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EVALUACIÓN DEL RIESGO GENÉTICO IN VITRO DE LA
EXPOSICIÓN AL HERBICIDA ROUNDUP EN CÉLULAS CHO – K1
Y LINFOCITOS HUMANOS
Trabajo de Grado Presentado para optar al Título de Maestría en Ciencias Biológicas
Presentado por: Sandra Liliana Ortiz Cuarán
Directora: Helena Groot de Restrepo Universidad de los Andes
Bogotá, Colombia
Codirectora: Maria Mercedes Torres Carvajal Universidad de los Andes
Bogotá, Colombia
FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDA DE LOS ANDES
2008
AGRADECIMIENTOS
A Dios. A mi familia. A mi mamá por su inmenso amor, su ejemplo y su apoyo constante. A Nirris por su paciencia y por estar conmigo durante todos estos años. A mi papá por su apoyo y enseñarme a ver más allá. A Mancho y a la mona por los mejores momentos en su hermosa compañía. A Sonia M por sus palabras de aliento. A Helena por su confianza, por todas las oportunidades que me brindó y por sus valiosas enseñanzas. Por transmitirme su pasión por la ciencia. A Maria Mercedes por darme la oportunidad de aprender nuevas cosas y por sus aportes a este trabajo. A las niñas del Laboratorio, especialmente a Diana por su inmenso apoyo, por su paciencia y por estar ahí siempre y a Carolina por tener la mejor actitud frente a las situaciones más difíciles, las de ella y las mías. A Marcela Varona y a Orlando Martínez por sus valiosos comentarios.
EVALUACIÓN DEL RIESGO GENÉTICO IN VITRO DE LA
EXPOSICIÓN AL HERBICIDA ROUNDUP EN CÉLULAS CHO – K1 Y
LINFOCITOS HUMANOS
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Formulación comercial Roundup
2.2. Estudios previos de genotoxicidad del glifosato y la formulación Roundup
2.3. Células de Ovario de Hámster Chino (CHO – K1)
2.4. Linfocitos humanos
2.5. Ensayo del Cometa
3. JUSTIFICACIÓN
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
4.2. Objetivos específicos
5. METODOLOGÍA
5.1. Compuestos químicos y reactivos
5.2. Cultivo celular
5.2.1. Células CHO – K1
5.2.2. Linfocitos humanos
5.2.3. Extracción de linfocitos
5.3. Ensayos de citotoxicidad aguda
5.3.1. Células CHO – K1
5.3.2. Linfocitos humanos
5.4. Ensayo del Cometa
5.5. Análisis estadístico
6. RESULTADOS
6.1. Evaluación de la citotoxicidad y genotoxicidad de células CHO-K1 expuestas
al herbicida Roundup
6.1.1. Citotoxicidad aguda
6.1.2. Ensayo del cometa
6.2. Evaluación de la citotoxicidad y genotoxicidad de linfocitos humanos
expuestos al herbicida Roundup
6.2.1. Citotoxicidad aguda
6.2.2. Ensayo del cometa
7. DISCUSIÓN
8. CONCLUSIONES
9. PERSPECTIVAS
10. REFERENCIAS
1. INTRODUCCIÓN
Los plaguicidas están definidos como una sustancia o mezcla de sustancias que pretenden
prevenir, destruir o reducir una peste. En general, los pesticidas están clasificados de
acuerdo a su blanco biológico en: insecticidas, herbicidas, rodenticidas y fungicidas entre
otros (Barile, 2008). El uso de herbicidas en el control de malezas se ha extendido
considerablemente en los últimos años, incluso en una mayor proporción que el uso de
insecticidas (Cavas, 2007).
Roundup es un herbicida ampliamente utilizado en la agricultura y la industria para el
control de diferentes especies de maleza. Esta formulación comercial contiene ácido de
glifosato (360g/L) como ingrediente activo y una amina polietoxilada (150g/L), derivada de
ácidos grasos, que aumenta la absorción del ingrediente activo cuando éste entra en
contacto con el follaje (Williams, 2000). El modo de acción de este herbicida radica en la
inhibición de la formación de aminoácidos aromáticos de la vía del shikimato, una vía
metabólica exclusiva de plantas; una vez el glifosato cumple su función en la planta, se une
a las partículas del suelo y allí es rápidamente degradado, principalmente por
microorganismos, a ácido aminometilfosfónico (AMPA) y CO2 (Bolognesi, 1997).
Las similitudes inherentes entre los procesos bioquímicos y fisiológicos del organismo
blanco de los pesticidas y otros organismos que se encuentran en áreas cercanas, dan lugar
al estudio de los posibles efectos tóxicos colaterales de los pesticidas en otros organismos
(Barile, 2008). Los posibles efectos genotóxicos del glifosato y de la formulación Roundup
han sido ampliamente estudiados en diversos sistemas biológicos (Peluso, 1998). Los
resultados obtenidos en estos trabajos, mediante el uso de ensayos de mutagénesis, daño
cromosómico y daño en el ADN; han mostrado resultados contradictorios.
El glifosato técnico ha demostrado ser genotóxico in vitro en modelos murinos y en
linfocitos bovinos (Lioi, 1998); sin embargo estudios de mutagénesis realizados en
diferentes cepas de Salmonella (Test de Ames) y en células de ovario de hamster chino
(CHO locus hgprt) indicaron que el glifosato solo no tiene potencial mutagénico
oncogénico. Por otra parte, se ha observado una actividad mutagénica y clastogénica debil
para la formulación comercial como se demostró por la inducción de mutaciones reversas
en Salmonella typhimurioum TA100 y TA98 y la inducción de el daño cromosómico en
células de Allium cepa y en linfocitos humanos (Peluso, 1998).
Diversos estudios han demostrado que las interacciones con el ADN pueden dar lugar a
cambios en la expresión génica o pueden afectar otros procesos biológicos importantes
(Williams, 2000). El ensayo del cometa es una técnica rápida y ampliamente utilizada para
la detección de rompimientos en el ADN que pueden ocurrir como consecuencia de una
respuesta celular a un agente genotóxico (Wolz, 2002). Teniendo en cuenta el uso extensivo
del herbicida Roundup en la agricultura y en la industria y la exposición ocupacional de la
población humana a este herbicida, el objetivo de este estudio fue determinar el potencial
citotóxico y genotóxico del herbicida Roundup en células CHO – K1 y linfocitos humanos,
utilizando el ensayo del cometa con el fin de contribuir a un mayor conocimiento sobre el
riesgo genético de la exposición a este herbicida.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Glifosato
El glifosato es un ácido orgánico débil, soluble en agua, que está generalmente presente
en la forma química de sal de isopropilamina (Figura 1). Las propiedades
fisicoquímicas específicas de este compuesto se muestran en la Tabla 1. Este herbicida
tiene una actividad sistémica, es decir que luego de ser aplicado sobre sistema foliar, es
traslocado por el sistema vascular de la planta afectando toda la planta y luego este es
absorbido por el sistema foliar y las partes no leñosas de la planta para después ser
rápidamente traslocado al resto de la planta.
Figura 1: Formula química del glifosato2
2Fuente: Documento Plan de Manejo Ambiental Erradicación de Cultivos Ilícitos. 2000 (en línea)
La figura 2 muestra el mecanismo de acción del glifosato en las plantas blanco. El
ingrediente activo inhibe de una forma competitiva a la enzima 5-enolpiruvil shikimato-
3-P sintetasa (EPSP) que está involucrada en formación de aminoácidos aromáticos de
la vía del shikimato, una vía metabólica exclusiva de plantas. La inhibición de esta,
hace que se bloquee la síntesis del corismato el cual es un intermediario de aminoácidos
aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptofano) que son indispensables para la formación
de proteínas implicadas en el crecimiento y la supervivencia de la planta (Williams
2000). Asimismo, el glifosato puede inhibir la síntesis del ácido indolacético, la
clorofila y proteínas involucradas en la síntesis de azúcares y en la detoxificación de la
planta; además de modular el citocromo P450 en otras especies vegetales (Richards,
2005). Como resultado, la muerte de la planta es lenta e inicia con una suspensión del
crecimiento, seguida de clorosis y finalmente necrosis de los tejidos de la misma planta
(Bolognesi, 1997. Solomon, 2005).
Tabla 1: Propiedades químicas del glifosato3
Nombre químico N- (fosfonometil) glicina
Fórmula química C3H8NO5P
Peso molecular 169.08 g/mol
Características organolépticas Solución líquida, clara, viscosa, inodora
pH 4,4 a 4,9 1Fuente: Glyphosate. Herbicide Information Profile.United Status Department of Agriculture. 1997 (en
línea)
El metabolismo del glifosato (Figura 3) se lleva a cabo principalmente por
microorganismos y de manera limitada por las plantas mediante la formación de
complejos con iones en agua (Ca2+ y Mg2+), la absorción por el sedimento y la
fotodegradación en agua (Bolognesi, 1997, Williams, 2000, Daruich, 2001). El
principal producto de degradación es el ácido aminometil fosfórico (AMPA), y en
menor grado el dióxido de carbono, formaldehído, 1,4 dioxano y ácido fosfónico
(Buffin, 2000).
Figura 2. Mecanismo de acción del glifosato en plantas (Williams, 2000)
Figura 3. Vías de degradación de glifosato (Williams, 2000)
2.2. Formulación Roundup
El glifosato es considerado uno de los descubrimientos más importantes en el campo de
la agricultura, ya que es altamente efectivo y su aplicación puede hacerse de diversas
maneras; por esta razón el glifosato ha sido comercializado en la forma de diferentes
formulaciones que contienen otros compuestos que favorecen e incrementan la
eficiencia del ingrediente activo para su uso en campo.
Roundup es una de las formulaciones comerciales a base de glifosato más vendidas a
nivel mundial. Este herbicida es ampliamente utilizado en la industria agrícola para el
control de diferentes tipos de maleza en cultivos como: café, banano, vegetales, cereales
y algodón; en silvicultura y a nivel industrial y residencial (Peluso, 1998. Acquavella,
2004).
La composición de la formulación Roundup (Tabla 2) consiste en la mezcla del
ingrediente activo en la forma de ácido de glifosato (360g/L) o de sal de
isopropilamina (480g/L) y de la amina polietoxilada (150g/L), derivada de ácidos
grasos, cuya función es aumentar la absorción del ingrediente activo una vez este
(Williams, 2000). El modo de acción del POEA consiste en la reducción de la tensión
superficial de las hojas, con el fin de promover la diseminación de las gotas del
ingrediente activo. Asimismo, previene la agregación y aumentan la penetración de los
herbicidas en los tejidos de la planta.
Tabla 2. Composición de la Formulación Roundup1
Glifosato 41.0%
Ácidos orgánicos relacionados 1.5%
Isopropilamina 0.5%
POEA (surfactante) 15.4%
Agua 41.6% 3Fuente: Documento Plan de Manejo Ambiental Erradicación de Cultivos Ilícitos. 2000 (en línea)
2.3. Estudios del potencial genotóxico del glifosato y de la formulación comercial
Roundup.
La genética toxicológica tiene como objetivo, entre otros, la identificación de
carcinógenos y de agentes genotóxicos potenciales. La genotoxicidad del glifosato ha
sido ampliamente estudiada en diferentes sistemas biológicos y mediante diversos
ensayos. Estos estudios han mostrado resultados contradictorios en cuanto al efecto
genotóxico del glifosato técnico en los diferentes sistemas evaluados y en cuanto al
posible mecanismo de toxicidad inducido por este. Adicionalmente, los estudios
comparativos de la toxicidad del glifosato y de Roundup revelan, en su mayoría, un
efecto más marcado cuanto se utiliza la formulación comercial. Sin embargo, el
mecanismo determinante de esta toxicidad diferencial entre el herbicida comercial y
su ingrediente activo no ha sido aún elucidado.
Actualmente la evaluación del potencial genotóxico de una compuesto determinado se
realiza mediante dos ensayos recomendados por las agencias de regulación ambiental:
el test de Ames, para determinar el potencial mutagénico, y la estimación de la
inducción de daño cromosómico en células de mamífero.
Los estudios enfocados hacia la estimación del potencial genotóxico del ingrediente
activo solo han demostrado que el glifosato técnico no tiene potencial mutagénico en
ensayos en Salmonella typhimurium y en E.coli a una concentración de 5mg de
glifosato/placa. Resultados similares fueron obtenidos en un estudio en células de
mamífero (CHO) mediante el ensayo de reversión del locus HGPRT in vitro cuando
las células fueron expuestas a una concentración de glifosato de 22.5 mg/mL (Li and
Long, 1988; Moriya, 1983 en Williams, 2000).
Sin embargo, el glifosato indujo un incremento de aberraciones cromosómicas y de
intercambio de cromátidas hermanas en linfocitos humanos expuestos a una
concentración de 1.4 mg/L y en linfocitos bovinos expuestos en un rango de
concentraciones de 2.9mg/L de glifosato (Lioi, 1998a, Lioi 1998b en Williams, 2000).
En años anteriores un trabajo realizado en el Laboratorio de Genética Humana que
reportó que el ingrediente activo es citotóxico y genotóxico en líneas celulares
normales (fibroblastos humanos primarios y células de hamster chino) y líneas
celulares transformadas (células de fibrosarcoma humano). En este estudio, la
determinación de la viabilidad celular después de un periodo de tratamiento de 4
horas, permitió evidenciar que el glifosato es citotóxico en un rango de
concentraciones de 4.0 a 6.5mM en los fibroblastos normales; de 0.9 a 2.7mM en las
células de hamster chino y de 4.5 a 5.75mM en las células de fibrosarcoma (Figuras
4a y 5a).
La viabilidad celular de las líneas transformadas se vio reducida en un 80% cuando
las células fueron expuestas a una concentración de 5.5mM de glifosato mientras que
las células revelaron un efecto similar en la viabilidad celular al ser tratadas con
glifosato a una concentración de 6.5mM. Estos resultados demostraron una mayor
sensibilidad, en términos de viabilidad celular, de las células de fibrosarcoma humano
en comparación con las células normales cuando fueron expuestas a glifosato.
Asimismo, este estudio mostró que el glifosato inducía rompimientos en el ADN a
concentraciones de 4.0 a 6.5mM para los fibroblastos normales; a dosis mayores a
6mM para las células de hamster chino y de 4.75 a 5.75mM para las células de
fibrosarcoma, evidenciado por el Ensayo del Cometa (Figura 4b y 5b). De esta forma
la evaluación del daño en el ADN también evidenció una diferencia en la sensibilidad
de las líneas celulares estudiadas no obstante su estado de eficiencia del gen p53, un
gen requerido para el funcionamiento adecuado de la reparación genómica global,
encargada de la eliminación de un amplio grupo de lesiones en el ADN (Monroy,
2004. Monroy, 2005).
Figura 4: Citotoxicidad y Genotoxicidad en fibroblastos humanos normales (GM38) expuestos a
diferentes concentraciones de glifosato (Monroy, 2005)
A B
Figura 5: Citotoxicidad y Genotoxicidad en células de fibrosarcoma humano (HT1080) expuestas
a diferentes concentraciones de glifosato (Monroy, 2005)
A B
Por otro lado, el potencial oncogénico potencial del glifosato ha sido evaluado en tres
estudios mediante la determinación de la formación de tumores intersticiales después de
alimentar a ratas y ratones con diferentes concentraciones de glifosato (20.000 ppm en
ratones o 30.000 ppm en ratas). Estos estudios permitieron concluir que este compuesto
no es oncogénico en ninguna de estas dos especies. El glifosato ha sido clasificado
como “no oncogénico” por la Organización Mundial de la Salud (WHO, 1994) y en la
categoría de “evidencia de no carcinogenicidad en humanos” según la Agencia de
Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) (US EPA, 1992 en Williams, 2000)
Si bien el glifosato es un herbicida altamente eficiente, este no es usado en campo como
ingrediente activo solo sino formulado con otros compuestos que potencian su acción
en la planta blanco. Teniendo en cuenta lo anterior, se han realizado diversos estudios
comparativos para determinar el potencial tóxico diferencial del glifosato técnico y de
la formulación Roundup.
Recientemente se reportó la inducción de rompimientos en el ADN en células hepáticas
y de riñón de ratones expuestos tanto a la formulación comercial como al ingrediente
activo solo en una dosis de 300mg/Kg de glifosato. Los resultados de este estudio
evidencian un aumento en el número de rompimientos en el ADN cuando los dos tipos
celulares fueron tratados con los dos compuestos durante un periodo de 4 horas.
Adicionalmente, al evaluar la inducción de intercambio de cromátidas hermanas en
linfocitos humanos expuestos in vitro a un rango de concentraciones de 0.01 a 6mg/L
de los dos compuestos, se observó la formulación Roundup presentaba una mayor
genotoxicidad en comparación en el ingrediente activo (Bolognesi, 1997).
Asimismo, la evaluación de la formación de aductos en el ADN en células hepáticas y
de riñón de ratones tratados con el herbicida comercial y el glifosato técnico (122-182
mg/kg) evidenció una mayor inducción de aductos en las células de los ratones tratados
con Roundup en comparación con las de los ratones tratados con el ingrediente activo
solo (Peluso, 1998).
Por otro lado se ha demostrad que la formulación Roundup induce la disminución de la
viabilidad celular en varios modelos in vitro. Un estudio publicado recientemente por
Peixoto y cols (Peixoto, 2005) reveló que el herbicida comercial altera las funciones
bioenergéticas mitocondriales y la permeabilidad de la membrana de las células
hepáticas de ratón, cuando estas fueron expuestas a un rango de concentraciones de 0 a
10mM de ácido de glifosato presente en Roundup.
Del mismo modo se ha observado que el glifosato técnico y la formulación comercial
son tóxicos en células de placenta humana después de un periodo de incubación de 18
horas a concentraciones menores a las encontradas en el uso en campo (1-2% en agua).
Así, la dosis letal media (LD50) fue aproximadamente 1.8 veces menor para Roundup
(0.7%) que para glifosato (Figura 6), lo cual permitió evidenciar que la disminución en
la viabilidad celular era más pronunciada en la formulación comercial en comparación
con el glifosato (Richard, 2005)
Las diferencias en la genotoxicidad del ingrediente activo y la formulación comercial
han sido atribuidas a la presencia de otros componentes de la formulación comercial (i.e
coformulantes y surfactantes) o al efecto sinérgico de éstos y el glifosato, lo cual pueda
tener un papel un papel importante en la toxicidad del herbicida. Adicionalmente se ha
reportado que los surfactantes presentes en las mezclas comerciales pueden estar
contaminados con cantidades traza de compuestos N-nitroso. Estos compuestos están
clasificados como carcinógenos químicos y pueden ser activados metabólicamente para
dar lugar a la formación de especies reactivas de oxígeno que forman aductos en el
ADN mediante la unión covalente a este (Bolognesi, 1997. Peluso, 1998. Peixoto,
2005).
Figura 6: Efectos de Roundup (A) y cantidades equivalentes de glifosato (B) en la viabilidad
de células de placenta humana (Richard, 2005).
GLIFOSATO ROUNDUP
2.4. Células de Ovario de Hámster Chino (CHO – K1)
La línea celular CHO-K1 (ATCC No: CCL-61) es un subclon derivado de la línea
celular parental, obtenida de una biopsia de un hamster adulto por T. Puck en 1957.
Generalmente esta línea celular, derivada del tejido de ovario de Cricetulus ariseus,
presenta morfología epitelial y elongada y propiedades adherentes en crecimiento in
vitro (Figura 7); asimismo presenta un tiempo de generación corto, un estado diploide
relativamente constante y un grado bajo de variabilidad en el número cromosómico
(22 cromosomas) (Puck, 1958, Kao, 1966). Adicionalmente se ha observado que estas
células presentan gran resistencia a condiciones tóxicas, lo cual ha permitido su uso
en diferentes ensayos de genética toxicológica in vitro (Puck, 1958, Kirkland 2007).
Otras ventajas de trabajar con esta línea celular son: alta tasa de crecimiento, alta
productividad, buena proliferación en cultivos de gran escala y adaptabilidad en
medios bajos en proteína.
Figura 7: Morfología de células CHO K1 en cultivo
Fuente: http://www.mpi-magdeburg.mpg.de
2.5. Linfocitos humanos
Los linfocitos son un tipo de células blancas, encargadas de la respuesta del sistema
inmune, que se desarrollan a partir de células progenitoras linfoides inmaduras y se
dividen en dos grupos principales dependiendo del lugar en que estos maduren:
linfocitos B, que maduran en la médula ósea, y linfocitos T, que lo hacen en el timo
(Figura 8).
Los linfocitos humanos han sido ampliamente utilizados en la evaluación del potencial
genotóxico de diferentes compuestos in vitro: metales pesados (Hartmann, 1994),
agentes alquilantes, benzo a pireno (Hartmann, 1995), gran variedad de fármacos
(Giannotti, 2002) y herbicidas (Soloneski, 1997). El uso extenso de este tipo celular en
estudios de genética toxicológica radica en que estas células son metabólicamente
eficientes ya que se ha demostrado que los linfocitos humanos tienen niveles
detectables de mARN de la enzima CYP2E1, una enzima que está involucrada en el
metabolismo oxidativo de xenobióticos de bajo peso molecular, principalmente de
sustancias químicas. De igual forma este tipo celular en linfocitos humanos se han
detectado bajos niveles de CYP2B6, CYP3A3, CYPC8-19, CYP3A5 y CYP 4B1. Sin
embargo no se observó expresión de las enzimas CYP1A1, CYP1A2, CYP2F1,
CYP3A4 y CYP3A7 (Tabla 3. Figura 9) (Hukkannen, Krovat, 2000).
Figura 8: Proceso de diferenciación de los linfocitos 5
Tabla 3: Expresión de mARN de
diferentes enzimas CYP en linfocithumanos
CYP Linfocitos 2B6/7 +/-
2C8-19 +/- 2E1 + 3A5 +/- 4B1 +/-
5http://www.cancerhelp.org.uk/c
ancer_images/bloodcellsmade.gifos
Figura 9: Expresión de diferentes enzimas CYP en
linfocitos humanos (Krovat, 2000)
2.6. Ensayo del Cometa
El potencial genotóxico de una sustancia determinada es uno de los factores de riesgo
más importantes en la determinación de los efectos a largo plazo a nivel de toxicología
carcinogénica y reproductiva (Bolognesi, 2003); teniendo en cuenta que las
interacciones con el ADN pueden dar lugar a cambios en la expresión génica o pueden
afectar otros procesos biológicos importantes (Williams, 2000).
El ensayo del cometa es una técnica rápida y ampliamente utilizada para la detección de
daño en el ADN que pueden ocurrir como consecuencia de una respuesta celular a un
agente genotóxico (Wolz, 2002). Esta prueba fue desarrollada por Singh en 1988 y
actualmente es una de las metodologías más utilizadas para evaluar la genotoxicidad de
diferentes tipos de agentes mutagénicos como químicos industriales, biocidas,
productos agroquímicos y farmacéuticos (Hartmann, 2003).
Los sistemas celulares más utilizados para la evaluación de daño in vitro son células de
hamster chino, de ovario o de pulmón, y linfocitos humanos (Hartmann, 1997) (Figura
10). La parte inicial de la evaluación del daño en el ADN in vitro mediante el ensayo
del cometa requiere la determinación de la viabilidad celular, después de la exposición
al compuesto prueba, con el fin de establecer un rango de concentraciones que no
induzca el inicio de procesos de necrosis o apoptosis. De esta manera se logra
establecer la significancia biológica de los resultados de la prueba dado que la
genotoxicidad solo es relevante si ocurre en células capaces de sobrevivir al daño (Elia,
1994 en Hartmann, 1997).
Figura 10: Uso de células de mamíferos para pruebas regulatorias de la German Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM) entre
1995 y 2005. (Kirkland, 2007)
Huly: Linfocitos humanos MLA: ensayo de linfoma en ratones V79, CHO y CHL: células de hamster chino.
El ensayo de viabilidad celular con azul de tripán es un biomarcador de la estabilidad de
la membrana celular durante la interacción célula-herbicida, en el que el colorante es
excluido de las células viables pero puede entrar a través de las membranas celulares
dañadas para así marcar el citoplasma (Jamil, 2004). El azul de tripán ha sido utilizado
para estudiar la citotoxicidad de medicamentos antitumorales de una gran variedad de
tumores. En estos estudios se ha encontrado una buena correlación entre la respuesta in
vitro y los resultados obtenidos en quimioterapia in vivo, tanto en animales como en
humanos (Durkin, 1979 en Rossman, 2005).
Una vez establecido el rango de concentraciones del tratamiento en las que las células
muestran una viabilidad mayor al 80%, se procede a realizar el Ensayo del Cometa. En
este ensayo, en un medio alcalino (pH>13) el aumento de la migración del ADN en la
electroforesis está asociado con un aumento en los niveles de rompimiento de cadena
sencilla, sitios álcali-labiles y rompimientos de cadena sencilla producidos por sitios de
reparación por escisión incompleta (Tice, 2000; Hartmann, 2003; Garaj-Vrhovac,
2003). La evaluación de los parámetros de daño en el ADN se puede hacer mediante la
clasificación de la morfología del núcleo en cinco categorías (de células sin daño, 0, a
células con daño máximo, 4) (Figura 11) o con la ayuda de sistemas de análisis (i.e
CASP) que permiten cuantificar el daño en el ADN mediante diferentes parámetros
como el porcentaje de ADN en la cola, el momento de cola (olive) y la longitud de la
cola del cometa.
Figura 11: Categorías de clasificación del daño en el ADN según la
morfología del núcleo (Monroy, 2005)
0
1
2
3
4
Las ventajas que se obtienen con la utilización del ensayo del cometa radican en que:
(a) presenta una alta sensibilidad para detectar bajos niveles de daño en el ADN, (b)
requiere un bajo número de células por muestra, (c) se obtienen resultados en un
periodo de tiempo relativamente corto y a un costo efectivo, y (d) existe correlación
entre el Ensayo del Cometa y otros ensayos citogenéticas como la evaluación de
aberraciones cromosómicas (Faust 2004, Tice 2000).
3. JUSTIFICACIÓN
El uso de herbicidas en el control de malezas se ha extendido considerablemente en los
últimos años, incluso en una mayor proporción que el uso de insecticidas (Cavas, 2007).
El glifosato es un herbicida ampliamente utilizado a nivel industrial y en agricultura en
cultivos de café, banano, vegetales, cereales y algodón; en silvicultura y a nivel
industrial y residencial (Peluso, 1998. Acquavella, 2004). Sin embargo, el glifosato no
es aplicado en campo como ingrediente activo solo sino en la forma de formulaciones
técnicas que contienen, además del glifosato, otros componentes que actúan como
coadyuvantes o surfactantes. Dentro de las formulaciones comerciales más vendidas a
nivel mundial se encuentra Roundup, la cual contiene además del ingrediente activo, un
surfactante que altera la tensión superficial de las hojas para así favorecer la acción del
glifosato.
El potencial tóxico del glifosato y de la formulación Roundup ha sido evaluado en
diferentes sistemas biológicos y mediante diversos ensayos. De esta forma, el glifosato
técnico no ha demostrado tener potencial mutagénico en ensayos en Salmonella
typhimurium y en E.coli. Resultados similares fueron obtenidos en un estudio en células
de mamífero (CHO) mediante el ensayo de reversión del locus HGPRT. (Li and Long,
1988; Moriya, 1983 en Williams, 2000). Por otra parte, el glifosato técnico mostró la
inducción de un incremento de aberraciones cromosómicas y de intercambio de
cromátidas hermanas en linfocitos humanos (Lioi, 1998a, Lioi 1998b en Williams,
2000). Por su parte se ha demostrado que la formulación Roundup induce un aumento
en el intercambio de cromátidas hermanas en linfocitos humanos in vitro, así como en
la frecuencia de micronúcleos en ratones cuando fueron alimentados con Roundup
(Bolognesi, 1997)
Si bien los ensayos estándar iniciales muestran resultados negativos, hay evidencia de
resultados positivos reportados en la literatura; es por esto que es necesario realizar un
estudio complementario. Además de las pruebas estándar anteriormente mencionadas,
se requiere de la ejecución de ensayos adicionales para aclarar la actividad de la
sustancia prueba o para determinar la relevancia de los efectos biológicos observados en
estudios previos. Estas pruebas adicionales comprenden el estudio de interacciones con
el ADN y/o la inducción de daño primario en el ADN (Thybaud, 2007).
Adicionalmente el uso extensivo de este herbicida a nivel industrial y en la agricultura,
crea la necesidad de evaluar la eficiencia de diferentes biomarcadores de exposición que
revelen el potencial genotóxico de este herbicida en la población humana expuesta.
El ensayo del cometa es una técnica rápida y altamente sensible para la detección de
daño en el ADN (cadena sencilla, doble cadena y sitios lábiles al álcali). Esta
metodología ha sido ampliamente utilizada en la evaluación, tanto in vitro como in vivo,
del potencial genotóxico de diferentes herbicidas. Los sistemas celulares más utilizados
para la determinación in vitro del daño en el ADN mediante este ensayo son las células
de hamster chino (CHO); las cuales presentan una gran resistencia a condiciones tóxicas
y tienen un tiempo de generación corto, y los linfocitos humanos; han sido ampliamente
utilizados en la evaluación del potencial genotóxico en la exposición a herbicidas y
además son metabólicamente competentes.
Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo del presente estudio es evaluar el riesgo
genético in vitro de la exposición al herbicida Roundup en células CHO – K1 y
linfocitos humanos.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Evaluar el riesgo genético in vitro de la exposición al herbicida Roundup en células
CHO – K1 y linfocitos humanos.
4.2. Objetivos específicos
4.2.1. Evaluar la citotoxicidad aguda de Roundup en células de hamster chino y
linfocitos humanos.
4.2.2. Determinar potencial daño en el ADN inducido por el herbicida Roundup en
células de hamster chino y linfocitos humanos.
4.2.3. Determinar el daño en el ADN por medio de diferentes parámetros visuales
y automatizados.
5. METODOLOGÍA
5.1. Compuestos químicos y reactivos
La formulación Roundup® (EPA Reg. No. 524-445) fue comprada en la Compañía
Agrícola Colombiana Ltda. (Monsanto). Se preparó una solución stock del herbicida
a una concentración de 25mM de ácido de glifosato por dilución en agua destilada
estéril. Las soluciones de trabajo del herbicida fueron preparadas en medio de
cultivo RPMI 1640 no suplementado con suero bovino fetal. El medio de cultivo
RPMI 1640, la tripsina y los antibióticos se compraron en GIBCO. El
dimetilsulfóxido (DMSO), la agarosa de bajo punto de fusión y de punto de fusión
normal fueron compradas en SIGMA.
5.2. Cultivo celular
5.2.1. Células CHO – K1
La línea celular CHO-K1 (ATCC No: CCL-61) es un subclon derivado de la línea
celular parental, obtenida de una biopsia de un hamster adulto.
Las células CHO-K1 fueron cultivadas en medio RPMI 1640, suplementado con
10% de suero bovino fetal (SBF), 2.2% de bicarbonato de sodio, 1% de antibióticos
(penicilina/estreptomicina), 0.1% de fungizona y 1% de L-glutamina. Las células
fueron incubadas en cajas de 100mm a 37ºC en una atmósfera húmeda al 5% de
CO2. Para almacenamiento por largo tiempo, las células fueron congeladas en
nitrógeno líquido en una solución de suero bovino fetal al 5% de DMSO.
5.2.2. Linfocitos humanos
Se tomaron muestras de sangre de seis donantes (tres hombres y tres mujeres), de
edades entre los 17 y los 30 años. Los donantes eran no fumadores, no habían sido
expuestos a rayos X y no habían tenido un consumo alto de bebidas alcohólicas o
medicamentos en los últimos tres meses.
5.2.3. Extracción de linfocitos
La extracción de linfocitos se realizó de acuerdo a un protocolo publicado
previamente (Speit, 1996), con algunas modificaciones. Brevemente, se tomaron
4mL de sangre total que fueron adicionados a 4mL de Ficoll Hypaque precalentado
(37ºC). Posteriormente la muestra se centrifugó a 1800rpm por 25 minutos, luego se
removió cuidadosamente la capa de linfocitos (Figura 12) y se resuspendieron en
8mL de RPMI suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%. Se realizaron
dos lavados con 8mL de RMPI suplementado, centrifugando las células a 1200 rpm
por 10 minutos. Finalmente las células fueron resuspendidas en 8mL de RPMI
suplementado e incubadas a 30ºC durante 30 minutos. Después del periodo de
incubación las células fueron centrifugadas a 1000rpm, el sobrenadante fue
descartado y las células fuero resuspendidas en 400uL de RPMI suplementado
(suspensión 1).
Figura 12: Extracción de linfocitos con Ficoll Hipaque
PlasmaCélulas mononucleadas
Glóbulos rojosHistopaque
Fuente: Protocolo de Histopaque 1077
5.3. Ensayos de citotoxicidad aguda
5.3.1. Células CHO – K1
La citotoxicidad aguda de las células expuestas al herbicida Roundup se determinó
de acuerdo con una metodología desarrollada por otros autores (Plewa, 2000.
Kiskinis, 2002); empleando el cultivo de células en microplacas de 96 pozos. Se
realizaron 2 réplicas por cada uno de los tratamientos evaluados y tres replicas de
cada experimento. En la microplaca, cada una de las columnas corresponde a un
tratamiento y cada una de las filas, a una replica.
Las células fueron sembradas en una concentración de 3 x 105 células/mL en cada
uno de los pozos y fueron cultivadas durante 24 horas con medio de cultivo
suplementado antes de la exposición al herbicida, con el fin de permitir la adhesión
celular en cada pozo. Después del periodo de incubación, el medio de cultivo fue
cuidadosamente aspirado de cada uno de los pozos y se realizaron dos lavados con
100uL de Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS).
Tabla 4: Diseño de la microplaca para la evaluación de citotoxicidad aguda en células CHO –K1 expuestas a Roundup
C - Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Dosis 4 C +
Suspensión celular 100uL 100uL 100uL 100uL 100uL 100uL
RPMI no suplementado 100uL
Roundup 100uL 0.005mM
100uL 0.01mM
100uL 0.02mM
100uL 0.04mM
EMS 100uL 4mM
Volumen final 200uL 200uL 200uL 200uL 200uL 200uL
Los tratamientos consistieron en la adición de RPMI 1640 suplementado (sin SBF)
y las diferentes concentraciones de Roundup® (Tabla 4). El control negativo fueron
células tratadas con RPMI 1640 no suplementado, sin adición de la formulación. El
control positivo fueron células expuestas a una concentración de 4mM de
etilmetanosulfonato (EMS), el cual ha sido caracterizado como agente citotóxico y
genotóxico (Anderson, 2003; Hartman, 2001). La microplaca estuvo en agitación
orbital por 5 minutos para favorecer la distribución homogénea del herbicida en
cada pozo. Posteriormente se incubó por 3 horas a 37ºC, 5% CO2.
Al final del tiempo de incubación se retiró el medio de cultivo de cada pozo, se hizo
un lavado con 100uL de HBSS y se adicionaron 60uL de solución de tripsina
(solución 1:10 - 0,1% tripsina: PBS 1X) para favorecer el desprendimiento de las
células. A continuación la microplaca estuvo en agitación orbital por 2 minutos, se
incubó nuevamente durante 3 minutos a 37ºC y luego se adicionaron 100uL de
RPMI 1640 suplementado al 5% de SBF. Posteriormente se determinó el porcentaje
de viabilidad celular por exclusión con azul de tripán, adicionando 10uL de
suspensión celular a 90uL de azul de tripán. El conteo celular se hizo en cámara de
Neubauer para así obtener los porcentajes de viabilidad celular (Figura 13).
Figura 13: Determinación de viabilidad celular por exclusión de azul de tripán
Conteo en Cámara de
Neubauer Visualización de las células Viabilidad celular
% Células Vivas: CV x 100 CM+CV
% Células Muertas: CM x 100 CM+CV
http://wages/pastissue/article/nex8.jpg
V
M
wwwtecnic
43
21
Tomado de: .ub.es/biocel/wbc/
as/contajecelular.htm
Tomado de: ww.ngpharma.com/im
5.3.2. Linfocitos humanos
A partir de la suspensión celular de 400uL obtenida después de la extracción de
linfocitos (suspensión 1), se ajustó la concentración celular a 1.5 x 106 células/mL y
se verificó la viabilidad celular inicial por el método de exclusión de azul de tripán
(ver Figura 13) (Speit, 1996).
El tratamiento de las células se llevó a cabo en tubos ependorff de 1.5mL. Se
realizaron 2 réplicas por cada uno de los tratamientos evaluados y tres replicas de
cada experimento. En cada experimento se evaluaron cuatro concentraciones del
herbicida diluido en RPMI no suplementado. El control negativo consistió en tratar
las células con medio no suplementado y el control positivo fueron células tratadas
con etilmentanosulfonato (EMS) a una concentración de 3mM (Tabla 5). Las células
fueron incubadas a 37ºC por 3h en una atmósfera de 5% de CO2.
Tabla 5: Diseño del experimento para la evaluación de citotoxicidad aguda en linfocitos humanos expuestos a Roundup
C - Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3 Dosis 4 C +
Suspensión celular 100uL 100uL 100uL 100uL 100uL 100uL
RPMI no suplementado 100uL
Roundup 100uL 0.005mM
100uL 0.01mM
100uL 0.02mM
100uL 0.04mM
EMS 100uL 3mM
Volumen final 200uL 200uL 200uL 200uL 200uL 200uL
Después del periodo de incubación las células se centrifugaron a 1300rpm por 10
minutos, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 400uL de
RPMI suplementado cal 10% de SBF (suspensión 2). A partir de esta suspensión
celular se tomaron 10uL que fueron adicionados a 90uL de azul de tripán para así
evaluar la viabilidad celular en los linfocitos expuestos a diferentes concentraciones
del herbicida.
5.4. Ensayo del Cometa
Las concentraciones del herbicida utilizadas para el Ensayo del Cometa fueron
seleccionadas de acuerdo a los resultados obtenidos en los ensayos de citotoxicidad. Las
dosis que resultaron en una viabilidad menor al 75% en comparación con el control
negativo no fueron consideradas para la evaluación de la inducción de daño en el ADN.
En el presente estudio se utilizó la metodología descrita por Singh y col para el ensayo
del cometa (Singh, 1998) con algunas modificaciones (Plewa, 2002). Brevemente, a
partir de la suspensión celular utilizada para la determinación de viabilidad celular, se
tomaron 30uL que fueron mezclados con 270uL de agarosa de bajo punto de fusión
(LMA). De esta suspensión se tomaron 100uL que fueron esparcidos en láminas de
microscopio precubiertas con agarosa del punto de fusión normal al 1%. La agarosa de
las láminas solidificó después de 8 minutos a 4ºC y una capa final de LMA fue aplicada
a cada una de las láminas. Con el fin de remover la membrana celular, las laminas
fueron incubadas en solución de lisis (2.5 M NaCl, 100 mM Na2 EDTA, 10 mM Tris,
1% Triton X-100, and 10% DMSO) por un periodo no superior a dos semanas.
Posteriormente las láminas fueron tratadas con buffer alcalino (1 mM Na2EDTA, 300
mM NaOH, pH >13) por 25 minutos con el fin de permitir el desenrrollamiento del
ADN y de obtener la expresión de sitios lábiles al álcali en rompimientos de cadena
sencilla; la electroforesis se llevó a cabo a 25V, 290 mAmp por 35minutos a 4ºC. Las
láminas fueron lavadas con 400 mM de buffer Tris, pH 7.5 para neutralizar el gel y
posteriormente fueron lavadas con agua destilada fría y deshidratadas con metanol por 5
minutos. El marcaje se realizó con 20uL de Bromuro de Etidio (2ug/mL) por 5 minutos.
Se analizaron 25 células por lámina.
Después del marcaje las imágenes fueron analizadas utilizando un microscopio de
fluorescencia Zeiss con un filtro de excitación de BP 546/10nm y un filtro de barrera de
590nm en una magnificación de 40x, utilizando una cámara Canon PowerShot S40.
Las imágenes fueron analizadas con el programa CASP- comet assay software (versión
1.2.2) (Końca, 2003) para establecer los parámetros de longitud de la cola, % de ADN,
Momento de cola y Momento de cola Olive (Tabla 6 ). Los datos fueron
automáticamente exportados a una hoja de cálculo estándar para el análisis estadístico
posterior. Adicionalmente, el nivel de daño en cada célula fue clasificado de acuerdo a
las categorías previamente establecidas para la morfología del núcleo (Figura 11)(Speit,
1996).
Tabla 6: Parámetros de determinación de daño en el ADN según programa CASP
(versión 1.2.2) (Końca, 2003)
Parámetro Explicación
Longitud de la cola Longitud de la cola del cometa medida del
borde derecho de la cabeza del cometa hasta el fin de la cola (en pixeles)
Porcentaje de ADN Porcentaje de ADN en la cola del cometa Momento de cola % de ADN en la cola x longitud de la cola
Momento de cola olive % de ADN en la cola x (Media de la cola X – Media de la cabeza X)
5.5. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa Statistix 8.0. Los datos de
citotoxicidad aguda se analizaron con la Correlación de Pearson para determinar el
grado de asociación lineal entre la concentración de Roundup® y el porcentaje de
viabilidad celular.
La prueba Shapiro-Wilk se utilizó para determinar si los datos presentaban distribución
normal. Los datos obtenidos a partir del Ensayo del cometa fueron analizados por
medio de un ANOVA one way Dunnet`s`test para determinar si los parámetros de
evaluación de daño en el ADN presentaban diferencias significativas al comparar el
control negativo con los diferentes trabamientos con el herbicida.
6. RESULTADOS
6.1. Evaluación de la citotoxicidad y genotoxicidad de células CHO-K1 expuestas
al herbicida Roundup
6.1.1. Citotoxicidad aguda
En los ensayos preliminares, las células fueron expuestas a aquellas concentraciones
del herbicida a las que el ácido de glifosato fue citotóxico in vitro en células CHO
(1mM a 7mM) (Monroy, 2005). Los resultados de la evaluación de la citotoxicidad
de Roundup a estas concentraciones revelaron la inducción de la mortalidad del
100% de las células tratadas. Estos resultados difieren de los obtenidos con el ácido
de glifosato solo, en los que el tratamiento de las células CHO con una dosis de
5.5mM indujo solo un 20% de mortalidad.
Figura 14: Citotoxicidad aguda en células CHO – K1 expuestas a la formulación
Roundup (0 – 0.4mM de ácido glifosato)
Teniendo en cuenta lo anterior, se procedió a probar concentraciones más bajas del
herbicida en un rango de 0.01mM a 0.6mM. Las curvas de citotoxicidad aguda
revelaron una disminución constante en la viabilidad celular cuando las células
fueron expuestas durante 3 horas a una concentración de 0.01mM a 0.4mM de ácido
de glifosato en Roundup (Índice de correlación de Pearson = -0.9464) (Figura.14),
(Ortiz, 2006).
6.1.2. Ensayo del cometa
La evaluación del daño en el ADN inducido por Roundup en las células CHO se
realzó a las concentraciones a las que el herbicida indujo una reducción de menos
del 20% en la viabilidad celular. Así, la evaluación del daño en el ADN se realizó
después de 3 horas de tratamiento con un rango de concentraciones de 0.005mM a
0.04mM de ácido de glifosato en Roundup. Los parámetros de evaluación del daño
en el ADN incluyeron la determinación de la morfología del núcleo en cada célula
analizada (Figura 11) y de los parámetros de longitud de la cola, porcentaje de
ADN, Momento de cola y Momento de cola Olive (Tabla 6).
Los resultados obtenidos revelan la inducción significativa de daño en el ADN en
las células CHO-K1 a concentraciones superiores a 0.02mM de glifosato técnico,
presente en Roundup, de acuerdo a la determinación de la morfología del núcleo y
de la longitud de la cola (Figura 17, Tabla 7). Sin embargo, los otros parámetros
(porcentaje de ADN en la cola, momento de cola y momento de cola Olive) no
mostraron diferencias significativas entre el control y los tratamientos con las
diferentes dosis del herbicida.
Asimismo se observó, a partir de la estimación del coeficiente de variación de cada
parámetro, que la morfología del núcleo es el parámetro menos variable mientras
que el momento de cola Olive tiene el mayor valor de variación (Tabla 7).
Figura 15: Daño en el ADN en células CHO – K1 expuestas a Roundup
(evaluado mediante la morfología de los núcleos)
Tabla 7: Análisis estadístico de los parámetros de evaluación del daño en el
ADN en células CHO – K1 expuestas a Roundup PARÁMETRO C.V P DIFERENCIAS CON CONTROL
0.005 0.01 0.02 0.04 0.06 C+
Morfología 49.239 0.0000 1.1905 1.1391 1.1875* 1.2089* 1.3117* 2.7854*
Longitud 110.94 0.0000 17.436 10.394 11.938* 10.591* 15.545* 24.689*
% ADN 1097.6 0.0000 2.2872 882.25 94.345 11397 2.4783 9.3076
Momento de cola 1988.7 0.0297 0.2623 0.1991 1198.0 1.2089 0.3433 2.5303
Momento Olive 2065.6 0.0426 1.3328 5.1900 1.8738 13.216 1.5350 3.1601
*
** *
(mM)
C - 0.005 0.01 0.02 0.04 0.06 C+
6.2. Evaluación de la citotoxicidad y genotoxicidad de linfocitos humanos
expuestos al herbicida Roundup
6.2.1. Citotoxicidad aguda
Los linfocitos humanos fueron tomados de muestras de sangre de seis donantes (3
hombres y 3 mujeres). La determinación del rango de concentraciones a las que la
formulación Roundup es citotóxica en linfocitos humanos se hizo basada en las
dosis previamente evaluadas en las células CHO – K1 (0.005-0.4mM).
Los resultados demostraron una reducción en la viabilidad celular en un rango de
concentraciones de 0.005mM a 1mM de ácido de glifosato presente en la
formulación de Roundup (Correlación de Pearson = - 0.8296) (Figura 16).
Adicionalmente se observó una menor susceptibilidad de los linfocitos al herbicida
en comparación con las células CHO-K1. De esta forma a una dosis de 0.1mM de
ácido de glifosato, la viabilidad de los linfocitos se redujo en un 5% mientras que en
las células CHO-K1 la reducción fue de un 50%.
6.2.2. Ensayo del cometa
El ensayo del cometa fue llevado a cabo en linfocitos humanos a aquellas
concentraciones a las que Roundup mostró una reducción de menos del 20% en la
viabilidad celular. Así, la evaluación del daño en el ADN se realizó después de 3
horas de incubación de células expuestas en un rango de concentraciones de
0.005mM a 0.04mM de ácido de glifosato en Roundup. La evaluación del daño en
el ADN se hizo mediante la determinación de la morfología del núcleo en cada
célula analizada (Figura 11) y de los parámetros de longitud de la cola, porcentaje
de ADN, Momento de cola y Momento de cola Olive (Tabla 6). Adicionalmente se
evaluó si existían diferencias en los resultados obtenidos entre los diferentes
donadores y entre géneros.
Figura 16: Citotoxicidad aguda en linfocitos humanos expuestos a la formulación
Roundup (0 – 2mM de ácido glifosato)
Figura 17: Daño en el ADN en linfocitos humanos expuestos a Roundup
(mM)
0 0.005 0.01 0.02 0.04 0.05 0.1 0.2 0.5 1 2
Los resultados muestran la inducción significativa de daño en el ADN en linfocitos
humanos expuestos a concentraciones superiores a 0.005mM de glifosato técnico,
presente en Roundup, como se evidencia con los parámetros de morfología del
núcleo, longitud de la cola y porcentaje de ADN en la cola (Figura 17, Tabla 8).
Sinembargo, los otros parámetros de determinación de daño en el ADN (momento
de cola y momento de cola Olive) no mostraron diferencias significativas entre el
control y todos los tratamientos con las diferentes dosis del herbicida.
Tabla 8: Análisis estadístico de los parámetros de evaluación del daño en el
ADN en linfocitos humanos expuestos a Roundup PARÁMETRO C.V P DIFERENCIAS CON CONTROL
0.005 0.01 0.02 0.04 C+
Morfología 51.607 0.0000 1.1977* 1.2836* 1.3111* 1.3099* 2.8256*
Longitud 159.38 0.0019 14.801* 14.291* 17.708* 18.054* 66.068*
% ADN 200.46 0.0013 2.7314* 2.3125* 2.7528* 3.0829* 13.652*
Momento de cola 389.28 0.0006 2.5461* 1.3441 2.1586* 2.0189 13.912*
Momento Olive 277.93 0.0006 1.7836* 1.2942 1.7512* 1.8255* 10.001*
Adicionalmente se observó un efecto del donante cuando se evaluó el efecto de las
dosis del herbicida en los linfocitos humanos (P=0.0006). Así, el donante 6
(hombre, 17 años) presentó un mayor nivel de daño basal en el ADN inducido por el
herbicida, en comparación con los otros donantes (Figura 18. Tabla 9). Sin embargo
se realizó una regresión lineal para cada uno de los donantes y se observó que todos
mostraban una pendiente positiva a medida que aumentaba la dosis del herbicida, lo
cual revela un aumento en la inducción de daño en el ADN. El donante 6 mostró la
mayor pendiente. Las diferencias en el nivel de daño en el ADN observadas entre
géneros son causadas por el alto nivel de daño en el ADN en las células del donante
6 y no por una diferencia real entre los géneros. (P=0.000) (Figura 19).
Figura 18: Efecto del donante en la evaluación del daño en el ADN en linfocitos
humanos expuestos a Roundup (evaluado mediante la morfología de los núcleos)
Tabla 9: Análisis del varianza para el efecto del donante en la evaluación del daño
en el ADN (morfología) en linfocitos humanos expuestos a Roundup
Fuente DF SS MS F P Dosis 5 816.424 163.285 713.54 0.0000
Donante 5 109.646 21.929 95.83 0.0013 Dosis*Donante 25 87.883 3.515 15.36 0.0006
Error 3475 795.208 0.229 Total 3510
Figura 19: Efecto del género en la evaluación del daño en el ADN en linfocitos
humanos expuestos a Roundup (evaluado mediante la morfología de los núcleos)
7. DISCUSIÓN
En el presente estudio se evaluó el potencial citotóxico y genotóxico de la formulación
comercial Roundup (glifosato) en dos líneas celulares: células de ovario de hamster chino y
linfocitos humanos.
La determinación de la citotoxicidad inducida por el herbicida en las células de roedor
mostró una reducción constante en la viabilidad en las dos líneas celulares; lo cual puede
ser una consecuencia de la inducción de daño estructural o de la alteración de las funciones
celulares que conllevan finalmente a la muerte celular vía necrosis o apoptosis (Eisenbrand,
2002). La respuesta de las dos líneas celulares evidenció que las células de roedor fueron
más sensibles al herbicida, en términos citotoxicidad, en comparación con los linfocitos
humanos. De esta manera, cuando las células fueron tratadas a una concentración de
0.1mM de ácido de glifosato en Roundup, la viabilidad de las células de roedor se vio
reducida en un 50% mientras que en los linfocitos humanos esta reducción fue solo del 4%
aproximadamente.
Por otro lado, los resultados obtenidos en la evaluación de la citotoxicidad de la
formulación comercial Roundup en las células CHO K1 difieren de los efectos previamente
reportados en otro subclon de este tipo celular expuesto a diferentes concentraciones del
ingrediente activo solo. Si bien el glifosato técnico induce una reducción constante en la
viabilidad celular en un rango de concentraciones de 1mM a 7mM (Monroy, 2005), la
formulación comercial Roundup muestra un efecto similar a concentraciones de 0.01 a
0.4mM de ácido de glifosato. Estos resultados revelan un mayor potencial citotóxico del
herbicida comercial en comparación con el glifosato solo.
Los resultados anteriormente mencionados coinciden con estudios recientes que han
reportado diferencias en la toxicidad del ingrediente activo y del herbicida comercial. Por
una parte se ha demostrado un incremento en la toxicidad de Roundup en algunas cepas de
Salmonella debido a la acción del surfactante sobre la tensión superficial de la membrana
celular (Williams, 2000). Adicionalmente, un estudio publicado por Peixoto y cols.
(Peixoto, 2005) describió las interacciones del glifosato técnico y el Roundup con la
actividad mitocondrial en hepatocitos de ratón. Los resultados de este estudio permitieron
demostrar que la formulación comercial, y no el ingrediente activo solo, disminuyen la
viabilidad celular mediante la inducción del colapso del potencial eléctrico de la membrana
mitocondrial y del aumento en la permeabilidad de la membrana celular inducidos por el
surfactante. Los hallazgos obtenidos en estos dos estudios permiten sugerir que las
diferencias en la citotoxicidad inducida por el ingrediente activo solo y por el herbicida
comercial en los dos subclones de células CHO radica en la presencia de surfactantes y
coformulantes en el herbicida comercial, que pueden promover la aparición de alteraciones
estructurales y fisiológicas en la membrana celular y /o mitocondrial.
Actualmente los estudios relativos a la genotoxicidad del herbicida Roundup y su
ingrediente activo, el glifosato, han reportado resultados contradictorios. Algunos autores
han demostrado que el glifosato solo es genotóxico in vitro en líneas celulares de roedores
y en linfocitos de origen bovino (Lioi, 2005) sin embargo otros estudios, basados en
ensayos en bacterias y en ratones, han documentado que el glifosato no tiene potencial
mutagénico ni oncogénico (Williams, 2000). Por otra parte, la evaluación de la
genotoxicidad de la formulación comercial ha evidenciado la inducción de un incremento
de intercambio de cromátidas hermanas y la formación de aductos con el ADN in vivo e in
vitro.
En el presente estudio la determinación del potencial genotóxico de la formulación
Roundup en células de roedor mostró un incremento significativo de daño en el ADN a
concentraciones superiores a 0.02mM de ácido de glifosato presente en el herbicida. Este
resultado fue significativo solamente cuando se tuvo en cuenta la morfología del núcleo
como parámetro de evaluación del daño en el ADN.
La evaluación del potencial genotóxico del glifosato solo en otro subclon de las células
CHO reveló la inducción de daño en el ADN al exponer las células a concentraciones
mayores a 6mM de ácido de glifosato (Monroy, 2005). Sin embargo, nuestros resultados
dan evidencia de un mayor potencial genotóxico de la formulación comercial ya que ésta
induce daño en el ADN en este tipo celular en un rango de concentraciones menor (0.02-
0.04mM de ácido del glifosato).
Estudios anteriores han documentado que el herbicida comercial es más tóxico que el
glifosato solo; lo cual puede ser atribuido bien sea a algunos productos presentes en la
formulación comercial (i.e surfactantes o elementos traza) o a un efecto sinérgico del
glifosato con otros productos de la formulación (Bolognesi, 1997. Peluso, 1998).
La inestabilidad de las líneas celulares de roedores y su contribución a la obtención de
resultados erróneos en la evaluación de la genotoxicidad de diversos compuestos ha sido
previamente cuestionada. Algunas características de las células de roedores como su estado
de la proteína p53, la inestabilidad cariotípica y la deficiencia en la reparación del ADN han
sido reconocidas como las posibles causas de la alta tasa de falsos positivos obtenidos con
estas líneas celulares. Teniendo en cuanta lo anterior, recientemente se ha sugerido el uso
de sistemas celulares de origen humano los cuales tienen la forma activa de la proteína p53
y son eficientes en la reparación del ADN (Kirkland, 2007).
Por otra parte, los estudios de determinación del potencial genotóxico de un compuesto in
vitro deben considerar el metabolismo relativo del modelo de laboratorio versus el del
hombre (Thybaud, 2007). En el caso específico de la formulación Roundup, se conoce que
el metabolismo del glifosato da lugar a la formación de metabolitos secundarios (i.e
AMPA) que pueden ser más reactivos con al ADN que el ingrediente activo en su forma
inicial. Las líneas celulares humanas tienen, en su mayoría, un metabolismo de fase I y fase
II definido y ofrecen la mejor opción para limitar la obtención de falsos positivos en los
ensayos de genotoxicidad (Kirkland, 2007). Adicionalmente, los linfocitos humanos
específicamente son el sistema biológico más utilizado para la evaluación del riesgo
genético en una población humana expuesta a diferentes agentes químicos.
Teniendo en cuenta lo anterior, se determinó el potencial genotóxico in vitro de la
formulación Roundup en linfocitos humanos expuestos a diferentes concentraciones de este
herbicida. Los resultados de la evaluación del potencial genotóxico del herbicida en este
tipo celular mostraron la inducción de daño en el ADN después de la exposición in vitro a
concentraciones superiores a 0.005mM de ácido de glifosato presente en la formulación
Roundup; lo cual confirma los resultados obtenidos con las células de roedor. Estos
resultados fueron significativos cuanto se tuvieron en cuenta la morfología del núcleo, la
longitud de la cola y el porcentaje de ADN en la cola como parámetros de evaluación del
daño en el ADN.
Al comparar el potencial genotóxico del herbicida en los dos tipos celulares se observó que
Roundup induce un incremento en el nivel de daño en el ADN a concentraciones más bajas
en los linfocitos humanos en comparación con las células de roedor; lo cual evidencia una
mayor toxicidad del herbicida en las células humanas. Estas diferencias pueden ser
explicadas por la presencia de enzimas de biotransformación las células humanas, y la
ausencia de éstas en las células de roedores, que pueden favorecer la formación de
metabolitos secundarios y así contribuir a un aumento en la toxicidad y a una mayor
sensibilidad al herbicida.
En el caso de los linfocitos humanos, si bien existe un efecto genotóxico del herbicida
Roundup a concentraciones superiores a 0.005mM de ácido de glifosato; este efecto no se
ve reflejado en una disminución en la viabilidad celular, teniendo en cuenta que a estas
concentraciones la viabilidad celular se mantiene cerca del 95%. Estos resultados sugieren
que el herbicida Roundup actúa como un agente genotóxico en este tipo celular in vitro.
El ensayo del cometa es una técnica ampliamente utilizada para la evaluación del daño en
el ADN. En el presente estudio esta metodología reveló los efectos genotóxicos del
herbicida Roundup en las dos líneas celulares estudiadas. Asimismo permitió determinar
que los parámetros de morfología del núcleo y de longitud de la cola del cometa revelan
con una mayor sensibilidad el daño en el ADN inducido por este herbicida, cuando se
compara con los otros parámetros obtenidos a partir del análisis con el software CASP.
Estos resultados concuerdan con reportes anteriores en los que la evaluación de los
diferentes parámetros de daño en el ADN en el ensayo del cometa mostró que la morfología
era el parámetro que permitía una mayor precisión y reproducibilidad (Collins, 1997)
8. CONCLUSIONES
El herbicida comercial Roundup induce una reducción en la viabilidad celular y
daño en el ADN en las células de hámster chino y en los linfocitos humanos.
En el caso específico de las células de roedor, la citotoxicidad y genotoxicidad de la
formulación comercial fue mayor en comparación con el ingrediente activo solo, lo
cual podría sugerir un papel adicional de las sustancias coformulantes en la
toxicidad del herbicida comercial.
Los parámetros de morfología del núcleo de la célula y de longitud de la cola del
cometa mostraron una mayor sensibilidad en evaluación del daño en el ADN en las
células expuestas a Roundup, en comparación con los otros parámetros
Los dos tipos celulares estudiados mostraron diferencias en los efectos causados por
el herbicida comercial. Así, en términos de citotoxicidad, las células de roedor
fueron más sensibles a Roundup en comparación con los linfocitos humanos sin
embargo, éstos fueron más sensibles en términos de genotoxicidad en comparación
con las células de roedor.
En este estudio, el ensayo del cometa permitió revelar los efectos genotóxicos del
herbicida Roundup en linfocitos humanos in vitro lo cual sugiere que esta
metodología puede ser una herramienta útil en la evaluación del potencial
genotóxico de este herbicida en poblaciones expuestas.
9. PERSPECTIVAS
Este estudio permitió evidenciar que Roundup induce daño en el ADN in vitro en dos tipos
celulares sin embargo, es importante tener en cuenta que la extrapolación de los resultados
obtenidos a la población humana no es directa. Con el fin de establecer la relevancia de
estos resultados en la población humana es necesario tener en cuenta una serie de factores
concomitantes propios del individuo (edad, genero, metabolismo, susceptibilidad genética a
factores ambientales), propios del agente (propiedades fisicoquímicas y dosis) y propios del
medio ambiente (temperatura ambiental y presión atmosférica).
Teniendo en cuenta el uso extensivo del herbicida Roundup es importante definir el modo
de acción de los coformulantes presentes en el herbicida Roundup para así determinar la
existencia o no de interacciones de estos agentes con la célula, la inducción de cambios
anatómicos o la iniciación de un proceso carcinogénico para así establecer de una manera
más completa el potencial de la formulación comercial para inducir efectos genotóxicos en
humanos. Asimismo es necesario obtener resultados cuantitativos a partir de ensayos
realizados en modelos animales que sirvan para extrapolar y predecir los niveles tolerables
de exposición en la población humana.
.
10. REFERENCIAS
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