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UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOLOGÍA
Evaluación de un cultivo de fresa (Fragaria x ananassa Duch.) afectado por manchas foliares ocasionadas por
Mycosphaerella fragariae (Tul.) Lindau (anamorfo: Ramularia brunnea Peck.)
CARACAS, VENEZUELA
SEPTIEMBRE 2010
TRABAJO ESPECIAL DE GRADO
Presentado ante la Ilustre Universidad Central de Venezuela, por el Br. Oscar E. Parraga V. Como requisito parcial para optar al título de Licenciado en Biología
Tutora: MsC. Gunta Smits
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DEL EXAME! PÚBLICO Y SOLEM!E DEL TRABAJO ESPECIAL DE GRADO DEL Br. OSCAR PARRAGA
Quienes suscribimos, miembros del jurado evaluador designado por el Consejo de la Escuela de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela para examinar el Trabajo Especial de Grado del Br. Oscar Parraga, C.I: 18042093, titulado “Evaluación de un cultivo de fresa (Fragaria x ananassa Duch.) afectado por manchas foliares ocasionadas por Mycosphaerella fragariae (Tul.) Lindau (anamorfo: Ramularia brunnea Peck.)”, para optar al título de Licenciado en Biología, considerando que dicho trabajo cumple con los requisitos exigidos en los reglamentos respectivos lo consideramos APROBADO.
Para dar fe de ello se levanta la presente acta en Caracas, a los seis (6)
días del mes de septiembre del año 2010, dejando constar que la Prof. Gunta Smits actuó como coordinadora del jurado examinador.
___________________________ ______________________ Prof. Teresa Edith Vargas Prof. Octavio Carballo _______________________
Prof. Gunta Smits (Tutora)
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Dedicado en general a todo
aquel que decide cuidar una
planta y en particular a mi
abuela, María Tereza
Heredia de Viez, quien me
enseñó a mí a quererlas.
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AGRADECIMIE�TOS
A la familia Schmucke Kanzler por permitirme realizar este estudio en su cultivo de
fresas y por toda su buena disposición y amabilidad, y a Grecio González por ponerme en
contacto con ellos.
Al Laboratorio de Fitopatología del Instituto de Biología Experimental de la
Universidad Central de Venezuela y a la Profesora Gunta Smits por aceptarme como
tesista y por apoyarme en este proyecto.
A la profesora María Rodríguez y a los integrantes del Laboratorio de Productos
2aturales de la Escuela de Química, especialmente a Diana, Doris y Peggy; por
recibirme, guiarme y ayudarme con los análisis químicos.
Al profesor Freddy González Mujica del Laboratorio de Bioquímica del Instituto de
Medicina Experimental de la Facultad de Medicina, UCV, por permitirme estandarizar la
técnica de cuantificación de fenoles en su laboratorio y por facilitarme los reactivos para
ello.
A mis jurados: Teresa Edith Vargas, Octavio Carballo, María Rodríguez y Antonietta
Taddei por sus correcciones, críticas y sugerencias.
En general, a todos aquellos que, en mayor o menor medida, me ayudaron en la
concepción, ejecución o evaluación de esta tesis.
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RESUME!
El cultivo de fresa se ha expandido por todo el mundo por su adaptabilidad y escasas
exigencias; sin embargo, es afectado por variadas enfermedades de origen fúngico. La más
frecuente es la mancha foliar común o mancha púrpura causada por Mycosphaerella
fragariae (Ramularia brunnea) que produce manchas redondeadas de color púrpura y
centro necrótico en todos los órganos vegetativos de la planta. El objetivo del presente
estudio fue registrar el avance de la mancha foliar común y la presencia de compuestos
fenólicos en un cultivo de fresa. Para esto se recolectaron muestras de fresa, cultivar
Camino Real, en la Colonia Tovar y se determinó la incidencia y severidad de la mancha
púrpura. Se prepararon cámaras húmedas y se extrajeron los compuestos fenólicos por
medio de un macerado en metanol. Éstos se analizaron por cromatografía en capa fina de
sílica gel y se cuantificaron por el método de Folin-Ciocalteau. Se presentaron los primeros
síntomas en la 5º semana del cultivo alcanzando la máxima incidencia (50-60%) en la 14º
y manteniéndose así hasta el final del estudio. La severidad promedio presentó valores
entre 2,55 y 5,21% lo que clasifica al cultivar como de baja susceptibilidad. Además de R.
brunnea se encontraron otros 9 patógenos foliares, destacándose por su frecuencia
Phyllosticta fragariicola, Alternaria alternata y Colletotrichum spp. La concentración de
fenoles aumentó con la severidad de la enfermedad, siendo significativamente mayor en
hojas con severidades mayores al 5% con respecto a hojas sanas, sin embargo no se
hallaron compuestos nuevos en la cromatografía como respuesta a la infección.
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I!TRODUCCIÓ!
Historia
La fresa (Fragaria spp., Familia Rosaceae) es una hierba perenne de porte macollante
que se ha cultivado por sus pseudofrutos dulces y carnosos durante aproximadamente siete
siglos. Su distribución es cosmopolita, dominando originalmente los climas templados, aun
cuando hoy en día se ha extendido y naturalizado en las zonas tropicales. La primera
especie de este género en ser cultivada fue Fragaria vesca L., la cual era común en los
jardines franceses en el siglo XIV, esta especie está ampliamente distribuida en Europa,
Asia, América y África. En el siglo XVII se introduce en Europa la especie norteamericana
F. virginiana Mill., aunque ninguna de las dos anteriores demostró gran rendimiento
(Bailey, 1917). La nativa europea Fragaria moschata Weston era apreciada por su sabor
almizclado, pero su condición unisexual (desconocida para esta planta hasta el siglo XVIII)
llevó a la eliminación sistemática de las plantas masculinas de los jardines dada su aparente
“infertilidad”, dejando sólo las femeninas, las cuales sin polen disponible tampoco eran
capaces de fructificar (Darrow, 1966).
La introducción de la fresa silvestre de origen chileno, Fragaria chiloensis (L.) Mill., en
Francia, en el siglo XVIII marcó el nacimiento del tipo de fresa más cultivado hoy en día:
Fragaria x ananassa Duch., la cual resultó de la hibridización natural entre F. chiloensis y
F. virginiana, tomando el tamaño grande del fruto de la primera y el sabor y la cualidad
hermafrodita de la segunda. Esta cualidad era de gran importancia ya que la fresa grande
chilena es dioica y sólo llegaron a Europa ejemplares femeninos que difícilmente daban
frutos ya que F. chiloensis no es capaz de hibridizar con F. vesca (Everett, 1982). Fragaria
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x ananassa es conocida como fresón, pine strawberry o frasier-ananas; nombres que se
refieren a la forma, sabor y aroma de los frutos, los cuales asemejan a los de la piña
(Darrow, 1966). Durante el siglo XX la selección artificial llevó a la producción de frutos
cada vez más grandes y firmes, y variedades resistentes a enfermedades (Janick, 2005).
Morfología
La planta es bajo porte, rara vez alcanzando los 20 cm sobre el nivel del suelo, es una
hierba de tallo reducido, hojas pecioladas dispuestas helicoidalmente, compuestas
trifoliadas, aunque también se encuentran simples. El tamaño de la hoja varía con la
especie y el cultivar, teniendo desde menos de 5 hasta 20 cm de longitud desde la base del
pecíolo hasta la punta del folíolo central; al igual que el resto de la planta, las hojas suelen
ser pubescentes, y la densidad de tricomas se puede usar para diferenciar especies y hasta
cultivares entre sí, los bordes de las láminas son dentados o crenados y la forma es
obovada (Darrow, 1966).
La reproducción vegetativa es común, las plantas hijas se forman sobre estolones,
característica aprovechada por los productores de fresa para la obtención de materia prima
para el inicio del cultivo. La inflorescencia es determinada, tipo dicasio o pleocasio. Las
flores son hermafroditas en Fragaria x ananassa, aunque otras especies son dioicas, es
decir, presentan flores sólo masculinas o femeninas en cada individuo. La flor presenta
simetría radial, numerosos sépalos, 5 pétalos blancos y numerosos estambres y carpelos
libres. El fruto es tipo aquenio, aunque el receptáculo floral se desarrolla formando un
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pseudofruto carnoso y comestible, de forma cónica o acorazonada, color rojo y sabor dulce
o ligeramente ácido (Darrow, 1966).
Cultivo
La fresa es uno de los cultivos nativos de
zonas templadas con mayor adaptabilidad
desde el punto de vista agroecológico,
requiriendo terrenos soleados, bien drenados,
y no demasiado secos. Requiere buena
circulación de aire y se desarrolla mejor en
suelos ligeramente ácidos; por su importante
proporción de raíces superficiales sufre de forma muy temprana la pérdida de la humedad
del suelo, pudiendo disminuir la cosecha hasta en un 50% (Everett, 1982). El fotoperiodo
puede afectar la floración y el desarrollo de estolones, siendo esto es cada vez menos
común por la selección del carácter fotoindependiente de F. virginiana en las variedades de
cultivo. La industria está concentrada en los Estados Unidos (particularmente en el estado
de California), España (mayor exportador
de fresas del mundo, destacando la región
de Huelva con el 90% de la producción
española) Turquía e Italia (segundo
exportador de fresas del mundo).
Venezuela ocupa el 29° lugar en
Tabla I. Principales productores de fresas a nivel mundial para 2007. (FAOSTAT,
2010) País Producción (t)
1 Estados Unidos 1.148.530
2 España 263.900
3 Turquía 261.078
4 Méjico 207.485
5 Corea del Sur 203.227
6 Polonia 200.723
7 Egipto 200.254
8 Japón 193.000
9 Italia 155.583
10 Alemania 150.854
29 Venezuela 13.699
Tabla II. Superficie, producción y rendimiento de fresa, según entidad federal para 2007
(MAT, 2009).
Entidad federal
Superficie Cosechada
(ha)
Producción (t)
Rendimiento (kg/ha)
Aragua 204 5.415 26.545
Mérida 18 634 35.200
Miranda 57 285 5.000
Táchira 181 5.924 32.727
Trujillo 111 539 4.856
Vargas 52 903 17.365
Total 623 13.699 21989,26
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producción de fresas según estadísticas de la
Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación (Tabla I)
(Janick, 2005; FAOSTAT, 2010).
La fresa se cultiva en Venezuela en la
región de Los Andes (Estados Táchira,
Mérida y Trujillo) y en la región central de
la Cordillera de la Costa (Aragua, Miranda y
Vargas), siendo los mayores productores los
estados Táchira y Aragua (Tabla II). Las estadísticas obtenidas del Ministerio del Poder
Popular para la Agricultura y Tierras (MAT, 2009) señalan que en los últimos 10 años la
producción de fresas ha ido en aumento (Tabla III).
Enfermedades
Los investigadores Kapytowski y Bojarska (2005) señalan que las mayores
restricciones en la producción de fresa en diversos países se deben a enfermedades
fúngicas, alcanzando entre un 15 y 95% de pérdidas en el rendimiento.
Entre las principales enfermedades fúngicas de esta planta se ubican la mancha foliar
común, causada por Mycosphaerella fragariae, el moho gris en los frutos, causado por
Botrytis cinerea, antracnosis de la raíz, fruto y/o corona por Colletotrichum acutatum,
podredumbre del fruto (Rhizopus stolonifer), quemadura de las hojas causada por
Diplocarpon earlianum (Marssonina fragariae), pudriciones de la raíz y la corona por
Tabla III. Área cosechada, producción y rendimiento del cultivo de fresa en
Venezuela entre 1997 y 2007.
Año Superficie Cosechada
(ha)
Producción (t)
Rendimiento (kg/ha)
1997 446 2.728 6122,90
1998 609 6.028 9898,60
1999 704 7.888 11209,07
2000 610 7.255 11894,96
2001 638 8.612 13503,37
2002 643 9.155 14230,50
2003 1.784 12.212 6846,08
2004 1.834 10.824 5901,85
2005 1.642 12.112 7376,37
2006 1.792 11.993 6692,52
2007 623 13.699 21989,26
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Phytophthora fragariae y Phytophthora cactorum respectivamente, manchas foliares
(Gnomonia comari y Alternaria alternata), entre otras. Entre las enfermedades bacterianas
más importantes, aunque no la única, vale destacar la mancha angular o grasienta causada
por Xanthomonas fragariae.
Mycosphaerella fragariae (Tul.) Lindau (anamorfo: Ramularia brunnea Peck.) es un
ascomiceto que se desarrolla sobre los tallos, hojas (tanto en la lámina, como en el
pecíolo), sépalos y –en casos severos– aquenios de la fresa. Los primeros síntomas son
manchas redondeadas, de color purpúreo, que luego crecen, formándose un área necrótica
en el centro de la lesión. La infección suele comenzar en hojas jóvenes, pudiendo
permanecer latente en las lesiones mientras la hoja envejece. Cuando finalmente esporula,
las ascosporas o conidias son arrastradas por el agua de lluvia o riego a otras hojas donde
germinan, introduciendo el tubo germinativo por los estomas. El hongo requiere de un
período de incubación de unos 15 a 30 días antes de producir síntomas en las hojas
recientemente infectadas. Para el control de ésta y otras enfermedades foliares de fresa la
recomendación es la siembra de cultivares resistentes. (Dale y Fulton, 1957; Paulus, 1990).
El género Colletotrichum incluye, al menos, cuatro especies patogénicas a la planta de
fresa: C. acutatum Simmonds, C. gloeosporioides (Penz.) Penz. y Sacc., C. fragariae
Brooks y C. falcatum Went. Estas especies ocasionan manchas de bordes irregulares,
marrones o negras, en las hojas, pecíolos y estolones (excepto por C. acutatum, el cual es
un patógeno principalmente del fruto y no manifiesta síntomas en las hojas). En los frutos
causan lesiones hundidas, firmes y negras caracterizadas por la formación de masas de
esporas de color rosado o aspecto acuoso. Las esporas pueden ser lavadas hacia la corona o
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el hongo crecer en ese sentido causando su marchitamiento. El interior de la corona suele
adquirir entonces un característico color rojizo. La pudrición de la corona puede venir
acompañada por pudrición de la raíz. La esporulación ocurre entre 15 y 30°C y las conidias
son arrastradas por agua hacia nuevos hospedadores donde germinan a través de la
formación de apresorios (Smith, 1990; Maas, 2004).
Diplocarpon earlianum (Ell. & Ev.) Wolf (Anamorfo: Marssonina fragariae (Sacc.)
Kleb.) es un patógeno foliar (aunque también aparece en pecíolos, pedúnculos florales,
frutales y cálices) comúnmente asociado a M. fragariae. Se presenta como manchas
púrpuras de bordes irregulares, que al crecer se vuelven oscuras en el centro (lo cual las
diferencia de las causadas por Mycosphaerella), y posteriormente se ven rodeadas de
pequeños puntos negros brillantes, causados por los acérvulos del estado asexual del
hongo, al avanzar la infección las manchas coalescen y los bordes de la hojas se curvan
hacia arriba. El teleomorfo (estado sexual) es poco común en cultivos anuales, pero en
perennes se desarrollan las estructuras reproductivas sexuales (apotecios) durante el
invierno (Schubert, 1982).
Botrytis cinerea Pers.:Fr. (Teleomorfo: Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel) es la
principal fuente de pérdidas económicas en este cultivo ya que ataca directamente el fruto.
La infección suele darse durante la floración y el hongo permanece latente hasta la
maduración del fruto. Las lesiones, inicialmente pequeñas, pardas y firmes, se desarrollan
y crecen hasta que puede observarse el micelio y las esporas del hongo en la mayor parte
del fruto, estas son luego dispersadas por aire o agua. Si bien la infección se da en el
campo, las mayores consecuencias se observan en el transporte y almacenaje post-cosecha.
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El ciclo usualmente presenta sólo la fase asexual (Botrytis cinerea) y una forma de
resistencia (esclerocio), pero este último puede germinar formando un apotecio, el cual
representa la forma de reproducción sexual (B. fuckeliana) que libera ascosporas para su
multiplicación (Elad y Williamson, 2007).
Defensas
La relación entre las plantas y sus patógenos es más complicada de lo que aparenta, las
plantas han desarrollado defensas físicas y químicas contra sus agresores, los cuales a su
vez desarrollan mecanismos para evadir dichas defensas. Cuando la defensa de la planta es
efectiva la enfermedad no se desarrolla, esto se denomina una relación incompatible. De lo
contrario, si el patógeno es capaz de infectar la planta, coexistir con ella, y desarrollar la
enfermedad, la relación se denomina compatible (Misaghi, 1982).
Entre las defensas químicas destaca el papel de los compuestos del metabolismo
fenilpropanoide, estos son generados principalmente por la vía del ácido shikímico, de la
cual derivan, entre otros productos, los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y
triptófano) y muchos alcaloides (Marcano y Hasegawa, 2002). Los llamados compuestos
fenólicos, que incluyen fenoles simples, cumarinas, flavonoides, taninos, lignanos y una
gran variedad de estructuras más; participan en procesos fisiológicos como reacciones de
óxido-reducción, lignificación, quelantes, protección contra rayos UV, reguladores de
crecimiento, entre otros. Muchos de ellos exhiben actividad antimicrobiana y fitotóxica y
producen la agregación o inactivación de enzimas, características que los incluyen en el
arsenal de defensas químicas de las plantas. Dada la gran variedad de compuestos fenólicos
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que puede producir una planta y sus múltiples funciones es probable que su efecto
combinado, en vez de la acción de un compuesto específico, sea el responsable de la
inhibición de infecciones fúngicas en plantas resistentes (Misaghi, 1982; Latsague y Lara,
2003; Agrios, 2005; Treutter, 2005).
La presencia de compuestos fenólicos en fresa es bien conocida hoy en día (Määttä-
Riihinen y col., 2004; Seeram y col., 2006; Hernanz y col., 2007; Simirgiotis y col., 2009).
Los fenoles presentes en el fruto han sido intensamente investigados por su capacidad
antioxidante (Terry y col., 2004; Aavy y col. 2005;). Por ejemplo, se conoce que el
extracto metanólico de fresa (Fragaria vesca) y algunos polifenoles del mismo son capaces
de inhibir la enzima hialuronidasa, involucrada en procesos inflamatorios (Araujo y col.,
2002), en un estudio similar se pudo evidenciar que los fenoles de F. vesca poseen
actividad antiviral potenciada por sulfato ferroso (Morales y col., 2002). Por otra parte, el
papel de este tipo de compuestos en defensa es poco conocido, aún menos cuando se trata
de enfermedades de tipo foliar.
A!TECEDE!TES
Braun y Sutton (1988) usaron discos de hojas y estudios de campo para determinar la
prevalencia e infección de Botrytis cinerea en hojas de fresa (Fragaria x ananassa cv.
Redcoat), demostrando no sólo que éstas pueden servir como reservorio para la
enfermedad, sino que además el hongo puede estar en estado de latencia en hojas maduras
hasta que estén senescentes o mueran. Este estado de latencia duró hasta ocho meses en
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algunas plantas. En las hojas jóvenes y viejas si se desarrolló la infección y producción de
conidias, aunque con mayor intensidad en las hojas jóvenes. La microflora superficial de la
hoja resultó el factor determinante en la inhibición del crecimiento en hojas maduras, ya
que al desinfectar las hojas se formaron conidias sin importar la edad foliar.
Wilson y col. (1990) probaron en invernadero la temperatura y tiempo de humedad
necesarios para la infección de Colletotrichum acutatum en frutos maduros y verdes de
fresa cv. Midway. Determinaron que la temperatura óptima se ubicaba entre 25 y 30°C y el
tiempo de humedad óptimo fue de trece horas. La incidencia fue generalmente más alta
para frutos maduros.
Zheng y Sutton (1994), trabajando tanto estudios de campo como en invernadero,
determinaron que Diplocarpon earlianum progresa con mayor intensidad en hojas mayores
de veintiún días en Fragaria x ananassa cv. Kent, y que el período de alta humedad
necesario para estimular la máxima esporulación debía ser mayor de veinte días, siendo la
mínima duración cinco horas, aunque variando con la temperatura y edad foliar. La
temperatura mínima necesaria para la máxima esporulación se ubicó alrededor de los 20°C.
Estudios realizados con hojas cortadas y colocadas en cámaras húmedas llevaron a
Carisse y Peyrachon (1999) a la conclusión de que la temperatura óptima para la
esporulación de Mycosphaerella fragariae es de 20°C, y que a temperaturas menores de
5°C y mayores a 35°C, el hongo deja de esporular. El número de esporas producidas varía
con el cultivar de fresa inoculado. Además, la esporulación no ocurre sin al menos
veinticuatro horas de alta humedad.
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Filippone y col. (1999) aislaron una fitoanticipina (compuesto de defensa constitutivo)
de naturaleza anfipática de hojas de Fragaria x ananassa cv. Chandler, la cual
denominaron fragarina y que poseía fuerte actividad antibacteriana (inhibiendo el
crecimiento de Clavibacter michiganensis, Pseudomonas syringae pv. gladiolii,
Pseudomonas corrugata y Erwinia carotovora) y antifúngica contra especies del género
Colletotrichum (C. fragariae, C. acutatum, C. gloeosporioides). Si bien no especifican su
estructura, revelan que posee un peso molecular de 316 D y que puede encontrarse
asociada a proteínas.
Leandro y col. (2001) describieron el proceso de esporulación de Colletotrichum
acutatum en hojas de fresa (cv. Tristar) que no mostraban síntoma alguno. Las conidias
germinan en las primeras tres horas luego de la inoculación y forman un apresorio en las
seis horas siguientes, sin embargo, la penetración no ocurre sino hasta siete días después.
Las hifas principales colapsan, no sin antes formar conidias secundarias, las cuales, junto
con los apresorios llevan a cabo la mayor parte de la infección.
En los Estados Aragua y Miranda se han hallado Colletotrichum gloeosporioides,
Cercospora sp. y Gnomonia comari como patógenos fúngicos dominantes y Xanthomonas
fragariae, Erwinia y Pseudomonas entre los bacterianos, en cultivos de fresa cultivares
Capitola y Fehr (Guevara y col., 2004).
Terry y col. (2004) hallaron una relación negativa entre la presencia de compuestos con
actividad antifúngica y la etapa del desarrollo del fruto de Fragaria x ananassa cv. Elsanta.
Al extraer los metabolitos secundarios del fruto y la flor en distintas etapas del desarrollo
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descubrieron que el fruto verde, particularmente los aquenios, presentaba compuestos con
alta capacidad de inhibición del crecimiento de Botrytis cinerea y Cladosporium
cladosporioides, pero que al madurar los frutos estos compuestos desaparecían o perdían
actividad. Además, B. cinerea se desarrollaba más rápidamente en frutos maduros que en
verdes. Los compuestos detectados incluían fenoles y terpenoides.
Uselis y col. (2006) reportaron un promedio de incidencia de mancha foliar común
(Mycosphaerella fragariae) de entre 29 y 62% para dieciséis cultivares durante dos años
de estudios en campo, la intensidad de la infección varió entre 14 y 58 %. La incidencia de
ésta y otras enfermedades se relacionaba con el clima, siendo favorecida por la humedad y
bajas temperaturas, así como el florecimiento durante el período húmedo y la fructificación
tardía. No se evidenció relación entre la productividad y la resistencia de los cultivares.
Lanauskas y col. (2006) en un estudio sobre los métodos de fertilización, usando el
cultivar Honeoye, hallaron que la aplicación del fertilizante ecológico (aunque no definen
su composición ni origen) Biokal 01 disminuyó la incidencia de D. earlianum, pero no
tuvo efecto sobre la prevalencia e intensidad de M. fragariae. Sin embargo, deducen que la
diferencia se debe al tiempo de aplicación e infección: el fertilizante fue aplicado en plena
floración, siendo la infección por M. fragariae mucho más temprana. La infección por D.
earlianum suele ser posterior lo que indicaría que el fertilizante permitió la prevención de
la infección, pero sólo fue efectivo para D. earlianum porque ésta aún no había infectado la
planta.
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Hukkanen y col. (2007) hallaron que con la adición de Benzotiadiazol, un análogo
funcional del ácido salicílico, aumentó la acumulación de compuestos fenólicos en hojas y
frutos de Fragaria x ananassa cv. Jonsok y la resistencia a la infección con Sphaerotheca
macularis, un patógeno foliar. La diferencia en la acumulación de fenoles no se mantuvo
en el tiempo en plantas no inoculadas, lo cual indica un posible papel de defensa de estos
compuestos.
OBJETIVOS
Objetivo general:
Registrar la evolución de manchas foliares causadas por Mycosphaerella fragariae y la
presencia de compuestos fenólicos foliares en un cultivo de Fragaria x ananassa cv.
Camino Real.
Objetivos específicos:
Determinar la incidencia y severidad de manchas foliares causadas por Mycosphaerella
fragariae en un cultivo de Fragaria x ananassa cv. Camino Real ubicado en la Colonia
Tovar, Edo. Aragua.
Determinar la variedad de compuestos fenólicos presentes en las hojas de fresa y sus
variaciones ante la presencia del patógeno.
Cuantificar lo fenoles presentes en hojas de fresa a lo largo del cultivo.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo y recolección de muestras
Las plantas de fresa (Fragaria x ananassa cv. Camino Real) fueron cultivadas en la
Colonia Tovar, Municipio Tovar del Estado Aragua, a una altura aproximada de 1800
m.s.n.m. y a temperaturas de entre 17 y 24°C. Fueron regadas dos veces por semana. La
fertilización se llevó a cabo cada 15 días con abono orgánico foliar hasta el desarrollo de
los estolones con unas dos plántulas por estolón. Estas fueron trasplantadas y se cambió el
ferilizante por N:P:K 8:8:7 inicialmente y al alcanzar el tamaño adulto, 20:20:20.
El cultivo se inició las primeras semanas de septiembre de 2009. Luego de
aproximadamente un mes, tiempo en el cual se establecieron las plantas, se colectaron
entre 60 y 120 hojas al azar directamente del cultivo para ser evaluadas en el laboratorio.
En la Tabla IV se especifican los muestreos y las pruebas realizadas a cada lote de
muestras.
Tabla IV. Toma de muestras y análisis realizados a cada lote. Fecha del muestreo
Semana desde el inicio del cultivo
Evaluación realizada
11/Oct/2009 4 Evaluación general del cultivo. Determinación de patógenos.
10/Nov/2009 9 Determinación de patógenos, incidencia y severidad de manchas foliares.
30/Nov/2009 12 Determinación de patógenos, incidencia y severidad de manchas foliares, cuantificación de fenoles.
16/Dic/2009 14 Determinación de patógenos, incidencia y severidad de manchas foliares, cuantificación de fenoles.
23/Ene/2010 19 Determinación de patógenos, incidencia y severidad de manchas foliares, cuantificación de fenoles.
4/Feb/2010 21 Incidencia y severidad de manchas foliares, cuantificación de fenoles.
23/Feb/2010 24 Determinación de patógenos, incidencia y severidad de manchas foliares, cuantificación de fenoles.
13/Mar/2010 26 Incidencia y severidad de manchas foliares, cuantificación de fenoles.
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Cuantificación de incidencia y severidad de manchas foliares causadas por
Mycosphaerella fragariae.
La incidencia de manchas foliares se cuantificó contando el número de hojas colectadas
con dicho síntoma. Se tomaron en cuenta sólo las hojas que presentaban la mancha
característica de infección por M. fragariae: bordes morados y centros necróticos
grisáceos. Las hojas que presentaban síntomas de infección se compararon con las escalas
diagramáticas de Mazaro y col. (2006), para infecciones leves, y Delhomez y col. (1995),
para las infecciones más graves (Figura 1), para determinar la severidad de la enfermedad
en cada folíolo, luego de lo cual se totalizaron y promediaron para obtener la severidad de
Figura 1. Escalas diagramáticas usadas para la determinación de la severidad de la infección por M. fragariae. Der. Escala de Mazaro y col. (2006); Izq. Escala de Delhomez y
col. (1995).
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toda la muestra según la ecuación:
Smuestra= Σ ni×Si
N
Donde Si es cada uno de los niveles de severidad (en porcentaje del área foliar afectada),
ni es el número de folíolos que presentaron la severidad i y N es el número total de folíolos
evaluados.
Identificación de los patógenos usando cámaras húmedas
Para determinar los patógenos de naturaleza fúngica presentes en las muestras se
tomaron entre 3 y 10 folíolos de distintas plantas y se lavaron en una solución acuosa de
cloro al 10%, luego se colocaron en cámaras húmedas (cápsulas de Petri con papel de filtro
humedecido con agua destilada estéril) por al menos una semana. Las muestras fueron
examinadas a diario en el microscopio óptico para observar el crecimiento y esporulación
de los patógenos.
Extracción compuestos fenólicos foliares
El resto de la muestra, una vez evaluada la severidad e incidencia de las manchas
foliares se secó a temperatura ambiente y se clasificó según el área foliar afectada en 5 ó 6
categorías: S0 (hojas sanas); S0,1; S0,5; S2,5; S10 y S20. Luego de esto se pulverizaron las
hojas secas, se pesaron y se maceraron en metanol absoluto durante 48 horas, luego de las
cuales se separó el extracto metanólico y se almacenó. Esta extracción se repitió una vez
más luego de lo cual se descartó el material vegetal y se mezcló el metanol de ambas
extracciones.
20
Cuantificación de compuestos fenólicos presentes en el extracto
La cuantificación de los fenoles totales se realizó usando el reactivo de Folin-
Ciocalteau, modificando la metodología descrita en Gutiérrez y col. (2008): 50 µl de
muestra, 250 µl de reactivo de Folin-Ciocalteau (ácido fosfomolíbdico y fosfotúngstico o
H3PMo12O40 y H3PW12O40) y 450 µl de agua se mezclaron, se dejaron reaccionar durante 5
minutos adicionando luego 250 µl de carbonato de sodio (Na2CO3) 20% p/v. Luego se
incubó la mezcla por 30 minutos a 25°C para permitir el desarrollo del color (el reactivo de
Folin, originalmente amarillo, vira al azul en presencia de compuestos reductores) y se
leyó la absorbancia a 760 nm. El método de Folin-Ciocalteau se basa en la capacidad del
fosfomolibdato y fosfotungstato de reaccionar con los compuestos fenólicos de todo tipo
formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngsticos. La reducción de estos complejos a
pH básico los convierte en óxidos cromógenos azules (Mo8O23 y W8O23) siendo el color
proporcional al número de grupos hidroxilo del compuesto fenólico. Por esta última razón
se usa como patrón el ácido gálico (C6H2(OH)3COOH o ácido 3,4,5-trihidroxibenzoico) ya
que éste presenta tres grupos hidroxilo en el anillo aromático.
El contenido de fenoles totales se calculó usando una curva de calibración de ácido
gálico, por lo cual los resultados se presentan en unidades equivalentes de ácido gálico por
gramo de peso seco foliar. La curva de calibración se elaboró usando una solución patrón
de 50 µg/ml. Ésta se sirvió en alícuotas de 25; 50; 75; 100 y 150 µl generando una curva de
1,25; 2,5; 3,75; 5 y 7,5 µg de ácido gálico en cada cubeta de espectrofotometría. Una vez
ajustada la curva se generó la ecuación correspondiente para el ajuste de las unidades de
absorbancia en equivalentes de ácido gálico.
21
En la Figura 2 se presenta la curva de calibración de ácido gálico con la correspondiente
ecuación. Esta presenta un buen ajuste y fue usada parta la conversión de todos los datos
generados en el análisis de los extractos metanólicos foliares.
Separación cromatográfica de los compuestos presentes en el extracto metanólico
El análisis cualitativo de los compuestos presentes en los extractos foliares se realizó
por medio de una cromatografía en capa fina de sílica gel. Para esto se colocaron 10 gotas
de extracto metanólico a 1,5 cm de la base de la placa de cromatografía de sílica gel G-25
de 20x20 cm usando capilares de vidrio. Se desarrollaron cromatografías en dos sistemas
de solventes: el primero, según la metodología de Terry y col. (2004), conformado por una
mezcla hexano: acetato de etilo: metanol (60:40:1) se dejó correr durante
aproximadamente una hora. Luego de secar, la placa fue analizada en luz visible, UV de
onda larga (365nm) y UV de onda corta (254nm) y posteriormente rociada con ácido
sulfúrico y vainillina y calentada a
110 °C durante 5 a 10 minutos en
una plancha de calentamiento para
producir la aparición de manchas
donde los reactivos encontrasen
compuestos fenólicos o terpenoides.
En el caso de los compuestos
fenólicos la reacción se basa en la
condensación o sustitución del Figura 2. Curva de calibración de ácido gálico
para la determinación de fenoles por el método de Folin-Ciocalteau.
22
grupo aldehído de la vainillina en el anillo aromático dando un producto de condensación
entre rosado y rojo (Salunkhe y col., 1990; Shahidi y Naczk, 2003). Para la segunda
cromatografía se modificó el sistema de la primera para aumentar la polaridad; de acuerdo
a esto se usó una mezcla hexano: acetato de etilo (3:7) y se desarrolló el cromatograma en
una placa de menor tamaño durante media hora para luego rociar con anisaldehído y
calentar durante 5 minutos. Este reactivo, al igual que la vainillina, es un revelador de
amplio espectro ante el cual los compuestos fenólicos aparecen con tonalidades rojizas
hasta anaranjadas (Wagner y Bladt, 2001).
RESULTADOS
El cultivo de fresas en La Colonia Tovar se da en extensiones relativamente pequeñas
de terreno, con una inclinación más o menos pronunciada (por la geografía del sitio) al aire
libre, rara vez en viveros. Estas condiciones, además de una frecuente fertilización y
desmalezamiento son más que adecuadas para este cultivo; sin embargo, durante el período
de establecimiento y desarrollo del mismo, y por lo tanto durante el estudio, se dio una
fuerte sequía en la zona y en todo el país lo que llevó a la utilización de riego artificial
durante el período de estudio y la posibilidad de deficiencias hídricas en las plantas al ser
éste mucho más limitado que las lluvias que se darían normalmente en esa época del año.
A pesar de ello el cultivo de fresas no presentó problemas evidentes en su morfología, ni
síntomas de desecación. Las hojas maduras, completamente expandidas, tenían una
coloración opaca, verde oscura, y un tamaño superior a los 15 cm entre la base del pecíolo
23
y la punta del folíolo central. Si bien la mayoría de las hojas muestreadas fueron
trifoliadas, se observaron algunas tetrafoliadas, sin diferencias obvias en la incidencia y
severidad de manchas foliares entre éstas y las normales. Aquellas hojas que no
presentaron síntomas se clasificaron como S0, es decir, 0% de área foliar afectada por
manchas foliares. El avance de la mancha foliar causada por Mycosphaerella fragariae se
inició con pequeñas manchas púrpuras que en muchos casos no poseían ni siquiera el
característico centro necrótico, en su fase inicial una o dos de estas diminutas lesiones no
cubren ni siquiera el 1% del área foliar (Mazaro y col., 2006), por lo que se clasificaron
como S0,1 aquellos folíolos en la etapa inicial en los que se presentaban una o dos
manchas de menos de un milímetro de diámetro, sin el centro necrótico o con éste apenas
diferenciándose y S0,5 cuando presentaban entre dos y cinco manchas con el centro bien
diferenciado. No se observó una preferencia en la zona del folíolo en que se inició la
aparición de los síntomas, siendo éstos tanto en los bordes, como hacia la base y en ambos
lados, sin embargo, siempre se observaron los primeros síntomas en el haz, aunque en
casos severos se observaron manchas en el envés de la hoja. Posteriormente se observaba
un mayor número de lesiones, muchas veces observándose claramente como éstas crecían
en mayor proporción longitudinalmente a través de las hendiduras ocasionadas por las
nervaduras de las hojas, esto pudo deberse al crecimiento del hongo en el tejido subyacente
o bien a la dispersión de conidios por el agua de riego y el desplazamiento de esta última a
través de las hendiduras de las nervaduras. Con el avance de la infección se observó una
concentración de las lesiones hacia el nervio central y las venas secundarias. Si bien este
fue el patrón más común no se observaba en todas las infecciones siendo también comunes
infecciones localizadas, con un gran número de lesiones un área más o menos restringida
24
del folíolo, por ejemplo en un extremo. En ambos tipos se observaban lesiones
concrescentes en los casos de mayor severidad, es decir 10 y 20% del área foliar afectada.
Según el porcentaje del área foliar cubierta por manchas se definieron, además de las antes
mencionadas, las categorías S2,5; S10 y S20. No se observó una severidad mayor al 20%
en las muestras tomadas (Figura 3).
Patógenos asociados a manchas foliares en fresa
El patógeno más comúnmente hallado en las plantas de fresa examinadas, fue, como era
de esperarse, Ramularia brunnea; sin embargo, se hallaron una serie de hongos
patogénicos y algunos saprófitos oportunistas en, y alrededor de, las lesiones. No pudo
observarse la forma perfecta de R. brunnea: Mycosphaerella fragariae.
Entre los patógenos fúngicos hallados se identificaron, de mayor a menor frecuencia:
Phyllosticta fragariicola Roberge ex Desm., Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissler,
Colletotrichum falcatum Went, C. fragariae Brooks, Fusarium oxysporum f.sp. fragariae
Winks & Williams, Pestalotia sp., Gloeosporium fragariae Arnaud, Rhizopus stolonifer
(Ehrenb.) Lind. y Penicillium sp. Entre los saprófitos se encontraron Cladosporium sp. y
Volutella sp.
El principal patógeno hallado: Ramularia brunnea Peck, se caracterizó por presentar
conidios ubicados en conidióforos, estos últimos escasamente diferenciados del resto del
micelio. Las esporas fueron bicelulares, de forma alargada, siendo varias veces más largas
que anchas, hialinas y septadas, los bordes muy lisos y los extremos ligeramente agudos
25
Fig
ura
3. P
rogr
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e la
man
cha
foli
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Myco
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asta
20%
(la
may
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rid
ad o
bser
vad
a).
26
(Figura 4a). Externamente y con poco aumento sólo podía observarse una masa de micelio
extendido sobre la epidermis, por lo que fue absolutamente necesaria la observación de
todas las muestras bajo el microscopio para determinar la presencia del patógeno. El estado
perfecto de R. brunnea, M. fragariae, pertenece al phylum Ascomycota, orden Dothideales
ya que, entre otras cosas, los lóculos del peritecio carecen de hifas estériles y abren a través
de un poro apical (Agrios, 2005).
En contraste con el anterior, Phyllosticta fragariicola Roberge ex Desm.
(Deuteromycetos) mostraba un claro signo visible en la lupa estereoscópica: pequeños
puntos de color oscuro en los alrededores de manchas o leves necrosis, éstos fueron
formados por los picnidios del hongo, el cual forma estas estructuras especializadas para la
reproducción. Los picnidios son cuerpos esféricos coronados por una pequeña abertura u
ostiolo, éste último permite la liberación de las esporas, las cuales son unicelulares, de un
tamaño extremadamente pequeño, forma esférica y se liberan concatenadas formando un
“cirro”, similar a una nube o humo (Figura 4b). Éste último carácter permitió una clara
identificación del género Phyllosticta.
Alternaria alternata (Fr.:Fr.) Keissler (Deuteromycetes) se caracterizó por sus esporas
pluricelulares, muriformes, concatenadas y pardas. La estructura del conidio es muy
característica: una célula pequeña a manera de pie y entre tres y seis células más grandes
ubicadas unas sobre otras dando una forma ovalada a todo el conjunto, la espora presenta
divisiones tanto longitudinales como transversales (Figura 4c). Las esporas son
comúnmente dispersadas por el aire, así como por agua. Las enfermedades causadas por
Alternaria spp. suelen presentarse como manchas foliares y necrosis aunque también
27
pueden afectar el tallo, fruto, tubérculos y la muerte de plántulas. Sus hospedadores
incluyen papas, cucurbitáceas (pepino, melón, calabacín, etc.), tomates, cebollas entre
muchos otros. Las manchas foliares suelen ser oscurecimientos del tejido, numerosas,
concéntricas y concrescentes. La infección suele iniciar en las hojas inferiores senescentes,
muchas veces causando la marchitez total de la hoja, clorosis y/o su posterior caída.
Además, Alternaria puede causar infecciones post-cosecha de muchos frutos (Agrios,
2005).
La presencia de Colletotrichum falcatum Went se evidenció por la setas oscuras
irrumpiendo del tejido foliar, estas setas, septadas, abundantes en algunos casos, escasas en
otros, son un carácter diagnóstico del género Colletotrichum y se observaron tanto en C.
falcatum como en C. fragariae. Los conidios de esta especie son unicelulares, con un
denso contenido citoplasmático y de forma falcada, es decir curvada y aguda en ambos
extremos (Figura 4d). Colletotrichum fragariae Brooks se caracterizó por presentar las
típicas setas oscuras del género y conidias en forma alargada con uno o ambos extremos
redondeados. Colletotrichum es un género de hongos Deuteromycetos, es decir su
reproducción es asexual y no se ha confirmado un estado sexual (aunque para la especie C.
gloeosporioides, también hallada en fresa, se describe como teleomorfo a Glomerella
cingulata (Stonem.) Spauld. & Schrenk). Entre los síntomas que los caracterizan están la
marchitez de las hojas y posteriormente de toda la corona, así como la característica
pigmentación rojiza de los tejidos.
Fusarium oxysporum f.sp. fragariae Winks & Williams. Como su nombre lo dice, las
especies del género Fusarium (Deuteromycetos) se caracterizan por tener esporas de forma
28
fusiforme o falcada, pero mucho más grandes que la de C. falcatum y además se pueden
observar septos transversales entre las células del conidio (Figura 4e). La reproducción de
esta especie ocurre sólo por medio de estas esporas asexuales, aunque para otras especies
de Fusarium se conocen formas de reproducción sexual. Este hongo es común en el suelo y
suele ser un problema grave para muchos cultivos, para los cuales la formae specialis es
específica. El hongo suele causar la muerte de la planta por marchitez vascular, es decir, el
crecimiento del hongo en el xilema causa la pérdida de la conductividad xilemática y con
ella el marchitamiento (Agrios, 2005).
Pestalotia sp. Este hongo se caracterizó por la forma de las esporas, las cuales estaban
formadas por tres o cuatro células de color oscuro, en los extremos del conidio se pudieron
observar apéndices celulares alargados e incoloros, tres en un extremo y uno en el otro
(Figura 4f).
Los conidios de Gloeosporium fragariae Arnaud eran pequeños, alargados, unicelulares
y hialinos y se ubicaban en un acérvulo (Figura 4g).
El micelio de Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Lind. fue visible a simple vista y fácilmente
reconocible por sus esporas oscuras, éstas, observadas al microscopio eran igualmente
distintivas: unicelulares, oscuras, esféricas y ubicadas en un conidióforo largo, oscuro y
ensanchado en el extremo terminal en el que se insertaban las esporas (Figura 4h). Este
hongo pertenece al orden Mucorales de la clase Zygomycetos, del phylum Zygomycota, lo
que le confiere la característica de reproducirse sexualmente a través de la fusión de
gametos estructuralmente similares formando una zigospora. El hongo causa la pudrición
29
de muchos frutos, incluida la fresa, siendo un problema en el tratamiento post-cosecha de
varios productos vegetales (Agrios, 2005).
Penicillium sp. (Deuteromycetes) se caracterizó por sus esporas concatenadas y su
característica estructura reproductiva con conidióforos alargados, erectos y ramificados,
simétrica o asimétricamente, a aproximadamente un tercio de su extremo y culminados por
una cadena de conidios ovoides, generalmente coloreados, que según Alexopoulos y Mims
(1979) pueden ser azulados, verdosos o amarillos. Este hongo es responsable de buena
parte de las pérdidas post-cosecha de muchos frutos, generando inicialmente lesiones
hundidas decoloradas que posteriormente crecen y se cubren con el micelio blanco del
hongo que al esporular torna al color verde o azul; esta última característica les da el
nombre de pudriciones por mohos azules o verdes a aquellas causadas por Penicillium.
Además de lo anterior este género de hongos es conocido por la producción de una gran
variedad de toxinas (Agrios, 2005).
Incidencia y severidad de manchas foliares
Al inicio del cultivo no pudo observarse síntomas de la presencia de ninguno de los
hongos previamente mencionados. Se evidenciaron las primeras manchas foliares en la
visita de la semana 9 (10/11/09) en la cual se pudo determinar que ya el 25% de las
muestreas presentaban manchas foliares. La incidencia fue aumentando con el avance del
cultivo; sin embargo, rápidamente se estabilizó en un nivel relativamente alto, como se
muestra en la Figura 5. Más de la mitad de la muestra mostró síntomas consistentes con
Mycosphaerella fragariae entre finales de noviembre hasta el final del estudio a mediados
30
Figura 4. Patógenos foliares hallados en F. x ananassa cv. Camino Real. (a) Ramularia brunnea
(500X). (b) Phyllosticta fragariicola (125X). (c) Alternaria alternata (500X). (d) Colletotrichum
falcatum (125X).
cc
aa bb
dd
31
Figura 4 (Continuación). Patógenos foliares hallados en F. x ananassa cv. Camino Real. (e) Fusarium oxysporum (500X). (f) Pestalotia sp. (500X). (g) Gloeosporium fragariae (312,5X). (h)
Rhizopus stolonifer (500X).
ee
hh gg
ff
32
de marzo (semanas 12 a 26 desde el inicio del cultivo), en este período la incidencia se
presentó entre un mínimo de 50% (30/11/09, semana 12) y un máximo de 59% (23/1/10,
semana 19), sin variar más de 6% entre un muestreo y otro.
La severidad promedio se mantuvo en niveles considerablemente bajos (<10%)
presentando un mínimo de 2,55% del área foliar afectada por manchas foliares (23/2/10,
semana 24) y un máximo de 5,21% (23/1/10, semana 19). Si bien se evidenciaron niveles
de severidad de hasta el 20% del área foliar, en términos generales el mayor porcentaje de
los individuos manifestaron una severidad baja (Tabla V, en negritas). En el caso de la
mayoría de las muestras individuales (16/12/09; 4/2/10; 23/2/10 y 13/3/10, semanas 14; 21;
24 y 26 respectivamente), la severidad era menor al 1%, es decir, en cada muestreo la
Figura 5. Incidencia de manchas foliares en el tiempo de cultivo.
33
mitad o más de las hojas tomadas presentaban entre 0,1 y 0,5% del área foliar cubierta por
manchas, siendo las hojas con síntomas más graves la minoría.
Separación de compuestos foliares
En la cromatografía en capa fina del extracto metanólico de hojas de Fragaria x
ananassa se hallaron, al menos, catorce compuestos diferentes separados por el sistema de
solventes hexano: acetato de etilo: metanol (60:40:1). A simple vista y sin necesidad de
revelado alguno pudieron observarse siete compuestos por su característica coloración
(Tabla VI; VIS, Figura 6a). Bajo luz ultravioleta de onda corta (254 nm) se hallaron cinco
compuestos, uno de los cuales, de naturaleza
escasamente polar y que corrió con el frente
del solvente dando un Rf=1, no fue detectable
en el rango visible. En luz ultravioleta de
onda larga (365 nm) se hallaron siete
compuestos, la mayoría de ellos observados
previamente, excepto un compuesto de
naturaleza bastante polar hallado cerca del
Tabla VI. Rfs y Detección de compuestos presentes en el extracto metanólico de F. x
ananassa.
Rf VIS UV254 UV365 Vainillina/H2SO4
1,00 X X
0,96 X X X X
0,93 X X X
0,90 X X X
0,82 X X X
0,72 X
0,65 X X
0,53 X
0,37 X
0,20 X
0,14 X
0,10 X
0,06 X X X X
0,00 X X X
Tabla V. Severidad por la infección con M. fragariae y porcentaje de la muestra que mostraba dicha severidad. En la columna final severidad promedio.
Semana
Porcentaje del área foliar afectada Severidad Promedio
0,1 0,5 2,5 10 20
Porcentaje de la muestra que presentaba dicha severidad
14 33,33 16,67 22,22 27,78 0,00 3,45
19 12,80 24,64 26,54 27,96 8,06 5,21
21 32,50 23,75 16,88 20,63 6,25 3,89
24 39,22 26,47 16,67 15,69 1,96 2,55
26 39,74 15,38 24,36 20,51 0,00 2,78
34
origen (Rf=0,10). Sin embargo fue el reactivo de Vainillina/ácido sulfúrico el que permitió
la observación de la mayor cantidad de compuestos en el extracto con un total de once
compuestos observados, incluyendo varios compuestos de polaridad alta que no habían
podido ser detectados por ningún otro medio (Rf=0,53; 0,37; 0,20; 0,14).
Todos los compuestos antes mencionados fueron encontrados por igual en plantas
enfermas y sanas, generalmente siendo las manchas observadas en plantas sanas más
tenues. Éste fue un posible indicativo de una menor concentración de productos
metabólicos en las hojas de plantas sanas.
La mayoría de los compuestos detectados presentaba una respuesta ante el reactivo de
vainillina más parecida a la de los compuestos terpenoides, es decir, coloraciones moradas,
además de que escasos compuestos presentaban fluorescencia ante la luz UV
(característica común entre compuestos fenólicos); sin embargo, se pudo detectar, cerca del
origen (Rf=0,06), una banda de color rojizo. Es por esto que se desarrolló otra
cromatografía en el sistema de solventes hexano: acetato de etilo (3:7), el cual posee una
mayor polaridad permitiendo un mayor desplazamiento de esta banda y, de ser posible, la
separación de los compuestos presentes en dicha sección. En este análisis se pudieron
observar dos manchas (Rf=0,38 y 0,48) (Figura 6b y c), una de las cuales sólo era
observable bajo luz UV de onda larga (Rf=0,48). La otra reaccionó con anisaldehído,
presentando una coloración naranja, la cual es común para flavonoides y otros compuestos
fenólicos en presencia de este revelador (Wagner y Bladt, 2001). El resto de los
compuestos observados en el cromatograma anterior, se desplazó junto con, o cerca del
35
Figura 6. Cromatografía de los compuestos presentes en el extracto metanólico de hojas de F. x
ananassa. (a) Sistema hexano: acetato de etilo: metanol (60:40:1) revelador: vainillina /H2SO4. (b) Sistema hexano: acetato de etilo (3:7) revelado con anisaldehído. (c) cromatografía vista en (b) bajo luz UV (365 nm)
cc bb
SS00 SS00,,11 SS00,,55 SS22,,55 SS1100
aa
36
frente del solvente (Rf=0,96 y 1), según se pudo observar, ya que con anisaldehído estos
presentaron coloraciones azuladas y moradas.
Cuantificación de compuestos fenólicos por medio del método de Folin-Ciocalteau
La concentración de compuestos fenólicos en las hojas de Fragaria x ananassa Duch.
aumenta con la severidad de la enfermedad (Figura 7), sin embargo la correlación entre
ambos no es demasiado alta. Si bien la tendencia es al ascenso en la concentración de
fenoles foliares, la diferencia entre hojas sanas y enfermas sólo resulta significativa si éstas
últimas presentan más del 2,5% de su área cubierta por manchas patogénicas. Esto se
confirmó por medio de una prueba t de Student la cual sólo arrojó diferencias significativas
para los niveles de severidad 5, 10 y 20%. Vale destacar que las concentraciones de fenoles
foliares, como era de esperarse, variaron mucho a lo largo del cultivo; sin embargo, la
tendencia del aumento en su concentración con respecto a la severidad siempre se
Figura 7. Concentración de fenoles foliares vs. Severidad de manchas foliares en F. x
ananassa.
37
mantuvo, a pesar de
que las magnitudes
en las
concentraciones de
fenoles difirieron
mucho entre un
muestreo y otro.
Al comparar la
concentración de
fenoles entre hojas de plantas sanas y enfermas, fructificadas o no (Figura 8) se pudo
observar que la presencia del fruto en pleno desarrollo no altera la cantidad de compuestos
fenólicos en la hoja ya que no se observaron diferencias entre hojas sanas de plantas con o
sin frutos, de la misma manera las plantas afectadas por manchas foliares tuvieron siempre
la misma concentración de compuestos fenólicos sin diferencia aparente con respecto a la
presencia de frutos en la macolla. Tampoco se hallaron diferencias cualitativas en los
cromatogramas de plantas fructificadas o no, presentando siempre los mismos compuestos
mencionados anteriormente.
DISCUSIÓ!
La dinámica de la aparición de enfermedades, su desarrollo y control son influenciadas
por una gran variedad de factores ambientales, y biológicos tanto del hospedador como del
Figura 8. Contenido de fenoles foliares con respecto a severidad y fructificación. FS: Planta fructificada sana, FE: planta
fructificada enferma.
0
100
200
300
400
500
600
0 0,1 0,51 2,5 10 F S F E
S e ve ridad
Co
nte
nid
o d
e f
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ole
s (
Eq
uiv
ale
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s d
e
ác
. G
áli
co
/g p
es
o s
ec
o)
38
parásito. El caso de los patógenos foliares es particularmente especial ya que la hoja es
posiblemente el órgano metabólicamente más activo, lo cual implica una serie de factores
bióticos a tomar en consideración. Sin embargo el estudio de la patología de semillas,
frutos y flores suele tomar prevalencia ya que, en la mayoría de los casos, estos órganos
son el producto de interés y la fuente de ingreso que se lleva directamente al mercado.
Los estudios de patógenos en fresa (Fragaria spp.) son múltiples y muy variados y el
hecho de que una de las enfermedades más comunes, la mancha foliar ocasionada por
Mycosphaerella fragariae, sea de naturaleza foliar lo hace un caso de interés para estudiar
la influencia de estos patógenos en el desempeño y productividad final, así como en
aspectos metabólicos de una planta de ciclo corto y bastante adaptable a condiciones
meteorológicas y edáficas variadas.
En el trabajo de Delhomez y col. (2005) se separaron 23 genotipos –17 cultivares y 6
selecciones– de fresa en base a su susceptibilidad a Mycosphaerella fragariae, medida de
acuerdo a la progresión de la enfermedad y a la máxima severidad observada. De acuerdo a
estos parámetros, el cultivar Camino Real, usado en este estudio, puede caracterizarse
como de susceptibilidad baja, ya que su máxima severidad se mantuvo por debajo de 30%
del área foliar afectada (el máximo observado fue de 20%) y el tiempo necesario para
alcanzar dicha severidad superó, por mucho, los 30 días (sólo se observaron hojas con 20%
de severidad después de 19 semanas o 173 días). De los 23 genotipos analizados por
Delhomez y col. sólo 5 pertenecían a esta categoría, lo que describe la dominancia de este
patógeno en el cultivo de fresa; aunque hay que destacar que las variedades generalmente
recomendadas para Quebec, en donde se realizó dicho estudio, no contemplaban la
39
resistencia a enfermedades. En el trabajo recomiendan retomar la selección de cultivares
resistentes para evitar la propagación de M. fragariae.
A pesar de caracterizarse como un cultivar de baja susceptibilidad, Camino Real
mantiene una incidencia de más del 50% de manchas foliares a lo largo de su cultivo (a
pesar de presentar mantenimiento y nutrición constantes) esta aparente incongruencia
podría explicarse por el mantenimiento de este cultivo en el mismo sitio a lo largo de
varios años. En el estudio de Lugauskas y col. (2003) determinaron que las plantas de fresa
(Fragaria magna Thuill, en su caso) cultivadas siempre en el mismo sitio se mostraron
cada vez más susceptibles a enfermedades y menos productivas, tanto en número de
plántulas por estolón, número de inflorescencias por planta como en peso del fruto. En los
sitios donde se cultivaron las fresas continuamente (como en La Colonia Tovar, donde la
rotación de cultivos es poco frecuente) se halló una acumulación de patógenos en el suelo,
y de toxinas producidas por hongos de los géneros Penicillium y Fusarium (ambos
hallados en este estudio). La rotación del cultivo con gramíneas presentó una leve mejoría
en el estudio citado.
Otro aspecto a tomar en consideración es la baja precipitación observada durante el
período de estudio. En los seis meses en que se realizaron los muestreos no hubo
precipitaciones, esto tal vez no permitió al patógeno desarrollarse por falta de una mayor
humedad ambiental. Hay que recordar el estudio de Carisse y Peyrachon (1999) –ya citado
entre los antecedentes– en el que concluyen que se requieren al menos 48 horas de
humedad relativa alta para la esporulación de M. fragariae, al menos en cámaras húmedas.
En otro trabajo Carisse y col. (2000) demostraron que en hojas no desprendidas se requirió
40
al menos doce horas de humedad alta para la aparición de síntomas. En ambos estudios se
promedia la temperatura óptima para la infección alrededor de los 25°C y se considera nula
a los 35°C. En el presente estudio no sólo se observó una baja precipitación, sino que los
cielos despejados y la cercanía al suelo pudieron producir un aumento en la temperatura
alrededor de las hojas lo cual podría explicar la baja severidad observada. Por esto se
recomienda continuar el estudio con una comparación de los resultados en época de
lluvias, determinando así la respuesta del hongo ante una humedad atmosférica mayor y,
de haberlas, las diferencias en incidencia y severidad.
La remoción de las hojas enfermas, así como las muertas al inicio de la primavera
produjo un reducción significativa (de hasta el 90%) de los daños por M. fragariae en un
estudio realizado por Schmid y col. (2005) en Suiza. Lo que realza la importancia de los
métodos culturales simples y económicos en el control de este tipo de enfermedades.
Algunos de los géneros de hongos mencionados en este estudio como patógenos foliares
han sido identificados como patógenos del fruto de esta y otras plantas. Colletotrichum,
Penicillium y Rhizopus stolonifer fueron identificados por Fraire y col. (2003) como
patógenos post-cosecha de fresa, mientras que Alternaria, Cladosporium y Fusarium
fueron identificados como saprofíticos por medio de inoculaciones en material sano y
observación de síntomas. En el mismo estudio indican que, si bien Botrytis suele ser el
principal problema post-cosecha en el manejo de fresa, la ausencia de refrigeración puede
permitir el desarrollo de los hongos antes mencionados y otros de menor importancia, y
que en temperatura ambiente la pudrición por R. stolonifer es la más frecuente. El género
Pestalotia también está reportado como patógeno del fruto de fresa, particularmente P.
41
longisetula Guba, el cual es frecuente en Egipto. Este hongo causa lesiones en el fruto,
pérdida de sólidos solubles y es capaz de infectar otros frutales importantes como guayaba
(Psidium guajava L., Myrtaceae), duraznos (Prunus persica (L.) Batsch y P. armeniaca L.,
Rosaceae) y tomate (Lycopersicon esculentum Mill., Solanaceae), lo que lo convierte en un
posible problema de amplio rango (Embaby, 2007). En cuanto al género Phyllosticta, P.
ampelicida infecta hojas de vid, siendo un problema importante, ya que éstas manchas
preceden la infección del fruto causando la llamada pudrición negra de la uva. En las
lesiones foliares causadas por este hongo se pueden observar los pequeños picnidios
oscuros, típicos de Phyllosticta y también observados en este estudio (Agrios, 2005).
De la enfermedades estrictamente vegetativas, las antracnosis causadas por
Colletotrichum spp. son un problema creciente en el manejo de la fresa ya que la
aplicación de fungicidas no siempre es adecuada y los cultivares resistentes son escasos. Si
bien existe una búsqueda activa y constante de cultivares resistentes ésta es difícil por los
múltiples patógenos causantes de esta enfermedad y su propia variabilidad inter e
intraespecífica (Lewers y col., 2007).
Por su parte, Alternaria alternata es conocida por la producción de toxinas, muchas de
ellas específicas y otras de espectro mucho más amplio. La Tentoxina, que causa clorosis
en muchas especies y posterior muerte en plantas con más de un tercio del área foliar
afectada, interviene con el metabolismo primario inhibiendo la fosforilación oxidativa y
con el secundario inhibiendo las polifenol oxidasas (esto aumenta su virulencia), además
del desarrollo de los cloroplastos (Agrios, 2005). Entre las toxinas específicas de A.
alternata se encuentra la Toxina AF, la cual es específica para fresa (Fragaria grandiflora
42
Ehrh.) causando necrosis y fuga de electrolitos en el tejido foliar, posiblemente a través de
permeabilización de la membrana plasmática. Esta toxina está relacionada con las etapas
tempranas de la infección y de la invasión de las hifas del hongo (Maekawa y col., 1984;
Yamamoto y col., 1984).
La infección con Fusarium oxysporum f. sp. fragariae es el principal problema de este
cultivo en Japón, donde no existen cultivares resistentes ni fungicidas eficaces para el
control de Fusarium. Sin embargo, la infección, que causa muerte de toda la planta por
marchitamiento vascular, es atenuada por la colonización de la raíz por micorrizas
arbusculares, lo cual plantea una posibilidad de control biológico (Matsubara y col., 2004).
Dado que algunos de estos patógenos pueden afectar el fruto o pasar a ser graves
problemas como infecciones sistémicas, su presencia lleva a considerar un cuidadoso
estudio y seguimiento en nuestro país, ya que el avance de las infecciones y la selección de
cepas resistentes a fungicidas pueden aumentar su virulencia.
Respecto al aumento de compuestos fenólicos, éste se ha relacionado previamente con
etapas tempranas de infecciones por hongos foliares, así como con la susceptibilidad del
hospedador. Un caso bien estudiado es del durazno (Prunus persica (L.) Batsch) afectado
por cenicilla (Sphaeroteca pannosa (Wallr.) Lev. var. persicae Wor.), para el cual se ha
comprobado la acumulación de fenoles, así como el aumento en la actividad de enzimas
relacionadas a su síntesis y transformación (Fenilalanina amonio-liasa y polifenoloxidasa)
en las primeras veinticuatro horas de infección, correlacionadas además con la resistencia
de los cultivares estudiados (Hernández y col., 2002).
43
Entre los mecanismos de defensa desarrollados ante la invasión de patógenos en los
tejidos está presente la producción de especies reactivas de oxígeno –comúnmente
conocidas como ROS por el inglés: Reactive Oxygen Species–, las cuales resultan un arma
de doble filo al causar daños en las membranas tanto de los patógenos como del
hospedador. Cualquiera que sea su papel, el equilibrio de estas formas de oxígeno en los
tejidos suele ser un punto clave en los procesos de patogenicidad y resistencia. Al respecto,
el estudio de Ehsani-Moghaddam y col. (2006) demuestra un aumento en la actividad
superóxido dismutasa en plántulas de fresa dos días después de la inoculación con
Mycosphaerella fragariae. Se utilizaron para este ensayo tres cultivares: “Joliette”
(resistente), “Honeoye” (parcialmente resistente) y “Kent” (susceptible), de los cuales los
dos primeros presentaron niveles de actividad enzimática significativamente mayores que
los del cultivar susceptible así como síntesis de nuevas formas de superóxido dismutasas
como respuesta a la infección. El estudio demuestra la importancia de los procesos
oxidativos en la patogenia de M. fragariae en fresa, la cual adosada a la comprobada
actividad antioxidante de los compuestos fenólicos, podría explicar los aumentos en la
concentración de fenoles observados en el presente trabajo, los cuales fueron
significativamente mayores para plantas con infecciones severas (S≥5% de área foliar) en
las cuales la respuesta dada por superóxido dismutasas podría resultar insuficiente.
El aumento en la presión de oxígeno es otro factor capaz de ocasionar cambios en la
concentración de fenoles en fresa durante el almacenamiento post-cosecha de frutos de F. x
ananassa cv. Allstar (Zheng y col., 2007). Si bien en el estudio citado no se observaron
diferencias significativas en el contenido de fenoles totales, pudo observarse aumentos en
44
ciertos fenoles como el ácido elágico y aumentos y disminuciones en las distintas
antocianinas presentes.
La ausencia de compuestos nuevos en la cromatografía en capa fina tampoco es una
sorpresa. Según la revisión de Grayer y Kokubun (2001) no suelen observarse fitoalexinas
(compuestos sintetizados de novo como respuesta al ataque de un patógeno) en toda la
subfamilia Rosoideae, a la cual pertenece la fresa, aunque las contadas excepciones
reportadas incluyen dos compuestos escasamente caracterizados en raíces de fresa
(cultivares Surecrop y Stelemaster), los cuales están relacionados con la resistencia a
Phytophthora fragariae (Mussel y Staples, 1971). Por esto se puede decir que ningún
compuestos foliar puede usarse como marcador de la infección en esta planta, sin embargo
la cuantificación de fenoles permite distinguir plantas severemente afectadas y podría
fungir como indicador de susceptibilidad entre los cultivares así como la enzima
superóxido dismutasa citada previamente. Ya que se halló que estos compuestos están
relacionados directa o indirectamente a la respuesta de la planta ante este patógeno, se
sugiere comparar el contenido de fenoles, en términos de concentración en plantas sanas y
enfermas, de haber correlación entre el contenido de fenoles y la susceptibilidad podría
usarse esta característica para clasificar cultivares incluso sin necesidad de infección.
Además se sugiere el estudio a fondo de los compuestos, así como su identificación usando
técnicas como Resonancia Magnética Nuclear o Espectroscopía de Masas para así poder
identificar los compuestos mayoritarios y poder medir sus cambios individuales, pudiendo
así detectar un marcador bioquímico único par el proceso patológico.
45
CO!CLUSIO!ES
• La mancha foliar causada por Mycosphaerella fragariae sobre fresa, cultivar Camino
Real, alcanzó una incidencia máxima de casi 60% durante el período de estudio.
• La severidad promedio mantuvo niveles de entre 2,55 y 5,21% y la máxima fue de 20%
del área foliar afectada. Por esto puede caracterizarse al cultivar Camino Real como de
“susceptibilidad baja”.
• Se encontraron 10 hongos patogénicos en el tejido foliar, siendo los más frecuentes
Ramularia brunnea, Phyllosticta fragariicola y Alternaria alternata. Además se
hallaron Colletotrichum falcatum, C. fragariae, Fusarium oxysporum f.sp. fragariae,
Pestalotia sp., Gloeosporium fragariae, Rhizopus stolonifer y Penicillium sp.
• Entre los hongos saprófitos se encontraron Cladosporium sp. y Volutella sp.
• Entre los hongos encontrados se hallaron patógenos del fruto como Rhizopus stolonifer
y Pestalotia sp.
• La concentración de compuestos fenólicos foliares aumentó con la severidad de los
síntomas, aunque la diferencia sólo fue significativa en caso de que la infección
presentara una severidad igual o superior al 5% del área foliar afectada.
• Se hallaron hasta catorce compuestos en el extracto metanólico de hojas de fresa, cuya
presencia no se vio afectada por la infección, esto concuerda con la bibliografía previa
que reporta sólo un caso de fitoalexinas en fresa, siendo éste en tejido radical.
46
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