentração da vitamina C, glutationa reduzida (GSH), capacidade
antioxidante do plasma (FRAP) e grupamentos sulfídrilas totais do plasma (GS) como
defesa antioxidante do sangue em função da suplementação com vitamina C na infecção pelo
T. cruzi.
2.2.3 Determinar a influencia da vitamina C nas concentrações de glicemia, insulinemia,
hemoglobina glicada e glicogênio hepático e sua possível ação na multiplicação do T. cruzi.
27
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais utilizados
Nesta pesquisa foram utilizados 144 camundongos “Swiss” machos de 20 dias de
idade, pesando aproximadamente 25 gramas (grs). Esses animais foram divididos em lotes de
12 camundongos e mantidos em 12 gaiolas de 33x40x16,5cm no Biotério de Manutenção do
Laboratório de Parasitologia onde receberam ração padrão Nuvilab® (Anexo 1) e água
(suplementada ou não com vitamina C) ad libitum. Foram aclimatados em temperatura de
25ºC com fotoperíodo claro/escuro de 12 horas. A forma de tratamento, cuidados e eutanásia
dos camundongos seguiu as normas da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA).
Projeto aprovado no CEUA nº 1253/13, em 28/06/2013 (Anexo 2).
3.2 Infecção dos animais
Seis grupos de animais foram inoculados, por via intraperitoneal, com 5,0 x 104 formas
tripomastigotas da cepa QM2 de T. cruzi, caracterizada por Martins et al.69, a partir do sangue
proveniente de outro camundongo previamente infectado.
3.3 Identificação dos grupos
Os animais foram separados, aleatoriamente, e identificados da seguinte forma (Tabela
1):
28
Tabela 1 - Identificação dos grupos estudados nas fases aguda e crônica
FASE AGUDA
INFECTADOS NÃO INFECTADOS
INFA/C
Infectado agudo suplementado com vit. C
NINFA/C
Não infectado agudo suplementado com vit. C
INFA/A
Infectado agudo tratado com água
NINFA/A
Não infectado agudo tratado com água
FASE CRÔNICA
INFECTADOS NÃO INFECTADOS
INFC/C
Infectado crônico suplementado com vit. C
NINFC/C
Não infectado crônico suplementado com vit.C
INFC/A
Infectado crônico tratado com água
NINFC/A
Não infectado crônico tratado com água
3.4 Distribuição dos grupos
Para o estudo da fase aguda foram separados 2 grupos de 48 animais cada, sendo um
grupo de 48 camundongos denominado Lote 1, o qual foi dividido em 4 grupos de 12 animais
para o estudo da glicemia, insulinemia, óxido nítrico(NO) e um segundo grupo de 48 animais,
denominado Lote 2, o qual também foi dividido em 4 grupos de 12 animais para o estudo da
taxa de mortalidade, parasitemia, análise histopatológica e as determinações bioquímicas
(concentração plasmática de vitamina C, capacidade antioxidante do plasma (FRAP),
grupamentos sulfidrilas totais do plasma (GS), determinação da glutationa reduzida (GSH) e
glicogênio hepático e hemoglobina glicada).
- Para o estudo da fase crônica foi utilizado um grupo de 48 camundongos,
denominado Lote 3, o qual foi dividido em 4 grupos de 12 animais para a realização das
mesmas determinações da fase aguda com exceção da parasitemia.
No total foram obtidos 12 grupos de 12 animais cada, sendo que 6 grupos foram
infectados e 6 grupos não foram infectados.
29
Tabela 2 - Distribuição dos lotes em grupos estudados e o número de animais analisados em cada grupo nos períodos das fases aguda e crônica.
FASE AGUDA
LOTE 1
INFA/C INFA/A NINFA/C NINFA/A
15 DIAS 4* 4* 4* 4*
30 DIAS 4* 4* 4* 4*
60 DIAS 4* 4* 4* 4*
LOTE 2
60 DIAS 12* 12* 12* 12*
FASE CRÔNICA
LOTE 3
INFC/C INFC/A NINFC/C NINFC/A
180 DIAS 12* 12* 12* 12*
*numero de animais por grupo
3.5 Forma de Tratamento
Para os camundongos dos grupos INFA/C, INFC/C, NINFA/C e NINFC/C foi
oferecida água suplementada com o equivalente a 500 mg/dia vitamina C e ração Nuvilab®
ad libitum. Para suplementar a água a ser oferecida aos camundongos foi utilizado Cewin®
gotas Sanifi-Aventis Laboratory (Anexo 3), cuja apresentação de vitamina C é de 200 mg/ml.
Os grupos INFA/A, INFC/A, NINFA/A e NINFC/A receberam água e ração Nuvilab®
ad libitum padronizada pelo Biotério Central da Famema para alimentação dos animais.
Os grupos INFA/C, INFA/A, NINFA/C e NINFA/A receberam esse tratamento por 60
dias; e os grupos INFC/C, INFC/A, NINFC/C e NINFC/A receberam por 180 dias.
3.5.1 Cálculo da suplementação da água com vitamina C
A dosagem equivalente a 500 mg/dia de vitamina C foi determinada considerando
pesquisas prévias.49,50,51 Desta forma, foi fornecido aos camundongos dosagem equivalente a
30
500mg/dia considerando o peso médio dos camundongos, que é de, aproximadamente, 25 grs,
bem como o volume da ingesta diária que é ao redor de 5 mL. Portanto, foram diluídos 0,5
mL desse medicamento em 3000 mL de água, e distribuídos 500 mL nos bebedouros dos
grupos experimentais, sendo a solução trocada a cada 12 horas.
O bebedouro que serviu de recipiente para a água suplementada foi envolvido em
papel alumínio para evitar a oxidação pela luz.da vitamina C, mantendo a estabilidade da
solução.
3.5.2 Demonstração da estabilidade da atividade antioxidante da vitamina C na água de
suplementação
A avaliação da estabilidade da ação antioxidante da vitamina C na água oferecida aos
animais suplementados mostrou uma boa conservação após a realização da solução. A solução
recém-preparada apresentava 47.5 % de capacidade doadora de H+ para o radical estável
DPPH, a qual correspondeu a 34% no prazo de 6 horas e a 22.3 % ao final das 12 horas
(Figura 3).
Figura 3 - Cinética da atividade antioxidante da solução de vitamina C em 12 horas.
A estabilidade da atividade antioxidante da Vitamina C na água utilizada nos
bebedouros para suplementação dos animais durante o período de 12 horas foi demonstrada
determinada pela capacidade doadora de H+ para o radical estável DPPH (2,2-difenil-1-
picrilhidrazil).70 O DPPH apresenta máxima absorbância à 517nm, que decresce na presença
de moléculas doadoras de H+, indicado pela mudança da coloração roxa para amarelo. Os
experimentos foram realizados em triplicata para fins estatísticos, utilizando a solução de 1mL
31
de tampão acetato (pH 5,5 e 100mM), 1mL de etanol P.A., 500µL de solução de DPPH
(250µM) e de 50 da amostra de suplementação nos intervalos de tempo 0, 3, 6, 9 e 12 horas.
A Vitamina C reagiu com o radical DPPH por um período de 30 minutos em ambiente de
pouca luminosidade e em seguida submetidos à leitura em espectrofotômetro UV-Vis num
comprimento de onda de 517nm. O cálculo da atividade antioxidante foi realizado de acordo
com a fórmula: Atividade antioxidante (%) = [(Acontrole – Aamostra) / Acontrole] x 100; onde
Aamostra é a absorbância das amostras após 30 minutos e Acontrole é a absorbância do DPPH.
3.6 Estudo da parasitemia
Foi realizado durante a fase aguda da infecção. Desta forma, durante 60 dias foi
determinada, duas vezes por semana, a parasitemia de seis camundongos de cada grupo
infectado, utilizando sangue periférico caudal de acordo com o método de Brener71, iniciando
no 8º dia após a infecção, totalizando-se 16 contagens para cada animal. Esses animais foram
escolhidos aleatoriamente e mantidos em gaiolas isoladas até o final do estudo parasitêmico
recebendo normalmente o tratamento até o fim da fase aguda.
3.7 Estudo histopatológico e bioquímico
Para o estudo histopatológico e bioquímico os animais foram eutanasiados com CO2
no 60º dia para o estudo da fase aguda e aos 180º dias para o estudo da fase crônica.
3.7.1 Análise histopatológica
Os animais do Lote 2 foram eutanasiados por CO2 e foi coletado um fragmento de
coração, cólon, músculo esquelético da coxa, pâncreas e fígado de todos os camundongos dos
grupos INFA/C, INFA/A, NINFA/C e NINFA/A no 60º dia após a infecção para o estudo da
fase aguda e no 180º dia os camundongos do Lote 3, dos grupos INFC/C, INFC/A, NINFC/C
e NINFC/A para o estudo da fase crônica. O material recolhido foi conservado em frascos
plásticos contendo formol 10%; após, os tecidos foram embebidos em parafina e cortados em
seções de 5µm de espessura, corados pela hematoxilina-eosina para análise e examinados, em
esquema cego, sob um microscópio óptico com uma ampliação de 400x. Foi utilizada uma
escala semiquantitativa de zero a três cruzes para graduar o processo inflamatório, ninhos de
amastigotas e necrose, sendo considerado: “zero”- ausência de inflamação, ninhos de
32
amastigotas e necrose; “+”- inflamação discreta, raros ninhos de amastigotas e necrose; “++”-
inflamação moderada, moderado número de ninhos de amastigotas e necrose; e “+++”-
inflamação intensa, frequentes ninhos de amastigotas e necrose.
3.7.2 Análises Bioquímicas
3.7.2.1 Obtenção e Preparo do material
- Lote 1: Para a realização das determinações da glicemia foi coletado uma gota de
sangue da cauda dos animais semanalmente. Para as determinações da insulina e óxido nítrico
(NO), 4 animais de cada grupo foram eutanasiados por CO2 no 15º, 30º e 60º dias após a
infecção e o sangue coletado por punção cardíaca.
- Lote 2: Para a determinação plasmática da vitamina C, GSH reduzida, FRAP, GS e
hemoglobina glicada, os animais foram eutanasiados por CO2 no 60º dias após a infecção e o
sangue coletado por punção cardíaca em heparina. Para a dosagem de glicogênio hepático um
fragmento do fígado foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e, posteriormente,
armazenado à -80°C.
- Lote 3: Para a realização das determinações da glicemia foi coletado uma gota de
sangue da cauda semanalmente a partir do 60º pós-infecção até completar 180 dias. Para a
determinação da insulinemia, NO, hemoglobina glicada, concentração plasmática da vitamina
C, GSH reduzida, FRAP e GS, os animais foram eutanasiados por CO2 no 180º dias pós-
infecção. Para a dosagem de glicogênio hepático um fragmento do fígado foi imediatamente
congelado em nitrogênio líquido e, posteriormente, armazenado à -80°C.
Imediatamente após a coleta do sangue foi realizado o hemolisado para determinação
da GSH reduzida. Para tanto, foi realizada a adição de 50 µL de sangue em 500 µL de água
destilada. Deste hemolisado foram utilizados 200 µL para a determinação da concentração de
hemoglobina (Hb) pelo método do reagente da solução de Drabkin.72 Ao volume restante
foram adicionados 3,0 mL de solução precipitante (1,67 g de HPO3, 0,2 g de Na2-EDTA e 30
g NaCl em 100 mL de água deionizada), deixado em repouso no gelo por 5 minutos e, em
seguida, centrifugado à 2000 rpm por 2 minutos a 4º C. O sobrenadante foi utilizado para a
determinação da GSH. Um branco foi preparado pela adição de 2,0 mL de água em 3,0 mL de
solução precipitante e submetido ao mesmo procedimento.
33
O restante do sangue foi centrifugado a 3.000 rpm por 5 minutos a 4º C e uma porção
de 200 µL de plasma foi imediatamente acidificada com 800 µL de ácido tricloroacético 5%
para a determinação de ácido ascórbico. O volume restante do plasma foi armazenado à -80°C
para uso nas demais análises bioquímicas.
Um fragmento do fígado foi imediatamente congelado em nitrogênio líquido e,
posteriormente, armazenado à -80°C para posterior dosagem de glicogênio hepático.
3.7.2.2 Determinações Bioquímicas
3.7.2.2.1 Determinação das concentrações plasmáticas de óxido nítrico (NO) total (NO2/NO3)
O sangue foi retirado usando heparina como anticoagulante e, após centrifugação por
10 minutos, 3000 rpm e 4º C, utilizou-se o plasma obtido para o ensaio. Para determinação do
NO total (NO2/NO3)73,74 foi utilizado como meio de reação uma mistura de tampão fosfato de
sódio 20 Mm pH 7,4, cofator NADPH (concentração final 1,8 µM) e enzima Nitrato redutase
de Aspergillus (Sigma) na concentração de 0,1U/mL. Em paralelo, uma curva padrão de
nitrato de sódio (0 a 140 µM) foi submetida às mesmas condições do ensaio das amostras. As
amostras e a curva padrão foram incubadas por 2 horas em banho maria à 37ºC. Após este
período de incubação adicionou-se, à cada amostra, uma solução de Phenazina metasulfato
(80 µM) e o material foi incubado novamente no escuro por 30 minutos. Foi realizada, em
seguida, a precipitação protéica adicionando soluções de Sulfato de zinco (0,5 M em etanol
50%) e Carbonato de sódio (0,5M). O material foi centrifugado a 12000 rpm por 10 minutos à
4º C e coletou-se o sobrenadante para proceder à coloração com o Reagentes de Griess I
(sulfanilamida 1% em HCl 3N) e o Reagente de Griess II (naftiletilenodiamina 0,1% em HCl
3N). Depois de decorridos 10 minutos de reação, no escuro à temperatura ambiente, o
material foi centrifugado novamente e foi coletado o sobrenadante para leitura das amostras e
da curva padrão, em espectrofotômetro leitor de microplacas em 540nm. A concentração das
amostras foi calculada utilizando a curva padrão e expressa em µM/L.
34
3.7.2.2.2 Determinação das concentrações plasmáticas de ácido ascórbico (vitamina C)
A concentração de ácido ascórbico foi determinada no plasma de acordo com
Schaffert e Kingsley.75 Para tanto, 100 µL de solução contendo 2,4-dinitrofenilhidrazina
(2%), tiouréia (10%) e sulfato de cobre (1%) foram adicionados a 300 µL do plasma
acidificado em ácido tricloacético a 5%. Esse material foi mantido em banho-maria 37˚C por
4 horas e, posteriormente, colocado em banho de gelo. A seguir foram acrescentados 200 µL
de ácido sulfúrico (85%). A reação foi realizada por 20 minutos, em temperatura ambiente e
no escuro, e a leitura feita em espectrofotômetro a 515 nm, e as concentrações das amostras
foram obtidas comparando com uma curva padrão (0 a 4.0 mg/dL) de ácido ascórbico
submetida ao mesmo procedimento.
A contribuição relativa do ácido ascórbico (%) para a capacidade antioxidante total do
plasma (FRAP) foi determinada a partir da atividade relativa de 2,0 para a vitamina C como
determinada por Benzie e Strain.76
3.7.2.2.3 Determinação da glutationa reduzida (GSH)
A concentração de glutationa foi determinada pelo método colorimétrico desenvolvido
por Beutler77 que se baseia na redução do ácido 5,5´-dithiobis (2-acido nitrobenzoico)
(DTNB) que, na presença de glutationa, origina um composto amarelo, cuja densidade óptica
é medida em 412 nm.
Para a leitura no espectrofotômetro em 412 nm, foram colocados 800 µL de fosfato de
sódio 0,3M seguidos de 200 µL do hemolisado e foi registrada a DO-1. O mesmo
procedimento foi realizado no tubo branco. Em seguida foram adicionados 100 µL de DTNB
e a DO-2 foi registrada. A concentração de GSH foi expressa em µmol/g de Hb, considerando
o coeficiente de absorção molar para o DTNB==13,600 cm-1 M-1.78
3.7.2.2.4 Determinação da capacidade antioxidante plasmática pelo método “Ferric Reducing
Ability of Plasma” (FRAP)
O método, descrito por Benzie e Strain76, baseia-se na capacidade dos antioxidantes
plasmáticos em reduzir os íons Fe+++ em Fe++ na presença de 2,4,6 tripyridyl-s-triazine em pH
baixo com a formação de Tripyridil-s-triazine que possui coloração azul. O reagente foi
preparado pela adição de 25 ml de tampão acetato de pH 3,6 (0,3M), 2,5 ml de 2,4,6
35
tripyridyl-s-triazine 10mM em HCl 40mM e 2,5 ml de FeCl3.6H2O 20mM. Foram colocados
300µl do reagente em uma cubeta que foi submetida a banho-maria 37o C durante 5 minutos.
Foi realizada a leitura óptica (DO-1) desta solução em 593nm. Em seguida foram adicionados
10µl da amostra seguidos de 30µl de H2O. Após exatos 10 minutos em banho-maria 37oC, a
DO-2 foi lida em 593nm. A variação de DO entre leitura final e a inicial para cada amostra foi
utilizada para determinação da capacidade antioxidante do plasma por comparação da
absorbância do teste com a absorbância de soluções de Fe++ de concentrações conhecidas
(100-1000 µmol/l) que foram testadas em paralelo.
3.7.2.2.5 Grupamentos Sulfidrila totais em plasma (GS)
Foi utilizada a metodologia p roposta por Sedlak e Lindsay79 utilizando o reagente de
Ellman (ácido 5,5´-dithiobis (2-acido nitrobenzoico; DTNB). Os grupamentos tióis reagiram
com o DTNB formando um complexo, que absorve luz a 412 nm.
Uma alíquota de 50 µL do plasma foi misturada em 1 mL de tampão Tris-EDTA (1 mM),
sendo feita uma primeira leitura a 412 (A1).
Após essa leitura foi adicionado 20 µL de 5,5´- ditiobis ácido 2-nitrobenzóico (DTNB)
10 mM, diluído em metanol. Após 15 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, foi
realizado uma nova leitura (A2). O branco (B) foi composto de DTNB e tampão Tris-EDTA.
Os grupamentos sulfidrila totais foram calculados utilizando o coeficiente de absorção molar
para o DTNB=13,600 cm-1 M-1.78
3.7.2.2.6 Determinação da glicemia
Foi utilizado o monitor Advantage , com suas respectivas fitas, e a concentração de
glicose plasmática (mg. dl-1) foi determinada a partir do princípio de bioamperometria, no
qual a glicose é transformada pela glicose desidrogenase em glicolactona. A determinação da
glicose foi realizada após um jejum alimentar de cinco horas, de acordo com Ayala80
semanalmente durante a fase aguda da infecção e a cada 15 dias durante a fase crônica.
36
3.7.2.2.7 Determinação da insulinemia
Foi determinada, após jejum alimentar de cinco horas80 por meio do kit ELISA para
RAT / Mouse INSULIN da Mercodia(Sweden) aos 15º, 30º e 60º dias pós infecção na fase
aguda e ao 180º dias para a fase crônica.
3.7.2.2.8 Avaliação da Sensibilidade Insulínica periférica pelo Modelo “Quantitative Insulin
Sensitivity Check Index” (QUICKI)
Este método 81,82 baseia-se na homeostasia, considerando uma relação entre insulina e
glicemia no estado de jejum. Os valores das duas variáveis sofrem uma transformação
logarítmica para normalizar a grande variabilidade dos valores, principalmente da insulina,
permitindo a obtenção do índice com a seguinte fórmula:
QUICKI = 1 ÷ (Log insulina + Log glicemia)
3.7.2.2.9 Determinação do Glicogênio hepático
A extração do glicogênio foi realizada por meio da digestão do fígado (amostras de 50
a 100 mg) em uma solução de KOH (6N), à temperatura de 100ºC e precipitação com etanol
(95%).83 Após este processo, foi adicionado K2SO4 (10%). O material foi então centrifugado
(3000 rpm, à 4º C por 3 minutos) e, ao precipitado foi adicionado 2,5 ml de água destilada e
ressuspenso. A solução resultante foi submetida à reação de fenol-sulfúrico84 que produz uma
coloração laranja, determinada em 490 nm.
As concentrações das amostras foram obtidas por meio da comparação com um
controle padrão de glicose (0.02%) a partir do qual foram calculadas as concentrações do
glicogênio hepático (µmol de unidades glicosil-glicose.g de tecido-1).
3.7.2.2.10 Determinação da concentração de hemoglobina glicada
Foi determinada, após jejum alimentar de cinco horas80
, por meio do kit da Biosystens
(Spain) no 60º dias pós infecção na fase aguda e ao 180º dias para a fase crônica.
37
4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para avaliar os resultados do efeito de vitamina C na evolução da parasitemia, foi
realizada a Análise de Variância para Medidas Repetidas, um fator, com nível de significância
de 5% (p < 0,05). 85
Para os demais parâmetros, devido à natureza das variáveis em estudo, no resumo dos
dados utilizou-se média e desvio-padrão. A normalidade dos dados foi verificada por meio do
teste de Shapiro-Wilk (SW). Para as comparações entre três ou mais grupos utilizou-se o teste
de análise de variância paramétrica um fator (ANOVA), complementada pelo teste de Tukey
(variâncias homogêneas) ou Games-Howell (variâncias heterogêneas); quando em ao menos
um dos grupos em comparação não se verificou a normalidade dos dados, utilizou-se a análise
de variância não-paramétrica de Kruskal-Wallis(KW), com valor p calculado pelo método de
Monte Carlo, complementada pelo teste de comparações múltiplas de Dunn, ajustado para o
número de comparações (Armitage e Berry85, software SPSS 21,86). Adotou-se o nível de
significância de 5% de probabilidade para a rejeição da hipótese de nulidade em todos os
testes.
38
5 RESULTADOS
5.1. Os resultados obtidos para verificar o efeito da vitamina C na mortalidade e no processo inflamatório desencadeado pela infecção do T. cruzi estão apresentados abaixo.
5.1.1 Taxa de mortalidade
Durante a fase aguda e crônica foram observadas as seguintes taxas de mortalidade:
Tabela 3 – Taxa de mortalidade na fase aguda e crônica
Fase aguda
Grupos INFA/C INFA/A NINFA/C NINFA/A
Mortalidade 1* (8,33%)** 3* (25,0%)** 1* (8,33%)** 1* (8,33%)**
Fase crônica
Grupos INFC/C INFC/A NINFC/C NINFC/A
Mortalidade 3* (25,0%)** 6* (50,0%)** Zero Zero
*Número de animais **Porcentagem
Pode-se observar que o maior número de mortes ocorreu no grupo infectado que não
recebeu suplementação, tanto na fase aguda (INFA/A) quanto na crônica (INFC/A).
5.1.2 Determinação da parasitemia
Foram analisados ao microscópio ótico e a curva de parasitemia foi plotada para cada
grupo experimental empregando a média logarítmica da parasitemia detectadas dos animais,
que está expressa em números de tripomastigotas por 5µL de sangue. A Tabela 1 apresenta a
parasitemia média em 5µL de sangue e a média logarítmica dos grupos INFA/C e INFA/A.
39
Tabela 4 - Estudo da parasitemia durante a fase aguda apresentada pela parasitemia média e média logaritmica dos grupos infectados INFA/C e INFA/A
INFA/C* INFA/A*
Contagem Dia pós
infecção Parasitemia média em
5µL
Log da parasitemia
Parasitemia média em
5µL
Log da parasitemia
1 8 334 2,52 146 2,16
2 12 956 2,98 831 2,92
3 15 1955 3,29 4112 3,61
4 19 5244 3,72 8410 3,92
5 22 6403 3,81 4052 3,61
6 25 3499 3,54 10787 4,03
7 29 3893 3,59 9398 3,97
8 33 4975 3,70 1504 3,18
9 36 3932 3,59 2410 3,38
10 40 1772 3,25 1010 3,00
11 43 2143 3,33 740 2,87
12 47 1521 3,18 2038 3,31
13 50 2110 3,32 2481 3,39
14 54 1277 3,11 1544 3,19
15 57 1702 3,23 1413 3,15
16 61 2306 3,36 1390 3,14
*ANOVA de medidas repetidas (p > 0,05)
A Figura 4 abaixo apresenta a curva parasitêmica destes grupos no decorrer da fase aguda.
Figura 4- Curva parasitêmica pela média logarítmica do nº de tripomastigotas/5µl de sangue do grupo INFA/C e INFA/A durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi do 8º ao 61º dia
40
Os resultados obtidos no estudo da parasitemia da fase aguda não apresentaram
diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos ao longo do período analisado
(p>0,05). Entretanto, a Figura 2 demonstra que os animais do grupo INFA/C apresentaram
parasitemia inicial maior em relação ao grupo INFA/A, porém a partir do 12º dia a
multiplicação dos tripomastigotas aumentou no grupo INFA/A atingindo seu pico no 25º dia.
Até o 30º dia o grupo INFA/C apresentou uma parasitemia diminuída em relação ao INFA/A.
Porém, a partir do 47º dia não se observa diferença entre as parasitemias dos dois grupos até
60º dia ou final da fase aguda.
5.1.3 Estudo histopatológico
Os resultados da análise histopatológica na fase aguda estão expressos nas Tabelas 5 e
6 e figura 5, e para a fase crônica nas Tabelas 7 e 8 e figura 6.
41
Tabela 5 - Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas e fígado durante a fase aguda em camundongos experimentalmente infectados pelo Trypanosoma cruzi QM2 tratados com vitamina C (INFA/C) e com água (INFA/A)
INFA/C INFA/A Inflamação
% (11)* Necrose % (11)*
Amastigotas % (11)*
Inflamação % (9)*
Necrose % (9)*
Amastigotas % (9)*
Coração + 63,6% (7) --- 18,1% (2) 33,3% (3) --- 11,1% (1)
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Cólon + 81,9% (9) --- 54,5% (6) 44,4% (4) --- 22,2% (2)
++ 9,1% (1) --- 9,1% (1) 11,1% (1) --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Musc. Esquel.
+ 18,2% (2) 36,7% (4) 9,1% (1) 55,5% (5) 55,5% (5) 22,2% (2)
++ 54,5% (6) 9,1% (1) --- 44,4% (4) 33,3% (3) ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Pâncreas + 72,7% (8) --- --- 33,3% (3) --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Fígado + 90,9% (10) --- --- 44,4% (4) 11,1% (1) ---
++ 9,1% (1) --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
“%” indicam a porcentagem de camundongos com inflamação, necrose ou amastigotas em cada grupo
( )* indicam o número absoluto de animais em cada grupo.
Tabela 6 - Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas e fígado durante a fase aguda em camundongos não infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados com vitamina C (NINFA/C) e com água (NINFA/A).
“%” indicam a porcentagem de camundongos com inflamação, necrose ou amastigotas em cada grupo
( )* indicam o número absoluto de animais em cada grupo.
NINFA/C NINFA/A Inflamação
% (11)* Necrose % (11)*
Amastigotas % (11)*
Inflamação % (11)*
Necrose % (11)*
Amastigotas % (11)*
Coração + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Cólon + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Musc. Esquel.
+ --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Pâncreas + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Fígado + 18,2% (2) --- --- 9,1% (1) --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
42
Figura 5 - Fotos de cortes histológicos realizados pela técnica de Hematoxilina- Eosina em camundongos experimentalmente infectados pela cepa QM2 de T. cruzi e tratados com vitamina C durante a fase aguda da doença de Chagas
A - Corte de cólon evidenciando formas amastigotas de T. cruzi. B - Corte de cólon evidenciando formas de amastigotas de T. cruzi na camada muscular. C - Corte de coração evidenciando formas de amastigotas de T.
cruzi. D - Corte de cólon evidenciando formas de amastigotas de T. cruzi na camada muscular. E – Corte de músculo estriado evidenciando moderado processo inflamatório. F – Corte de músculo estriado evidenciando moderado processo inflamatório e necrose. G – Corte de fígado evidenciando moderado processo inflamatório. H – Corte do pâncreas evidenciando discreto processo inflamatório.
43
Nos resultados da análise histológica da fase aguda (Tabela 5 e Figura 5) foi observado
que os grupos de animais infectados INFA/C e INFA/A apresentaram inflamação em todos os
tecidos examinados. Todavia, os animais do grupo INFA/C apresentaram processo
inflamatório em maior número de animais de intensidade discreta a moderada quando
comparado com o grupo INFA/A em coração, cólon, pâncreas e fígado, entretanto em
músculo esquelético foi observado que os animais do grupo INFA/A apresentaram maior
número de animais com processo inflamatório variando de discreto a moderado. Embora não
infectados, os animais dos grupos NINFA/C e NINFA/A (Tabela 6) apresentaram inflamação
discreta em fígado.
Tabela 7 - Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas e fígado durante a fase crônica em camundongos experimentalmente infectados pelo Trypanosoma cruzi QM2 tratados com vitamina C (INFC/C) e com água (INFC/A)
“%” indicam a porcentagem de camundongos com inflamação, necrose ou amastigotas em cada grupo
( )* indicam o número absoluto de animais em cada grupo.
INFC/C INFC/A
Inflamação % (9)*
Necrose % (9)*
Amastigotas % (9)*
Inflamação % (6)*
Necrose % (6)*
Amastigotas % (6)*
Coração + 22,2% (2) --- --- 16,6% (1) --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Cólon + 55,5% (5) --- 22,2%(2) --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Musc. Esquel.
+ 44,4% (4) --- --- 16,6% (1) 16,6% (1) 16,6% (1)
++ --- --- --- 33,3% (2) --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Pâncreas + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Fígado + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
44
Tabela 8 - Análise histológica realizada no coração, cólon, músculo esquelético, pâncreas e fígado durante a fase crônica em camundongos não infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados com vitamina C (NINFC/C) e com água (NINFC/A)
NINFC/C NINFC/A
Inflamação % (12)*
Necrose % (12)*
Amastigotas % (12)*
Inflamação % (12)*
Necrose % (12)*
Amastigotas % (12)*
Coração + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Cólon + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Musc. Esquel.
+ --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Pâncreas + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
Fígado + --- --- --- --- --- ---
++ --- --- --- --- --- ---
+++ --- --- --- --- --- ---
“%” indicam a porcentagem de camundongos com inflamação, necrose ou amastigotas em cada grupo
( )* indicam o número absoluto de animais em cada grupo.
45
Figura 6 - Fotos de cortes histológicos realizados pela técnica de Hematoxilina- Eosina em camundongos experimentalmente infectados pela cepa QM2 de T. cruzi durante a fase crônica da doença de Chagas, sendo A, B e C em animais tratados com vitamina C e D, E e F tratados com água
A - Corte de cólon evidenciando formas amastigotas T. cruzi (seta). B – Corte de cólon evidenciando formas amastigotas T. cruzi (seta). C – Corte de cólon evidenciando discreto processo inflamatório (seta). D - Corte de músculo esquelético evidenciando formas amastigotas de T. cruzi (seta). E – Corte de músculo estriado evidenciando moderado processo inflamatório. F – Corte de músculo estriado evidenciando moderado processo inflamatório.
46
Na fase crônica a análise histológica (Tabelas 7 e 8 e Figura 6) apresentou uma
diminuição acentuada do processo inflamatório com relação à fase aguda. Sendo que no
coração, o grupo INFC/C apresentou processo inflamatório em um maior número de animais
do que no grupo INFC/A; no cólon só o grupo INFC/C apresentou inflamação discreta e
ninhos de amastigotas; porém no músculo esquelético o grupo INFC/A apresentou inflamação
de discreta a moderada, ninhos de amastigotas e necrose discreta, mais intensa do que em
INFC/C. O pâncreas e fígado não apresentaram acometimentos em nenhum dos grupos.
Observamos tanto na fase aguda como na fase crônica, que a intensidade de danos e
números de animais acometidos com processo inflamatório no músculo esquelético foi maior
comparado ao coração; e que no músculo esquelético os animais que receberam água
(INFA/A e INFC/A) foram mais atingidos que os animais que foram tratados com vitamina C
(INFA/C e INFC/C), uma vez que em coração, cólon, pâncreas e fígado os animais tratados
com vitamina C (INFA/C e INFC/C) foram mais acometidos que os tratados somente com
água (INFA/A e INFC/A).
5.1.4 Determinação das concentrações plasmáticas de óxido nítrico total (NO)
Os resultados das determinações do óxido nítrico nas fases aguda e crônica estão
expressos nas Tabelas 9 e 10 e Figura 7.
47
Tabela 9 - Valores médios, desvio padrão e análise estatística da concentração de NO no 15º, 30º e 60º dias pós-infecção nos grupos experimentais da fase aguda
* número de animais analisados em cada grupo e dia de estudo 1 Teste de Kruskal-Wallis ; 2 ANOVA um fator
Tabela 10 - Valores médios, desvio padrão e análise estatística da concentração de NO no 180º dias pós-infecção nos grupos experimentais da fase crônica
Dias pós-infecção
NO (µM/L) Análise estatística
INFC/C(9)* INFC/A(6)* NINFC/C(11)* NINFC/A(12)*
180º 30.38 (11.26)
30.66 (14.8)
15.50 (14.84)
7.96 (7.22)
p < 0.051
INFC/C X INFC/A X NINFC/C (p > 0.05); NINF/C X NINFC/A (p > 0.05); INFC/C X NINFC/A (p <0.05); INFC/A X NINFC/A (p < 0.05)
* número de animais analisados em cada grupo 1 ANOVA um fator
Dias pós-infecção
NO (µM/L) Análise estatística
INFA/C(4)* INFA/A(4)* NINFA/C(4)* NINFA/A(4)*
15º
180.4 (212.6)
225.7 (184.3)
55.14 (62.2)
11.3 (6.3)
p < 0.051
INFA/C X INFA/A X NINFA/C (p > 0,05); INFA/C X NINFA/C X NINFA/A (p > 0,05); INFA/A X NINFA/A (p < 0,05)
30º
84.21 (32.8)
26.1 (24.0)
2.41 (2.2)
4.43 (4.1)
p < 0.052
INFA/C X INFA/A (p > 0,05); INFA/A X NINFA/C X NINFA/A (p > 0,05); INFA/C X NINFA/C (p < 0,05); INFA/C X NINFA/A (p < 0,05)
60º
41.09 (38.8)
14.5 (8.9)
30.62 (32.2)
4.68 (4.1)
p < 0.052
INFA/C X INFA/A X NINFA/C (p > 0.05); INFA/A X NINFA/C (p > 0.05); INFA/C X NINFA/A (p < 0.05)
48
Figura 7 - Evolução da produção de óxido nítrico (NO) na fase aguda (15, 30 e 60 dias) e na fase crônica (180 dias)
Os resultados apresentados na Tabela 9 e Figura 7 indicam que no 15º dia após infecção
o valor de NO do grupo INFA/A foi maior seguido dos grupos INFA/C e NINFA/C, porém os
resultados não foram estatisticamente significativos (p>0,05). Houve significância estatística
entre os grupos INFA/A e NINFA/A (p<0,05).
No 30º dia, o valor de NO no grupo INFA/A diminuiu em relação ao grupo INFA/C,
embora sem diferenças estastísticas. Entre o grupo INFA/C e os grupos NINFA/C e NINFA/A
foi observado diferença estatisticamente significativa.
No final da fase aguda (60º dia) houve diferença estatisticamente significativa entre o
grupo INFA/C e o NINFA/A.
Para o final da fase crônica (Tabela 10 e Figura 7), foram encontradas diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos INFC/C e INFC/A em relação ao NINFC/A.
5.2 Determinação da dinâmica da defesa antioxidante do sangue em função da
suplementação com vitamina C na infecção pelo T. cruzi
5.2.1 Os resultados das análises bioquímicas obtidos para as fases aguda e crônica estão
apresentados nas Tabela 11 e 12 e Figuras de 8 a 17 respectivamente.
49
Tabela 11 - Valores médios, desvio padrão e análise estatística, mostrando as comparações significantes dos parâmetros bioquímicos determinados na fase aguda nos diferentes grupos experimentais infectados pela cepa QM2 do Trypanosoma cruzi
Parâmetro
INFA/C
INFA/A
NINFA/C
NINFA/A
Análise estatística
Vitamina C (µM/L)
75.23 (23.29)
35.57 (3.64)
58.17 (19.53)
42.40 (7.23)
p < 0.051
INFA/A X NINFA/A (p>0,05); NINFA/A X NINFA/C X INFA/C (p>0,05); INFA/C X INFA/A (p<0.05); INFA/A X NINFA/C (p<0.05); INFA/C X NINFA/A (p < 0,05)
GSH (µM/g Hb)
6.93 (1.78)
7.71 (1.53)
5.35 (1.50)
5.85 (1.89)
p < 0.051
NINFA/C X NINFA/A (p > 0,05); NINFA/A X INFA/C X INFA/A (p>0,05); NINFA/C X INFA/C (p < 0,05); NINFA/C X INFA/A (p < 0,05);
FRAP (µM/L)
1625.0 (372.6)
1331.0 (459.2)
1657.0 (448.7)
1485.0 (643.5)
p > 0.051
Contribuição da vitamina C ao FRAP
(%)
10.74 (7.98)
6.0 (2.36)
8.27 (6.13)
6.8 (3.54)
p > 0.051
GS
(µM/L)
144.59 (29.03)
92.73
(41.23)
121.10 (31.41)
50.31
(30.44)
p < 0.052
INFA/C X NINFA/C (p > 0,05); INFA/A X NINFA/C (p > 0,05); INFA/C X INFA/A ( p < 0,05); INFA/C X NINFA/A (p < 0,05); NINFA/C X NINFA/A (p < 0,05);
INFA/A X NINFA/A (p < 0,05) 1 Teste de Kruskal-Wallis; 2 ANOVA um fator
50
Tabela 12 - Valores médios, desvio padrão e análise estatística, mostrando as comparações significantes dos parâmetros bioquímicos determinados na fase crônica nos diferentes grupos experimentais infectados pela cepa QM2 do Trypanosoma cruzi.
1 Teste de Kruskal-Wallis
Parâmetro
INFC/C
INFC/A
NINFC/C
NINFC/A
Análise estatística
Vitamina C
(µM/L)
62.01
(13.78)
92.13
(38.54)
121.4
(29.20)
52.25
(14.01)
p < 0.051
INFC/C X INFC/A X NINFC/A (p > 0,05); INFC/A X NINFC/C ( p > 0,05);
INFC/C x NINFC/C (p<0.05); NINFC/C x NINFC/A (p<0.05)
GSH
(µM/g Hb)
5.61
(2.09)
4.75
(1.29)
5.14
(1.75)
6.73
(1.48)
p > 0.051
FRAP
(µM/L)
502 (42.17)
530.6 (70.47)
842.6 (273.4)
1459.0 (299.2)
p < 0.051
INF/C X INFC/A (p > 0,05);
INFC/C x NINFC/C (p<0.05); INFC/C x NINFC/A (p<0.05); INFC/A x NINFC/C (p<0.05);
INFC/A x NINFC/A (p<0.05); NINFC/C x NINFC/A (p<0.05);
Contribuição
da vitamina C
ao FRAP (%)
25.89
(8.93)
34.0
(10.94)
33.35
(19.07)
7.63
(2.37)
p < 0.051
INFC/C x INFC/A x NINFC/C (p > 0,05);
INFC/C x NINFC/A (p<0.05); INFC/A x NINFC/A (p<0.05); NINFC/C x NINFC/A (p<0.05)
GS
(µM/L)
205.0
(48.92)
211.5
(86.10)
260.0
(62.18)
48.80
(14.41)
p < 0.051
INFC/C x INFC/A x NINFC/C (p > 0,05); INFC/C x NINFC/A (p<0.05); INFC/A x NINFC/A (p<0.05); NINFC/C x NINFC/A (p<0.05)
51
Figura 8 - Valores médios e desvio padrão para as determinações das concentrações de vitamina C no plasma entre os grupos experimentais da fase aguda
INFA/C
INFA/A
NINFA/C
NINFA/A
0
50
100
150
micromo/L
A Figura 8 mostra que a forma de suplementação fornecida ao grupo INFA/C induziu
um aumento da concentração plasmática de vitamina C, estatisticamente significante
(p<0,05), em relação aos grupos INFA/A e NINFA/A. Também podemos observar diferença
estatisticamente significativa entre o grupo INFA/A e o NINFA/C.
Figura 9 - Valores médios e desvio padrão para as determinações das concentrações plasmáticas de vitamina C entre os grupos experimentais na fase crônica
INFC/C
INFC/A
NINFC/C
NINFC/A
micromol/L
Na Figura 9 podemos observar que o grupo NINFC/C exibiu maior valor de
concentração plasmática da vitamina C, diferindo de forma estatisticamente significativa
(p<0.05) do grupo INFC/C, bem como do grupo NINFC/A. No entanto, entre os infectados
(INFC/C e INFC/A), a suplementação não alterou a concentração de vitamina C no plasma
(p>0.05), bem como estes não diferiram do grupo NINFC/A.
52
Figura 10 - Valores médios e desvio padrão para as determinações de Glutationa reduzida (GSH) entre os grupos experimentais da fase aguda
INFA/C
INFA/A
NINFA/C
NINFA/A
0
2
4
6
8
10
Pode-se observar na Figura 10 relativa à Glutationa reduzida, que houve um aumento
significativo (p<0,05) nos grupos INFA/A e INFA/C em relação ao NINFA/C evidenciando
que a resposta da glutationa está relacionada à infecção na fase aguda e que a suplementação
com vitamina C não induziu alterações na concentração de GSH.
Figura 11 - Valores médios e desvio padrão para as determinações de Glutationa reduzida (GSH) entre os grupos experimentais na fase crônica
INFC/C
INFC/A
NINFC/C
NINFC/A
Observa-se que na Figura 11 relativa à Glutationa reduzida (GSH) que o grupo
NINFC/A apresentou os maiores valores, podendo-se inferir que a Glutationa não teve valores
aumentados na infecção em fase crônica seja em resposta à infecção, seja pela suplementação.
As diferenças observadas não foram estatisticamente significativas (p> 0.05).
53
Figura 12 - Valores médios e desvio padrão para as determinações da Capacidade antioxidante do plasma (FRAP) entre os grupos experimentais da fase aguda
Com relação ao FRAP (Figura 12), foi observado um aumento da capacidade
antioxidante nos grupos suplementados com vitamina C, apesar do mesmo não ser
estatisticamente significativo em relação aos grupos não suplementados, sugerindo que a
forma de suplementação foi eficiente em cooperar com a defesa antioxidante.
Figura 13 - Valores médios e desvio padrão para as determinações do FRAP entre os grupos experimentais na fase crônica
Com relação à capacidade antioxidante do plasma (FRAP) na Figura 13, pode-se
observar que os grupos INFC/C e INFC/A apresentaram valores semelhantes (p>0.05) e
inferiores (p<0.05) ao NINFC/C e NINFC/A. Quanto ao grupo NINFC/A as concentrações
foram semelhantes nas fases aguda e crônica, com valores maiores (p< 0.05) que os demais
54
grupos da fase crônica. Porém os grupos INFC/C, INFC/A e NINFC/C mostraram
concentrações menores na fase crônica comparadas com a fase aguda percebendo-se uma
diminuição da capacidade antioxidante do plasma.
Figura 14 - Valores médios e desvio padrão para as determinações da Contribuição da vitamina C à Capacidade antioxidante do plasma (FRAP) entre os grupos experimentais da fase aguda
Embora a contribuição da vitamina C ao FRAP não tenha sido estatisticamente
significativa (p>0,05) entre os grupos estudados, as diferenças observadas (Figura 14)
sugerem uma maior contribuição da vitamina C à capacidade antioxidante do plasma nos
grupos suplementados, constatando os resultados observados pelas Figuras 8 e 12.
Figura 15 - Valores médios e desvio padrão para as determinações da Contribuição da vitamina C à Capacidade antioxidante do plasma (FRAP) entre os grupos experimentais na fase crônica
INFC/C
INFC/A
NINFC/C
NINFC/A
55
Podemos observar na Figura 15 que a contribuição da vitamina C em relação à
capacidade antioxidante do plasma foi menor no grupo NINFC/A e esta diferença foi
estatisticamente significativa em relação a todos os demais grupos (p< 0.05). Os demais
grupos (INFC/C, INFC/A e NINFC/C) não diferiram entre si de forma estatisticamente
significativa (p> 0.05) quanto à contribuição da vitamina C.
Figura 16 - Valores médios e desvio padrão para as determinações dos grupamentos sulfidrilas do plasma (GS) entre os grupos experimentais da fase aguda
INFA/C
INFA/A
NINFA/C
NINFA/A
0
50
100
150
200
micromo/L
A resposta antioxidante relativa à concentração dos grupamentos sulfidrilas do plasma
(GS) (Figura 16) evidenciou que a suplementação com a vitamina C amplificou esta resposta,
uma vez que há diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre o grupo INFA/C em
relação ao INFA/A. O mesmo foi observado entre o NINFA/C e o NINFA/A, com p<0,05.
Figura 17 - Valores médios e desvio padrão para as determinações dos grupamentos sulfidrilas totais (GS) entre os grupos experimentais na fase crônica
INFC/C
INFC/A
NINFC/C
NINFC/A
0
100
200
300
400
micromo/L
56
Pela Figura 17 foi observado que a resposta antioxidante relativa à concentração de
grupamentos sulfidrilas do plasma evidencia que a infecção continua mobilizando este nível
de defesa, assim como a suplementação com vitamina C amplifica a resposta, uma vez que
houve diferença significativa (p<0.05) entre estes grupos e o grupo NINFC/A. Os demais
grupos não diferiram entre si de forma estatisticamente significativa (p> 0.05).
5.3. Determinação da influencia da vitamina C no controle glicêmico e sua possível ação
na multiplicação do T.cruzi
5.3.1 Determinação da glicemia, insulina, hemoglobina glicada e glicogênio hepático
As Tabelas 13 e 14 apresentam os resultados das determinações de glicemia,
insulinemia, hemoglobina glicada e glicogênio durante a fase aguda e crônica da infecção
chagásica.
57
Tabela 13 - Valores médios de glicemia, insulina, QUICKI, glicogênio hepático e hemoglobina glicada no 15º, 30º e 60º dias
INFA/C INFA/A NINFA/C NINFA/A Análise estatística
15 dias Glicemia (mg/dL)
(71,00) (23,85)
64,75 (17,58)
99,75 (8,18)
98,50 (9,88)
p < 0,051
INFA/C X INFA/A X NINFA/A (p > 0,05); INFA/C X NINFA/C X NINFA/A (p > 0,05); INFA/A X NINFA/C (p < 0,05)
Insulina (pmol/L)
62.86 (38.32)
85.76 (27.3)
110.11 (48.17)
150.31 (7.45)
p < 0,051
INFA/C X INFA/A X NINFA/C (p > 0,05); INFA/A X NINFA/C X NINFA/A (p > 0,05); INFA/C X NINFA/A (p < 0,05)
QUICKI 0,29
(0,26) 0,35
(0,03) 0,31
(0,03) 0,30 (0,0)
p > 0,051
30 dias Glicemia (mg/dL)
86,00 18,67
106,75 16,28
107,00 19,41
110,00 21,56
p > 0,051
Insulina (pmol/L)
104.68 (16,78)
87.76 (49.28)
76.13 (34,99)
112.01 (52.07)
p > 0,051
QUICKI 0,32 (0,01)
0,53 (0,27)
0,33 (0,03)
0,32 (,02)
p > 0,051
60 dias Glicemia (mg/dL)
114.5 (11.56)
115.50 (4.12)
105.5 (7.14)
121.75 (8.77)
p > 0,051
Insulina (pmol/L)
180.9 (80.88)
155.58 (10.23)
126.75 (92.95)
230,38 (221.03)
p > 0,051
QUICKI 0,29 (0,02)
0,29 (0,01)
0,32 (0,03)
0,29 (0,03)
p > 0,051
Glicogênio (g/100mg de fígado)
0.29 (0.08)
0.34 (0.13)
0.23 (0.08)
0.27 (0.06)
p > 0,051
Hb glicada (%)
6.29 (0.69)
6.00 (1.01)
7.10 (0.83)
5.31 (0.64)
p < 0.051
INFA/C X INFA/A X NINFA/C (p > 0,05); INFA/C X INFA/A X NINFA/A (p > 0,05); NINFA/C x NINFA/A (p< 0.05)
1 ANOVA um fator
58
Tabela 14 - Valores médios de glicemia, insulina, QUICKI, glicogênio hepático e hemoglobina glicada no 180º dias
INFC/C INFC/A NINFC/C NINFC/A Análise estatística
180 dias Glicemia (mg/dL)
98.56 (16.91)
81.83 (20.36)
99.36 (16.18)
125.4 (14.74)
p < 0.051
INFC/C X INFC/A X NINFC/C (p > 0.05); NINFC/C X NINFC/A (p > 0.05);
INFC/C X NINFC/A (p < 0.05); INFC/A x NINFC/A (p< 0.05)
Insulina (pmol/L)
573.2 (427.9)
200.2 (118.2)
125.0 (62.2)
187.3 (140.1)
p < 0.051
INFC/A X NINFC/C X NINFC/A (p > 0.05); INFC/C X INFC/A X NINFC/A (p>0.05); INFC/C x NINFC/C (p < 0.05);
QUICKI 0,27
(0,05) 0,30
(0,02) 0,32
(0,03) 0,31
(0,05)
p < 0,051
INFC/C X INFC/A X NINFC/A (p > 0.05); INFC/C X NINFC/C X NINFC/A (p>0.05); INFC/C X NINFC/C (p < 0.05)
Glicogênio (g/100mg de fígado)
0.68 (0.25)
0.58 (0.10)
0.25 (0.08)
0.43 (0.27)
p < 0,051
INFC/C X INFC/A X NINFC/A (p > 0 .05); INFC/A X NINFC/A (p > 0.05);
INFC/C X NINFC/C (p < 0.05); INFC/A X NINFC/C (p < 0.05)
Hb glicada (%)
4.77 (1.2)
9.59 (1.37)
4.16 (0.85)
4.12 (0.82)
p < 0,052
INFC/C X NINFC/C X NINFC/A (p > 0,05) INFC/A x NINFC/A (p< 0.05); INFC/A x INFC/C (p< 0.05); INFC/A x NINFC/C (p< 0.05)
1 Teste de Kruskal-Wallis; 2 ANOVA um fator
As Figuras 18, 19 e 20 apresentam a evolução da glicemia, da insulinemia e do índice
de sensibilidade à insulina (QUICKI) ao longo da fase aguda e crônica. As figuras 21 e 22
apresentam os valores para o glicogênio hepático e as Figuras 23 e 24 representam a
Hemoglobina glicada para os grupos experimentais na fase aguda e crônica, respectivamente.
59
Figura 18 - Determinações da glicemia na evolução da fase aguda (15, 30 e 60 dias) e na fase crônica (180 dias)
15 30 60 180
mg/dL
Figura 19 - Determinações das concentrações de insulina na evolução da fase aguda (15, 30 e 60 dias) e na fase crônica (180 dias)
60
Na Tabela 13 e Figura 18 pode-se observar que aos 15 dias, início da fase aguda os
menores valores da glicemia ocorreram nos animais do grupo INFA/A, seguido do INFA/C,
porém estas diferenças não foram estatisticamente significativas. Neste dia resultados
estatisticamente significativos foram observados entre INFA/A com NINFA/C.
No 30º dia, foi observado que o menor valor ocorreu no INFA/C seguido de INFA/A,
embora sem resultados estatisticamente significativos entre todos os grupos estudados. No 60º
dia também não houve diferença estatística entre os grupos.
Nos primeiros 15 dias a insulinemia (Figura 19) foi menor no grupo INFA/C seguido
de INFA/A e no 30º dia, o menor valor foi encontrado em NINFA/C seguido de INFA/A e ao
final da fase aguda nos grupos nos NINFA/C seguido de INFA/A.
Para a fase crônica, Tabela 14 e Figura 18, os maiores valores de glicemia foram
observados no grupo NINFC/A, sendo estes valores estatisticamente significativos (p< 0.05)
dos encontrados nos grupos INFC/C e INFC/A.
Com relação à insulinemia Tabela 13 e Figura 19 observaram-se resultados
estatisticamente significativos (p<0.05) entre os grupos INFA/C e NINFA/A nos primeiros 15
dias pos infecção. Na fase crônica (Tabela 14 e Figura 19) uma diferença estatisticamente
significativa (p<0.05) foi observada entre os grupos INFC/C e NINFC/C.
61
Figura 20 - Determinações do índice de sensibilidade à insulina (QUICKI) na evolução da fase aguda (15, 30 e 60 dias) e na fase crônica (180 dias)
15 30 60180
Na evolução da fase aguda, aos 15 dias pós infecção, o grupo INFA/A apresentou a
maior sensibilidade e o INFA/C a menor, porém estas diferenças não foram estatisticamente
significativas. Aos 30 dias, o INFA/A continuou apresentando maior índice de sensibilidade,
porém novamente, sem significância estatística em relação aos demais. No final da fase
aguda, o grupo NINFA/C apresentou a maior sensibilidade, porém as diferenças em relação
aos demais grupos não foram estatisticamente significativas. Na fase crônica, o índice de
sensibilidade à insulina, mostrou diferenças estatisticamente significativas (p< 0.05) entre os
grupos INFC/C e NINFC/C. Uma vez que este índice é inversamente proporcional à
concentração de insulina, o grupo INFC/C parece exibir uma sensibilidade menor, sugerindo
um efeito negativo decorrente da infecção associada à suplementação.
62
Figura 21 - Valores médios e desvio padrão das concentrações de Glicogênio hepático entre os grupos experimentais da fase aguda
Figura 22 - Valores médios e desvio padrão das determinações de Glicogênio hepático entre os grupos experimentais na fase crônica
INFC/C
INFC/A
NINFC/C
NINFC/A
A análise da Tabela 13 e Figura 21 demonstra que na fase aguda não houve resultados
estatisticamente significativos do glicogênio hepático entre os grupos estudados.
Para a fase crônica (Tabela 14 e Figura 22) observa-se menor valor no grupo NINFC/C
que apresentou diferenças estatisticamente significativas (p< 0.05) com os grupos INFC/C e
INFC/A.
63
Figura 23 - Valores médios e desvio padrão das determinações de Hemoglobina glicada para os grupos experimentais na fase aguda
INFA/C
INFA/A
NINFA/C
NINFA/A
% Hb glicada
Figura 24 - Valores médios e desvio padrão das determinações de Hemoglobina glicada para os grupos experimentais na fase crônica
INFC/C
INFC/A
NINFC/C
NINFC/A
Em relação à hemoglobina glicada, foram observadas diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos INFA/C e NINFA/C, assim como entre INFA/A e INFA/C e
entre NINFA/A e NINFA/C (p<0.05). Na fase crônica (Figura 24), o maior valor foi
constatado no grupo INFC/A, o qual diferiu de maneira estatisticamente significativa (p<0.05)
dos demais grupos.
64
6 DISCUSSÃO
6.1 Efeitos da suplementação com vitamina C no processo inflamatório desencadeado
pelo T. cruzi
A infecção pelo T. cruzi se inicia quando há a penetração de formas tripomastigotas no
hospedeiro, podendo ser pela via vetorial, oral, transfusão sanguínea, congênita e acidentes de
laboratório. Assim, após a inoculação destas formas é desencadeada a fase aguda da infecção
com intensa multiplicação dos parasitas e invasão de células, onde o T. cruzi pode ser
encontrado nas formas tripomastigotas no sangue e formas amastigotas nos tecidos de órgãos
acometidos.5,8,9 O T. cruzi é capaz de parasitar diferentes tipos celulares, incluindo
macrófagos, células musculares lisas e estriadas, inclusive fibroblastos.10
Nesta pesquisa foi observado intensa parasitemia com multiplicação dos
tripomastigotas até o 25º dia pós infecção nos grupos INFA/C e INFA/A; porém o grupo
INFA/C apresentou menor parasitemia nesse período em relação ao grupo INFA/A, embora
não significativa estatisticamente. Este resultado sugere que a suplementação com a vitamina
C no grupo INFA/C contribuiu com o sistema imunitário e controlou a multiplicação dos
parasitas, reduzindo o número dos tripomastigotas sanguíneos nesta fase.
A partir do 47º dia não se observou diferença entre as parasitemias dos dois grupos
infectados, mas ocorreu uma menor intensidade da mesma nos dois grupos até o final da fase
aguda, 60º dia. Provavelmente como conseqüência da maior parasitemia encontrada na fase
inicial da infecção, os grupos infectados e tratados com água apresentaram maior mortalidade
dos animais tanto na fase aguda como na crônica, sendo 25% no grupo INFA/A e 50% no
grupo INFC/A.
De acordo com Guarner,87 a fase aguda da infecção pelo T. cruzi se apresenta
generalizada, no interior de várias células, em quase todos os órgãos e suas formas
amastigotas podem ser encontradas em secções histológicas normalmente acompanhadas de
infiltração inflamatória mononuclear. O que concorda com Andrade10 que observou que nos
órgãos atingidos a presença dos parasitas e a ruptura dos ninhos de amastigotas promoveram
um quadro inflamatório com predomínio de células mononucleares próximas das células
parasitárias comprometidas.
Para Francisco,26 a infecção pelo T. cruzi é complexa, pois envolve o parasita, sua
multiplicação intracelular e a interação com os mecanismos da resposta imune, processo que
65
levam às lesões difusas, que pode ser constatado na análise histológica dos tecidos
acometidos.
Corroborando os estudos acima citados foi observado na análise histológica pela
técnica de hematoxilina eosina que na fase aguda todos os órgãos analisados como coração,
cólon, músculo esquelético, pâncreas e fígado apresentaram processo inflamatório de discreto
a moderado, alguns com necrose e ninhos de amastigotas. O grupo INFA/C, apresentou
processo inflamatório em maior número de animais de intensidade discreta a moderada
quando comparado ao grupo INFA/A, no coração, cólon, pâncreas e fígado, o mesmo não
correu com o músculo esquelético quando o grupo INFA/A apresentou maior número de
animais com processo inflamatório de discreta a moderado; necrose e ninhos de amastigotas.
A presença de maior processo inflamatório no músculo esquelético dos animais do grupo
INFA/A pode ser devido à maior sensibilidade deste tecido a ação de ROS e RNS, conforme
relatado por Wen et al.88
Para Junqueira,89 na fase aguda da doença de Chagas há uma resposta imune intensa
para controlar a replicação do parasita e conter a infecção para os tecidos, na tentativa de
atenuar o processo inflamatório nos locais da infecção o qual é a principal causa de danos nos
tecidos e perda funcional dos órgãos. De acordo com Ferreira60 a atividade inflamatória
desempenha um papel fundamental, sendo considerado o principal mecanismo de agressão do
miocárdio.
Entretanto, na fase crônica a análise histológica apresentou uma diminuição acentuada
do processo inflamatório com relação à fase aguda.
Os animais do grupo INFA/C apresentaram processo inflamatório em maior número de
animais e de maior intensidade, embora, tenham apresentado uma parasitemia menor até o 30º
dia da infecção, mostrando que a administração da vitamina C por si só não foi capaz de
proteger e conter a inflamação nos órgãos como coração, cólon, pâncreas e fígado. Uma
possível explicação para esta observação pode ser a de que, de acordo com Nightingale et al.45
a terapia oral com ácido ascórbico induz o aumento da biodisponibilidade de NO.
Neste contexto, pesquisas de Jackson et al.46 relataram que o NO está sujeito à rápida
inativação pelo ânion superóxido, um produto do metabolismo oxidativo normal e que
antioxidantes tais como o α tocoferol, glutationa e ácido ascórbico são conhecidos por reagir
com superóxidos. Assim, o ácido ascórbico evitaria a interação do NO com superóxido
controlando sua biodisponibilidade, porém, esse fato tem sido evidenciado fisiologicamente
apenas em altas concentrações de ácido ascórbico, validando deste modo os resultados
encontrados no grupo NINFA/C, que apresentaram valores de NO mais alto que o grupo
66
NINFA/A aos 15 e 60 dias de tratamento. Entretanto, Fisher e Naughton44 declararam que a
elevada administração de ácido ascórbico pode ser prejudicial em pacientes que sofrem
condições inflamatórias crônicas.
Embora estudos de Saeftel et al.90 mostrarem que o NO é essencial para o controle da
parasitemia durante as primeiras semanas de infecção, quando as células NK, por sua
produção de IFN-δ, ativam as células efetoras, os macrófagos, para induzir iNOs para agir no
controle precoce da replicação dos parasitas, o NO pode ter um efeito deletério durante a
patogênese da doença de Chagas.
Neste estudo foi observado que nos primeiros 15 dias, o grupo INFA/A apresentou
parasitemia mais baixa que INFA/C, mas maior concentração de NO. Porém, no 30º dia o
grupo INFA/A apresentou concentração de NO mais baixa que INFA/C e maior parasitemia,
embora estas diferenças observadas não tenham atingido significância estatística. Desta
forma, foi observado que os animais do grupo INFA/C apresentaram concentração de NO
mais alta por um período maior de tempo, o qual tem efeito lesivo nas membranas das células
conforme pesquisas de Ribeiro et al.47 e Arantes et al.48 que relataram que altas concentrações
de NO provocaram maior dano ao DNA das células cardíacas e esplênicas e que quantidades
excessivas de NO tem efeito pró-inflamatório, o que causa danos aos neurônios durante a fase
aguda e pode favorecer o desenvolvimento de megaesôfago na fase crônica.
Os resultados de NO demonstrados no grupo INFA/A evidenciaram a dinâmica da
imunidade inata desencadeada pelo T. cruzi no início da fase aguda quando ocorre a ativação
sistêmica de citocinas pró-inflamatórias como células Natural Killer (NK) e macrófagos, que
irão produzir IL-12 responsável pela síntese inicial da IFN-δ pelas células NK. O IFN-δ tem
um papel importante na ativação de macrófagos, que expressam iNOs e produzem altas
quantidade de NO que controlarão a replicação do parasita.15,91
Todavia, por volta de duas semanas, a imunidade inata vai sendo substituída pela ação
do sistema imune adaptativo em células TCD8+ e CD4+ e células B produzindo anticorpos
que irão limitar a replicação do parasita de forma independente de NO, com isso sugerindo
que o NO é indispensável durante o início da infecção pelo T. cruzi (os primeiros 20 dias),
quando o sistema imune adaptativo ainda não é eficaz, mas que posteriormente pode se tornar
dispensável,90 o que corrobora os resultados encontrados no final da fase aguda e crônica
quando foi observada diminuição na concentração do NO.
A diminuição da concentração de NO pode ser explicada por pesquisas de Stempin et
al.92 quando demonstraram que a cruzipaina, uma glicoproteína encontrada na membrana das
formas amastigotas e tripomastigotas seria a responsável por estimular a resposta Th2. De
67
acordo com esses autores, a cruzipaina estimula macrófagos a aumentarem a atividade da
arginase 1, que resulta na secreção de IL-4, IL-10 e TGF-β, citocinas desencadeadoras da
resposta imune supressora Th2.
Desta forma, a cruzipaina altera o metabolismo da arginina, ao induzir a síntese de
arginase 1, a qual irá competir com a iNOS, levando a formação de L-ornitina, que por sua
vez é induzida pelo TGF-β, favorecendo a síntese de poliaminas, substancia essencial para a
replicação intracelular do T. cruzi.92,93 Assim, a diminuição na concentração de NO é
favorável à sobrevivência intracelular do T. cruzi, levando o hospedeiro a iniciar a fase
crônica da doença de Chagas.
Assim, devido à ação da resposta imune, na fase crônica a análise histológica
apresentou uma diminuição acentuada dos ninhos de amastigotas e processo inflamatório em
relação à fase aguda. Veloso94 também encontrou diminuição dos ninhos de amastigotas
quando estudou camundongos infectados pelo T. cruzi na fase crônica.
Em relação ao processo inflamatório, embora os animais que foram suplementados
com a vitamina C apresentassem maior dano tecidual em maior número de animais que os
suplementados com água, a concentração de NO aos 180 dias pós infecção, se apresentou em
níveis semelhantes nestes dois grupos. Provavelmente, a manutenção da maior concentração
de NO durante a fase aguda, como citado anteriormente, influenciou neste resultado. De
acordo com Pissetti et al.,95 pacientes na fase indeterminada da doença exibem concentrações
de NO mais baixa quando comparado com pacientes que apresentavam alterações cardíacas e
digestivas.
6.2 Avaliação da dinâmica da defesa antioxidante do sangue em função da suplementação com vitamina C na infecção pelo T. cruzi.
O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre uma geração excessiva de
compostos oxidantes frente à produção insuficiente de mecanismos antioxidantes de defesa.21
Assim, na infecção pelo T. cruzi é observado que os danos encontrados nos hospedeiros são
causados pelo excesso de radicais livres, especialmente pelo metabolismo de espécies reativas
de oxigênio e nitrogênio.30
A formação de radicais livres é resultado do metabolismo de oxigênio, sendo a
mitocôndria a principal fonte geradora por meio do transporte de elétrons,30 sendo produzidos
naturalmente ou por alguma disfunção biológica 22 como processos inflamatórios, no caso, a
68
doença de Chagas. Assim, alguns estudos têm demonstrado a relação entre estresse oxidativo
e as defesas antioxidantes durante o curso da infecção e progressão da doença de Chagas em
modelos experimentais e em humanos.26
Para combater a formação dos radicais livres e neutralizá-los antes de causar danos ou
amenizar os mesmos, os sistemas biológicos utilizam moléculas e enzimas como
antioxidantes. Como exemplo de antioxidantes endógenos enzimáticos temos a glutationa
peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) e não enzimáticos a
glutationa (GSH). Além desses, o organismo utiliza aqueles provenientes da dieta como: - α-
tocoferol (vitamina E), β caroteno (pró-vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C) e
compostos fenólicos.26
Assim, alguns estudos têm descrito os possíveis efeitos da suplementação com
antioxidantes exógenos, como vitamina C, vitamina E, carotenóides em indivíduos expostos
a situações de estresse oxidativo.96
Neste contexto, pesquisas de Boni et al.97 relataram que a vitamina C é considerada
como o mais importante antioxidante do fluido extracelular, uma vez que é transportada no
plasma na forma de ácido ascórbico, sendo capturada pelas células do sistema transportador
de glicose e pelo sistema de transporte ativo especifico. No plasma, a vitamina C atua como
agente redutor, doando elétrons para várias espécies reativas, principalmente o peróxido,
eliminando-as antes que reajam com as membranas e as lipoproteínas.
Ainda de acordo com Boni et al.,97 o ácido ascórbico protege contra a peroxidação
lipídica de duas maneiras, uma direta quando elimina os radicais peróxidos antes que eles
iniciem a peroxidação lipídica e outra indireta regenerando a forma ativa da vitamina E e
outros antioxidantes como o β-caroteno, flavonóides e glutationa para que exerçam seu papel
antioxidante.
A forma de suplementação adotada neste estudo mostrou-se eficaz, uma vez que nos
tratamentos observaram-se concentrações plasmáticas de vitamina C diferenciadas entre os
grupos experimentais, as quais se traduziram em efeitos biológicos distintos, que atuaram
sobre o arsenal da defesa antioxidante. A diluição da vitamina C na água a ser administrada
aos animais garantiu a manutenção do nível da mesma, conforme pode ser observado na
Figura 3, corroborando pesquisas de Benke98, que referiram que a preservação dos níveis de
ácido ascórbico no organismo estava relacionada à dose e modo de administração.
Com relaçãos a GSH os resultados evidenciaram que na fase aguda, embora os níveis
de GSH tenham sido maiores nos grupos infectados, a suplementação com vitamina C
69
diminuiu os níveis deste antioxidante na condição de infecção (INFA/C), bem como na sua
ausência (NINFA/C).
A glutationa (GSH), um tripeptídeo, é a principal linha de defesa presente na maioria
das células, sendo o tiol (-SH) mais abundante no meio intracelular.21 É encontrada na forma
reduzida (GSH) como na forma oxidada (GSSH). Portanto o excesso de GSSH é resultante
de um ambiente mais oxidante, o que favorece a formação de dissulfeto (-SS-) nas proteínas
portadoras de grupamentos –SH. Desta forma, o estresse oxidativo ocorre quando há o
descontrole entre o consumo de GSH e a produção de GSSH em um meio mais oxidante ou
com deficiência do sistema protetor. Entretanto, quando existe o equilíbrio entre o sistema de
óxido-redução, a GSH é regenerada.21,99
Esta linha de defesa é uma resposta importante para o hospedeiro, uma vez que estudos
experimentais têm demonstrado que esta resposta ao T.cruzi envolve a regulação positiva do
sistema de defesa antioxidante através das enzimas GPx, GSH e GSSH.28 Estes resultados
também são corroborados por Wen e Garg100 que demonstraram que o hospedeiro responde à
fase aguda da infecção por mecanismos de “up regulation” do sistema de defesa antioxidante
envolvendo a glutationa. As funções da GSH incluem a manutenção de grupamentos
sulfidrila de proteinas, eliminação de peróxidos e regeneração de vitaminas antioxidantes
como a vitamina C e a vitamina E.101 Há uma constante de reserva da GSH reduzida
especialmente nos eritrócitos, (99,5%) daí a utilização do mesmo para sua análise, sendo
responsável pela homeostase contra o dano oxidativo celular, cujas alterações dos seus níveis
podem indicar o estado oxidante circulante, importante para avaliação do estresse
oxidativo.102
No entanto, Tavares35 relatou propriedades pro oxidantes da vitamina C em doses
farmacológicas, levando ao aumento de radicais livres, portanto, a suplementação
possivelmente desregula este equilibrio no sentido do efeito pro oxidante e a GSH esteja
regenerando a vitamina C quando esta é oxidada intracelularmente a ácido dehidroascórbico
(DHA) ou atuando na defesa contra os efeitos de sua ação pro oxidante.
Na fase crônica, essa defesa não é mais detectada, demonstrando um esgotamento
dessa resposta na sintese de GSH induzida pela infecção, como observado em camundongos
durante a progressão da doença de Chagas, em que esse sistema de defesa não mais responde
ao estresse oxidativo crônico,103 bem como não se observou mais o efeito da vitamina C.
A suplementação na fase aguda propiciou ainda o aumento da capacidade antioxidante
do plasma (FRAP) na presença de vitamina C, transformando o Fe3+ em Fe2+ , embora sem
70
significancia estatística, sendo que tal aumento em resposta à ingesta de vitamina C já foi
demonstrado.104
Os antioxidantes constituintes do FRAP incluem ácido úrico, ácido ascórbico,
bilirrubina e tiois na fase aquosa.76,105 Porém, o FRAP não é a simples soma das atividades
de suas várias substâncias antioxidantes, pois é influenciada pelas interações entre eles, de
forma que esta cooperação providencia uma proteção amplificada contra os radicais livres.106
Ao avaliar a contribuição da vitamina C ao FRAP, se evidenciou que as maiores
contribuições foram obtidas na condição de suplementação, embora, novamente, essa
constatação não tenha sido corroborada pela análise estatística. Na literatura, a contribuição
da vitamina C ao FRAP tem sido reportada como variando de 10% a 15%,76,107,108 o que
indica, frente aos resultados obtidos na fase aguda dessa pesquisa, que a presença de infecção,
sem suplementação, tenha diminuido estes valores, implicando em um papel importante para
este antioxidante nesta fase da infecção.
Com a evolução da infecção para a fase crônica, as diferenças entre os grupos
suplementados não foram mais observadas quanto à capacidade antioxidante, embora o grupo
NINFC/C tenha apresentado o maior valor que o grupo INFC/C, mas a contribuição da
vitamina C aumentou de forma expressiva em todos os grupos em comparação ao observado
no NINFC/A, indicando uma alteração na dinamica entre os antioxidantes presentes no
plasma.
Outro parâmetro avaliado foram os grupamentos sulfidrilas do plasma (GS), que são a
defesa primária, dando origem de forma eficaz aos antioxidantes do plasma,108 podendo atuar
como “poupadores” das vitaminas C e E, o que possui importantes implicações nos sistemas
de defesa antioxidante que estejam sob continuo estresse mediados pelos radicais livres.
Observou-se na fase aguda, que a suplementação com vitamina C aumentou o GS na
presença ou não da infecção. Como pode-se verificar, o grupo INFA/C apresentou maior
concentração que o INFA/A, com resultados estatisticamente significativos, demonstrando
que a suplementação associada a infecção amplifica esta resposta.
Uma provável explicação para este evento seria o aumento da síntese da proteína
metalotioneina desencadeado pela infecção pelo T. cruzi.109 Ela possui um alto conteúdo de
cisteina, podendo atuar como um antioxidante.110 Sua síntese é induzida por fatores
inflamatórios, IL-6 e intermediários reativos de oxigênio produzidos durante a resposta
inflamatória. Esta proteína possui diversas funções, participando na absorção, armazenamento
e homeostase de metais essenciais como zinco e cobre.111,112 Além disto, o zinco é um
71
importante regulador da síntese de GSH, e a síntese de metalotioneina responde aos níveis de
zinco, portanto, esta proteína pode influenciar a taxa de síntese de GSH.
A presença da vitamina C parece potencializar este efeito desencadeado pela infecção,
o que pode ser corroborado com evidencias da literatura que relatam o efeito indutor da
vitamina C sobre a síntese da metalotioneína.113 Este efeito persiste na fase crônica,
evidenciando a importância do GS para combater o dano oxidativo nesta patologia.
6.3 Influencia da vitamina C no controle glicêmico e sua possível ação na multiplicação
do T. cruzi
Em humanos, muitos trabalhos têm sido realizados com pacientes chagásicos
demonstrando alterações no metabolismo, na resposta da insulina e, consequentemente, da
glicose. Saldanha et al.53 observaram alterações morfológicas e morfométricos das ilhotas
pancreáticas na fase crônica da doença de Chagas, constatando alterações funcionais levando
a distúrbios da glicemia e insulimenia. Entretanto, Guariento et al.,57 ao realizar o teste de
tolerância oral à glicose em pacientes na forma clínica indeterminada da doença de Chagas
não observaram diferença significativa no valor de glicemia comparado ao grupo controle; no
entanto, os níveis de insulina foram menores comparados ao grupo controle, sugerindo uma
provável relação com a disfunção anatômica do pâncreas.
Os resultados observados nesta pesquisa, em que no início da fase aguda, os animais
infectados apresentaram valores absolutos de glicemia mais baixos que os não infectados,
com resultados estatisticamente significativos, são corroborados com os autores Combs et
al.64 e Hoelscher et al.114 que demonstraram que a infecção pelo T. cruzi em camundongos na
fase aguda resulta em hipoglicemia grave. Tais resultados sugerem que possa ocorrer um
efeito sobre o metabolismo da glicose supostamente devido à invasão do parasita no fígado
causando inflamação hepática e consequentemente, diminuição da produção hepática de
glicose pela gliconeogênese. Outro fato relevante é que as formas tripomastigotas do T. cruzi
não possuem reserva de glicose, e assim, precisam adquiri-la do hospedeiro para sua
sobrevivência.115
Outra hipótese sugerida por Nagajyothi et al.116 é que a hipoglicemia pode ser
resultado do grande aumento de citocinas ativas como uma “tempestade de citocinas” levando
os animais a diminuir o consumo de alimentos, o que em muitos casos é fator preditivo de
mortalidade.
72
Com relação à insulina, os resultados obtidos nesta pesquisa mostraram que nos
primeiros 15º dias os menores valores foram encontrados nos grupos INFA/C e INFA/A, com
diferenças estatisticamente significativas, coincidindo com os valores da glicemia que
também estavam diminuídos nesse período, levando a um menor estimulo da secreção de
insulina. Esses resultados são corroborados pelas pesquisas de Combs et al.64 que encontraram
níveis de insulina diminuídos na fase inicial da infecção pelo T. cruzi, e concluíram que esta
resposta era consistente com a resposta a níveis muito baixos de glicose neste período.
A resistência à insulina não pode ser desconsiderada na patogênese das disfunções do
metabolismo da glicose na doença de Chagas, uma vez que nesta doença podem estar
relacionada com as co-morbidades como obesidade e Diabetes Mellitus.56
Quando se observa a sensibilidade à insulina (QUICKI) na fase aguda entre os
diferentes tratamentos, embora não se tenha conseguido validação estatística para as
diferenças observadas, pode-se inferir uma tendência dos resultados obtidos.
No início da infecção, os animais do grupo INFA/C exibiram o menor valor de
QUICKI e os INFA/A, a maior. No 30º dia, os animais do grupo INFA/A continuaram a
exibir a maior sensibilidade, porém no 60º dia, final da fase aguda os dois grupos
apresentaram o mesmo valor para este índice. Um fato interessante é que a maior
sensibilidade do grupo INFA/A mostrou-se consistente com menores concentrações de
insulina até o 30º dia, fato este que não foi observado no grupo INFA/C. Neste grupo, tanto o
valor do índice quanto os de insulina mostraram-se baixos no 15º dia, o que pode evidenciar
um efeito da vitamina C neste controle, nos dias iniciais da infecção, onde estas diferenças
foram mais discrepantes.
Apesar do índice de sensibilidade à insulina (QUICKI) não ter apresentado
significância estatística na fase aguda da infecção, foi observado processo inflamatório em
pâncreas principalmente no grupo INFA/C, entretanto não foram observados ninhos de
amastigotas.
Na fase crônica, o grupo INFC/C voltou a apresentar uma sensibilidade à insulina
diminuída, desta vez consistente com a insulina aumentada para este grupo.
Beigsten et al. 66 descreveram que a glicose é o principal estimulador fisiológico para a
liberação da insulina pelas células β do pâncreas, todavia, a glicose e o ácido ascórbico
possuem estrutura similar, assim estes autores sugeriram que o ácido ascórbico inibiria a
secreção da insulina induzida pela glicose possivelmente pela hiperpolarização das células β
do pâncreas sendo esse processo dependente da dose é irreversível, o que explicaria os
73
resultados no grupo NINF/C aos 30º, 60º e 180º da suplementação, com os menores valores
absolutos de insulina encontrados ao longo do período experimental.
Tais observações são confirmadas por estudos de Johnston e Yen67 quando relataram
que níveis elevados de vitamina C plasmática retardam a resposta da insulina após ingestão de
glicose em indivíduos normoglicêmicos prorrogando a hiperglicemia pós-prandial, uma vez
que altas concentrações de vitamina C plasmática inibem por competição a transferência da
glicose nas células β do pâncreas.
Neste contexto, estudos de Nagajyothi et al.63 encontraram reduzida secreção de
insulina na fase aguda da infecção pelo T. cruzi em camundongos, prosseguindo até a fase
crônica, provavelmente por inflamação pancreática com disfunção das células β do pâncreas,
isso porque encontraram em seu estudo histológico formas amastigotas em células β no
pâncreas, apesar da concentração de glucagon produzido pelas células α estar normal, sendo
inconsistente o aumento da resposta do glucagon na hipoglicemia não ocorrendo
gliconeogênese hepática. Da mesma forma, Santos et al.54 observaram alterações histológicas
e funcionais do pâncreas de hamsters infectados pelo T. cruzi, sendo que a infecção chagásica
experimental causou pancreatite semelhante à doença de Chagas humana, e também
observaram níveis de glicose alterados e uma tendência a hipoinsulinemia nos animais
infectados.
Os resultados do glicogênio hepático obtidos nesta pesquisa mostraram um aumento da
sua concentração no grupo INFA/C em relação ao controle, podendo sugerir uma menor
capacidade de mobilizar esta reserva quando associadas à infecção e a suplementação com
vitamina C. Na fase crônica, os níveis de glicogênio hepático continuaram maiores no grupo
INFC/C, bem como no INFC/A, ambos comparados ao NINFC/C, o qual apresentou a menor
concentração de glicogênio, porém valores de glicemia semelhantes ao NINFC/A. Isto
demonstra o efeito marcante da infecção sobre a capacidade de utilizar esta reserva, uma vez
que os grupos INFC/C e INFC/A apresentaram os menores valores de glicemia quando
comparados ao NINFC/A.
No entanto, o grupo NINFA/C apresentou os maiores valores de hemoglobina glicada
indicando um efeito mais consistente da vitamina C em manter níveis glicêmicos mais
elevados por maiores períodos de tempo, seja atuando sobre a insulina, seja interferindo na
absorção de glicose pelas células. Na fase crônica, o grupo INFC/A apresentou maiores
valores de hemoglobina glicada, embora sem variações na glicemia quando comparado aos
demais grupos.
74
Com relação à hemoglobina glicada, Ayala117 descreve que em camundongos é
possível que os níveis de glicose e de insulina em jejum não representam um estado basal
estacionário sendo sugestiva a dosagem dos níveis da hemoglobina glicada para confirmação
da tendência da glicemia a longo prazo.
No entanto, outra possibilidade é que o ascorbato ou o ácido dehidroascórbico, que são
considerados poderosos agentes glicantes,118,119 principalmente sob condições oxidantes,
estejam atuando120,121 uma vez que tanto na fase aguda quanto na crônica, os grupos com
maior hemoglobina glicada também exibiram altos valores de vitamina C plasmática. A
importância e possíveis implicações fisiológicas deste mecanismo serão objeto de futuras
investigações.
Portanto, os resultados sugerem um efeito da vitamina C sobre os parâmetros avaliados
na análise do controle glicêmico que podem ter importantes repercussões fisiológicas para os
portadores da doença de Chagas, tanto na fase aguda quanto na sua evolução para a crônica.
75
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados evidenciaram que:
1. A suplementação controlou a parasitemia entre 15º e o 30º dias pós infeção.
2. Na avaliação do processo inflamatório por meio das determinações de NO e análise histopatológica, foi observado que os animais INFA/C obtiveram um nível maior de inflamação e necrose tecidual. Tal fato pode ser atribuído aos processos inflamatórios, em que os macrófagos são ativados e produzem altos níveis de NO. Também foi confirmado que a vitamina C aumenta a biodisponibilidade do NO nesse processo durante a fase aguda. Na fase crônica, houve diminuição esperada da concentração do NO, porém esta foi maior nos grupos infectados, seguido do NINFC/C e NINFC/A.
3. A forma de suplementação aumentou a concentração plasmática de vitamina C na fase aguda. No entanto, na fase crônica a suplementação foi eficiente apenas na ausência de infecção, o que necessita de maiores investigações.
4. Quanto à GSH, na fase aguda, a infecção aumentou sua concentração no grupo INFA/A. No grupo INFA/C, a diminuição da concentração de GSH sugeriu sua utilização para a regeneração da vitamina C. Na fase crônica, aparentemente, houve diminuição em todos os grupos quando comparados ao controle não infectado.
5. A determinação do FRAP na fase aguda não foi significativamente alterada pela suplementação, embora aumentou a contribuição relativa da vitamina C para esse parâmetro. Na fase crônica, ocorreu diminuição da capacidade antioxidante nos grupos infectados quando comparados aos não infectados, porém com níveis ainda expressivos de contribuição da vitamina C.
6. Pode-se inferir que os níveis de GSH e FRAP observados na fase crônica poderiam estar relacionados com a progressão da doença de Chagas.
7. Na dosagem de GS foi observado que a suplementação com vitamina C aumenta essa resposta na fase aguda e que este nível de defesa continua sendo mobilizado na fase crônica.
8. Quanto à influência da vitamina C nos processos metabólicos e controle glicêmico foi observado que os animais infectados tiveram, no início da infecção, diminuição dos níveis de glicose e insulina comparados aos não infectados. Observou-se ainda que o grupo NINFA/C obteve níveis de insulina menores durante as fases aguda e crônica comparados com os demais grupos, bem como menor deposição de glicogênio hepático. No entanto, ocorreu um aumento expressivo do nível de insulina no grupo INFC/C na fase crônica, o que necessita maior investigação.
9. Na dosagem de hemoglobina glicada também foi observado no grupo NINFA/C valores maiores que os demais na fase aguda. Já na fase crônica houve aumento no grupo INFC/A em relação aos demais.
76
8 CONCLUSÕES
Nossos resultados podem inferir que a suplementação com vitamina C controla a mortalidade e inicialmente a parasitemia. Contudo ocorre maior intensidade do processo inflamatório e necrose nos tecidos, provavelmente pelo grande aumento dos níveis de NO, principalmente na fase aguda da infecção pelo T. cruzi, sugerindo a hipótese da vitamina C agir como pró-oxidante e pró-inflamatório.
Com relação à defesa antioxidante, a suplementação com a vitamina C se mostrou eficaz, principalmente na fase aguda da infecção, pois apresentou um aumento da GSH, da contribuição ao FRAP e do GS.
Quanto à influência da vitamina C no controle glicêmico, observou-se nos início da infecção uma diminuição nos valores de glicemia e insulinemia, provavelmente devido a intensa multiplicação parasitária neste período da infecção.
77
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Anexo 1
NUVILAB CR1 IRRADIADA
(Alimento completo para camundongos e ratos)
COMPOSIÇÃO BÁSICA DO PRODUTO: Milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, carbonato de cálcio, fosfato bicálcico, cloreto de sódio, gordura vegetal, premix vitamínico mineral aminoácido.
NÍVEIS DE GARANTIA POR QUILOGRAMA DO PRODUTO:
Umidade (máx.) 12,50% Proteína Bruta (min.) 22,00% Extrato Etéreo (min.) 5,00% Matéria Mineral (máx.) 10,00% Matéria Fibrosa (máx.) 8,00% Cálcio (máx.) 1,40% Fósforo (min.) 0,60%
ENRIQUECIMENTO POR QUILOGRAMA DO PRODUTO:
VITAMINAS: Vitamina A 13.000 UI, vitamina D3 2.000 UI, vitamina B1 5 mg, vitamina B12 22 mcg, vitamina B2 6 mg, vitamina B6 7 mg, vitamina E 34 mg, vitamina K3 3 mg, niacina 60 mg, biotina 0,05 mg, ácido fólico 1 mg, ácido pantotênico 21 mg, colina 650 mg.
MICROELEMENTOS MINERAIS: Cobre 10 mg, cobalto 1,5 mg, ferro 50 mg, iodo 2 mg, manganês 60 mg, selênio 0,05 mg, zinco 60 mg.
AMINOÁCIDOS: Lisina 100 mg, metionina 300 mg.
ADITIVOS: Antioxidante 100 mg
INDICAÇÃO: Alimento irradiado para camundongos e ratos de laboratório
USO: Administração à vontade através de comedouros suspensos.
CONSERVAÇÃO: Conservar o produto em ambiente Seco e arejado, evitando luz e calor excessivos.
PRAZO DE VALIDADE: 3 meses após data de Fabricação
Rótulo Registrado no Ministério da Agricultura sob n.º PR 4453 00270 – Indústria Brasileira
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Anexo 2
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Anexo 3
Cewin gotas - Bula
Esta bula é meramente informativa destinada ao público em geral.
Princípio ativo : ácido ascórbico.
Classe terapêutica : vitaminas
Apresentação : Solução oral 200 mg/mL: embalagem com 1 frasco de 20 mL.
Fórmula
Cada mL Cewin Solução oral contém 200 mg de ácido ascórbico. Excipientes: sorbitol, metilparabeno, propilparabeno, hidróxido de sódio, sacarose, fosfato sódio de riboflavina, álcool etílico, aroma artificial de caramelo e água purificada.
Cada 1 mL de Cewin Solução oral equivale a 20 gotas e 1 gota equivale a 10 mg.
Indicação : Este medicamento é destinado ao tratamento de todos os estados em que há deficiência ou aumento das necessidades de vitamina C no organismo. Está também indicado como auxiliar do sistema imunológico (sistema de defesa contra infecções) e ainda nas fases de crescimento.
Farmocinética :
Cewin é um medicamento que possui em sua fórmula uma substância denominada ácido ascórbico ou vitamina C. Cewin combate a deficiência desta vitamina no organismo e auxilia nas funções do sistema imunológico (sistema de defesa contra infecções) e nas fases de crescimento.
Tempo médio de início de ação
Tempo para pico de concentração plasmática do ácido ascórbico após ingestão oral é de 2 a 3 horas.
Quando não Devo Usar Esse Medicamentos:
Cewin não deve ser utilizado por pacientes com reconhecida hipersensibilidade (alergia) ao ácido ascórbico ou a qualquer outro componente do produto e em pacientes com litíase urinária (cálculo nos rins) acompanhada por oxalúria (presença de oxalatos ou ácido oxálico - substâncias que formam os cálculos renais - na urina).
Este medicamento é contraindicado para uso em pacientes com insuficiência renal severa (redução grave da função dos rins).
4. O QUE DEVO SABER ANTES DE USAR ESTE MEDICAMENTO?
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ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES
Nos diabéticos as doses de vitamina C podem interferir nos testes de avaliação da glicose na urina sem alterar a glicose no sangue e nestes casos o uso de Cewin deve ser interrompido pelo menos 7 dias antes do exame. A vitamina C pode aumentar a excreção de ferro com o uso de desferoxamina. O uso da vitamina C pode alterar ainda o resultado de alguns outros exames de laboratório (sangue oculto nas fezes, desidrogenase lática, transaminases e bilirrubina).
Gravidez e amamentação Este medicamento não deve ser utilizado por mulheres grávidas sem orientação médica.
Populações especiais
Em pacientes com insuficiência renal, Cewin deve ser utilizado somente com orientação e supervisão médica.
Atenção diabéticos: Cewin Solução oral contém açúcar (450 mg de sacarose).
Interações Medicamentosas:
Em pacientes em uso de indivavir (substância para tratamento da AIDS) e doses elevadas de vitamina C, reduziu-se significativamente a concentração sérica (no sangue) de indinavir.
Informe ao seu médico se você está fazendo uso de algum outro medicamento.
Modo de Conservar:
Cewin solução oral deve ser mantido em sua embalagem original, em temperatura ambiente (entre 15 e 30oC). Proteger da luz.
A VITAMINA C, QUANDO EXPOSTA AO AR, PODE TER SUA COLORAÇÃO ALTERADA. PRESERVE A INTEGRIDADE DA EMBALAGEM.
Número de lote e datas de fabricação e validade: vide embalagem. Não use medicamento com o prazo de validade vencido. Guarde-o em sua embalagem original.
Após aberto, válido por 30 dias. Características do medicamento
Cewin solução oral é um liquido límpido, viscoso, de coloração amarela, com odor característico de caramelo.