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Extração, caracterização dos extratos de Pinus halepensis
e modelação. Avaliação da sua atividade antioxidante,
antimicrobiana e antifúngica
Sara Alexandra Batista Figueira
Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em
Mestrado Integrado em Engenharia Biológica
Orientadores: Professor José Augusto Paixão Coelho Professor António Manuel de Figueiredo Palavra
Júri
Presidente: Professor Miguel Nobre Parreira Cacho Teixeira Orientador: Professor José Augusto Paixão Coelho
Vogal: Doutora Maria Beatriz Pinto Pereira Palma Nobre
maio de 2019
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Prefácio
O trabalho apresentado nesta tese foi realizado no Instituto Superior Técnico e no Instituto Superior
de Engenharia de Lisboa, durante o período de setembro de 2018 a janeiro de 2019, sob supervisão
do Professor Doutor José Augusto Paixão Coelho. A tese foi coorientada no Instituto Superior Técnico
pelo Professor Doutor António Manuel de Figueiredo Palavra.
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Declaração
Declaro que o presente documento é um trabalho original da minha autoria e que cumpre todos os
requisitos do Código de Conduta e Boas Práticas da Universidade de Lisboa.
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Agradecimentos
Gostaria de agradecer ao Professor José Coelho por me ter acompanhado neste processo, por ter
partilhado os seus conhecimentos, pelo nível de exigência e disponibilidade para me ajudar sempre
que necessário. Não esquecendo a sua simpatia e boa disposição.
Agradeço também ao Professor Dr. António Palavra por me ter proposto um tema tão aliciante de
mestrado e pela leitura da tese.
Agradeço ainda à Professora Paula Robalo pela simpatia e pelo uso do equipamento de microondas
e à Dra. Cecília Calado pelo uso do equipamento de espectrofotometria.
Agradeço ao Professor Amin Karmali, pela orientação e partilha de conhecimentos científicos sobre
microbiologia que foram indispensáveis para que este trabalho fosse concluído.
Agradeço ao meu namorado, Sérgio, pela paciência, disponibilidade e apoio nos bons e nos maus
momentos, por me motivar e acreditar em mim desde o início do meu percurso académico. Sem ele
este processo teria sido mais difícil.
Por fim, devo agradecer às pessoas mais importantes da minha vida, aos meus pais e à minha irmã,
pela sua dedicação, carinho, afeto, e apoio em todas as etapas que percorri, a sua disponibilidade e
preocupação diárias e os seus conselhos que influenciaram as minhas escolhas e me tornaram na
pessoa que sou hoje.
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Resumo
O crescente conhecimento das potencialidades do género Pinus na medicina tradicional,
nomeadamente das agulhas, têm promovido o estudo destas plantas.
O estudo de Pinus halepensis realizou-se através de extrações usando métodos
convencionais e não convencionais. Efetuou-se a hidrodestilação e a extração em Soxhlet com
metanol e hexano, onde se obtiveram rendimentos de 0,8% e de 15,3% e 16,3%, respetivamente.
Também foi realizada a extração supercrítica com CO2 (SFE) e extração por microondas. Na SFE
foram usadas diferentes condições de extração, obtendo-se um rendimento entre 0,88% e 1,79%.
A análise dos óleos obtidos foi efetuada por GC-FID sendo identificados treze compostos, nos
quais o β-Cariofileno, α-Pineno e α-Humulene estão presentes em maior quantidade.
Avaliou-se a atividade antioxidante e o teor de polifenóis dos diversos extratos e óleos
através dos métodos de DPPH e Folin-Ciocalteau. Considerando os rendimentos e por comparação
com o óleo essencial obtido os extratos conseguidos por Soxhlet apresentam maior poder
antioxidante e um maior teor em polifenóis. Os valores obtidos variaram entre 12,64 e 0,440
Trolox/mgextrato e entre 1215,2 e 602,6 µmol EAG/gextrato.
Para os óleos essenciais, avaliou-se o poder antimicrobiano contra Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus casei, Bacillus pumilus e Saccharomyces
cerevisiae, e antifúngico contra Ganoderma lucidium e Lentinula edodes. Verificou-se que os óleos
apresentaram atividade antimicrobiana contra todas as espécies microbianas exceto no caso da
Pseudomonas aeruginosa. Não apresentaram atividade antifúngica
A modelação matemática dos dados experimentais para os óleos voláteis obtidos da SFE foi
feita utilizando dois modelos, Sovová 1994 e Sovová 2005.
Palavras-chave: Pinus halepensis, óleo volátil, atividade biológica, atividade antioxidante,
polifenóis
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Abstract
The importance and studies in the extraction from Pinus needles have increase due it too
different applications, namely in traditional medicine.
Extractions from Pinus halepensis have been carried out applying conventional and
unconventional methods. Hydrodistillation and Soxhlet extraction were performed with methanol and
hexane, yielding 0.8% and 15.3% and 16.3%, respectively. Supercritical CO2 and microwave
extractions have been used as comparison unconventional methods. Supercritical CO2 extraction and
microwave yields were obtained up to 1,79% and 0.8%, respectively.
GC-FID analysis (essential and volatile oils) were carried out being identified thirteen
compounds, in which the β-Cariofileno, α-Pineno and α-Humulene are present in higher quantities.
Antioxidant activity and polyphenols content on the extracts and oils through DPPH and Folin-
Ciocalteau method, were assessed. It was verified that the extracts obtained from Soxhlet presents
higher antioxidant activity and polyphenols content. The values obtained varied between 12,64 and
0,440 Trolox/mgextract and between 1215,2 e 602,6 µmol EAG/gextract, respectively.
Antimicrobial power against Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Lactobacillus casei, Bacillus pumilus and Saccharomyces cerevisiae, and antifungal power against
Ganoderma lucidium and Lentinula edodes, were tested. The values showed that the oils have
antimicrobial power against all species less Pseudomonas aeruginosa and do not present antifungal
power. Mathematical modeling of the data obtained by SFE was done applying two models, Sovová
1994 e Sovová 2005.
Keywords: Pinus halepensis, volatile oil, biological activity, antioxidant activity, polyphenols
xi
xii
Abreviaturas e siglas
ABTS - 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfónico
ANOVA - Teste de análise da variância
BHT - Butil-hidroxitolueno
CI - Ionização química
CI50-Concentração que inibe 50%
CMI - Concentração Mínima Inibitória
DPPH - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EI – Ionização de eletrões
EAG - Equivalentes de ácido gálico
FID – Ionização de chama
FSC – Fluidos supercríticos
GC - Cromatografia gasosa
CGL - Cromatografia gás-líquido
GC-MS - Cromatografia gasosa com detetor de espectrometria de massa
CGS - Comatografia gás-sólido
HD – Hidrodestilação
LOD - Limite de deteção
LOQ - Limite de quantificação
MAE- Extração assistida por micro-ondas
OMS – Organização Mundial de Saúde
PAM - Plantas Aromáticas e Medicinais
Pc- pressão supercrítica
Tc - temperatura crítica
Trolox - Ácido 2-carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano
SFE – Extração com fluidos supercríticos
xiii
xiv
Nomenclaturas
C- Concentração do soluto na fase fluída, kg.kg
-1
C0- Concentração do soluto na fase fluída, em t=0, kg.kg-1
C1- Constante do modelo 1 e 2
C2- Constante do modelo 1 e 2
e – Rendimento de extração, kg.kg-1
h – coordenada axial, m
H- Altura do leito de extração, m
k- Parâmetro de extensão do modelo de fluxo de pistão de Lack
K – Coeficiente de partição entre a concentração de soluto na fase sólida e gasosa
Kf – Coeficiente externo de transferência de massa, m.s-1
Ks – Coeficiente interno de transferência de massa, m.s-1
Mp – Massa inicial de planta no extrator, kg
q- Concentração de soluto na fase sólida, kg.kg-1
q0 – Concentração de soluto na fase sólida, em t=0, kg.kg-1
qk – Conteúdo inicial de soluto de difícil acesso no sólido, kg.kg-1
Q – Taxa de caudal fluido, kg.s-1
Qc – Coordenada do ponto de passagem entre a extração rápida e lenta, kg.kg-1
r- Fração inicial de soluto nas células fragmentadas
r0 – Fração inicial de soluto total e de soluto em células intactas
t- tempo, s
µ - Velocidade superficial do fluido supercrítico, m.s-1
z- Proporção dos parâmetros adimensionais do coeficiente externo de transferência de massa
zW – Coordenada axial adimensional entre a extração rápida e lenta
xi – Fração mássica de planta em cada peneiro
di – Diâmetro do peneiro
xv
Letras Gregas
α- Superfície do volume unitário de partículas, m-1
ɛ - Fração do leito vazio
ϒ – Razão entre a massa de solvente na matriz e no leito, kg.kg-1
ρf – Densidade do solvente
ρs – Densidade do sólido
Ʈ – Tempo adimensional
Ʈ m – Tempo adimensional onde se inicia o segundo período
Ʈn – Tempo adimensional onde se inicia o terceiro período
xvi
Índice
Prefácio .................................................................................................................................................ii
Declaração ........................................................................................................................................... iv
Agradecimentos .................................................................................................................................. vi
Resumo .............................................................................................................................................. viii
Abstract ................................................................................................................................................ x
Abreviaturas e siglas ........................................................................................................................... xii
Nomenclaturas .................................................................................................................................. xiv
Objetivos ..................................................................................................................................... 1 1.
Introdução ................................................................................................................................... 3 2.
Revisão da Literatura ................................................................................................................... 5 3.
3.1 Plantas Aromáticas e Medicinais ............................................................................................. 5
3.2 Óleos Essenciais ....................................................................................................................... 6
3.3 Género Pinus ........................................................................................................................... 7
3.3.1 Pinus halepensis .................................................................................................................. 8
3.3.1.1 Discrição Botânica ............................................................................................................... 9
3.3.1.2 Importância do Pinheiro de Alepo e suas Aplicações........................................................ 10
3.4 Métodos de Extração ............................................................................................................ 13
3.4.1 Extração Supercrítica com CO2 .......................................................................................... 13
3.4.2 Hidrodestilação.................................................................................................................. 15
3.4.3 Microondas ........................................................................................................................ 15
3.4.4 Sohxlet ............................................................................................................................... 16
3.5 Identificação dos principais componentes ............................................................................ 17
3.5.1 Cromatografia .................................................................................................................... 17
3.5.1.1 Cromatografia Gasosa (GC-FID) ......................................................................................... 17
3.6 Avaliação das Propriedades Antioxidantes ........................................................................... 18
3.6.1 DPPH .................................................................................................................................. 19
3.7 Determinação do Teor em Polifenóis .................................................................................... 20
3.8 Análise das propriedades antimicrobianas e antifúngicas .................................................... 22
3.9 Tratamento de Resultados e Análises Estatísticas ................................................................ 24
3.10 Modelação para a Extração Supercrítica ............................................................................... 24
3.10.1 Modelo 1 – Sovová 1994 ................................................................................................... 26
3.10.2 Modelo 2 – Sovová 2005 ................................................................................................... 28
Parte Experimental .................................................................................................................... 29 4.
xvii
4.1 Preparação da amostra: Determinação do tamanho de partícula e densidade ................... 29
4.2 Extração de Pinus halepensis................................................................................................. 29
4.2.1 Hidrodestilação.................................................................................................................. 29
4.2.2 Extração supercrítica ......................................................................................................... 30
4.2.3 Soxhlet ............................................................................................................................... 32
4.2.4 Microondas ........................................................................................................................ 32
4.3 Determinação dos compostos dos óleos .............................................................................. 33
4.3.1 GC-FID ................................................................................................................................ 33
4.4 Quantificação e caracterização dos extratos de P. halepensis .............................................. 33
4.4.1 Método do Radical Livre DPPH .......................................................................................... 33
4.4.2 Determinação do teor de Polifenóis ................................................................................. 34
4.5 Avaliação da atividade antimicrobiana de Pinus halepensis ................................................. 34
4.5.1 Método de difusão de disco .............................................................................................. 35
4.5.2 Método de microdiluição em caldo .................................................................................. 36
Resultados e discussão .............................................................................................................. 37 5.
5.1 Determinação do tamanho de partícula e densidade de Pinus halepensis .......................... 37
5.2 Obtenção do óleo essencial de Pinus halepensis através do método convencional de
hidrodestilação .................................................................................................................................. 37
5.3 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de Soxhlet .... 38
5.4 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de Microondas
39
5.5 Obtenção do óleo volátil de P. halepensis através do método não-convencional com CO2
supercrítico ........................................................................................................................................ 40
5.6 Determinação dos compostos dos óleos por GC-FID ............................................................ 45
5.7 Quantificação e Caracterização de P. halepensis .................................................................. 47
5.7.1 Determinação do poder antioxidante por DPPH............................................................... 47
5.7.2 Determinação do teor de polifenóis ................................................................................. 49
5.8 Determinação da atividade antimicrobiana e antifúngica .................................................... 51
5.8 Modelação dos extratos supercríticos de P. halepensis ....................................................... 62
Conclusões e perspetivas futuras .............................................................................................. 67 6.
Referências ................................................................................................................................ 69 7.
Anexos ....................................................................................................................................... 76 8.
xviii
Índice de Figuras Figura 1: Constituintes dos óleos essenciais (Fonte: [[14]]) .................................................................... 7
Figura 2:Pinus halepensis Mill ................................................................................................................. 8
Figura 3: Representação das folhas (1), flores (2), frutos (3) e sementes (4) de P. halepensis ............ 10
Figura 4: Diagrama de fases pressão-temperatura de substâncias pura; (Fonte:[28]) ......................... 13
Figura 5:Reação do DPPH com espécies antioxidantes; (Fonte:[40]) ................................................... 19
Figura 6:Reação de substâncias redutoras com reagente de Folin-Ciocalteu. No exemplo, o ácido
gálico, em condição alcalina reage com o complexo fosfomolíbdico do reagente de Folin-Ciocalteu.
Na reação, há a mudança na cor, de amarelo para azul, indicando que houve redução do complexo
fosfomolíbdico; (Fonte:[45]) ................................................................................................................. 21
Figura 7: Montagem laboratorial da extração de óleo volátil de P. halepensis por hidrodestilação,
equipamento de Clevenger ................................................................................................................... 29
Figura 8:Esquema da instalação de SFE no IST. C-Garrafa de CO2; S1-Arrefeciemnto; F-Filtro; CP-
Bomba de circulação;BP-Regulador de pressão; M1-M4-Manómetros; S2-Permutador de calor; V-
Vaso de extração; SP1,SP2-Separadores; FL-Rotâmetro; DTM-Contador de gás seco ......................... 30
Figura 9: Equipamento de extração supercrítica com CO2 usado para extrair óleos voláteis de
extratos de folhas de P. halepensis ....................................................................................................... 30
Figura 10: Montagem laboratorial da extração por Soxhlet ................................................................. 32
Figura 11: Montagem Laboratorial da extração por microondas de óleo volátil de P. halepensis ...... 33
Figura 12: Extrato de P. halepensis obtido através da extração em Soxhlet ........................................ 38
Figura 13: Tonalidade da planta antes (2) e após (1) extração em Soxhlet com hexano e metanol .... 38
Figura 14: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo
para a respetiva P(bar) e T(ºC) .............................................................................................................. 41
Figura 15: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído em função da
mCO2/mplanta usada na extração supercrítica de P. halepensis para a respetiva P(bar) e T(ºC) ....... 41
Figura 16: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração
supercrítica de P. halepensis em função do tempo para a respetiva P(bar) e T(ºC) ............................. 42
Figura 17: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo
usando diferentes caudais de CO2 para a respetiva P(bar) , T(ºC) e caudal (L/min) ............................ 43
Figura 18: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração
supercrítica de P. halepensis em função da massa de CO2 por massa de planta tendo em conta
diferentes caudais para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) ...................................................... 44
Figura 19: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração
supercrítica de P. halepensis em função do tempo tendo em conta diferentes caudais para a
respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) ................................................................................................ 45
Figura 20: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o Trolox para a avaliação das
propriedades antioxidantes dos extratos de P. halepensis .................................................................. 47
Figura 21: Atividade antioxidante dos extratos de P. halepensis obtidos por extração em Soxhlet com
metanol e hexano .................................................................................................................................. 48
Figura 22: Poder antioxidante dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos
por hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) ........................................... 49
Figura 23: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o ácido gálico para determinação do
teor em polifenóis ................................................................................................................................. 49
Figura 24: Teor de polifenóis do extrato de P. halepensis obtido por extração em Soxhlet com
metanol e hexano .................................................................................................................................. 50
xix
Figura 25: Teor de polifenóis dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos por
hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) .................................................. 51
Figura 26:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de
disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE
100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Ampicilina ....................................................................................... 52
Figura 27: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Escherichia Coli pelo método de
disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE
100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Gentamicina .................................................................................... 53
Figura 28:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus pumilus pelo método de
disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE
100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Gentamicina .................................................................................... 54
Figura 29: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lactobacillus casei pelo método de
disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE
100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Gentamicina .................................................................................... 55
Figura 30: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Pseudomonas aeruginosa pelo
método de disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE
110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-Gentamicina ........................................................................ 56
Figura 31: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Saccharomyces cerevisiae pelo
método de disco, após 18h de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE
110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-Amphotericin B solubilized .................................................. 56
Figura 32:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Ganoderma lucidium pelo método
de difusão de disco após 1 semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-
SFE 110_50; E- 100_40; F-SFE 100_50; H-Amphotericin B solubilized .................................................. 57
Figura 33:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lentinula edodes pelo método de
difusão de disco após 1 semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-
SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-Amphotericin B solubilized ............................................ 58
Figura 34: Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição
em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de
extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e 50ºC, sem centrifugação .................................... 60
Figura 35:Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição
em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de
extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e 50ºC, após centrifugação ................................... 61
Figura 36: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os quatro
ensaios efetuados, nas condições de P(bar), T(ºC) e caudal constante de 8L/min .............................. 62
Figura 37: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios
efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais ............................................................ 62
Figura 38: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 2, Sovová 2005, para os quatro
ensaios efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e um caudal constante de 8L/min ......................... 63
Figura 39: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios
efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais ............................................................ 63
Figura 40: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de
100ºC e 150W durante 60minutos........................................................................................................ 79
Figura 41: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de
108ºC e 100W durante 35minutos........................................................................................................ 80
Figura 42: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de
108ºC e 100W durante 65minutos........................................................................................................ 81
xx
Índice de Tabelas
Tabela 1: Classificação Científica de Pinus halepensis Mill; (Fonte: [17]) .................................. 9
Tabela 2: Principais componentes dos óleos essenciais de P. halepensis de diferentes
origens reportados da literatura de agulhas, botões e galhos; (Fonte: [[6]])............................. 11
Tabela 3:Rendimentos e propriedades físico-químicas do óleo essencial das agulhas, cones
e hastes de P. halepensis provenientes da Tunísia; (Fonte: [9]) ................................................ 11
Tabela 4: Identificação de diferentes grupos de compostos em diferentes órgãos de P.
halepensis provenientes da Tunísia; (Fonte:[6])............................................................................ 12
Tabela 5:Distribuição quantitativa da amostra de P. halepensis nos diferentes peneiros ...... 37
Tabela 6: Condições operatórias para a extração de óleo essencial de P. halepensis por
microondas .......................................................................................................................................... 39
Tabela 7: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa
de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração
Supercrítica com CO2 ........................................................................................................................ 40
Tabela 8: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o processo
de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo volátil em
relação ao óleo obtido na hidrodestilação ...................................................................................... 42
Tabela 9: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa
de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração
Supercrítica com CO2 ........................................................................................................................ 43
Tabela 10: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o
processo de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo
volátil em relação ao óleo obtido na hidrodestilação .................................................................... 44
Tabela 11: Percentagem da composição do óleo essencial (EO) e óleo volátil (SFE) isolado
de P. halepensis ................................................................................................................................. 46
Tabela 12: Valores do poder antioxidante dos diferentes extratos obtidos a partir de P.
halepensis ............................................................................................................................................ 48
Tabela 13: Valores do teor de polifenóis dos diferentes extratos obtidos a partir de P.
halepensis ............................................................................................................................................ 50
Tabela 14:Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P.
halepensis no crescimento de Bacillus subtilis através do método de difusão em disco ....... 52
Tabela 15: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P.
halepensis no crescimento de Escherichia coli através do método de difusão em disco ....... 53
Tabela 16: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P.
halepensis no crescimento de Bacillus pumilus através do método de difusão em disco ...... 54
Tabela 17: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P.
halepensis no crescimento de Lactobacillus casei através do método de difusão em disco; 55
Tabela 18: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P.
halepensis no crescimento de Saccharomyces cerevisiae através do método de difusão em
disco...................................................................................................................................................... 57
Tabela 19: Condições operatórias usadas nos ensaios de microdiluição para Bacillus subtilis ............ 59
Tabela 20: Coeficientes de transferência de massa e respetivo desvio padrão para a
extração do óleo volátil de P. halepensis nas diferentes condições .......................................... 64
Tabela 21: Cálculo do coeficiente de transferência de massa externa usando a correlação
empírica proposta por Wakao e Kaguei [52] .................................................................................. 64
xxi
Tabela 22:Determinação do diâmetro de partícula de P. halepensis depois da sua trituração
e distribuição da mesma pelos diferentes peneiros com diferentes diâmetros ........................ 76
Tabela 23: Determinação da densidade aparente de P. halepensis .......................................... 76
Tabela 24: Dados para o cálculo das diferentes concentrações de óleos e de solvente para a
obtenção de uma concentração final de 60mg/mL ....................................................................... 77
Tabela 25: Determinação do rendimento da hidrodestilação com folhas de P. halepensis ................. 78
Tabela 26: Medições efetuadas e rendimentos obtidos na Extração com CO2 Supercrítico para a
obtenção do óleo volátil de P. halepensis ............................................................................................. 81
Tabela 27: Média dos valores de poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE
estudadas .............................................................................................................................................. 82
Tabela 28: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para o
poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE ................................................ 83
Tabela 29: Média dos valores de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE
estudadas .............................................................................................................................................. 84
Tabela 30: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para o
teor de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE .................................................. 84
Tabela 31: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus subtilis e respetivos desvio
padrão e erros; ...................................................................................................................................... 85
Tabela 32:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para
Bacillus subtilis; ..................................................................................................................................... 86
Tabela 33: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Escherichia coli e respetivos desvio
padrão e erros; ...................................................................................................................................... 86
Tabela 34: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para
Escherichia coli; ..................................................................................................................................... 87
Tabela 35: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus pumilus e respetivos desvio
padrão e erros; ...................................................................................................................................... 87
Tabela 36: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para
Bacillus pumilus; .................................................................................................................................... 88
Tabela 37:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Lactobacillus casei e respetivos
desvio padrão e erros; ........................................................................................................................... 88
Tabela 38: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para
Lactobacillus casei; ................................................................................................................................ 89
Tabela 39:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de saccharomyces cerevisae e
respetivos desvio padrão e erros; ......................................................................................................... 89
Tabela 40:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para
saccharomyces cerevisae; ..................................................................................................................... 90
Tabela 41: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação ................................................................. 90
Tabela 42: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 2,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação ................................................................. 91
Tabela 43: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 1mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação ................................................................. 91
xxii
Tabela 44: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 0,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação ................................................................. 91
Tabela 45: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra após centrifugação ....................................................................... 92
Tabela 46: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 2,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra após centrifugação ....................................................................... 92
Tabela 47: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 1mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra após centrifugação ....................................................................... 92
Tabela 48: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com
uma concentração de 0,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo
negativo e absorvância da amostra após centrifugação ....................................................................... 93
Tabela 49: Dados para o cálculo do kf teórico tendo em conta o método de Wakao e Kaguei ........... 93
xxiii
1
Objetivos 1.
Este trabalho pretende estudar a planta Pinus halepensis proveniente da Tunísia, tendo em
conta:
i) Análise de diferentes métodos extrativos convencionais como a hidrodestilação em
Clevenger; solventes orgânicos em Soxhlet e métodos extrativos não convencionais
como a extração supercrítica e microondas a partir das suas folhas;
ii) Determinação e comparação dos diferentes rendimentos dos métodos;
iii) Identificação dos principais compostos presentes nos óleos por GC-FID e GC-MS;
iv) Avaliação das propriedades antioxidantes por DPPH;
v) Avaliação do teor de Polifenóis pelo método Folin-Ciocalteu;
vi) Avaliação das propriedades antimicrobianas e antifúngicas;
vii) Modelação do processo de extração com CO2 supercrítico.
Espera-se com este trabalho aumentar o conhecimento da composição e das propriedades
da planta Pinus halepensis da família Pinacacea e ainda potenciar as aplicações dos seus extratos.
2
3
Introdução 2.
O uso de plantas (inteiras ou as suas folhas, cascas, sementes e resinas) é tão antigo quanto
a história da humanidade, sendo utilizadas pelo homem como alimento, medicamento, na construção
de abrigos e até mesmo no seu aquecimento. Os efeitos benéficos para a saúde humana associados
ao uso de plantas, assim como dos seus óleos essenciais ou extratos, têm sido conhecidos desde a
antiguidade. [1]
Desde há 5000 anos que as plantas aromáticas são submetidas a processos de destilação
entrando em receitas de bálsamos, poções e em técnicas de prevenção e tratamento de doenças.[2]
Existem relatos do uso destas plantas pelos hindus e pelos egípcios em 2000 a.C.[1] Os egípcios
utilizavam os óleos essenciais, provenientes da destilação das plantas, em massagens para
embelezar e proteger a pele do clima árido e para embalsamar os mortos, mostrando que conheciam
as suas propriedades antissépticas. Estes conhecimentos foram-se difundindo de geração em
geração e as técnicas da extração destes óleos foram-se aperfeiçoando. Foi somente durante os
séculos XVI e XVII que os óleos essenciais tiveram as suas primeiras aplicações e sua introdução no
comércio. Posteriormente a aromaterapia cresceu rapidamente ao redor do mundo. O termo
"aromaterapia" teria sido criado por um químico francês, Maurice René de Gattefossé em 1937, que
após ter queimado as mãos as colocou, acidentalmente, num tanque que continha óleo essencial de
lavanda, pensando que fosse água. Para sua surpresa a dor passou e a cicatrização do ferimento
ocorreu sem infeção. A partir deste evento passou a investigar as atividades terapêuticas dos óleos
essenciais, que eram até então apenas usados como odorizantes e em produtos cosméticos.[3]
Atualmente tem-se verificado um interesse crescente pelos compostos bioativos das plantas,
nomeadamente os óleos essenciais, devido à ideia, generalizada, de que os produtos naturais
apresentam menor toxicidade e efeitos colaterais relativamente aos produtos sintéticos. [4]
Os óleos essenciais têm na sua constituição substâncias com um elevado valor comercial e
por isso possuem grande interesse industrial. Devido à sua importância e ao aumento do seu uso tem
havido um maior interesse, no meio científico, de desenvolver novos produtos e de comprovar as
suas propriedades como moléculas biologicamente ativas. Atualmente existem diversos trabalhos que
analisam e comparam as composições químicas dos óleos essenciais obtidos das mais diversas
fontes vegetais. Estes trabalhos, geralmente, são baseados em pesquisas a nível laboratorial usando
uma grande diversidade de espécies de plantas aromáticas e promovendo o desenvolvimento de
novos métodos para obtenção destes óleos essenciais com um elevado rendimento. [5]
O género Pinus pertence à família Pinacacea e ocorre naturalmente no hemisfério norte e têm
sido plantadas em algumas regiões do hemisfério sul. As propriedades medicinais e aromáticas dos
seus compostos químicos (nomeadamente resinas, óleos essenciais, terebentina, etc.) tornam-nas
numa das plantas mais importantes em toda a civilização. [6] O género Pinus é um género produtor
4
de madeira utilizado como matéria-prima para a produção de celulose e papel de qualidade superior,
chapas, laminados, móveis, tábuas ou ainda na construção de casas, caixotarias e pellets. Também
produz resinas cuja sua parte sólida é utilizada na produção de colas, vernizes, tintas e adesivos e a
fase líquida usada na indústria de solventes, fungicidas e germicidas.[7] Para além disso, este género
possui compostos voláteis, designados por óleos essenciais, que têm despertado, recentemente,
algum interesse devido à possibilidade do seu uso como aditivo natural para a substituição de
agentes antimicrobianos sintéticos por naturais e por possuir diferentes propriedades
farmacológicas.[6],[8]
No norte da bacia do mediterrâneo, Pinus halepensis é uma espécie pioneira e expansionista
que coloniza terrenos agrícolas abandonados caracterizados por uma elevada biodiversidade. Devido
à riqueza dos seus metabólitos secundários (terpenos, compostos fenólicos,..), P. halepensis pode
desempenhar um papel importante na sucessão de plantas através de vários processos. Por
exemplo, os compostos secundários podem afetar os simbiontes das raízes e a qualidade do local,
interferindo na decomposição, mineralização e humidificação.[6]
Vários estudos têm sido realizados em diversos países, nomeadamente relacionados com a
análise de compostos voláteis das agulhas de várias espécies de Pinus, mais especificamente os de
P. halepensis. A maioria destes ensaios foram feitos com espécies de P. halepensis provenientes da
América do Norte, e um número limitado de espécies do Mediterrâneo. Pesquisas em óleos
essenciais de espécies de Pinus encontram-se descritos uma vez que estes apresentam
propriedades terapêuticas, nomeadamente atividades antimicrobiana, antioxidante e herbicida. Estes
óleos também são usados como fragrâncias em cosméticos e aditivos aromatizantes para bebidas e
alimentos. Várias análises fitoquímicas de P. halepensis foram publicadas em terpenos, turpentina e
compostos fenólicos. A literatura relata alguns trabalhos sobre a composição química dos óleos
essenciais de P. halepensis provenientes de Itália, Argélia, Grécia, Marrocos e Turquia. [9],[8] [6]
Para que se possa desenvolver e explorar o potencial fitoquímico, farmacológico e agrotóxico
de P. halepensis é necessário que seja feito o estudo dos seus extratos bem como uma análise dos
seus componentes.
5
Revisão da Literatura 3.
3.1 Plantas Aromáticas e Medicinais
A expressão “Plantas Aromáticas e Medicinais - PAM” é utilizada indistintamente, como forma
de designar um grupo de plantas que se distinguem pelos seus fins e características. [10] São
consideradas PAMs, todas aquelas que podem ser usadas na cura ou prevenção de doenças, na
alimentação como conservante, aromatizante ou em cosmética e perfumes. As PAMs permaneceram
como principais agentes farmacêuticos até meados do século XX. Ao logo do século XX verificou-se
uma diminuição drástica da procura de PAMs. Esta diminuição está relacionada com a inovação
tecnológica e consequente desenvolvimento de produtos químicos sintéticos, que tiveram uma rápida
aceitação no mundo ocidental com desvalorização do uso de plantas em tratamentos. Porém a partir
de 2003 a procura aumentou devido, sobretudo, às alterações da consciência crítica humana
relativamente aos medicamentos de síntese química e aos benefícios de produtos bioativos à base
de plantas. Hoje em dia há uma maior procura de medicamentos à base de extratos vegetais, levando
a um maior investimento em estudos científicos, que envolvem a investigação das propriedades
terapêuticas das plantas. [11]
Cerca de 70% a 95% dos habitantes dos países em desenvolvimento, “principalmente, na
Ásia, África, América Latina e Médio Oriente”, utilizam-nas para os cuidados de saúde primários,
como apoio aos medicamentos tradicionais. Em alguns países desenvolvidos, o uso de medicação
tradicional é igualmente significativa, sendo cada vez mais utilizados no tratamento, prevenção e
manutenção da saúde pessoal, pois oferece benefícios terapêuticos e tratamentos mais
acessíveis.[12]
Na sua composição podem apresentar substâncias biologicamente ativas, tais como
saponinas, taninos, óleos essenciais, flavonoides, alcaloides e outros compostos complexos, com
propriedades curativas e que usualmente são encontrados nas mesmas como metabolitos
secundários. [12] A importância das plantas aromáticas e medicinais para produtos farmacêuticos,
indústrias de alimentos e fragrâncias é em parte devido a uma pequena fração, o óleo essencial.
Dependendo do método de extração usado, a composição do óleo essencial pode mudar levando a
desvios do odor natural da planta. [13] Devido à sua composição, têm sido utilizadas como fontes de
agentes terapêuticos através: i) do isolamento de compostos bioativos para o uso direto como drogas,
como por exemplo a digoxina, taxol e a morfina; ii) para a produção de compostos bioativos com
diferentes estruturas que permitam a síntese de compostos de entidades patenteáveis de maior
atividade ou de menor toxicidade; iii) para utilização como ferramentas farmacológicas; e iv) aplicação
da planta ou de algumas partes desta como medicamento.[12]
A Organização Mundial de Saúde (OMS) tem estimulado a utilização de plantas medicinais e
publicado vários relatórios com normas e guias de conservação, investigação e avaliação da
segurança e eficácia, controlo de qualidade, seleção de plantas medicinais e normas de
6
recomendação. Desta forma têm vindo a surgir cada vez mais produtos à base de plantas com
utilização em diversos sectores, nomeadamente na culinária, medicamentos, aromaterapia e
medicinas alternativas. [11]
Atualmente, as plantas aromáticas e medicinais têm um papel importante na indústria
cosmética, alimentar e farmacêutica. No entanto, existem informações sobre plantas medicinais que
ainda são desconhecidas e sendo estas uma fonte de compostos bioativos para a produção de novos
fármacos, é necessário investir na investigação para identificação destes constituintes ativos. [12]
3.2 Óleos Essenciais
Mais de 2000 espécies de plantas, de 60 famílias diferentes, permitem obter óleos essenciais
mas apenas cerca de 100 espécies são a base para a produção de óleos essenciais de importância
económica em todo o mundo. [4]
Os óleos essenciais, aroma ou essência, são os princípios odoríferos voláteis, produzidos
pelas plantas e são utilizados desde a antiguidade não só pelas suas propriedades medicinais
(antimicrobianas e antioxidantes), mas também pela sua importância na indústria de perfumes e
sabores. [4]
Os óleos essenciais são, em geral, uma mistura de compostos com características físico-
químicas próprias que quando combinadas, conferem ao óleo um odor particular. Estes possuem na
sua composição compostos naturais complexos e voláteis – os compostos terpénicos – que são
metabolitos secundários das plantas. Sendo misturas naturais muito complexas os óleos essenciais
podem conter cerca de 20-60 componentes em concentrações muito diferentes (Figura 1). [14]
Normalmente um óleo essencial é caracterizado por dois ou três componentes principais, em
concentrações bastante elevadas, em comparação com outros componentes, que por vezes estão
presentes em quantidades vestigiais. Geralmente, esses componentes principais determinam as
propriedades biológicas de determinado óleo essencial. Os monoterpenos são as moléculas mais
representativas de alguns óleos essenciais (às vezes constituindo cerca de 90 %). Já os
sesquiterpenos são uma grande família de produtos naturais que desempenham importantes papéis
ecológicos nas interações com os insetos e os microrganismos, pois atuam como atrativos ou
repelentes. Além disso estes compostos são os principais componentes de muitos óleos essenciais,
que são importantes comercialmente para as indústrias de aromas e fragrâncias. [4]
7
Figura 1: Constituintes dos óleos essenciais (Fonte: [[14]])
O tipo de material vegetal (folhas, caules, flores ou raízes), bem como o estádio de
desenvolvimento do órgão são dois fatores determinantes para a sua composição. Para cada espécie
em particular é importante escolher as melhores variedades e realizar um estudo detalhado sobre as
condições de cultivo, colheita e armazenamento, temperatura, tempo de destilação, produção de
biomassa e rendimento e qualidade do óleo essencial obtido. [14]
3.3 Género Pinus
O gênero Pinus pertence à família Pinacacea e compreende cerca de 250 espécies. É o
maior gênero de coníferas que ocorre naturalmente na região Mediterrânea, Caribe, Ásia, Europa,
América do Norte e América Central.[15]
São árvores perenes e resinosas que crescem até 3-80m de altura. Têm casca cinzenta
escura, frequentemente avermelhada, profundamente fissurada e áspera. As suas folhas são
apresentadas em grupos de 20-30 folhas que persistem em média um ano e meio. Apresentam
também flores masculinas com cerca de 1,5 cm de comprimento, dispostas em forma de cones. Os
pinheiros têm quatro tipos diferentes de folhas. As mudanças começam em primeiro lugar com um
verticilo de 4-20 folhas de sementes, seguidamente surgem folhas juvenis em plantas jovens com 2–
6 cm de comprimento de cor verde ou verde azulada arranjadas em espiral no broto. Estas são
posteriormente substituídas por folhas protetoras pequenas e não fotossintéticas a partir das folhas
8
juvenis. Por fim as folhas protetoras dão origem a folhas adultas em forma de agulha, verdes e
enfaixadas em grupos de 2 a 5 agulhas. [7], [15]
O género Pinus possui diferentes propriedades farmacológicas e é amplamente utilizado na
prática terapêutica tradicional e como aditivo alimentar tendo uma elevada importância econômica.[8]
As suas agulhas apresentam propriedades anti-envelhecimento e anti-inflamatórias. Já as suas folhas
têm sido usadas para doenças do fígado, doenças de pele e hipertensão.[7]
Pinus é representado na Turquia por cinco espécies; nomeadamente P. brutia Tenore
(pinheiro turco), P. halepensis Mill (pinheiro de Alepo), P. nigra (pinheiro preto europeu), P. pinea L.
(pinheiro manso) e P. sylvestris L. (Pinheiro silvestre). [15]
3.3.1 Pinus halepensis
Pinus halepensis Mill pertence ao gênero Pinus da família Pinaceae. É a maior e mais
importante representante do género Pinus. A sua extensão continental estende-se do norte de África
(Marrocos, Argélia, Tunísia e Líbia) e Oriente Médio (Síria, Líbano, Jordânia, Palestina e Turquia) até
o sul da Europa Mediterrânea (Grécia Oriental, Croácia, norte de Itália, leste de França e leste de
Espanha).[16]
P. halepensis é conhecida pelas suas propriedades medicinais, bem como pela sua
importância econômica.[16] É usada para a produção de madeira e resina. A sua madeira é estável
mesmo com elevada humidade pelo que é usada para fins de construções, fabricação de móveis e
em menor escala para a fabricação de celulose e papel.[9]
Figura 2:Pinus halepensis Mill
9
Tabela 1: Classificação Científica de Pinus halepensis Mill; (Fonte: [17])
Reino
Plantae
Divisão
Spermatophyta
Sub- Divisão
Coniferophytina
Classe
Pinatae
Sub-Classe
Pinidae
Ordem
Pinales
Família
Pinaceae
Género
Pinus
Espécie
Pinus halepensis Mill
Nome Comum
Pinheiro-de-Alepo
3.3.1.1 Discrição Botânica
Pinus halepensis é uma árvore com cerca de 15 m de altura, resinosa com o tronco mais ou
menos tortuoso, copa sub-arredondada e ramos glabros. Possui 20 a 30 folhas em cada verticilo com
duração de mais ou menos 2 anos. Estas folhas estão agrupadas nas pontas dos ramos como
“pincel”, delgadas, primeiramente de cor azul-acinzentada e depois verde-escura, com 5-14 cm de
comprimento, com seção mais ou menos semilunar, ápice agudo e canais resiníferos junto da
superfície (Figura 3 - 1). Já o fruto tem a forma de um cone. (Figura 3 - 2). Os cones novos
apresentam uma cor verde-amarelada e os cones maduros uma cor acastanhada brilhante. Estes têm
cerca de 5-14 cm de comprimento e cerca de 3 cm de diâmetro, geralmente solitários, persistentes e
ovado-cônicos. Sobre o pedúnculo robusto, apontado para trás, com 1-2 cm de comprimento,
possuem escamas oblongas, mais ou menos angulosas com um disco pouco saliente e um múcron
ligeiramente saliente (Figura 3-3). As suas sementes são escuras, com cerca de 6 mm de
comprimento e ovado-oblongas e podem ser armazenadas por vários anos em embalagem
herméticas num lugar seco e frio. A germinação é sem pré-tratamento dentro de 15-30 dias. Não
precisa de micorrizas e podem ser plantadas diretamente no lugar definitivo ou em sacos plásticos
(Figura 3-4). [18]
Cresce relativamente bem em terrenos pobres de montanhas. Embora seja uma árvore de
fácil adaptação ao meio ambiente, não tolera climas extremamente frios e solos húmidos. Cresce
bem em climas com 400-800 mm de precipitação durante inverno, com 5-6 meses de seca, com
temperaturas de 2-34 °C e em altitudes de 1'500-2'500 m. Aguenta solos de textura ligeira até média
10
e com boa drenagem. É resistente ao frio, ao vento salgado e à seca e é moderadamente tolerante
ao fogo.[18]
Figura 3: Representação das folhas (1), flores (2), frutos (3) e sementes (4) de P. halepensis
3.3.1.2 Importância do Pinheiro de Alepo e suas Aplicações
O pinheiro de Alepo tem vários papéis ecológicos, socioeconômicos, terapêuticos e culinários.
A sua madeira tem um peso específico de 0,50-0,53 kg e tem uma durabilidade moderada. A
sua secagem e preservação é fácil pelo que pode ser utilizada para construções em geral e caixas.
Os troncos servem para postes de construção, para cercas e para lenha. É uma árvore resinosa que
é plantada muitas vezes para fins de proteção devido à forma do seu tronco. [18]
Este pinheiro possui óleos essenciais aromáticos que são um dos grupos mais importantes
dos componentes farmacologicamente ativos. São produzidos a partir do seu metabolismo
secundário e podem ser utilizados como aditivo alternativo em alimentos, bebidas, produtos
farmacêuticos, em preparações cosméticas e em produtos domésticos. [7]
Os principais componentes dos óleos essenciais de P. halepensis relatados na literatura
estão presentes na seguinte Tabela 2. [6]
1 2
3 4
11
Tabela 2: Principais componentes dos óleos essenciais de P. halepensis de diferentes origens reportados da literatura de
agulhas, botões e galhos; (Fonte: [[6]])
Origem da
Planta Argélia Grécia Itália Marrocos Turquia
Sítio Ghazaouet Saida Sidi
Feradj Tissemsilt Djefa
Método de
Extração HD HD HD HD HD HD HD HD HD HD HD HD
Compostos % % % % % % % % % % % %
α-Pineno Nd 6,4 1,2 6,7 17,6 13,4 18,1 8,5 23,3 47,1 18,4 16,4
Sabineno Nd 0,7 1,2 7,0 2,6 1,3 9,4 6,1 3,7 Nd 0,1 0,6
β-Pineno Nd 5,6 0,2 2,0 1,6 1,1 2,0 1 3,1 2,8 46,8 18,7
Mircene Nd 0,5 3,1 8,7 3,2 6,6 27,9 1 16,3 6,3 1,3 3,8
3-Carene Nd 0,4 0,2 0,1 1,9 6,9 1,7 12,5 Nd 1,7 0,9 16,3
ρ-Cimeno Nd Nd Nd 0,3 3,0 Nd 1.1 1,0 0,7 0,4 Tr 0,1
Limoneno Nd 0,1 Tr 0,8 0,1 5,0 1.1 11,4 1,3 0,8 2,3 18,7
Terpinolene Nd 2,4 Nd Nd Nd Nd Nd 1,0 Nd Nd 0,3 1,8
Terpinen-4-ol 0,4 0,6 Tr Nd 0,6 0,7 Nd Nd 3,8 Nd Nd Nd
α-terpinolene Nd Nd 0,1 0,2 Tr 3,1 9,9 Nd 10,1 1 Nd Nd
E-β-cariofileno 3 Nd Nd 7,1 2,7 Nd Nd Nd Nd 11,2 9,2 9,5
α-humulene 0,74 10,5 7,9 2,8 1,4 3,4 2,9 Nd 3,2 2,7 1,8 1,8
Isovalerato de
2-feniletilo Nd Nd Nd 7,4 8,4 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd
Germacreno D Nd 0,8 0,5 0,2 Tr 0,5 0,1 Nd Nd tr 8,8 1,5
Óxido de
cariofileno 48,2 Nd Nd Nd Nd Nd 0,1 Nd 1,2 7,8 0,4 0,4
Bulnesol Nd Nd Nd Nd Nd 7,6 Nd Nd Nd Nd Nd Nd
Z-β-cariofileno Nd 25 40,3 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd
Aromadendeno Nd 5,4 7,1 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd
Óxido de
humuleno 6,7 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd
Thumbergol 8,3 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd
Nd-compostos não detetatos; tr- vestígios (>0,05%);
As diferenças encontradas na composição do óleo de P. halepensis coletada nos diferentes
países pode ser explicada pelo clima e condições do solo. [7],[19]
Tabela 3:Rendimentos e propriedades físico-químicas do óleo essencial das agulhas, cones e hastes de P.
halepensis provenientes da Tunísia; (Fonte: [9])
Órgãos Rendimento
(%)
Índice de
refração
Índice de
Acidez
Densidade Cor
Agulhas 0,85 ± 0,003 1,48 ± 0,0 1,76 ± 0,020 0,83 ± 0,0 Amarelo
Cones 0,80 ± 0,001 1,47 ± 0,0 2,40 ± 0,018 0,89 ± 0,0 Amarelo
Hastes 0,60 ± 0,005 1,48 ± 0,0 1,87 ± 0,001 0,87 ± 0,0 Transparente
12
Tendo em conta os diferentes órgãos foram até à data identificados 58 compostos nos óleos
provenientes das agulhas, 57 nos óleos provenientes dos cones e cerca de 27 nos óleos proveniente
das hastes. Dos 67 componentes identificados α-Pineno e β-Carofileno foram aqueles que foram
encontrados em maior quantidade em Argélia. Tendo em conta a Tabela 4 e considerando os
diferentes grupos de compostos, as hastes e os cones são constituídos na sua maioria por
hidrocarbonetos monoterpénicos (80,09% e 78,22% respetivamente) enquanto os monoterpenos
oxigenados e os hidrocarbonetos sesquiterpénicos estão presentes em menores quantidades. Por
outro lado, os hidrocarbonetos monoterpénicos (42,80%) e os hidrocarbonetos sesquiterpénicos
(48,29%) formam, em conjunto, a porção principal do óleo presente nas agulhas. [6]
Tabela 4: Identificação de diferentes grupos de compostos em diferentes órgãos de P. halepensis provenientes da Tunísia;
(Fonte:[6])
Agulhas Caules Hastes
Total identificado (%) 97,56 99,87 97,43
Hidrocarbonetos Monoterpénicos (%) 42,80 78,22 80,09
Monoterpenos Oxigenados (%) 1,31 3,08 1,13
Hidrocarbonetos Sesquiterpénicos (%) 48,29 15,82 6,42
Sesquiterpénicos Oxigenados (%) 5,16 2,75 9,78
A potencial atividade como herbicida de óleos essenciais do organismo de P. halepensis foi
avaliada através dos seus efeitos na germinação e crescimento de plântulas de S. arvensis, L.
rigidum e R. raphanistrum. Os resultados obtidos mostraram que os óleos essenciais de agulha, cone
e hastes inibiram completamente a germinação e o crescimento das plântulas de todas as plantas
daninhas testadas. [6] De igual modo a atividade antibacteriana, antifúngica e herbicida dos óleos
essenciais de P. halepensis foram em parte estudados. [6]
Os óleos essenciais isolados de agulhas, cones e caules de P. halepensis foram também
testados quanto à sua atividade antifúngica contra diversas estirpes. Os resultados da atividade
antifúngica mostraram ser significativamente reduzidos. Assim, parece que os óleos essenciais de P.
halepensis têm mais atividade bioherbicida do que biofungicida. [6]
Como uma fonte potencial de antimicrobianos de origem natural, os óleos essenciais foram
avaliados quanto aos seus efeitos inibitórios do crescimento de microrganismos patogênicos
(bactérias Gram-positivas e Gram-negativas). Foram registadas inibição contra diversos tipos de
bactérias nomeadamente L. monocytogenes, K. pneumoniae, E. faecalis, Acinetobacter baumanii. Por
outro lado mostrou-se ineficaz contra S. aureus, B. cereus, E. coli, Salmonella typhimurium e Proteus
mirabilis. Estes resultados mostram a possibilidade destes óleos apresentarem uma boa inibição
contra alguns microorganismos. [6]
13
3.4 Métodos de Extração
3.4.1 Extração Supercrítica com CO2
Devido ao elevado interesse da obtenção de produtos naturais biologicamente ativos, a
comunidade científica tem vindo a desenvolver tecnologias voltadas para o processo de extração
destes compostos. [20], [21], [22], [23]
De entre as tecnologias implementadas, a extração supercrítica proporciona a obtenção de
produtos isentos de resíduos tóxicos e de qualidade elevada quando comparadas aos produtos
obtidos por técnicas convencionais. [24], [25], [26]
O óleo obtido por esta técnica inovadora é atualmente designado por óleo volátil para o
distinguir do óleo essencial, o qual é por definição produzido principalmente pelas técnicas de
hidrodestilação e destilação por arrastamento de vapor.
Os processos de extração supercrítica consistem na separação de substâncias solúveis de
uma matriz sólida por contacto com um solvente que se encontra a temperaturas e pressões acima
do seu ponto critico. O ponto crítico de uma substância pura é definido como o ponto de diagrama de
fases onde termina a curva de equilíbrio líquido vapor e o menisco separando ambas as fases
desaparece e somente uma fase simples ocorre. Acima deste ponto temos apenas um fluido
homogéneo designado por
fluido supercrítico. [27]
Figura 4: Diagrama de fases pressão-temperatura de substâncias pura; (Fonte:[28])
A Figura 4 representa um diagrama de pressão e temperatura para substâncias puras. A
região no diagrama P-T acima da Pc e da Tc é chamada de região supercrítica. Nesta região, o fluido
supercrítico tem características termofísicas intermédias. Fluidos nestas condições supercríticas
exibem maior poder de solubilização e propriedades de transporte que aumentam as capacidades de
extração. Em particular, os fluidos supercríticos têm uma viscosidade menor e uma difusividade maior
Região
Supercrítica Líquido Sólido
Gás
Ponto Crítico
Pre
ssão
Temperatura
14
que os solventes líquidos. Portanto, eles podem penetrar os poros do material sólido mais
eficientemente do que os solventes líquidos. Diferentes substâncias têm diferentes pressões e
temperaturas críticas. Estas propriedades são importantes na seleção do fluido apropriado e as
condições de operação para qualquer aplicação em processos de SFE. [28]
Este processo consiste em duas etapas: a extração e a separação do extrato do solvente. Na
extração, o solvente supercrítico flui através de um leito fixo de partículas sólidas e dissolve os
componentes extraíveis do sólido. O solvente é alimentado no extrator e distribuído uniformemente na
entrada do leito fixo. O solvente e os componentes solúveis saem do extrator e alimentam o
separador onde se separam os produtos do solvente supercrítico. O método mais simples para a
regeneração do solvente consiste na redução da densidade por expansão, visto que a baixas
densidades o poder de solubilização do solvente diminui e os produtos precipitam. [20] O material
vegetal antes de ser submetido ao processo de extração é moído (triturado ou pulverizado) para
aumentar a área de superfície e promover uma boa mistura com o solvente, o que facilita o processo
de obtenção dos produtos naturais e aumenta a velocidade de extração. Por vezes, é sujeito
previamente a processos de pré-tratamento, como a secagem, de modo a evitar a sua degradação
por impurezas, microrganismos e exposição ao ar. [12]
Diversas substâncias foram utilizadas como fluidos supercríticos (FSC) nomeadamente o
etano, propano, butano, pentano, óxido nitroso, amoníaco, éter dimetílico, triflucrometano, água e
dióxido de carbono.[12] O solvente supercrítico de maior aplicabilidade é o dióxido de carbono por ser
não tóxico, de baixo custo, relativamente inerte do ponto de vista químico, e por apresentar condições
criticas (Tc=31,1ºC e Pc=72,9 bar) proporcionando temperaturas de processamento baixas e evitando
a degradação de produtos de alto valor acrescentado, características de interesse para as áreas de
alimentos, fármacos e de cosméticos. Finalmente, devido a ser uma molécula não polar, o CO2 é um
mau solvente de compostos polares contudo, através da adição de um composto polar, designado
por co-solvente, compostos polares podem também ser extraídos. O etanol e a água são os co-
solventes mais utilizados. [20]
A SFE usando dióxido de carbono é um método particularmente adequado para a extração de
materiais naturais a partir de plantas medicinais e aromáticas. A utilização destes processos
tecnológicos, comparativamente a outros métodos de extração convencionais permite: i) a utilização
de pequenas quantidades de amostra e de solventes orgânicos para extração; ii) a aplicação de CO2
supercrítico que não deixa resíduos prejudiciais no extrato; iii) a utilização de temperaturas mais
baixas e a ausência de ar possibilitam a conservação de estruturas dos compostos bioativos
presentes na planta. Escolhendo a pressão e temperatura ótimas, é possível precipitar os compostos
indesejáveis no primeiro separador e o óleo volátil no segundo. Outros parâmetros como tamanho de
partícula, tempo de extração e taxa de solvente influenciam o rendimento do processo e a qualidade
do óleo obtido. Todos estes parâmetros devem ser levados em conta para adquirir um conhecimento
completo do processo. [12], [27]
15
3.4.2 Hidrodestilação
A hidrodestilação é um método tradicional para a extração de compostos bioativos e de óleos
essenciais das plantas. [29] Existem três tipos de hidrodestilação: com imersão em água, com
imersão em água e injeção de vapor, e com injeção direta de vapor. Na hidrodestilação, o material
vegetal é imerso em água sob aquecimento até à fervura, resultando na formação de vapores que
arrastam os compostos voláteis, os quais, após condensação, se separam da fase aquosa por
decantação. A hidrodestilação envolve três processos físico-químicos principais: Hidrodifusão,
hidrólise e decomposição por calor. [30]
É um processo versátil que pode ser usado para pequenas ou grandes indústrias. A
hidrodestilação utilizando o aparelho Clevenger é o método oficial AOAC para a análise de óleos
voláteis e de especiarias. Vários investigadores usaram esta técnica para obter óleos essenciais de
diferentes fontes de plantas.[31] No entanto esta técnica tem algumas desvantagens como
modificações químicas e alteração da qualidade dos óleos essenciais e ainda perda de alguns
componentes voláteis devido às elevadas temperaturas de extração. Essa desvantagem limita o seu
uso para extração de compostos termolábeis.[32]
3.4.3 Microondas
A tecnologia de microondas tem sido recentemente aplicada para a extração de compostos
orgânicos. A extração por microondas tem vindo a ganhar destaque por apresentar um elevado
rendimento de produto extraído, curto tempo de extração e redução dos resíduos gerados. As
técnicas convencionais para a extração de matrizes sólidas consomem muito tempo e solventes e a
análise de numerosas amostras é limitada pela etapa de extração. O desenvolvimento de microondas
no campo da extração de compostos orgânicos ocorreu devido à necessidade de um método rápido,
seguro e barato para o estudo de um grande número de amostras. [33], [34]
Por favorecer, com maior precisão, o controle das condições do procedimento experimental
como tempo, temperatura e agitação magnética permite trabalhar em sistema fechado com frascos
vedados hermeticamente o que evita possíveis degradações térmicas e oxidação do material, por
exemplo. [33]
A extração assistida por microondas usa a energia proveniente de microondas para aquecer
solventes de forma rápida e eficiente. A matriz da planta já contém uma quantidade significativa de
água que absorve fortemente energias microondas o que causa o rompimento da célula, devido a um
superaquecimento interno, facilitando o processo de extração. Além disso a migração de iões
dissolvidos aumenta a penetração do solvente na matriz e consequentemente o rendimento de
extração.[35]
16
A radiação microondas possui uma frequência de 300-300000 MHz que provoca movimento
das espécies em solução pela migração de iões e/ou rotações de dipolo, causada pelo elevado
número de alterações do campo eletromagnético. Este mecanismo de aquecimento induzido vem da
interação entre as moléculas de solvente e da radiação eletromagnética gerada pelas microondas.
[35]
A utilização desta técnica tem-se mostrado promissora em diversos ramos industriais e
científicos. Este método possui certas vantagens como promover aquecimentos espacialmente
uniformes em menores intervalos de tempo, além de poder efetuar aquecimentos de forma seletiva,
dependendo de certas propriedades físico-químicas do material. Outra vantagem do processo é a
possibilidade da não utilização de solventes orgânicos ambientalmente agressivos. Em decorrência
dessas propriedades singulares, este método apresenta aplicação em processos como a dissolução
de soluções analíticas, no isolamento de analitos orgânicos, no pré-tratamento de amostras para
análises cromatográficas, na síntese de uma ampla gama de compostos orgânicos, na vulcanização
de borracha, no processamento de cerâmicos, na sinterização e na obtenção de óleos essenciais e
extratos vegetais. [36]
3.4.4 Sohxlet
De entre as metodologias de extração a quente, destaca-se a feita em equipamento tipo
Soxhlet. O primeiro aparelho foi desenvolvido por Franz Von Soxhlet em 1879 que ressaltou a
importância do grau de trituração da amostra quanto à duração e eficácia do processo. No processo
de liberação extrativa, têm-se em conta três etapas principais: a penetração do solvente no tecido; a
formação de uma micela intracelular e, a difusão do extrato na micela externa. Este método de
extração consiste no tratamento sucessivo e intermitente da amostra imersa num solvente puro (éter
de petróleo, éter dietílico ou n-hexano), devido à sifonagem e posterior condensação do solvente
aquecido dentro do balão que está na base do aparelho. [37] Este método possui vantagens e
desvantagens. Os principais inconvenientes que o método de Soxhlet apresenta são o tempo
requerido para a extração e o grande volume de solvente utilizado, o qual não é somente de alto
custo, mas também pode ser nocivo à saúde e ao meio ambiente. Já as principais vantagens que
apresenta são a amostra estar sempre em contato com o solvente, havendo a sua constante
renovação, a temperatura do sistema manter-se relativamente alta, visto que o calor aplicado para o
processo de evaporação é constante, é uma metodologia muito simples que não requer formação
especializada e que possibilita a extração de uma maior quantidade de óleo em relação a outros
métodos, sem a necessidade de filtração da micela após o término da extração, uma vez que a
amostra se encontra envolta num cartucho durante todo o procedimento. [37], [38]
17
3.5 Identificação dos principais componentes
3.5.1 Cromatografia
Entre os métodos de separação, a cromatografia tem grande aplicabilidade em áreas tão
diversas como ambiental, farmacêutica, análises clínicas, medicina legal e outras. A cromatografia
permite separar e quantificar componentes com características físico-químicas muito semelhantes,
tais como dioxinas e furanos, em misturas complexas. O limite de deteção obtido pela cromatografia
pode ser cerca de 100 a 1000 vezes menor que aquele obtido por outros métodos de separação. [39]
O processo de separação ocorre através da distribuição dos componentes da amostra entre
duas fases: uma fase fixa de grande área superficial (fase estacionária), que é percolada por um
fluido (fase móvel) numa direção definida. A fase móvel pode ser um gás inerte, um líquido ou um
fluido supercrítico, dependendo do tipo de cromatografia utilizada. A fase estacionária deve ser
imiscível com a fase móvel, podendo ser colocada numa coluna ou depositada numa superfície plana.
A fase móvel e a fase estacionária são escolhidas de modo a que os componentes da amostra se
distribuam entre elas de modo distinto. Os analitos fortemente retidos pela fase estacionária movem-
se mais lentamente na fase móvel e consequentemente são eluídos após os componentes com baixa
interação com a fase estacionária. Essa retenção seletiva dos componentes da amostra pela fase
estacionária é uma característica que resulta em migrações diferenciadas dos compostos de
interesse. De acordo com o estado físico da fase móvel utilizada, a cromatografia em coluna pode ser
classificada em cromatografia gasosa (gás inerte), cromatografia líquida (líquido) ou cromatografia
com fluido supercrítico (fluido no estado supercrítico). Com mais de um século de existência, a
cromatografia foi iniciada por Michael S. Tswett. [39]
3.5.1.1 Cromatografia Gasosa (GC-FID)
A cromatografia gasosa é uma das mais importantes técnicas analíticas disponíveis
atualmente. Num curto espaço de tempo tornou-se a principal técnica de separação e determinação
de compostos voláteis e/ou volatilizáveis. O excelente poder de resolução alcançado permite a
determinação de dezenas de diferentes compostos em matrizes complexas. Outra vantagem desta
técnica é que tem uma elevada sensibilidade e detetabilidade. A cromatografia gasosa pode ser
aplicada em amostras gasosas, líquidas ou sólidas, desde que os analitos sejam voláteis ou possam
ser volatilizados sem sofrer decomposição térmica. A cromatografia gasosa classifica-se, de acordo
com a natureza da fase estacionária, em cromatografia gás-sólido (CGS) e cromatografia gás-líquido
(CGL). A fase estacionária pode ser um sólido (CGS) ou um líquido imobilizado sobre um suporte
inerte (CGL), sendo que a CGL é a mais versátil e seletiva forma de cromatografia a gás, devido à
grande diversidade de fases líquidas disponíveis.[39]
18
A análise dos diferentes óleos (essencial e volátil) de P. halepensis foi efetuada usando a
cromatografia gasosa com deteção por espectrometria de massa (GC-MS), e à quantificação por GC-
FID determinando-se os diferentes constituintes dos mesmos.
A separação dos vários constituintes da amostra é feita na coluna: consoante são mais ou
menos adsorvidos ou absorvidos na fase estacionária, levarão mais ou menos tempo a percorrer a
coluna. A velocidade de progressão de um dado constituinte dependerá do caudal do gás de
arrastamento, da temperatura a que se encontra a coluna e da natureza da fase estacionária. À saída
da coluna encontra-se um detetor. O tipo de detetor mais usual na cromatografia gasosa é o de
ionização de chama (FID). Neste detetor, o gás que sai da coluna é misturado com uma quantidade
aproximadamente igual de hidrogénio e queimado numa atmosfera de ar. Os compostos orgânicos ao
serem queimados nestas condições produzem iões, dando origem à passagem de corrente entre dois
elétrodos situados na zona da chama.
Os constituintes dos óleos essenciais são identificados por comparação aos diferentes
padrões de fragmentação que se observam nos seus espectros de massa presentes em bibliotecas
de espectros, onde se relaciona os espectros obtidos das análises com os do banco de dados da
biblioteca. Existem bases de dados com espectros de massa de muitos componentes. A
cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massa permite realizar numa só operação, para uma
amostra da ordem de 1μL, uma análise quantitativa com uma indicação das proporções em que se
encontram os componentes. Quando se dispõe de substâncias padrão, a calibração do equipamento
permite uma análise quantitativa exata da amostra. No entanto esta técnica é geralmente
demorada.[5]
3.6 Avaliação das Propriedades Antioxidantes
O interesse por substâncias antioxidantes aumentou consideravelmente nos últimos anos
uma vez que moléculas que diminuem a peroxidação de lípidos podem minimizar ou inibir os danos
oxidativos causados ao ADN, proteínas e carboidratos causando envelhecimento e doenças
degenerativas, cancro, doenças cardiovasculares, cataratas e disfunções cerebrais, como Alzheimer
e Parkinson. [40] Devido à grande importância dada atualmente aos radicais livres e antioxidantes,
existe uma forte demanda por técnicas analíticas capazes de identificar e quantificar esses dois
grupos de compostos. [40]
Considerando a grande variedade de compostos com propriedades antioxidantes, alguns
métodos in vitro foram desenvolvidos para a avaliação da atividade anti-radicalar destas espécies.
Estes métodos empregam espécies radicalares estáveis em que a deteção do ponto final da reação
se realiza, geralmente, por medida da absorvância na região da radiação UV. Entre as metodologias
mais conhecidas para determinação da atividade antioxidante estão o DPPH (1,1-difenil-2-
picrilhidrazina) e o ABTS [2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfónico]. [40]
19
3.6.1 DPPH
O teste de DPPH é um dos métodos indiretos para se determinar a atividade antioxidante
mais antigo tendo surgido originalmente em 1950 para se descobrir os dadores de hidrogénio em
matérias naturais. Uma característica desse método é que ele não envolve condições drásticas de
temperatura e oxigenação. [41]
O método DPPH baseia-se na transferência de eletrões por ação de um antioxidante (AH) ou
uma espécie radicalar. O DPPH que possui cor púrpura é reduzido formando difenil-picril-hidrazina,
de coloração amarela. Devido à sua coloração, pode ser facilmente detetado por espectroscopia a
515nm devido à sua intensa absorção na região do visível. O método consiste em avaliar a
capacidade do DPPH reagir com dadores de hidrogênio, conforme apresentado na Figura 5. Na
presença de substâncias antioxidantes o mesmo recebe um H+ sendo então reduzido.[40]
Figura 5:Reação do DPPH com espécies antioxidantes; (Fonte:[40])
A capacidade de eliminar o radical DPPH (% de atividade antioxidante) é calculada utilizando a
seguinte equação:
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝐴𝑛𝑡𝑖𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒 (%) =𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒(−)−𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒(−)× 100 (1)
Em que:
Acontrole(-)= absorvância da solução de DPPH sem a amostra;
Aamostra= absorvância da amostra com o DPPH.[40]
A percentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH
consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para diminuir a
concentração inicial de DPPH em 50% é denominada por concentração inibitória (CI50). Quanto
maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor será a sua CI50 e maior a será a sua atividade
antioxidante. [41]
20
O método tem como vantagens ser de fácil execução, bastante reprodutível, permite a
avaliação de várias amostras em simultâneo diminuindo o tempo de ensaio. Outra vantagem
associada é o fato de ser possível realizar ensaios com baixas concentrações. No entanto, existe a
desvantagem de as moléculas de DPPH• serem muito volumosas, diminuindo desta forma o acesso
ao radical. [42]
De forma a uma melhor perceção dos resultados obtidos é frequente fazerem-se
comparações com antioxidantes de referência, sendo os mais utilizados o ácido ascórbico, o trolox e
o butil-hidroxitolueno (BHT). [42]
O trolox é um reagente que é facilmente adquirido e encontra-se disponível em forma de
cristais. Apresenta uma cor violeta bastante acentuada e é necessário evitar ou reduzir ao máximo a
sua exposição à luz, visto que a mesma provoca uma degradação do radical. [42]
3.7 Determinação do Teor em Polifenóis
Os polifenóis podem ser encontrados em quase todas as famílias de plantas e estão
concentrados no tecido foliar, na epiderme, na casca, flores e frutos tendo um papel biológico
importante nas plantas. Os polifenóis nos tecidos vegetais permitem a supressão e liberação de
hormonas de crescimento, como a auxina, permite a proteção da planta contra a radiação UV,
fornece “Propriedades sensoriais” para a sua proteção contra herbívoros, permitem a prevenção de
infeções microbianas e ainda participam no amadurecimento e outros processos de crescimento.[43]
Recentemente, os compostos polifenólicos ocupam um lugar de destaque na ciência
ambiental como importante classe de produtos naturais bioativos em todo o mundo. As suas
propriedades biológicas incluem efeitos anticancerígenos, antioxidantes e anti-inflamatórios. Estes
possuem também propriedades antimicrobianas e anti-carecinogénicas e ainda são uma fonte
importante, como agentes anti-infeciosos, contra patogénicos humanos resistentes a antibióticos. [43]
O monômero básico dos polifenóis é o anel fenólico e geralmente estes são classificados
como ácidos fenólicos e álcoois fenólicos. Dependendo da força do anel fenólico, os polifenóis podem
ser classificados em muitas classes, mas as classes principais nos polifenóis são os ácidos fenólicos,
flavonóides, estibinas, álcoois fenólicos e lignanas. Estes compostos são incorporados na dieta
humana e originários de plantas como frutas, legumes, cereais e café. [43]
Embora a determinação quantitativa de polifenóis seja prejudicada pela sua diversidade e
complexidade estrutural, vários métodos têm sido usados para determinar polifenóis em extratos de
plantas. Assumindo que a quantificação de polifenóis individuais não revela adequadamente a
proporção de procianidinas poliméricas, então a espectrofotometria na região ultravioleta pode ser
uma ferramenta útil para ajudar a resolver este problema.[44] As reações colorimétricas são
amplamente utilizadas no método espectrofotométrico UV/VIS, que é de fácil execução, rápido e de
21
baixo custo. No entanto, é importante que no ensaio colorimétrico se use uma substância de
referência para que este método possa medir, por comparação, a concentração total de grupos
hidroxila fenólicos no extrato da planta. Os polifenóis em extratos de plantas reagem com reagentes
redox específicos (reagente Folin-Ciocalteu) para formar um complexo azul que pode ser quantificado
por espectrofotometria de luz visível. O método de Folin-Ciocalteu é descrito em várias farmacopéias.
A composição química deste reagente inclui o ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) e ácido
fosfomolíbdico (H3PMo12O40), que são reduzidos a partir dos extratos ou substâncias testadas e que,
originalmente, possuem coloração amarela. Um meio com pH alcalino propicia que substâncias
redutoras, como as substâncias fenólicas, dissociem um protão levando à formação do anião
fenolato. Este anião é capaz de reduzir o reagente de Folin-Ciocalteu formando óxido de tungstênio
(W8O23) e óxido de molibdênio (Mo8O23). Estes óxidos possuem coloração azul que é detetável na
banda do espectro de 760 nm, possibilitando a quantificação dessas substâncias através da
espectrofotometria. [45]
Figura 6:Reação de substâncias redutoras com reagente de Folin-Ciocalteu. No exemplo, o ácido gálico, em condição alcalina reage com o complexo fosfomolíbdico do reagente de Folin-Ciocalteu. Na reação, há a mudança na cor, de amarelo para azul,
indicando que houve redução do complexo fosfomolíbdico; (Fonte:[45])
A absorção máxima dos cromóforos depende da solução alcalina e da concentração de
compostos fenólicos. No entanto, este reagente decompõe-se rapidamente em soluções alcalinas, o
que torna necessário o uso de um enorme excesso do reagente para obter uma reação completa.
Esse excesso pode resultar em precipitados e alta turbidez, impossibilitando a análise
espectrofotométrica. Para resolver este problema, Folin e Ciocalteu incluíram sais de lítio no
reagente, o que impediu a turvação. A reação geralmente fornece dados precisos e específicos para
vários grupos de compostos fenólicos, porque muitos compostos mudam de cor diferentemente
devido a diferenças na massa unitária e na cinética da reação. [44]
22
3.8 Análise das propriedades antimicrobianas e antifúngicas
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) aproximadamente 25% das mortes no
mundo inteiro são decorrentes de doenças causadas por microrganismos, sendo a segunda maior
causa de mortalidade mundial.[46]
O uso incorreto dos medicamentos antibacterianos e antifúngicos é descrito como um dos
principais responsáveis pelo aparecimento de microrganismos resistentes a medicamentos como
antibióticos, germicidas e desinfetantes. Isso ocorre principalmente pelo fato de as bactérias
apresentarem capacidade genética para adquirir e transmitir resistência contra esses agentes
antibacterianos atualmente disponíveis, assim como os fungos apresentarem mutações próprias, que
proporcionam o surgimento de estirpes resistentes. Esta problemática, atrelada às altas taxas de
resistência dos microrganismos, especialmente em ambientes hospitalares, justifica a urgência do
desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos e antifúngicos. As doenças infeciosas são
consideradas um grave problema de saúde pública, em virtude do impacto que geram à sociedade.
São provocadas por microrganismos patogênicos que invadem o organismo do hospedeiro, evitam as
suas defesas e provocam danos aos tecidos.[46],[47]
A utilização de extratos, oriundos de produtos naturais, com a finalidade de serem agentes
antimicrobianos pode ser uma via importante, já que se tem em vista que os mesmos são dotados de
uma reduzida possibilidade de ocasionar resistência microbiana, porque os mesmos são misturas
complexas, o que torna a adaptação dos microrganismos difícil. [46], [48]
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada através da determinação de uma
pequena quantidade da substância necessária para inibir o crescimento do microrganismo-teste; esse
valor é conhecido como Concentração Mínima Inibitória (CMI). Um aspeto bastante relevante na
determinação da CMI de extratos vegetais é a preocupação em relação aos aspetos toxicológicos,
microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais ou as suas combinações.
Atualmente existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos
extratos vegetais. Os mais conhecidos incluem o método de difusão em ágar, método de
macrodiluição e microdiluição. As variações referentes à determinação da CMI de extratos de plantas
podem ser atribuídas a vários fatores entre eles podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e
a estirpe utilizada no teste, a origem da planta, a época da colheita, se os extratos foram preparados
a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de extrato testada. Assim, não existe um método
padronizado para expressar os resultados de testes antimicrobianos de produtos naturais.
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico, no
qual um microrganismo é estimulado a crescer num meio de cultura sólido com uma substância
biologicamente ativa onde posteriormente se relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento
do microrganismo com a concentração da substância em estudo. A aplicação do método de difusão
23
limita-se a microrganismos de crescimento rápido, sendo eles aeróbios ou aeróbios facultativos. A
avaliação é comparada a um padrão biológico de referência (controlo positivo) e a zona ou halo de
inibição de crescimento é medida partindo-se da circunferência do disco ou poço, até a margem onde
há crescimento de microrganismos. De acordo com a dimensão do halo os microrganismos podem
ser classificados como: sensíveis, quando o diâmetro da zona de inibição é maior ou igual a 3 mm;
moderadamente sensíveis quando o halo é maior que 2 mm mas menor que 3 mm; e resistentes,
quando o diâmetro é menor ou igual que 2 mm. Como controlo positivo, aplica-se um quimioterápico
padrão, e como controlo negativo o solvente utilizado para a dissolução dos extratos. As condições
de incubação recomendadas são temperatura entre 35-37ºC para bactérias durante 24 a 48 horas e
para fungos de 25 a 27ºC por 48 a 72 horas. [46]. Estes ensaios quando utilizados para avaliação de
produtos naturais, extratos ou compostos isolados, não são quantitativos pois apenas indicam se
existe inibição de crescimento microbiano. Para obtenção de resultados mais fiáveis neste teste, os
diâmetros da zona de inibição podem ser associados com as concentrações inibitórias mínimas
(CMIs) com microrganismos conhecidos por serem suscetíveis ou resistentes a vários agentes
antimicrobianos. [12]
O método de diluição em caldo tem em conta a relação entre a proporção de crescimento do
microrganismo em meio líquido e a concentração da substância antimicrobiana in vitro. A avaliação é
comparada com um padrão biológico de referência. O método fornece resultados quantitativos e não
é influenciado pela velocidade de crescimento dos microrganismos. Uma desvantagem é a
dificuldade na deteção de contaminações no caso de teste de materiais clínicos. Como controlo
positivo, utiliza-se um caldo com um quimioterápico padrão com a suspensão padronizada de
microrganismo em teste, e como controlo negativo o meio de cultura com o solvente usado para
dissolução da amostra e a suspensão microbiana. Podem ser usadas duas metodologias: a macro e
a microdiluição. A macrodiluição envolve testes em tubos de ensaio, com volume de meio de cultura
entre 1 e 10 mL. Este método é trabalhoso, consome muito tempo, requerer muito espaço no
laboratório e gera grande quantidade de resíduos. A microdiluição utiliza microplacas com 96 poços,
com volume de meio de cultura entre 0,1 e 0,2 mL.[49] No método de diluição em caldo a CMI pode
ser determinada por espectrometria, através da atividade antimicrobiana que pode ser determinada
em termos de percentagem de inibição, que é dada pela expressão (2):
% 𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 =[1−(𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎−𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜)]
𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100 (2)
No qual a Aamostra é a absorvância do crescimento microbiano na presença do agente antimicrobiano,
Acontrolo negativo é a absorvância do agente antimicrobiano dissolvido no meio de cultura e Acontrolo positivo
que é a absorvância do inoculo normalizado em meio de cultura. Este resultado indica a percentagem
de células microbianas que o potencial agente microbiano testado poderá ser capaz de inibir. [12]
24
3.9 Tratamento de Resultados e Análises Estatísticas
Condições ambientais, diferenças nos equipamentos e valores de referência são fatores que
causam diferenças nos dados. Essas variações nos dados são aceitáveis num nível restrito, que é
definido na etapa de desenvolvimento do método. Um dos passos mais importantes no
desenvolvimento de métodos envolve a determinação dos limites de qualificação e quantificação. A
qualidade dos dados varia devido a mudanças de reagentes, equipamentos, métodos de calibração,
operadores e/ou analistas. Por isso, o Controle de Qualidade e Garantia de Qualidade foram
estabelecidas para garantir a integridade dos resultados. Dessa forma, as práticas analíticas
precisam de usar resultados qualificados por métodos de validação. Os limites de deteção (LOD) e de
quantificação (LOQ) são os valores mais importantes que os investigadores procuram quando
consideram a validade do método. Problemas com a deteção e quantificação de um analito podem
resultar da concentração da amostra, de efeitos de matriz ou outras condições, como sensibilidade do
instrumento e pureza do reagente. [50]
A determinação dos limites de deteção e quantificação é efetuada por um método que se
apoia em considerações estatísticas e que se baseia em determinados parâmetros da curva de
calibração. As diferenças significativas entre médias são identificadas com auxílio dos testes de
Tukey HSD, de Scheffé. Enquanto as correlações e a verificação de linearidade é conseguida através
do teste de Pearson. [42]
Para uma curva de calibração linear, assume-se que a resposta do instrumento y está
linearmente relacionada com a concentração padrão x para uma faixa limitada de concentração. O
modelo pode ser expresso por:
𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (3)
Este modelo é usado para calcular a sensibilidade b e o LOD e LOQ. Portanto, o LOD e LOQ podem
ser expressos como:
𝐿𝑂𝐷 = 3𝑆𝑎 (4)
𝐿𝑂𝑄 =10𝑆𝑎
𝑏 (5)
onde Sa é o desvio padrão da resposta e b é a inclinação da curva de calibração.[51]
3.10 Modelação para a Extração Supercrítica
A modelação dos dados experimentais da extração supercrítica de óleos voláteis proveniente
de plantas aromáticas é importante, pois pode ser usado como uma ferramenta para o
dimensionamento, melhoria e ampliação desde o processo a nível laboratorial até ao processo numa
escala piloto e industrial. [22]
25
Vários modelos têm sido propostos na literatura para descrever a extração de óleos voláteis
com fluídos supercríticos. Para o projeto e otimização de processos de extração SFE, é necessário
conhecer as características da matéria-prima (concentração inicial do soluto na matriz da planta, a
composição da mistura do soluto, a humidade e pré-tratamentos, como secagem e moagem), os
parâmetros utilizados no processo de extração (pressão, temperatura, caudal do solvente) e os dados
de equilíbrio da fase fluida.[52]
Os modelos matemáticos disponíveis para descrever a extração de solutos de matrizes
sólidas utilizando fluidos supercríticos são classificados em quatro grupos principais: modelos
empíricos, modelos baseados em analogias de transferência de calor, modelo de núcleo encolhido e
modelos baseados em balanços de massa diferenciais. [52]
Os modelos mais bem-sucedidos nessa área científica descrevem o processo experimental
utilizando balanços de massa diferenciais para as fases fluida e sólida, como os propostos por
Reverchon e Sovová. [52] Estes modelos têm em consideração algumas características da matriz
vegetal, nomeadamente o tamanho das partículas e a porosidade do leito. Embora seja necessário
determinar vários coeficientes, estes modelos refletem os mecanismos por trás do processo de
extração (relações de equilíbrio e mecanismos de transferência de massa) [22], [52]
Todos os modelos matemáticos utilizados baseiam-se em algumas hipóteses gerais: i)
embora o leito sólido seja composto por partículas com um soluto multi-componente, assume-se que
o comportamento de todos os compostos extraídos é semelhante e podem ser descritos por um único
componente, uma vez que tendo em conta estudos anteriores foram obtidas composições
semelhantes para as amostras de extrato coletado sucessivamente, mostrando que as mudanças na
composição não eram significativas; ii) os gradientes de concentração na fase fluida desenvolvem-se
em escalas maiores que o tamanho da partícula; iii) o caudal do solvente é uniformemente distribuído
em todas as secções do extrator e a porosidade não é afetada durante o tempo de extração; iv) a
queda de pressão e os gradientes de temperatura dentro do extrator são desprezados e o leito sólido
é considerado homogêneo em relação à concentração inicial do soluto e ao tamanho de partícula; v)
o solvente é livre de soluto na entrada do extrator e flui axialmente através do leito do material vegetal
moído. [52]
A equação diferencial do balanço de massa considerando o fluxo de pistão é:
𝜕𝐶
𝜕𝑡+
𝑢𝜕𝐶
𝜀𝜕ℎ+
(1−𝜀)
𝜀
𝜌𝑠
𝜌𝑓
𝜕𝑞
𝜕𝑡= 0 (4)
E o rendimento de extração é:
26
𝑒 =�̇�
𝑡∫ 𝐶(ℎ = 𝐻)𝑑𝑡𝑡
0 (5)
Assume-se que as concentrações são homogêneas em ambas as fases através das seguintes
condições iniciais:
𝑞(ℎ, 𝑡 = 0) = 𝑞0, 𝐶(ℎ, 𝑡 = 0) = 𝐶0
E a condição de fronteira:
𝐶(ℎ = 0, 𝑡) = 0
3.10.1 Modelo 1 – Sovová 1994
O modelo de fluxo em pistão de Lack, desenvolvido por Sovová (1994) para a extração
supercrítica de óleo de sementes moídas, supõe que uma parte do soluto nas partículas da planta
obtida por moagem se encontra em células fragmentadas, facilmente acessíveis durante a extração,
e o resto do soluto se encontra inacessível em células intactas. A equação (6) descreve a extração do
soluto que se encontra acessível, controlada por transferência de massa externa: [52]
𝜕𝑞
𝜕𝑡= −
𝑘𝑓𝑎𝜌𝑓
𝜌𝑠(𝐶0 − 𝐶) para 𝑞 ≥ 𝑞𝑘 (6)
Presume-se que a concentração da fase fluida de equilíbrio, C0, seja igual à solubilidade do
óleo no solvente. Quando a concentração da fase sólida local é reduzida para q=qk, a extração das
células intactas começa, sendo esta controlada pela transferência de massa interna e traduzida por:
[52]
𝜕𝑞
𝜕𝑡= −𝑘𝑠𝑎𝑞 para 𝑞 < 𝑞𝑘 (7)
Assume-se uma concentração zero na superfície da partícula e posteriormente despreza-se o
termo de acumulação (𝜕𝐶 𝜕𝑡⁄ ) na equação (4). Procede-se a uma manipulação adicional baseada na
suposição de que extrato em solvente supercrítico é de baixa solubilidade. Assim, é obtida uma
aproximação analítica das equações (4), (5), (6) e (7).
27
𝑒 =
{
(
𝑞𝑘𝜏
𝑍) [1 − 𝑒𝑥𝑝(−𝑍)], 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏 < 𝜏𝑚
(𝑞𝑘𝜏
𝑍) [𝜏 − 𝜏𝑚𝑒𝑥𝑝(𝑍𝑤 − 𝑍)], 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏𝑚 ≤ 𝜏 < 𝜏𝑛
𝑞0 − (𝑞𝑘
𝑘𝑍) 𝑙𝑛{1 + [𝑒𝑥𝑝(𝑟0𝑘𝑍) − 1]
𝑒𝑥𝑝[𝑘(𝜏𝑚−𝜏)]
𝑟0, 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏 ≥ 𝜏𝑛
(8)
Onde o tempo adimensional é dado por:
𝜏 =𝑘𝑓𝑎𝜌𝑓𝐶0
𝜌𝑠𝑞𝑘𝑡 (9)
A relação dada entre o soluto total e o soluto das células intactas é dada por:
𝑟0 =𝑞0
𝑞𝑘 (10)
e onde Z é um termo adimensional proporcional ao coeficiente de transferência de massa externa
dado por:
𝑍 =𝑘𝑓𝑎𝑀𝑝
𝑄
𝜌𝑓
𝜌𝑠 (11)
A curva de extração consiste em três regiões. Na primeira região, que é controlada pela resistência
do filme de solvente, ocorre a extração do soluto acessível a 𝜏 ≥ 𝜏𝑚:
𝜏𝑚 = 𝑟0 − 1 (12)
Depois das partículas soltarem o soluto acessível, o CO2 difunde-se dentro delas para extrair o soluto
mais profundo, enquanto, a jusante dessa região, o soluto acessível continua a ser removido. As
dimensões da fronteira entre as regiões com e sem soluto facilmente acessível são dadas por:
𝑍𝑤 =1
𝑘𝑟0𝑙𝑛
𝑟0 𝑒𝑥𝑝[𝑘(𝜏−𝜏𝑚)]−1
𝑟0−1, 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏𝑚 ≤ 𝜏 ≤ 𝜏𝑛 (13)
𝑘 =𝑘𝑠𝜌𝑠𝑞𝑘
𝑘𝑓𝜌𝑓𝐶0 (14)
A terceira e a última etapa corresponde à extração do soluto dentro das partículas, que é controlado
pela resistência interna de transferência de massa, e começa no tempo adimensional.
𝜏𝑛 = 𝜏𝑚 +1
𝑘𝑙𝑛
1+𝜏𝑚𝑒𝑥𝑝[𝑘(𝑟0𝑘𝑧)]
1+𝜏𝑚 (15)
Este modelo apresenta três parâmetros de transferência de massa ajustáveis, sendo eles k f, ks e r0.
[50]
28
3.10.2 Modelo 2 – Sovová 2005
A extensão do modelo de fluxo pistão de Lack para extração de óleos vegetais foi
posteriormente modificado por Sovová em 2005 para permitir a sua aplicação a diferentes tipos de
equilíbrio de fases e diferentes padrões de fluxo. As equações para o balanço de massa para a fase
sólida foram escritas separadamente para células intactas e fragmentadas, assumindo o coeficiente
de transferência de massa interna para determinar o transporte de células intactas para células
fragmentadas e o coeficiente de transferência de massa externa para controlar o transporte de
células fragmentadas para solvente. Agora no modelo, o parâmetro r é fração inicial de soluto nas
células fragmentadas e é dado por: [52]
𝑟 = 1 −𝑞𝑘
𝑞0 (16)
Foram propostas expressões aproximadas para curvas de extração para casos particulares
de fluxo de pistão e misturador ideal em combinação com diferentes relações de equilíbrio de fase. As
expressões consistem em duas partes, a primeira é válida para o período inicial, quando a extração
de células fragmentadas prevalece, e a segunda é válida para o período final controlado pela difusão
interna. Neste modelo, a expressão usa o sistema fluxo pistão, a relação de equilíbrio linear e
despreza a resistência de transferência de massa externa. [52]
𝑒 = �̇�𝑞0
𝐾+𝑦
𝑟
𝑝𝑎𝑟𝑎 0 ≤ �̇� ≥ 𝑄�̇�,
𝑒 = 𝑞0[1 − 𝐶1exp (−𝐶2𝑄)̇ ] 𝑝𝑎𝑟𝑎 �̇� > 𝑄�̇� (17)
Onde y é a razão entre a massa de solvente na matriz e no leito:
𝑦 =𝜌𝑓𝜀
𝜌𝑠(1−𝜀) (18)
Este modelo ainda possui dois parâmetros de transferência de massa ajustáveis, ks e r, que
são estimados a partir das constantes C1, C2, K e da coordenada �̇�c no ponto de cruzamento entre a
primeira e a segunda parte da curva de extração: [52]
𝑟 = 1 − 𝐶1exp (−𝐶2𝑄𝑐)̇ (19)
𝐾𝑠𝑎 =(1−𝑟)𝐶2
1−(1−𝑟)𝐾𝐶2
𝑄
𝑀𝑝 (20)
29
Parte Experimental 4.
4.1 Preparação da amostra: Determinação do tamanho de partícula e densidade
As folhas de Pinus halepensis foram colhidas em março de 2018 na Tunísia.
Estas foram posteriormente limpas e secas à temperatura ambiente e ao abrigo de luz num
local seco. Depois de secas, as folhas foram mantidas a -20ºC antes de se proceder à sua trituração.
A trituração foi efetuada com o auxílio de um moinho de lâminas (IKA WERKE M20) evitando a perda
de partículas de dimensões menores aquando da abertura do moinho. Por fim, a planta (com um teor
de humidade de aproximadamente 6%) foi sujeita a um sistema de peneiração (C.I.S.A Barcelona),
constituído por 8 compartimentos com diferentes diâmetros (1mm, 0,8mm, 0,63mm, 0,5mm, 0,4mm,
0,315mm, 0,2mm e 0,1mm) de forma determinar o diâmetro médio de partícula. (Anexo A) A
densidade aparente de P. halepensis foi determinada recorrendo a uma balança e a uma proveta.
(Anexo B)
A planta foi usada sempre nas mesmas condições.
4.2 Extração de Pinus halepensis
4.2.1 Hidrodestilação
A primeira técnica de extração realizada foi a hidrodestilação, recorrendo a um método
clássico de comparação, num equipamento Clevenger, com o objetivo de se obter óleo essencial de
P. halepensis.
O balão de fundo redondo, com capacidade para 1L, foi carregado com aproximadamente
100g de planta e 500mL de água destilada. O ensaio decorreu por um período de três horas, de
acordo com a montagem da figura seguinte.
Figura 7: Montagem laboratorial da extração de óleo volátil de P. halepensis por hidrodestilação, equipamento de Clevenger
30
4.2.2 Extração supercrítica
A segunda técnica de extração realizada foi a extração supercrítica, com o objetivo de se
obter óleo volátil de P. halepensis, tendo-se utilizado um equipamento existente no Laboratório de
Baro/Biotecnologia do Instituto Superior Técnico (IST). Nas Figuras 8 e 9 é apresentado,
respetivamente, o esquema e a fotografia do equipamento.
Figura 8:Esquema da instalação de SFE no IST. C-Garrafa de CO2; S1-Arrefeciemnto; F-Filtro; CP-Bomba de circulação;BP-
Regulador de pressão; M1-M4-Manómetros; S2-Permutador de calor; V-Vaso de extração; SP1,SP2-Separadores; FL-
Rotâmetro; DTM-Contador de gás seco
Figura 9: Equipamento de extração supercrítica com CO2 usado para extrair óleos voláteis de extratos de folhas de P.
halepensis
O CO2 (com uma pureza de 99,995%) proveniente de uma garrafa (C) é comprimido numa
bomba de diafragma (CP - Milton Roy model Milroyal B) e pré-aquecido num permutador de calor
(S2) antes de entrar no vaso de extração (V, 1L). A pressão é controlada por um regulador de
31
pressão (BP - Tescom Corporation model 26-1722-44-043) e medida num manómetro (M2, 0.7bar -
do tipo Bourdon). A temperatura do sistema, nomeadamente no vaso foi alcançada com a ajuda de
uma camisa de água sendo controlada através da sua medição em três pontos diferentes do vaso
(Topo, Base e Centro). O fluído supercrítico depois de atravessar a nossa matriz a extrair, é
descomprimido em dois separadores (SP1 e SP2 com 0,27L), sequenciais, permitindo o
fracionamento do extrato obtido, separando os compostos mais pesados como as ceras e outros do
óleo volátil obtido no segundo separador. A pressão correspondente aos dois separadores é
controlada em dois manómetros (M3, - Bourdon) (M4, - Bourdon). A temperatura no primeiro e no
segundo separador é controlada por banho termostático. O caudal de gás e volume total utilizado é
medido com um rotâmetro (FL) e um contador de gás seco (DTM - American Metter Company, model
DTM-200A), respetivamente. [28]
Foram realizadas seis extrações supercríticas. As condições estudadas foram com um caudal
constante de aproximadamente 8L/min a:
90bar e 40˚C;
100bar e 40˚C;
110bar e 50˚C;
100bar e 50˚C;
E para uma pressão e temperatura constante de 90bar e 40ºC foram estudados os caudais
aproximados de:
8L/min;
6L/min;
12L/min;
Um tubo de aço que se ajustava perfeitamente ao extrator foi utilizado para introduzir a nossa
matriz a extrair, facilitando o processo de limpeza e enchimento do vaso de extração. No fundo do
tubo de aço, e como filtro foi colocado uma quantidade de algodão, um esfregão de aço, algumas
esferas de vidro e outra quantidade e algodão até se obter uma altura de leito de 24cm. De seguida,
preencheu-se o tubo de extração com cerca de 70g de amostra (P. halepensis) seca, sempre
intercalada com esferas de vidro, e tapou-se com outro esfregão de aço para o seu isolamento, de
forma a não existir arrastamento de partículas sólidas da planta para fora do tubo. As esferas de vidro
entre as 70g de planta são colocadas para evitar a formação de aglomerados permitindo assim o
aumento da área de contacto com o CO2 para uma melhor extração dos óleos voláteis. Introduziu-se
o tubo de extração dentro do vaso de extração. Estabilizaram-se as condições de trabalho (pressão e
temperatura) para a obtenção das condições supercríticas. Iniciou-se o ensaio com a abertura das
válvulas V7, V8 e V9 fazendo-se variar as condições de estudo. A descompressão do CO2 foi
efetuada em dois passos sucessivos, a 70bar e -18ºC no separador SP1, e de seguida para o
separador a SP2, a 20 bar e 16ºC, sendo finalmente Libertado para a pressão atmosférica na válvula
V2. O ensaio continuou com a medição de vários pontos, onde se registou o volume total de CO2, o
32
tempo decorrido e a massa recolhida no SP2. A massa foi recolhida à pressão atmosférica e a uma
temperatura controlada por banho de gelo e sal no SP1 (aproximadamente -18˚C) e a um banho de
água tépida em SP2.
4.2.3 Soxhlet
A extração em Soxhlet foi realizada com a amostra de planta após extração supercrítica nas
condições de 90bar, 40ºC e um caudal de CO2 de 8L/min. Este método de extração foi realizado com
hexano e metanol com o objetivo de se obter os compostos lipídicos apolares e polares do extrato de
P. halepensis respetivamente.
Para tal, procedeu-se ao enchimento do cartucho com aproximadamente 12,55g de planta.
Usou-se um volume inicial de 250mL de hexano (Panreac) e posteriormente 250mL de metanol
(Panreac).
O ensaio decorreu por um período de três horas. Na Figura 10 é apresentado a instalação do
processo de extração Soxhlet.
Figura 10: Montagem laboratorial da extração por Soxhlet
4.2.4 Microondas
A extração em microondas foi realizada com o objetivo de obter óleos essenciais e analisar o
seu rendimento de extração em relação aos métodos anteriormente descritos.
Para tal, procedeu-se ao enchimento do balão de fundo redondo com capacidade de 100mL
com aproximadamente 15g de planta seca e 60mL de água destilada. O ensaio decorreu por um
33
período de uma hora com uma potência de 100W e uma temperatura limite de 108ºC em sistema
aberto, utilizando o sistema de Clevenger, adaptado para este sistema de aquecimento. Na Figura 11
é apresentado a instalação do processo de extração por microondas.
Figura 11: Montagem Laboratorial da extração por microondas de óleo volátil de P. halepensis
4.3 Determinação dos compostos dos óleos
4.3.1 GC-FID
Os óleos essenciais e voláteis, obtidos respetivamente por hidrodestilação e extração
supercrítica foram analisados por GC-FID de forma a quantificar os diferentes compostos presentes e
avaliar as diferenças entre os dois tipos de óleo.
Na análise cromatográfica gasosa utilizou-se uma coluna DB-1 (id de 30m x 0,25mm,
espessura de filme de 0,25mm; J & W Scientific Inc). Durante a análise, a temperatura do forno foi de
40°C durante 2min, posteriormente a temperatura foi aumentando cerca de 3ºC/min até que fosse
atingida uma temperatura de 230°C. Por fim, aumentou-se o incremento para 5°C/min até serem
atingidos os 310°C. Esta temperatura final foi mantida isotermicamente durante 15minutos. As
temperaturas do injetor e detetor foram de 310°C, sendo o gás de arraste, hélio, ajustado para uma
velocidade linear de 24cm/s. Os compostos foram identificados com base nos seus índices de
retenção, em relação a uma mistura de n-alcanos C9 – C20, num detetor de FID e amostras padrão
em GC-MS.
4.4 Quantificação e caracterização dos extratos de P. halepensis
4.4.1 Método do Radical Livre DPPH
O poder antioxidante das amostras foi determinado de acordo com o descrito na literatura
[16], [53], com algumas alterações, recorrendo ao leitor de microplacas (BioTek Synergy 2).
34
Inicialmente foram utilizadas soluções de Trolox (Sigma Aldrich 98%) para uma gama de
concentrações de 20 a 280μg/mL, como antioxidante de referência para a realização da curva de
calibração.
Para tal foram utilizadas microplacas NUNC-96 de fundo plano onde 30μL de cada amostra
de Trolox com diferentes concentrações (20, 30, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 180, 220, 260 e 280µg/L)
dissolvidas em metanol foram misturadas com 270µL de solução de DPPH (4mM, 100μL). A mistura
reacional foi incubada sem exposição à luz durante 40minutos tendo sido lida num leitor de
microplacas, após ao período de incubação, a 515nm. De forma simultânea, foram efetuadas
medidas do branco, constituído apenas pelo solvente (neste caso, por metanol) e do controlo
constituído por 30μL de metanol e 270μL de DPPH.
Para a medição da atividade antioxidante dos nossos extratos o processo foi igual ao anterior
havendo a substituição das amostras de Trolox pelas amostras obtidas pelos processos descritos
anteriormente também dissolvidas em metanol.
Foram efetuados quadruplicados de cada concentração.
4.4.2 Determinação do teor de Polifenóis
A determinação do teor de polifenóis foi efetuada com base no método de Folin-Ciocalteu
com algumas alterações. [44], [53],[54]
Para tal recorreu-se a placas NUNC-96 e um leitor de placas (BioTek Synergy 2).
Inicialmente, as amostras de extratos e de óleos foram dissolvidas em metanol. Depois procedeu-se
ao teste do seu teor em polifenóis recorrendo-se ao seguinte procedimento: Pipetaram-se 30μL de
cada amostra para cada poço. De seguida, adicionaram-se 150μL de reagente Folin-Ciocalteu
(previamente diluído em água destilada, 1:10v/v). Deixou-se em repouso durante 4 minutos e
adicionaram-se 120μL de solução de carbonato de sódio (previamente preparado, 75g/L). Deixou-se
em repouso durante 30 minutos a 40ᵒC e efetuou-se a sua leitura a 765nm. Foram efetuados
quadruplicados de cada amostra.
De forma simultânea, foram efetuadas medidas ao branco constituído apenas por solvente
(neste caso, por metanol) e ao controlo, que é constituído por 30μL metanol, 150μL reagente Folin-
Ciocalteu e 120μL de solução de carbonato de sódio.
Utilizou-se uma solução de ácido gálico (Sigma Aldrich, 97,5-102,5%) para a realização da
curva de calibração (entre 0 e 55μg) para os resultados serem expressos em equivalentes de ácido
gálico.
4.5 Avaliação da atividade antimicrobiana de Pinus halepensis
Para a avaliação da atividade antimicrobiana comparou-se os quatro óleos voláteis obtidos
pela extração supercrítica, um óleo obtido por microondas e o óleo obtido por hidrodestilação de P.
35
halepensis tendo-se testado seis espécies bacterianas, Bacillus subtilis ATCC 9372, Pseudomonas
aeruginosa L10, Escherichia coli ATCC 26666, Lactobacilus casei ATCC 7469 e Bacillus pumilus
ATCC 31093, uma espécie de levedura Sacaromyces cerevisae e duas espécies de fungos
Ganoderma lucidium e Lentinula edodes.
Os ensaios de suscetibilidade foram realizados de acordo aos estabelecidos nas normas de
Clinical and Laboratory Standards Institute [55] e National comitee for clinical Laboratory Standards
[56], mas com algumas alterações.
Para os métodos de suscetibilidade usados neste trabalho, o inóculo foi preparado pelo
método de crescimento, que consistiu na seleção de uma colónia isolada de estirpes puras de cada
microrganismo de placas de agar de crescimento com duração de 24h. A colónia isolada foi
posteriormente introduzida em tubos de ensaio com 5mL de meio de cultura estéril (Nutrient Broth,
Himedia) para bactérias e 5mL de meio de cultura estéril (Malt Extract, Himedia) para levedura.
Seguiu-se a incubação durante a noite destes com agitação a 37ºC para bactérias e 25ºC para a
levedura.
Posteriormente foi medida a absorvância de cada meio num espectrofotómetro (Thermo,
Nicolet evelution 300) a 655nm para as bactérias e 550nm para a levedura para medir o grau de
turbidez.
Obteve-se o inóculo final para se utilizar no método de difusão de disco.
Já para os fungos, selecionou-se um quadrado com cerca de 1cm de cada placa de
crescimento (presentes no laboratório de bioquímica do ISEL) e colocou-se numa placa com meio
PDA (Himedia) a incubar durante 72h a 25ºC. Posteriormente, rasparam-se as placas com a ajuda de
um bisturi sem ferir o agar em cerca de 500µL de NaCL (85%). Por fim, transferiu-se cada suspensão
para um eppendorf de 1mL.
Todo o material usado foi esterilizado na autoclave a 121ºC durante 15minutos. Todas as
soluções cuja composição se alterava com o tratamento térmico foram esterilizadas com recurso a
filtros de 0,45µm (Millipore).
A descrição da preparação dos meios encontra-se no Anexo C.
4.5.1 Método de difusão de disco
Para a aplicação do método de difusão de disco em agar teve-se por base o método de Bauer
et al. [57] e os procedimentos descritos na literatura, com algumas alterações.[6],[15]
Posteriormente à preparação dos inóculos, mergulhou-se um cotonete estéril no mesmo,
removendo-se o excesso de fluido do cotonete e inocularam-se as superfícies da placa de Petri com
Agar Nutrient (Himedia) para as bactérias e com PDA (Himedia) para os fungos e levedura.
36
Os discos de papel de filtro (Macherey-Nage) de diâmetro de 6mm, foram dispostos
uniformemente sobre a superfície de agar inoculada. Foram adicionados 10µL de cada solução em
estudo, controlo positivo e controlo negativo em cada um dos discos.
Os extratos de P. halepensis foram dissolvidos em dimetilsulfóxido 99,9% (DMSO, Merk) de
forma a obter uma concentração final de 60mg/mL.
Os controlos positivos usados foram a Ampicilina (Sigma-Aldrich) com uma concentração de
75µg/mL para B. subtilis e Gentamicina (Sigma-Aldrich) com uma concentração de 330µg/mL para as
restantes estirpes bacterianas. Já para os fungos e levedura foi usada a Amphotericin B solubilized
(Sigma-Aldrich). O solvente de dissolução dos extratos (DMSO) foi usado como controlo negativo. As
placas foram incubadas a 37ºC por um período de aproximadamente de 18h para as bactérias e
incubadas a 25ºC durante 24h para a levedura e 72h para os fungos.
O teste de cada microrganismo foi estudado em triplicado e o diâmetro das zonas de inibição
foi medido em milímetros com uma craveira, incluindo o diâmetro do disco.
4.5.2 Método de microdiluição em caldo
Para aplicação do método da microdiluição em caldo teve-se por base o método de Balouiri et
al. [58] e as normas: i) M07-A9 [55] e iii) M27-A2 [56].
Em microplacas de 96 poços estéreis testaram-se diferentes concentrações de extrato de
óleo essencial (5; 2,5; 1 e 0,5 mg/mL) e diferentes volumes de cada concentração (2,4,6 e 8µL)
provenientes da SFE a 110 bar e 50ºC em culturas de células de Bacillus subtilis. Deste modo,
distribuíram-se 20μL de inoculo previamente ajustado com uma turbidez de 0.5 McFarland, 2, 4, 6 ou
8µL de extrato de óleo de cada uma das concentrações e 178, 176, 174 ou 172µL de meio de cultura
estéril (himedia), respetivamente.
Adicionalmente, realizou-se um controlo negativo composto por 2, 4,6, ou 8μL de DMSO,
20μL de inoculo e 178, 176, 174 ou 172µL de meio de cultura estéril (himedia), respetivamente de
modo a perfazer um volume de 300 µL. O controlo positivo era constituído por 160μL de Nutrient
Broth, 20μL de inoculo e 20μL de Ampicilina.
Os extratos P. halepensis foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) 99,9% (Merck) para
uma concentração final de 5mg/mL. Posteriormente procedeu-se a diluições sucessivas de 1:2 dos
mesmos, através da adição de DMSO até a concentração final de 0,5mg/mL, obtendo-se assim uma
gama de concentrações entre 5mg/mL a 0,5mg/mL.
O teste de cada microrganismo na presença do extrato foi realizado em quadruplicado. Para
evitar que as placas secassem, estas foram tapadas e seladas e postas a incubar a 37°C por um
período compreendido entre 18h a 24h.
O crescimento microbiano foi determinado por um espectrofotómetro (Bio-Rad Model 680
microplate reader) a um comprimento de onda de 655nm.
37
Resultados e discussão 5.
5.1 Determinação do tamanho de partícula e densidade de Pinus halepensis
Depois de se triturar e de se peneirar a amostra de folhas de Pinus halepensis, obteve-se
uma distribuição da mesma tendo em conta o diâmetro de partícula de acordo com a Tabela 5.
Tabela 5:Distribuição quantitativa da amostra de P. halepensis nos diferentes peneiros
Peneiro Diâmetro (mm) Massa (g)
1 1,0 136,48
2 0,8 147,13
3 0,63 161,42
4 0,5 36,49
5 0,4 5,09
6 0,315 5,66
7 0,2 3,75
8 0,1 1,15
Massa Total (g): 497,17
O diâmetro médio da partícula foi determinado pela equação (21). De acordo com a fração
mássica retida em cada peneiro o valor obtido foi de 0,76 mm.
𝑑𝑖 =𝑥𝑖𝑑𝑖
∑𝑥𝑖𝑑𝑖 (21)
A densidade de P. halepensis foi de 0,35 g/mL, de acordo com os valores no Anexo B.
5.2 Obtenção do óleo essencial de Pinus halepensis através do método convencional de
hidrodestilação
A obtenção do óleo essencial foi efetuada através da hidrodestilação. O rendimento foi
determinado através da quantidade de óleo obtida, face à quantidade de planta pesada usada como
carga, sendo este de 0,8% (m/m) tendo em conta a massa de planta pesada. (Anexo D)
O óleo obtido caraterizou-se pela sua tonalidade transparente e apresentar um odor
característico bastante acentuado.
Estudos realizados revelam que o rendimento de hidrodestilação varia de região para região
havendo diferenças notórias entre espécies de P. halepensis cultivadas na Argélia, Marrocos, Grécia
e Itália. Os rendimentos variaram entre 0,50% e 0,89% (v/m).[6] No entanto um estudo realizado com
agulhas de P. halepensis colhidas na Turquia revelaram que o rendimento foi de 0,85%.[19]
38
5.3 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de Soxhlet
Os extratos de P. halepensis foram obtidos por extração em Soxhlet onde foi usado metanol,
como solvente, para obter compostos polares e o hexano, como solvente, para obter compostos
apolares. Após as extrações, o solvente contendo o extrato foi levado ao rotavapor para secagem e
posteriormente levado à linha de vácuo para garantir a secagem total do extrato e separação do
solvente usado. Obteve-se um rendimento no valor de 15,3% e de 16,3% respetivamente.
O extrato obtido apresentava uma tonalidade verde escura (Figura 12).
Figura 12: Extrato de P. halepensis obtido através da extração em Soxhlet
A planta após extração (Figura 13) apresentava uma cor acastanhada e sem aroma
percetível.
Figura 13: Tonalidade da planta antes (2) e após (1) extração em Soxhlet com hexano e metanol
1
2
39
5.4 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de
Microondas
Os extratos de P. halepensis foram obtidos por extração em microondas em sistema aberto.
Para descobrir as condições ótimas para a extração de óleo essencial usando o microondas foram
testadas diferentes condições que se encontram representadas na Tabela 6 bem como os seus
respetivos rendimentos.
Tabela 6: Condições operatórias para a extração de óleo essencial de P. halepensis por microondas
Condições Operatórias
Nº Ensaio Potência (W) Temperatura (ºC) Tempo (min) Rendimento (%)
1 150 100 60 0,76
2 75 108 60 0,45
3 100 108 35 0,47
4 100 108 65 0,75
No ensaio 1 fixou-se a potência, temperatura e o tempo apresentados na Tabela 6. Este
ensaio teve um tempo total de extração de 54minutos e verificou-se que a temperatura de ebulição da
mistura era superior a 100ºC uma vez que a temperatura máxima atingida durante o ensaio foi de
108ºC. Deste modo, nos restantes ensaios a temperatura estabelecida foi de 108ºC. Posteriormente
realizou-se o ensaio 2, onde se constatou que o rendimento de extração obtido era menor que o
rendimento de extração pretendido tendo em conta o ensaio anterior pelo que foram descartadas
estas condições de potência. De seguida foi realizado o ensaio 3, onde se fixaram novamente a
temperatura e o tempo a uma potência de 100W. Neste ensaio verificou-se que era necessário
aumentar o tempo de extração visto que o rendimento obtido foi de apenas 0,47% (m/m). Por último
foi realizado o ensaio 4 sem tempo pré-estabelecido novamente a 100W. Verificou-se que passados
35minutos de ensaio o rendimento era de 0,6% (m/m) pelo que se realizaram mais 30minutos de
ensaio obtendo-se um rendimento final de 0,75% (m/m), mais semelhante ao rendimento obtido na
hidrodestilação. (Anexo E)
Pode-se concluir que as condições ótimas de extração usando o método de microondas são
uma potência de 100W, uma temperatura de 108ºC e um tempo de extração de aproximadamente 1h,
obtendo-se rendimentos idênticos à hidrodestilação convencional, mas para um tempo de 3h.
Os rendimentos foram determinados através da quantidade de óleo obtida, face à quantidade
de planta pesada usada como carga. O óleo obtido caraterizou-se pela sua tonalidade transparente e
apresentar um odor característico bastante acentuado semelhante ao óleo obtido pela
hidrodestilação.
40
5.5 Obtenção do óleo volátil de P. halepensis através do método não-convencional com CO2
supercrítico
O óleo volátil de P. halepensis com CO2 supercrítico foi obtido através de seis ensaios com as
condições operatórias apresentadas na Tabela 7.
Tabela 7: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração Supercrítica com CO2
Condições Operatórias
Ensaio Pressão
(bar)
Temperatura
(ºC)
Caudal
(L/min)
mCO2
(kgCO2/kg
planta)
t (min) Rendimento
(%)
1 90 40 8 42,67 198 1,71
2 100 40 8 32,51 153 1,73
3 110 50 8 43,1 196 1,32
4 100 50 8 58,26 256 0,88
A massa extraída foi medida ao longo do tempo bem como o volume de solvente utilizado,
para permitir uma melhor compreensão da evolução da extração e se proceder ao cálculo do seu
rendimento. Quando se verificava que a massa extraída era insignificante para um determinado
volume, dava-se por terminado o ensaio. (Anexo F)
Através da extração supercrítica, obteve-se um óleo de tonalidade bem diferente ao
anteriormente obtido por hidrodestilação e microondas, uma vez que este agora apresentava uma cor
amarelada e com um odor mais intenso e ligeiramente diferente.
A influência das diferentes pressões e das diferentes temperaturas na extração do óleo volátil
de P. halepensis foi estudado usando um diâmetro de partícula de 0,76mm e um fluxo de CO2 de
aproximadamente 8L/min (Figura 14, 15 e 16).
Tendo em conta os dados da Tabela 7 verificou-se que os rendimentos do ensaio 1 e 3 são
semelhantes, no entanto no ensaio 1 são necessários mais tempo de extração e massa de CO2 para
a extração do óleo do que no ensaio 2. No último ensaio, nas condições do ensaio 4, verificou-se que
o rendimento de extração obtido foi o menor e o onde foi necessário uma maior quantidade de CO2 e
de tempo de extração (Figura 14).
Tendo em conta o estudo a diferentes pressões e temperaturas e o que foi dito anteriormente,
verifica-se que as condições de extração de 100bar e a 40ºC apresenta maior rendimento. Contudo, a
análise do óleo e as suas potencialidades, propriedades antioxidantes ou antimicrobianas, será
avaliada nos capítulos seguintes para comparação.
41
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
Re
nd
ime
nto
Extr
ato
To
tal (%
)
Tempo (minutos)
110_50
100_40
90_40
100_50
Figura 14: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo para a respetiva P(bar) e T(ºC)
Figura 15: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído em função da mCO2/mplanta usada na extração supercrítica de P. halepensis para a respetiva P(bar) e T(ºC)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0Relç
ão
en
tre
ole
o v
olá
til e
óle
o e
sse
ncia
ll
mCO2/mplant
90_40
110_50
100_40
100_50
42
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
Re
lçã
o e
ntr
e o
leo
esse
ncia
l e ó
leo
vo
látil
Tempo (minutos)
90_40
110_50
100_40
100_50
Tabela 8: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o processo de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo volátil em relação ao óleo obtido na hidrodestilação
Condições Operatórias
Ensaio Pressão
(bar)
Temperatura
(ºC)
Caudal
(L/min) t (min)
Quantidade
de óleo
1 90 40 8 50 1,8
2 100 40 8 68 2,0
3 110 50 8 110 1,5
4 100 50 8 256 1,0
Fazendo uma comparação do óleo essencial extraído de P. halepensis na hidrodestilação e o
óleo volátil de P. halepensis obtido pela SFE (Figura 16 e Tabela 8) verifica-se que o óleo essencial
é extraído mais rapidamente nas condições de 90bar e 40ºC obtendo-se uma quantidade de óleo
volátil 1,8 vezes superior ao óleo obtido na hidrodestilação.
Figura 16: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração supercrítica de P. halepensis em função do tempo para a respetiva P(bar) e T(ºC)
A influência dos diferentes caudais na extração do óleo volátil de P. halepensis foram
estudados usando as condições operatórias apresentadas na Tabela 9.
43
Tabela 9: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração Supercrítica com CO2
Condições Operatórias
Ensaio Pressão
(bar)
Temperatura
(ºC)
Caudal
(L/min)
mCO2
(kgCO2/kg
planta)
t (min) Rendimento
(%)
1 90 40 6 38,54 251 1,78
2 90 40 8 42,67 198 1,71
3 90 40 12 35,7 107 1,79
Tendo em conta estas três condições estudadas (Tabela 9, Figura 17 e Figura 18) verifica-
se que o rendimento é semelhante.
Figura 17: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo usando diferentes caudais de CO2 para a respetiva P(bar) , T(ºC) e caudal (L/min)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
Ren
dim
ento
do
Ext
rato
To
tal(
%)
Tempo (minutos)
90_40_6
90_40_12
90_40_8
44
Figura 18: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração supercrítica de P. halepensis em função da massa de CO2 por massa de planta tendo em conta diferentes caudais para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal
(L/min)
Tabela 10: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o processo de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo volátil em relação ao óleo obtido na hidrodestilação
Condições Operatórias
Ensaio Pressão
(bar)
Temperatura
(ºC)
Caudal
(L/min) t (min)
Quantidade
de óleo
1 90 40 6 89 2,0
2 90 40 8 50 1,75
3 90 40 12 36 2,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0
Rel
ção
en
tre
ole
o v
olá
til e
óle
o e
ssen
cial
mCO2/mplanta
90_40_6
90_40_8
90_40_12
45
Figura 19: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração supercrítica de P. halepensis em função do tempo tendo em conta diferentes caudais para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min)
Tendo em conta o que foi dito anteriormente verifica-se que, um maior caudal de dióxido de
carbono reduz o tempo de extração, ou seja, o ensaio realizado com um caudal de 12L/min decorreu
de uma forma mais rápida do que o ensaio realizado com um caudal de 6L/min ou 8L/min. Por outro
lado, como o rendimento é semelhante nos três ensaios, também é possível constatar que, um
aumento do caudal de CO2 não se traduz num aumento do rendimento, pois a quantidade de óleo
presente na planta é a mesma.
Os parâmetros estudados mostraram diferentes influências no óleo volátil extraído. A pressão
e a temperatura controlam o rendimento de extração, uma vez que uma ligeira variação destes
parâmetros leva a uma alteração na densidade do solvente supercrítico. As diferenças de
rendimentos de extração são devido às diferentes densidades do solvente, uma vez que se sabe que
em densidades mais elevadas o CO2 supercrítico apresenta um poder de solvente mais forte mas
menor seletividade, ou seja, a elevadas densidades de solvente a melhoria do rendimento de
extração pode ter sido devido ao aumento da quantidade da cera cuticular e outros compostos não
voláteis. [27]
5.6 Determinação dos compostos dos óleos por GC-FID
O principal método de quantificação dos compostos presentes no óleo essencial e óleo volátil
foi a técnica de GC-FID. Na Tabela 11 são apresentados os resultados para o óleo essencial (HD) e
para o óleo volátil (SFE) nas duas condições de pressão e temperatura.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0
Rel
ção
en
tre
ole
o v
olá
til e
óle
o e
ssen
cial
Tempo (minutos)
90_40_6
90_40_8
90_40_12
46
Tabela 11: Percentagem da composição do óleo essencial (EO) e óleo volátil (SFE) isolado de P. halepensis
Pinus halepensis
Componentes RI ESC
EO 90bar 90bar 100bar 100bar 110bar
40ºC 40ºC(R) 40ºC 40ºC(R) 50ºC
α-Pineno 933 11.2 7.5 6.8 5.7 6.2 7.3
Sabineno 962 0.9 0.5 0.7 0.5 0.5 0.6
β-Pineno 967 1.8 1.1 1.0 0.8 0.9 1.1
β-Myrceno 979 4.8 3.9 3.7 3.3 3.0 4.0
δ-3-Careno 1006 2.5 2.0 1.8 1.7 1.9 2.0
p-Cymeno 1009 0.9 0.5 0.7 0.6 0.5 0.6
α-Terpinoleno 1064 2.1 2.0 2.0 1.9 1.7 2.0
β-Carofileno 1415 47.3 52.4 53.0 54.1 53.5 52.8
Aromadendreno 1442 4.8 5.1 4.7 5.1 5.0 4.9
α-Humulene 1449 8.8 9.2 9.4 9.6 9.4 9.1
Germacreno D 1475 5.2 6.2 6.0 6.3 6.6 5.8
Cubebol 1489 1.9 2.0 1.9 1.9 2.1 1.9
Óxido de humuleno 1599 2.5 2.9 3.0 3.4 3.3 3.0
n-Heptacosano 2702 t t t 0.1 0.2 0.1
n-Octacosano 2805 t t t 0.1 0.1 T
n-Nonacosano 2898 t t t t T T
n-Triacontano 3000 t t t t T T
n-Hentriacontano 3100 t t t t T T
Compostos Identificados 94.7 95.3 94.7 95.1 94.9 95.2
Grupo de componentes
Monoterpenos hidrocarbonados
24.2
17.5 16.7 14.5 13.0 17.6
Monoterpenos oxigenados
T
t t t T T
Sesquiterpeno hidrocarbonados
66.1
72.9 73.1 75.1 74.5 72.6
Sesquiterpenos oxigenados
4.4
4.9 4.9 5.3 5.4 4.9
Fenilpropanoides
T
t t t T T
Outros
T t t 0.2 0.3 0.1
RI: indice de retenção calculados em relação a uma mistura de alcanos C9-C33 n-alcanos na coluna DB-1; t: traços (<0.1%).
Na Tabela 11 são identificados maioritariamente os 13 componentes que representam pelo
menos 94% dos componentes totais no óleo. Os compostos voláteis obtidos são dominados por
hidrocarbonetos sesquiterpénicos nomeadamente pelo β-Carofileno (52,4% a 54,1%). Em
quantidades variáveis, o α-Pineno (5,7% a 7,5%) e o Óxido de Humuleno (2,9% a 3,4%) são os
compostos que dominam as diferentes amostras de monoterpenos hidrocarbonados e sesquiterpenos
oxigenados, respetivamente.
Observa-se que o óleo essencial contém um teor mais elevado de monoterpenos
hidrocarbonados e um teor menor de sesquiterpenos hidrocarbonados do que os óleos voláteis
obtidos com CO2 supercrítico. De uma forma geral nos óleos voláteis é possível verificar a presença
47
de ceras como n-Heptacosano e n-Octacosano. Tanto o α-Pineno como o β-cariofileno são
responsáveis pelo odor da planta o que pode justificar o odor intenso dos óleos bem como as
diferenças de odor do óleo de hidrodestilação e o óleo de SFE uma vez que estes estão presentes
em maior quantidade e em quantidades diferentes em cada um dos óleos.
Em geral, tendo em conta os resultados obtidos verifica-se que estes estão de acordo com a
informação retirada da literatura no ponto 3.3.1.2.
5.7 Quantificação e Caracterização de P. halepensis
5.7.1 Determinação do poder antioxidante por DPPH
A avaliação do poder antioxidante dos diferentes extratos foi efetuada em relação a um
composto referência, o Trolox (Figura 20). Desta forma, todos os resultados são expressos em
equivalentes de Trolox de acordo com a equação Y=-9,188+0,781X.
Figura 20: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o Trolox para a avaliação das propriedades antioxidantes dos
extratos de P. halepensis
Verificou-se que a extração em Soxhlet confere um maior poder antioxidante do que os outros
extratos como se encontra representado na Tabela 12.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160
% In
ibiç
ão
Concentração (µg/mL)
48
Tabela 12: Valores do poder antioxidante dos diferentes extratos obtidos a partir de P. halepensis
Condições Operatórias
Ensaio Pressão (bar) Temperatura
(ºC)
Caudal
(L/min)
µg
Trolox/mgextrato
SFE
1 90 40 8 0,440
2 100 40 8 0,633
3 110 50 8 0,564
4 100 50 8 0,556
5 90 40 6 0,606
6 90 40 12 0,568
HD 7 0,613
Soxhlet 8 Metanol 12,64
9 Hexano 5,89
Pela análise do gráfico (Figura 21), verifica-se que, o extrato obtido usando como solvente o
metanol, apresenta um poder antioxidante superior em relação ao extrato obtido usando como
solvente hexano (Tabela 12).
Figura 21: Atividade antioxidante dos extratos de P. halepensis obtidos por extração em Soxhlet com metanol e hexano
Pela análise do gráfico da Figura 22 e do Anexo G-Tabela 28 que apesar de terem valores
diferentes estes são estatisticamente iguais tendo em conta a análise do tratamento estatístico.
0
2
4
6
8
10
12
14
µg T
rolo
x/m
gext
Soxhlet Hexano
Soxhlet Metanol
49
Figura 22: Poder antioxidante dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos por hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min)
Sendo o Trolox o composto de referência, quanto maior for o valor de equivalentes de Trolox
maior será o poder antioxidante dos extratos analisados.
5.7.2 Determinação do teor de polifenóis
A quantificação dos polifenóis dos diferentes extratos foi efetuada para o ácido gálico, um
composto de referência, cuja reta de calibração se encontra representada na Figura 23. Deste modo,
todos os resultados são expressos em equivalentes de ácido gálico de acordo com a equação
Y=0,0069+0,027X.
Figura 23: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o ácido gálico para determinação do teor em polifenóis
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
µg
Tro
lox/
mge
xt
SFE 90_40_6
SFE 90_40_12
SFE 90_40
SFE 100_40
SFE 110_50
SFE 100_50
HD
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0
Ab
sorv
ânci
a
Massa(µg)
50
Verificou-se que o maior teor de polifenóis foi obtido no extrato proveniente da extração em
Soxhlet. Já o teor de polifenóis dos restantes extratos de óleo volátil e de óleo essencial é
significativamente inferior, como se encontra representado na Tabela 13.
Tabela 13: Valores do teor de polifenóis dos diferentes extratos obtidos a partir de P. halepensis
Condições Operatórias
Ensaio Pressão (bar) Temperatura
(ºC)
Caudal
(L/min) EAG/gextrato
SFE
1 90 40 8 902,1
2 100 40 8 694,6
3 110 50 8 739,5
4 100 50 8 684,4
5 90 40 6 811,3
6 90 40 12 621,2
HD 7 602,6
Soxhlet 8 Metanol 1215,2
9 Hexano 1193,2
Pela análise do gráfico (Figura 24), verifica-se que, o extrato obtido usando como solvente
metanol, apresenta um teor em polifenóis estatisticamente igual ao extrato obtido usando como
solvente hexano apesar de terem valores diferentes. (Anexo G- Tabela 30)
Figura 24: Teor de polifenóis do extrato de P. halepensis obtido por extração em Soxhlet com metanol e hexano
Tendo em conta os extratos obtidos pela SFE, verifica-se que os extratos que contêm uma
maior teor de polifenóis são os que foram obtidos nas condições de 90bar e 40ºC tanto para um
caudal de CO2 de 8L/min como para um caudal de 6L/min, sendo estatisticamente semelhantes entre
0,0
200,0
400,0
600,0
800,0
1000,0
1200,0
1400,0
µm
ol E
AG
/gex
t
Soxhlet Metanol
Soxhlet Hexano
51
si tendo em conta a análise estatística apresentada no Anexo G- Tabela 30. Posteriormente seguem-
se os restantes extratos de óleos provenientes da SFE e da HD que apesar de terem valores
diferentes através da análise do tratamento estatístico se verifica que são estatisticamente iguais
entre si. (Anexo G-Tabela 30)
Figura 25: Teor de polifenóis dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos por hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min)
Comparados os resultados com a literatura [59], verifica-se que o óleo essencial apresenta
um teor em polifenóis de 91,77mgEAG/g de extrato. Apesar de os valores serem semelhantes, o
desvio do valor do ensaio e o valor da literatura pode dever-se ao facto de num caso o óleo ter sido
dissolvido em metanol e o outro em etanol e a localização da colheita da planta que apesar de serem
ambas provenientes da Tunísia, serem de regiões diferentes.
5.8 Determinação da atividade antimicrobiana e antifúngica
A suscetibilidade antimicrobiana dos diferentes extratos obtidos por extração supercrítica de
P. halepensis foi avaliada pelo método de difusão de disco em agar, utilizando diferentes estirpes
microbianas, uma estirpe de levedura e duas estipes de fungos.
A avaliação do potencial microbiano foi realizada com base no diâmetro de inibição (DZI) de
crescimento microbiano em torno do disco que continha uma concentração de extrato de 60mg/mL.
No caso de não existir uma zona de inibição, foi assumido que os extratos não eram suscetíveis ao
agente microbiano testado. A atividade dos diferentes extratos foi comparada com a presença de um
controlo negativo, constituído pelo solvente de diluição dos extratos, o DMSO, e um controlo positivo,
constituído pelo antibiótico de referência para cada estirpe microbiana. Deste modo, foi possível
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
600,0
700,0
800,0
900,0
1000,0
µm
ol E
AG
/gex
t
SFE_90_40
SFE_110_50
SFE_100_40
SFE_100_50
SFE_90_40_6
SFE_90_40_12
HD
52
averiguar a sensibilidade do método, sendo que, o mesmo só é válido se o controlo positivo não
mostrar crescimento microbiano e o controlo negativo apresentar crescimento.
O diâmetro da zona de inibição em mm foi calculado incluindo o disco com 6mm.
Verifica-se que, para Bacillus subtilis, todos os extratos apresentaram um efeito inibitório em
torno dos discos (Figura 26). Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria
irregular, foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 10,2±1,1 e 14,7±0,5
mm.
Figura 26:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de disco, após 18h de incubação
a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Ampicilina
O DMSO (controlo negativo) não mostrou uma ação inibitória no crescimento desta bactéria,
enquanto a Ampicilina com uma concentração de 75µg/mL (controlo positivo), demonstrou ação
inibitória com um diâmetro de zona de inibição de 26,4±0,9mm. Analisando os resultados verifica-se
que Bacillus subtilis apresentou maior suscetibilidade antimicrobiana na SFE nas três primeiras
condições da Tabela 14 exibindo portanto o maior diâmetro de zona de inibição não apresentando
diferenças estatisticamente significativas entre si (Anexo G-Tabela 32). Segue-se o extrato de SFE
nas condições de 100bar e 50ºC, o extrato de MAE e o extrato de HD, que são diferentes entre si
mas estatisticamente iguais quando sujeitos a uma análise estatística (Anexo G-Tabela 32), na qual
a bactéria demonstrou menor suscetibilidade.
Tabela 14:Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus
subtilis através do método de difusão em disco
Ampicilina
DMSO SFE 90_40
SFE 110_50
SFE 100_40
SFE 100_50
HD MAE
DZI (mm) Bacillu
s subtilis
26,4±0,9 0,0±0,
0 14,1±0,
1 14,3±0,
1 14,7±0,
5 11,6±0,
6 10,3±1,
0 11,7±0,
1
A A
B
C D
E
F
G
T
H H
53
Quanto a Escherichia coli, todos os extratos exibiram efeito inibitório no crescimento em torno
dos discos (Figura 27). Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria irregular,
foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 9,4±0,4 e 11,4±0,3 mm.
Figura 27: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Escherichia Coli pelo método de disco, após 18h de
incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-
Gentamicina
O DMSO (controlo negativo) não mostrou nenhuma ação inibitória no crescimento da bactéria
em estudo. No entanto, a Gentamicina, presente numa concentração de 330 µg/mL (controlo
positivo), apresentou um diâmetro de zona de inibição de 22,4±0,2mm, demonstrando assim a sua
ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Escherichia coli apresentou maior
suscetibilidade antimicrobiana na SFE, nomeadamente na terceira e quarta da Tabela 15 exibindo
portanto o maior diâmetro de zona de inibição não apresentando diferenças estatisticamente
significativas entre si quando sujeitas a análise estatística (Anexo H-Tabela 34). Seguem-se os
restantes extratos de SFE, HD e MAE, na qual a bactéria demonstrou menor suscetibilidade não
havendo também diferenças estatisticamente significativas entre si quando sujeitas a análise
estatística (Anexo H-Tabela 34).
Tabela 15: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de
Escherichia coli através do método de difusão em disco
Gentamicina
DMSO SFE 90_40
SFE 110_50
SFE 100_40
SFE 100_50
HD MAE
DZI (mm) Escherichi
a Coli 22,4±0,2
0,0±0,0
9,9±0,8
9,1±0,2
11,4±0,3
11,3±0,5
9,4±0,4
9,7±0,3
A
B
C
D
E F
G
H
54
Em relação a Bacillus pumilus, todos os extratos exibiram efeito inibitório no crescimento em
torno dos discos (Figura 28). Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria
irregular, foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 9,6±0,5 e 11,9±0,6 mm.
Figura 28:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus pumilus pelo método de disco, após 18h de
incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-
Gentamicina
O DMSO (controlo negativo) não mostrou nenhuma ação inibitória no crescimento da bactéria
em estudo. No entanto, a Gentamicina, presente numa concentração de 330 µg/mL (controlo
positivo), apresentou um diâmetro de zona de inibição de 22,0±1,0mm, demonstrando assim a sua
ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Bacillus pumilus apresentou maior
suscetibilidade antimicrobiana na SFE, nomeadamente nas condições dois, três e quatro
apresentadas na Tabela 16 exibindo portanto o maior diâmetro de zona de inibição não apresentando
diferenças estatisticamente significativas entre si tendo em conta as análises estatísticas
apresentadas no Anexo H-Tabela 36. Seguem-se os extratos de SFE nas condições 90bar e 40ºC,
MAE e HD na qual a bactéria demonstrou menor suscetibilidade não apresentando diferenças
estatísticas quando analisadas estatisticamente. (Anexo G- Tabela 36)
Tabela 16: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus
pumilus através do método de difusão em disco
Gentamicina DMSO SFE 90_40
SFE 110_50
SFE 100_40
SFE 100_50
HD MAE
DZI (mm) Bacillus pumilus
22,0±1,0 0,0±0,0 10,5±0,7 11,2±0,7 11,7±0,7 11,9±0,6 9,6±0,5 10,7±0,5
Quanto a Lactobacillus casei, todos os extratos exibiram efeito inibitório no crescimento em
torno dos discos (Figura 29). Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria
irregular, foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 9,7±0,6 e 12,7±1,2 mm.
A
C
D
E F
B
G
H
55
Figura 29: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lactobacillus casei pelo método de disco, após 18h de
incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-
Gentamicina
O DMSO (controlo negativo) não mostrou nenhuma ação inibitória no crescimento da bactéria
em estudo. No entanto, a Gentamicina, presente numa concentração de 330 µg/mL (controlo
positivo), apresentou um diâmetro de zona de inibição de 24,7±1,2mm, demonstrando assim a sua
ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Lactobacillus casei apresentou
maior suscetibilidade antimicrobiana na SFE, nomeadamente nas condições 100bar e 490ºC
exibindo, portanto, o maior diâmetro de zona de inibição. Seguem-se os restantes extratos na qual a
bactéria demonstrou menor suscetibilidade. Apesar de estes últimos valores serem diferentes na
Tabela 17, quando analisados estatisticamente não apresentaram diferenças estatísticas entre si.
(Anexo G-Tabela 38)
Tabela 17: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de
Lactobacillus casei através do método de difusão em disco;
Gentamicina DMSO SFE 90_40
SFE 110_50
SFE 100_40
SFE 100_50
HD MAE
DZI (mm) Lactobacillus
casei 24,7±1,2 0,0±0,0 10,0±0,7 10,8±0,6 12,7±1,2 11,9±0,6 9,7±0,6 10,7±0,3
Quanto a Pseudomonas aeruginosa, nenhum dos extratos exibiram efeito inibitório no
crescimento em torno dos discos (Figura 30).
A
C
D
E F
B
G
H
56
Figura 30: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Pseudomonas aeruginosa pelo método de disco, após 18h
de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-
Gentamicina
O DMSO (controlo negativo) não mostrou nenhuma ação inibitória no crescimento da bactéria
em estudo. No entanto, a Gentamicina, presente numa concentração de 330 µg/mL (controlo
positivo), apresentou um diâmetro de zona de inibição de 17,7±1,1mm, demonstrando assim a sua
ação inibitória e a validade dos resultados.
Também se realizou o teste de difusão de disco para a análise de leveduras, nomeadamente
a Saccharomyces cerevisiae (Figura 31). Neste ensaio verifica-se que todos os extratos mostraram
efeito inibitório a volta do disco. Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria
irregular, foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 8,1±0,1 e 10,6±0,9 mm.
Figura 31: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Saccharomyces cerevisiae pelo método de disco, após 18h
de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-
Amphotericin B solubilized
A B
C
D
E F
H
A
B
C
D
E
F
G
H
57
O DMSO (controlo negativo) não mostrou nenhuma ação inibitória no crescimento da bactéria
em estudo. No entanto, a Amphotericin B solubilized, presente numa concentração de 5mg/mL
(controlo positivo), apresentou um diâmetro de zona de inibição de 14,5±0,7mm, demonstrando
assim a sua ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Saccharomyces
cerevisiae apresentou maior suscetibilidade antimicrobiana na HD exibindo portanto o maior diâmetro
de zona de inibição. Seguem-se os restantes extratos, nas condições dois, três, quatro e cinco de
acordo com a Tabela 18, que apresentam diâmetros de zona de inibição intermédios e que não
apresentam diferenças estatisticamente significativas entre si apesar de terem valores diferentes.
(Anexo G-Tabela 40) Por último o extrato de SFE nas condições de 90bar e 40ºC foi o extrato na
qual a bactéria demonstrou menor suscetibilidade.
Tabela 18: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de
Saccharomyces cerevisiae através do método de difusão em disco
Amphotericin B solubilized
DMSO SFE 90_40
SFE 110_50
SFE 100_40
SFE 100_50
HD MAE
DZI (mm)
Saccharomyces cerevisiae
14,5±0,7 0,0±0,0 8,1±0,1 9,8±0,8 9,5±0,7 9,2±0,3 10,6±0,9 10,2±0,8
Por fim, também se realizaram testes de difusão de disco para duas espécies de fungos,
nomeadamente, Ganoderma lucidium e Lentinula edodes.
Nestes ensaios verificou-se que nenhum extrato apresentou efeito inibitório a volta do disco
em nenhuma das duas espécies. (Figura 32 e 33)
Figura 32:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Ganoderma lucidium pelo método de difusão de disco após 1
semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- 100_40; F-SFE 100_50; H-
Amphotericin B solubilized
A A
B
B
C C
D D
E E F
F
G G
H H
58
Figura 33:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lentinula edodes pelo método de difusão de disco após 1
semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-
Amphotericin B solubilized
Os óleos essenciais de P. halepensis mostram um bom efeito inibitório contra a levedura em
estudo e contra a maior parte das estirpes bacterianas estudadas. No entanto mostrou-se ineficaz
como antifúngico.
Considerando todos os ensaios efetuados verifica-se que em nenhum deles, o diâmetro da
zona de inibição dos extratos foi superior ao diâmetro de zona de inibição do controlo positivo,
antibiótico de referência. Assim, o efeito antimicrobiano dos extratos de P. halepensis contra os
microrganismos de teste é pouco significativo quando comparado com o antibiótico de referência.
Eventualmente, para obtenção de um maior diâmetro da zona de inibição dos extratos para as
estirpes em estudo ter-se-ia de aumentar a concentração dos mesmos, dado que estes extratos
podem ter algum potencial como uma fonte alternativa de agentes antimicrobianos.
De acordo com a literatura, foram avaliadas a atividade antimicrobiana contra S. aureus, P.
aeruginosa, E. coli e B.cereus usando o método de discos com óleo essencial proveniente das folhas
secas de P. halepensis da região de Argélia. O óleo essencial mostrou uma forte atividade contra S.
aureus e B. cereus. Contrariamente, o óleo foi ineficaz contra P. aeruginosa e E.coli. Em comparação
com a literatura vemos algumas diferenças, nomeadamente a ação inibitória contra E. coli. Tais
resultados podem dever-se aos rendimentos e às diferentes composições dos óleos que são
resultantes de processos adaptativos, nomeadamente as condições ecológicas (como condições
climáticas, altitude, regiões geográficas), período de colheita da planta e o método de extração de
óleo essencial.[6]
No geral, os óleos essenciais revelaram atividades antimicrobianas em bactérias Gram-
positivas e bactérias Gram-negativas e em espécies de levedura; no entanto, foram verificadas
A A
B
B
C C
D
D E E
F F
G G
H H
59
atividades antibacterianas mais significativas em bactérias Gram-positivas do que em bactérias
Gram-negativas, o que pode ser consequência das diferenças na constituição da parede celular.[60]
No método de microdiluição em caldo, a atividade antimicrobiana de P. halepensis foi
avaliada considerando a estirpe de Bacillus subtilis tendo em conta as condições apresentadas na
Tabela 19.
Tabela 19: Condições operatórias usadas nos ensaios de microdiluição para Bacillus subtilis
Condições Operatórias
Nº Ensaio Pressão (bar) Temperatura (ºC) Concentração de
OV (mg/mL)
Volume OV
(µL)
1
110 50
5
2
2 4
3 6
4 8
5
2,5
2
6 4
7 6
8 8
9
1
2
10 4
11 6
12 8
13
0,5
2 14
15 4
16 6 8
Estes ensaios permitiram determinar as correspondentes percentagens de inibição utilizando
a Equação 22.
%𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 =1−(𝐴𝐶𝑁−𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)
𝐴𝐶𝑁−𝐴𝐶𝑃 (22)
De modo a validar este método, realizou-se um controlo positivo (constituído por meio de
cultura, inoculo e Ampicilina) que não deve apresentar crescimento microbiano e o controlo negativo
(que consiste no meio de cultura, inoculo e DMSO) que deve apresentar crescimento. Para efeitos de
cálculo utilizou-se um valor médio das absorvâncias para o controlo positivo e para o controlo
negativo de cada concentração. Os resultados obtidos neste ensaio encontram-se no Anexo I.
60
Figura 34: Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e
50ºC, sem centrifugação
Analisando a Figura 34, os ensaios realizados para Bacillus subtilis que apresentam uma
percentagem de inibição acima de 100% foram desprezados, uma vez que o controlo negativo
(constituído por inoculo, DMSO e meio de cultura) não apresentou crescimento como seria esperado.
A ausência de crescimento deste microrganismo nestas condições pode estar relacionada com a
presença de uma concentração mais elevada de DMSO. Este solvente pode ter agido com um agente
bacteriostático, inibindo assim o crescimento de Bacillus subtilis.
Assim sendo, tendo em conta os restantes resultados, espera-se que à medida que o volume
e as concentrações de extrato aumentem que aumente a percentagem de inibição. No entanto não
conseguimos verificar esse padrão nem retirar conclusões. Pensa-se que tal facto se deveu à
formação de um precipitado após o contacto do extrato de óleo de P. halepensis com o meio de
cultura o que poderia alterar os valores de absorvância e consequentemente a % de Inibição. Para
tentar resolver o problema realizou-se uma centrifugação diferencial. Com esta técnica esperava-se
que, devido aos diferentes pesos moleculares, que a cultura celular se afundassem e o precipitado do
óleo ficasse no sobrenadante voltando-se a medir a absorvância após retirar o sobrenadante e
perfazer o volume do precipitado celular com meio estéril até aos 300 µL. Após centrifugação obteve-
se o gráfico da Figura 35.
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
0,5 1 2,5 5
% In
ibiç
ão
Concentração (mg/mL)
Extrato-2µL
Extrato-4µL
Extrato-6µL
Extrato-8µL
61
Figura 35:Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e
50ºC, após centrifugação
Analisando a Figura 35 verificou-se, na maioria dos casos que, quanto maior a concentração
e o volume de extrato maior a percentagem de inibição contra a espécie Bacillus subtilis.
Conclui-se também que para um volume de extrato de 2µL, 4 µL e 6 µL a CIM90 encontra-se
acima de 5mg/mL. Para o volume de extrato de 8µL a CIM90 encontra-se entre 1mg/mL e 5mg/mL. O
maior grau de inibição foi verificado para um volume de 8 µL e uma com contração de extrato de óleo
de 5mg/mL apresentando um valor de aproximadamente 100%.
Para um volume de extrato de 8 µL e uma concentração de 2,5mg/mL os ensaios realizados
não foram conclusivos, uma vez que o controlo negativo (constituído por inoculo, DMSO e meio de
cultura) não apresentou crescimento como seria esperado. A ausência de crescimento pode estar
relacionada com a presença de DMSO como já foi referido anteriormente.
Em geral, tendo em conta o método de microdiluição para Bacillus subtilis tal como no método
de difusão de disco, o maior ou menor valor de CMI de cada extrato, pode estar associado às
características intrínsecas dos microrganismos testados, que estão relacionados com a
permeabilidade da sua superfície celular para com os extratos e a sua composição[12]. Apesar de
nos diferentes ensaios, com volumes diferentes de extrato, não se ter usado o mesmo volume de
meio de cultura e consequentemente oferecer diferentes quantidades de nutrientes à cultura celular,
pensa-se que os resultados não foram afetados, uma vez que a diferença de volumes era muito
pequena, na ordem dos µL.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
180,0
200,0
0,5 1 2,5 5
% In
ibiç
ão
Extrato-2µL
Extrato-4µL
Extrato-6µL
Extrato-8µL
62
5.8 Modelação dos extratos supercríticos de P. halepensis
Pelo modelo de Sovová 1994, o ajuste dos dados experimentais, para os 4 ensaios com os
mesmos caudais e 3 ensaios com caudais iguais estão representados na Figura 36 e Figura 37,
respetivamente.
Figura 36: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os quatro ensaios efetuados, nas condições de P(bar), T(ºC) e caudal constante de 8L/min
Figura 37: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0 50 100 150 200 250 300
Y (
%)
t (minutos)
90_40_8
100_40_8
100_50_8
110_50_8
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0 50 100 150 200
Y (
%)
t(minutos)
90_40_8
90_40_6
90_40_12
63
Pelo modelo de Sovová 2015, o ajuste dos dados experimentais, para os 4 ensaios com os
mesmos caudais e três ensaios com caudais iguais estão representados na Figura 38 e Figura 39,
respetivamente.
Figura 38: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 2, Sovová 2005, para os quatro ensaios efetuados nas
condições de P(bar), T(ºC) e um caudal constante de 8L/min
Figura 39: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios efetuados nas
condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais
Os coeficientes externos e internos de transferência de massa (kf e ks) e o desvio padrão (%)
obtidos pela modelação da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis pelos métodos de
Sovová 1994 e Sovová 2005 encontram-se apresentados na Tabela 20.
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0,018
0,02
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
Y (%
)
t (minutos)
90_40_8
100_40_8
100_50_8
110_50_8
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
Y(%
)
t (minutos)
90_40_6
90_40_8
90_40_12
64
Tabela 20: Coeficientes de transferência de massa e respetivo desvio padrão para a extração do óleo volátil de P. halepensis
nas diferentes condições
Tabela 21: Cálculo do coeficiente de transferência de massa externa usando a correlação empírica proposta por Wakao e Kaguei [52]
Pressão (bar) Temperatura (ºC)
Caudal de CO2 (L/min)
Kf*10e6
90 40 8 0,16 100 40 8 0,19 100 50 8 0,35 110 50 8 0,27 90 40 6 0,13 90 40 12 0,21
Analisando os ensaios realizados para o mesmo caudal de CO2 e diferentes condições de
pressão e temperatura não conseguimos estabelecer um padrão entre estas e os coeficientes de
transferência de massa. Tendo em conta o modelo de Sovavá 1994 verifica-se que tanto o coeficiente
de massa externo como interno se comportam da mesma maneira. Ambos aumentam quando
passamos de 90 bar para 100 bar mantendo a temperatura, diminuem quando mantemos a pressão e
aumentamos a temperatura e voltam a diminuir quando aumentamos a pressão e mantemos a
temperatura. Para o modelo de Sovavá 2005, verifica-se uma diminuição do coeficiente de massa
interno quando aumentamos a pressão e diminuímos a temperatura, um aumento quando mantemos
a pressão e aumentamos a temperatura e de novo uma diminuição quando aumentamos a pressão e
mantemos a temperatura.
Já no ensaio realizado a 90 bar e 40ºC para diferentes caudais usando o modelo de Sovavá
2005, verificamos que o coeficiente interno de transferência de massa aumenta com o aumento do
caudal de CO2. Já para o modelo de Sovavá 1994, verifica-se uma diminuição do coeficiente de
massa interno de 6 para 8L/min de CO2 e um aumento de 8L/min para 12L/min. No coeficiente de
massa externo verifica-se o oposto.
Foi determinado o desvio padrão, onde se obtiveram valores inferiores a 6%, o que leva a
concluir que estes são modelos que apresentam uma boa solução para o ajuste destes dados
Sovová 1994
Sovová 2005
Pressão (bar)
Temperatura (ºC)
Caudal de CO2 (L/min)
KS*1e8 Kf*1e6 Desvio Padrão
(%) KS*1e8
Desvio Padrão
(%)
90 40 8 3,14 3,42 1,59 7,51 2,44
100 40 8 9,04 9,66 11,4 2,43 14,2
100 50 8 5,08 3,90 3,21 7,71 4,42
110 50 8 4,19 1,01 0,89 6,90 5,50
90 40 6 6,06 0,60 1,64 6,15 4,21
90 40 12 6,01 1,48 2,28 15,7 3,98
65
experimentais menos nos dados relativos à SFE a 100bar e 40ºC onde obtivemos desvios acima de
11%.
O modelo de Sovová apresenta uma modelação mais aplicada para a transferência de massa
no processo de extração de óleos vegetais com dióxido de carbono supercrítico. Este modelo assume
a existência de dois períodos no processo de extração, no primeiro o óleo de fácil acesso é removido
a uma taxa constante, e no segundo período a resistência interna à transferência de massa controla o
processo de extração, correspondendo a transferência de massa do óleo de difícil acesso, presente
no interior da matriz sólida.
Tendo em conta os gráficos apresentados era esperado que fossem identificados dois
períodos destintos: uma primeira parte em que se vê um aumento linear da curva no qual o óleo
extraído é de fácil acesso e ocorre rapidamente. E uma segunda parte onde se vê uma estabilização
da curva a tender para um patamar onde está a ser extraído o óleo de difícil acesso.
Uma das desvantagens deste modelo é que não inclui a interação matriz soluto, que
desempenha um papel fundamental na extração de óleos voláteis. Além disso, o coeficiente de
transferência de massa da fase fluida, Kf, além de descrever o período de equilíbrio da extração,
também reflete o seu desvio ao modelo de fluxo pistão, pois é obtido pelo ajuste da curva no período
de transição em relação ao rendimento experimental, pelo que os valores de Kf avaliados não são
confiáveis, a menos que o padrão de fluxo real seja levado em conta no modelo. Portanto, o Ks é
estimado de uma forma mais precisa, tornando-o mais significativo do que o coeficiente Kf. Isso é
corroborado pelo cálculo do coeficiente de transferência de massa externa usando a correlação
empírica proposta por Wakao e Kaguei [52] (Anexo I). Das Tabelas 20 e 21 pode-se observar que,
em geral, o Kf estimado pelo modelo é maior do que quando obtido pela correlação.
66
67
Conclusões e perspetivas futuras 6.
Tendo em conta o trabalho apresentado anteriormente verificou-se que o rendimento de
extração dos extratos e dos óleos de P. halepensis dependem da técnica de extração usada. Pelos
métodos de extração convencionais, nomeadamente a hidrodestilação e a extração em Soxhlet com
metanol e hexano, obtiveram-se os rendimentos 0,8% e 15,3% e 16,3%, respetivamente. Já os
rendimentos mais elevados obtidos pelos métodos não convencionais, nomeadamente da SFE de
óleos voláteis com CO2 e de extração por microondas, foram de 1,79% e 0,76%, respetivamente. Esta
diferença de valores entre os métodos convencionais e os não convencionais deve-se possivelmente
à extração de diferentes compostos que apresentam propriedades físico-químicas diferentes.
Foram estudadas diferentes condições de extração na SFE usando CO2, nomeadamente
diferentes pressões, temperaturas e caudais. Tendo em conta os diferentes caudais de extração,
verificou-se que os rendimentos de extração não foram afetados, as únicas diferenças verificadas
foram em relação ao tempo de extração uma vez que o óleo volátil da planta é sempre o mesmo e
não há alterações na densidade do solvente supercrítico. No entanto, quando se varia a temperatura
ou a pressão verifica-se que os rendimentos de extração sofrem alterações. Este facto pode dever-se
à alteração da densidade do solvente supercrítico que pode levar à extração de componentes não
voláteis.
Para analisar os constituintes dos óleos obtidos pelos métodos de extração estudados,
nomeadamente HD e SFE com CO2 foi feita uma análise GC-FID. Foram identificados treze
compostos dos quais o α-Pineno, β-cariofileno e o α -humuleno se encontravam em maior quantidade
para ambos os óleos. Os resultados estão de acordo com os resultados da literatura uma vez que, os
sesquiterpenos hidrocarbonados e os monoterpenos hidrocarbonados se encontram em maior
quantidade e os sesquiterpenos oxigenados em menor quantidade, no entanto não foram
identificados monoterpenos oxigenados.
Através do método de DPPH estudou-se a capacidade antioxidante dos extratos e óleos
voláteis obtidos. Verificou-se que o extrato com maior capacidade antioxidante é o obtido em Soxhlet
e o de óleos voláteis foi verificado na SFE a 100bar e a 40ºC tendo por base de comparação o
composto de referência Trolox.
Pelo estudo do teor de polifenóis, usando o método de Folin-Ciocalteau, verificou-se de igual
forma um teor de polifenóis mais elevado nos extratos obtidos em Soxhlet e dos óleos voláteis para a
SFE nas condições de 90bar e 40ºC.
De forma a testar as propriedades antimicrobianas e antifúngicas usou-se o teste de difusão
de discos onde se verificou que era eficaz contra todas as bactérias estudadas, menos a
Pseudomonas aeruginosa e não apresentava atividade antifúngica. Também foram realizados testes
68
antimicrobianos em meio líquido, através da microdiluição em caldo usando Bacillus subtilis, onde
também se verificou inibição no seu crescimento. No entanto, sabe-se que este efeito está
dependente das características dos microrganismos e da composição dos extratos pelo que seria
recomendável associar os métodos de difusão em disco e microdiluição em caldo para uma gama de
concentrações de extrato maiores para comprovar este efeito antimicrobiano.
A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais é atribuída a um número pequeno de
terpenos e compostos fenólicos, no entanto é difícil atribuir a atividade de uma mistura complexa a
um constituinte único ou particular, mas pode-se afirmar que a variação na composição química do
óleo essencial ou volátil pode ser responsável pelas diferentes atividades antibacterianas.
A modelação dos resultados experimentais da extração supercrítica permitiu um bom ajuste
dos dados experimentais da SFE do óleo volátil menos nas condições de 100 bar e 40ºC Nos dois
modelos estudados, Sovová 1994 e Sovová 2005, os coeficientes de transferência de massa interna
e externa apresentam valores na mesma ordem de grandeza e desvios padrão no ajuste entre 0,89%
e 14,19%. A utilidade prática destes modelos prende-se com a possível previsão de comportamentos
a diferentes condições de trabalho (pressão, temperatura e caudal de CO2), bem como o
conhecimento do regime em causa (laminar ou turbulento).
De forma a dar continuidade ao estudo de P. halepensis sugere-se a realização da SFE com
co-solventes, a realização de diferentes testes para avaliar a atividade antioxidante de modo a
consolidar os dados obtidos. Realizar o estudo do teor de flavonoides. Estudar a atividade biológica
em meio líquido com outras estirpes microbianas e ainda, comparar os extratos e os óleos obtidos ao
nível da sua composição química, por exemplo através de HPLC.
69
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74
75
76
Anexos 8.
ANEXO A - Distribuição do tamanho de partícula e determinação do diâmetro médio da mesma
Tabela 22:Determinação do diâmetro de partícula de P. halepensis depois da sua trituração e distribuição da mesma pelos diferentes peneiros com diferentes diâmetros
Diâmetro (mm) Massa (g) Fração Mássica F*D
1 136,48 0,275 0,275
0,8 147,13 0,296 0,237
0,63 161,42 0,325 0,205
0,5 36,49 0,073 0,0367
0,4 5,09 0,010 0,0041
0,315 5,66 0,011 0,0036
0,2 3,75 0,008 0,0015
0,1 1,15 0,002 0,00023
Diâmetro (mm) 0,76
ANEXO B – Determinação da densidade de Pinus halepensis
Tabela 23: Determinação da densidade aparente de P. halepensis
Volume (mL) Massa (g) Densidade (g/mL)
1,0 0,354 0,354
2,0 0,703 0,352
3,0 1,043 0,348
4,0 1,383 0,346
5,0 1,729 0,346
Média: 0,349
Desvio Padrão 0,004
Erro (%): 1,08
ANEXO C – Preparação de meios
- Meios de cultura usados:
Nutriente agar: Meio de cultura usado no crescimento de bactérias. A sua preparação foi
feita tendo em conta a indicação do frasco com uma concentração de 28g/L;
PDA: Meio de cultura usado no crescimento de fungos. A sua preparação foi feita tendo em
conta a indicação do frasco com uma concentração de 39,2g/L;
77
Malt Extract: Meio de cultura usado no crescimento de leveduras. A sua preparação foi feita
com uma concentração de 46g/L tendo em conta as seguintes proporções:
- Malt extratc:20g
- Peptona:6g
- Dextrose:20g
- 1 L de água destilada;
- Extratos:
Para estudar o efeito da inibição dos extratos obtidos por HD e ESF no método de difusão de
discos usou-se uma concentração de óleo de 60mg/mL. O solvente usado foi o DMSO.
Os cálculos para a obtenção desta concentração para os diferentes óleos encontram-se
especificadas na Tabela 24.
Tabela 24: Dados para o cálculo das diferentes concentrações de óleos e de solvente para a obtenção de uma concentração final de 60mg/mL
Massa
eppendorf
(g)
Massa
eppendorf +
Massa Óleo (g)
Massa Óleo (g) VDMSO
(mL)
VDMSO
(µL)
SFE -90bar_40ºC 2,788 2,813 0,025 0,423 423,3
SFE -100bar_40ºC 2,807 2,851 0,044 0,725 725,0
SFE- 110bar _50ºC 2,783 2,809 0,025 0,423 423,3
SFE-100bar _50ºC 2,807 2,836 0,029 0,482 481,7
HD 2,788 2,816 0,028 0,462 461,7
- Antibióticos usados:
Ampicilina:
- Preparar uma solução de 3mL com uma concentração de 7,5µg/mL (C16H18N3O4SNa);
- Transferir a suspensão em eppendorfs e armazenar a -4ºC.
Sulfato de Gentamicina:
- Preparar uma solução de 3mL com uma concentração de 330 μg/mL (11% de água e 571µg
Gentamicina base/mg);
- Transferir a suspensão em eppendorfs e armazenar a -4ºC.
Amphotericin b:
78
- Preparar uma solução de 1mL com uma concentração de 5,2mg/mL (C47H73NO17);
- Transferir a suspensão em eppendorfs e armazenar a -4ºC.
- Preparação da solução de 0.5 Farlan
-Preparar uma solução de 5mL com uma concentração de 0,48mol/L de Cloreto de Bário (1,175% v/v
de BaCl2.2H2O)
-Preparar uma solução de 0,18mol/L de Ácido Sulfúrico (H2SO4 a 1% v/v)
-Com agitação adicionar 0,5mL da solução de bário a 99,5mL de solução de H2SO4
-Verificar se a densidade da turbidez do padrão (absorvância) se encontra entre 0,08 -0,13 a 625nm
-Transferir a suspensão para tubos de 4 a 6mL em tubos de tampa roscada, selar e armazenar no
escuro à temperatura ambiente.
-Agitar sempre o padrão no vórtex antes de cada medição.
ANEXO D – Cálculo do Rendimento em Peso Seco da Hidrodestilação
Tabela 25: Determinação do rendimento da hidrodestilação com folhas de P. halepensis
Hidrodestilação M óleo (g) Rendimento (%)
1 0,784 0,784
2 0,825 0,825
3 0,775 0,775
Média: 0,795
79
ANEXO E- Microondas
Figura 40: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de 100ºC e 150W
durante 60minutos
80
Figura 41: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de 108ºC e 100W
durante 35minutos
81
Figura 42: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de 108ºC e 100W durante 65minutos
ANEXO F - Medições efetuadas para a obtenção do óleo supercrítico
Tabela 26: Medições efetuadas e rendimentos obtidos na Extração com CO2 Supercrítico para a obtenção do óleo volátil de P. halepensis
Ensaio
Tempo
(min) Volume de CO2 (mL) Massa extraída (g)
Rendimento de
Extração (%)
90bar
40ºC
8L/min
1 17,00 140,61 0,2209 0,316
2 17,75 146,23 0,2097 0,615
3 22,58 187,94 0,2776 1,012
4 26,43 214,18 0,1493 1,225
5 31,28 253,41 0,0986 1,366
6 38,09 309,41 0,1489 1,579
7 45,00 353,96 0,0921 1,710
110bar
50ºC
8L/min
1 18,00 140,00 0,1070 0,153
2 18,45 151,94 0,1142 0,316
3 23,20 192,94 0,1341 0,508
4 38,50 304,28 0,2116 0,810
5 50,00 400,45 0,2118 1,112
6 48,05 404,38 0,1439 1,318
100bar
40ºC
8L/min
1 18,83 133,42 0,1243 0,178
2 19,33 155,35 0,1862 0,444
3 25,58 204,71 0,2851 0,851
4 38,00 305,18 0,2549 1,215
5 50,93 404,60 0,3604 1,730
100bar
50ºC
8L/min
1 16,20 154,12 0,0570 0,081
2 23,23 201,13 0,0640 0,173
3 36,35 310,15 0,1271 0,354
4 47,12 401,37 0,1363 0,549
5 60,00 500,46 0,1156 0,714
6 72,97 603,24 0,1146 0,878
90bar
40ºC
5,73L/min
1 28,82 154,01 0,3726 0,308
2 27,88 147,80 0,3858 0,628
3 33,00 199,11 0,3717 0,935
4 42,37 252,46 0,3709 1,242
82
5 50,57 297,62 0,3652 1,544
6 68,00 399,08 0,2846 1,780
90bar
40ºC
12L/min
1 12,23 150,00 0,4098 0,339
2 15,83 199,52 0,4430 0,706
3 21,23 270,65 0,5268 1,141
4 24,88 306,57 0,3857 1,461
5 33,16 414,58 0,4042 1,795
ANEXO G – Comparação estatística
As comparações estatísticas foram realizadas pelo oneway ANOVA seguido pelo teste Turkey
HSD. Os valores que apresentam um valor de probabilidade (p) menor que 0,05 são considerados
estatisticamente não significativos.
- Poder Antioxidante
Tabela 27: Média dos valores de poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE estudadas
Condições Média Desvio Padrão
Erro (%)
Designação
SFE 90_40_6 0,61 0,05 8,20 A
SFE 90_40_12 0,57 0,03 5,26 B
SFE 90_40 0,44 0,03 6,82 C
SFE 110_50 0,56 0,05 8,93 D
SFE 100_40 0,63 0,04 6,35 E
SFE 100_50 0,57 0,04 7,02 F
HD 0,61 0,02 3,28 G
Soxhlet Hexano 5,89 0,24 4,07 H
Soxhlet Metanol 12,6 0,19 1,51 I
83
Tabela 28: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para o
poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE
Par
A B C D E F G H I
A
p-
value -
0.8999947
0.6441406
0.8999947
0.8999947
0.8999947
0.8999947
0.0010053
0.0010053
p - Insignificante
Insignificante
Insignificante
Insignificante
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
B
p-
value - -
0.8999947
0.8999947
0.8999947
0.8999947
0.8999947
0.0010053
0.0010053
p - -
Insignificante
Insignificante
Insignificante
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
C
p-
value - - -
0.8999947
0.5559413
0.8999947
0.6720432
0.0010053
0.0010053
p - - -
Insignificante
Insignificante
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
D
p-
value - - - -
0.8999947
0.8999947
0.8999947
0.0010053
0.0010053
p - - - -
Insignificante
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
E
p-
value - - - - -
0.8999947
0.8999947
0.0010053
0.0010053
p - - - - -
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
F
p-
value - - - - - -
0.8999947
0.0010053
0.0010053
p - - - - - -
Insignificante
<0,01 <0,01
G
p-
value - - - - - - -
0.0010053
0.0010053
p - - - - - - - <0,01 <0,01
H
p-
value - - - - - - - -
0.0010053
p - - - - - - - - <0,01
84
- Teor de Polifenois
Tabela 29: Média dos valores de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE estudadas
Condições Média Desvio Padrão
Erro (%)
Designação
SFE 90_40 0,44 0,02 4,27 A
SFE 110_50 0,35 0,24 6,86 B
SFE 100_40 0,37 0,01 2,11 C
SFE 90_40_6 0,42 0,01 3,46 D
SFE 90_40_12 0,35 0,01 2,33 E
SFE 100_50 0,36 0,01 3,5 F
HD 0,34 0,02 6,57 G
Soxhlet Hexano 0,51 0,02 4,23 H
Soxhlet Metanol 0,55 0,04 7,17 I
Tabela 30: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para o teor de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE
Par
A B C D E F G H I
A
p-
value - 0.0010
053
0.0181979
0.8999947
0.0011939
0.0010053
0.0010053
0.0010053
0.0078227
P - <0,01
p<0.05
Insignificante
<0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01
B
p-
value - -
0.6523915
0.0068670
0.8999947
0.8999947
0.8999947
0.0010053
0.0010053
P - -
Insignificante
p<0.01
Insignificante
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
C
p-
value - - -
0.1613756
0.7871381
0.8281449
0.3906172
0.0010053
0.0010053
P - - -
Insignificante
Insignificante
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
D
p-
value - - - -
0.0115368
0.0092676
0.0025169
0.0010053
0.0010053
P - - - -
p<0.05
<0,01 <0,01 <0,01 <0,01
E p-
value - - - - -
0.8999947
0.8999947
0.0010053
0.0010053
85
P - - - - -
Insignificante
Insignificante
<0,01 <0,01
F
p-
value - - - - - -
0.8999947
0.0010053
0.0010053
P - - - - - -
Insignificante
<0,01 <0,01
G
p-
value - - - - - - -
0.0010053
0.0010053
P - - - - - - - <0,01 <0,01
H
p-
value - - - - - - - -
0.4692917
P - - - - - - - -
Insignificante
- Atividade Antimicrobiana
Tabela 31: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus subtilis e respetivos desvio padrão e erros;
Média
Desvio Padrão
Erro (%)
Designação
Controlo 26,4 0,9 3,6
DMSO - - -
HD 10,3 1,0 9,6 A
SFE 90_40 14,1 0,1 0,5 B
SFE 110_50 14,3 0,1 1,0 C
SFE 100_40 14,7 0,5 3,4 D
SFE 100_50 11,6 0,6 5,5 E
MAE 11,7 0,1 0,9 F
86
Tabela 32:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Bacillus subtilis;
Par A B C D E F
A
p-value - 0.0028066 0.0022782 0.0013477 0.2947236 0.2043412
p - <0,01 <0,01 <0,01 Insignificante Insignificante
B
p-value - - 0.8999947 0.8828612 0.0209513 0.0290724
p - - Insignificante Insignificante <0,05 <0,05
C
p-value - - - 0.8999947 0.0159764 0.0219412
p - - - Insignificante <0,05 <0,05
D
p-value - - - - 0.0080862 0.0108165
p - - - - <0,01 <0,05
E
p-value - - - - - 0.8999947
p - - - - - Insignificante
Tabela 33: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Escherichia coli e respetivos desvio padrão e erros;
Média
Desvio Padrão
Erro (%)
Designação
Controlo 22,4 0,2 1,0
DMSO - - -
Hidrodestilação 9,4 0,4 4,1 A
SFE 90_40 9,9 0,8 7,9 B
SFE 110_50 9,1 0,2 2,5 C
SFE 100_40 11,4 0,3 2,5 D
SFE 100_50 11,3 0,5 4,7 E
MAE 9,7 0,3 3,2 F
87
Tabela 34: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Escherichia coli;
Par A B C D E F
A
p-value - 0.6843989 0.8999947 0.0010053 0.0010053 0.8999947
p - Insignificante Insignificante <0,01 <0,01 Insignificante
B
p-value - - 0.3893697 0.0043740 0.0063093 0.8999947
p - - Insignificante <0,01 <0,01 Insignificante
C
p-value - - - 0.0010053 0.0010053 0.7470496
p - - - <0,01 <0,01 Insignificante
D
p-value - - - - 0.8999947 0.0026709
p - - - - Insignificante <0,01
E
p-value - - - - - 0.0037435
p - - - - - <0,01
Tabela 35: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus pumilus e respetivos desvio padrão e erros;
Média
Desvio Padrão
Erro (%)
Designação
Controlo 22,0 1,0 4,55
DMSO - - -
Hidrodestilação 9,6 0,5 5,3 A
SFE 90_40 10,5 0,7 6,2 B
SFE 110_50 11,2 0,7 6,5 C
SFE 100_40 11,7 0,7 5,6 D
SFE 100_50 11,9 0,6 5,4 E
MAE 10,7 0,5 4,6 F
88
Tabela 36: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Bacillus pumilus;
Par A B C D E F
A
p-value - 0.3209812 0.0157638 0.0010053 0.0010053 0.4021565
p - Insignificante <0,05 <0,01 <0,01 Insignificante
B
p-value - - 0.6406530 0.1172982 0.0349517 0.8999947
p - - Insignificante Insignificante <0,05 Insignificante
C
p-value - - - 0.8540059 0.5235452 0.8999947
p - - - Insignificante Insignificante Insignificante
D
p-value - - - - 0.8999947 0.4229704
p - - - - Insignificante Insignificante
E
p-value - - - - - 0.2008390
p - - - - - Insignificante
Tabela 37:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Lactobacillus casei e respetivos desvio padrão e erros;
Média
Desvio Padrão
Erro (%)
Designação
Controlo 24,7 1,2 4,7
DMSO - - -
Hidrodestilação 10,0 0,7 7,4 A
SFE 90_40 10,8 0,6 5,3 B
SFE 110_50 12,7 1,2 9,6 C
SFE 100_40 10,2 0,5 5,2 D
SFE 100_50 10,7 0,3 2,5 E
MAE 10,0 0,7 7,4 F
89
Tabela 38: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Lactobacillus casei;
Par A B C D E F
A
p-value - 0.8999947 0.2196127 0.0010053 0.8970597 0.4281913
p - Insignificante Insignificante <0,01 Insignificante Insignificante
B
p-value - - 0.6238834 0.0010053 0.8999947 0.7935205
p - - Insignificante <0,01 Insignificante Insignificante
C
p-value - - - 0.0078546 0.8190097 0.8999947
p - - - <0,01 Insignificante Insignificante
D
p-value - - - - 0.0010661 0.0171641
p - - - - <0,01 <0,05
E
p-value - - - - - 0.8999947
p - - - - - Insignificante
Tabela 39:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de saccharomyces cerevisae e respetivos desvio padrão e erros;
Média
Desvio Padrão
Erro (%)
Designação
Controlo 14,5 0,7 4,9
DMSO - - -
Hidrodestilação 10,6 0,9 8,9 A
SFE 90_40 8,1 0,1 0,9 B
SFE 110_50 9,8 0,8 7,8 C
SFE 100_40 9,5 0,7 7,4 D
SFE 100_50 9,2 0,3 3,1 E
MAE 10,2 0,8 8,0 F
90
Tabela 40:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para saccharomyces cerevisae;
Par A B C D E F
A
p-value - 0.0205321 0.6297375 0.5523514 0.3255088 0.8999947
p - <0,05 Insignificante Insignificante Insignificante Insignificante
B
p-value - - 0.1649268 0.4502915 0.6529627 0.0550494
p - - Insignificante Insignificante Insignificante Insignificante
C
p-value - - - 0.8999947 0.8999947 0.8999947
p - - - Insignificante Insignificante Insignificante
D
p-value - - - - 0.8999947 0.8544063
p - - - - Insignificante Insignificante
E
p-value - - - - - 0.6205579
p - - - - - Insignificante
ANEXO H- Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis com extratos de P.
halepensis
Tabela 41: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,22 0,13
4 0,23 0,35
6 0,27 0,26
8 0,25 0,37
91
Tabela 42: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 2,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,24 0,06
4 0,24 0,08
6 0,22 0,35
8 0,14 0,27
Tabela 43: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 1mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,22 0,05
4 0,23 0,06
6 0,26 0,10
8 0,23 0,08
Tabela 44: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 0,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,21 0,17
4 0,24 0,08
6 0,24 0,11
8 0,22 0,06
92
Tabela 45: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,17 0,10
4 0,16 0,18
6 0,18 0,23
8 0,27 0,26
Tabela 46: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 2,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,20 0,05
4 0,24 0,06
6 0,24 0,11
8 0,17 0,26
Tabela 47: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 1mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,19 0,15
4 0,20 0,05
6 0,19 0,05
8 0,22 0,06
93
Tabela 48: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 0,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação
Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra
2 0,19 0,05
4 0,22 0,04
6 0,24 0,05
8 0,21 0,06
ANEXO I- Determinação do Coeficiente de transferência de massa pelo método de Wakao e
Kaguei
Tabela 49: Dados para o cálculo do kf teórico tendo em conta o método de Wakao e Kaguei
Para calcular o coeficiente de transferência de massa usei as seguintes fórmulas [52]:
- Cálculo do número de Reynols:
𝑅𝑒 =𝑑𝑝𝜌𝑓𝑢
𝜇𝑓
-Cálculo do número de Schmidt:
𝑆𝑐 =𝜇𝑓
𝜌𝑓𝐷12
-Cálculo do número de Sherwood:
𝑆ℎ = 2 + 1,1𝑅𝑒0,6𝑆𝑐1/3
Condições viscosidade
(cP) Pf
(kg/m3)
d(m) V*10e4 (m/s)
V12 (cm
3/mol)
Re Sh Sc D12*10e-
11 kf*10e6
90bar_40ºC_8L/min 0,034806 485,5 0,0458 3,20 219,95 204,27 431,31 4128,15 1,74 0,16
100bar_40ºC_8L/min 0,047825 628,61 0,0458 2,32 221,44 139,81 297,65 2668,26 2,85 0,19
100bar_50ºC_8L/min 0,028368 386 0,0458 4,39 221,44 273,59 387,53 1766,85 4,16 0,35
110bar_50ºC_8L/min 0,03661 502,64 0,0458 3,05 219,066 191,54 318,82 1862,87 3,91 0,27
90bar_40ºC_6L/min 0,034806 485,5 0,0458 2,15 219,95 137,31 340,27 4128,15 1,74 0,13
90bar_40ºC_12L/min 0,034806 485,5 0,0458 4,83 219,95 308,68 551,99 4128,15 1,74 0,21
94
-Estimativa do coeficiente de difusão:
𝐷12 = 7,4 × 10−12
𝑇√∅𝑀1
𝜇𝑓𝑉2𝑏𝑝0,6
-Cálculo do coeficiente de transferência de massa:
𝑆ℎ =𝑑𝑝𝐾𝑓
𝐷12
Onde:
𝑑𝑝 – Diâmetro do leito, m
𝜌𝑓 – Densidade do solvente
𝑢- Velocidade, m/s
𝜇𝑓- Viscosidade do solvente, cP (http://webbook.nist.gov/chemistry)
∅- Fator de fluidos,assume valor 1 para o Dioxido de Carbono
𝑉2𝑏𝑝-Volume molar do óleo volátil, foi calculado tendo em conta os três maiores constituintes do óleo
essencial, α-Pineno, β-cariofileno e α-humuleno, m3/kmol
𝑀1- Massa Molar do Dióxido de Carbono, Kg/Kmol
𝑇- Temperatuira usada na SFE, K