examen final de doctorado
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS
AVANZADOS DEL I.P.N. Unidad – Irapuato.
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS
FOSFATASAS ÁCIDAS DE MEMBRANA PLASMÁTICA DE
BETABEL (Beta vulgaris L.)
M. en C. Eduardo Armienta Aldana
Asesor de tesis:
Dr. Luis E. González de la Vara
Sinodales:
Dra. Marina Gavilanes Ruiz
Dr. César Ordorica Falomir
Dr. John Paul Délano Frier
Dr. Plinio Guzmán Villate
Dr. Neftalí Ochoa Alejo
Depto. Biotecnología y Bioquímica
Lab. Bionergética y Biomembranas
Ca2+Cinasas
Ca2+-depend.
Cinasas
Calmodulina-depend.
MAP
KKK
MAP
KK
MAP
K
Proteína
Uniendo GTP
Regulación
hacia
abajo
MAP
KKK
MAP
KK
MAP
K
Ser/Thr
H
H
D
D
Tip
o I
II:
Cin
asa
s re
cep
tore
s T
ipo I
I: R
ecep
tore
s aco
pla
dos
T
ipo I
: C
an
ale
s ió
nic
os
a p
rote
ínas
G
Receptores Segundos Cinasas dependientes Reguladores
mensajeros de segundos mensajeros hacia abajo
Taylor y Whitelaw, 2001
Membrana Plasmática
Temperatura
ABA
Citocininas
Giberelinas
Luz
Patógenos
IAA
Ser/Thr cinasas
Oligogalacturonidos
Histidina cinasa
Etileno
Citocininas
VÍAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES
PRESENTES EN PLANTAS
Respuesta a estímulos luminosos
Respuesta a hormonas
Regulación del ciclo celular
Respuesta a patógenos
Interacciones célula-célula
PHY y Fototropina son cinasas
CTR1 es cinasa, ABI1 y ABI2 son fosfatasas
CDK es cinasa y cdc25 es fosfatasa
Xa21 es cinasa
SRK1 y CLV1 son cinasas
2. Receptor
3. Proteína G
4. Efector
Fosfatasa
P
Pi H+
H+
Vera Estrella et al. 1994
6. Cinasa
5. H+-ATPasa
1. Primer
mensajero
Evocador
ProteínaSer
Thr
TyrProteína
Ser
Thr
TyrP
ATPADP
Pi
Proteínas
fosfatasas
Proteínas
cinasas
PROCESO DE
FOSFORILACIÓN/DESFOSFORILACIÓN
Fosfatasas de Ser/Thr
Familia PPP PP1: Levaduras, plantas y animales
PP2A: Levaduras plantas y animales
PP2B: Levaduras, plantas(?) y animales
Nuevas: PP4, PP5, PP6, RdgC/PP7 (levaduras, plantas(?)
y animales
Familia PPM PP2C: Levaduras, animales y plantas (ej. ABI, KAPP, MP2C)
Fosfatasas de Tyr
Específicas de Tyr Parecidas a receptores: animales
Intracelulares: Levaduras, animales y plantas (ej. AtPTP1)
VH1
MKPs: Levaduras, animales y plantas (ej. AtDsPTP1)
CDC25: Levaduras, animales y plantas(?)
PTEN
Especificidad dual
CLASIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS
Luan, 2003
Dominio catalítico
Motivos TPR
Unión a CnB Unión a CaM
Unión a Ca2+
Familia PPP
PP1
PP2A, PP4, PP6
PP5
PP2B
RdgC/PP7
Dominio catalíticoFamilia PPM
PP2C (rata)
AtPP2C
KAPP
ABI
MP2CLuan, 2003
DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS
FOSFATASAS DE Ser/Thr
PP2A PP2Ac PP2Ac PP2Ac
A
A A
B BB
PP2B
CnB
CnB
CnB
CnA CnA CnA
CaM CaM
CaM+ nM Ca2+ + nM Ca2+
- Ca2+ - Ca2+
Inactiva Inactiva Activa
PP1 PP1cR RPP1c
Luan, 2003
SUBUNIDADES Y REGULACIÓN DE LA
FAMILIA PPP
CD45
HPTPb
PTPm
PTP1B
AtPTP1
SHPs
VH-1
CDC25
MKP-1
AtDsPTP1
Dominio catalítico
Dominio SH2
Fibronectina III
Membrana Plasmática
Parecidas a receptores Intracelulares Especificidad dual
Específicas de TyrLuan et al., 2001
DOMINIOS ESTRUCTURALES DE LAS
FOSFATASAS DE Tyr
PP1
PTP
N-terminal
Central a3-helix
Andersen et al Mol. Cell. Biol. 2001
Kerk et al. 2002
Fosfatasas en Arabidopsis
112 fosfatasas:
PP2C (69)
PTP (1)
Ser/Thr familia PPP (23)
Fosfatasas de especificidad dual (18)
Fosfatasas de bajo peso molecular (1)
Localización Referencia
Células de tomate Stenzel et al., 2003
Raíces de Arabidopsis del Pozo et al., 1999
Semillas de lupino y secretadas de
raíces de lupino Olczak y Wątorek, 2003
Li y Tadano, 1996
Frijol colorado Grote et al., 1998
LOCALIZACIÓN DE LAS
FOSFATASAS ÁCIDAS
Las fosfatasas ácidas se suelen encontrar en casi todos los compartimientos
subcelulares, pero principalmente en vacuolas (Mimura et al., 2003),
citoplasma y pared celular (Sano et al., 2003)
FUNCIÓN DE LAS FOSFATASAS ÁCIDAS
Función Referencia
Disponibilidad de P Narang et al., 2000
Stenzel et al., 2003
Estrés salino, hídrico u osmótico Knight y Knight, 2001
Zhu, 2002
González et al., 2003
Wang et al., 2003
Germinación de semillas de
Vigna sinensis Biswas y Cundiff, 1991
Almacenamiento vegetativo (VSP) Berger et al., 1995
Funciones metabólicas Turner y Plaxton, 2001
Movilización de P y metabolismo
del oxígeno (actividad de peroxidasa) del Pozo et al., 1999
FOSFATASAS ÁCIDAS PURPURAS (PAPs)
Tipo I
polipéptidos de aproximadamente 35 kDa
Centros binucleares Fe2+-Fe3+
Tipo II
Polipéptidos de aproximadamente 55 kDa
Centros binucleares Zn2+-Fe3+
Se han descrito 24 genes de PAPs en el genoma de Arabidopsis (Li et al., 2002)
Las fosfatasas ácidas reportadas por Olczak y Wątorek (2003) son PAPs, así como
la descrita por del Pozo et al., 1999
DESFOSFORILACIÓN DE PROTEÍNAS DE LA
MEMBRANA PLASMÁTICA DE BETABEL
0.5 1 5 10 20 60 8040
11697
67
45
29
Tiempo (min)
AutorradiografíaArmienta Aldana, 1999
OBJETIVO GENERAL
La identificación, purificación y caracterización
bioquímica de algunas fosfatasas presentes en la
membrana plasmática de betabel (Beta vulgaris L.)
OBJETIVOS PARTICULARES
Purificar a homogeneidad una o varias fosfatasas presentes en
la membrana plasmática de betabel.
Estudiar la actividad enzimática y las características bioquímicas
de las fosfatasas purificadas.
Determinar el grado de asociación de las fosfatasas con la membrana
plasmática de betabel.
Determinar su posible función en la planta, mediante la medición de
la actividad de fosfatasa en membranas plasmáticas de betabeles
cultivados bajo dos regímenes de estrés (estrés salino y estrés de
fosfato).
Extracción con Tritón X-114
Fase Superior Fase Inferior
CromatografíaColumna de DEAE-Sefarosa
CromatografíaColumna de CM-Sefarosa
Reextración con Tritón X-114
Fase Superior Fase Inferior
Membranas Plasmáticas de Betabel
PURIFICACIÓN DE LA FOSFATASA DE 95 kDa
Armienta Aldana, 1999
1169
767
45
29
kDa
F.S. 0.1 M 0.5 MDEAEMPB
CM
95 kDa
MPM: Marcadores de peso molecular
MPB: Membranas plasmáticas de betabel
FS: Fase superior
DEAE: Mezcla de fracc. de la columna de
DEAE-Sefarosa
0.1 M: Fracc. eluídas con 0.1 M NaCl
0.5 M: Fracc. eluídas con 0.5 M NaCl
Armienta Aldana, 1999
Memb. Plasmáticas
Extracción TX-114
DEAE-Sefarosa
CM-Sefarosa
Proteína
(mg)
Act. Especifica
(nmol mg-1 min-1)
Purificación
(veces)
15.047 4.924 1
5.829 16.31 3
0.288 100.0 20
0.016 230.0 47
Act. total
(nmol mg-1 )
74.09
95.05
28.85
3.762
Rendimiento
(%)
128
39
5.1
Pasos
(empleando pNPP como sustrato)
CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
DE 95 kDa
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
pH
Fosf
ata
sa (
nm
ol
mg
-1m
in-1
)
11697
67
45
29
1 2 3 4 5 6 7
95 kDa
1. Fracción citosólica de Arabidopsis
2. Fracción microsomal de Arabidopsis
3. Gradiente de glicerol de SN
4. Gradiente de glicerol de FS
5. Fracción purificada de CM-Sefarosa
6. Sobrenadante
7. Membrana plasmática de betabel
F.S
.
0.1 M 0.5 M
11697
67
45
29
kDa
95 kDa
FS: Fase superior
0.1 M: Fracc. eluídas con 0.1 M NaCl
0.5 M: Fracc. eluídas con 0.5 M NaCl
% Act.
Control 61.5 100
9.5 15
55.4 90
53.9 88
64.3 105
39.3 64
Molibdato 1 mM
Citrato 2 mM
ZnSO4. 7H2O 1 mM
Heparina 20 mg/mL
MnSO4 1 mM
DTT 1 mM 62.2 101
Control 90.0 100
Vanadato 2 mM 70.1 78
Control 480.8 100
FeSO4 3 mM (incubación) 499.3 104
Control 226.0 100
FeCl3 3 mM (incubación) 318.1 141
(nmol mg-1 min-1)
(Actividades medidas con pNPP a 405 nm)
Armienta Aldana, 1999
INHIBIDORES Y ACTIVADORES DE LA
FOSFATASA DE 95 kDa
CONCLUSIONES I
Con TX-114 se extrajo una fosfatasa de 95 kDa, mostró un pH
óptimo de 6.0, también mostró actividad de fosfatasa en gel, no
desfosforiló fosfoproteínas, fue inhibida por molibdato y activada
por iones hierro
PURIFICACIÓN DE LAS FOSFATASAS
DE 82 kDa Y 36 kDa
Membranas plasmáticas de betabel
Extracción con n-octilglucósido
Sobrenadante Pastilla
Centrifugación
CromatografíaColumna de Sefacríl S-300-HR
CromatografíaColumna de DEAE-Sefarosa
116
97
67
45
29
1 2 3 4 5
82 kDa
65 kDa
36 kDa
1. Membranas plasmáticas de betabel
2. Sobrenadante de la extracción con
n-octilglucósido
3. Mezcla de fracciónes de la columna de
Sefacril (S10-S11)
4. Fracción de la columna de DEAE-Sefarosa
con actividad de fosfatasa de 82 kDa *
5. Fracción de la columna de DEAE-Sefarosa
con actividad de fosfatasa de 36 kDa +
Fracción
0
5
10
15
20
25
30
35
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18Act. Vol.
Proteína
Fo
sfa
tasa (
nm
ol
mL
-1m
in-1
)
mg
/mL
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
Act. Vol.
Proteína
Fo
sfa
tasa (
nm
ol
mL
-1m
in-1
)
mg
/mL
Fracción
NR A B D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8
*
+
Sefacríl
DEAE
4.212937266.710.0018DEAE-Sefarosa
14.716.2470.223.50.0499Sefacril S300-HR
60.71.749.496.71.96Extracto de
Octilglucósido
1001.028.9159.55.51Membranas
Plasmáticas
(%)(Veces)(nmol mg-1 min-1)(nmol min-1)(mg)
RendimientoPurificaciónAct. EspecíficaAct. TotalProteina
TABLA DE PURIFICACIÓN DE
FOSFATASA DE 82 kDa
(empleando pNPP como sustrato)
1.373.968459.150.0013DEAE-Sefarosa
11.816.5152683.010.0544Sefacril S300-HR
33.21.27117.3232.71.98Extracto de
Octilglucósdio
100192.6701.77.58Membranas
Plasmáticas
(%)(Veces)(pmol mg-1 min-1)(pmol min-1)(mg)
RendimientoPurificaciónAct. EspecíficaAct. TotalProteina
TABLA DE PURIFICACIÓN DE
FOSFATASA DE 36 kDa
(empleando 32P-MBP como sustrato)
Fracción
Act
ivid
ad
de
fosf
ata
sa (
pm
ol
mL
-1m
in-1
)0
2
4
6
8
10
12
14
B 3 4 5 6 7 8
FS S5 S6 S7 SN S5 S6 S7 P
134
94
6956
43
34
2422
Ext. Con TX-114 Ext. con octilglucósido
FS: Fase superior de la extracción con TX-114
S5, S6 y S7: Fracciones obtenidas de la columna
de Sefacríl provenientes de la FS
SN: Sobrenadante obtenido de la extracción con
n-octilglucósido
S5, S6 y S7: Fracciones obtenidas de la columna
de Sefacríl provenientes del SN
P: pastilla resultante de la extracción con
n-octilglucósido
CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
DE 82 kDa
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.00
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Fosf
ata
sa (
nm
ol
mg
-1m
in-1
)
pH
0 2 4 6 8 10 120
500
1000
1500
2000
2500
3000
Concentración pNPP (mM)
Fosf
ata
sa (
nm
ol
mg
-1m
in-1
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
% A
cti
vid
ad
de F
osf
ata
sa
Inhibidor
Activador
Sin efecto
4076 + 255b-Naftil fosfato
3984 + 248a-Naftil fosfato
4599 + 446Pirofosfato de sodio
4172 + 927GTP
4158 + 649ATP
3757 + 215Fosfoserina
3644 + 404Fosfotreonina
4140 + 266Fosfotirosina
4067 + 392p-Nitrofenil fosfato
(nmol mg-1 min-1)
82-kDa
APasaSustrato
USO DE DIVERSOS INHIBIDORES Y
ACTIVADORES, ASÍ COMO DE
DIVERSOS SUSTRATOS
CARACTERIZACIÓN DE LA FOSFATASA
DE 36 kDa
4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
0
500
1000
1500
2000
2500
pH
Fosf
ata
sa (
nm
ol
mg
-1m
in-1
)
Concentración MBP (mg/mL)
Fosf
ata
sa (
nm
ol
mg
-1m
in-1
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 0.5 1 1.5 2 2.5
105150 mMNaCl
100150 mMKCl
805 mMFeSO4
51.75 mMMnSO4
31.25 mMMgSO4
10.75 mMNaF
99.31 mMVanadato
55.11 mMMolibdato
02 mMAcido okadaico
16.62 nMAcido okadaico
Actividad (%)ConcentraciónCompuesto
USO DE DIVERSOS INHIBIDORES Y
ACTIVADORES
CONCLUSIONES II
Con n-octilglucósido se purificaron 2 fosfatasas de 82 y 36 kDa
La fosfatasa de 82 kDa es una fosfatasa ácida y no desfosforiló
fosfoproteínas. Mostró un pH óptimo de 5.6 y una Km de 7.7 ± 2 mM.
Fue inhibida por molibdato y activada por KCl
La fosfatasa de 36 kDa es una fosfatasa de proteínas. Mostró
un pH óptimo de 6.6 y no se alcanzó el punto de saturación con
2 mg/mL de sustrato (32P-MBP). Fue inhibida por ácido okadaico,
mostrando características de una PP2A
ACTIVIDAD DE FOSFATASA EN VACUOLAS
0
50
100
150
200
250
300
1 2 3 4
Fracción
Fosf
ata
sa (
nm
ol
mg
-1m
in-1
)
1. Sobrenadante obtenido de la plasmólisis
de betabeles
2. Pastilla obtenida de la plasmólisis de
betabeles
3. Sobrenadante obtenido de la centrifugación del
gradiente discontinuo de dextran
4. Vacuolas
11697
67
45
29
1 2 3 4 5 6 7
1. Sobrenadante obtenido de la preparación de membranas
plasmáticas
2. Fracción de la columna de DEAE con actividad de fosfatasa
3. Fracción purificada de la columna de CM-Sefarosa de la
fosfatasa de 95 kDa
4. Sobrenadante obtenido de la plasmólisis de betabeles
5. Pastilla obtenida de la plasmólisis de betabeles
6. Sobrenadante obtenido de la centrifugación del gradiente
discontinuo de dextran
7. Vacuolas
CONCLUSIONES III
En preparaciones de vacuolas se observó actividad de fosfatasa y al
parecer esta actividad corresponde a fosfatasas que no
se han identificado
DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE FOSFATASA
DE UNA EXTRACCIÓN SECUENCIAL DE
MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE BETABELMembranas plasmáticas de betabel
Diluir (0.2 M Sacarosa)
Pastilla 1 Sobrenadante 1
1er Lavado (0.3 M KI)
Pastilla 2 Sobrenadante 2
Extracción (0.05% (w/v) Brij 58 P)
Pastilla 3 Sobrenadante 3
2do Lavado (0.3 M KI)
Pastilla 4 Sobrenadante 4
Extracción (15 mM CHAPS)
Pastilla 5 Sobrenadante 5
ResuspenderBerzci y Møller, 1998
Fo
sfa
tasa
(%
)
Acti
vid
ad
de f
osfa
tasa n
mo
l m
in-1
0
5
10
15
20
25
30
35
SN 1 SN 2 SN 3 SN 4 SN 5 P 50
5
10
15
20
25
30
35
40
45
pNPP
pm
ol m
in-1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
SN1 SN2 SN3 SN4 SN5 P50
5
10
15
20
25
30
Fracción
32P-MBP
CONCLUSIONES IV
Con la extracción secuencial a las membranas plasmáticas se
observó que en todas las fracciones obtenidas se observaba
actividad de fosfatasa
Cuando se empleó pNPP y 32P-MBP como sustratos una buena
parte de la actividad representa las proteínas solubles atrapadas en
las vesículas.
Por el otro lado, cuando se empleó 32P-MBP como sustrato, 27% de
la actividad representa las proteínas asociadas débilmente a la
membrana plasmática
DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE FOSFATASA
EN BETABELES CULTIVADOS BAJO
CONDICIONES DE ESTRÉS
116 134
94
69
56
43
34
2422
kDa
97
67
45
29
kDa
MPB C E.F. E.S. E.S. E.F. C MPB
Gel teñido con
azul de Coomassie
Inmunodetección
con anticuerposMPB: Membrana plasmática de betabel
C: Control de invernadero
E.S.: Betabeles bajo estrés salino
E.F.: Betabeles bajo estrés de fosfato
0
20
40
60
80
100
120
140
160
E.S. E.F. C
2 mM pNPP
5 mM pNPP
nm
ol
mg
-1m
in-1
0
20
40
60
80
100
120
140
C E.S. E.F. MPB
- Mo
+ Mo /+ 10 min
+ Mo
nm
ol
mg
-1m
in-1
MPB: Membrana plasmática de betabel
C: Control de invernadero
E.S.: Betabeles bajo estrés salino
E.F.: Betabeles bajo estrés de fosfato
CONCLUSIONES V
Se observó un aumento en la actividad de fosfatasa en las
muestras de membranas plasmáticas de betabeles bajo condiciones
de estrés salino y de fosfato.
CONCLUSIONES FINALES
Se purificaron 3 fosfatasas ácidas de la membrana plasmática de betabel
de 82, 36 y 95 kDa, respectivamente
La fosfatasa de 82 kDa es muy posiblemente una fosfatasa soluble
La fosfatasa de 36 kDa es una fosfatasa de proteínas y tiene
características de una PP2A (una subunidad catalítica de 36 kDa y una
subunidad regulatoria de 65 kDa)
La fosfatasa de 95 kDa es una fosfatasa inespecífica
Aproximadamente un 47% de actividad de fosfatasa representa
fosfatasas solubles atrapadas en las vesículas de
membranas plasmáticas