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Mauro Pellegrino Avanzi
Expansão ex-vivo de megacariócitos e
proplaquetas a partir de células-tronco
Tese apresentada ao Curso de Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo
para obtenção de título de Doutor em
Medicina
Área de concentração:
Ciências de Saúde
Orientador:
Prof. Dr. Carlos Sérgio Chiattone
São Paulo
2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Avanzi, Mauro Pellegino Expansão ex-vivo de megacariócitos e proplaquetas a partir de células-tronco./Mauro Pellegino Avanzi. São Paulo, 2014.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Carlos Sergio Chiattone 1. Células tronco 2. Megacariócitos 3. Proplaquetas
BC-FCMSCSP/12-14
Aos meus pais, Osmar e Mariza,
serei para sempre grato pelo exemplo,
pelo amor incondicional e por todo o
esforço na minha educação.
Aos meus irmãos, Daniella, Patrícia, Dante e Thaís,
companheiros e sempre presentes
em minhas realizações e vitórias
Agradecimentos
À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, por fornecer todos
os recursos necessários para a realização desta tese.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – FCMSCSP,
na pessoa do Diretor Prof. Dr. Valdir Golin, pela oportunidade de realizar essa
pós-graduação.
À coordenação do curso de Pós-graduação da FCMSCSP, na pessoa do Prof.
Dr. Carlos Alberto Longhi, pelo suporte para a realização deste estudo.
À coordenação do curso de Pós-graduação em Ciências da Saúde da
FCMSCSP, na pessoa da Profa. Dra. Yvoty Alves dos Santos Sens, pelo apoio
no desenrolar desta tese.
Ao Prof. Dr. Carlos Sérgio Chiattone, meu orientador, que me incentivou e me
conduziu pelo processo de ensino à investigação científica.
Ao Prof. Dr. Dante Langhi Jr, que sempre me orientou e incentivou no processo
de pesquisa e pós-gradução.
Ao Dr. W. Beau Mitchell, coordenador do laboratório de biologia plaquetária do
New York Blood Center, que participou direta e ativamente na elaboração das
ideias e experimentos apresentados nesta tese. Ao longo de anos de trabalho
tornou-se um grande mestre e amigo.
Ao Dr. Mohandas Narla e ao Dr. Christopher Hillyer do New York Blood Center
pelo apoio a esse projeto e por fornecerem condições para sua execução.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela assistência ao curso de pós-graduação no Brasil, em especial à Faculdade
de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo.
Sumário
1. Introdução ---------------------------------------------------------------------------- 8
2. Objetivos ------------------------------------------------------------------------------ 12
3. Artigos anexos ---------------------------------------------------------------------- 15
3.1 Artigo 1 --------------------------------------------------------------------------- 15
3.2 Artigo 2 --------------------------------------------------------------------------- 23
3.3 Artigo 3 --------------------------------------------------------------------------- 33
4. Considerações finais -------------------------------------------------------------- 44
5. Levantamento Bibliográfico ---------------------------------------------------- 45
6. Anexos --------------------------------------------------------------------------------- 50
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Introdução
Todos os anos milhões de pacientes no Brasil e no mundo sofrem de
doenças que cursam com trombocitopenia e que vão, em algum momento,
necessitar de transfusão de concentrado de plaquetas (1, 2). A trombocitopenia
acarreta distúrbios na coagulação primária e tem como principal complicação
clínica o surgimento de sangramentos espontâneos ou provocados por traumas
(3). As principais condições patológicas que levam à trombocitopenia são
tratamentos quimioterápicos, desordens autoimunes, infecções graves e
cirurgias de grande porte (3). A transfusão de concentrado de plaquetas exerce
papel fundamental na prevenção e tratamento desses distúrbios hemorrágicos.
Porém, o processo de obtenção de plaquetas é, não somente demorado e
custoso, como depende exclusivamente de doadores voluntários (1). A
crescente demanda associada à insuficiência de doadores voluntários e o curto
período de armazenamento acarretam a constante escassez de concentrados
de plaqueta para uso clínico (1).
Plaquetas são fragmentos celulares de megacariócitos produzidos na
medula óssea e desempenham papel fundamental na coagulação sanguínea.
Aproximadamente 1 trilhão de plaquetas encontram-se em circulação no corpo
humano e são completamente repostas a aproximadamente cada 10 dias (3).
Os processos patológicos que cursam com trombocitopenia aumentam
consideravelmente a necessidade de plaquetas circulantes e,
consequentemente, exigem um incremento significativo na função medular. As
plaquetas, apesar de serem células anucleadas, apresentam um citoesqueleto
9
altamente organizado e armazenam em seu citoplasma mais de 300 proteínas
necessárias ao processo de coagulação. As plaquetas têm função não
somente na coagulação, mas também em processos inflamatórios, crescimento
vascular e metástase tumoral (3).
Há grande interesse na possibilidade de se produzir plaquetas em
laboratório em larga escala a partir de células-tronco (4-6). Células-tronco são
células indiferenciadas, em estado imaturo de desenvolvimento e capazes de
se replicarem ou diferenciarem em uma gama diversa de células (7). Os
principais tipos conhecidos de células-tronco são: células-tronco embrionárias
(HESC) (7), células-tronco pluripotentes induzidas (IPS) (8) e células-tronco
hematopoiéticas (CTH) (9). CTH são células progenitoras que se encontram
principalmente na medula óssea ou em circulação sanguínea, sendo capazes
de se diferenciar em todos os tipos de linhagens celulares sanguíneas. CTH
podem ser obtidas principalmente a partir de medula óssea, cordão umbilical
ou sangue periférico com auxílio de máquinas de aférese (10).
Alguns grupos de pesquisa vêm desenvolvendo métodos de
diferenciação de células-tronco em megacariócitos e plaquetas para uso clínico
(6, 11-14). Porém, com os métodos de expansão e diferenciação celular
disponíveis atualmente a quantidade de plaquetas produzidas em laboratório é
muito baixa para ser aplicada clinicamente (15). Avanços recentes no estudo
do desenvolvimento de células-tronco e megacariócitos proporcionaram
informações importantes na elucidação dos mecanismos envolvidos na
expansão celular e produção de plaquetas a partir de megacariócitos (16-19).
O refinamento de técnicas de expansão de células-tronco em laboratório (9, 20,
10
21) e um aprofundamento na compreensão das vias de sinalização envolvidas
no processo de maturação de megacariócitos e liberação de plaquetas (19, 22)
geram nova esperança de se tornar possível a produção de plaquetas ex-vivo.
Utilizando-nos desse conhecimento adquirido, associado a conceitos e ideias
inovadoras, propusemos um modelo de expansão que combine as mais
diversas técnicas e estratégias para se obter plaquetas ex-vivo em larga
escala. Para tanto, foram utilizadas exclusivamente células-tronco humanas
derivadas de cordão umbilical e foram utilizados somente reagentes livres de
produtos animais e/ou derivados de plasma.
O complexo processo de produção de plaquetas a partir de células-
tronco pode ser dividido em diversas fases, dependendo da característica da
célula, processos intra-celulares e influência do micro ambiente. De forma
geral, células-tronco hematopoiéticas são recrutadas para a linhagem
megacariocítica pela citocina trombopoietina (TPO) (23). A TPO estimula o
desenvolvimento e produção de proteínas específicas da linhagem
megacariocítica e sinaliza para que a célula entre num processo característico
de duplicação nuclear denominado endomitose (23). O megacariócito
amadurece em um meio ambiente, ou nicho, da medula óssea interagindo com
proteínas e com a matriz extracelular, o que possibilita seu amadurecimento e
crescimento em um local específico. Esse meio ambiente também inibe a
liberação de plaquetas e permite que o megacariócito exclusivamente
amadureça e cresça. A presença de colágeno tipo I exerce papel fundamental
nesse processo de inibição da liberação de plaquetas por megacariócitos
maduros no ambiente medular (18). Os megacariócitos têm a marcante
11
característica de duplicar seu conteúdo nuclear sem realizar divisão celular,
processo esse denominado de endomitose. Esse processo permite que o
megacariócito adquira grande tamanho e possua um conteúdo nuclear até 64
vezes superior ao normal. O aumento do conteúdo nuclear, ou poliploidização,
tem papel fundamental na produção de plaquetas, permitindo que o
megacariócito produza grandes quantidades de proteínas e organelas
necessárias à formação e funcionamento da plaqueta (17, 24). O
desenvolvimento de um complexo sistema de membranas citoplasmáticas,
denominado Sistema de Demarcação de Membrana (SDM), possibilita o
aumento da superfície celular e, consequentemente, um incremento na
produção de plaquetas (25). À medida que o megacariócito amadurece, seus
antígenos de superfície mudam e a célula se torna menos aderente ao meio
ambiente da medula óssea e pronta para migrar para perto dos capilares
sanguíneos num ambiente denominado de nicho perivascular. O megacariócito
maduro é estimulado a migrar para o nicho perivascular por intermédio de uma
série de sinais, sendo o principal deles a proteína SDF1-α (22). A partir do
momento em que o megacariócito se aproxima do ambiente vascular os
processos de inibição da liberação de plaquetas cessam e a célula passa a
receber estímulos de produção e liberação de proplaquetas e plaquetas. As
proplaquetas são extensões citoplasmáticas do megacariócito e contêm todos
os elementos para a composição da plaqueta (26-28). As proplaquetas se
estendem por entre as células endoteliais dos vasos até chegarem ao lúmem
vascular. Uma vez dentro do lúmen, o fluxo sanguíneo, por força de tração,
leva à liberação das plaquetas a partir das extremidades das proplaquetas.
12
Objetivos
É possível vislumbrar a produção em larga escala de plaquetas em
laboratório a partir de células-tronco hematopoiéticas. O processo de produção
de plaquetas a partir de células-tronco foi dividido em etapas. Cada etapa
corresponde a um momento específico do desenvolvimento celular,
possibilitando fornecer condições de cultura específicas para cada um desses
estágios. Para que haja a produção em larga escala de plaquetas é necessário
que duas barreiras sejam transpassadas. Primeiramente, há a necessidade de
se maximizar o número de megacariócitos em cultura e aumentar o grau de
poliploidização dessas células. A segunda barreira é reverter a inibição inata ao
processo de liberação plaquetária e, ao mesmo tempo, estimular a liberação de
proplaquetas e plaquetas. Essa inibição se faz importante dentro da medula
óssea, para que não haja a liberação de plaquetas em local e momento
indevidos. Porém, em cultura, essa inibição deve ser revertida a fim de que
haja a liberação maciça de plaquetas pelos megacariócitos. Para que esses
objetivos fossem alcançados, o projeto foi dividido em três etapas principais: 1)
expansão de megacariócitos; 2) indução de poliploidização nos megacariócitos;
3) estímulo à formação de proplaquetas. As etapas foram realizadas
inicialmente de forma separada a fim de determinar as condições adequadas
para sua otimização e, em seguida, executadas em sequência, simulando
assim as reais condições de produção fisiológica de plaquetas na medula
óssea.
Esse projeto visou desenvolver métodos laboratoriais para a produção
em larga escala de proplaquetas e plaquetas para transfusão, utilizando-se
13
como fonte células-tronco hematopoiéticas derivadas de cordão umbilical.
Desenvolvemos durante esse projeto estratégias que potencializassem e
incrementassem cada um das etapas do processo de produção de
proplaquetas e plaquetas. A utilização sequencial dessas estratégias
possibilitou um aumeto significativo na produção de proplaquetas ex-vivo.
Os artigos anexados a essa tese descrevem exatamente as etapas
acima mencionadas. O primeiro artigo descreve estratégias utilizadas com o
objetivo de aumentar o grau de poliploidização dos megacariócitos cultivados.
Mostramos que a inibição de miosina via um inibidor de Rho-Rock foi capaz de
aumentar siginificativamente os níveis de ploidia megacariocitária. Além disso,
propomos um novo modelo de sinalização celular em que a inibição de Rho-
Rock não age somente em receptores de miosina e fibras de stress mas
também tem efeito na lamelopodia, na actina, na replicação de DNA e interfere
na formação de microtubos. Todas essas funções somadas fazem com que o
inibidor de Rho-rock tenha um efeito tão pronunciado no aumento dos graus de
poliploidização.
O segundo artigo anexado mostra que o uso de inibidores de Rho-Rock
não somente leva a um aumento na ploidia megacariocitária mas também a um
aumento na extensão do Sistema de Demarcação de Membranas (SDM) e,
principalmente, acarreta um expressivo incremento nos níveis de liberação de
proplaquetas. Além disso, mostramos também a necessidade de inibição dos
genes Myc e NF-E2 para que haja não somente aumento dos níveis de ploidia
do megacariócito, mas também incremento nos níveis de liberação de
proplaquetas.
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O terceiro artigo anexado nessa tese é um artigo de revisão sobre a
produção ex-vivo de plaquetas a partir de células-tronco. Esse artigo mostra os
principais avanços ocorridos nesta área nos últimos anos, as dificuldades
encontradas por diferentes grupos e as perspectivas futuras para a produção
em larga escala de plaquetas a partir de células-tronco.
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Considerações finais
O processo de produção em larga escala de plaquetas a partir de
células-tronco vem se desenvolvendo rapidamente e é muito provavel que em
breve faça parte da prática clínica transfusional. Porém, alguns obstáculos
ainda precisam ser transpostos para que isso realmente se torne realidade.
Essa tese apresenta possíveis soluções para problemas práticos encontrados
na produção de proplaquetas e plaquetas em larga-escala. Nos dois artigos
publicados e anexados apresentamos estratégias que utilizam inibidores de
Rho-Rock para aumentar, não somente o grau de poliploidização dos
megacariócitos, mas também os níveis de liberação de proplaquetas. Além
disso, descrevemos novas vias de sinalização no processo de poliploidização e
mostramos a importância de genes como Myc e NF-E2 no processo de
formação de proplaquetas. Essa definição dos genes responsáveis pelo
processo de poliploidização e liberação de proplaquetas é de suma
importância, pois permitirá a engenharia de células com a expressão desejada
desse genes. Esse processo de engenharia celular tornará possível simular em
laboratório o comportamento fisiológico dos megacariócitos e,
consequentemente, otimizar o processo de liberação plaquetária. Sendo assim,
as descobertas aqui apresentadas representam avanços importantes no
processo de produção em larga escala de plaquetas em laboratório. Porém,
outros obstáculos ainda devem ser transpostos e mais pesquisas devem ser
realizadas a fim de que a produção ex-vivo de plaquetas em larga-escala se
torne uma realidade.
45
Levantamento bibliográfico
Referências citadas na tese: (1-28)
Referências citadas somente nos artigos: (29-81)
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Anexos
1. Aprovação do Comitê de Ética