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EVALUACIÓN DEL POTENCIAL BIOFERTILIZANTE DE TRES CONSORCIOS DE CIANOBACTERIAS EN EL CRECIMIENTO Y VALOR NUTRICIONAL DE PASTO RYEGRASS ANUAL (Lolium multiflorum) A NIVEL DE CÁMARA DE INVERNADERO
Formulación del Problema
Fertilizantes Químicos
• Uso de fertilizantes de forma desmesurada
• Perjuicios al suelo, la atmósfera y agua de
consumo
Ambiental• Contaminación de
acuíferos subterráneos por lixiviación
• Desbalance del ecosistema e infertilidad de suelos (Blanco, 1999).
• Reducción de la diversidad microbiana y nutrientes naturales del suelo (Sanchez & Mass,
2009)
Salud humana*Agua contaminada con
nitratos
* La transformación de nitratos a nitritos desemboca en compuestos cancerígenos conocidas como Nitrosaminas (Suquilanda, 2003).
Justificación del problema
Aumento del
rendimiento de las
Pasturas
• Uso de fertilizantes que suplan el nitrógeno que demandan las plantas
• El uso continuo e inadecuado de químicos es más nocivo que beneficioso
Implementación de
biofertilizantes
• Mantener la fertilidad del suelo, promover los rendimientos de cultivos, cuidar el ambiente y reducir costos
• Uso de abonos orgánicos como fuente de vida bacteriana para e suelo y para la nutrición de las plantas (Anesín et al., 2003).
Desarrrollo
biotecnológico
Producción Agraria
• Empleo de microorganismos fotosintéticos con capacidad para fijar nitrógeno atmosférico
Objetivos de la Investigación
Objetivo general
• Evaluar el potencial biofertilizante de tres consorcios de cianobacterias en el crecimiento y valor nutricional de pasto Ryegrass annual (Lolium multiflorum) a nivel de cámara de invernadero.
Objetivos específicos• Obtener consorcios de cianobacterias a partir de diferentes
muestras de suelo, biofilms y cortezas de árboles tomadas en las faldas del volcán Pasochoa.
• Producir biomasa en medio líquido a partir de consorcios de cianobacterias mantenidos en medio sólido.
• Preparar los biofertilizantes que serán empleados como tratamientos.
• Evaluar bajo biofertilización la evolución del crecimiento del Raygrass en masetas.
• Determinar la materia seca, humedad, proteína, fibra bruta, grasa y ceniza del Raygrass anual.
• Comprobar la sobreviviencia de cianobacterias en el Raygrass anual.
Hipótesis de la InvestigaciónHipótesis nula• Los tres consorcios microbianos con cianobacterias presentan similares efectos fertilizantes en el Raygrass.• Los consorcios microbianos con cianobacterias, como los fertilizantes orgánicos tienen el mismo efecto sobre las
plántulas de Raygrass en crecimiento y valor nutricional.• Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias tienen el mismo efecto que un fertilizante
químico Hipótesis alternativa• Los tres consorcios de cianobacterias presentan diferentes efectos sobre las plántulas de Raygrass. • Los consorcios de cianobacterias y los fertilizantes orgánicos muestran diferentes efectos en el crecimiento y valor
nutricional del Raygrass.• Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias, no presentan el mismo efecto que los
fertilizantes químicos.
BiofertilizantesProducto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicosSu aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo.Favorece la aireación y oxigenación del sueloSon fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998).Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos
Cianobacterias
Procariotas fotosintéticos, su tamaño varía de 0,5 a 70um de diámetro, carece de núcleo y organelosAislado de muestras ambientales, clínicas , animales y plantas.Amplia distribución desde climas fríos, tropicales hasta los más extremosEn el área agrícola han sido empleadas como biofertilizante en forma libre y simbiosisTienen la capacidad de llevar a cabo la diferenciación celular Generan celular especializadas (Heterocistos) donde se produce la fijación de nitrógeno mediada por la enzima nitrogenasa (luden, 2000).
Fijación biológica de Nitrógeno por cianobacteriasProducto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicosSu aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo.Favorece la aireación y oxigenación del sueloSon fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998).Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos
Metodología
Recolección de muestras Lupinus spp. Cantón SaquísiliCánton Pujilí
Cantón Guamote
Muestras
RizosferaRaices
HojasCampos Silvestres
Campos Cultivados
1.- Provincia de Cotopaxi
Localidades muestreadas
2.- Provincia de Chimborazo
Campos muestreados
Cantón SaquísiliCánton Pujilí
Cantón Guamote
Muestras
RizosferaRaices
Hojas
Diseño experimental empleado en el muestreo
Proceso de aleatorización simple de campo Número de hileras Número de plantas por hileras
Localidades muestreadas
Decantación
CVP (Diluciones seriadas en caldo
peptona)
10-1 10-4
0,1 ml
Siembra Agar Cetrimida
Conteo UFC/g
Cultivo Puros
16 S 956 pbPAGS-FPAGS-R
(Spilker et al, 2004)
(+)
ETA 396 pbETA 1ETA 2
(Ashraf y Carl, 1994)
Secuenciación amplicón
16SPseudomona aeruginosa y ETA
Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas
90 ml y 95 ml Caldo Peptona
% Humedad, Temperatura, Ph y Análisis Físico- Químico del
Suelo
Identificación Fenotípica de posibles cepas
Pseudomonas aeruginosa
1.- % Humedad, Temperatura (superficial, media y baja) y
pH
3.- Análisis Físico –Químico muestra compuesta por campo
(500g) : 6 submuestras
2.- Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas
90 ml y 95 ml Caldo Peptona
MUESTREO
Decantación
CVP (Diluciones seriadas en caldo
peptona)
10-1 10-4
0,1 ml
Siembra Agar Cetrimida
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
Conteo UFC/g.s
Cultivo Puros
1
Identificación Fenotípica
Tinción GRAM (-)
Oxidasa (+)
Identificación de pigmentos
King A King B
Pruebas Bioquímicas
No fermentadores TSI
O-F Medio Hugh Leifson
Acetamida
Reducción de Nitratos
Gelatinasa
Crecimiento a 4°C y 42°C.
Control -
21
MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICAExtracción de ADN
Identificación Genotípica DO260/DO280= 1,5 – 2
ng/uL= 5
PCR 16s Pseudomonas aeruginosa
16 S 956 pbPAGS-FPAGS-R
(Spilker et al, 2004)
(+) P. aeruginosa Pseudomonas spp.
ETA 396 pbETA 1ETA 2
(Ashraf y Carl, 1994)
MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA
IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA
Secuenciación amplicón 16S Pseudomonas aeruginosa y ETA
Secuencia consenso
MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA
IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA
SECUENCIACIÓN
Resultados y Discusión 1.- Análisis Físico- Químico:
FACTOR MICROBIOLÓGICO
0,00E+00
1,00E+05
2,00E+05
3,00E+05
4,00E+05
5,00E+05
6,00E+05
7,00E+05
8,00E+05
Cachapamba S. J C.
cultivado
Cachapamba S. J C.
silvestre
Chaloapamba C. cultivado
Chaloapamba C. silvestre
Hojas 1,92E+04 3,97E+04 1,69E+04 6,77E+04
Rizosfera 4,90E+05 2,26E+05 2,63E+05 3,15E+04
Total 2,55E+05 1,33E+05 1,40E+05 4,96E+04
2,55E+05
1,33E+05 1,40E+05
4,96E+04
4,90E+05
2,26E+052,63E+05
3,15E+04
1,92E+04
3,97E+041,69E+04
6,77E+04
UFC
/gra
mo
de
sue
lo
Densidad bacteriana de la Provincia de Cotopaxi
0,00E+00
5,00E+04
1,00E+05
1,50E+05
2,00E+05
2,50E+05
3,00E+05
3,50E+05
4,00E+05
M Pacari C. cultivado
S. M. de Pumachaca C. silvestre
San Pedro C. cultivado
Sacaguan C. silvestre
Hojas 1,70E+03 1,13E+04 3,57E+04 2,46E+03
Rizosfera 1,72E+03 2,37E+05 6,65E+04 3,10E+04
Total 1,71E+03 1,24E+05 5,11E+04 1,67E+04
1,71E+03
1,24E+05
5,11E+041,67E+04
1,72E+03
2,37E+05
6,65E+04
3,10E+041,70E+03
1,13E+04
3,57E+04
2,46E+03
UFC
/gra
mo
de
suel
o se
co
Densidad bacteriana en la Provincia de Chimborazo
Figura 1 -2 . Densidad bacteriana de Pseudomonas spp (UFC/g.s) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.
Hojas RizosferaMuestras
1.50E+04
4.43E+04
7.36E+04
1.03E+05
1.32E+05
1.61E+05
1.91E+05
2.20E+05
Den
sida
d B
acte
riana
UFC
/g.s
A
B
A
B
Densidad bacteriana Pronvincias de Cotopaxi y Chimborazo
Figura 3 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en las muestras de rizosfera y hoja de los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.
Silvestre CultivadoTipo
7.66E+04
8.99E+04
1.03E+05
1.17E+05
1.30E+05
1.43E+05
1.57E+05
1.70E+05
Den
sida
d B
acte
riana
(UF
C/g
.s)
A
A
A
A
Densidad Bacteriana Provincias de Cotopaxi y Chimborazo
Figura 4 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.
Tabla 2 Descripción de los lugares, campos, coordenadas geográficas e historia agrícola de los cultivos .
FACTORES FÍSICOS
Figura 5. Factores Físicos: Clase Textural, Humedad(%) y Temperatura (°C) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.
FACTORES QUÍMICOS1.-pH
2.- % Materia orgánica
Figura 6 Factores Químicos: pH y Materia Orgánica (MO %) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.
FACTORES QUÍMICOS
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
M, Pacari C, Cultivado
S, M de Pumachaca C, Silvestre
San Pedro C, Cultivado
Sacaguan C, Silvestre
Cachapamba C, Cultivado
Cachapamba C, Silvestre
Chaloapamba C, Cultivado
Chaloapamba C, Silvestre
2,97
6,515,22
3,79
6,046,93
3,89 4,260,03
0,08
0,02
0,02
0,02
0,04
0,020,02
2,30
1,10
1,30
1,90
1,801,50
1,201,30
0,010,11
0,080,12
0,250,30
0,150,23
CA
MPO
S
B (meq/100ml)
Zn (meq/100ml)
Mn (meq/100ml)
Na (meq/100ml)
Ca (meq/100ml)
Figura 7 Elementos inorgánicos B, Na, Ca, Mn y Zn en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.
2.- Caracterización fenotípicamente los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa
Cepa Comunidad Campo Muestra Morfología celularMorfología de
la colonia
Pigmentos
Pioverdina Piocianina Piorrubina
ATCC 10145 ______ ______ ______Bacilos Gram
Negativos B + + +
58SCRCachapamba San José Cultivado Rizosfera A + - -
30PCCR Chaloapamba Cultivado Rizosfera B + + -
26SCR Chaloapamba Cultivado Rizosfera A + - -
32PCH Chaloapamba Cultivado HojasBacilos Gram
Negativos D + - -
23SCR Chaloapamba Cultivado RizosferaBacilos Gram
Negativos A + - -
47PPCR Chaloapamba Cultivado RizosferaBacilos Gram
Negativos C + + -
17CSSR Sacaguan Silvestre RizosferaBacilos Gram
Negativos A + - -
A: Colonias grandes de color crema, consistencia mucosa y halo amarillo verdoso
B: Colonias grandes e irregulares con centro mucoso y halos azul verdoso - amarillo verdoso
C: Colonias medianas transparentes con halos azul verdoso - amarillo verdoso
D: Colonia mediana redonda y consistencia mucosa con halo amarillo verdoso
Tabla 3 Características fenotípicas de posibles cepas de Pseudomonas aeruginosa encontradas en los campos muestreados.
3.- Caracterización genotípicamente los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA
Tabla 4 Aislados positivos a la amplificación del gen 16S y ETA mediante el ensayo de PCR .
Cultivado Cachapamba
San José
Silvestre Cachapamba
San JoséCultivado
ChaloapambaSilvestre
ChaloapambaCultivado M Pacari
Silvestre S. M.
PumachacaCultivado
San PedroSilvestre
Sacaguan TotalPresente 1 0 2 0 0 0 0 0 3Ausente 5 6 4 6 6 6 6 6 45(a): Puntos muestreados donde esta presente o ausente P. aeruginosa 48X2 exp= 11 < X2 teo = 14,06 con un nivel de confianza del 95% se acepta la Ho
Pseudomonas aeruginosa
Campo / Comunidad (a)
Tabla 5. Frecuencia de Pseudomonas aeruginosa en campos cultivados y silvestres en Lupinus spp. Prueba de contraste de independencia de variables cualitativas Chi – cuadrado X2.
4.- Caracterización molecular de los amplicones los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA
Tabla 6 Resultados de secuenciación del amplicón 16s DNAr y amplicón ETA
Los suelos rizósfericos de Lupinus spp, presentaron características texturales de suelos arenosos; valores bajos de temperatura a excepción de la comunidad de Musuk Pacarí y bajos porcentajes de humedad.
Entre los factores químicos de los suelos rizósfericos estudiados, el pH dio valores
neutros, característica asociada a los suelos arenosos. La variación de las cantidades de micronutrientes, Ca, Mn Na Zn y B está relacionado
a los bajos valores de materia orgánica y baja capacidad de intercambio catiónico. La densidad bacteriana de Pseudomonas spp 103-5 UFC/g.s de los suelos Lupinus spp
fue menor en comparación con otros estudios que reportan valores de 10 6-7 . La densidad bacteriana de Pseudomonas spp, fue significativamente diferente de
acuerdo al tipo de muestras, existiendo una mayor cantidad en la rizosfera de las dos provincias.
Conclusiones
La caracterización fenotípica permitió identificar siete posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa, sin embargo estos resultados presentaron ambigüedad en las pruebas de crecimiento a 42°C y utilización de acetamida. La caracterización molecular del los aislados que amplificaron el gen 16s DNAr de Pseudomonas aeruginosa y Exotoxina a través de PCR y secuenciación dieron como resultados tres aislados de P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR y 6 que poseen el fragmento de 396pb del gen ETA: 4 P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR, 42 y 2 P. fluorencens 11 y 19.
La cantidad de aislamientos de Pseudomonas aeruginosa depende del tipo de campo encontrándose con mayor frecuencia en campos cultivados que silvestres, las zonas de donde se aisló P. aeruginosa corresponden a las comunidades de Cachapamba San José y Chaloapamba caracterizados por ser un terreno de pastoreo y uso de abono orgánico gallinaza con rotación de cultivos de papa y zanahoria respectivamente.
La presencia de Pseudomonas aeruginosa en los campos cultivados permitieron advertir que la rizosfera es un potencial reservorio de este microorganismo.
La presencia del gen ETA en los aislados de Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens presumió la trasferencia de genes de virulencia entre microorganismo habitantes de un mismo nicho ecológico.
Relacionar factores bioquímicos como respiración microbiana recuento de poblaciones microbianas, coeficiente metabólico e índices de mineralización para entender los cambios de parámetros microbiológicos calidad y salud del suelo.
cultivo de enriquecimiento como el caldo Acetamida que permita una selección previa de Pseudomonas aeruginosa.
Observar los pigmentos después del tiempo de incubación a 37°C se coloque las cajas a temperatura ambiente durante 24 horas para una mejor visualizan de los pigmentos.
Estudiar nuevas zonas geográficas donde se utilice sistemas de riego, abonos orgánicos.
Recomendaciones
A nivel molecular, realizar una identificación de otros factores de virulencia en Pseudomonas aeruginosa como Exoenzima S presentes en aislados ambientales y clínicos.
Utilizar otro tipos de genes como marcadores taxonómicos en la identificación de P. aeruginosa. gyrB, exoA, y algD; y primers específicos diseñados para la amplificación y secuenciación (Osayande, et al., 2009) que podrían ser utilizados en futuros proyectos.
Ensayos in vitro mediante la inoculación de cepas de Pseudomonas aeruginosa provenientes de muestras ambientales y clínicas donde hayan sido identificados factores de virulencia, para determinar y comparar el grado de virulencia de las diferentes P. aeruginosa y la respuesta del huésped.
Se recomienda el control de la carga microbial en sistemas de riego y abonos de animales de granja así como un análisis microbiológico de los indicadores de calidad de agua y abonos orgánicos.