FACOLTArsquo DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia

EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD

IN MODELLI IN VIVO E IN VITRO DI INVECCHIAMENTO E NEURODEGENERAZIONE

Anno Accademico 2013-2014

Candidata Maria Lo Giudice

matricola 1466710

CorrelatoreAnnamaria Confaloni

RelatoreGiancarlo Poiana

SOD= SUPEROSSIDODISMUTASI tra i piugrave importanti enzimi antiossidanti presenti in tutte le cellule che metabolizzano lrsquoO2

3 isoforme

Cu Zn-SOD SOD citosolica- nucleo spazio mitocondriale intermembrana lisosomi perossisomi

Mn-SOD SOD mitocondriale- matrice mitocondriale

Cu Zn-SOD SOD

extracellulare

rMnSODLSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al 2006) Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietagrave strutturali e funzionali

Localizzazionemitocondrio RER vescicole secretorie

StrutturaContiene la sequenza leader allrsquoN-terminale ritenuta responsabile dellrsquointernalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al 2011)

Applicazioni

bull Funzione antiossidantebull Azione anti-tumorale (Pica et al 2010)bull Effetto radio-protettivo (Borrelli et al 2009)bull Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al 2013)

Promettenti potenzialitagrave

Sistema nervosohellip

INVECCHIAMENTO CEREBRALE

NEURODEGENERAZIONE

Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo

Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso

In quali condizioni del SN

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

In quali condizioni del SN

Mn-SOD

Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)

Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)

STRESS OSSIDATIVO

ECCESSO DI ROS

NEUROINFIAMMAZIONE

Mn-SOD

MORTE CELLULARE

MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)

MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)

MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)

TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD

Modello in vivo di invecchiamento

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

Scopo della ricerca

Modello in vitro di neurodegenerazione

Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica

Modello IN VIVO

18 topi C57BL maschi di

18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina

9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la

rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina

Al termine del trattamentohellip

Materali e metodi

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

2rsquorsquo 2rsquorsquo

5 min

4 min

2rsquorsquo

90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo

30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo

Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

02

04

06

08

1

12

14

16

BLC

CD

30

L

Eo

tax

in

Eo

taxi

n-2 F

as

Lig

an

d

Fra

cta

lkin

e

GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

IL-1β

IL-2 IL-3IL-4

IL-6IL-9

IL-10

IL-1

2 p

40

p7

0

IL-12 p70IL-13IL-17

I-TACKC

Leptin

LIX

Lym

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MCP-1 MC

SF

MIG

MIP-1αMIP-1γ

RANTESSD

F-1

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TECK

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TNFα

sTNFR 1sTNFR 2

Rap

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con

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

0

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

trl

MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

40

60

80

100

120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

0

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100

120

v

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llula

re ri

spett

o al

Ctr

l

Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

SOD= SUPEROSSIDODISMUTASI tra i piugrave importanti enzimi antiossidanti presenti in tutte le cellule che metabolizzano lrsquoO2

3 isoforme

Cu Zn-SOD SOD citosolica- nucleo spazio mitocondriale intermembrana lisosomi perossisomi

Mn-SOD SOD mitocondriale- matrice mitocondriale

Cu Zn-SOD SOD

extracellulare

rMnSODLSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al 2006) Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietagrave strutturali e funzionali

Localizzazionemitocondrio RER vescicole secretorie

StrutturaContiene la sequenza leader allrsquoN-terminale ritenuta responsabile dellrsquointernalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al 2011)

Applicazioni

bull Funzione antiossidantebull Azione anti-tumorale (Pica et al 2010)bull Effetto radio-protettivo (Borrelli et al 2009)bull Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al 2013)

Promettenti potenzialitagrave

Sistema nervosohellip

INVECCHIAMENTO CEREBRALE

NEURODEGENERAZIONE

Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo

Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso

In quali condizioni del SN

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

In quali condizioni del SN

Mn-SOD

Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)

Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)

STRESS OSSIDATIVO

ECCESSO DI ROS

NEUROINFIAMMAZIONE

Mn-SOD

MORTE CELLULARE

MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)

MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)

MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)

TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD

Modello in vivo di invecchiamento

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

Scopo della ricerca

Modello in vitro di neurodegenerazione

Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica

Modello IN VIVO

18 topi C57BL maschi di

18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina

9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la

rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina

Al termine del trattamentohellip

Materali e metodi

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

2rsquorsquo 2rsquorsquo

5 min

4 min

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Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

02

04

06

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Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

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al C

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

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D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

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Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

rMnSODLSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al 2006) Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietagrave strutturali e funzionali

Localizzazionemitocondrio RER vescicole secretorie

StrutturaContiene la sequenza leader allrsquoN-terminale ritenuta responsabile dellrsquointernalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al 2011)

Applicazioni

bull Funzione antiossidantebull Azione anti-tumorale (Pica et al 2010)bull Effetto radio-protettivo (Borrelli et al 2009)bull Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al 2013)

Promettenti potenzialitagrave

Sistema nervosohellip

INVECCHIAMENTO CEREBRALE

NEURODEGENERAZIONE

Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo

Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso

In quali condizioni del SN

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

In quali condizioni del SN

Mn-SOD

Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)

Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)

STRESS OSSIDATIVO

ECCESSO DI ROS

NEUROINFIAMMAZIONE

Mn-SOD

MORTE CELLULARE

MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)

MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)

MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)

TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD

Modello in vivo di invecchiamento

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

Scopo della ricerca

Modello in vitro di neurodegenerazione

Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica

Modello IN VIVO

18 topi C57BL maschi di

18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina

9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la

rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina

Al termine del trattamentohellip

Materali e metodi

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

2rsquorsquo 2rsquorsquo

5 min

4 min

2rsquorsquo

90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo

30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo

Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

02

04

06

08

1

12

14

16

BLC

CD

30

L

Eo

tax

in

Eo

taxi

n-2 F

as

Lig

an

d

Fra

cta

lkin

e

GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

IL-1β

IL-2 IL-3IL-4

IL-6IL-9

IL-10

IL-1

2 p

40

p7

0

IL-12 p70IL-13IL-17

I-TACKC

Leptin

LIX

Lym

ph

ota

ctin

MCP-1 MC

SF

MIG

MIP-1αMIP-1γ

RANTESSD

F-1

TCA-3

TECK

TIM

P-1

TIMP-2

TNFα

sTNFR 1sTNFR 2

Rap

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Cor

tecc

ia tr

atta

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orte

ccia

con

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

0

02

04

06

08

1

12

14

16

BLC

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GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

IL-1β

IL-2 IL-3IL-4

IL-6IL-9

IL-10

IL-1

2 p

40

p7

0

IL-12 p70IL-13IL-17

I-TACKC

Leptin

LIX

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MCP-1 MC

SF

MIG

MIP-1αMIP-1γ

RANTESSD

F-1

TCA-3

TECK

TIM

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TIMP-2

TNFα

sTNFR 1sTNFR 2

Rap

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le c

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hine

Cor

tecc

ia tr

atta

toC

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ccia

con

trol

lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

trl

MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

trl

Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

40

60

80

100

120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

0

20

40

60

80

100

120

v

italit

agrave ce

llula

re ri

spett

o al

Ctr

l

Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

INVECCHIAMENTO CEREBRALE

NEURODEGENERAZIONE

Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale del cervello spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo

Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni eo cellule accessorie con conseguente compromissione dellrsquointero sistema nervoso

In quali condizioni del SN

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

In quali condizioni del SN

Mn-SOD

Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD PD SLA) e nel ldquonormalerdquo declino cognitivo etagrave-correlato (Flynn et al 2013)

Lrsquooverespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo la morte neuronale e lrsquoinfiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al 2011)

STRESS OSSIDATIVO

ECCESSO DI ROS

NEUROINFIAMMAZIONE

Mn-SOD

MORTE CELLULARE

MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)

MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)

MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)

TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD

Modello in vivo di invecchiamento

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

Scopo della ricerca

Modello in vitro di neurodegenerazione

Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica

Modello IN VIVO

18 topi C57BL maschi di

18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina

9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la

rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina

Al termine del trattamentohellip

Materali e metodi

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

2rsquorsquo 2rsquorsquo

5 min

4 min

2rsquorsquo

90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo

30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo

Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

02

04

06

08

1

12

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16

BLC

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GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

IL-1β

IL-2 IL-3IL-4

IL-6IL-9

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IL-12 p70IL-13IL-17

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MIP-1αMIP-1γ

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

0

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GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

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I-TACKC

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con

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

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al C

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

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Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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100

120

v

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o al

Ctr

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

STRESS OSSIDATIVO

ECCESSO DI ROS

NEUROINFIAMMAZIONE

Mn-SOD

MORTE CELLULARE

MnSOD possiede un ruolo protettivo dallrsquoinduzione dellrsquoapoptosi innescata dal TNF-α (Delhalle et al 2002)

MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c(Holley et al 2011)

MnSOD opera la neutralizzazione dellrsquoO2- (Fukui et al 2010)

TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD

Modello in vivo di invecchiamento

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

Scopo della ricerca

Modello in vitro di neurodegenerazione

Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica

Modello IN VIVO

18 topi C57BL maschi di

18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina

9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la

rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina

Al termine del trattamentohellip

Materali e metodi

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

2rsquorsquo 2rsquorsquo

5 min

4 min

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Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

trl

MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

trl

Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

40

60

80

100

120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

0

20

40

60

80

100

120

v

italit

agrave ce

llula

re ri

spett

o al

Ctr

l

Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

TESTARE LrsquoEFFETTO DELLA rMnSOD

Modello in vivo di invecchiamento

Stress ossidativoNeuroinfiammazione

Morte cellulare

Scopo della ricerca

Modello in vitro di neurodegenerazione

Analisi comportamentale Analisi cellulareAnalisi biochimica

Modello IN VIVO

18 topi C57BL maschi di

18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina

9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la

rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina

Al termine del trattamentohellip

Materali e metodi

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

2rsquorsquo 2rsquorsquo

5 min

4 min

2rsquorsquo

90rsquorsquo30rsquorsquo 30rsquorsquo

30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo 30rsquorsquo30rsquorsquo

Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

02

04

06

08

1

12

14

16

BLC

CD

30

L

Eo

tax

in

Eo

taxi

n-2 F

as

Lig

an

d

Fra

cta

lkin

e

GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

IL-1β

IL-2 IL-3IL-4

IL-6IL-9

IL-10

IL-1

2 p

40

p7

0

IL-12 p70IL-13IL-17

I-TACKC

Leptin

LIX

Lym

ph

ota

ctin

MCP-1 MC

SF

MIG

MIP-1αMIP-1γ

RANTESSD

F-1

TCA-3

TECK

TIM

P-1

TIMP-2

TNFα

sTNFR 1sTNFR 2

Rap

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esp

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le c

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hine

Cor

tecc

ia tr

atta

toC

orte

ccia

con

trol

lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

0

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IL-2 IL-3IL-4

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IL-12 p70IL-13IL-17

I-TACKC

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MIP-1αMIP-1γ

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con

trol

lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

litagrave

cellu

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

40

60

80

100

120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

0

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spett

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Ctr

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Modello IN VIVO

18 topi C57BL maschi di

18 mesi divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina

9 topi Trattati sottoposti a trattamento intranasale con la

rMnSOD 45 microM9 topi Ctrl sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina

Al termine del trattamentohellip

Materali e metodi

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

2rsquorsquo 2rsquorsquo

5 min

4 min

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Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

02

04

06

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1

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

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0

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

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cellu

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etto

al C

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

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07

5 μ

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- rM

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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Mn

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Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Analisi comportamentale Fear conditioning

Training tone + shock Baseline Pause

3 min 90rsquorsquo30rsquorsquo

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5 min

4 min

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Materali e metodi

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

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08

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BLC

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I-TACKC

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

0

02

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GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

IL-1β

IL-2 IL-3IL-4

IL-6IL-9

IL-10

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IL-12 p70IL-13IL-17

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Leptin

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trol

lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

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07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

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D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

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120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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v

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Ctr

l

Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Analisi biochimica valutazione dellrsquoespressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine BLC CD30L Eotaxin Eotaxin-2 Fas Ligand Fractalkine GCSF GM-CSF IFNγ IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12 p40p70 IL-12 p70 IL-13 IL-17 I-TAC KCCXCL1 LeptinOB LIX Lymphotactin MCP-1 MCSF MIG MIP-1α MIP-1γ RANTES SDF-1 TCA-3 TECK TIMP-1 TIMP-2 TNF-α sTNF-RI sTNF-RII Mediante una reazione antigeneanticorpo il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione

Cx trattato Cx Ctrl

Materali e metodi

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

02

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1

12

14

16

BLC

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

0

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

litagrave

cellu

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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07

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M- r

Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

0

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Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

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Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

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Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

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Trattamento con menadione MTT Risultati

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

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Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

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Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

FEAR CONDITIONING

4 Parametribull Freezingbull Groomingbull Not movingbull Crossingmin

bull Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dellrsquoattivitagrave locomotoria sia nel tone che nel context retest =gt nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali

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hine

Cor

tecc

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ccia

con

trol

lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

trl

MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

litagrave

cellu

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etto

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

40

60

80

100

120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

0

20

40

60

80

100

120

v

italit

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llula

re ri

spett

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Ctr

l

Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

0

02

04

06

08

1

12

14

16

BLC

CD

30

L

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IL-2 IL-3IL-4

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IL-12 p70IL-13IL-17

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MIP-1αMIP-1γ

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Diminuzione per IL-1β -33 (plt001) IL-2 -20 (plt005)TNFα -29 (plt005)sTNF-R2 -14

(plt005)

0

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BLC

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IL-2 IL-3IL-4

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IL-12 p70IL-13IL-17

I-TACKC

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MIP-1αMIP-1γ

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TIMP-2

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sTNFR 1sTNFR 2

Rap

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Cor

tecc

ia tr

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toC

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ccia

con

trol

lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

40

60

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100

120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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120

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

0

02

04

06

08

1

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BLC

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GCSFGM-CSFIFNyIL-1α

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IL-2 IL-3IL-4

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RANTESSD

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lo MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY

Risultati

Tendenza a diminuire per lrsquoIL-1α -15 (p= 009) lrsquoIL-3 -30 (p= 007) I-TAC -25 (p= 009) LIX -13 (p= 007)

Tendenza ad aumentare per MIP-1γ +20 (p=

006)

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

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etto

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

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07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

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D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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07

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

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075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Il trattamento con la rMnSOD 075 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare

- rMnSOD + rMnSOD 075 μM 3h + rMnSOD 075 μM 6h

Conferma dellrsquoazione anti-tumorale della rMnSOD giagrave descritta in letteratura (Mancini et al 2008) estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa

Modello in vitro

Cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

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M

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

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Trattamento con menadione MTT Risultati

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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Mn

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Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

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Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

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Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Modello in vitro

Le cellule SK-N-BE dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose mostrando un fenotipo neuron-like

Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo

Menadioneinduttore del radicale O2-nei mitocondri causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale

Glutammatoinduttore di eccitotossicitagrave

Materali e metodi

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

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MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

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07

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M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

litagrave

cellu

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risp

etto

al C

trl

Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

20

40

60

80

100

120

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

0

20

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80

100

120

v

italit

agrave ce

llula

re ri

spett

o al

Ctr

l

Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

Grazie per lrsquoattenzione

NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD

Conferma dellrsquoavvenuto differenziamento e della non tossicitagrave della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate

Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento

IMMUNOCITOCHIMICA

Risultati

vita

litagrave

cellu

lare

risp

etto

al C

trl

MTT

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

D

Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

SOD

Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

0

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

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Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a

Trattamento con menadione

Trattamento con glutammato

bull Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2rsquo7rsquo-Dichlorodihydrofluorescein diacetate DCDHF-DA

bull Valutazione della vitalitagrave cellulare mediante il saggio dellrsquoMTT

Materali e metodi

+rMnSOD 075 μM

1h

+menadione 25 o 50 μM

1h 20h

+rMnSOD 075 μM+glutammato 05 o 1 mM

Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

nSO

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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M- r

Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

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Risultati modello in vitro

La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

Mn

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M

Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

0

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

SOD

07

5 μ

M- r

Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

Glut 05mM Glut 05mM+rMnSOD

075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS

+ r

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Men 50 μMCtrl Men 25 μM

- rM

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Trattamento con menadione DCDHF-DA

Risultati

Men 50 μM -30 (plt 001) rispetto al Ctrl

Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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M- r

Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

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Men 50 μM + rMnSOD -20 (plt 005) rispetto al Ctrl

Trattamento con menadione MTT Risultati

vita

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Ctrl Ctrl + rMnSOD 075μM

Men 50 μM Men 50μM + rMnSOD 075μM

Men 25 μM Men 25 μM + rMnSOD 075μM

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La rMnSOD risulta efficace nel contrastare lrsquoincremento dei ROS indotto dal glutammato

Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

075μM

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Riassumendo rMnSOD amp modello in vivo

Nessun effetto

sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

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Trattamento con glutammato DCDHF-DA

Risultati

+ r

Mn

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Ctrl Glutam 05 mM Glutam 1 mM

Glut 1 mM -16 (plt 005) rispetto al Ctrl

Glut 1 mM+ rMnSOD -15 (plt 001) rispetto al Ctrl

Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

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sul profilo cognitivo degli animali trattati

Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

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Glut 05 mM+ rMnSOD -18 (plt 001) rispetto al Ctrl

Trattamento con glutammato MTT

Risultati

Ctrl Ctrl+rMnSOD 075μM

Glut 1mM Glut 1mM+rMnSOD

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Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

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Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

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Riduzione significativa di IL-1β IL-2 TNF-α e sTNF-RII

Riduzione vicina alla significativitagrave di IL-1α IL-3 I-TAC e LIX

Aumento significativo di MIP-1γProbabilmente

attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo

La rMnSOD egrave in grado di agire sulla neuroinfiammazione modulando lrsquoespressione di importanti fattori che la promuovono(Dilger et al 2008)

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

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NeuroteamAnnamaria ConfaloniAlessio CrestiniPaola PiscopoLorenzo Malvezzi-CampeggiRoberto RivabeneMaria Lo GiudiceGiulio Di CiacciaVania Batalha

Riassumendo rMnSOD amp modello in vitro

Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE

Inefficacia nel contrastare la mortalitagrave cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicitagrave nel co-trattamento con il glutammato

Probabilmente riconducibile allrsquoeccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello

Marcata azione di scavenger dei ROS in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato

PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

Dipartimento di Biologia

CellulareampNeuroscienze

Laboratorio di Clinica Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles

DarwinProf Giancarlo Poiana

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PROSPETTIVE FUTURE

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD su topi piugrave anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria

Valutare lrsquoeffetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi

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