Examensarbete 10p C-nivå Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi VT 2005

Evaluation of a genomic work flow for the detection of Bacillus subtilis in

animal feed and food samples

Stina Lindberg

Handledare: Rickard Knutsson Statens veterinärmedicinska anstalt Resurslaboratoriet för beredskapsdiagnostik, avdelningen för bakteriologi

1

ABSTRACT

Bacillus anthracis is one of the most feared agents of biological warfare and causes the

deadly disease called anthrax. SVA (statens veterinärmedicinska anstalt) is working on a

project together with SLV (statens livsmedelsverk) where the target is to find rapid and

effective detection methods for Bacillus anthracis in animal feed and food samples. Bacillus

subtilis, which is harmless, was used in this study as a model organism to Bacillus anthracis.

A known concentration of vegetative Bacillus subtilis was spiked in animal feed and food

samples. The genomic work flow was based on automated DNA isolation and real time PCR.

The aim of the study was to screen for inhibitory components in the animal feed and food

samples using two different DNA isolation robots; Magnatrix 8000 and Biorobot EZ1. The

results showed that DNA of high quality was extracted from the samples with both robots.

However, the CT-value generated by the real time PCR showed considerable variation

depending on the sample matrix. Some samples, for instance egg and liver, were problematic

and gave low concentrations and high CT-values probably due to inhibitory components in the

samples. Further studies will be needed to solve these problems and optimize the methods that

were used in this study.

Keywords: Biorobot EZ1, DNA isolation, inhibitory components, Magnatrix 8000, real time

PCR

2

INNEHÅLL

Abstract……………………………………….. 1

Introduktion…………………………………... 3

Material/ Metoder…………………………….. 6

Förberedelser…………………………………. 6

Förstudier……………………………………. 8

Huvudstudie………………………………… 12

Resultat………………………………………. 14

Koncentrationsbestämningar……………….. 14

Jämförelsestudie av fyra

DNA-prepareringsmetoder………………….. 15

Test av två primerpar………………………... 16

Resultat från huvudstudien…………………. 17

Diskussion……………………………………. 18

Acknowledgement…………………………… 20

Referenser……………………………………. 21

3

INTRODUKTION

Bakteriesläktet Bacillus ingår i familjen Bacillaceae och består av mer än 50 olika arter. Alla

är grampositiva, sporbildande stavar (1). De växer inom ett brett temperaturområde från 15

till 45ºC. Tre kända arter är Bacillus anthracis, Bacillus cereus och Bacillus subtilis. Bacillus

anthracis orsakar sjukdomen anthrax som även kallas mjältbrand. Denna bakterie har två

plasmider; pX01 och pX02, som innehåller gener som bl.a. kodar för två

sjukdomsframkallande toxin och för en kapsel som skyddar bakterien mot fagocytos. Det

finns tre olika typer av anthrax; hudanthrax, intestinal anthrax och lunganthrax. Hudanthrax är

den vanligaste och mildaste formen och börjar som ett ”myggstick” på huden för att sedan

utvecklas till ett sår som täcks av en kolsvart skorpa. Hudanthrax förekommer i samband med

hudinfektioner kombinerat med hantering av anthraxsmittat livsmedel eller djur och kan botas

med antibiotika. Den intestinala formen förekommer efter intag av infekterad föda. De första

symtomen är kräkningar, diarré och magsmärtor. Lunganthrax smittoväg är genom inhalation

av anthraxsporer och de tidiga symtomen är influensaliknande. Intestinal- och lunganthrax är

de farligaste typerna av anthrax och leder ofta till döden. Symtomen för dessa två former av

anthrax är från början relativt milda, för att sedan plötsligt slå till med full kraft och skapa en

akut sjukdom. Detta karakteriseras av andnöd och desorientering följt av cirkulatorisk kollaps,

chock, koma och död, allt inom några timmar. I de fall då de dödliga formerna upptäcks tidigt

finns möjlighet för behandling, men detta försvåras av att de tidiga symtomen är så

svårupptäckta (2).

Bacillus cereus är fakultativt anaerob och förekommer i de flesta miljöer (1). B. cereus kan

orsaka flera olika sjukdomar. Gastroenterit orsakas av två olika enterotoxiner, ett värmestabilt

och ett värmelabilt. Det värmestabila enterotoxinet orsakar ”kräkningstypen” och kan

förekomma i kontaminerat ris. När riset kokas dör bakterierna men sporerna överlever. Om

riset sedan inte kylförvaras övergår sporerna till den vegetativa formen och en snabb

bakterietillväxt kan ske. Enterotoxinet som frigörs förstörs inte även om riset återuppvärms.

Efter intag av riset följer en inkubationstid på 1-6 timmar innan sjukdomen utbryter.

Det värmelabila enterotoxinet orsakar ”diarrétypen” och bildas i tunntarmen. Risklivsmedel är

kött, grönsaker, kryddor, torkade livsmedel och mjölk. Inkubationstiden är 6-24 timmar då

bakterierna förökar sig intestinalt och producerar toxinet. Bacillus cereus kan även ge upphov

till ögoninfektion i samband med ögonskada. Man tror att orsaken är tre olika toxiner som

interagerar med varandra; nekrotiskt toxin, cereolysin och phospholipas C. En tredje åkomma

orsakad av Bacillus cereus är intravenös kateterrelaterad sepsis.

4

Bacillus subtilis betraktas som icke-patogen och orsakar inga sjukdomar. Precis som Bacillus

cereus förekommer den i många olika miljöer, bland annat i vatten, jord och luft.

Påvisning av bakteriesläktet Bacillus kan ske fenotypiskt genom uppodling eller genom

detektion av toxin eller antikroppar mot toxin genom att utföra en ELISA. Påvisning genom

genotypiska metoder, dvs. att identifiera en för bakterien specifik DNA eller RNA-sekvens, är

ett fördelaktigare alternativ då dessa metoder går snabbare och har högre känslighet och

specificitet.

Bacillus anthracis är en av de mest fruktade organismerna inom biologisk krigsföring och

orsakade exempelvis stor problematik år 2001 i USA då organismen spreds genom brev.

SVA bedriver tillsammans med SLV ett resurslaboratorium för beredskapsdiagnostik. Där

pågår ett forskningsprojekt initierat av krisberedskapsmyndigheten (KBM) som är inriktat

mot storskalig diagnostik vid avsiktlig smittspridning av mikroorganismer via livsmedel, djur

och vatten. Olika provbearbetningsstrategier studeras för att förbättra analyskedjans kapacitet

vid misstanke om smittspridning av B. anthracis. Genom detta hoppas man kunna analysera

ett större antal livsmedel- och djurprover så effektivt som möjligt.

Eftersom det innebär en större säkerhetsrisk att arbeta med B. anthracis användes i detta

projekt Bacillus subtilis som modellorganism. Avsikten är att sedan, när dessa metoder

fungerar på B. subtilis, gå vidare och testa dessa metoder med B. cereus och slutligen med B.

anthracis.

I detta projekt har några genotypiska metoder för detektion av Bacillus subtilis studerats.

Projektet gick ut på att ympa in en känd koncentration av Bacillus subtilis i 41 olika

djurfoderprover och livsmedelsprover, för att därefter rena fram bakterie-DNA från dessa

prover med två robotar. Syftet var att undersöka kvaliteten på det renade DNA:t med

avseende på renhet och koncentration. Detta för att hitta eventuella inhiberande faktorer som

kan finnas i djurfoder och livsmedel och försvåra en effektiv analys. Dessa faktorer måste i så

fall minimeras. Koncentrationen och renheten på det framrenade DNA:t analyserades med två

metoder; spektrofotometriskt och med realtids-PCR.

Realtids-PCR baseras på förändring i fluorescens, där fluorescensen är proportionell mot den

exponentiellt amplifierade PCR-produkten (se figur 2). Vid ett visst antal cykler överstiger

fluorescensen ett tröskelvärde. Det antal cykler som krävs för att överstiga tröskelvärdet

kallas för CT-värdet. CT-värdet blir lägre ju mer DNA som finns från början. I detta projekt

användes CT-värdet även som en indikation på hur inhiberande de olika djurfoder- och

livsmedelsproverna var. Högre CT-värde tyder på en större inhibering.

5

Det finns två olika typer av detektionssystem, specifika och icke-specifika. Specifika

detektionssystem använder sig av prober som binder specifikt till en viss DNA-sekvens.

Proberna är märkta med en fluorescerande substans (3). Ett exempel på en sådan probe är

TaqMan.

I detta projekt användes SYBR-green som är en icke-specifik metod (3). SYBR-green är en

substans som endast binder in till dubbelsträngat DNA och fungerar på liknande sätt som

etidiumbromid. I lösning är den svagt fluorescerande men sänder ut en starkt fluorescerande

signal när den bundit till DNA (4). Realtids-PCR med SYBR-green följs alltid av en

smältpunktsanalys för att kontrollera att rätt PCR-produkt har blivit amplifierad (3).

Smältpunktsanalysen utförs med andra ord istället för att göra en gelelektrofores på PCR-

produkten. Vid en viss temperatur smälter den dubbelsträngade PCR-produkten isär och blir

enkelsträngad, detta syns som en sänkning i fluorescensen (se figur 3). Olika längd och

sekvens hos PCR-produkten ger olika smältpunkt.

16S rRNA-genen, en gen hos Bacillus subtilis (5) har tidigare med framgång använts för att

detektera Bacillus subtilis med PCR. I detta fall användes dels denna gen, dels en kommersiell

PCR-assay specifik för bakteriesläktet Bacillus.

Frågeställningarna för detta projekt var; går det att med hjälp av robotar rena fram bakterie-

DNA med hög kvalité från djurfoder och livsmedel? Finns det inhiberande komponenter i

dessa prover som kan störa analysen? Vilken metod är att föredra?

6

METODER

FÖRBEREDELSER

Foderprover som skulle användas som provmatriser hämtades på avdelningen för foder på

SVA. Livsmedel som skulle användas som provmatriser inhandlades i en livsmedelsaffär.

Alla provmatriser numrerades M1-M41 (se tabell 1).

Stomachering

10,0g av vardera provmatris vägdes upp i varsin filterpåse som omgavs av en ytterpåse. 90ml

NaCl-lösning 0,86-0,90% (SVA, Uppsala) tillsattes och påsen inkuberades sedan i 30min i

rumstemperatur. Proverna stomacherades därefter i stomacher 400 circulator (Seward

www.sewardsearch.co.uk) i 2min med 230rpm. Vid stomachering pressas och bearbetas

provet mekaniskt till en lösning. Lösningen från vardera prov pipetterades över till falconrör.

Från falconrören pipetterades sedan 1ml lösning till eppendorfrör, 24st per prov.

Eppendorfrören och falconrören med resterande lösning lades i frysen i -70ºC för förvaring

till senare bruk.

7

Tabell 1. Översikt av provmatriser som använts i studien.

Beteckning Provmatris Fabrikat/ kommentar Stomachering M1 Standardmjölk Arla Nej M2 Vispgrädde Arla Nej M3 Vaniljglass, ospädd, smält Blåvitt Nej M4 Vetemjöl Kungsörnen Ja M5 Majsmjöl Saltå kvarn Ja M6 Müsli Frebaco, müsli plus Ja M7 Florsocker Dan sukker Ja M8 Hamburgerdressing Kavli, amerikansk dressing Ja M9 Tonfisk i vatten Rainbow Ja M10 Chokladsås O´hoj, tub Ja M11 Svartpeppar mellanmalen Santa Maria Ja M12 Oregano Santa Maria Ja M13 Curry Santa Maria Ja M14 Fullkornsvälling Semper från 1år Ja M15 Fullkornsgröt Semper, mild Ja M16 Ketchup Felix Ja M17 Apelsinjuice JO Nej M18 Hel fodermajs Ja M19 Helt vete Ja M20 Jästfoder Yeesac Ja M21 Foderpellets Ja M22 Foderpellets För höns Ja M23 Maltkorn Ja M24 Foderpellets För nöt Ja M25 Hö Ja M26 Fodermjöl För svin Ja M27 Hel havre Ja M28 Miljödamm Foderfabrik Ja M29 Tilväxtfoder Kieman2, för svin Ja M30 Hamrahö Ja M31 Hundtorrfoder Ja M32 Hästkraftfoder Grovt Ja M33 Sojamjöl Ja M34 Kaviar Kalles Ja M35 Nötfärs Färsk Ja M36 Ägg Gula + vita Ja M37 Bröd Skogaholmslimpa Ja M38 Sallad Dole, Mini Family vacpac Ja M39 Ungnötslever Färsk Ja M40 Grishjärta Färskt Ja M41 Kycklinglever Fryst Ja

8

Uppodling av Bacillus subtilis

Kolonier av Bacillus subtilis stam ATCC 6633 togs från rutinlaboratoriet på SVA och

utströks på 2 hästblodagarplattor (SVA, Uppsala). Dessa inkuberades i 30ºC över natt.

Nästa dag togs kolonier från de två hästblodagarplattorna med sterila öglor till två falconrör

innehållande 40ml BHI-buljong (brain heart infusion, SVA Uppsala). Dessa inkuberades

sedan över natt i 30ºC.

10% glycerol användes som infrysningsmedium för att bevara cellernas viabilitet. 100µl

glycerol pipetterades till 48st eppendorfrör. Sedan pipetterades 1ml av BHI-buljongen från de

två falconrören till eppendorfrören, 24 eppendorfrör per falconrör. Eppendorfrören lades

sedan i frysen i -70ºC för förvaring till senare bruk.

FÖRSTUDIER

Koncentrationsbestämning av de frysta Bacillus subtilis-proverna

Ett av de frysta eppendorfrören med B. subtilis i BHI-buljong tinades. Därefter gjordes en

8-stegs seriespädning 1/10; 900µl BHI-buljong pipetterades till 8 eppendorfrör. Därefter togs

100µl från varje spädningssteg till nästa rör. 18 hästblodagarplattor lufttorkades för att få bort

kondens. Därefter togs 100µl från varje eppendorfrör till 2 hästblodagarplattor per rör och

racklades ut. Plattorna lades i en plastpåse och sattes i inkubatorn i 30ºC över natt. Dagen

därpå räknades kolonier på de olika plattorna.

Odling och koncentrationsbestämning av övernattskultur inför DNA-isolering

Ett eppendorfrör med B. subtilis togs från frysen och tinades. Därefter togs 100µl från detta

rör till ett falconrör innehållande 9,9ml BHI-buljong. Falconröret sattes i inkubatorn i

30ºC över natt, dvs. röret inkuberades totalt 18 timmar. Övernattskulturen i falconröret

seriespäddes därefter till 9 eppendorfrör på samma sätt som vid tidigare seriespädning.

Därefter togs 100µl från rör 3-8 till 2 hästblodagarplattor per rör och racklades ut. Plattorna

sattes i inkubatorn i 30ºC över natt. Dagen därpå räknades kolonier och koncentrationen av

övernattskulturen bestämdes. Koncentrationen av detta rör var viktig att känna till då likadana

övernattskulturer skulle användas till inympning av B. subtilis i djurfoder- och

livsmedelsproverna.

9

Jämförelsestudie av fyra DNA-prepareringsmetoder

Denna studie gjordes för att få en jämförelse mellan manuella kit och de robotar som skulle

användas i huvudstudien.

DNA från B. subtilis i BHI-buljong renades fram med två manuella kit; ”Genomic DNA

purification kit” (Gentra www.gentra.com) och ”High pure PCR template preparation kit”

(Roche www.roche-applied-science.com), samt med två robotar; Biorobot EZ1 (Qiagen

www.qiagen.com) och Magnatrix 8000 (Magnetic biosolutions www.magbio.com). Därefter

analyserades det framrenade DNA:t på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop

www.nanodrop.com) samt med realtids-PCR.

Med Biorobot EZ1 användes kitet ”DNA tissue kit” (Qiagen). Tre prover analyserades; 1ml

B. subtilis från frysen, 1ml övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong samt 1ml

övernattskultur av B. subtilis behandlat tre timmar med Proteinas k. Dessa prover spanns ner

till en pellet och späddes därefter med buffert G2 till en volym av 200µl. Detta för att roboten

tar en volym på 200µl.

Med Magnatrix 8000 användes kitet ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit” (Genpoint

www.genpoint.no). Endast ett prov bestående av övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong

analyserades. I jämförelsestudien studerades därför bara resultaten från övernattskultur av B.

subtilis i BHI-buljong från de fyra olika metoderna. Metodiken för de två robotarna redovisas

längre fram.

Preparation av DNA med ”Genomic DNA purification kit”

Prover som användes var 1ml övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong, samt 1ml B.

subtilis från frysen. Preparationen utfördes enligt protokoll för gram-positiva bakterier; först

utfördes cell-lysering genom att tillsätta 0.5ml cellsuspension till ett eppendorfrör som

centrifugerades i 5s i 13000-16000xg för att få en pellet. Supernatanten avlägsnades med en

pipett. 300µl ”Cell Suspension Solution” tillsattes till pelleten och pipetterades försiktigt upp

och ned några gånger tills pelleten lösts upp. 1,5µl ”Lytic Enzyme Solution” tillsattes och

röret vändes 25ggr och inkuberades därefter i 37ºC i 30min för att förstöra cellväggarna.

Röret bör vändas några gånger under inkuberingen. Röret centrifugerades sedan i 13000-

16000x g i 1min för att få en pellet. Supernatanten pipetterades bort. För att lysera cellerna

tillsattes 300µl ”Cell Lysis Solution” till pelleten och pipetterades försiktigt upp och ned

några gånger tills pelleten lösts upp. Efter lysering utfördes en RNas-behandling; 1,5µl

”RNase A Solution” tillsattes till cell-lysatet och röret vändes upp och ned 25ggr för att

därefter inkuberas i 37ºC i 30min. Proteiner avlägsnades därefter genom att först kyla provet

10

till rumstemperatur. Sedan tillsattes 100µl ”Protein Precipitation Solution” till provet och

detta mixades på vortex i 20s. Sedan centrifugerades provet i 3min i 13000-16000xg.

Proteinerna formar då en pellet. Supernatanten som innehåller DNA:t pipetterades över till ett

1.5ml eppendorfrör innehållande 300µl 100% isopropanol. Detta rör vändes försiktigt 50ggr

och centrifugerades sedan i 13000-16000xg i 1min. DNA:t formas då till en pellet.

Supernatanten sögs bort och 300µl 70% etanol tillsattes till pelleten. Röret vändes några

gånger för att tvätta DNA-pelleten. Röret centrifugerades därefter i 13000-16000xg i 1min

och etanolen sögs sedan försiktigt bort med en pipett. Slutligen utfördes DNA-hydrering då

100µl ”DNA Hydration Solution” tillsattes till pelleten och röret inkuberades i 1 timme i 65ºC

eller över natt i rumstemperatur. DNA:t förvarades sedan i frys för senare analyser.

Preparation av DNA med ”High pure PCR template preparation kit”

Prover som användes var 1ml B. subtilis från frysen, samt 1ml övernattskultur av B. subtilis i

BHI-buljong. Förberedelser som gjordes var blandning av 50mg Lysozyme och 5ml Tris-HCl

samt tillsats av 4,5ml PCR-vatten till den burk med Proteinas K som medföljde ”kitet”.

Därefter följdes protokollet; 200µl bakterielösning pipetterades till ett 1,5ml eppendorfrör och

centrifugerades i 5min i 3000xg. Pelleten som då bildades resuspenderades i 200µl PBS. 5µl

lysozyme tillsattes och röret inkuberades därefter i 37ºC i 15min. Efter detta tillsattes 200µl

”Binding Buffer” och 40µl Proteinas K. Röret mixades på vortex och inkuberades i 70ºC i

10min. Sedan tillsattes 100µl isopropanol och röret mixades igen. Provet pipetterades över till

ett filterrör som sattes i ett uppsamlingsrör. Dessa rör centrifugerades i 1min i 8000xg.

Uppsamlingsröret med innehåll slängdes därefter bort och filterröret sattes i ett nytt

uppsamlingsrör. 500µl ”Inhibitor Removal Buffer” pipetterades i filterröret och rören

centrifugerades sedan 1min i 8000xg. Uppsamlingsröret med innehåll slängdes bort och ett

nytt uppsamlingsrör kombinerades med filterröret. 500µl ”Wash Buffer” tillsattes till

filterröret följt av centrifugering i 1min i 8000xg. Uppsamlingsröret med innehåll slängdes

och ett nytt uppsamlingsrör kombinerades med filterröret. Dessa rör centrifugerades i 10s i

13000xg och uppsamlingsröret slängdes. Filterröret sattes i ett 1,5ml reaktionsrör. För att

eluera DNA:t tillsattes 200µl föruppvärmd (70ºC) ”Elution Buffer” i filterröret. Rören

centrifugerades i 1min i 8000xg. Reaktionsröret innehöll därefter det eluerade DNA:t. DNA:t

förvarades sedan i frys för senare analyser.

11

Test av två olika primerpar inför huvudstudiens realtids-PCR

För att undersöka vilket primerpar som var bäst att använda till huvudstudiens utfördes fyra

PCR-analyser, två för varje primerpar. De primerpar som undersöktes var ”B. subtilis 5F

primer” och ”B. subtilis 3R primer” (5) (ABI www.abionline.com) samt det kommersiella

paret ”Bacillus primer upp” och ”Bacillus primer low” (Genpoint www.genpoint.no). ”B.

subtilis 5F och 3R primer” var 19 baspar långa. PCR-produkten var en 595 baspar lång

sekvens baserad på 16S rRNA genen (5). ”Bacillus primer upp” och ”Bacillus primer low”

var 19 respektive 21 baspar långa och PCR-produkten var 541 baspar lång.

Mastermixar som användes var ”Core kit” (Applied biosystems

www.appliedbiosystems.com), och ”SYBR Green PCR mastermix” (Applied biosystems).

Mastermixarna blandades till i ett renrum i en UV-bänk. ”Core kit” blandades enligt följande

(de volymer som anges gäller per DNA-prov och ska alltså multipliceras med det antal DNA-

prov som ska analyseras); 5µl 10xSYBR Green buffer, 6µl MgCl2 (25mM), 1µl dUTP

(20mM), 1µl dATP (10mM), 1µl dGTP (10mM), 1µl dCTP (10mM), 27,25µl ddH2O, 0,25µl

(5U/µl) TaqGold, 1µl 1% BSA, 2µl ”B. subtilis 5F primer” (arb-lösning) och 2µl ”B. subtilis

3R primer” (arb-lösning) eller 2µl ”Bacillus primer upp” (10pmol/µl) och 2µl ”Bacillus

primer low” (10pmol/µl), 0,5µl Amp Erase. Dessa reagenser blandades i ett eppendorfrör.

”SYBR Green PCR mastermix” blandades enligt följande; 2µl ”B. subtilis 5F primer” (arb-

lösning) och 2µl ”B. subtilis 3R primer” (arb-lösning) eller 2µl ”Bacillus primer upp”

(10pmol/µl) och 2µl ”Bacillus primer low” (10pmol/µl), 25µl SYBR Green PCR mastermix

samt 19µl ddH2O pipetterades i ett eppendorfrör.

48µl av varje mastermix pipetterades till provbrunnar på en mikrotiterplatta. 2µl templat

tillsattes till varje brunn förutom i den negativa kontrollen där istället 2µl ddH2O tillsattes.

Det templat som användes var B. subtilis-DNA från övernattskultur i BHI-buljong framrenat

med Biorobot EZ1.

Den PCR-maskin som användes var 7500 real time PCR system (Applied Biosystems).

Programmet som kördes hade en initial denaturation vid 95ºC i 4min och sedan 40 cykler med

denaturering vid 95ºC i 15sek, ”annealing” vid 58ºC i 45sek och elongering vid 72ºC i 35sek.

Under detta steg mättes fluorescensen. Till sist en slutlig elongering vid 72ºC i 7min. Detta

program följdes av en smältpunktsanalys; 95ºC i 15sek, 60ºC i 1min och slutligen 95ºC i

15sek.

12

HUVUDSTUDIE

Bakterie-DNA:t renades fram ur djurfoder- och livsmedelsproverna med två olika robotar;

Magnatrix 8000 och Biorobot EZ1. Samma kit användes som i ”jämförelsestudie av fyra

DNA-prepareringsmetoder”. Bägge robotarna använder sig av samma analysprincip,

magnetisk separation. För Biorobot EZ1 med kitet ”DNA tissue kit” går det till på följande

sätt: bakteriecellerna lyseras och magnetiska kulor tillsätts till provet. I närvaro av ett

kaotropiskt salt kommer det DNA som finns i provet att binda till den kiselyta som täcker de

magnetiska kulorna. Genom användning av en magnet kommer därefter en separation ske, då

DNA:t och de magnetiska kulorna hålls kvar vid magneten, medan resterande

provkomponenter tvättas bort. Slutligen elueras det framrenade DNA:t i ett skruvlocksrör (6).

Vid preparering med ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit” på Magnatrix 8000 ser

metodiken lite annorlunda ut. Där binds hela bakterien upp på de magnetiska kulorna. Sedan

sker lysering av cellerna (se figur 1.)

Figur 1. Analysprinicpen för ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit” på Magnatrix 8000 (Genpoint

www.genpoint.no)

13

Preparation av DNA med Biorobot EZ1 och programmet ”DNA tissue kit”.

Vid tre olika tillfällen preparerades DNA från alla provmatriser (se tabell 1) med 100µl

inympad B. subtilis från övernattskultur i BHI-buljong (ca 18h inkubering). Dessutom tillkom

ett prov bestående av endast övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong. Detta prov

fungerade som jämförelseprov.

Preparationen utfördes enligt protokoll: 200µl prov pipetterades till märkta 2ml skruvlocksrör.

Roboten startades genom att slå på strömbrytaren på robotens baksida. I menyfönstret valdes

”start” och ”1” för ”bacterial protocol”. Elueringsvolym valdes genom att trycka ”2”, vilket

motsvarar 75µl. Robot-luckan på framsidan öppnades och de två metallställen lyftes ur. I det

bakre stället sköts lösningsstrippar in så att ett ”klick” hördes. En lösningsstrip per prov

laddades. Stället skakades om så att magnetkulorna suspenderades. Stället sattes sedan

tillbaks i roboten. Det främre stället laddades med 1,5ml elueringsrör i första raden, ett rör per

prov. I andra raden laddades en pipettspetshylsa och en pipettspets per prov. Rad nummer tre

lämnades tom och rad nummer fyra laddades med 2ml skruvlocksrör innehållande proverna.

Robot-luckan stängdes och genom att följa menyfönstrets instruktioner kontrollerades att allt

var på rätt plats. Programmet startades genom att trycka på ”start”.

Preparation av DNA med roboten Magnatrix 8000 och kitet ”ChlamCAP bacterial DNA

isolation kit”

Alla provmatriser (se tabell 1) togs ut ur frysen, ett eppendorfrör per prov. Förutom dessa

prover tillkom även här ett jämförelseprov bestående av övernattskultur av B. subtilis i BHI-

buljong. Till alla provmatriser tillsattes 100µl övernattskultur av B. subtilis. Rören mixades på

vortex. 700µl av varje prov pipetterades sedan till varsin brunn på en 96-hålsplatta. 96-

hålsplattan och alla reagenser tillsattes till respektive position och behållare i maskinen.

DNA-prepareringen utfördes sedan genom ”ChlamCap bacterial DNA isolation kit” som finns

inprogrammerat i roboten.

Mätning av preparerat DNA på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer

Allt DNA framrenat på Biorobot EZ1 och Magnatrix 8000 analyserades spektrofotometriskt.

Datorn tillhörande Nanodrop ND-1000 spectrophotometer startades och programmet ”nucleic

acid measurement” valdes på menyn. 2µl PCR-vatten pipetterades på detektorn och

kalibrering utfördes genom att trycka ”OK”. Därefter torkades detektorn av försiktigt med en

pappershanduk och en ny 2µl droppe med PCR-vatten laddades på detektorn. ”Blankning”

utfördes genom att trycka på ”blank”. Knappen ”measure” med en grön ”flagga” började lysa

14

grön vilket tyder på att det är klart att börja mäta DNA-proverna. Vattendroppen torkades av

från detektorn och 2µl av det första DNA-provet pipetterades på. Genom att trycka på

”measure” börjar Nanodrop att utföra mätningen. Det resultat som fås är koncentrationen

DNA (ng/µl) och DNA:ts renhet (A260/280 och A260/230). Resultatet läses av på skärmen. Det

gamla provet torkades sedan av och nästa prov pipetterades på tills alla prover var mätta.

Realtids-PCR på B. subtilis-DNA från provmatriserna

Allt B. subtilis-DNA framrenat med Biorobot EZ1 och Magnatrix 8000 från de olika

djurfoder- och livsmedelsproverna analyserades även med realtids-PCR.

Den ”Mastermix” som användes var ”Core kit” (för recept se sid. 11) med primerpar

”Bacillus upp” och ”low”. Maskinen och programmet som användes var samma som vid

testet av de två primerparen.

RESULTAT

Koncentrationsbestämning av de frysta B. subtilis-proverna

Efter räkning av kolonier från hästblodagarplattorna erhölls följande resultat: 1,4x107 CFU/ml

Koncentrationsbestämning av övernattskultur inför DNA-isolering

Efter räkning av kolonier från hästblodagarplattorna erhölls följande resultat: 7,0 x107 CFU/ml

15

Jämförelsestudie av fyra DNA-prepareringsmetoder

Med Gentras kit blev renheten dålig. När proven späddes 10ggr blev resultatet bättre. Till

denna studies realtids-PCR användes primerpar ”3R” och ”5F” trots att det visat sig att

primerpar ”Bacillus upp och low” ger bättre resultat (se tabell 3). Detta berodde på att det

andra primerparet inte fanns tillgängligt vid detta försök.

Tabell 2. Resultat från övernattskultur av B. subtilis analyserad med Nanodrop och realtids-PCR. Metod Konc (ng/µl) A260/280

1) A260/2302) CT Tm

Gentras kit 16,7 2,58 0,08 39,83 75,0 Roches kit 25,1 1,83 1,42 39,29 75,0 EZ1 32,1 1,45 0,41 39,88 74,2 Magnatrix 17,3 1,49 0,18 39,66 74,6 1) Värdet bör ligga mellan 1,4-2,0 2) Värdet bör ligga >1,8 Test av två olika primerpar Rätt PCR-produkt blev amplifierad för bägge paren. Primerparet ”3R” samt ”5F” ska ge en

PCR-produkt med smältpunkt vid ca 80ºC (7). Primerparet Bacillus “low” och “upp” ska ge

en PCR-produkt med smältpunkt vid ca 85ºC (7). Primerparet ”low” och ”upp” gav dock ett

lägre CT-värde och alltså en tidigare detektion, varför detta primerpar användes till

huvudstudiens PCR-analyser.

Tabell 3. Resultatet för test av två primerpar. Resultatet är medelvärdet för de två mastermixar som användes i denna studie. Primerpar CT Tm Bacillus primer low + primer upp 15,69 85,1 B.subtilis primer 3R + 5F 26,76 79,9

16

Resultat från huvudstudien Tabell 4. B. subtilis-DNA preparerat med Biorobot EZ1 och Magnatrix 8000. Resultat från mätning på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer samt PCR-resultat. Magnatrix 8000 Biorobot EZ1 Prov Konc1) A260/280

2) A260/2303) CT Tm Konc A260/280 A260/230 CT Tm

Mjölk 26,0 1,51 0,15 20,17 84,9 7,7 1,84 0,30 17,65 84,7 Vispgrädde 7,4 1,27 0,07 33,60 84,9 21,0 1,39 0,03 19,11 85,0 Vaniljglass 5,9 1,20 0,38 25,22 85,2 7,0 1,50 0,18 17,24 85,4 Vetemjöl 2,7 1,05 0,27 29,47 85,2 29,8 1,85 1,05 18,74 85,0 Majsmjöl 13,9 1,28 0,18 27,85 85,6 12,6 1,85 0,59 19,11 85,0 Müsli 12,6 1,72 0,27 28,67 85,2 5,8 1,93 0,36 19,73 85,0 Florsocker 21,5 1,42 0,23 18,37 84,9 3,6 2,13 0,31 19,80 85,4 Dressing 14,6 1,35 0,03 21,84 84,6 9,8 1,31 0,34 20,33 85,4 Tonfisk 13,8 1,46 0,24 24,13 84,9 2,0 3,87 0,20 19,68 84,7 Chokladsås 42,7 1,32 0,07 23,58 84,9 8,0 1,84 0,34 17,23 85,0 Svartpeppar 39,4 1,33 0,07 22,67 84,9 4,6 1,44 0,34 18,13 85,4 Oregano 19,1 1,44 0,24 18,69 85,2 12,4 1,32 0,45 16,65 85,4 Curry 0,2 -0,09 0,03 31,31 83,9 75,0 1,31 0,47 21,99 83,1 Välling 2,7 2,19 0,18 29,11 85,2 10,4 1,63 0,36 20,10 85,4 Fullkornsgröt 2,9 1,66 0,12 36,50 85,2 6,3 1,46 0,30 21,00 85,0 Ketchup 18,5 1,46 0,14 23,54 84,9 4,1 1,34 0,31 21,22 85,0 Apelsinjuice 2,1 3,26 0,25 36,35 84,9 10,5 1,93 0,50 18,52 84,4 Fodermajs 2,7 6,17 0,08 26,48 84,9 6,9 1,49 1,33 19,54 84,7 Helt vete 10,9 1,44 0,22 22,38 85,6 1,1 0,76 0,73 20,11 85,4 Jästfoder 0,8 -1,78 0,28 31,39 85,6 22,8 1,75 1,41 18,10 85,4 Foderpellets 26,3 1,76 0,13 29,34 85,2 5,4 1,38 0,55 21,09 85,7 Foderpellets 5,9 1,73 0,06 28,21 85,6 16,0 1,75 1,03 31,13 82,0 Maltkorn 15,6 1,27 0,20 21,60 85,2 1,4 0,75 0,47 28,73 85,1 Foderpellets 13,0 1,43 0,04 29,89 84,2 3,4 1,37 0,46 36,64 80,9 Hö 14,4 1,29 0,32 23,60 84,9 3,0 1,28 0,80 32,30 84,8 Fodermjöl 18,4 1,50 0,19 25,13 85,2 2,4 1,18 0,66 31,82 84,1 Hel havre 15,5 1,25 0,24 22,31 85,6 2,4 0,90 1,01 32,78 84,5 Miljödamm 4,8 1,46 0,27 30,52 85,6 34,9 1,73 1,79 34,21 82,0 Tilväxtfoder 13,5 1,72 0,17 26,03 85,6 8,1 1,40 1,19 34,15 82,3 Hamrahö 18,5 1,32 0,43 23,67 85,6 3,9 1,48 0,41 30,43 84,8 Hundtorrfoder 5,3 1,11 0,28 23,46 85,2 4,9 1,73 0,45 29,97 85,1 Hästkraftfoder 25,9 1,68 0,22 28,14 83,9 13,0 1,40 0,65 29,67 85,1 Sojamjöl 8,0 1,68 0,35 33,85 84,5 8,1 1,46 0,63 31,07 84,8 Kaviar 1,9 1,64 0,36 35,47 84,5 2,1 0,86 0,18 39,07 84,8 Nötfärs 2,5 1,37 0,09 33,53 84,5 10,2 1,88 1,16 36,15 83,4 Ägg 0,0 0,01 0,00 - 65,7 0,1 0,04 0,00 - 66,4 Bröd 11,2 1,54 0,11 36,00 85,1 3,6 1,18 0,43 33,70 84,8 Sallad 9,9 1,36 0,57 34,59 84,1 1,6 0,98 0,28 33,87 84,8 Ungnötslever 19,3 1,85 0,81 38,26 82,0 40,4 1,80 1,72 32,63 84,1 Grishjärta 9,5 1,73 0,46 30,04 84,1 2,7 1,04 0,47 28,47 85,1 Kycklinglever 1,8 5,06 0,56 - 66,4 159,7 1,84 2,10 36,07 84,1 B.sub4) 17,3 1,49 0,18 29,54 84,8 9,0 1,55 0,51 27,76 84,8 Negativ - 66,1 - 65,3 Medelv 12,93 1,52 0,22 27,86 84,9 10,95 1,53 0,62 25,49 84,57 Stdav 9,83 1,01 0,16 5,31 0,67 13,75 0,51 0,42 6,98 1,08 Max 42,70 6,17 0,81 38,26 85,60 75,00 3,87 1,79 39,07 85,70 Min 0,20 -1,78 0,03 18,37 82,00 1,10 0,75 0,03 16,65 80,90 1)ng/µl 2)Värdet bör ligga mellan 1,4-2,0 3) Värdet bör ligga >1,8 4) Övernattskultur av B. subtilis

17

Figur 2. Resultat från analys med realtids-PCR på 30 olika provmatriser spikade med B. subtilis preparerade med Magnatrix 8000 kombinerat med ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit”. Resultatet visar att DNA har amplifierats i samtliga provmatriser. En hög variation i CT-värde mellan de olika provmatriserna förekommer dock.

Figur 3. Resultat av smältpunktsanalysen vid realtids-PCR för ovanstående 30 provmatriser. Smältpunkten ligger vid 85˚C vilket tyder på att rätt PCR-produkt amplifierats.

18

Figur 4. Den vänstra linjen är mjölk och den högra är grädde. Mjölken har ett lågt CT-värde och alltså en tidig detektion. Grädde är mer problematisk och har ett högt CT-värde. Gräddens högre fettinnehåll skulle kunna vara en inhiberande komponent.

DISKUSSION

Av de manuella kiten från Roche och Gentra gav Roches kit en högre DNA-koncentration och

en bättre renhet (se tabell 2). Detta kit var även lättare att använda och tog kortare tid. Ett

problem som uppstod vid användning av båda kiten var att vid centrifugeringen av det frysta

B. subtilisprovet bildades ingen tydlig pellet. Detta kan bero på glycerolen som fanns i B.

subtilis-provet. De andra två proverna som bestod av övernattskultur av B. subtilis innehöll

ingen glycerol och vid preparation av dessa prover uppstod inte detta problem. Problemet

löstes genom att centrifugera provet en gång till. Renheten blev dålig med Gentras kit. När

proverna späddes 10ggr blev renheten betydligt bättre. Förmodligen innehåller ”DNA

hydration solution” som medföljer kitet, komponenter som interfererar med Nanodrop vid

mätning av DNA:t. Vid jämförelsestudien mellan robotarna och de manuella kiten var

resultaten relativt likvärdiga (se tabell 2). Att använda robotarna till preparering av DNA ur

djur- och livsmedelsproverna i denna studie var dock det bästa alternativet då vi ville ha

möjligheten att preparera många prover samtidigt. Detta underlättas självklart genom att

använda robotar istället för manuella kit. Magnatrix är den mest effektiva av de två robotarna

eftersom denna robot tar 96 prover åt gången medan Biorobot EZ1 endast tar 6 prover.

Biorobot EZ1 är dock mindre i storlek och kan tex. få plats i en LAF-bänk vilket kan vara

nödvändigt vid hantering av misstänkt smittade prover.

19

Vid test av de två primerparen blev rätt PCR-produkt amplifierad för bägge paren (se tabell

3). Det kommersiella primerparet ”low” och ”upp” gav dock en tidigare detektion och därför

användes detta primerpar till huvudstudiens PCR-analyser.

Provmatrisresultaten (se tabell 5) uppvisade en väldigt hög variation. Olika provmatriser gav

olika DNA-koncentrationer vid mätning på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer. Detta

beror på att vissa provmatriser innehåller komponenter som kan interferera både med DNA-

isoleringen och vid mätning på Nanodrop. En annan orsak till att resultaten hade så hög

variation vid mätning på Nanodrop kan vara att DNA-proverna inte skjuvades innan mätning.

Vid skjuvning bearbetas provet mekaniskt vilket medför att provet blir mer homogent.

Resultatet varierade också beroende på om provet var preparerat med Biorobot EZ1 eller med

Magnatrix 8000. Ett exempel på detta är prov M41, kycklinglever, som gav mycket låg DNA-

koncentration vid preparering på Magnatrix, men däremot mycket hög koncentration vid

preparering på EZ1. Detta kan bero på att analysprincipen ser lite olika ut för de två

robotarna. Eftersom lysering av bakterien sker innan uppbindning till de magnetiska

partiklarna vid preparering på Biorobot EZ1 kan även ospecifikt DNA som finns i

provmatrisen bindas upp till de magnetiska partiklarna och ge en felaktigt hög koncentration

DNA. Vid preparering med ”ChlamCap bacterial DNA isolation kit” på Magnatrix 8000

binds hela bakterien till partiklarna vilket leder till att endast bakterie-DNA:t renas fram.

Kvoten A260/280 såg oftast bra ut, vilket tyder på att provet inte är förorenat av proteiner.

Kvoten A260/230 däremot var genomgående lägre än vad det borde vara. Detta kan bero på

organiska föreningar som finns kvar i provet.

Nanodrop användes i denna studie mer som ett komplement till den realtids-PCR som

utfördes. Den ingår alltså egentligen inte i den analyskedja som är tänkt att användas om ett

riktigt utbrott skulle inträffa. Fördelen med Nanodrop är att den tar små volymer och är snabb

och enkel att använda. En nackdel med Nanodrop är att detektionsgränsen ligger vid 10ng/µl.

Resultat under detta värde har alltså en viss osäkerhetsfaktor.

Det är inte enbart DNA-prepareringen och mätningen på Nanodrop som kan störas av olika

komponenter från provmatriserna. Provmatriserna innehåller även komponenter som kan

verka inhiberande på PCR-analysen. Resultatet blir ett högt CT-värde, dvs. en sen detektion.

För att öka PCR-analysens robusthet måste dessa inhibitorer karakteriseras (8). Vad gäller

djurfoder och livsmedel kan inhibering ske på grund av ett antal vanligt förekommande

ämnen såsom lipider, salt och proteiner (9).

Utifrån erhållna resultat verkar fett-och kolesterolrika livsmedel vara problematiska

provmatriser. Ett tydligt exempel på det är att mjölk gick bra att analysera medan grädde som

20

innehåller mer fett skapade problem (se figur 4). Provmatrisen bestående av ägg var också

problematisk. I princip inget DNA renades fram, varken med EZ1 eller Magnatrix och därav

blev det inte heller någon detektion vid PCR-analysen. Ägg innehåller mycket kolesterol

(10) som kan vara en PCR-inhiberande komponent.

I övrigt verkar det som att provmatriser bestående av kött t.ex. ungnötslever och nötfärs

skapar vissa problem. Detta kan bero på att kött innehåller mycket DNA som kan störa och

försvåra en specifik framrening av endast B. subtilis-DNA. Om detta främmande DNA inte

renas bort helt kan det dessutom påverka PCR-analysens känslighet och specificitet (9). En

annan svår matris var kaviar, som också den är relativt fett-och kolesterolrik samtidigt som

den innehåller mycket DNA.

Smältpunkten låg på ca 85°C för de flesta provmatriser, vilket tyder på att rätt PCR-produkt

amplifierats. I de två fall då det inte blev någon detektion, dvs. för provmatriserna bestående

av ägg och kycklinglever blev smältpunkten mycket lägre. Detta är ett resultat av ”primer

dimer”, då de två primerparen bundit till varandra. Den smältpunkt som fås är den temperatur

då primerparen smälter isär.

Det Taq-polymeras som användes i detta projekt är känsligt för inhiberande faktorer (11). Ett

alternativ för att skapa en mer robust PCR-analys är att använda sig av ett annat DNA-

polymeras. I en tidigare studie visade det sig att man genom att använda Tth DNA- polymeras

kunde minska de inhiberande effekterna till stor del (9). Det skulle kunna vara en möjlig

lösning för de provmatriser som skapade problem i denna studie. Till skillnad från Taq-

polymeraset innehåller Tth-polymeraset en högre koncentration KCl samt ämnen som gör

PCR-analysen mer effektiv, såsom Tween 20 och glycerol. Resultatet blir att man får en

snabbare detektion vid lägre DNA-koncentrationer (8).

Sammanfattningsvis kan man säga att de två robotarna EZ1 och Magnatrix är bra metoder för

att preparera B. subtilis-DNA ur komplexa djur- och livsmedelsprover. Resultatet är dock

mycket varierande och vissa provmatriser skapade problem på grund av inhiberande faktorer.

Fortsatta studier krävs därför för att även dessa provmatriser ska kunna analyseras effektivt.

ACKNOWLEDGEMENT

Jag vill tacka Rickard Knutsson på SVA, Cecilia Dahlberg på livsmedelsverket, mina

opponenter Göte Swedberg, Lisa H. Ekbom och Suzanna Törnquist.

21

REFERENSER

1. K.A. Lampel, D. Dyer, L. Kornegay, P.A. Orlandi. 2004. Detection of Bacillus spores

using PCR and FTA filters. Journal of food protection. 67: 1036-1038

2. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yolken. 1995. Manual of

Clinical Microbiology 349-355. American Society for microbiology, Massachusetts

avenue N.W, Washington DC.

3. Quantitative and qualitative PCR Technology catalouge. 2002. 4-10 Eurogentec,

Searing, Belgien.

4. M.T. Dorak. Real-time PCR http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html

5. P. Wattiau, M.E. Renard, P. Ledent, V. Debois, G. Blackman, S.N. Agathos. 2001. A

PCR test to identify Bacillus subtilis and closely related species and its application to

the monitoring of wastewater biotreatment. Applied Microbiology and Biotechnology

56: 816-819.

6. EZ1 DNA handbook. 2004. 7-8 Qiagen.

7. J. Meinkoth , G. Wahl. 1984. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid

supports. Analytical biochemistry 138: 267-284.

8. R. Knutsson, C. Löfström, H. Grage, J. Hoorfar, P. Rådström. 2001. Modeling of 5´

Nuclease Real-Time Responses for optimization of a High- Throughput Enrichment

PCR Procedure for Salmonella enterica. Journal of Clinical Microbiology 40: 52-60.

9. C. Löfström, R. Knutsson, C. Engdahl Axelsson, P. Rådström. 2004. Rapid and

Specifik Detection of Salmonella spp. in Animal Feed Samples by PCR after Culture

Enrichment. Applied and Environmental Microbiology 70: 69-75.

22

10. Livsmedelstabell, energi och näringsämnen. 2002. Livsmedelsverket.

11. Ø. Olsvik, T. Popovic, E. Skjerve, K. S. Cudjoe, E. Hornes, J. Ugelstad, M. Uhlén.

1994. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology. Clinical

Microbiology Reviews 7:43-54.