extracciÓn de adn y diferenciaciÓn de especies de...
TRANSCRIPT
1. C. yuhsienensis
4. C. grijsii
5. C. caudata
Marcadores RAPDS
Conclusiones
pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 C
500
1000
2. C. longicarpa
Este trabajo ha sido financiado por la Xunta de Galicia (proyecto XUGA PGIDIT03RAG60301PR)
6. C. sasanqua
7. C. salicifolia
8. C. sinensis
5. C.lutchuensis
EXTRACCIÓN DE ADN Y DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DEMEDIANTE MARCADORES RAPD-PCRCAMELLIA
Vela P. , Aguín O. , C. Salinero , M. J. Sainz1 1 1 2
Estación Fitopatológica do Areeiro. Diputación Provincial de Pontevedra. Subida a la Robleda s/n. 36153 Pontevedra. España. www.efa-dip.orgDpto. de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela. Campus Universitario, 27002 Lugo, España.
1
C. transnokoensis
C. oleifera
C. polyodonta
C. taliensis
9416
pbM C2 3 4 51 M6 7 8
pb
2313023130
655794166557
43614361
Extracción del ADN genómico de 8 especies de mediante el Kit
Puregene: calles 1-8; C: control negativo; M: marcador Lambda Hind III.
Camellia
Se utilizaron 24 primers, de los que sólo 4 ( generaron bandas polimórficas, reproducibles y claras. La reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en un termociclador PCR- Express - ThermoHybaid siguiendo el ciclo propuesto por Parks (2000). La reacción estándar
para un volumen final de 20 µl contenía: 2ng/µl de ADN, 0.4 µM de primer, 100 µM de cada dNTP, 2 mM de MgCl y 0.06 u/µl de Taq-polimerasa. La electroforesis
se llevó a cabo a 100 voltios durante 90 minutos en gel de agarosa al 2% en tampón TBE 1X. La tinción se realizó con bromuro de etidio durante 30 minutos y las
bandas se visualizaron con un transiluminador y se fotografiaron.
OPAA-01, OPAA-03, OPAA-04 y OPAG-15)
et al
2
Bandas generadas con el primer OPAA - 01 (5’ - AGACGGCTCC- 3’) en gel
de agarosa (2%), donde M: marcador de 100 bp (MWM XIV); calles 1-8:
especies de ; C: control negativo.Camellia
Los primers OPAA-01, OPAA-03, OPAA-04 y OPAG-15 sirven para diferenciar 8 especies de estudiadas, ya que generan patrones de bandas diferentes para
cada una de ellas, pero es necesario ampliar los estudios para conseguir desarrollar marcadores que permitan la identificación de cultivares.
Camellia
2 ciclos:60 s a 92 ºC7 s a 42 ºC70 s a 72 ºC
38 ciclos:1 s a 92 ºC7 s a 42 ºC70 s a 72 ºC
4 min a 72 ºC
Ciclos de PCR:
Material vegetal Estado Protocolos de extracción de ADN
Yema
Brote
Hoja
Capullo
Fresco
Congelado
Liofilizado
SDS:Isopropanol
EZNA plant DNA Miniprep kit (Omega-Biotek)
Puregene DNA Isolation kit (Gentra System)
V Congreso Ibérico de Ciencias Hortícolas, Porto (Portugal) del 22 al 27 de mayo de 2005