Кому нужны трансгенные животные (gm) и почему их нужно...
TRANSCRIPT
Кому нужны трансгенныеживотные (GM) и почему их нужно изучать
Евгений Леонидович ЗавьяловЕжегодный научно-практический семинар
ООО «ФАРМБИОЛАЙН»
Новосибирск19 сентября 2019 г
ЦКП «SPF-виварий»ФИЦ ИЦиГ СО РАН
450 инбредных линий мышей!
Зачем создавать трансгенных животных?
- Модели патологий в биомедицинских исследованиях;
- Модели для изучения функций специфических генов на уровне всего организма. Более 95
процентов используемых моделей - генетически модифицированные грызуны;
- Создание и тестирование новых лекарственных средств, в том числе, получение человеческих
антител для использования в качестве терапевтических средств. Каждые два из трех препаратов
моноклональных антител, одобренных FDA были получены от трансгенных мышей;
- Получение большого количества сложных человеческих белков для лечения заболеваний
человека. Имеющиеся технологии производства таких белков в реакторах на основе клеток млекопитающих
является очень дорогостоящим - производственного комплекса для одного терапевтического белка оценивается в
500 миллионов долларов США!!!
- Источник органов для трансплантации…
0
5000
10000
15000
20000
25000
3000020
01
200
2
200
3
200
4
200
5
200
6
200
7
200
8
200
9
201
0
201
1
201
2
201
3
201
4
201
5
201
6
201
7
201
8
Количество публикаций в Pub Med – 337551
Ключевое слово: transgenic mice
Трансгенные мыши несут
зеленый флуоресцентный белок,
который светится зеленым при
голубом свете.
Ingrid Moen et al., BMC
Cancer, 12/21 (2012), 1-10.
Трансге́нный органи́зм — живой организм, в геном
которого искусственно введен ген, который не может быть приобретен при естественном скрещивании.
wikipedia.org
Генетически
модифицированные
организмы (GM)Knock-out
Дата Событие люди место
1891 г. Первый успешный перенос эмбрионов на ангорских кроликах Walter Hip
1963 г. Разработка принципов культивирования яйцеклеток in vitro Ральф Бринстера Пенсильванский университет
1966 г. Представлена методика микроинъеций оплодотворенные яйцеклеток
мышей, что открыло возможность введения чужеродную ДНК
Те Пинг Лин Калифорнийская медицинская школа
1974 г. Первая публикация о введении чужеродной ДНК мышам Jaenisch, Mintz Salk Institute, Fox Chase Institute for Cancer Research
1980 г. Сообщение о первом успешном развитии трансгенных мышей Barbosa, Gordon, Plotkin,
Ruddle, Scangos
Yale University
1980 г. Опубликована методика использования микрокапилляров из стекла
для инъекций ДНК в ядра культивируемых клеток млекопитающих
Capecchi University of Utah
1992 г. Первая модель трансгенной мыши, созданная для изучения связи
между метилированием ДНК и болезнями человека
Li, Bestor, Jaenisch Whitehead Institute for Biomedical Research
1994 г. Первые линии трансгенных мышей, полученные для продуцирования
человеческих моноклональных антител
Bruggemann, S.Green,
Lonsberg, Neuberger
Cell Genesys, GenPharm, Laboratory o Molecalar Biology
1996 г. Овечка Долли - первое клонированное млекопитающее Wilmut, Campbell Roslin Institute
2006 г. Впервые одобрен препарат на основе полностью человеческих
моноклональных антителAgensys, Amgen
2007 г. Нобелевская премия по физиологии в медицине за открытия
принципов проведения специфических генетический модификаций у
мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток
Capecchi, Evans, Smithies
2013 г. Опубликован революционный метод CRISPR-Cas9 редактирования,
открывший принципиально новые возможности в редактировании
геномов высших организмов
Cong, Ran, Cox, Lin,
Barretto, Habib, Hsu, Wu,
Jiang, Marraffini, Zhang
Science. 2013; 339 (6121): 819–823.
2019 г. Применение CRISPR-Cas9 технологии для генетического контроля у
мышей
University of California San Diego
GM животные: график ключевых событий
Технология получения трансгенных мышей
Микроинъекция ДНК
в оплодотворенную яйцеклетку
Яйцеклетка
Имплантация эмбриона
суррогатной матери
Пронуклеус
Рождение
трансгенных
мышат
Эмбрионалные
стволовые клетки
Химеризация
Трансгенное
животное
F1
F2Имплантация эмбриона
суррогатной матери
Введение ДНК
и генетическая
модификация
клеток
Введение
модифицированных
клеток в бластоцисту
Химера Дикий тип
Дикий тип Гетерозигота Гетерозигота
Микроинъекция
ДНК
ПЦР
диагностика
наличия трансгена
у родившихся
мышат
Изучение наследования трансгена в череде поколений, экспрессии рекомбинантного белка и его биологической активности, сохранение биологических свойств
рекомбинантного белка в сравнении с природным аналогом, соответствие уровня его продукции биотехнологическим задачам; и т.д.
Последствия IVF (ЭКО) на здоровье потомков
> 7 млн. IVF детей рождено
> 2 % новорожденных в EC и USA
1978
2015
Применение IVF (ЭКО) процедур в мире
Ожирение и IVF
“Low birth weight increases risk of metabolic disorder”(Ramírez-Vélez R, 2012)
Birth weight
730
740
750
760
770
780
Control IVF
0
5
10
15
20
25
Control IVF
16th day embryo 14-16 weeks offspring
Fat, %
body
mass
Body m
ass, m
g
p<0.05p<0.001
2015
KLH
Контроль
Эпигенетическое программирование
Спаривание
Критические этапы формирования и развития плода
Имплантация
Развитие эмбриона
650
700
750
800
850
900
NM Control Imm Control Imm
Масса эмбриона на 16 сутки, мг
Контроль
KLH
KLH
Контроль СперматозоидыKLHЕстественное
покрытие Вазэктомированный самецKLH
Пок
рыт
ие
сам
цом
Контроль
In vitro fertilization
(IVF)
Вазэктомированный
самец
Контроль
KLH (иммунизация)
Контроль
Масса эмбриона, мгA
AA
B
BB
B
C
Масса плаценты, мг
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
Control SVO SVZ IVF
720
740
760
780
800
820
840
860
880
Control SVO SVZ IVF
Репродуктивные эффекты дефицита фактора некроза
опухоли (TNF-) у мышейФа́ктор некро́за о́пухоли (ФНО, фактор некроза опухоли-альфа, кахексин, кахектин, англ. tumor necrosis factor, TNF) — внеклеточный белок,
многофункциональный провоспалительный цитокин. Влияет на липидный метаболизм, коагуляцию, устойчивость к инсулину, функционирование эндотелия,
стимулирует продукцию ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, интерферона-гамма, активирует лейкоциты, один из важных факторов защиты от внутриклеточных паразитов и вирусов.
Избыточная продукция ФНО вызывает расстройства гемодинамики (снижает сократимость миокарда, минутный объем крови, диффузно увеличивает проницаемость
капилляров), цитотоксический эффект на клетки организма. Нарушения регуляции ФНО у человека ассоциированы с различными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, рак, клиническая депрессия, псориаз и воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона, язвенный колит) Википедия
До
Эм
бр
ио
на
ль
ны
е п
оте
ри
, %
После
имплантационные
Всего
Ген Функция Заболевание Мутация
1. Cntn5Контактин 5
Влияет на взаимодействие клеток при нейрогенезе
Аутизм,Нейродегенерация, Болезнь Гиршпрунга
Нокин
2. Cntn6 Формирование аксональных связей
Аутизм,Нейродегенерация, Гиперактивность, Слабоумие, Шизофрения, Биполярные расстройства и др.
Делеция
3. Cntn6 Дупликация
4. Cntn6 Инверсия
5. C-kit Цитокиновый рецепторглиальных клеток
Биполярные расстройства
Делеция
6. Panx1раннексин-1
Panx1 – компонент межклеточных щелевых контактов, широко представлен в ЦНС
Воспаление и отек мозга, гибель нейронов
Нокаут
7. Panx1 Нокин
8. Epb41L4aмембранный белок
Ген экспрессирован в клетках мозга
Нейробиологические эффекты неизвестны
Делеция
9. C-kit/kdr Оба гена – рецепторы тирозинкиназы, тип III
Слабоумие 3D мутации путем делециимежгенногоучастка ДНК
10. Unc5b/Slc29a3 UNC5B – рецептор нитрина; Slc29a3 – транспортернуклеозидов
Слабоумие
Фенотипирование мышей с целевыми мутациями, полученными в ИЦиГ СО РАН
3D мутации – новая область для анализа генетических ассоциаций с нейропатологиями
На мышах с контролируемой генетической и эпигенетической изменчивостью исследовать вклад наследственных и средовых факторов в индивидуальные вариации коннектома и глимфатической системы, а также оценить значение этих вариаций в формировании нейропатологий
Нейроимиджинг
Коннектом
Глимфатические потоки
Поведенческие тесты
http://www.findmice.org/
The International Mouse Phenotyping Consortium
The European Mouse Mutant Archive
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
20
01
20
02
20
03
20
04
20
05
20
06
20
07
20
08
20
09
20
10
20
11
20
12
20
13
20
14
20
15
20
16
20
17
20
18
Количество публикаций в Pub Med – 26346
Ключевое слово: Phenotyping mice
Мировые ресурсы лабораторной мыши и фенотипирование
Спасибо за внимание!