expressão gênica: princípios e aplicações rodrigo a. panepucci
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Expressão Gênica: Princípios e Expressão Gênica: Princípios e AplicaçõesAplicações
Rodrigo A. Panepucci
Genoma Humano:
30 a 60 mil genes
3 bilhões pb
23 pares cromossômicos (50~300 milhões pb cada)
Como estudar tamanha complexidade, de forma abrangente ?
RNA mensageiroRNA mensageiro
Estrutura GênicaEstrutura Gênica
ProximalPromoterElement (TFBS)TATA box
Exon
Enhanceror UAS
Intron
-200 -30-10 to –50 kb +10 to +50 kb
TranscriçãoRNA
mRNA
Regiões Regulatórias Região Codante
DNA e RNADNA e RNA
Hibridização de Ácidos Hibridização de Ácidos NucléicosNucléicos
Northern BlottingNorthern Blotting
Probe labeling
pBS-SemaIII
dATP
dGTPdTTP
dCTPRNA isolation
AAAAAA
Gel electophoresis
Blotting
Hybridization
Autoradiography
Reverse Northern BlottingReverse Northern Blotting
Down-regulation of transcripts
Up-regulation of transcripts
* * labeled (specific) probe
target
Northern
* *
specific probes
labeled target
reverse Northern
Macro-ArraysMacro-Arrays
Densidade baixaMembranasSondas radioativasBaixa sensitividadeSpots de cDNABarato $
Alta densidadeLaminas de VidroSondas fluorescentesAlta sensitividadeSpots com cDNA ou OligonucleotideosCaro $$$
Micro-ArraysMicro-Arrays
Spots
Hibridização
Quantificando a Expressão Quantificando a Expressão GênicaGênica
Célula ou TecidoNormal
Célula ou TecidoNeoplásico
Célula ou TecidoIndiferenciado
Célula ou TecidoDiferenciado
A1x A1y
A2x A2y
A3x A3y
Duplicatas
A1A2A3
x y
Amostras
B1x B1y
B2x B2y
B3x B3y
Duplicatas
B1B2B3
x y
Amostras
Abordagem ExperimentalAbordagem Experimental
Plataforma CodeLinkPlataforma CodeLink
RNA totalRNA bacteriano
(controle) Transcrição reversa
Síntese da segunda fita de cDNA
Fragmentação & Hibridização
Matriz em gel
Sondas
cRNA
Biotina
Detecção
Biotina
Conjugado
Estreptavidina
T7 RNA polimerase e rNTPs biotinilados
TTTTT - T7
AAAAATTTTT - T7
TTTTT
cRNA
Plataforma CodeLinkPlataforma CodeLink
~ 10.000Genes
MicroarraysMicroarrays de oligonucleotídeos de oligonucleotídeos (CodeLink Human UniSet I)
AplicaçõesAplicações
Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)
Alvos terapêuticos
Marcadores Diagnósticos
Marcadores Prognósticos
Mecanismo de ação de drogas
Linfoma de Células do MantoLinfoma de Células do Manto
Zona marginalZona do manto
Origem CelularOrigem Celular
Centro germinativoCentro germinativo
Adaptado: Delves & Roitt. NEJMNEJM 343:108, 2000
(Linfócitos B virgens)(Linfócitos B virgens)
14q32
Ig Cµ
11q13
Ciclina D1
Translocação t(11;14)(q13;q32)
Patogênese molecularPatogênese molecular
Linfoma decélulas
do manto
LinfócitoB
virgemX
ObjetivoObjetivo
Vias alteradas(Alvos Terapeuticos)
Amostras de células isoladas com elevado grau de pureza
Microarrays
ScreeningMCL – 3
VsNBC - 3
MCL MCL NBCNBC
ValidaçãoMCL (PB) - 21MCL (pure) – 6NBC - 4
GenesGenesDiferencialmente ExpressosDiferencialmente Expressos
Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/
Redes de Associação BiológicasRedes de Associação Biológicas(Pathway Studio)(Pathway Studio)
MedScanMedScan
MedScanMedScan
Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/
Interpretação dasInterpretação dasRedes de Associação BiológicasRedes de Associação Biológicas
Identificação de Vias de SinalizaçãoIdentificação de Vias de Sinalização
Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/
Vias de Sinalização AlteradasVias de Sinalização Alteradasno Linfoma de Células do Mantono Linfoma de Células do Manto
• Genes relacionados à apoptose
• Via PI3K/AKT (Fosfatidilinositol-3-quinase-AKT)
• Via WNT
• Via TGFβ (Fator de crescimento tumoral β)
PIK3R1PIK3CA
AKT
AKT
PDK1 PDK2AKT AKTP
PP
P
Thr308Ser473
Thr308Ser473
Alvos celulares
PIP2
PIP3
p110p85
Via de sinalização PI3K/AKTVia de sinalização PI3K/AKT
Adaptado: Vivanco & Sawyers. Nat Rev CancerNat Rev Cancer 2:489, 2002
AplicaçõesAplicações
Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)
Alvos terapêuticos
Marcadores Diagnósticos
Marcadores Prognósticos
Mecanismo de ação de drogas
Copyright ©2006 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.
Gold, M. R. Blood 2006;108:1425-1426
AKTion on Mantle Cell Lymphoma
Linfoma de células do mantoLinfoma de células do manto
AplicaçõesAplicações
Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)
Alvos terapêuticos
Marcadores Diagnósticos
Marcadores Prognósticos
Mecanismo de ação de drogas
Mecanismo de ação de drogas
Ação in-vitro do inibidor da via TGF-B (Halofuginona), na linhagem GRANTA de Linfoma da Zona do Manto
Efeito in-vivo da droga Hidroxyurea na Anemia Falciforme
AplicaçõesAplicações
Pesquisa Básica (Biologia do Câncer)
Alvos terapêuticos
Marcadores Diagnósticos
Marcadores Prognósticos
Mecanismo de ação de drogas
Baixo Risco
LLA Pediátrico
Diagnostico:
Reavaliação: Baixo Risco
Baixo Risco
Alto Risco
Quimioterapia
Baixo Risco
Expressão Gênica e Risco Associado
Diagnóstico:
Reavaliação: Baixo Risco
Baixo Risco
Alto Risco
Avaliação da expressão gênica ao diagnósticoAgrupamento baseado na reavaliação
Baixo Risco
Expressão Gênica e Marcadores
Diagnóstico:
Reavaliação: Baixo Risco
Baixo Risco
Alto Risco
Marcadores de Prognóstico ou Diagnóstico DiferencialSERP1 - 25 ALL children (14 good responders vs 11 poor responders)
Baixo Risco
Bases Moleculares do Risco
Diagnóstico:
Reavaliação: Baixo Risco
Baixo Risco
Alto Risco
Anti-Apoptóticos ? Proliferação ? Resistência a Drogas ?
Baixo RiscoDiagnóstico:
Reavaliação: Baixo Risco
Baixo Risco
Alto Risco
Pró-Apoptóticos ? Anti-Proliferação ?
Bases Moleculares do Risco
Bases Moleculares daMudança de Risco
Pró-Apoptóticos
Anti-Apoptóticos
AplicaçõesAplicações
Pesquisa Básica (Biologia de Células Tronco)
Alvos terapêuticos
Marcadores Diagnósticos
Marcadores Prognósticos
Mecanismo de ação de drogas
Células Tronco Hematopoéticas
CD34+CD34+&&
CD133+CD133+
Células CD133+ Uma sub-população mais primitiva dentre as CD34+(Potencial endotelial)
Redes TranscricionaisRedes Transcricionais
BM
A1A2
B1B2
UCB BM UCB
12
12
12
1 & 2 = Pooled SamplesA & B = Individual Samples
Experimental Design
CodeLink Human UniSet I (~10.000 genes)
CD34 CD133Vs
Comparison of gene expression profiles betweenCD133+ and CD34+ from BM & UCB cells
CD133+ (BM&UCB) CD34+ (BM&UCB)
Vs
891 Up-Regulated in CD133+ 375 Down-Regulated in CD133+
Name DescriptionCTNNA2 catenin (cadherin-associated protein), alpha 2DLX2 distal-less homeo box 2E4F1 E4F transcription factor 1EP300 E1A binding protein p300FOXG1B forkhead box G1BGATA3 GATA binding protein 3HMGA1 high mobility group AT-hook 1HOXA9 homeo box A9HOXB4 homeo box B4HOXC6 homeo box C6JUND jun D proto-oncogeneKLF2 Kruppel-like factor 2 (lung)MEF2D MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide D
(myocyte enhancer factor 2D)PAX5 paired box gene 5 (B-cell lineage specific activator)PAX6 paired box gene 6 (aniridia, keratitis)PML promyelocytic leukemiaRUNX1 runt-related transcription factor 1 (acute myeloid
leukemia 1; aml1 oncogene)SRF serum response factorTAL1 T-cell acute lymphocytic leukemia 1USF1 upstream transcription factor 1
47Differentially
ExpressedTranscription
Factors
Hemato-Endothelial
Related
Transcription Factors Over-Representedin CD133 cells
GATA3 (BM: CD34-CD133)
BM-CD34 BM-CD1330.25
0.5
1
2
4
8
16
32
Samples
Fold
(Lo
g 2)
P < 0.0001
Mann-Whitney Test
Higher Expression of GATA3 in CD133+ Cells
GATA3
Complexo Transcricional eFatores de Transcrição (TF)
Complexo Transcricional eFatores de Transcrição (TF)
Fatores de Transcrição (TFs)Fatores de Transcrição (TFs)Zinc FingerZinc Finger
123456789……AAGTTAATGACTAACCGGTTAATGAGAACCAGGTTAATGAGAACCAAGTTAATGATTGACAAGTTAATGATTGACCAGTTAATGATTGACAAGTTAATGATTGACAAGTTAATGATTGAC AGGTTAATGACTAACGGGTTAATGACTAACACGTTAATGACTAACGTGTTAATGACTAACAAGTTAATGACTAACGAGTTAATGACTAACCAGTTAATGACTAACAAGTTAATGACTAACAAGTTAATGACTAACATGTTAATGACTAAC
Pos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15A 14 16 4 0 1 19 20 1 4 13 4 4 13 12 3C 3 0 0 0 0 0 0 0 7 3 1 0 3 1 12G 4 3 17 0 0 2 0 0 9 1 3 0 5 2 2T 0 2 0 21 20 0 1 20 1 4 13 17 0 6 4
• Uma matriz de freqüência (PWM) para um Fator de Transcrição pode ser construída a partir de um conjunto de sítios de ligação determinados empiricamente.
Representação Esquemática
Sítios de Ligação de TFsSítios de Ligação de TFs
Promoter Analysis Transcription Element Listening System (TELIS)
V$NFKAPPAB_01V$NFKAPPAB65_01V$CREL_01
600bp Upstream Promoters of 44 Differentially Expressed Transcription
Factors
TF-BS Search
Statistically Significant
(Top 3)
Highly Stringent
FrequencyNumber of binding sites
per promoter
Incidence% of promoters with at least one binding site
1. V$NFKAPPAB_01z = 4.37 p = 1.25E-5
Sample mean = 0.114Population mean = 0.020
Ratio = 5.8
n = 4/44 p = 0.0097Sample mean = 9.09%Population mean = 1.90%Ratio = 4.8
2. V$NFKAPPAB65_01
z = 4.10 p = 4.10E-5Sample mean = 0.114
Population mean = 0.022Ratio = 5.2
n = 5/44 p = 0.0025Sample mean = 11.36%Population mean = 2.15%Ratio = 5.3
3. V$CREL_01
z = 3.07 p = 0.0022Sample mean = 0.182
Population mean = 0.063Ratio = 2.9
n = 7/44 p = 0.0149Sample mean = 15.91%Population mean = 5.98%Ratio = 2.7
Overrepresented NFB Biding Sites andTF Genes Potentially Up-Regulated by NFB
in CD133+ cells
p50 p65
O Fator Transcricional NF-B
NFKB1
NFKB2
Chen et al, 1998, Nature, Vol 391 -N 22
RelA
NFKB2 (BM: CD34-CD133)
BM-CD34 BM-CD1330.125
0.250.5
1248
163264
Samples
Fold
(Lo
g 2)
RELB (BM : CD34-CD133)
BM-CD34 BM-CD1330.25
0.5
1
2
4
8
16
Samples
Fold
(Lo
g 2)
P = 0.0247 P = 0.0944
Mann-Whitney Test
Higher Expression ofNon-Canonical NFB Sub-units onCD133+ HSC Compared to CD34+
NFB2 RELB
Correlation RELB (BM-CD133)
-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -74
5
6
7
8
9
10
NFKB2 (Ct)
RE
LB (
Ct)
P = 0.0002
Spearman’s Correlation (r = 0.6028)
0 to 2 TF Binding Sites
Correlation of NFB2 and RELB Levelsin HSC
CorrelationRELB & NFKB2
0 to 2 TF Binding Sites
Correlation GATA3 (BM-CD133)
-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7
6
7
8
9
10
NFKB2 (Ct)
GA
TA3
(C
t)
P = 0.0008
Spearman Correlation (r = 0.5415)
Correlation GATA3 BM CD133+
Correlation of NFKB2 and GATA3in HSC
Correlation RELB-GATA3 (BM-CD133)
4 5 6 7 8 9 10 11
6
7
8
9
10
RELB(Ct)
GA
TA3
(C
t)
0 to 2 TF Binding SitesP = 0.0013
Spearman’s Correlation (r = 0.4995)
Correlation GATA3 & RELB
Correlation of RELB and GATA3in HSC
RNAi
GATA3 NFKB2 RELB02468
101214
Unstimulated CD34Stimulated CD34 (Control)Stimulated CD34 (NFKB2 RNAi)
125
150
175
Evaluated Transcript
Rel
ativ
e Fo
ld C
hang
e
Effect of NFKB2 RNAi Inhibition onRELB and GATA3 Levels
NFKB2Inhibition