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PATHOGENESE VON KRANIOSYNOSTOSEN

PATHOGENESIS OF CRANIOSYNOSTOSES

Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Graduate School of Life Sciences,

Julius-Maximilians-Universität Würzburg,

Klasse Biomedizin

Vorgelegt von

EVA-MARIA KÖNIG

geboren in Erlenbach am Main

Würzburg, 2018

I

Eingereicht am:

MITGLIEDER DES PROMOTIONSKOMITEES:

Vorsitzender: Prof. Dr. Thomas Dandekar

1. Betreuer: Prof. Dr. Eva Klopocki

2. Betreuer: Prof. Dr. Franz Jakob

3. Betreuer: Prof. Dr. Christian Stigloher

Tag des Promotionskolloquiums:

Doktorurkunde ausgehändigt am:

II

AFFIDAVIT

I hereby confirm that my thesis entitled “PATHOGENESIS OF CRANIOSYNOSTOSES” is the result of my

own work. I did not receive any help or support from commercial consultants. All sources

and/or materials applied are listed and specified in the thesis.

Furthermore, I confirm that this thesis has not yet been submitted as part of another

examination process neither in identical nor in similar form.

PLACE, DATE SIGNATURE

EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich an Eides statt, die Dissertation „PATHOGENESE VON KRANIOSYNOSTOSEN“

eigenständig, d.h. insbesondere selbstständig und ohne Hilfe eines kommerziellen

Promotionsberaters angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und

Hilfsmittel verwendet zu haben.

Ich erkläre außerdem, dass die Dissertation weder in gleicher noch in ähnlicher Form bereits in

einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.

ORT, DATUM UNTERSCHRIFT

III

» And above all, watch with glittering eyes the whole world around you

because the greatest secrets are always hidden in the most unlikely places. Those who don’t believe in magic will never find it. «

-ROALD DAHL-

IV

INHALTSVERZEICHNIS

ABBILDUNGSVERZEICHNIS -------------------------------------------------------------- VII

TABELLENVERZEICHNIS ---------------------------------------------------------------- VIII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS --------------------------------------------------------------- IX

ZUSAMMENFASSUNG ----------------------------------------------------------------------- 1

SUMMARY ----------------------------------------------------------------------------------- 3

1. EINLEITUNG ------------------------------------------------------------------------------ 5

1.1 Embryonale Kopfentwicklung ------------------------------------------------------------------- 5

1.2 Schädelanatomie ------------------------------------------------------------------------------------ 6

1.3 Ossifikation (Knochenbildung) ------------------------------------------------------------------ 7

1.4 Osteoblasten Differenzierung ------------------------------------------------------------------ 10

1.4.1 Transkriptionsfaktoren ---------------------------------------------------------------------- 11

1.4.2 Regulatorische Signalwege ------------------------------------------------------------------ 13

1.5 Suturen – Anatomie, Funktion und Wachstumsregulation ---------------------------- 18

1.6 Kraniosynostose ----------------------------------------------------------------------------------- 20

1.7 Zielsetzung ------------------------------------------------------------------------------------------ 23

2. MATERIAL & METHODEN ------------------------------------------------------------- 25

2.1 Material ---------------------------------------------------------------------------------------------- 25

2.1.1 Patienten ---------------------------------------------------------------------------------------- 25

2.1.2 Danio rerio Haltung --------------------------------------------------------------------------- 29

2.1.3 Bakterienstamm ------------------------------------------------------------------------------- 30

2.1.3 Primer ------------------------------------------------------------------------------------------- 30

2.1.4 Chemikalien und Reagenzien --------------------------------------------------------------- 30

2.1.5 Enzyme, Plasmide und Kits ------------------------------------------------------------------ 30

2.1.6 Programme und Datenbanken -------------------------------------------------------------- 31

2.2 Allgemeine Methoden ---------------------------------------------------------------------------- 32

2.2.1 Polymerase-Kettenreaktion ----------------------------------------------------------------- 32

2.2.2 Sanger Sequenzierung ------------------------------------------------------------------------ 33

2.3 Spezielle Methoden ------------------------------------------------------------------------------- 35

2.3.1 In vitro Spleißanalyse durch Minigen-Konstrukte -------------------------------------- 35

2.3.2 RNA Isolation aus Blutproben -------------------------------------------------------------- 37

2.3.3 Mikroarray basierte vergleichende Genomhybridisierung (Array-CGH) ----------- 38

2.3.4 Quantitative Echtzeit-PCR ------------------------------------------------------------------- 41

2.3.5 Next Generation Sequencing ----------------------------------------------------------------- 42

V

2.3.6 in-situ Hybridisierung ------------------------------------------------------------------------ 46

2.3.7 Mikroinjektion von mRNA in Danio rerio Embryonen --------------------------------- 49

3. ERGEBNISSE---------------------------------------------------------------------------- 51

3.1 Array-CGH Analysen ------------------------------------------------------------------------------ 51

3.1.1 Verlust 15q21.3-------------------------------------------------------------------------------- 51

3.1.2 Zugewinn 5p15.1-p12 ------------------------------------------------------------------------ 54

3.1.3 Verlust 2q37.3-qter und Zugewinn 5q35.2-qter ---------------------------------------- 56

3.1.4 Zugewinn 2q34-qter und Verlust 17q25.3 ----------------------------------------------- 57

3.1.5 Zugewinn 5q34-qter und Verlust 8p23.3-pter ------------------------------------------- 59

3.1.6 Verlust 7q21.13-q21.3 ----------------------------------------------------------------------- 61

3.2 Kraniosynostose NGS Genpanel --------------------------------------------------------------- 64

3.2.1 Homozygote Missense-Variante in POR - c.902G>A ------------------------------------- 67

3.2.2 Hemizygote Missense-Variante in HUWE1 – c.329G>A --------------------------------- 69

3.2.3 Homozygote Spleißvariante in MEGF8 – c.828G>A ------------------------------------- 70

3.2.4 Heterozygote Missense-Variante in FGFR2 – c.1150G>A ------------------------------- 73

3.2.5 Heterozygote Frameshift-Variante in ERF – c.151delG --------------------------------- 75

3.2.6 Heterozygote Missense-Variante in PTCH1 – c.3436G>A ------------------------------- 76

3.2.7 Heterozygote Missense-Variante in MSX2 – c.442C>G ---------------------------------- 77

3.2.8 Heterozygote Missense-Variante in MEGF8 – c.5210C>G ------------------------------ 79

3.2.9 Heterozygote Nonsense-Variante in TCF12 – c.1885C>T ------------------------------- 82

3.2.10 Heterozygote Frameshift-Variante in TCF12 – c.825delG ------------------------------ 83

3.2.11 Heterozygote Spleißvariante in TCF12 – c.1036-1G>C --------------------------------- 85

3.3 Sequenzierung des SMAD6 Gens und des BMP2 Risikoallels -------------------------- 86

3.4 Funktionelle Analysen --------------------------------------------------------------------------- 88

3.4.1 Analyse von Spleißsequenzvarianten durch ein in vitro Minigensystem ----------- 88

3.4.2 Expressionsmuster und Überexpression von fgf10a in Danio rerio ----------------- 94

3.4.3 Expressionsmuster von huwe1 in Danio rerio ------------------------------------------- 97

4. DISKUSSION ---------------------------------------------------------------------------- 99

4.1 Varianten im Kontext der Osteoblasten Differenzierung ---------------------------- 100

4.1.1 FGF Signalweg ------------------------------------------------------------------------------- 100

4.1.2 BMP Signalweg ------------------------------------------------------------------------------ 103

4.1.3 WNT Signalweg ------------------------------------------------------------------------------ 105

4.1.4 IHH Signalweg ------------------------------------------------------------------------------- 106

4.1.5 Transkriptionsfaktoren -------------------------------------------------------------------- 109

4.1.6 weitere Faktoren ---------------------------------------------------------------------------- 120

VI

4.2 Fazit & Ausblick ---------------------------------------------------------------------------------- 125

5. LITERATURVERZEICHNIS ------------------------------------------------------------ 128

DANKSAGUNG -----------------------------------------------------------------------------XII

CURRICULUM VITAE -------------------------------------------------------------------- XIII

PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE-------------------------------------------- XIV

ANHANG --------------------------------------------------------------------------------- XVI

A) Primersequenzen ---------------------------------------------------------------------------------- XVI

B) Ethikvotum ---------------------------------------------------------------------------------------- XVIII

C) Genliste Kraniosynostose Panel ------------------------------------------------------------------ XX

D) Auflistung Bereiche mit lückenhafter Abdeckung ------------------------------------------ XXII

E) DECIPHER Patienten mit überlappenden Aberrationen ----------------------------------- XXV

F) Auswertung SMAD6 Sequenzierungsprojekt ---------------------------------------------- XXVIII

G) Vektorkarten -------------------------------------------------------------------------------------- XXIX

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

VII

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 1.1: Embryonale Entwicklung des Gesichts 6

Abbildung 1.2: Schematische Darstellung des Schädeldachs eines Neugeborenen und eines

Erwachsenen 7

Abbildung 1.3: Intramembranöse Ossifikation 8

Abbildung 1.4: Endochondrale Ossifikation 10

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der wichtigsten Transkriptionsfaktoren und Signalwege der

Osteoblasten Differenzierung 13

Abbildung 1.6: Schematische Darstellung einer kranialen Sutur 18

Abbildung 1.7: Schädelform nach Fusion einzelner Schädelnähte 21

Abbildung 2.1: Neurocranium von Danio rerio 29

Abbildung 2.2: Schematischer Ablauf einer Array-CGH 39

Abbildung 2.3: Übersicht über die Anreicherungsschritte des Nextera Rapid Capture Kits (Illumina) 44

Abbildung 2.4: Prinzip der Cluster Generierung 45

Abbildung 3.1: Stammbaum und Segregationsanalyse der Familie CRA_1/_2 52

Abbildung 3.2: Array-CGH Profil und qPCR Ergebnis der Patienten CRA_1 und CRA_2 53

Abbildung 3.3: Stammbaum der Familie von Patient CRA_10 (II-2) 54

Abbildung 3.4: Array-CGH Profil von Chromosom 5 des Patienten CRA_10 55

Abbildung 3.5: Stammbaum der Familie von Patientin CRA_32 (II-1) 56

Abbildung 3.6: Array-CGH Profil der Chromosomen 2 und 5 der Patientin CRA_32 57

Abbildung 3.7: Stammbaum und Ergebnisse von Patientin CRA_35 59

Abbildung 3.8: Stammbaum, Array-CGH Analyse und FISH von Patientin CRA_58 60

Abbildung 3.9: Stammbaum der Familie von Patient CRA_59 (II-1) 61

Abbildung 3.10: Array-CGH Profil und qPCR Ergebnis von Patient CRA_59 und Eltern 63

Abbildung 3.11: Ergebnis des CNV Tools von GensearchNGS für Exon 6 von TCF12 66

Abbildung 3.12: Stammbaum und NGS Ergebnis des Patienten CRA_6 68

Abbildung 3.13: NGS Ergebnis des Patienten CRA_14 und Sanger Sequenzierung 70

Abbildung 3.14: NGS Ergebnis der Patienten CRA_18 und CRA_19, Spleißvorhersage und

Segregationsanalyse 72

Abbildung 3.15: NGS Ergebnis des Patienten CRA_29 und Segregationsanalyse 74

Abbildung 3.16: NGS Ergebnis der Patientin CRA_34 (II-1) und Segregationsanalyse 76

Abbildung 3.17: NGS Ergebnis und Stammbaum des Patienten CRA_43 77

Abbildung 3.18: NGS Ergebnis des Patienten CRA_48 (II-3) und Segregationsanalyse 79

Abbildung 3.19: NGS Ergebnis von Patient CRA_49, Segregationsanalyse und MEGF8

Expressionsanalyse 81

Abbildung 3.20: NGS Ergebnis des Patienten CRA_56 und Segregationsanalyse 82

Abbildung 3.21: NGS Ergebnis von Patientin CRA_64, Spleißvorhersage und


Abbildung 3.22: NGS Ergebnis von Patientin CRA_80, Spleißvorhersage und


Abbildung 3.23: In vitro Spleißanalyse der Variante MEGF8 c.828G>A 90

Abbildung 3.24: In vitro Analyse der potentiellen Spleißvariante TCF12 c.825delG 91

Abbildung 3.25: In vitro Spleißanalyse der Variante TCF12 c.1036-1G>C 93

Abbildung 3.26: Fgf10a und fgfr2 Expressionsanalyse in verschiedenen Entwicklungsstadien und

Geweben des Zebrafischs 94

Abbildung 3.27: Expressionsmuster von fgf10a und fgfr2 in Danio rerio Embryonen 95

Abbildung 3.28: Fgf10a RNA Injektion in Zebrafisch Embryonen 96

Abbildung 3.29: Huwe1 Expressionsanalyse in verschiedenen Entwicklungsstadien und Geweben

von Danio rerio 97

Abbildung 3.30 Expressionsanalyse von huwe1 in Danio rerio Embryonen 98

TABELLENVERZEICHNIS

VIII

Abbildung 4.1: Schematische Darstellung der Signalwege der Osteoblasten Differenzierung 100

Abbildung 4.2: Lokalisation der detektieren SMAD6 Varianten 104

Abbildung 4.3: Aminosäure Alignment der MSX2 Homöodomäne verschiedener Spezies 111

Abbildung 4.4: Vergleich partieller 5q Trisomien von Kraniosynostose Patienten 112

Abbildung 4.5: Lokalisation der detektieren TCF12 Varianten 116

Abbildung 4.6: Positionsvergleich von TCF12 Deletionen und Duplikationen assoziiert mit

Kraniosynostose 117

Abbildung 4.7: Lokalisation der MEGF8 Varianten auf Genom- und Protein Ebene 121

TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 1.1. Klassische Kraniosynostose Gene und ihre assoziierten Syndrome 22

Tabelle 2.1: Kraniosynostose-Kohorte 25

Tabelle 2.2: SMAD6-Kohorte 28

Tabelle 2.3: Verwendete Programme und Datenbanken 31

Tabelle 3.1: Übersicht der Patienten mit (potentiell) pathogenen chromosomalen Veränderungen 51

Tabelle 3.2: Verwendete NGS Kontrollproben 64

Tabelle 3.3: Ergebnis der CNV Analyse für TCF12 mit GensearchNGS 65

Tabelle 3.4: Patienten mit bekannten Kraniosynostose Mutationen 66

Tabelle 3.5: Patienten mit potentiell pathogenen Varianten 67

Tabelle 3.6: SMAD6 Varianten der SMAD6-Kohorte 86

Tabelle 4.1: Phänotypischer Vergleich von Kraniosynostose Patienten mit MSX2 p.P148 Substitution 109

Tabelle 4.2: Klinische Auffälligkeiten von Patienten mit partieller 5q Trisomie 113

Tabelle 4.3: Phänotypischer Vergleich von Patienten mit MEGF8 Varianten 120 Tabelle 4.4: Phänotypischer Vergleich von Patienten mit HUWE1 p.R110Q bzw. p.R110W Mutation 123

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

IX


# * Stopcodon

∅ Durchschnitt

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM mikromolar

µm Mikrometer

∞ unendlich A A Auge

Abb. Abbildung

ACMG American College of Medical Genetics and Genomics

AD Aktivierungsdomäne

Array-CGH Mikroarray basierte CGH

AS Aminosäure B BBDS Bent Bone Dyplasia Syndrom

BCNS Basal Cell Nevus Syndrom

bHLH basic helix-loop-helix

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise C cDNA komplementäre DNA

CGH comparative genomic hybridization

cm Zentimeter

CNV copy number variant

Cy3 Cyanin 3

Cy5 Cyanin 5 D D damaging

ddH2O demineralisiertes Wasser

ddNTP Didesoxynukleosidtriphosphat

Del Deletion

DIG Digoxigenin

DMEM Dulbecco's modified eagle's medium

DNA deoxyribonucleic acid

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

Dup Duplikation E EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

engl. englisch

Exo Exonuklease I F F Flossenansätze

FCS fötales Kälberserum

female weiblichen Kontroll-DNA

FISH Fluoreszenz in-situ Hybridisierung

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

FLU Fluorescein

fs frameshift

fwd forward G G Gehirn

g Gramm

gDNA genomische DNA

GRCh37 Genome Reference Consortium Human Build 37 H h Stunde

H Herz

HEK human embryonic kidney


X

hem. hemizygot

het. heterozygot

hg19 Humane Genomversion 19

hom. homozygot

hpf hours post fertilization

HSF3 Human Splicing Finder I IARC International Agency for Research on Cancer

Ig Immunglobulin

ISH in-situ Hybridisierung K K Kontrolle

kb Kilobasen

Kb Kiemenbögen

Kba Kiemenbögenanlagen

kg Kilogramm

kon Konsensus

lat. lateinisch M M molar

M Marker

MAF minor allel frequency

Mb Megabasen

mg Milligramm

Mh Mittelhirn

min Minute

ml Milliliter

mM millimolar

MNG Mittelhirn-Nachhirn-Grenze

mRNA messenger RNA

MRT Magnetresonanztomographie N N/A not available

NBT/BCIP Nitroblau-Tetrazoliumchlorid/ 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat

ng Nanogramm

NGS next generation sequencing

NLZ Neuralleistenzellen O OP Operation

oV otisches Vesikel P P. Perzentile

PBS phosphate buffered saline

PBST PBS mit Tween 20

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PD possibly damaging

PFA Paraformaldeyd

pM pico molar

pM pikomolar Q qPCR quantitative Echtzeit-PCR R Ref. Referenz

Rep Repressordomäne

rev reverse

RNA ribonucleic acid

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur S S Schwanzknospe

s Sekunde

s.f. steril filtriert

SAP Shrimp Alkaline Phosphatase

Sequ. Sequenz


XI

SNP single nucleotide polymorphism SSC saline sodium citrate

SSCT SSC mit Tween 20

SSW Schwangerschaftswoche T Temp. Temperatur

ter Telomer

TM Transmembran U U units V V Voderhirn

V.a. Verdacht auf

Var Variante W WT Wildtyp Z z.B. zum Beispiel

ZUSAMMENFASSUNG

1

ZUSAMMENFASSUNG

Das humane Schädeldach besteht aus fünf Schädelplatten, die durch intramembranöse

Ossifikation entstehen. Wenn diese in der Embryonalentwicklung aufeinandertreffen, bilden sich

Schädelnähte aus, die eine Fusion der Schädelplatten verhindern und damit ein

Schädelwachstum parallel zu Gehirnentwicklung ermöglichen. Für diesen Prozess ist eine

Balance aus Zellproliferation und Differenzierung nötig, deren Aufrechterhaltung wiederum

durch eine komplexe Regulation von verschiedenen Signalwegen gewährleistet wird. Störungen

in diesem regulatorischen System können zu einer vorzeitigen Fusion der Schädelplatten,

Kraniosynostose genannt, führen. Die Kraniosynostose ist eine der häufigsten kraniofazialen

Fehlbildungen beim Menschen. Durch kompensatorisches Wachstum an den nicht fusionierten

Suturen entstehen charakteristische Schädeldeformationen, die sekundär einen erhöhten

intrakranialen Druck zur Folge haben können. Eine vorzeitige Fusion der Suturen kann sowohl

isoliert als auch syndromal zusammen mit weiteren klinischen Auffälligkeiten vorliegen. Bisher

sind über 150 verschiedene Kraniosynostose Syndrome beschrieben und insgesamt 25-30%

aller Kraniosynostose Patienten sind von einer syndromalen Form betroffen. Da die klinischen

Merkmale der Kraniosynostose Syndrome variabel sind und zum Teil überlappen, ist eine klare

klinische Diagnose häufig erschwert. Sowohl Umwelteinflüsse als auch genetische

Veränderungen können die Ursache für Kraniosynostosen sein. Vor allem bei syndromalen

Kraniosynostosen wurden genetische Veränderungen, wie beispielsweise Mutationen in den

Genen FGFR2, FGFR3, TWIST1 und EFNB1, identifiziert. Darüber hinaus wurden chromosomale

Veränderungen wie partielle Monosomien von 7p, 9p oder 11p sowie partielle Trisomien von

5q, 13q oder 15q mit Kraniosynostose assoziiert. Trotzdem ist in über 50% der Fälle die

genetische Ursache unbekannt und die Pathogenese von Kraniosynostosen noch nicht

vollständig geklärt.

Ziel dieser Arbeit war es neue genetische Ursachen bei Kraniosynostose Patienten zu

identifizieren und so zur Aufklärung der Pathogenese beizutragen. Es wurde die genomische

DNA von 83 Patienten molekulargenetisch durch Mikroarray basierte vergleichende

Genomhybridisierung (Array-CGH) oder durch ein speziell entworfenes Next Generation

Sequencing (NGS) Genpanel untersucht. Bei 30% der Patienten konnte eine potentiell pathogene

Veränderung identifiziert werden. Davon waren 23% chromosomale Aberrationen wie

unbalancierte Translokationen, isolierte interstitielle Verluste und ein Zugewinn an

genomischen Material. Bei zwei Patienten wurden unbalancierte Translokationen mit partieller

5q Trisomie nachgewiesen. Das Gen MSX2 liegt innerhalb des duplizierten Bereichs, sodass

möglicherweise eine MSX2 Überexpression vorliegt. Für ein normales Schädelwachstum ist

jedoch die richtige Menge an MSX2 kritisch. Des Weiteren wurde eine partielle Deletion von

ZUSAMMENFASSUNG

2

TCF12 detektiert, die in einer Haploinsuffizienz von TCF12 resultiert. TCF12 Mutationen sind mit

Koronarnahtsynosten assoziiert. In einem anderen Fall lag das Gen FGF10 innerhalb der

duplizierten 5p15.1-p12 Region. Das Gen kodiert für einen Liganden des FGF Signalwegs und

wurde bisher noch nicht mit Kraniosynostose assoziiert. Aufgrund dessen wurden Analysen im

Tiermodell Danio rerio durchgeführt. Eine simulierte Überexpression durch Injektion der fgf10a

mRNA in das 1-Zell Stadium führte zu schweren Gehirn-, Herz- und Augendefekten.

Mittels NGS wurden 77% der potentiell pathogenen genetischen Veränderungen identifiziert.

Hierfür wurde in dieser Arbeit ein Genpanel erstellt, das 68 Gene umfasst. Es wurden sowohl

bekannte Kraniosynostose- als auch Kandidaten-Gene sowie Gene, die mit der Ossifikation

assoziiert sind, in die Analyse eingeschlossen. Das Genpanel wurde durch die Sequenzierung von

fünf Kontrollproben mit bekannten Mutationen erfolgreich validiert. Anschließend wurde die

genomische DNA von 66 Patienten analysiert. Es konnten 20 (potentiell) pathogene Varianten

identifiziert werden. Neben bereits bekannten Mutationen in den Genen FGFR1, FGFR2, FGFR3

und TWIST1, konnten zusätzlich 8 neue, potentiell pathogene Varianten in den Genen ERF,

MEGF8, MSX2, PTCH1 und TCF12 identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu

bei das Mutationsspektrum dieser Gene zu erweitern. Bei zwei der Varianten handelte es sich

um potentielle Spleißvarianten. Für diese konnte in einem in vitro Spleißsystem gezeigt werden,

dass sie eine Änderung des Spleißmusters bewirken. Der Nachweis von zwei seltenen Varianten

in den Genen FGFR2 und HUWE1 hat außerdem dazu beigetragen die Pathogenität dieser

spezifischen Varianten zu bekräftigen. Eine Variante in POR, die aufgrund bioinformatischer

Analysen als potentiell pathogen bewertet wurde, wurde nach der Segregationsanalyse als

wahrscheinlich benigne eingestuft. Zusammenfassend konnten bei etwa einem Drittel der

Patienten, die mit dem NGS Genpanel analysiert wurden, eine genetische Ursache identifiziert

werden. Dieses Genpanel stellt somit ein effizientes diagnostisches Tool dar, das zukünftig in der

genetischen Routine-Diagnostik von Kraniosynostose-Patienten eingesetzt werden kann. Die

Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl eine Untersuchung auf CNVs als auch auf

Sequenzänderungen bei Kraniosynostose Patienten sinnvoll ist.

SUMMARY

3

SUMMARY

Cranial bones are formed by intramembranous ossification. During development, the cranial

bones are separated by fibrous sutures, which function as bone growth sites and therefore, the

cranial sutures need to remain patent to allow the expansion of the skull during brain

development. Thus, there must be a balance of cell proliferation and differentiation within the

suture. This complex process requires a tight regulation of gene expression and interacting

signal pathways. Imbalances or dysfunction of the involved factors can result in abnormal skull

growth. One of the most common congenital craniofacial disorders by affecting approximately

one in 2500 newborns is craniosynostosis. It is defined as the premature ossification of one or

more calvarial sutures. Compensatory growth of the skull leads to a characteristic dysmorphic

cranial vault and facial asymmetry. Premature ossification of the cranial sutures can occur either

as isolated malformation or as part of a syndrome. Isolated craniosynostoses are more frequent,

nevertheless, 25-30% of all cases are syndromic craniosynostoses with more than 150

syndromes reported. There is a high intra- and interfamilial variability and clinical overlap of the

different syndromes. Environmental influences as well as genetic defects like mutations and

chromosomal aberrations are known to cause craniosynostosis. So far genetic causes have been

identified mainly for syndromic craniosynostoses, i.e. mutations in FGFR2, FGFR3, TWIST1, and

EFNB1. Furthermore, chromosomal rearrangements like i.e. partial monosomy of 7p, 9p, and

11p as well as partial trisomy of 5q, 13q, and 15q, have been reported in 11-15% of the

syndromic craniosynostosis cases. However, in more than 50% of the cases the underlying

genetic cause remains unknown. Furthermore, the pathogenesis of craniosynostoses is still not

fully understood.

In this project 83 craniosynostosis patients were analysed either by microarray-based

comparative genomic hybridisation (array-CGH) or gene panel based next generation

sequencing (NGS) to further investigate the pathogenesis of craniosynostosis. In a total of 30%

of the patients a potential genetic cause was identified. Among those 23% had chromosomal

rearrangements which are likely to cause the observed phenotypes, i.e. unbalanced

translocations affecting several genes as well as interstitial deletions and an isolated duplication

have been detected. Two patients had unbalanced translocations with partial 5q trisomies

encompassing MSX2. MSX2 gene dosage is critical for normal growth of the cranial bone plates as

loss-of-function mutations lead to delayed and incomplete ossification of the parietal bones.

Furthermore, we identified a partial TCF12 deletion which is likely to result in TCF12

haploinsufficiency. TCF12 mutations frequently lead to premature fusion of the coronal sutures,

although its pathogenesis is still not fully understood. In another case isolated duplication of

5p15.1-p12 includes FGF10 which is a known ligand of the FGF signalling pathway. So far, no

SUMMARY

4

association of FGF10 with craniosynostosis has been made. To investigate its potential role

during development and in the pathogenesis of craniosynostosis functional experiments were

performed in Danio rerio, an animal model for craniosynostosis. Simulation of fgf10a

overexpression by injection of fgf10a RNA at 1-cell stage resulted in severe anomalies of the

brain, heart and eyes.

In addition, 77% of the identified genetic causes were detected by NGS. For this study a gene

panel was designed comprising 68 genes of known and candidate craniosynostosis genes as well

as genes associated with bone development. Performance of the NGS gene panel was validated

by sequencing five control patients with known mutations. Subsequently, genomic DNA of 66

patients was analysed by the designed craniosynostosis panel. 20 (potential) pathogenic

variants were detected. Although, in most of the cases hot spot sequencing of one or more

common craniosynostosis genes was performed prior to including the patients in the study, we

determined 9 known mutations in the genes FGFR1, FGFR2, FGFR3, and TWIST1. In addition, 8

novel, potentially disease-causing variants in the genes ERF, MEGF8, MSX2, PTCH1, and TCF12

were identified. This work contributed to extend the mutational spectrum within those genes.

Two of those variants were predicted to affect splice sites. Analysis by an in vitro splice assay

revealed that those variants result in aberrant splicing. Furthermore, the detection of two rare

variants of FGFR2 and HUWE1 adds support to their pathogenicity. An additional variant within

POR had to be classified as likely benign after segregation analysis. Overall, in nearly one third of

the analysed cases an underlying genetic cause could be identified by the designed gene panel.

Thus, the NGS panel presents as an efficient tool for genetic diagnostics of craniosynostoses. The

data of this work clearly show both copy number variant and single nucleotide variant analysis

should be considered in genetic diagnostics of craniosynostosis patients.

1. EINLEITUNG

5

1. EINLEITUNG

» Life’s true face is the skull. « Niko Kazantzakis

1.1 Embryonale Kopfentwicklung

Die Embryonalentwicklung des Kopfes lässt sich in fünf Phasen unterteilen: 1) Bildung von

Neuralleistenzellen (NLZ), 2) Migration der NLZ, 3) Ausbildung der Gesichtswülste, 4) Fusion

der Gesichtswülste und 5) Skelettbildung. Der Kopf entwickelt sich hauptsächlich aus

paraxialem Mesoderm und pluripotenten kranialen NLZ. NLZ sind pluripotente Zellen, die zu

Zellen des peripheren Nervensystems, Melanozyten, Odontoblasten, Chondroblasten,

Osteoblasten und Myofibroblasten differenzieren können (DUPIN AND COELHO-AGUIAR 2013). Der

Gesichtsschädel und ein Großteil des fazialen Bindegewebes entstammen von kranialen NLZ. Die

NLZ entstehen vor und während der Neurulation an der Grenze von Neuralplatte und nicht-

neuralem Ektoderm. Für die Bildung der Zellen spielen unter anderem der Transkriptionsfaktor

SNAIL sowie räumliche Gradienten von BMP und WNT Signalen eine wichtige Rolle (SPERBER et

al. 2010). Die NLZ durchlaufen anschließend eine epithelial-mesenchymale Transition (NODEN

AND TRAINOR 2005). Durch den Verlust von Zell-Zell Kontakten, der Zellpolarität sowie durch

Umorganisation des Zytoskeletts ändert sich ihr epithelialer Phänotyp zu dem einer

Mesenchymzelle. An diesem Prozess sind vor allem Expressionsänderungen von Integrinen,

Cadherinen und β-Catenin beteiligt (DE MELKER et al. 2004; TANEYHILL 2008). Nach der

Transformation wandern die kranialen NLZ auf vorgegebenen Wegen von den Rhombomeren in

den frontonasalen Bereich und in die 1.-4. Kiemenbögen des Embryos ein. Die Migration

erfordert eine komplexe Regulation, die durch Kommunikation mit umliegenden Geweben

erfolgt. An der gerichteten Wanderung der NLZ sind unter anderem Ephrine und Semaphorine

beteiligt (WANG AND ANDERSON 1997; GOLDING et al. 2000). Zusätzlich zeigten in vitro

Migrationsversuche mit murinen NLZ, dass FGF2 und FGF8 einen chemotaktischen Einfluss auf

die Wanderungsaktivität der Zellen haben (KUBOTA AND ITO 2000). Nach Ankunft der kranialen

NLZ im frontonasalen Bereich und im 1. Kiemenbogen beginnen die Zellen zu proliferieren und

differenzieren, wodurch sich in der 4. Entwicklungswoche die Gesichtswülste ausbilden. Der

Kopf entwickelt sich aus fünf um die primäre Mundhöhle gruppierten Gesichtswülste: der

Stirnnasenwulst und den paarigen Unter- und Oberkieferwülsten (Abb. 1.1 A). Durch weitere

Proliferation der Zellen wachsen die Fortsätze medial aufeinander zu. Reguliert wird dieser

Prozess unter anderem von BMP, FGF und SHH Signalen. Im unteren Bereich der

Stirnnasenwulst bilden sich die Riechplakoden aus, die sich später zur Riechgrube und

letztendlich zu Geruchsepithelien entwickeln. An deren Seiten formt mesenchymales Gewebe die

1. EINLEITUNG

6

lateralen und medialen Nasenwülste (Abb. 1.1 B). Durch Fusion der Nasenwülste und

Oberkieferwülste entstehen Wangen, Nase, Philtrum, Oberkiefer und Gaumen. Der Unterkiefer

entsteht durch die Verschmelzung der Unterkieferwülste. Diese fusionieren gleichzeitig lateral

mit den Oberkieferwülsten, wodurch die Mundöffnung verkleinert wird (Abb. 1.1 C) (SPERBER et

al. 2010). Störungen in diesem Fusionsprozess können zu Lippen- und Kieferspalten

unterschiedlichster Art führen. Die Fusion ist in der 10. Entwicklungswoche abgeschlossen. Die

letztendliche Morphologie des Schädels entsteht vor allem durch das Wachstum der Knochen.

Bereits in der 7.-8. Entwicklungswoche bilden sich Ossifikationszentren aus. Die Prozesse der

Knochenbildung werden in den Kapiteln 1.3 und 1.4 ausführlicher erläutert.

Abbildung 1.1: Embryonale Entwicklung des Gesichts. A 4. Entwicklungswoche. Proliferierende NLZ bilden die fünf Gesichtswülste um die primitive Mundhöhle aus. B 5. Entwicklungswoche. Durch mediales Wachstum nähern sich die Gesichtswülste an. In der Stirnnasenwulst entsteht die Riechplakode und die lateralen und medialen Nasenwülste. C 10. Entwicklungswoche. Die Fusion der Geschichtswülste zu Nase, Oberkiefer und Unterkiefer ist abgeschlossen.

1.2 Schädelanatomie

Der menschliche Schädel wird unterteilt in Gesichtsschädel (lat. Viscerocranium) und

Hirnschädel (lat. Neurocranium). Unter Viscerocranium werden die Strukturen des Nasen- und

Kieferskeletts zusammengefasst. Das Neurocranium setzt sich aus der Schädelbasis und dem

Schädeldach zusammen. Das Schädeldach wiederum besteht aus fünf Knochenplatten: dem

paarigen Stirnbein (lat. Os frontale), dem paarigen Scheitelbein (lat. Os parietale) und dem

unpaarigen Hinterhauptsbein (lat. Os occipitale) (Abb. 1.2). Studien mit transgenen Mäusen, die

das NLZ Markergen Wnt1 zusammen mit der β-Galaktosidase R26R exprimieren, zeigten, dass

das paarige Stirnbein sich von NLZ ableitet, die paarigen Scheitelbeine jedoch von paraxialem

Mesoderm. Das Hinterhauptsbein hat sich aus beiden Vorläufern entwickelt (JIANG et al. 2002).

A

Stirnnasenwulst

B C

Oberkiefer-wülste

Unterkiefer-wülste

Auge

4 Wochen 10 Wochen5 Wochen

Nasenwülste

1. EINLEITUNG

7

Abbildung 1.2: Schematische Darstellung des Schädeldachs eines Neugeborenen und eines Erwachsenen. Die Schädelplatten, Schädelnähte und Fontanellen sind gekennzeichnet.

Bereiche, an denen zwei Schädelplatten aufeinandertreffen, werden Schädelnähte (Suturen)

genannt, Stellen, an denen mehrere Platten aufeinandertreffen, hingegen Fontanellen. Es gibt

vier unterschiedliche Suturen: die Frontalnaht (metopisch, lat. Sutura metopica), die Sagittalnaht

(lat. Sutura sagittalis/interparietalis), zwei Koronarnähte (lat. Sutura coronalis) und die

Lambdanaht (lat. Sutura lambdoidea) (Abb. 1.2). Bei einem Neugeborenem sind die

Schädelplatten noch nicht fusioniert, sondern durch mesenchymales Gewebe getrennt (Abb. 1.2

Neugeboren). An diesen Bereichen findet das Schädelwachstum statt. Die Anatomie der Suturen

und die Wachstumsregulation werden in Kapitel 1.5 beschrieben. Die posteriore Fontanelle

schließt sich zwischen dem 2. und 3. Lebensmonat, die anteriore Fontanelle innerhalb des 2.

Lebensjahres. Die Fusion der Frontalnaht ist ebenfalls im 2. Lebensjahr abgeschlossen. Die

anderen Suturen verknöchern hingegen erst zwischen dem 30. und 40. Lebensjahr (Abb. 1.2

Adult) (AVIV et al. 2002). Im Alter von 10 Jahren ist jedoch bereits 95% des neurokranialen und

65% des fazialen Wachstums des Kopfes abgeschlossen (SPERBER et al. 2010).

1.3 Ossifikation (Knochenbildung)

Es gibt zwei Arten der Knochenbildung: intramembranöse und endochondrale Ossifikation. Das

Schädeldach, Teile des Viscerocraniums, wie z.B. Teile des Unterkiefers, und die Schlüsselbeine

entstehen durch intramembranöse Ossifikation (Abb. 1.3). Die Schädelbasis hingegen und das

restliche Skelett werden durch endochondrale Ossifikation gebildet (Abb. 1.4). Der Unterschied

der beiden Osteogenese Arten liegt darin, dass bei der endochondralen Knochenbildung

zunächst ein Knorpelgerüst gebildet wird, das anschließend durch Knochen ersetzt wird (Abb.

1.4). Bei der intramembranösen Ossifikation wird Knochen direkt aus mesenchymalem

Bindegewebe gebildet, weswegen auch häufig die Bezeichnung desmale Ossifikation verwendet

ANTERIORE

FONTANELLE

POSTERIORE

FONTANELLE

Os frontale

Os parietale

Os occipitale

Neugeboren Adult

FRONTALNAHT

KORONARNÄHTE

SAGITTALNAHT

LAMBDANAHT

1. EINLEITUNG

8

wird (Abb. 1.3). Durch diese Ossifikationsart entsteht Knochen, der als platter Knochen (lat. Ossa

planum) bezeichnet wird. Die initialen Schritte zur Ausbildung von Ossifikationszentren sind

jedoch bei beiden Ossifikationsarten gleich. Während der Embryonalentwicklung des

kraniofazialen Skeletts wandern multipotente kraniale NLZ in die Kiemenbögen zu den Stellen

der späteren Knochen (siehe Kapitel 1.1). Diese Zellen besitzen das Potential zu Osteoblasten,

Chondrozyten, Myoblasten und Adipozyten zu differenzieren (DUPIN AND COELHO-AGUIAR 2013).

Die genauen molekularen Vorgänge, die dazu führen, dass diese multipotenten

Mesenchymzellen anschließend aggregieren, sind noch weitestgehend unbekannt. Epitheliale

und mesenchymale Interaktionen spielen bei der Induktion der Kondensation jedoch eine Rolle

(RICE 2008). Des Weiteren ist bekannt, dass sich die Kondensationen durch eine höhere

Zelldichte und die Expression von extrazellulärer Matrix- und Zelloberflächenmolekülen, wie

Tenascin, Syndecane, N-CAM und N-Cadherin, vom umgebenden Bindegewebe unterscheiden.

Kontrolliert wird die Expression unter anderem von TGF-β, Fibronectin, BMP2 und MSX1 (HALL

AND MIYAKE 1995). Mausstudien zeigten, dass eine bestimmte Größe der Kondensation

notwendig ist, damit eine Differenzierung der Zellen stattfindet (RICHMAN AND MITCHELL 1996).

An diesem Punkt beginnen sich die beiden Ossifikationsarten zu unterscheiden.

Abbildung 1.3: Intramembranöse Ossifikation. A Kondensation von mesenchymalen oder Neuralleisten Zellen. B Differenzierung zu Osteoblasten und Osteoid Sekretion. C Mineralisierung von Osteoid und Osteozyten Differenzierung. D Schematischer Aufbau der platten Knochen.

An Stellen der intramembranösen Knochenbildung differenzieren die Vorläuferzellen zu

Osteoblasten (Abb. 1.3 B). Die Osteoblasten Differenzierung und die beteiligten Signalwege

werden ausführlicher in Kapitel 1.4 erläutert. Essentiell für die Differenzierung sind die

Transkriptionsfaktoren RUNX2, Osterix (OSX/SP7) und ATF4 sowie das Signalmolekül β-Catenin

(RUTKOVSKIY et al. 2016). Osteoblasten bilden und sezernieren unmineralisierte Osteoid Matrix

bestehend aus Typ I Kollagen, Bone Sialoprotein (BSP), Osteopontin und Osteocalcin (Abb.

1.3 B). Anschließend kommt es zur Anreicherung von Hydroxylapatit und der Expression von

Alkalischer Phosphatase, wodurch die extrazelluläre Matrix kalzifiziert wird und harte

Knochenmatrix entsteht (RICHTSMEIER AND FLAHERTY 2013). Die Osteoblasten werden nach und

nach in Osteoid bzw. kalzifizierter Knochenmatrix eingeschlossen und ein Teil differenziert über

A B C D

Mesenchymzellen Osteoblasten Osteozyten

Osteoid kalzifizierte Knochenmatrix

Geflechtknochen

Lamellenknochen

1. EINLEITUNG

9

mehrere Zwischenstufen zu Osteozyten (Abb. 1.3 C). Der andere Teil unterläuft Apoptose.

Osteozyten machen 95% der Zellen eines Knochens aus. Die Morphologie der reifen Osteozyten

unterscheidet sich deutlich von den Osteoblasten. Das Volumen des Zellkörpers sowie die

Anzahl der Zellorganellen ist in Osteozyten deutlich reduziert und es werden lange Zellfortsätze

ausgebildet, über die sie miteinander in Verbindung stehen (FRANZ-ODENDAAL et al. 2006). Statt

Osteoblasten-spezifischer Gene erfolgt die Expression von Osteozyten Markern wie

beispielsweise Sclerostin, FGF23, DMP1 und RANKL (BONEWALD 2011). Osteozyten spielen eine

Rolle bei der Mechanosensorik, Regulation der Osteoblasten und Osteoklasten Differenzierung

sowie der Regulation der Phosphat Homöostase (CAPULLI et al. 2014). Die Knochenmatrix bildet

ein zufälliges Netzwerk um die embryonalen Blutgefäße, sodass sich aus den feinen

Knochenbälkchen ungeordneter schwammartiger Geflechtknochen bildet. Die Außenseite der

Geflechtknochen ist umgeben von mesenchymalen Zellen, die differenzieren und das Periost,

bestehend aus einer äußeren Kollagenschicht und einer inneren zellreichen Schicht mit

Osteoblasten, bilden. Letztendlich erfolgt in den ersten Lebensjahren eine Umbildung des

schwammartigen Knochens. Dieser wird an den Rändern durch kompakten Lamellenknochen

ersetzt, sodass die sandwichartige Struktur der platten Knochen entsteht (Abb. 1.3 D). Im

Inneren bleibt der schwammartige Knochen erhalten und das vaskuläre Gewebe wird zu

Knochenmark. Die paarigen Stirnbeinplatten entstehen aus je einem Ossifikationszentrum. Die

Scheitelbeinplatten und das Hinterhauptsbein werden aus je zwei auseinanderliegenden

Zentren gebildet, die im 4. Entwicklungsmonat zu den Schädelplatten verschmelzen (SPERBER et

al. 2010). Anschließend fusionieren die aufeinandertreffenden Schädelplatten nicht, sondern es

erfolgt die Ausbildung von Suturen (siehe Kapitel 1.5).

Im Gegensatz zu den Schädelplatten wird die Schädelbasis durch endochondrale Ossifikation

gebildet. Beispielhaft wird diese an den Röhrenknochen (lat. Ossa longa) des Skeletts erläutert.

Nach der Kondensation der mesenchymalen Zellen (Abb. 1.4 A) erfolgt die Differenzierung zu

Typ II Kollagen sezernierenden Chondroblasten. Eine wichtige Rolle spielt hierbei der

Transkriptionsfaktor SOX9 sowie die Faktoren SOX5 und SOX6. Es folgt die Differenzierung zu

Chondrozyten, die Knorpelmatrix bestehend aus Typ II, IX und XI Kollagen und Proteoglykane

sezernieren und das Knorpelgerüst bilden (Abb. 1.4 B) (GOLDRING et al. 2006). Um die

Knorpelanlage herum bildet sich das Perichondrium, das aus einer Kollagenfaserschicht und

einer zellreichen Schicht besteht. Mesenchymale Zellen differenzieren ringsum zu Osteoblasten,

sodass um das Knorpelgerüst eine Manschette aus Knochen entsteht (Abb. 1.4 D). Hier findet

appositionelles Knochenwachstum statt. In der zentralen Region der Knorpelanlage (Diaphyse)

befinden sich Chondrozyten, die zunächst rasch proliferieren, dann in einen Zellzyklusarrest

übergehen und ihr Zellvolumen vergrößern. Anschließend erfolgt die Differenzierung zu

hypertrophen Chondrozyten (Abb. 1.4 C). Die Expression von Typ X Kollagen und den

Proteinasen MMP9 und 13 bewirkt eine Remodellierung der Knorpelmatrix. Dies ermöglicht das

1. EINLEITUNG

10

Einwandern von Blutgefäßen in die Diaphyse (Abb. 1.4 D). Dadurch gelangen Osteoblasten

Vorläufer in den Knorpel und das primäre Ossifikationszentrum wird gebildet.

Abbildung 1.4: Endochondrale Ossifikation. A Kondensation von multipotenten Mesenchymzellen. B Ausbildung eines Knorpelgerüsts durch Chondrozyten. C Differenzierung von hypertrophen Chondrozyten in der Diaphyse. D Ausbildung einer Knochenmanschette und Einwandern von Blutgefäßen in die Diaphyse. E Differenzierung von Osteoblasten und Ersatz des Knorpels durch Knochen.

Die Differenzierung zu Osteoblasten erfolgt und das Knorpelgerüst wird nach und nach durch

schwammartigen Knochen ersetzt. Die noch knorpeligen Bereiche proximal und distal der

Diaphyse werden Epiphyse genannt (Abb. 1.4 E). Hier wird die Wachstumsfuge ausgebildet, die

das Längenwachstum (interstitielles Wachstum) der Röhrenknochen ermöglicht (BILEZIKIAN et

al. 2002; LONG AND ORNITZ 2013). Die Wachstumsfugen bestehen aus mehreren Zonen mit

Knorpelzellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien. An der Ausbildung und

Aufrechterhaltung der Wachstumsfuge sind viele regulatorischen Signale der FGF-, BMP- und

WNT- Signalwegen beteiligt. Wichtige Regulatoren für die Zonenbildung sind jedoch PTHrP und

IHH (BILEZIKIAN et al. 2002). Da der Fokus dieser Arbeit auf der Entwicklung und dem Wachstum

der Schädelplatten liegt, wird die Regulation des interstitiellen Wachstums der Röhrenknochen

nicht näher erläutert.

1.4 Osteoblasten Differenzierung

Die Differenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen zu Osteoblasten ist sowohl bei der

intramembranösen als auch bei der endochondralen Knochenbildung erforderlich. Die

Vorläuferzellen haben das Potential sich zu Osteoblasten, Chondroblasten, Adipozyten,

Fibroblasten und Myoblasten zu entwickeln. Die Osteoblasten Differenzierung erfolgt über

mehrere Zwischenstufen von Osteo-Chondro-Vorläufern zu Präosteoblasten und schließlich zu

A B C D E

Mesenchymzellen

Knorpel

Chondrozyten

hypertrophe Chondrozyten

OsteoblastenPerichondrium

Knochen

Wachstums-fuge

1. EINLEITUNG

11

Osteoblasten. Ein weites Spektrum an regulatorischen Signalen ist hierfür notwendig, von denen

die meisten an vielen Prozessen der Embryonalentwicklung beteiligt sind (Abb. 1.5). Im

Folgenden werden die wichtigsten Transkriptionsfaktoren und regulatorischen Signalwege für

die Osteoblasten Differenzierung erläutert.

1.4.1 Transkriptionsfaktoren

Für die Osteoblasten Differenzierung sind spezifische Transkriptionsfaktoren notwendig, die zu

unterschiedlichen Zeitpunkten in der Differenzierung exprimiert und durch viele Signale

reguliert werden. Die wichtigsten Transkriptionsfaktoren sind RUNX2, OSX und ATF4. Sie

vermitteln die Expression von Osteoblast-spezifischen Genen wie COL1A1, IBSP, SPP1

(Osteopontin) und BGLAP (Osteocalcin) (Abb. 1.5).

RUNX2

Essentiell für die Osteogenese ist der Transkriptionsfaktor RUNX2, der eine Runt DNA

Bindedomäne besitzt und an das DNA Motiv TGPyGGPyPy bindet. Die Heterodimerbildung mit

dem Koaktivator CBFβ ist in vitro für die DNA Bindung nötig (KOMORI 2006). Des Weiteren zeigte

die verzögerte Ossifikation in Cbfβ-/- Mäusen, dass der Koaktivator auch in vivo für eine normale

Skelettentwicklung wichtig ist (YOSHIDA et al. 2002). RUNX2 Bindungsstellen wurden unter

anderem in den Promotoren der Osteoblasten Markergene COL1A1, IBSP, SPP1 und BGLAP

identifiziert (KOMORI 2005). Der homozygote Knockout von Runx2 in Mäusen hat zur Folge, dass

weder endochondrale noch intramembranöse Ossifikation stattfindet. Es liegt ein reines

Knorpelskelett vor, das auch Defekte in der Chondrozyten Differenzierung aufweist (KOMORI et

al. 1997; OTTO et al. 1997). Bestätigt wurde dies auch in Zellkultur, Runx2 defiziente murine

Zellen aus Calvarien können nicht zu Osteoblasten differenzieren. Allerdings ist eine

Differenzierung zu Adipozyten und Chondrozyten weiterhin möglich (KOBAYASHI et al. 2000).

Diese Studien zeigen, dass RUNX2 eine essentielle Rolle in der frühen Osteoblasten

Differenzierung spielt und die Etablierung des Osteo-Chondro-Vorläufers aus den multipotenten

Mesenchymzellen vermittelt. RUNX2 wird aufgrund dessen auch als Masterregulator der

Osteoblasten Differenzierung bezeichnet. Heterozygote Runx2+/- Mäuse zeigen einen ähnlichen

Phänotyp wie Menschen mit heterozygoten RUNX2 Mutationen: verzögerte Verknöcherung der

calvarialen Suturen und Fontanellen, dentale Anomalien, hypoplastische oder fehlende

Schlüsselbeine und Kleinwuchs (KOMORI et al. 1997; LEE et al. 1997; MUNDLOS et al. 1997; OTTO et

al. 1997). Die Skeletterkrankung wird als Kleidokraniale Dysplasie (OMIM 119600) bezeichnet.

Viele Faktoren nehmen Einfluss auf die Expression, Funktion oder Aktivität von RUNX2, wie

beispielsweise MSX2, DLX5 und STAT1. Einer dieser Faktoren ist auch TWIST1. Twist1+/- Mäuse

zeigen im Schädeldach den gegenteiligen Effekt von Runx2+/- Mäusen, die Schädelplatten

fusionieren (EL GHOUZZI et al. 1997; HOWARD et al. 1997). Eine heterozygote Inaktivierung beider

1. EINLEITUNG

12

Gene führt jedoch zu einer normalen Schädelentwicklung (BIALEK et al. 2004). Dies legt die

Vermutung nahe, dass TWIST1 die Osteoblasten Differenzierung durch RUNX2 inhibiert.

Zellkulturanalysen zeigen, dass TWIST1 direkt mit RUNX2 interagiert und dadurch die

transaktivierende Funktion von RUNX2 inhibiert (BIALEK et al. 2004). Heterozygote Mutationen

von TWIST1 sind im Menschen assoziiert mit dem Saethre-Chotzen Syndrom.

Osterix

RUNX2 dirigiert multipotente Zellen in die Osteoblasten und Chondrozyten Richtung, die

Differenzierung zu Osteoblasten erfolgt jedoch erst zusammen mit dem Transkriptionsfaktor

OSX und dem Signalmolekül β-Catenin. OSX ist ein Zinkfinger Transkriptionsfaktor, der die

Expression von COL1A1, IBSP, SPP1, BGLAP und ALPL (Alkalische Phosphatase) vermittelt (STEIN

et al. 1996). Osx ist in Mäusen essentiell für die Knochenbildung, da Osx defiziente Mäuse nur ein

Knorpelskelett ausbilden. Es konnte keine Expression von Osteoblasten Markern nachgewiesen

werden, wohingegen die Expression von Runx2 normal war. Im Gegensatz dazu findet in Runx2-/-

Mäusen keine Osx Expression statt (NAKASHIMA et al. 2002). Folglich scheint die OSX Aktivität

nach RUNX2 zu erfolgen. Weitere Studien zeigten, dass die OSX Expression durch BMP2

induzierbar und durch p53 und p38 MAPK reprimierbar ist, sowie, dass die OSX Transaktivität

durch NFATC1 verstärkt werden kann (NAKASHIMA et al. 2002; CELIL AND CAMPBELL 2005; KOGA et

al. 2005; WANG et al. 2007b).

ATF4

Zu den Transkriptionsfaktoren mit basischer Leucin-Zipper Domäne zählt ATF4. Dieser

Transkriptionsfaktor ist vor allem für die terminale Osteoblasten Differenzierung wichtig. Atf4

defiziente Mäuse zeigen embryonal eine verzögerte Ossifikation, vor allem in den frontalen und

parietalen Schädelplatten, aber auch in den Schlüsselbeinen und Röhrenknochen. Die Expression

der Osteoblasten Marker Bsp und Osteocalcin ist in diesen Mäusen reduziert, wohingegen Runx2

und Osx normal exprimiert werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die ATF4 Aktivität nach

RUNX2 und OSX erfolgt. Zusätzlich fiel auf, dass in Atf4-/- Mäusen die Col1a1 Expression normal,

die Synthese von Typ I Kollagen jedoch gestört war (YANG et al. 2004). Der zugrundeliegende

Mechanismus ist noch unbekannt. In vitro Experimente zeigten außerdem, dass ATF4 zusammen

mit RUNX2 am Osteocalcin Promoter interagiert und die Aktivität von RUNX2 verdreifacht (XIAO

et al. 2005). Des Weiteren konnte in vitro eine Erhöhung der β-Catenin Menge durch ATF4

festgestellt werden. Hierbei ändert sich jedoch nicht das Level an β-Catenin mRNA, sondern

ATF4 wirkt durch einen unbekannten Mechanismus auf posttranskriptioneller Ebene (YU et al.

2013). Das Signalmolekül β-Catenin spielt ebenfalls eine essentielle Rolle bei der Osteoblasten

Differenzierung (siehe 1.4.2 WNT).

1. EINLEITUNG

13

1.4.2 Regulatorische Signalwege

Vier entwicklungsbiologisch wichtige Signalwege tragen hauptsächlich zur Osteoblasten

Differenzierung bei und nehmen unter anderem Einfluss auf die genannten

Transkriptionsfaktoren (Abb. 1.5). Die Signaltransduktion durch WNT, BMP, FGF, und IHH und

ihre Beteiligung an der Differenzierung von Osteoblasten wird im Folgenden erläutert.

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der wichtigsten Transkriptionsfaktoren und Signalwege der Osteoblasten Differenzierung. Die Osteoblasten Differenzierung ist ein Prozess, der einer komplexen Regulation von vielen grundlegenden Signalwegen unterliegt. Die essentiellen Transkriptionsfaktoren RUNX2, OSX und ATF4 vermitteln die Expression von Osteoblast-spezifischen Genen. Weitere Regulation erfolgt durch die Signalwege: WNT, BMP, FGF und IHH.

WNT

Die WNT Liganden sind sezernierte Glykoproteine, deren Signaltransduktion an vielen

Entwicklungsprozessen beteiligt ist und beispielsweise Einfluss auf die Polarität, Migration,

Proliferation oder Differenzierung einer Zelle haben kann. In Menschen und Mäusen wurden

bisher 19 WNT Gene identifiziert (WANG et al. 2014). Die Signalübertragung durch die WNT

Liganden kann über den kanonischen Signalweg durch das Signalmolekül β-Catenin oder den

nicht-kanonischen Signalweg durch intrazelluläre Kalziumfreisetzung oder planare Zellpolarität

erfolgen (LOGAN AND NUSSE 2004; KOHN AND MOON 2005; JENNY 2010). An der Osteoblasten

Differenzierung ist hauptsächlich der kanonische Weg beteiligt (Abb. 1.5). Die WNT Liganden

interagieren mit einem Rezeptor der Frizzeld (FZD) Familie und den Ko-Rezeptoren LRP5 oder

WNT BMP FGF

Osteoblasten MarkerDegradation

β-Catenin

GSK-3

APC

LEF/TCF

Axi

n

DSH

WNT

LRP5/6 FZD

BMP

RUNX2OSX

β-Catenin

PGSK-3

APC

Axi

n

β-Catenin

P

CKI

CKI

BMPR

SMAD1/5/8SMAD1/5/8

PP

TAK1

MKK

p38 MAPK

β-Catenin

β-Catenin

β-Catenin

β-Catenin

P

SMAD1/5/8

P

SMAD1/5/8

P

SMAD4

SMAD4

FGFRFGF

HS

RAF

MEK1/2

ERK1/2

FRS2α

GRB2

SOS

RAS

PI3K

PDK

AKT

GAB1

PTCH1SMO

ATF4

IHH

IHH

GLI2

GLI2A GLI3R

GLI3

ZY

TO

PL

ASM

AE

XT

RA

ZE

LL

UL

ÄR

EM

AT

RIX

NUKLEUS

1. EINLEITUNG

14

LRP6. Dadurch wird das zytoplasmatische Phosphoprotein Dishevelled (DSH) aktiviert und

vermittelt die Dissoziation eines Proteinkomplexes bestehend aus Axin, APC, CKI und GSK-3

Kinase. Dieser Komplex phosphoryliert β-Catenin, was zu dessen Degradation führt. Durch die

Inaktivierung des Komplexes akkumuliert β-Catenin im Zytoplasma und gelangt letztendlich in

den Nukleus. Dort bildet es einen Komplex mit LEF1 und TCF und vermittelt die Transkription

von Osteoblasten Genen. Der konditionelle Knockout der Ko-Rezeptoren Lrp5/6 im

embryonalen Mesenchym von Mäusen zeigte die Wichtigkeit des kanonischen WNT Signalwegs

für die Osteoblasten Differenzierung und damit für die embryonale Entwicklung des Skeletts. Die

Mäuse bildeten keine Osteoblasten und zeigten Skelettfehlbildungen (JOENG et al. 2011). Die

Inaktivierung von β-Catenin in Vorläuferzellen verhinderte ebenfalls die Differenzierung zu

Osteoblasten und führte dazu, dass die Zellen zu Chondrozyten differenzierten (GUO et al. 2004;

DAY et al. 2005; HILL et al. 2005; HU et al. 2005; RODDA AND MCMAHON 2006). β-Catenin ist somit

schon zu einem frühen Zeitpunkt für die Osteoblasten Differenzierung wichtig und unterdrückt

die Chondrozyten Differenzierung. An der Skelettbildung beteiligte WNT Liganden sind vor

allem WNT3a, WNT5a/b, WNT6 und WNT10a/b (YAMAGUCHI et al. 1999; YANG et al. 2003;

NIEMANN et al. 2004; BENNETT et al. 2005; BENNETT et al. 2007; TAKADA et al. 2007; STEVENS et al.

2010; CAWTHORN et al. 2012). Die Signaltransduktion durch WNT kann durch mehrere

Antagonisten reguliert und inhibiert werden. WIF-1 und sFRPs sind sezernierte Proteine, die

extrazellulär an WNT Liganden binden und somit eine Bindung an den FZD Rezeptor verhindern

(LEYNS et al. 1997; HSIEH et al. 1999). Des Weiteren können die Ko-Rezeptoren durch DKK1

zusammen mit Kremen2 oder durch Sclerostin inaktiviert werden (BAFICO et al. 2001; LIU et al.

2002; MAO et al. 2002; SEMENOV et al. 2005).

BMP

Zu der TGF-β Superfamilie gehören die sezernierten BMP Wachstumsfaktoren. Diese

Signalproteine spielen eine wichtige Rolle in vielen prä- und postnatalen Prozessen wie z.B.

Herzentwicklung, Skelettbildung sowie Organ- und Gewebehomöostase. An der Osteogenese

sind vor allem die Wachstumsfaktoren BMP2, 4, 5, 6, 7 und 9 beteiligt (LUU et al. 2007). Die

Rezeptoren bilden einen heterotetrameren Komplex aus Typ I und II BMPR. Bei den Rezeptoren

handelt es sich um Serin/Threonin Kinasen. Nach der Bindung des BMP Liganden kann die

Signaltransduktion über zwei Wege erfolgen: den SMAD abhängigen Signalweg oder den MAPK

Signalweg (Abb. 1.5). Beide sind an der Osteoblasten Differenzierung beteiligt. Bei der

Signaltransduktion über SMAD werden die regulatorischen SMADs 1, 5 oder 8 durch die

Rezeptoren phosphoryliert und können mit dem Kofaktor SMAD4 einen Komplex bilden. Im

Zellkern vermittelt dieser Komplex zusammen mit weiteren Koaktivatoren die Transkription

von Osteoblasten Genen, unter anderem auch von RUNX2 (LEE et al. 2002; WU et al. 2016).

Außerdem konnte gezeigt werden, dass dieser Komplex auch direkt mit RUNX2 interagieren

1. EINLEITUNG

15

kann und so die Osteoblasten Genexpression beeinflusst (FRANCESCHI AND XIAO 2003). Die

Beteiligung der Signaltransduktion über SMAD1 an der Osteoblasten Differenzierung konnten

Wang et al. in Mäusen durch die Osteoblasten spezifische Inaktivierung von Smad1 nachweisen.

Die Embryonen zeigten eine gestörte Osteoblasten Proliferation und Differenzierung (WANG et

al. 2011).

Nach der Rezeptoraktivierung kann die Signalweiterleitung auch über den SMAD unabhängigen

Weg stattfinden. Hierbei erfolgt die Aktivierung der Kinasen TAK1, MKK, und p38 MAPK, was

wiederum zur Phosphorylierung von RUNX2, OSX und DLX5 führt (ULSAMER et al. 2008; ORTUNO

et al. 2010; GE et al. 2012). Dies steigert deren Transkriptionsaktivität, da die Interaktion mit

Kofaktoren durch die Phosphorylierung erleichtert wird. Lee et al. zeigten außerdem, dass die

Signaltransduktion über MAPK in vitro die RUNX2 und OSX Expression positiv beeinflusst (LEE et

al. 2002).

Am besten untersucht im Zusammenhang mit der Osteoblasten Differenzierung sind die

Liganden BMP2 und BMP7. BMP2 steigert unter anderem die Osteocalcin und OSX Expression

sowie die Alkalische Phosphatase Aktivität (LEE et al. 2003; LUU et al. 2007; WANG et al. 2010).

Für BMP7 konnte die Expressionsinduktion von Osteoblasten Markern wie Alkalische

Phosphatase und die Förderung der Kalzium Mineralisierung nachgewiesen werden (GU et al.

2004; SHEN et al. 2010). Die BMP Signaltransduktion ist außerdem auch an der Proliferation und

Differenzierung der Chondrozyten beteiligt, indem sie Einfluss auf die SOX9 Expression nimmt

(PARK et al. 2005; PAN et al. 2008).

Inhibiert werden kann die BMP Signaltransduktion durch zahlreiche Antagonisten wie z.B.

Noggin, Chordin oder inhibitorische SMADs. Der bekannteste Antagonist ist das extrazelluläre

Protein Noggin. Es bindet BMPs und verhindert so deren Rezeptorbindung. Noggin-/- Mäuse

zeigen schwere Skelettfehlbildungen aufgrund einer gestörten BMP Signaltransduktion (BRUNET

et al. 1998; WIJGERDE et al. 2005). Eine Überexpression von Noggin in vitro verhindert die

Osteoblasten Differenzierung (DEVLIN et al. 2003; WU et al. 2003). Die Expression des BMP

Antagonisten wird nicht nur durch FGF Signaltransduktion oder SOX9 vermittelt, sondern auch

durch BMPs induziert, sodass eine negative Rückkopplung durch den BMP Signalweg entsteht

(GAZZERRO et al. 1998).

FGF

An vielen Entwicklungsprozessen ist auch die Signaltransduktion über die FGF

Wachstumsfaktoren beteiligt. Bei der Skelettentwicklung tragen sie unter anderem zur

Osteoblasten Differenzierung bei. FGFs sind sezernierte Polypeptide, die an Tyrosin Kinase

Rezeptoren (FGFR) binden. 22 FGF Liganden und vier Rezeptoren wurden im Menschen

identifiziert. Die Rezeptoren besitzen drei extrazelluläre Immunglobulin (Ig) ähnliche Domänen.

Durch alternatives Spleißen können Varianten dieser Ig Domänen in FGFR1-4 ausgebildet

1. EINLEITUNG

16

werden, sodass die Isoformen der Rezeptoren unterschiedliche Ligandenaffinitäten aufweisen.

Die Bildung der Isoformen ist hierbei gewebespezifisch, die b-Form liegt in epithelialem und die

c-Form in mesenchymalem Gewebe vor (JOHNSON AND WILLIAMS 1993; ORNITZ et al. 1996).

Zusammen mit einer Heparinsulfat Kette bindet der Ligand an den Rezeptor. Die Rezeptoren mit

Liganden bilden Homodimere aus, wodurch die Autophosphorylierung der zytoplasmatischen

Rezeptorbereiche erfolgt. An die phosphorylierten Stellen können Adaptorproteine wie FRS2α

binden, die weitere Signalmoleküle rekrutieren und letztendlich zur Aktivierung von drei

möglichen Signalwegen führen (Abb. 1.5). Eine Möglichkeit ist die Aktivierung der RAS/MAPK

Kaskade, die beteiligt ist an Zellproliferation und -differenzierung. Hierbei werden die Kinasen

JNK, ERK1/2 und p38 MAPK aktiviert. Des Weiteren kann der PI3/AKT Signalweg durch FGFR

aktiviert werden. Dieser spielt eine Rolle bei der Zellpolarität und -überleben. Eine weitere

Option ist die Signaltransduktion über PLCγ (ESWARAKUMAR et al. 2005). Die FGF

Signaltransduktion wird durch verschiedene Inhibitoren reguliert. So binden beispielsweise

Proteine der SPRY Familie an RAF oder konkurrieren mit GRB2 um die Bindung an FRS2α und

verhindern dadurch die Weiterleitung des Signals (HANAFUSA et al. 2002; TIMSAH et al. 2014). Die

Phosphorylierung der Effektorkinase ERK kann durch SEF verhindert oder durch DUSP6 wieder

aufgehoben werden (CAMPS et al. 2000; TORII et al. 2004; LI et al. 2007).

In den Osteoblasten Vorläuferzellen und in Osteoblasten werden hauptsächlich die Rezeptoren

FGFR1 und FGFR2 exprimiert (DELEZOIDE et al. 1998; OHBAYASHI et al. 2002). FGFR3 hingegen

wird vor allem in proliferierenden Chondrozyten exprimiert (NASKI AND ORNITZ 1998; RICE et al.

2000). Ein wichtiger Ligand während der Osteoblasten Differenzierung ist FGF2. In Zellkultur

konnte gezeigt werden, dass FGF2 die Transkription von Osteocalcin, BMP2 und TWIST1 fördert

(NEWBERRY et al. 1999; RICE et al. 2000; YOON et al. 2014). Des Weiteren reguliert FGF2 die

Funktion von RUNX2, vermutlich über Phosphorylierung durch ERK1 (XIAO et al. 2002; PARK et

al. 2010). Eine reduzierte Osteogenese ist die Folge, wenn die FGF2 Aktivität in

Hühnerembryonen blockiert wird (MOORE et al. 2002). Dahingegen zeigen neugeborene Fgf2-/-

Mäuse keine skelettalen Auffälligkeiten. Adulte Mäuse haben jedoch ein reduziertes

Knochenwachstum und eine geringere Knochendichte (ZHOU et al. 1998; MONTERO et al. 2000).

Neben FGF2 spielt auch FGF18 eine Rolle in der Osteoblasten Differenzierung. Die Expression

des Liganden kann durch β-Catenin und RUNX2 vermittelt werden (REINHOLD AND NASKI 2007).

In vitro wiederum hat FGF18 durch die Effektorkinase ERK einen Einfluss auf die RUNX2

Expression (HAMIDOUCHE et al. 2010). Fgf18 defiziente Mäuse zeigen eine verzögerte Ossifikation

des Skeletts, was zur Annahme führt, dass FGF18 wichtig für die Osteoblasten Differenzierung

ist (LIU et al. 2002; OHBAYASHI et al. 2002).

Mutationen in den Rezeptorengenen FGFR1-3 sind im Menschen mit diversen

Skeletterkrankungen assoziiert, die zum Teil auf die Beteiligung der FGF Signaltransduktion bei

der Osteoblasten Differenzierung zurückzuführen sind. Jacob et al. konnten zeigen, dass FGFR1

1. EINLEITUNG

17

die Differenzierung fördert, jedoch ohne einen Effekt auf RUNX2. Des Weiteren zeigte sich auch,

dass der Einfluss von FGFR1 Zeitpunkt spezifisch ist. Vorläuferzellen werden durch FGFR1 zur

Differenzierung stimuliert, in Osteoblasten hingegen wird eine weitere Differenzierung inhibiert

(JACOB et al. 2006). Sowohl die Präosteoblasten Proliferation als auch die Funktion der

differenzierten Osteoblasten wird durch FGFR2 gefördert (YU et al. 2003). Zudem konnte in

humanen Osteoblasten gezeigt werden, dass aktivierende FGFR2 Mutationen die RUNX2

Expression steigern (TANIMOTO et al. 2004; BARONI et al. 2005). Die verschiedenen Rezeptoren

haben zum einen unterschiedliche Funktionen in der Regulation der Proliferation der

Vorläuferzellen und der Differenzierung zu Osteoblasten und zum anderen kann jeder Rezeptor

unterschiedliche, Zeitpunkt spezifische Effekte haben. Die regulatorischen Mechanismen sind

jedoch noch nicht im Detail bekannt.

IHH

Neben seiner Funktion innerhalb der Wachstumsfuge trägt IHH auch zur Differenzierung von

Osteoblasten bei. Das Signalprotein IHH bindet an den PTCH1 Rezeptor, wodurch die

Inhibierung des Membranproteins SMO aufgehoben wird (Abb. 1.5). Daraufhin vermittelt SMO

im Zytoplasma die Bildung der Aktivatorversion von GLI2 (GLI2A) und hemmt die Bildung von

inhibitorischem GLI3R. Durch die Aktivierung und Derepression der Zinkfinger

Transkriptionsfaktoren erfolgt die Transkriptionsregulation verschiedener Gene. IHH wird

hauptsächlich in prähyperthrophen und frühen hypertrophen Chondrozyten exprimiert und

wirkt auf die Osteoblasten Vorläufer im Perichondrium des Knorpelgerüsts (BITGOOD AND

MCMAHON 1995). Dadurch spielt der IHH Signalweg vor allem bei der Osteoblasten

Differenzierung in der endochondralen Ossifikation eine Rolle. Ihh defiziente Mäuse sind

minderwüchsig und zeigen eine verzögerte und gestörte Ossifikation des axialen Skeletts. Das

endochondrale Skelett dieser Mäuse weist keine reifen Osteoblasten auf (ST-JACQUES et al. 1999).

Es zeigte sich, dass die Osteoblasten Vorläufer dieser Mäuse kein Runx2 bilden (RAZZAQUE et al.

2005). Eine erzwungene Runx2 Expression führte jedoch zu keiner Aufhebung des Phänotyps,

sodass IHH die Osteoblasten Differenzierung vermutlich noch über einen weiteren Effektor

vermittelt (TU et al. 2012). IHH hat jedoch auch Einfluss auf die Differenzierung von

Osteoblasten während der intramembranösen Osteogenese. Ihh-/- Mäuse zeigen breitere Suturen

und ein verzögertes Wachstum der Schädelplatten im Vergleich zu Wildtyp Mäusen (ST-JACQUES

et al. 1999; TU et al. 2012). Es zeigte sich, dass Ihh auch an den Fronten der Schädelplatten

exprimiert wird (JACOB et al. 2007). Klopocki et al. identifizierten Duplikationen am IHH Lokus

bei Patienten mit vorzeitiger Fusion der Schädelplatten und Syndaktylie (KLOPOCKI et al. 2011).

Eine gesteigerte Ihh Expression durch Verdopplung von Enhancerregionen führt auch in Mäusen

zur Fusion der Schädelplatten (WILL et al. 2017). Dies zeigt, dass IHH auch bei der

intramembranösen Ossifikation zur Regulation der Osteoblasten Proliferation und

1. EINLEITUNG

18

Differenzierung beiträgt. In vitro wurden im Zusammenhang mit der Osteoblasten

Differenzierung auch die Interaktion von IHH mit dem BMP und WNT Signalweg nachgewiesen

(DAY AND YANG 2008; LENTON et al. 2011).

1.5 Suturen – Anatomie, Funktion und Wachstumsregulation

Von den intramembranösen Ossifikationszentren aus wachsen die Schädeldachknochen apikal

aufeinander zu. Treffen zwei Schädelplatten während der pränatalen Entwicklung aufeinander,

so werden Suturen gebildet, die eine Fusion der Schädelknochen verhindern. Die beiden Platten

bleiben durch faseriges Bindegewebe getrennt. Eine Sutur ist ein Komplex aus den

Wachstumsfronten der aufeinandertreffenden Schädelknochen, dem dazwischen liegenden

zellreichen Bindegewebe, der darunterliegenden Dura mater sowie dem darüberliegenden

Pericranium (Abb. 1.6). Hierbei überlappen die Schädelplatten Os frontale und Os parietale an

den Koronarnähten sowie Os parietale und Os occipitale an der Lambdanaht. An der Frontal- und

Sagittalnaht hingegen treffen die Platten stumpf aufeinander (COHEN 1993). Die wichtigste

Funktion der Suturen ist, dass sie Wachstumsstellen darstellen. An den Wachstumsfronten kann

neuer Knochen gebildet werden, sodass parallel zur Gehirnentwicklung das Schädeldach

vergrößert werden kann. Des Weiteren sind die faserigen Verbindungen zwischen den

Schädelplatten ein Vorteil bei der Geburt. Sie ermöglichen eine minimale Verformung des

Schädels und erleichtern somit den Durchgang durch den Geburtskanal. Zusätzlich können

Suturen vor allem im Kindesalter ein gewisses Maß an mechanischen Stress absorbieren (RICE

2008).

Abbildung 1.6: Schematische Darstellung einer kranialen Sutur. Die beiden Schädelplatten sind durch mesenchymales Bindegewebe getrennt. In der Suturenmitte findet die Proliferation der Vorläuferzellen statt. Im Bereich der Wachstumsfront differenzieren die Zellen zu Osteoblasten und es wird neue Knochenmatrix gebildet. Begrenzt wird der suturale Komplex oben vom Pericranium und unten von der Dura mater.

Um einen vorzeitigen Verschluss der Schädelnähte zu verhindern und gleichzeitig ein

gleichmäßiges Knochenwachstum sicherzustellen, ist eine komplexe Regulation durch die an der

Osteoblasten Differenzierung beteiligten Signalwege und ihre Antagonisten notwendig (Kapitel

Wachstums-front

MesenchymzelleOsteoblast Osteoid

Schädelplatte

Dura mater

Pericraniummesenchymales

Bindegewebe

1. EINLEITUNG

19

1.4). Expressionsgradienten der Signalmoleküle und Rezeptoren sind erforderlich, um eine

Differenzierung der proliferierenden Vorläuferzellen im Bindegewebe zu inhibieren und an den

Wachstumsfronten zu induzieren. Die Signale gehen hierbei von allen Komponenten des

suturalen Komplexes aus. So zeigten Transplantationsexperimente an Ratten, dass die

Dura mater pränatal bei der Bildung der Suturen keine Rolle spielt, jedoch postnatal Einfluss auf

die Fusion oder die Durchgängigkeit der Suturen hat (OPPERMAN et al. 1993; LEVINE et al. 1998).

Außerdem gibt es regionale Signalunterschiede in der Dura mater, sodass in Ratten die

interfrontale Schädelnaht teilweise fusioniert, die restlichen Schädelnähte jedoch offen bleiben

(LEVINE et al. 1998). Die genauen Mechanismen und Interaktionen der beteiligten Signalwege an

der suturalen Wachstumsregulation sind teilweise noch immer unklar. Viele Studien wurden im

Zusammenhang mit dem FGF Signalweg durchgeführt. In vivo führt eine gesteigerte FGF

Signaltransduktion zur vorzeitigen Fusion der Schädelplatten (CARLTON et al. 1998; ZHOU et al.

2000; CHEN et al. 2003; ESWARAKUMAR et al. 2004). Mit Ausnahme der Liganden FGF3, 4, 5, 6 und

8 werden alle FGF Liganden im suturalen Komplex exprimiert (ISEKI et al. 1999; HAJIHOSSEINI AND

HEATH 2002). Besonders stark exprimiert, vor allem im mesenchymalen Bindegewebe und der

Dura mater, sind die Signalmoleküle FGF2 und FGF9 (KIM et al. 1998; RICE et al. 2000; WARREN et

al. 2003). Die Expression der Rezeptoren erfolgt in definierten Zonen innerhalb der Suturen. In

den differenzierten Osteoblasten an der Wachstumsfront wird FGFR1 und in den angrenzenden

proliferierenden Präosteoblasten FGFR2 exprimiert. Das Expressionsmuster von FGFR3 deckt

sich mit dem von FGFR2, allerdings wird FGFR3 deutlich schwächer exprimiert (ISEKI et al. 1997;

ISEKI et al. 1999; JOHNSON et al. 2000; YOSHIDA et al. 2005). Iseki et al. konnten zeigen, dass eine

geringe FGF Signaltransduktion über FGFR2 assoziiert ist mit der Proliferation der

Vorläuferzellen und im Gegensatz dazu verstärkte FGF Signale zur FGFR1 Expression und

Osteoblasten Differenzierung führen (ISEKI et al. 1999; YU et al. 2003). Der FGF Signalweg trägt

somit dazu bei, dass die Schädelplatten wachsen, allerdings nicht vorzeitig fusionieren. Auf die

FGFR2 Expression und somit auch auf die Aufrechterhaltung der Suturen hat unter anderem

TWIST1 Einfluss. Hierbei ist der Effekt auf die FGFR2 Expression abhängig davon mit welchem

Partner TWIST1 ein Dimer bildet. TWIST1 kann mit sogenannten E Proteinen Heterodimere

ausbilden und dadurch die Transkription anderer Gene vermitteln. Homodimere (T/T) fördern

und Heterodimere (T/E) inhibieren die FGFR2 Expression (CONNERNEY et al. 2006). Welches

Dimer gebildet wird ist wiederum abhängig von der Expression der Id Proteine. Id Proteine

verhindern die T/E Bildung durch Bindung der E Proteine (MASSARI AND MURRE 2000). Im

suturalen Komplex werden Id Proteine in Zellen nahe der Wachstumsfront exprimiert, sodass in

diesem Bereich T/T überwiegt und in den undifferenzierten Mesenchymzellen der Suturenmitte

T/E vorliegt. TWIST1 trägt somit zur Bildung der Grenze von starker und geringer FGF

Signalgebung bei. Auch hier gibt es Interaktionen mit anderen Signalwegen, so kann die Id

Expression durch den BMP Signalweg induziert werden (CONNERNEY et al. 2006; CONNERNEY et al.

1. EINLEITUNG

20

2008). Neben den in Kapitel 1.4 genannten Signalwegen spielen bei der Wachstumsregulation

der Schädelplatten noch weitere Faktoren wie MSX2, FOXC1, Eph/Ephrine und TGF-β eine Rolle

(RICE 2008). Über die grundlegenden Signale, die die Expression der Faktoren der

unterschiedlichen Signalwege vermitteln, ist noch wenig bekannt. Mechanische Kräfte scheinen

allerdings daran beteiligt zu sein. Das wachsende Gehirn erzeugt Druck und Spannung auf die

Suturen. Mechanischer Stress kann über die extrazelluläre Matrix eine Verformung des

Zytoskeletts bewirken und dadurch Änderungen in der zellulären Signalgebung vermitteln (MAO

AND NAH 2004; TEMIYASATHIT AND JACOBS 2010). Case et al. konnten in vitro zeigen, dass β-Catenin

in Präosteoblasten akkumuliert, wenn diese mechanischem Stress ausgesetzt werden (CASE et al.

2008). Es sind jedoch noch weitere Studien nötig, um die genauen Zusammenhänge der

Wachstumsregulation des Schädels zu identifizieren.

1.6 Kraniosynostose

Wenn die Balance zwischen Proliferation und Differenzierung in den Suturen durch

Fehlregulation der unter Kapitel 1.4 und 1.5 beschriebenen Signalwege gestört wird, kann es zu

einer fehlerhaften Ossifikation des Schädels kommen. Dazu zählt unter anderem die vorzeitige

Fusion einer oder mehrerer Suturen. Dies wird als Kraniosynostose bezeichnet. Kraniosynostose

ist eine der häufigsten angeborenen kraniofazialen Fehlbildungen mit einer Inzidenz von

1:2100-2500 (LAJEUNIE et al. 1995; BOULET et al. 2008; JOHNSON AND WILKIE 2011). Dabei kann die

vorzeitige Fusion isoliert oder zusammen mit weiteren klinischen Auffälligkeiten als Teil eines

Syndroms vorliegen. Ca. 70% der Fälle haben isolierte Kraniosynostose (WILKIE et al. 2017).

Allerdings sind über 150 Syndrome bekannt, bei denen Kraniosynostose Teil des Phänotyps ist

(OMIM Datenbank).

Verschließt sich eine Schädelnaht zu früh, so findet kompensatorisches Wachstum an den noch

offenen Suturen statt, um eine normale Gehirnentwicklung zu ermöglichen. Dadurch entsteht ein

deformierter Schädel. Abhängig davon welche Schädelnaht von Kraniosynostose betroffen ist,

entsteht eine charakteristische Kopfform (Abb. 1.7). So führt beispielsweise eine vorzeitig

fusionierte Sagittalnaht zu verstärktem longitudinalem Wachstum der parietalen Knochen,

sodass sich ein Skaphozephalus, auch Dolichozephalus genannt, bildet. Die Sagittalnaht ist mit

über 50% die am häufigsten von einer vorzeitigen Verknöcherung betroffene Schädelnaht.

Ebenfalls sehr häufig sind unilaterale oder bilaterale Fusionen der Koronarnähte (20-30%)

(KIMONIS et al. 2007; CIUREA AND TOADER 2009).

1. EINLEITUNG

21

Abbildung 1.7: Schädelform nach Fusion einzelner Schädelnähte. Durch die vorzeitige Verknöcherung einer Sutur findet vermehrtes Wachstum an den anderen Wachstumsfronten statt, sodass ohne chirurgische Korrektur ein deformierter Schädel entsteht.

Sekundäre Folgen von Kraniosynostosen können ein erhöhter intrakranieller Druck, faziale

Deformationen, Intelligenzminderung oder seltener auch Hörstörungen sein. Das Sehvermögen,

die Atemwege und die Zahnstellung können wiederum durch die fazialen Deformationen

beeinträchtigt werden. Die einzige therapeutische Möglichkeit für Kraniosynostosen ist bisher

eine Operation. Die chirurgische Korrektur wird gewöhnlich innerhalb des ersten Lebensjahres

durchgeführt und dient meist dazu eine normale Gehirnentwicklung zu ermöglichen. Häufig

spielen bei der Entscheidung zur Operation auch psychosoziale Aspekte in Bezug auf die

Deformationen eine Rolle.

Die Pathogenese von Kraniosynostosen ist noch nicht vollständig geklärt, allerdings sind neben

genetischen Ursachen auch Umwelteinflüsse als Risikofaktoren beschrieben. Zu diesen zählen

eine verminderte Fruchtwassermenge, Mehrlingsschwangerschaften, Rachitis durch Vitamin D

Mangel, maternale Hyperthyreose sowie Teratogene wie Retinoide oder Methotrexat (ROY et al.

1981; RIDGWAY AND WEINER 2004; RASMUSSEN et al. 2007; WANG et al. 2007a; SANCHEZ-LARA et al.

2010). Kraniosynostosen sind genetisch betrachtet eine sehr heterogene Erkrankung mit

assoziierten Mutationen in vielen verschiedenen Genen sowie beschriebenen Aberrationen fast

aller Chromosomen. Bei ca. 24% der Patienten kann eine genetische Ursache identifiziert

werden, der Großteil davon weist syndromale Kraniosynostosen auf (WILKIE et al. 2017).

Chromosomale Aberrationen wie z.B. partielle Monosomien von 7p, 9p und 11p oder partielle

Trigonozephalus Skaphozephalus

Brachyzephalus

Plagiozephalus

Plagiozephalus

1. EINLEITUNG

22

Trisomien von 5q, 13q und 15q wurden mit Kraniosynostose assoziiert und bei ca. 11-15% der

syndromalen Patienten detektiert (WILKIE et al. 2010; WILKIE et al. 2017). Bisher sind außerdem

Mutationen in mindestens 57 Genen beschrieben, deren Assoziation mit Kraniosynostose

validiert ist (TWIGG AND WILKIE 2015). Unter diesen Mutationen sind sowohl Veränderungen, die

einen Funktionsverlust (engl. loss-of-function) als auch Veränderungen, die einen

Funktionsgewinn (engl. gain-of-function) zur Folge haben. Am häufigsten treten

Kraniosynostose Mutationen in den Genen FGFR1, FGFR2, FGFR3, TWIST1 und TCF12 auf (WILKIE

et al. 2017). In Tabelle 1.1 sind klassische Kraniosynostose Gene mit Mutationen und ihren

assoziierten Syndromen gelistet. Hierbei können zum einen Mutationen in verschiedenen Genen

zu dem gleichen Phänotyp führen (z.B. FGFR1/FGFR2 - Pfeiffer Syndrom) und zum anderen

gleiche Mutation unterschiedliche Syndrome ergeben (z.B. FGFR2 S267P – Crouzon

Syndrom/Pfeiffer Syndrom). Veränderungen in den FGFR Genen sind die häufigsten (ca. 45%)

identifizierten genetischen Ursachen bei Kraniosynostose Patienten (WILKIE et al. 2017). Alle

FGFR Mutationen werden dominant vererbt und haben einen gain-of-function Effekt, der die

Liganden unabhängige Rezeptordimerisierung vermittelt oder die Affinität der Liganden

Bindung ändern.

Tabelle 1.1. Klassische Kraniosynostose Gene und ihre assoziierten Syndrome

Gen Mutationen Kraniosynostose / Syndrom OMIM

EFNB1 >701 Kraniofrontonasale Dysplasie 304110

FGFR1 P252R P252R

Jackson-Weiss Syndrom Pfeiffer Syndrom

123150 101600

FGFR2

S252W, P253R >302 A344G >302

Apert Syndrom Crouzon Syndrom Jackson-Weiss Syndrom Pfeiffer Syndrom

101200 123500 123150 101600

FGFR3 A391E P250R

Crouzonodermoskeletales Syndrom Muenke Syndrom

123500 602849

MSX2 P148H, P148L Kraniosynostose 2 604757

RAB23 62 Carpenter Syndrom 201000

TCF12 >403 Kraniosynostose 3 615314

TWIST1 A186T, S188L >1001

Kraniosynostose 1 Saethre-Chotzen Syndrom

123100 101400

1 (RICE 2008) 2 (MUENKE et al. 2011) 3 (SHARMA et al. 2013; DI ROCCO et al. 2014; PAUMARD-HERNANDEZ et al. 2015; LEE et al. 2017)

Kraniosynostose Syndrome zeigen eine große klinische Variabilität und phänotypische

Überlappung, dennoch gibt es einige syndromspezifische Merkmale, die im Folgenden für die

sogenannten klassischen Kraniosynostose Syndrome kurz erläutert werden. Patienten, die vom

Apert Syndrom betroffen sind, haben häufig folgende kraniofaziale Auffälligkeiten: bilaterale

1. EINLEITUNG

23

Koronarnahtsynostose, Mittelgesichtshypoplasie, Exophthalmus, trapezförmige Oberlippe sowie

dentale Anomalien. Besonders charakteristisch sind jedoch symmetrische Syndaktylien der

Hände und Füße. Die phänotypischen Merkmale des Crouzon Syndroms sind sehr variabel.

Häufig sind multiple Suturen fusioniert, was zu einem Turmschädel führt. Die typische Crouzon

Fazies entsteht durch Exophthalmus, Hypertelorismus, Hypoplasie des Oberkiefers und einer

schnabelförmigen Nase. Eher unspezifisch sind die Merkmale des Muenke Syndroms, die in ihrer

Ausprägung von nicht sichtbar bis zu phänotypisch komplex reichen können. Es ist vor allem

genetisch durch die FGFR3 Substitution P250R definiert. Koronarnahtsynostosen, milde

Brachydaktylie, Hörstörungen sowie variable mentale Einschränkungen wurden bei Muenke

Patienten beschrieben. Ein Kleeblattschädel mit Fusion aller Suturen tritt häufiger bei Patienten

mit Pfeiffer Syndrom auf. Des Weiteren sind Patienten oft von Exophthalmus, Oberkiefer

Hypoplasie, partiellen Syndaktylien und verbreiterten Daumen und Großzehen betroffen. Eine

Haploinsuffizienz von TWIST1 ist die Ursache für das Saethre-Chotzen Syndrom.

Hauptmerkmale dieses Syndroms sind Koronarnahtsynostosen, eine hohe Stirn mit tiefem

Haaransatz, kleine Ohren mit prominenter Helix und partielle Syndaktylie des 2. und 3. Fingers

(MUENKE et al. 2011; FORREST AND HOPPER 2013).

1.7 Zielsetzung

Die Pathogenese von Kraniosynostosen ist noch nicht vollständig geklärt. Eine komplexe

Regulation von Genexpression und Signalwegen ist notwendig, um ein normales Wachstum der

Schädelplatten zu gewährleisten. In über 50% der Kraniosynostose Fälle ist die genetische

Ursache bisher unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit ist es neue genetische Ursachen für

Kraniosynostose zu identifizieren, um so dazu beizutragen die Pathogenese von

Kraniosynostosen weiter aufzuklären. Die Aufklärung und das Verständnis des grundlegenden

Mechanismus der Erkrankung könnte in Zukunft zur Entwicklung neuer Therapieansätze

führen. Im Rahmen dieser Arbeit soll eine Patienten Kohorte, die in Kooperation mit der

Pädiatrischen Neurochirurgie der Universitätsklinik Würzburg erstellt wird, molekulargenetisch

untersucht werden. Hierzu sollen die genetischen Analysen mit den Methoden Mikroarray-

basierter komparativer genomischer Hybridisierung (Array-CGH) und Next Generation

Sequencing (NGS) erfolgen. Hochauflösende Array-CGH ermöglicht eine genomweite Analyse von

Verlusten und Zugewinnen an genomischen Materials. Diese Kopienzahlveränderungen (engl.

copy number variants; CNV) können benigne sein oder aber eine pathogene Gendosis-

Veränderung zur Folge haben. Wie kritisch die Dosis mancher Faktoren in der

Schädelentwicklung sein kann, zeigen die Beispiele RUNX2 und TWIST1. Haploinsuffizienzen von

RUNX2 bzw. TWIST1 durch Mutationen oder CNVs können zu Kleidokranialer Dysplasie bzw.

Saethre-Chotzen Syndrom führen (GRIPP et al. 2000; OTTO et al. 2002). Bei der Auswertung der

1. EINLEITUNG

24

Array-CGH Daten der Kraniosynostose Kohorte soll aber auch besonders auf konservierte, nicht-

kodierende Bereiche im größeren Umfeld von Genen, die an der Osteogenese beteiligt sind,

geachtet werden. Man nimmt an, dass strukturelle Veränderungen von regulatorischen

Bereichen Änderungen in der Genexpression bewirken können und somit Einfluss auf die

komplexe Regulation der Schädelbildung nehmen. Dieser Mechanismus wird auch als Ursache

für einige Fälle von Kraniosynostose Typ Philadelphia vermutet. Betroffenen Patienten haben

Mikroduplikationen, die im Intron von NHEJ1, einem Nachbargen von IHH, überlappen. In dieser

Region liegen konservierte nicht-kodierende Elemente, die Einfluss auf die IHH Expression

nehmen. Eine Duplikation dieses Bereichs führt zu einer gesteigerten IHH Expression (KLOPOCKI

et al. 2011; WILL et al. 2017).

Des Weiteren soll im Rahmen dieser Arbeit ein NGS Kraniosynostose Genpanel, das die

gleichzeitige Analyse von mehreren Zielgenen ermöglicht, erstellt und die Kohorte damit

molekulargenetisch untersucht werden. Die phänotypischen Auffälligkeiten syndromaler

Kraniosynostosen sind zum einen oft unterschiedlich stark ausgeprägt und zum anderen häufig

nicht syndromspezifisch, sodass es oft schwer ist eine Diagnose anhand des Phänotyps zu

treffen. Häufig müssen in der molekulargenetischen Diagnostik mehrere Gene separat analysiert

werden, was zeitaufwändig und kostenintensiv sein kann. Neben bekannten Kraniosynostose

Genen soll das Genpanel auch weitere an der Osteogenese beteiligten Gene umfassen. Das Panel

soll zum einen als zeitsparendes diagnostisches Tool verwendet werden und zum anderen dazu

beitragen neue potentiell pathogene Varianten zu identifizieren, um das Mutationsspektrum

bekannter Kraniosynostose Genen zu erweitern. Neue potentiell pathogene Ursachen aus beiden

Analysemethoden sollen durch anschließende Analysen, wie beispielsweise Segregations-

analysen durch Sanger Sequenzierung oder quantitative Polymerasekettenreaktion, bestätigt

werden. Des Weiteren sollen, soweit möglich, funktionelle Untersuchungen in Zellkultur oder

dem Modellorganismus Danio rerio durchgeführt werden.

2. MATERIAL & METHODEN

25


2.1 Material

Die Auswahl und Zusammensetzung der Patienten Kohorten wird erläutert sowie eine

Auflistung der Hersteller, von denen Chemikalien und Kits bezogen wurden, und die

Quellenangaben zu den genutzten Datenbanken und Software. Die Zusammensetzung der

verwendeten Puffer befindet sich unter 2.2 und 2.3 bei der jeweiligen Methode.

2.1.1 Patienten

Im Rahmen dieser Arbeit sollen genetische Analysen durchgeführt werden, um die Pathogenese

von Kraniosynostose weiter aufzuklären. Hierzu wurde eine Kraniosynostose Patienten Kohorte

erstellt, die zum einen aus dem Kollektiv des Diagnostiklabors des Institut für Humangenetik

stammt und zum anderen über die kraniofaziale Sprechstunde der Pädiatrischen Neurochirurgie

der Universitätsklinik Würzburg durch OA PD Dr. med. T. Schweitzer rekrutiert wurden (Tabelle

2.1). Die Kohorte umfasst 83 Kraniosynostose Patienten mit isolierter und syndromaler

Kraniosynostose. Bei 62 Patienten wurden bereits zuvor genetische Analysen, wie z.B.

Sequenzierung der Gene FGFR1, FGFR2, FGFR3 und TWIST1, durchgeführt und waren ohne

Ergebnis.

Tabelle 2.1: Kraniosynostose-Kohorte

Patienten-ID

Kraniosynostose Auffälligkeiten Extremitäten

zusätzliche Auffälligkeiten

Diagnostik Array-

CGH NGS

CRA_1 koronar unilateral - - + + -

CRA_2 koronar bilateral - - + - -

CRA_3 sagittal, koronar - + + - +

CRA_4 sagittal, koronar - - + + -

CRA_5 koronar - - + + -

CRA_6 lambda - + + - +

CRA_7 koronar bilateral - - + + -

CRA_8 koronar bilateral + + + + -


CRA_10 sagittal - + + + -


CRA_12 metopisch, koronar - - + + -

CRA_13 koronar bilateral - + + + +

CRA_14 metopisch, lambda - + + - +

CRA_15 lambda - - + + -


26

CRA_16 + + + + + +

CRA_17 koronar unilateral - + + - +

CRA_18 + + + + + +

CRA_19 sagittal + + - - +

CRA_20 metopisch, sagittal - + + - +

CRA_21 koronar, lambda - + + + +

CRA_22 + N/A + + + +

CRA_23 metopisch - - + - +

CRA_24 metopisch - - - - +

CRA_25 multiple + + + + +

CRA_26 + N/A + + - +

CRA_27 koronar unilateral - N/A + - +


CRA_29 + + - + - +

CRA_30 metopisch - + + + -

CRA_31 sagittal - + + + +

CRA_32 koronar, lambda - + + + -

CRA_33 multiple - + + + +

CRA_34 sagittal + + + + +

CRA_35 koronar unilateral - + + + -

CRA_36 + + + + - +


CRA_38 sagittal N/A N/A - + -

CRA_39 sagittal N/A N/A - + -

CRA_40 koronar - + + + -

CRA_41 koronar + - + + +

CRA_42 koronar + - + - +

CRA_43 metopisch + N/A + - +

CRA_44 + N/A + + - +

CRA_45 metopisch, koronar - + + + -

CRA_46 koronar bilateral - + + - +

CRA_47 metopisch - + + + +

CRA_48 lambda + + + - +

CRA_49 metopisch + + + + +

CRA_50 sagittal + + + - +

CRA_51 sagittal - + + - +

CRA_52 sagittal - + + - +

CRA_53 metopisch - + N/A + +

CRA_54 + N/A N/A N/A - +

CRA_55 + - + + - +


27

CRA_56 koronar bilateral - - + - +

CRA_57 + - + + - +

CRA_58 multiple - + - + -

CRA_59 multiple - + - + -

CRA_60 metopisch - + + - +

CRA_61 + + - + - +

CRA_62 koronar, lambda + + - - +

CRA_63 metopisch - + + - +

CRA_64 multiple + + + + +

CRA_65 + N/A + - - +

CRA_66 + - + + - +

CRA_67 koronar - + - - +

CRA_68 koronar - - - - +

CRA_69 + - N/A - - +

CRA_70 koronar - N/A - - +

CRA_71 metopisch N/A N/A - - +

CRA_72 metopisch, sagittal - + + - +

CRA_73 sagittal - - - - +


CRA_75 koronar bilateral - + + - +


CRA_77 sagittal - + - - +

CRA_78 koronar - + - - +


CRA_80 koronar - + + - +

CRA_81 koronar unilateral - - + - +

CRA_82 koronar - + + - +

CRA_83 koronar unilateral - + + - + +: ja; -: nein; N/A: nicht bekannt

Für das Teilprojekt 3.4 wurde eine zusätzliche Patienten Kohorte erstellt (Tabelle 2.2). Diese 96

Patienten weisen einen vorzeitigen Verschluss der Frontal- oder Sagittalnaht auf und wurden

aus dem Kollektiv des humangenetischen Diagnostiklabors des Instituts ausgewählt. Die

klinischen und persönlichen Daten aller Patienten wurden von den betreuenden Ärzten erhoben

und pseudonymisiert. Für die genetischen Analysen wurde genomische DNA (gDNA) aus

peripherem Blut als Untersuchungsmaterial verwendet. Die Isolation der gDNA aus den

Blutproben fand durch das humangenetische Diagnostiklabor statt. Ein Votum der

Ethikkomission der medizinischen Fakultät der Universität Würzburg sowie die

Einverständniserklärungen der Patienten bzw. der Eltern für die Durchführung von genetischen

Analysen liegen vor (Votum Nr. 89/13, Anlage B).


28

Tabelle 2.2: SMAD6-Kohorte

Patienten ID

Kraniosynostose Patienten ID

Kraniosynostose Patienten ID

Kraniosynostose

P01 sagittal P33 sagittal P65 sagittal


P03 metopisch P35 metopisch P67 metopisch

P04 metopisch P36 sagittal P68 sagittal

P05 metopisch P37 metopisch, sagittal P69 metopisch


P07 metopisch, sagittal P39 sagittal P71 metopisch



P10 metopisch P42 metopisch P74 sagittal


P12 sagittal P44 sagittal P76 sagittal, +



P15 metopisch, sagittal P47 metopisch P79 metopisch




P19 metopisch P51 sagittal P83 metopisch


P21 sagittal P53 metopisch P85 metopisch

P22 sagittal P54 sagittal P86 metopisch

P23 metopisch P55 metopisch P87 metopisch




P27 metopisch, sagittal P59 sagittal P91 metopisch

P28 sagittal P60 metopisch P92 sagittal


P30 sagittal, + P62 sagittal P94 sagittal


P32 metopisch P64 sagittal P96 metopisch + V. a. Fusion einer weiteren Naht


29

2.1.2 Danio rerio Haltung

Der Zebrabärbling (Danio rerio), umgangssprachlich Zebrafisch genannt, ist beheimatet in

südasiatischen Süßgewässern und gehört zu der Familie der Karpfenfische (Cyprinidae). Adulte

Fische können bis zu 5 cm groß werden und besitzen das namensgebende Muster aus goldenen

und blauschwarzen Längsstreifen. Die Fische wurden nach Kimmel und Westerfield gehalten

(KIMMEL et al. 1995; WESTERFIELD 1995). Die leichte und kostengünstige artgerechte Haltung, die

hohe Nachkommenzahl sowie eine kurze Generationszeit trugen dazu bei, dass der Zebrafisch

ein wichtiger Modellorganismus wurde. Des Weiteren erleichtern die extrakorporale

Entwicklung und die Transparenz der Larven die Untersuchungen der embryonalen

Entwicklung. Weitere Vorteile sind die hohe genetische Ähnlichkeit zwischen Zebrafisch und

Säugetieren und die Vielzahl an Methoden, die zur genetischen Manipulation (z.B. Morpholinos,

ektopische RNA Expression, CRISPR/Cas9) zur Verfügung stehen. Dies alles macht den

Zebrafisch zu einem guten Modell für humane genetische Erkrankungen. Auch für

Kraniosynostosen ist der Zebrafisch ein geeigneter Modellorganismus. Das Zebrafisch

Neurocranium entsteht wie bei Säugetieren durch intramembranöse Ossifikation und besitzt die

gleichen cranialen Suturen (Abb. 2.1). Auch die Morphologie der Suturen ist ähnlich (QUARTO AND

LONGAKER 2005). Im Gegensatz zum Menschen bleiben jedoch alle Suturen lebenslang offen.

Abbildung 2.1: Neurocranium von Danio rerio. Das linke Bild zeigt eine konfokale Aufnahme eines 10 Wochen alten Zebrafischs (nac-/-tra-/-). Die Färbung der Knochen erfolgte mit Alizarinrot. Das Neurocranium Schema links wurde modifiziert nach Kague et al. (KAGUE et al. 2012). Die Schädelnähte sind gekennzeichnet.

Neben dem Wildtyp Stamm AB/AB wurde im Rahmen dieses Projekts auch der nac-/-tra-/- Stamm

verwendet. Die nac-/-tra-/- Fische sind auch als adulte Fische transparent, da Mutationen in den

Genen mitfa und mpv17 ein Verlust der Melanozyten und Iridophoren bewirken.

intrafrontal

sagittal

koronar

lambda


30

In dieser Arbeit wurden neben Zebrafisch Embryonen auch komplementäre DNA (engl.

complementary DNA; cDNA) von wildtypischen Zebrafischen verwendet. Sie diente als Template

für die Amplifikation der Hybridisierungssonden und der kodierenden Sequenz von fgf10a und

huwe1. Die cDNA der Stadien 4 Zell, 1k Zell, Dome, Shield, 1-3 Somiten, 24 hpf (engl. hours post

fertilization), 32 hpf und 48 hpf war bereits vorhanden und wurde zu gleichen Anteilen zu einem

Stadien-Mix vermischt. Des Weiteren wurden diese cDNAs und cDNA aus Augen, Gehirn, Haut,

Hoden, Kiemen, Leber und Muskel für Expressionsanalysen verwendet.

2.1.3 Bakterienstamm

Im Rahmen dieser Arbeit wurden chemisch kompetente Escherichia coli DH5α von Life

Technologies verwendet.

2.1.3 Primer

Die in dieser Arbeit verwendeten Primer wurden mit dem Programm Primer3Plus erstellt.

Sofern nicht anders vermerkt, wurden hierfür die Voreinstellungen verwendet. Mit BLAST (Basic

Local Alignment Search Tool) wurde sichergestellt, dass keine weiteren Bindungsstellen des

Primers im Genom vorliegen. Die Primer wurden über die Firmen Sigma-Aldrich und Eurofins

bezogen. Sinnstrang-Primer werden als forward (fwd) und Gegenstrang-Primer als reverse (rev)

bezeichnet. Die Primersequenzen können dem Anhang A entnommen werden.

2.1.4 Chemikalien und Reagenzien

Soweit nicht anders vermerkt wurden die verwendeten Chemikalien und Reagenzien von den

Firmen Applied Biosystems, Beckman Coulter, Bioline, Chemikalien Schellert, Merck, Serva,

Sigma-Aldrich, Roche sowie Roth bezogen.

2.1.5 Enzyme, Plasmide und Kits

Die jeweiligen Hersteller der verwendeten Enzyme, Plasmide und Kits sind innerhalb der

Methodenbeschreibungen vermerkt.


31

2.1.6 Programme und Datenbanken

Tabelle 2.3 beinhaltet eine Auflistung der verwendeten Software, Online Tools und Datenbanken

sowie ihrer Quellen.

Tabelle 2.3: Verwendete Programme und Datenbanken

Software/Datenbank Quelle

Alamut 2.7-1 Interactive Biosoftware

ApE http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/

BioEdit http://en.bio-soft.net/format/BioEdit.html

CodonCode Aligner 7.1.2 Demo CodonCode Corporation

CytoGenomics 4.02.21 Agilent Technologies

Database of Genomic Variants (DGV) http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home

DECIPHER GRCh37 https://decipher.sanger.ac.uk/

ECR Browser https://ecrbrowser.dcode.org/

Ensembl http://www.ensembl.org/index.html

Ensembl BLAST http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Tools/Blast

ExAC Browser http://exac.broadinstitute.org/

Fruitfly http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html

GensearchNGS 1.6.58 PhenoSystems

Haplopainter 1.043 http://haplopainter.sourceforge.net/index.html

Hbond Score https://www2.hhu.de/rna/html/hbond_score.php

Human Splicing Finder v3.1 http://www.umd.be/HSF3/HSF.shtml

MutationTaster http://www.mutationtaster.org/

NEB Tm Calculator https://tmcalculator.neb.com/#!/main

OMIM https://www.omim.org/

Osteogenesis Imperfecta Variant Database

https://oi.gene.le.ac.uk/home.php?select_db=COL1A2

PolyPhen-2 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

Primer3plus https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

QuantStudioTMReal-Time PCR Applied Biosystems

SIFT http://sift.jcvi.org/

UCSC Genome Browser https://genome.ucsc.edu/

UniProt http://www.uniprot.org/


32

2.2 Allgemeine Methoden

Die wichtigsten molekulargenetischen Standardmethoden innerhalb dieser Arbeit werden im

Folgenden beschrieben. Methoden wie Gelelektrophorese, Restriktionsverdau, Transformation,

Plasmid Präparation und Quantifizierung von Nukleinsäuren werden allerdings nicht weiter

ausgeführt.

2.2.1 Polymerase-Kettenreaktion

Durch Oligonukleotid-Primer begrenzte DNA-Abschnitte können mit Hilfe der Polymerase-

Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction; PCR) amplifiziert werden (MULLIS et al. 1986).

Eine PCR besteht aus drei sich zyklisch wiederholenden Schritten: Denaturierung,

Primerhybridisierung und Synthese. Die in einem Zyklus entstehenden PCR Produkte dienen im

folgenden Zyklus wiederum als Matrize, wodurch eine exponentielle Amplifikation des

entsprechenden DNA-Abschnitts erreicht wird. Für diese Arbeit wurden die DNA-Polymerasen

Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs; NEB) und Platinum Taq DNA-

Polymerase (Invitrogen) verwendet. Als Template DNA dienten humane gDNA sowie humane

und Zebrafisch cDNA. Durch Gelelektrophorese wurde der Erfolg der PCR überprüft.

a) Standard PCR für Klonierungen

Für die Amplifikation von DNA-Abschnitten oder von vollständig kodierenden Gensequenzen,

die in ein Plasmid einkloniert wurden, wurde die Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB)

verwendet.

25 µl Ansatz Komponenten 5 µl 5x Q5 Reaktions-Puffer 4,5 µl dNTPs [je 2,5 mM] 1,25 µl Primer fwd [10 µM] 1,25 µl Primer rev [10 µM] 0,5 µl Q5 Polymerase auf 25 µl ddH2O + 1-3 µl Template DNA (1 µl gDNA [50 ng/µl], 2-3 µl cDNA)

Für das Thermocycler Programm wurde die Primerhybridisierungstemperatur wie vom

Hersteller empfohlen über NEB Tm Calculator berechnet.

Thermocycler Bedingungen:

Temp. Zeit Zyklen

98°C 30 s

98°C 10 s

30x 50-72°C 10 s

72°C 20 s pro kb

72°C 2 min

10°C ∞


33

b) Standard PCR vor Sequenzierungen

10x Ammoniumpuffer 75 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,8); 2,64 g Ammoniumsulfat; 500 µl 20% Tween-20; auf 100 ml mit ddH2O auffüllen 5x Puffer B 4 ml 10x Ammoniumpuffer, je 80 µl von 100 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP;

1,76 ml 50 mM Magnesiumsulfat; 8 ml Enhancer (Invitrogen); 19,2 ml ddH2O

Für die Bestätigung von NGS detektierten Varianten, die Sequenzierung der SMAD6 Kohorte

oder die Analyse von cDNA durch Sanger Sequenzierung wurden die entsprechenden DNA-

Abschnitte zuvor durch PCR amplifiziert, um ein optimales Sequenzierergebnis zu erhalten.

Hierfür wurde die Platinum Taq DNA-Polymerase (Invitrogen) verwendet.

14,8 µl Ansatz Komponenten 12,5 µl 5x Puffer B 0,5 µl Primer fwd [10 µM)] 0,5 µl Primer rev [10 µM] 0,3 µl Platinum Taq Polymerase + 1-3 µl Template DNA (1 µl gDNA [50 ng/µl], 2-3 µl cDNA)


Temp. Zeit Zyklen

95°C 5 min

95°C 30 s

3x 62°C 30 s

72°C 30 s

95°C 30 s

3x 59°C 30 s

72°C 30 s

95°C 30 s

30x 56°C 30 s

72°C 30 s

72°C 5 min

10°C ∞

2.2.2 Sanger Sequenzierung

Die von Frederik Sanger in den 1970er Jahren etablierte Methode zur Bestimmung der

Basenabfolge der DNA basiert auf dem Kettenabbruch-Prinzip (SANGER AND COULSON 1975). Der

Reaktionsansatz gleicht einem PCR Ansatz, mit dem Unterschied, dass nur ein Primer eingesetzt

wird und der Reaktion zusätzlich Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTP) hinzugefügt werden.

Diesen ddNTPs fehlt die 3‘Hydroxygruppe, wodurch nach ihrem Einbau keine weitere Synthese

durch die DNA-Polymerase mehr möglich ist. Hier erfolgt der namensgebende Abbruch der

Synthese, der statistisch an jeder Basenposition stattfindet. Heutzutage sind die ddNTPs mit

unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen markiert. Die Ermittlung der Sequenz erfolgt durch


34

die kapillarische Auftrennung der Fragmente und Anregung der Fluoreszenz-Farbstoffe in einer

Sequenzier-Plattform.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden PCR Produkte als Sequenzier-Templates verwendet. Die PCR

Ansätze wurden für ein optimales Sequenzierergebnis vor ihrer Verwendung enzymatisch

aufgereinigt. Durch Exonuklease I (Exo, Affymetrix) wird einzelsträngige DNA verdaut und

durch Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP, Affymetrix) werden nicht verwendete Nukleotide

dephosphoryliert.

7,6 µl Ansatz Komponenten 1,5 µl PCR Produkt 0,3 µl Exo [10 U/µl] 0,3 µl SAP [1 U/µl] 5,5 µl ddH2O


Temp. Zeit

37°C 30 min

85°C 15 min

98°C 3 min

10°C ∞

Anschließend wurden zu diesem Ansatz die weiteren Komponenten der Sequenzierreaktion

hinzu pipettiert. Bei der Komponente BigDye® Terminator (Applied Biosystems) handelt es sich

um einen vorgefertigten Mix aus DNA-Polymerase, dNTPs und Fluoreszenz markierten ddNTPs.

11,1 µl Ansatz Komponenten 7,6 µl ExoSAP Ansatz 0,5 µl Primer fwd oder rev [10 µM] 2 µl 5x Sequenzierpuffer 1 µl BigDye® Terminator Mix


Temp. Zeit Zyklen

96°C 2 min

96°C 20 s

28x 56°C 20 s

60°C 3 min

60°C 10 min

10°C ∞

Die bei der Kettenabbruch-Reaktion entstandenen DNA-Fragmente wurden durch

Ethanolpräzipitation für die Sequenzierplattform vorbereitet. Alkohol und einfach geladene

Salze bewirken ein Ausfallen der DNA aus einer wässrigen Lösung, die dann durch

Zentrifugation pelletiert werden kann. Zu jedem Sequenzieransatz wurde folgender Ansatz

hinzu pipettiert.


35

14 µl Ansatz Komponenten 2 µl 3 M Natriumacetat pH 5,2 2 µl 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pH 8,0

10 µl ddH2O

Danach wurde 60 µl eiskalter 100% Ethanol hinzugegeben, der Ansatz kurz gevortext und die

Proben für 5 min bei 4°C mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Anschließend wurde der

Überstand abgenommen, das DNA-Pellet mit 180 µl 70% Ethanol gewaschen und der

Zentrifugationsschritt wiederholt. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet für 5-10

min luftgetrocknet. Nach der Resuspension der Pellets in 35 µl HiDi-Formamid (Applied

Biosystems) wurden die Proben auf der Sequenzierplattform ABI 3130xL Genetic Analyzer

(Applied Biosystems) analysiert. Bei einer Probenanzahl >24 wurden die Proben mit Hilfe eines

Janus Roboters (PerkinElmer) gefällt und anschließend sequenziert.

2.3 Spezielle Methoden

Im Folgenden werden die Methoden vergleichende Genomhybridisierung und Next Generation

Sequencing, die verwendet wurden, um die Kranio Kohorte molekulargenetisch zu untersuchen,

erläutert. Des Weiteren werden einige Methoden beschrieben, mit denen funktionelle Analysen

durchgeführt wurden.

2.3.1 In vitro Spleißanalyse durch Minigen-Konstrukte

Für die Bewertung von NGS detektierten Varianten stehen eine Vielzahl von bioinformatischen

Programmen zur Verfügung. Die Programme Fruitfly und HBond sowie die Spleißvorhersage

Funktion der Software Alamut (Interactive Biosoftware) wurden beispielsweise verwendet, um

den Einfluss einer Sequenz Variante auf das Spleißen der prä-mRNA vorherzusagen. Eine

tatsächliche Aussage über einen Einfluss lässt sich jedoch nur durch die Überprüfung der

Patienten mRNA treffen. Steht hierfür keine erneute periphere Blutprobe des Patienten zur

Verfügung oder das Gen wird nicht im Blut exprimiert, so kann alternativ mit einem

sogenannten Minigen-System eine in vitro Spleißanalyse durchgeführt werden. Für diese Arbeit

wurde für solche Analysen der Vektor pSPL3b (erhalten von AG Gessler, Anhang G) verwendet.

Dieser beinhaltet einen Spleißdonor und einen Spleißakzeptor, die durch eine intronische

Sequenz getrennt sind. Diese beiden artifiziellen Exons werden in dieser Arbeit mit Exon A und

B benannt. Im Intron Bereich befindet sich eine multiple Klonierungsstelle, in welche die zu

analysierenden DNA-Abschnitte eingebracht werden können. Einkloniert wird das Exon mit der

betroffenen Spleißstelle und umgebende intronische Sequenzen. Wenn möglich sollten die

intronischen Abschnitte größer als 60 bp sein (DESVIAT et al. 2012). Sofern die Intron Größen es


36

zulassen, können auch mehrere Exons eines Gens eingebracht werden. Dies spiegelt eher die in

vivo Situation wider. Gleichzeitig wird als Kontrolle ein Konstrukt mit der wildtypischen

Sequenz erstellt. Es folgt die Transfektion in eine Zelllinie und die Analyse der entstandenen

Spleißprodukte. Im Folgenden werden die Einzelschritte ausführlicher erläutert.

a) Erstellung der Minigen-Konstrukte

Für potentielle Spleißvarianten der Gene MEGF8 und TCF12 wurde das in vitro Spleißsystem

durchgeführt. Die entsprechenden Exons mit umgebenden Intronsequenzen wurden nach dem

Standardprotokoll der Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, siehe 2.2.1 a) amplifiziert. Die

Primer Sequenzen können dem Anhang A entnommen werden. Männliche Referenz-DNA

(Agilent) und die entsprechenden Patienten gDNAs dienten als Template. In beiden Fällen

konnten die PCR Produkte über die Restriktionsstellen der Restriktionsenzyme XhoI (NEB) und

BamHI (NEB) in den Vektor pSPL3b einkloniert werden. Die Minigen-Konstrukte wurden durch

Restriktionsverdau und Sequenzierung mit den Vektor-spezifischen Primern SD6 und SA2

verifiziert. Die Vektorkarten der Konstrukte befinden sich im Anhang G.

b) Zellkultur und Transfektion

Die Zelllinien HEK293T (humane embryonale Nierenzellen) und U2OS (humane Osteosarcoma-

Zellen) wurden für die in vitro Spleißanalyse verwendet. Die Zellen wurden in Zellkulturflaschen

im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit gehalten. Als Nährmedium wurde

DMEM (Sigma-Aldrich) mit 10% FCS (fötales Kälberserum, Sigma-Aldrich) verwendet. Am

Vortag der Transfektion wurde die Konzentration der Zellen mit Hilfe einer Neubauer-

Zählkammer bestimmt und in eine 6-Well-Platte 4x105 Zellen in einem Volumen von 2 ml je Well

ausgesät. Am darauffolgenden Tag fand vor der Transfektion, sofern eine Zelldichte von 50-80%

je Well vorlag, ein Mediumwechsel statt. Als Transfektionsreagenz wurde FuGENE®6 (Roche)

im Verhältnis von 3:1 (FuGENE µl : DNA µg) verwendet. In je 100 µl DMEM wurden 2 µg des

pSPL3b Leervektors bzw. der Vektor-Konstrukte verdünnt. Anschließend wurde zu jedem

Ansatz 6 µl FuGENE zugegeben und für 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Der

Transfektionsansatz wurde tropfenweise in jeweils ein Well der 6-Well-Platte gegeben. Die

Zellen wurden für 24 h im Brutschrank inkubiert.

c) RNA Isolation, cDNA Synthese und Analyse

Für die RNA Isolation wurden die adhärierten Zellen abgelöst, in 2 ml Medium aufgenommen

und in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Es folgte eine Zentrifugation für 5 min bei 4°C und

1000 xg. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit 1 ml 1x DPBS (PAN-Biotech)

resuspendiert. Der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt und das entstandene Pellet mit

700 µl QIAzol Lysis Reagenz (Qiagen) versetzt und für 1 min gevortext. Anschließend erfolgte


37

die RNA Isolation mit dem miRNeasy Mini Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben. Die RNA wurde

mit 35 µl Reinstwasser eluiert und die Konzentration photometrisch bestimmt. Im Anschluss

erfolgte die Synthese der cDNA aus der RNA durch eine Reverse Transkriptase. Hierfür wurde

das Kit High-Capacity RNA-to-cDNA™ (Applied Biosystems) verwendet. Als Primer sind in diesem

Kit sowohl zufällige Oktamer- als auch oligo d(T)–Primer enthalten.

20 µl Ansatz Komponenten 10 µl 2x RT Puffer bis zu 9 µl RNA (bis zu 2 µg) 1 µl 20x RT Enzym Mix


Temp. Zeit

37°C 90 min

95°C 5 min

10°C ∞

Zur Analyse der entstandenen Spleißprodukte wurde eine PCR mit den Vektorprimern SD6 und

SA2 und der cDNA als Template durchgeführt. Die PCR Produkte wurden zum einen über

Gelelektrophorese und zum anderen durch Sequenzierung analysiert. Hierbei fand ein Vergleich

des wildtypischen Konstrukts mit dem Konstrukt, das die Sequenzvariante des Patienten

enthielt, statt.

2.3.2 RNA Isolation aus Blutproben

10x Erythrozyten Lysis Puffer 155 mM NH4Cl; 10 mM KHCO3; 0,1 mM EDTA-Na2; mit ddH2O auf 100 ml auffüllen und bei 4°C lagern

Zur Überprüfung detektierter Varianten bzw. deren Effekte auf mRNA Ebene wurde RNA aus

Blutproben der entsprechenden Patienten isoliert. Es ließ sich sowohl aus EDTA-Vollblut als

auch aus Heparin-Vollblut erfolgreich RNA isolieren. Die Erythrozyten wurden hierfür im ersten

Schritt durch einen hypotonischen Puffer lysiert. Es wurde 2,5 ml Vollblut mit 45 ml 1x Lysis

Puffer versetzt und für 15 min bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Bei erfolgreicher Lyse wird

die zuvor trübe Lösung klarer. Die Lösung wurde für 5 min bei 4°C und 500 xg zentrifugiert. Die

intakten Leukozyten wurden als weißes Pellet sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen,

das Pellet in 10 ml 1x DPBS resuspendiert und der Zentrifugationsschritt wiederholt. Es folgte

ein weiterer Waschschritt. Hierfür wurde der Überstand erneut abgenommen, das Pellet in 2 ml

1x DPBS resuspendiert, in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt und für 5 min bei 4°C und 500 xg

zentrifugiert. Zur Lyse und Homogenisierung der Leukozyten wurde das Pellet mit 700 µl QIAzol

Lysis Reagenz (Qiagen) versetzt und für 1 min gevortext. Anschließend erfolgte die RNA

Isolation mit dem miRNeasy Mini Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben. Die RNA wurde mit 35 µl

Reinstwasser eluiert und die Konzentration photometrisch bestimmt. Im Anschluss erfolgte die


38

Synthese der cDNA wie unter 2.3.1 c) beschrieben. Die Analyse der cDNA erfolgte durch

Sequenzierung (siehe 2.22).

2.3.3 Mikroarray basierte vergleichende Genomhybridisierung (Array-CGH)

Mit der vergleichenden Genomhybridisierung (CGH) lassen sich chromosomale Veränderungen,

wie Verlust und Zugewinn von genetischem Material, genomweit nachweisen. Mit der

konventionellen Methode fand hierbei eine gleichzeitige Hybridisierung von Patienten gDNA

und Referenz-DNA, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzmolekülen markiert waren, auf

Referenz Metaphase Chromosomen statt. Durch das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten

entlang eines Chromosoms ließen sich chromosomale Veränderungen identifizieren

(KALLIONIEMI et al. 1992). Die Auflösung dieser konventionellen CGH ist jedoch begrenzt auf 5-

10 Mb. Eine höhere Auflösung wurde durch die Weiterentwicklung dieser Methode, die so

genannte Array-CGH, erreicht (SOLINAS-TOLDO et al. 1997; PINKEL et al. 1998). Hierbei findet die

Hybridisierung nicht mehr mit Metaphase Chromosomen statt, sondern mit auf einen Glasträger

aufgebrachte 25-85-mer Oligonukleotiden, die das gesamte Genom abdecken. Der Glasträger

wird als Mikroarray und die DNA-Fragmente der Hybridisierungsmatrix als Probes bezeichnet.

Die Auflösung der Array-CGH ist abhängig von der Anzahl der Probes und ihrer Verteilung über

das Gesamtgenom und liegt bei < 100 kb. Der Vorteil der Array-CGH liegt darin, dass innerhalb

eines Experiments mikroskopische und submikroskopische Kopienzahlveränderungen des

Gesamtgenoms detektiert werden können und als Ausgangsmaterial gDNA ausreichend ist.

Balancierte Translokationen, Inversionen oder Polyploidien können mit dieser Methode jedoch

nicht nachgewiesen werden.

Der Ablauf der Methode ist schematisch in Abbildung 2.2 dargestellt. Es werden gleiche Mengen

an Patienten gDNA und Referenz-DNA des passenden Geschlechts mit den

Fluoreszenzfarbstoffen Cyanin3 und Cyanin5 (Cy3/Cy5) markiert (Abb. 2.2 A) und auf dem

Mikroarray kohybridisiert (Abb. 2.2 B). Hierbei erfolgt die Zugabe von Cot-1 DNA. Diese

unmarkierte repetitive DNA dient dem Blocken von repetitiven Sequenzen der Zentromere und

Telomere. Durch vorherige Denaturierung liegen die DNAs einzelsträngig vor und können sich

an die Probes der Hybridisierungsmatrix anlagern. Sind bei der Patienten gDNA im Vergleich zur

Referenz-DNA chromosomale Veränderungen vorhanden, so führt dies zu einer Änderung im

Hybridisierungsverhältnis an den entsprechenden Oligonukleotiden. Folglich ändern sich auch

die Fluoreszenzsignale. Die Fluoreszenzsignale werden von einem Laserscanner detektiert (Abb.

2.2 C) und durch eine Software zu einem genomischen Profil verrechnet, das ausgewertet und

bewertet werden kann (Abb. 2.2 D + E).


39

Abbildung 2.2: Schematischer Ablauf einer Array-CGH. A Referenz- und Patienten gDNA werden Fluoreszenz-markiert. B Es folgt die Hybridisierung beider DNAs mit den Probes auf dem Mikroarray. C Die Fluoreszenzsignale werden anschließend gescannt. D+E Mit den Scans wird durch eine Software das genomische Profil berechnet. Grundlage hierfür ist das Mischverhältnis der Fluoreszenzsignale, das Rückschlüsse auf unterschiedliche Mengen in den beiden DNA-Proben gibt. Ist der berechnete log2ratio Wert 0, so liegt kein Unterschied zwischen Referenz und Patient vor, negative Werte bedeuten ein Verlust und positive Werte ein Zugewinn in der Patienten gDNA. Die Interpretation der Daten erfolgt anschließend über einen Abgleich mit Datenbanken.

In dieser Arbeit wurden zur Analyse der gDNA von Kraniosynostose Patienten hochauflösende

1M Oligonukleotid Arrays (Agilent) verwendet. Ausgangsmaterial waren je 1,5 µg

hochqualitativer gDNA und Referenz-DNA in 26 µl Reinstwasser. Diese wurden zusammen mit je

5 µl der randomisierten Primer für 10 min bei 98°C denaturiert. Der Ansatz wurde kurz auf Eis

inkubiert und anschließend mit 19 µl des Markierungsansatzes gemischt. Patienten-DNAs

wurden immer mit Cy5, Referenz-DNAs mit Cy3 fluoreszenzmarkiert. Die Reaktion wurde im

Thermocycler inkubiert.

19 µl Ansatz Komponenten 10 µl 5x Reaktionspuffer 5 µl 10x dNTPs 3 µl Cyanin3 dUTP /

Cyanin5 dUTP 1 µl Exo(-)Klenow

(A) Markierung der genomischen DNA

(B) Hybridisierung

(C) Scannen der Fluoreszenzsignale

(D) Berechnung des genomischen Profils

Referenz

Patient

Zugewinn

Verlust

Normales Verhältnis

log2ratio

Verlust

Zugewinn

4

(E) Dateninterpretation


40


Temp. Zeit

37°C 2 h

65°C 10 min

4°C ∞

1x TE-Puffer pH 8,0 10 mM Tris-Cl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0)

Für die Aufreinigung der markierten DNAs wurden die Ansätze mit 430 µl 1x TE-Puffer

gemischt, auf eine Säule gegeben und für 10 min bei 11.000 xg zentrifugiert. Anschließend

wurde der Durchfluss verworfen, die Säule mit 480 µl 1x TE-Puffer gewaschen und die

Zentrifugation wiederholt. Zur Elution der gereinigten Probe wurde die Säule umgedreht in ein

neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und 1 min bei 1.000 xg zentrifugiert. Das Probenvolumen

wurde mit 1x TE-Puffer auf 80,5 µl eingestellt. Der Erfolg der Markierungsreaktion wurde durch

nanophotometrische Messung der DNA- und Fluorophor-Konzentration überprüft. Jeweils 79 µl

der Patienten- und Referenz-DNA wurden anschließend miteinander gemischt. Zu dem DNA-

Ansatz wurde der Hybridisierungsmix gegeben, der Cot-1 DNA enthält.

362 µl Ansatz Komponenten 50 µl Cot-1 DNA [1 mg/ml] 52 µl 10x aCGH Blocking Agent 260 µl 2x Hybridisierungspuffer

Die Hybridisierungsreaktion wurde für 3 min bei 98°C denaturiert und anschließend für 30 min

bei 37°C inkubiert. Von der Reaktion wurden 490 µl auf einen Glasträger in der

Hybridisierungskammer pipettiert, der Glasträger mit der Hybridisierungsmatrix ohne

Lufteinschlüsse aufgelegt und die Kammer verschlossen. Die Hybridisierungskammer wurde für

40 h bei 65°C und 20 rpm in einem Hybridisierungsofen (SHEL LAB) inkubiert. Anschließend

wurden die Glasträger entnommen und im Waschpuffer 1 (Agilent) getrennt. Der erste

Waschschritt des hybridisierten Glasträgers erfolgte im Waschpuffer 1 für 5 min bei RT, der

zweite im auf 37°C erwärmten Waschpuffer 2 (Agilent) für 1 min. Durch langsames

Herausziehen aus dem Puffer wurde der Objektträger getrocknet. Anschließend wurde der

Glasträger in einem Laserscanner (NimbleGen MS200, Roche) mit 2 µm Auflösung gescannt. Die

Berechnung des genomischen Profils erfolgte mit der Software CytoGenomics (Agilent) mit

folgenden Filtereinstellungen: 5 Probes und log2ratio=0.29. Die detektierten

Kopienzahlveränderungen wurden anschließend einzeln auf ihre klinische Relevanz bewertet.

Die genomischen Bereiche wurden im UCSC Browser betrachtet und die Verknüpfungen zu den

Datenbanken DGV und DECIPHER verwendet. In DGV sind Daten über häufige benigne CNVs

hinterlegt. Ein CNV mit einer hohen Frequenz in der Population hat sehr wahrscheinlich keinen


41

kausalen Zusammenhang mit dem Phänotyp des Patienten. Die Datenbank DECIPHER hingegen

ermöglicht einen Abgleich der Daten mit denen von anderen Patienten. Im Optimalfall sind auch

klinische Informationen und das Ergebnis einer parentalen Analyse hinterlegt. CNVs in nicht

kodierenden Bereichen wurden noch mit dem ECR Browser betrachtet. Hierbei werden die

Genome von sequenzierten Genomen verschiedener Spezies auf konservierte Region hin

analysiert und diese grafisch dargestellt. Evolutionär konservierte Bereiche sind häufig ein Indiz

für Regulatorregionen. Zusätzlich wurden alle analysierten Patientenproben untereinander

verglichen und so häufig auftretende Aberrationen als klinisch nicht relevant eingestuft.

2.3.4 Quantitative Echtzeit-PCR

Die Validierung und die Analyse der Segregation von Array-CGH Ergebnissen erfolgte durch

quantitative Echtzeit-PCR (qPCR). Hierbei kann durch DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe die

Menge der entstehenden PCR-Produkte quantitativ bestimmt werden. Mit jedem

Amplifikationszyklus nimmt die detektierbare Fluoreszenz proportional zur Menge der PCR-

Produkte zu. Es wird ein Schwellenwert für das Fluoreszenzsignal festgelegt, dessen Erreichung

abhängig ist von der eingesetzten DNA-Menge. Liegt eine Duplikation vor, so wird dieser Wert

schneller, bei einer Deletion langsamer erreicht als bei der Referenz-DNA. Somit lassen sich

Kopienzahlveränderungen durch qPCR nachweisen. Des Weiteren wurde qPCR auch zur

Expressionsanalyse von MEGF8 in peripherem Blut verwendet.

Für jede Kopienzahlveränderung wurden Primerpaare erstellt, die sowohl innerhalb als auch

außerhalb der mit Array-CGH detektierten Aberration lagen. Für das Primerdesign wurde das

Online Programm Primer3Plus (UNTERGASSER et al. 2012) mit folgenden Einstellungen

verwendet: Produktgröße: 80-90 bp, Primerlänge: 18-22 bp, Schmelztemperatur: 58-62°C, und

maximale Mononukleotidwiederholung: 3. Die Überprüfung der Primer auf ihre Individualität

innerhalb des humanen Genoms erfolgte durch die BLAST Funktion des Genombrowsers

Ensembl. Zusätzlich wurde für die endogene Kontrolle ein Primerpaar für das autosomale

Haushaltsgen Albumin (ALB) erstellt. Des Weiteren diente ein Amplikon in dem X-

chromosomalen Gen Faktor VIII (F8) der Kontrolle des Geschlechts. Die Primersequenzen

können dem Anhang A entnommen werden. Als Kalibrator wurde immer weibliche Referenz-

DNA (Agilent) verwendet. Für die Expressionsanalyse wurde RNA aus peripheren Blutproben

isoliert (2.3.2.). In die cDNA Synthese wurden 1,5 µg der RNA in ein 20 µl Reaktionsansatz

eingesetzt (2.3.1.c). Von der cDNA wurden 0,25 µl mit 3,75 µl dH2O versetzt und als Template für

die qPCR Analyse verwendet. Es wurden Primerpaare für MEGF8 und die Haushaltsgene GAPDH

und RPLPO erstellt.

Jedes Primerpaar wurde als Triplikat des folgenden Ansatzes pipettiert:


42

10 µl Ansatz Komponenten 4 µl gDNA [2,5 ng/µl] /cDNA 3 µl ddH2O 2 µl 5x HOT FirePol Eva Green Plus

1 µl Primer-Mix [je 3,3 pmol/µl]

qPCR Bedingungen:

Temp. Zeit Zyklen

95°C 15 min

95°C 15 s

40x 60°C 20 s

72°C 20 s

Die Messung und anschließende Schmelzkurvenbestimmung erfolgte in dem qPCR System ViiA™

7 (Applied Biosystems). Mit Hilfe der Software QuantStudioTM v1.3 (Applied Biosystems) wurde

die relative Quantifizierung (RQ-Werte) mit der ΔΔCt Methode durchgeführt.

2.3.5 Next Generation Sequencing

Die Sequenz des menschlichen Genoms wurde 2003 veröffentlicht. Das Human Genom Project

benötigte 13 Jahre und 3 Milliarden US-Dollar für die vollständige Sequenzierung mit der Sanger

Methode. Die Sequenziertechnik der sogenannten ersten Generation erlaubte lediglich die

Sequenzierung von Einzelfragmenten, sodass am Tag nur ca. 100 kb mit einem Gerät analysiert

werden konnten. Darauffolgende Sequenziertechniken werden unter dem Begriff Next

Generation Sequencing (NGS) zusammengefasst. Im Gegensatz zur Sanger Methodik ermöglichen

NGS Techniken eine massive parallele Sequenzierung von Millionen verschiedener DNA

Fragmenten, sodass eine Sequenzierung des humanen Genoms innerhalb weniger Tage möglich

ist. Im hohen Durchsatz, der gesteigerten Geschwindigkeit und den sich dadurch ergebenen

verringerten Kosten liegen die Vorteile im Vergleich zu Sanger Sequenzierung. Mit den neuen

Techniken ergaben sich viele Anwendungsmöglichkeiten. Neben Exom- und

Genomsequenzierung kann unter anderem auch die Analyse von DNA-Methylierung und RNA

Sequenzierung erfolgen. In dieser Arbeit lag der Fokus jedoch auf dem sogenannten Targeted

Sequencing. Hierbei werden nur bestimmte Zielsequenzen aus dem Genom angereichert und

sequenziert. Es gibt sowohl vorgefertigte Gen Panels zu bestimmten Krankheiten wie

beispielsweise Krebs oder Herzerkrankungen; als auch die Möglichkeit eine eigene Auswahl an

Genen festzulegen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein individuelles Gen Panel für

Kraniosynostose und andere Skelettfehlbildungen erstellt. Die Anreicherungschemikalien für die

Zielsequenzen wurden von den Firmen Illumina und Agilent bezogen. Die anschließende

Sequenzierung erfolgte auf dem MiSeq Sequenziergerät von Illumina. Im Folgenden werden die

Schritte a) Design des Panels, b) Probenanreicherung, c) Sequenzierung auf dem MiSeq und d)

Auswertung der Sequenzierdaten einzeln beschrieben.


43

a) Design Kraniosynostose Panel

Die erste Version des Kraniosynostose Panels wurde mit der Software DesignStudio von

Illumina erstellt. Es umfasst 65 Gene und drei nicht-kodierende Regulatorbereiche. Dabei

handelt es sich sowohl um häufige und seltene Kraniosynostose Gene wie FGFR1-3 oder MEGF8,

als auch um Gene wie SHH und TBX3, die mit anderen Skelettfehlbildungen assoziiert sind.

Zusätzlich wurden Gene aus assoziierten Signalwegen wie z.B. ERK1 oder RALDH1 mit

analysiert. Eine Auflistung der Gene mit Transkriptnummern und OMIM Nummern befindet sich

im Anhang C.1. Die drei Regulatorregionen sind: BMP2 Enhancer (OMIM 112261) assoziiert mit

Brachydaktylie Typ A2, IHH Regulator assoziiert mit Kraniosynostose Typ Philadelphia (OMIM

185900) und ZPA regulatorische Sequenz (ZRS, OMIM 605522) assoziiert mit Polydaktylie.

Nachdem das Anreicherungskit Nextera Rapid Capture für diese Version aufgebraucht war,

wurde das Design des Kranio Panels modifiziert und aktualisiert. Dies erfolgte mit der Software

SureDesign von Agilent. Die zweite Version orientierte sich an der von Twigg und Wilkie

veröffentlichten Kraniosynostose Genliste (TWIGG AND WILKIE 2015). Gene aus assoziierten

Signalwegen wurden durch neue und seltene Kraniosynostose Gene ersetzt, sodass die zweite

Version 67 Gene und die drei Regulatorregionen beinhaltet. Alle Gene sind im Anhang C.2

gelistet. Bei beiden Designs wurden die Sonden für die Zielgene so gewählt, dass UTR-Bereiche,

Exon Sequenzen und ca. 100 bp der Intron Sequenzen angereichert und sequenziert werden.

Zusätzlich sollten alle Sonden überlappen. Die Abdeckung der Zielsequenzen mit Sonden wurde

im UCSC Browser überprüft.

b) Probenanreicherung

Die Anreicherung der Zielsequenzen in der Patienten DNA erfolgte entweder durch das Nextera

Rapid Capture Kit (Illumina) oder durch das SureSelectQXT Kit (Agilent) und wurde jeweils nach

Herstellerangaben ausgeführt. Bei beiden Panel Kits handelt es sich um die gleiche

Anreicherungsmethodik, lediglich die Abfolge der einzelnen Schritte variiert. Für die Erstellung

der DNA-Bibliothek wurden pro Patient jeweils 50 ng gDNA eingesetzt und 12 Patientenproben

parallel angereichert und in einem Lauf sequenziert. Abbildung 2.3 zeigt schematisch den Ablauf

der Anreicherung mit dem Nextera Rapid Capture Kit. Im ersten Schritt wird die gDNA durch

Transposasen zufällig in ca. 300 bp große Fragmente zerschnitten. Dabei erfolgt gleichzeitig eine

Ligation von spezifischen Adapter Sequenzen an beiden Enden der Fragmente (Abb. 2.3 A). Um

das parallele Sequenzieren von 12 Patienten zu ermöglichen, werden über PCR Amplifikation für

jede Patientenprobe individuelle Barcode Sequenzen angefügt (Abb. 2.3 A). In der späteren

Datenanalyse ist dadurch eine Zuordnung der Sequenzen möglich. Nach dem Poolen aller

Proben werden diese in Einzelstränge denaturiert (Abb. 2.3 B) und mit Biotin markierten

Sonden hybridisiert (Abb. 2.3 C). Die Sonden sind in diesem Fall komplementär zu den

Zielsequenzen des Kranio Panels. Über magnetische Streptavidin Beads werden die


44

hybridisierten Regionen herausgefiltert, sodass nach einem Waschschritt und der Elution von

den Beads nur die DNA Fragmente der Zielsequenzen noch vorhanden sind (Abb. 2.3 D). Um die

Anreicherungsspezifität dieser Fragmente zu erhöhen, werden die Schritte C bis E wiederholt.

Anschließend erfolgt eine PCR Amplifikation und Aufreinigung. Die erhaltene DNA-Bibliothek

wird dann denaturiert, auf 8 pM verdünnt, mit 10% PhiX Bibliothek versetzt und anschließend

sequenziert. PhiX dient als Qualitätskontrolle für die Sequenzierung.

Abbildung 2.3: Übersicht über die Anreicherungsschritte des Nextera Rapid Capture Kits (Illumina). A Transposasen schneiden die gDNA zufällig in ca. 300 bp Fragmente und fügen Adaptersequenzen an. Jede Probe wird über PCR mit einem individuellen Barcode versehen. B Die 12 Patientenproben werden gemischt und denaturiert. C Komplementäre Biotin Sonden hybridisieren mit den Zielsequenzen. D Über magnetische Streptavidin Beads werden die Zielfragmente herausgefiltert und anschließend von den Sonden eluiert.

c) Sequenzierung auf dem MiSeq Sequenziergerät

Für die Sequenzierung auf dem MiSeq wurde das MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina) nach Angaben

des Herstellers verwendet. Mit diesen Sequenzierchemikalien können auf dem MiSeq bei einer

Sequenzlänge von 2x 150 bp bis zu 5,1 Gb Sequenzierdaten generiert werden. Innerhalb des

Gerätes gelangt die denaturierte DNA-Bibliothek auf einen Glasobjektträger (engl. Flow Cell).

Dort binden die Adaptersequenzen der DNA Fragmente an komplementäre forward und reverse

Oligos auf der Oberfläche der Flow Cell (Abb. 2.4 A). Es folgt eine klonale Amplifikation der DNA

Fragmente über PCR ähnliche Schritte. Dieses Prinzip der Generierung von Bereichen mit

Index 1 Index 2

P5

P7

A Tagmentierung & Barcoding

gDNATransposom

+

~ 300 bp

PCR Amplifikation

B Denaturierung der DNA Bibliothek

C Hybridisierung mit Zielsonden

D Anreicherung der Zielsequenzen

Biotin-Sonden

Streptavidin Beads


45

identischen Molekülen (engl. cluster) auf der Flow Cell wird Brücken Amplifikation (engl. bridge-

amplification) genannt (Abb. 2.4 B-E).

Abbildung 2.4: Prinzip der Cluster Generierung. A Die angereicherten Zielsequenzen binden über Adapter an komplementäre Oligos an die Oberfläche der Flow Cell. B Die freien Enden der DNA Fragmente können nun ebenfalls an benachbarte Oligos binden, sodass ein DNA-Bogen bzw. -Brücke entsteht. C Es folgt die Synthese des komplementären Strangs. Dieser Schritt wird Brücken Amplifikation genannt. D Durch ein Denaturierungsschritt liegen erneut Einzelsträngige Fragmente vor. E Schritte B-D werden so oft wiederholt bis Bereiche mit identischen Molekülen generiert wurden.

Die anschließende Sequenzierung erfolgt nach dem Sequencing-by-Synthesis Prinzip. Hier

kommen reversible Terminator-dNTPs zum Einsatz. Jede der vier DNA Basen ist mit einem

anderen Fluoreszenzmolekül markiert. Das Fluoreszenzsignal des eingebauten Nukleotids wird

detektiert und anschließend das Fluoreszenzmolekül und die Terminatorgruppe abgespalten,

sodass im darauffolgenden Zyklus das nächste Nukleotid eingebaut werden kann. Im Folgenden

wird für die bei der Sequenzierreaktion entstehenden DNA Abschnitte die englische

Bezeichnung Reads verwendet. Das DNA Fragment wird von beiden Seiten sequenziert (engl.

paired-end). Diese Methode erzeugt zwar kürzere Reads (100-250 bp), allerdings werden

dadurch Sequenzierfehler reduziert und sorgt damit für genauere Daten.

d) Datenanalyse und Varianten Klassifizierung

Das Alignment der Sequenzierdaten mit dem humanen Referenzgenom (GRCh37/hg19) erfolgte

entweder mit der Software MiSeq Reporter (Illumina) auf dem Sequenziergerät oder der

Software GensearchNGS (Phenosystems). Im MiSeq Reporter wurden die Voreinstellungen für

das Alignment verwendet, in GensearchNGS wurde die erlaubte Fehlerrate auf 6 und die

maximale indel-Länge auf 12 gesetzt. Die Variantenfilterung erfolgte in allen Fällen mit

GensearchNGS. Folgende Einstellungen zur Variantenidentifikation werden als Standardfilter

bezeichnet: Abdeckung der Variante > 5 Reads, Balance aus forward und reverse Reads für die

Variante > 0, Allelhäufigkeit (engl. minor allele frequency; MAF) ≤ 1%, Exondistanz ≤ 25 bp und

Ausschluss von Varianten in der 5‘ und 3‘UTR. Die erhaltenen Varianten wurden mit der

Populationsdatenbank Exome Aggregation Consortium (ExAC), der dbSNP Datenbank sowie den

Mutationsdatenbanken Human Gene Mutation Database (HGMD®) und ClinVar abgeglichen.

Eine Bewertung von nicht-synonymen Varianten (engl. missense) erfolgte mit den

Vorhersageprogrammen SIFT, MutationTaster und PolyPhen-2. Varianten, die kanonische

BA C D E


46

Spleißstellen betreffen, wurden mit der Spleißvorhersage Funktion der Software Alamut und

den Programmen Fruitfly und HBond analysiert. Aufgrund der aufgeführten Analysen wurden

die Varianten nach den ACMG Richtlinien und IARC Empfehlungen klassifiziert (PLON et al. 2008;

RICHARDS et al. 2015): Klasse I = benigne, Klasse II = wahrscheinlich benigne, Klasse III =

Variante mit unklarer Relevanz, Klasse IV = wahrscheinlich pathogene Variante und Klasse V =

pathogene Variante. In wenigen Fällen wurde die CNV Analysefunktion von GensearchNGS

verwendet, um Hinweise auf Deletionen oder Duplikationen zu erhalten. Hierbei wird die

durchschnittliche Abdeckung der Zielsequenzen des jeweiligen Patienten mit der von mehreren

anderen Patienten innerhalb des gleichen Laufs verglichen.

2.3.6 in-situ Hybridisierung

Eine Methode zum Nachweis von spezifischen Nukleinsäuren (RNA oder DNA) in Geweben,

Zellen oder auf Chromosomen ist die in-situ Hybridisierung (ISH). Hierbei hybridisiert eine

komplementäre Sonde (RNA oder DNA), die beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder

Digoxigenin (DIG) markiert ist, mit der spezifischen Nukleinsäure. Im Rahmen dieser Arbeit

wurde diese Methode angewandt um Genexpressionsmuster von möglichen

Kraniosynostosegenen im Tiermodel Danio rerio zu untersuchen. Des Weiteren wurde

Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) zur Bestätigung von Array-CGH Ergebnissen und zur

strukturellen Analyse der chromosomalen Aberrationen genutzt.

a) ISH auf Danio rerio Embryonen

Hybridisierungspuffer 25 ml Formamid; 12,5 ml 20x SSC; 250 µl 20% Tween-20; 150 µl Heparin [50 mg/ml]; 250 mg Torula RNA; auf 50 ml mit ddH2O auffüllen PBST 5,8 g NaCl; 145 mg KCl; 1 g Na2HPO4∙2H2O; 150 mg KH2PO4; 5 ml 20% Tween-20;

auf 1 l mit ddH2O auffüllen und steril filtrieren 20x SSC 175,3 g NaCl; 88,2 g Tris-Na-Citrat-Dihydrat; auf 1 l mit ddH2O auffüllen 2x SSCT 10 ml 20x SSC; 500 µl 20% Tween-20; auf 100 ml mit ddH2O auffüllen Färbepuffer 1 ml 5 M NaCl; 5 ml 1 M Tris-Cl (pH 9,5); 250 µl 20% Tween-20; auf 50 ml mit ddH2O auffüllen

Zur Analyse der Genexpressionsmuster der Gene fgf10a und huwe1 in Zebrafisch Embryonen

wurden zunächst die spezifischen komplementären RNA Sonden, sogenannte antisense

Riboproben, hergestellt. Als Negativkontrolle wurden auch sense Riboproben erstellt. Hierfür

wurden ca. 300-500 bp große Abschnitte der jeweiligen kodierenden Sequenz nach dem

Standardprotokoll der Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, siehe 2.2.1 a) amplifiziert. Die


47

Primer Sequenzen können dem Anhang A entnommen werden. Als Template wurde Zebrafisch

cDNA aus einem Stadienmix verwendet. Die erhaltenen PCR Produkte wurden aufgereinigt und

anschließend eine Addition von Adenin Überhängen an beide Enden der PCR Produkte mit der

Mango Taq Polymerase (Bioline) nach folgendem Ansatz durchgeführt.

50 µl Ansatz Komponenten 20 µl PCR Produkt 10 µl 5x Puffer Mango 1,5 µl 50 mM MgCl2 1 µl 10 mM ddATP 0,5 µl Mango Taq Polymerase 17 µl ddH2O

Die Ansätze wurden für 20 min bei 72°C inkubiert. Mit dem TA-Cloning Kit (Thermo Fisher

Scientific) wurden die PCR Produkte nach Herstellerangaben in das PCRII Plasmid eingebracht.

Die Kontrolle der Sequenz und der Orientierung innerhalb des Plasmids erfolgte durch

Sequenzierung mit den M13fwd und M13rev Primern (Anhang A). Die Vektorkarten der

Konstrukte befinden sich im Anhang G. Die pCRII Plasmide wurden für die Herstellung der

antisense bzw. sense Sonden jeweils mit den Restriktionsenzymen HindIII bzw. EcoRV (NEB)

linearisiert. Die Plasmide wurden anschließend aufgereinigt und als Template für die in vitro

Transkription der Riboproben durch die RNA Polymerasen Sp6 und T7 verwendet. Die fgf10a

Sonden wurden mit DIG (Roche), die huwe1 Sonden mit Fluorescein (FLU, Roche) markiert.

20 µl Ansatz Komponenten 1 µg linearisiertes Plasmid 2 µl DIG/FLU RNA labeling Mix 0,5 µl RNase Inhibitor 2 µl 10x Transkriptionspuffer 1 µl RNA Polymerase (Sp6/T7) auf 20 µl ddH2O

Die Ansätze wurden für 2 h bei 37°C inkubiert bevor zu jedem Ansatz 1 µl RQ DNase zum Verdau

des Templates hinzugegeben wurde. Die Reaktion wurde für 30 min bei 37°C inkubiert und die

RNA Sonden anschließend mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) aufgereinigt und in 50 µl

Reinstwasser eluiert. Die Qualität der Sonden wurde durch Gelelektrophorese kontrolliert.

Danach wurden die Riboproben mit 100 µl Hybridisierungspuffer gemischt und bei -20°C

gelagert.

Die nac-/-tra-/- Zebrafisch Embryonen wurden dechorionisiert, mit 4% Paraformaldeyd (PFA)

über Nacht fixiert und bei -20°C in 100% Methanol gelagert. Vor der Verwendung für eine ISH

müssen diese über eine Methanol/PBST-Reihe (75%; 50%; 25%) jeweils 5 min rehydriert und

abschließend zweimal in steril filtriertem (s.f.) PBST gewaschen werden. Damit die RNA Sonden

in das Gewebe eindringen können, erfolgte ein Verdau mit Proteinase K (Stocklösung

[10 mg/ml]; verwendet 5 µl in 2 ml PBST) für 24 hpf Embryonen für 4 min und für 48 bzw.


48

52 hpf Embryonen für 8 min bei RT. Durch zweimaliges Waschen mit 1x Glycerin wurde der

Verdau gestoppt. Die Embryonen wurden mit 4% PFA für 20 min fixiert und anschließend 5x für

je 5 min mit s.f. PBST gewaschen. Zur Vorbereitung auf die Hybridisierung wurden diese danach

in 1 ml Hybridisierungspuffer bei 65°C im Wasserbad für 1 h inkubiert. Währenddessen wurden

die RNA Sonden 1:100 mit Hybridisierungspuffer verdünnt und für 10 min bei 80°C erhitzt. Nach

der Vorinkubation der Embryonen wurde der Puffer durch 500 µl der Sonden Verdünnung

ausgetauscht und über Nacht bei 65°C im Wasserbad hybridisiert. Am nächsten Tag wurde die

Hybridisierungslösung abgenommen und die Embryonen durch folgenden Schritte bei 65°C

gewaschen: zweimal 30 min in 50% Formamid/2x SSCT, 30 min in 2x SSCT und zweimal 30 min

in 0,2x SSCT. Abschließend wurden sie in PBST aufgenommen und für 1 min bei RT inkubiert.

Mit 5% Schafserum in PBST erfolgte das Blocken für 1 h auf dem Schüttler bei RT. Zur

Probendetektion wurde die Lösung durch 400 µl einer anti-DIG bzw. anti-FLU Fab-Fragment

Verdünnung (1:3000) ersetzt. Die Antikörper Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C auf dem

Schüttler. Nach Abnahme des Antikörpers folgten sechs Waschschritte mit PBST für jeweils 20

min und zweimaliges Waschen mit dem Färbepuffer für je 5 min bei RT auf dem Schüttler. Die

Embryonen wurden mit einer NBT/BCIP-Färbelösung (1 ml Färbepuffer + 20 µl NBT/BCIP) für

bis zu 24 h unter Lichtausschluss bei RT gefärbt. Die Färbung wurde durch mehrmaliges

Waschen mit PBST gestoppt. Die Aufnahmen der gefärbten Embryonen erfolgten an einem

Stereomikroskop. Anschließend wurden die Embryonen in 100% Methanol bei -20°C gelagert.

b) FISH auf humanen Metaphasechromosomen

Pepsin-Lösung 40 ml 0,01 N HCl; 40 µl 10%ige Stocklösung 20x SSC 175,3 g NaCl; 88,2 g Tris-Na-Citrat-Dihydrat; auf 1 l mit ddH2O auffüllen und pH 7,0 einstellen 4% Formaldehyd-Lösung 4,32 ml 37% Formaldehyd; 190 mg MgCl2; auf 40 ml mit 1x DPBS auffüllen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde FISH auf humane Metaphasechromosomen angewandt, um die

durch Array-CGH detektierten chromosomalen Aberrationen zu bestätigen und strukturell zu

analysieren. Das Anlegen und die Aufarbeitung der Blutkulturen wurde von der zytogenetischen

Diagnostik des humangenetischen Instituts durchgeführt. Die aufgearbeitete Lösung von in

Methanol:Eisessig (3:1) fixierten Patienten-Zellen wurde für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.

Diese Suspension wurde anschließend mit einer Glaspipette auf einen eiskalten und mit

Propanol/Salzsäure vorbehandelten Objektträger aufgetropft und luftgetrocknet. Dann folgte

ein zweiminütiger Waschschritt in 2x SSC bei 37°C. Um die Zugänglichkeit der Sonden an die

Chromosomen zu verbessern, wurde ein Verdau der chromosomalen Proteine in einer

Pepsinlösung für 10 min bei 37°C durchgeführt. Dieser wurde durch Inkubation des

Objektträgers in 1x DPBS (PAN-Biotech) für 5 min bei RT gestoppt. Die Nachfixierung erfolgte 5


49

min in einer 4% Formaldehydlösung bei RT. Der Objektträger wurde dann 5 min in PBS

gewaschen und in einer Ethanolreihe (70%; 85%; 100%; jeweils 1 min) dehydriert und

anschließend luftgetrocknet. Die folgende Denaturierung der Hybridisierungssonden und der

Chromosomen unterschied sich je nach verwendeter Sonde. Für die 5q und 8q Subtelomer-

Sonden (Kreatech) wurde je 1 µl Sonde mit 8 µl Hybridisierungspuffer gemischt und für 10 min

bei 90°C denaturiert. Für die entsprechenden Objektträger erfolgte die Denaturierung für 2,5

min in 70% Formamid/PBS bei 72°C mit anschließender Ethanolreihe (70%; 85%; 100%;

jeweils 1 min). Nach der Lufttrocknung wurde die Hybridisierungslösung auf den Objektträger

pipettiert und mit einem Deckglas und Fixogum (Marabu) luftdicht verschlossen. Für die

Hybridisierung mit den Sonden des TeloMark Mix 02 (CytoCell) und 17q (Kreatech) wurden 3 µl

des Sondenmix mit 1 µl der 17q Subtelomer-Sonde gemischt. Die Sondenmischung und der

Objektträger wurden 5 min auf einer Heizplatte bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde die

Hybridisierungslösung auf den Objektträger pipettiert, mit einem Deckglas und Fixogum

luftdicht verschlossen und für 2 min bei 75°C auf einer Heizplatte denaturiert. Die Objektträger

wurden über Nacht bei 37°C in einer feuchten Kammer hybridisiert. Am darauffolgenden Tag

wurde das Deckglas entfernt und der Objektträger gewaschen: 2 min in 0,4x SSC 72°C und 30 sec

in 2x SSC/0,05% Tween-20. Auf den Objektträger wurden 20 μl Vectashield® mit DAPI

pipettiert, mit einem Deckglas eingedeckt und 10 min bei 4°C entwickelt. Die Auswertung

erfolgte an einem Fluoreszenzmikroskop.

2.3.7 Mikroinjektion von mRNA in Danio rerio Embryonen

Die durch Array-CGH detektieren Duplikationen können viele Gene betreffen und zu einer

Überexpression dieser Gene führen. Dies wiederum kann dann zu dem Phänotyp des Patienten

führen. Eine Möglichkeit um den potentiellen Effekt einer Überexpression eines Kandidatengens

zu untersuchen ist die Injektion von in vitro erstellter mRNA in die erste Zelle des Zebrafisch

Embryos. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dies mit dem Gen FGF10 durchgeführt.

a) Herstellung der fgf10a RNA

Für die Erstellung der mRNA wurde zunächst die kodierende Sequenz des Zebrafisch Orthologs

fgf10a nach dem Standardprotokoll der Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB, siehe 2.2.1 a)

amplifiziert. Die Primer Sequenzen können dem Anhang A entnommen werden. Als Template

wurde Zebrafisch cDNA aus einem Stadienmix verwendet. Die erhaltenen PCR Produkte wurden

aufgereinigt und anschließend Adenin Überhänge wie unter 2.3.5 a) beschrieben angefügt. Mit

dem TA-Cloning Kit (Thermo Fisher Scientific) wurden die PCR Produkte nach

Herstellerangaben in das pCRII Plasmid zwischenkloniert. Das erhaltene pCRII Konstrukt sowie

der Zielvektor pCS2 (Addgene) wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI (NEB) verdaut. Das

erhaltene fgf10a-Fragment wurde über Gelelektrophorese mit dem GenEluteTM Gel Extraction Kit


50

(Sigma-Aldrich) aufgereinigt. Der geschnittene pCS2 Vektor wurde dephosphoryliert,

aufgereinigt und anschließend mit dem fgf10a-Fragment ligiert. Die Orientierung und Sequenz

der entstandenen Vektoren wurden durch Sequenzierung mit den Primern Sp6 und M13rev

kontrolliert. Die Vektorkarten befinden sich im Anhang G. Das pCS2_fgf10a Plasmid wurde mit

dem Restriktionsenzym NotI (NEB) linearisiert und als Template für die in vitro mRNA Synthese

eingesetzt. Die in vitro Transkription wurde mit dem mMESSAGE mMACHINE Sp6 Kit

(Invitrogen) nach folgendem Ansatz durchgeführt:

20 µl Ansatz Komponenten 1 µg linearisiertes Plasmid 2 µl 10x Reaktionspuffer 10 µl 2x NTP-Mix 2 µl RNA Polymerase Sp6 auf 20 µl ddH2O

Die Reaktion wurde für 2 h bei 37°C inkubiert. Zum Verdau der Template DNA wurde danach

1 µl DNase hinzugegeben und für 15 min bei 37°C inkubiert. Die gecappte mRNA wurde mit dem

RNeasy Mini Kit (Qiagen) aufgereinigt und in 50 µl Reinstwasser eluiert. Die Qualität wurde

durch Gelelektrophorese kontrolliert und die Konzentration nanophotometrisch bestimmt.

b) Mikroinjektion der RNA

Die Injektionslösung bestand aus der erstellten mRNA, Phenol-Rot und Fluorescein-

Isothiocyanat (FITC)-Dextran. Phenol-Rot (Roth) diente hierbei der optischen Kontrolle der

injizierten Menge. FITC-Dextran (Sigma-Aldrich) ist ein fluoreszierender Farbstoff, der es

ermöglicht nach der Injektion zu kontrollieren, ob die Lösung von der Zelle aufgenommen

wurde. Die Konzentration der mRNA in der Lösung betrug 100 ng/µl.

10 µl Ansatz Komponenten 2,5 µl mRNA [40 ng/µl] 0,5 µl Phenol-Rot [3% in H2O] 0,5 µl FITC-Dextran [20 mg/ml] 6,5 µl ddH2O

Die Mikroinjektionen wurden nach den Beschreibungen von Stuart und Westerfield

durchgeführt (STUART et al. 1988; WESTERFIELD 1995). Mit Hilfe eines Mikromanipulators wurde

die Lösung über eine dünne Injektionsnadel in nac-/-/tra-/- Zebrafisch Embryonen, die sich im 1-

Zell-Stadium befanden, injiziert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die Injektion in die erste

Zelle oder direkt unter dieser erfolgte. Unter einem Fluoreszenzmikroskop konnte durch das

injizierte FITC-Dextran nach ein paar Stunden der Erfolg der Injektion kontrolliert werden und

Embryonen, die die Lösung nicht aufgenommen haben, aussortiert werden. Die Entwicklung der

Embryonen sowie nicht-injizierter Kontrollen erfolgte bei 28°C. Morphologische

Untersuchungen und Dokumentation dieser erfolgte durch ein Stereomikroskop zu den

Zeitpunkten 24 h, 48 h und 72 h.

3. ERGEBNISSE

51

3. ERGEBNISSE

Durch Array-CGH und das Kranio NGS Genpanel wurden 83 gDNA Proben von Kraniosynostose

Patienten analysiert. Sofern eine mögliche genetische Ursache identifiziert werden konnte,

wurde in den meisten Fällen eine Validierung mit einer anderen Methode oder funktionelle

Analysen durchgeführt. Für ein Teilprojekt wurde eine weitere Kohorte bestehend aus 96

Patienten erstellt, die eine vorzeitige Fusion der Frontal- und/oder Sagittalnaht zeigten. Bei

diesen wurde eine Sanger Sequenzierung des SMAD6 Gens sowie eines intergenischen

Einzelnuleotid Polymorphismus (engl. single nucleotide polymorphism, SNP) 345 kb von dem Gen

BMP2 entfernt (BMP2 Risikoallel) durchgeführt.

3.1 Array-CGH Analysen

Von den 83 Kraniosynostose Patienten der Kohorte wurde die gDNA von 33 Patienten zunächst

durch Array-CGH auf chromosomale Veränderungen untersucht. Hierbei handelt es sich um 13

Patienten mit isolierter Kraniosynostose und 20 Patienten mit syndromaler Kraniosynostose.

Tabelle 3.1 gibt einen Überblick über die gefundenen und als (potentiell) pathogen eingestuften

Aberrationen. Im Folgenden werden die einzelnen Fälle genauer vorgestellt.

Tabelle 3.1: Übersicht der Patienten mit (potentiell) pathogenen chromosomalen Veränderungen

Patienten ID

Kraniosynostose weitere klinische

Auffälligkeiten Array-CGH Ergebnis

CRA_1/_2 koronar - Del 15q21.3

CRA_10 sagittal + Dup 5p15.1-p12

CRA_32 koronar, lambda + Del 2q37.3-qter; Dup 5q35.2-5qter

CRA_35 koronar + Dup 2q34-qter; Del 17q25.3

CRA_58 multiple + Dup 5q34-qter; Del 8p23.3-pter

CRA_59 multiple + Del 7q21.13-q21.3

+:ja; -:nein; Del: Deletion; Dup: Duplikation

3.1.1 Verlust 15q21.3

Die Patienten CRA_1 und CRA_2 sind Zwillinge, die beide eine Kraniosynostose aufweisen. An

klinischer Information lag vor, dass bei Patient CRA_2 ein beidseitiger Verschluss der

Koronarnähte bestand und eine Operation durchgeführt wurde. Sein Zwillingsbruder CRA_1 hat

eine unilaterale Koronarnahtsynostose, die nicht operativ korrigiert wurde. Die Eltern zeigen

keine kraniofazialen Auffälligkeiten.

3. ERGEBNISSE

52

Exon 8 und 10 von FGFR2, Exon 7 von FGFR3 und TWIST1 wurden durch das humangenetische

Diagnostiklabor untersucht. Die klassischen Kraniosynostose Syndrome Crouzon Syndrom,

Saethre-Chotzen Syndrom sowie Muenke Syndrom wurden dadurch ausgeschlossen. Im Rahmen

einer TCF12 Sequenzierungsstudie, durchgeführt von I. Köblitz, wurde bei den Zwillingen eine

homozygote Variante (c.5A>G, p.Y2C) mit unklarer Signifikanz detektiert. Die Veränderung

betrifft das alternative, verkürzte Transkript NM_207040. Eine Segregationsanalyse zur

weiteren Bewertung der Variante wurde durchgeführt (Abb. 3.1). Die Mutter zeigte an dieser

Position die wildtypische Sequenz homozygot, der Vater war heterozygot c.5A>G. Die

homozygote Variante der Zwillinge ließ sich durch die Segregationsanalyse nicht erklären. Ein

Mutationsereignis an identischer Stelle als Keimbahnmosaik bei der Mutter oder eine Deletion

auf dem maternalen Allel wären die möglichen Erklärungen.

Abbildung 3.1: Stammbaum und Segregationsanalyse der Familie CRA_1/_2. Unter jedem Familienmitglied ist das jeweilige Elektropherogramm aus der Sequenzierung des sogenannten alternativen Exon 9A des TCF12 Transkripts NM_207040 dargestellt. Die Position c.5 ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die Zwillinge sind homozygot und der Vater heterozygot für die Variante c.5A>G. Die Mutter zeigt die wildtypische Sequenz.

Daraufhin wurden die Brüder in die Kraniosynostose Kohorte aufgenommen und mit der gDNA

von Patient CRA_1 eine Array-CGH durchgeführt. Als klinisch relevante Aberration wurde eine

ca. 183 kb Deletion auf Chromosom 15 eingestuft (Abb. 3.2 A, [arr[hg19] 15q21.3(57,414,955-

57,601,502)x1]). Diese heterozygote Deletion betrifft die Exons 6-21 des TCF12 Gens (Abb. 3.2 A

rechts) und erklärt so die homozygot erscheinende Variante. Die Datenbank DECIPHER ergab 12

Patienten, die überlappende Deletionen für diesen DNA-Abschnitt besitzen. Alle Deletionen sind

als potentiell pathogen eingestuft, heterozygot und deutlich größer (>500 kb) als die von Patient

CRA_1 (Anhang E).

c.5A>G homozygot

wtc.5A>G heterozygot

c.5A>G homozygot

3. ERGEBNISSE

53

Abbildung 3.2: Array-CGH Profil und qPCR Ergebnis der Patienten CRA_1 und CRA_2. A Log2ratio Profil von Chromosom 15. Eine ca. 183 kb große, heterozygote Verlust (roter Balken), der teilweise das Gen TCF12 (schwarzer Pfeil) betrifft, wurde detektiert. B Auswertung der qPCR. Die Amplikons A und E liegen außerhalb der Aberration, Amplikons B, C und D innerhalb. Das Amplikon F8 dient der Kontrolle des Geschlechts. Die erhaltenen Ct-Werte wurden mit der endogenen Kontrolle ALB verrechnet und zur weiblichen Kontroll-DNA (female) ins Verhältnis gesetzt. Die erhaltenen RQ-Werte sind logarithmisch als Balkendiagramm mit Standardabweichung dargestellt. Eine Reduktion der Kopienzahl für die Amplikons B, C und D liegt bei den Patienten CRA_1 und CRA_2 (Index_1 und Index_2) sowie der Mutter vor. Der Vater zeigt für diesen Bereich eine normale Kopienzahl.

Validierung

Um die exakte Größe der Deletion bei Patient CRA_1 zu bestimmen, wurde von I. Köblitz eine

Bruchpunktbestimmung mittels PCR und Sequenzierung durchgeführt. Die Deletion ist 193 kb

groß (GRCh37/hg19; chr15:57.413.085-57.606.267) und betrifft Exon 6 bis 21 von TCF12

(NM_207037.1). Zur Bestätigung der detektierten Deletion in den Zwillingen wurde eine qPCR

durchgeführt. Gleichzeitig wurden auch die gDNAs der Eltern analysiert, um zu untersuchen, ob

Del

etio

n

Chr15 15q21.3

TC

F1

2

A

B

3. ERGEBNISSE

54

die Deletion de novo entstanden ist oder vererbt wurde. Hierfür wurden die Primerpaare A und

E als Kontrollprimer außerhalb der Deletion gewählt. Die Amplikons B, C und D liegen innerhalb

des deletierten Abschnitts (Primer Sequ. Anhang A). Für die endogene Kontrolle wurde ein

Amplikon für das Haushaltsgen ALB und für die Kontrolle des Geschlechts das Primerpaar F8 für

das X-chromosomale Gen Faktor VIII (F8) verwendet. Die Auswertung zeigt bei den Zwillingen

(Index_1 und Index_2) für die Amplikons B, C und D eindeutig eine Reduktion in der Kopienzahl

im Verhältnis zur weiblichen Kontroll-DNA (female) und bestätigt die durch Array-CGH

detektierte heterozygote Deletion (Abb. 3.2 B). Bei der Mutter zeigt sich für diese Amplikons

ebenfalls eine Reduktion, beim Vater jedoch eine normale Kopienzahl (Abb. 3.2 B). Dies lässt den

Schluss zu, dass die Deletion über die Mutter an die Zwillinge vererbt wurde.

3.1.2 Zugewinn 5p15.1-p12

Eine vorzeitige Fusion der sagittalen Schädelnaht wurde bei Patient CRA_10 im Alter von drei

Monaten festgestellt und anschließend chirurgisch behandelt. Eine hohe Stirn, Hypertelorismus,

ein breiter Nasenrücken, Strabismus sowie ein dysplastisches, tief-sitzendes und rotiertes

rechtes Ohr sind weitere kraniofaziale Auffälligkeiten. In seiner sprachlichen und

psychomotorischen Entwicklung zeigte er sich leicht verzögert. Im Alter von 17 Jahren wurden

zusätzlich noch Astigmatismus, überstreckbare Finger, muskuläre Hypotonie, leichtes Pectus

carinatum, leichte Skoliose, Hyperlordose, Spondylarthose sowie Osteoporose festgestellt. Bei

ihm liegt eine Lernschwäche vor. Seine Eltern und seine Schwester haben keine bekannten

klinischen Auffälligkeiten (Abb. 3.2).

Abbildung 3.3: Stammbaum der Familie von Patient CRA_10 (II-2).

Vor der Aufnahme in die Kraniosynostose-Kohorte wurden Exon 5 von FGFR1, Exon 8 und 10

von FGFR2 sowie Exon 7 von FGFR3 der Patienten gDNA durch das humangenetische

Diagnostiklabor analysiert und ein klassisches FGFR assoziiertes Kraniosynostose Syndrom

ausgeschlossen. Innerhalb des Forschungsprojekts wurde dann eine Array-CGH Analyse

durchgeführt. Nach Bewertung aller detektierter Kopienzahlveränderungen wurde ein

Zugewinn auf Chromosom 5 als klinisch relevant eingestuft. Die 13,1 Mb große Duplikation von

5p15.1-p13.3 betrifft 7 Gene (Abb. 3.4 A). Bei genauer Betrachtung des Arrayprofils von 5p fällt

3. ERGEBNISSE

55

auf, dass das Profil in der proximal gelegenen Region bis zum Zentromer erhöht bleibt (Abb. 3.4

A links). Dies lässt vermuten, dass der Zugewinn größer sein könnte, als mit der

Analyseeinstellung log2ratio = 0,29 detektierbar ist. Für eine erneute Analyse wurden die

Kriterien auf log2ratio = 0,15 und Proben = 100 gesetzt. Durch Erhöhung der Probenanzahl auf

100 wurde verhindert, dass zu viele, klinisch irrelevante Aberrationen gelistet wurden. Die

erneute Auswertung führte zu der Detektion einer proximal vergrößerten Duplikation auf dem

p-Arm von Chromosom 5 (Abb. 3.4 B, [arr[hg19] 5p15.1p13.3(17,686,734-30,849,372)x3,

5p13.3p12(31,414,788-46,100,000)x~2-3]). Die insgesamt 28,4 Mb große Duplikation umfasst

über 130 Gene, unter anderem FGF10.

Abbildung 3.4: Array-CGH Profil von Chromosom 5 des Patienten CRA_10. A Profil mit Standardeinstellungen log2ratio = 0,29 und Proben = 5. Ein 13,1 Mb großer Zugewinn von 5p15.1-p13.3 (blauer Balken) wurde als klinisch relevant eingestuft. Bei genauer Betrachtung des Profils des 5p-Arms (linkes Panel) ist auffällig, dass das log2ratio Profil proximal der detektieren Duplikation nicht auf einen Nullwert zurückfällt. B Profil mit Analyseeinstellungen log2ratio = 0,15 und Proben = 100. Durch die geänderten Analyse-Kriterien wurde ein deutlich größerer Zugewinn (28,4 Mb), der bis zum Zentromer reicht, detektiert. Die Position des FGF10 Gens auf Chromosom 5 ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.

In der Datenbank DECIPHER sind 15 Patienten mit teilweise überlappenden 5p Trisomien ohne

weitere klinisch relevante Aberration gelistet (Anhang E). Eine Analyse durch FISH zur

Validierung und zur Untersuchung der strukturellen Anordnung der Duplikation, sowie die

Analyse der Eltern war, aus Mangel an entsprechenden Blutproben nicht möglich. Aufgrund

dessen wurden zu FGF10 weitere Analysen im Modellorganismus Zebrafisch durchgeführt (siehe

3.4.2).

Du

pli

kat

ion

Chr5 5p15.1-p13.3 5p15.1-p12

FGF10

log2ratio:0,29 log2ratio:0,15log2ratio:0,29

BA

3. ERGEBNISSE

56

3.1.3 Verlust 2q37.3-qter und Zugewinn 5q35.2-qter

Patientin CRA_32 hat eine Kraniosynostose der Koronarnaht unilateral und der Lambdanaht, die

im ersten Lebensjahr chirurgisch korrigiert wurde. Zusätzliche Auffälligkeiten sind

Mikrozephalie, Plagiozephalie, Strabismus, breite Daumen, muskuläre Hypotonie und

überstreckbare Gelenke. Kraniofazial zeigt sie milde Ptosis, nach außen abfallende Lidachsen,

eine spitze Nase, ein flaches Philtrum, einen kleinen Mund mit einer dünnen Oberlippe sowie

kleine, weit auseinander stehende Zähne. Ihre mentale und sprachliche Entwicklung ist

verzögert. Ihre nicht miteinander verwandten Eltern und ihre Zwillingsschwester sind gesund

(Abb. 3.5).

Abbildung 3.5: Stammbaum der Familie von Patientin CRA_32 (II-1).

Vor der Aufnahme in die Kraniosynostose-Kohorte wurden Sequenzierungen von FGFR3 (nur

Exon 7), TWIST1 und TCF12 durch das Diagnostiklabor des Instituts durchgeführt und zeigten

wildtypische Sequenzen. Aufgrund der vielen zusätzlichen klinischen Merkmale wurde die gDNA

mittels Array-CGH analysiert. Die Auswertung des Array Profils ergab zwei klinisch relevante

Aberrationen. Ein 1,55 Mb großer, heterozygoter Verlust an genetischem Material von 2q37.3-

qter, der 32 Gene umfasst und ein 7,85 Mb großer Zugewinn von 5q35.2-5qter (Abb. 3.6;

[arr[hg19] 2q37.3(241,476,655-243,038,331)x1, 5q35.2q35.3(172,856,313-180,712,263)x3]).

Mehr als 100 Gene sind von dem Zugewinn betroffen, darunter auch das mit Kraniosynostose

assoziierte Gen MSX2. Ein Abgleich mit der Patienten-Datenbank DECIPHER ergab 56 Patienten,

die überlappende 2q Monosomien besitzen. Diese sind jedoch meist deutlich größer (>3 Mb)

und bei 22 Patienten liegt der Verlust gemeinsam mit einer weiteren chromosomalen

Veränderung vor (Anhang E). Bei keinem Patienten jedoch ist zusätzlich ein Zugewinn auf

Chromosom 5 vorhanden. Ein Vergleich partiellen Trisomie von Patientin CRA_32 mit der

DECIPHER Datenbank ergab 50 Patienten mit überlappenden Trisomien, die jedoch größtenteils

deutlich kleiner (<1 Mb) als der hier detektierte Zugewinn sind (Anhang E). Bei 7 dieser

Patienten liegt ein Zugewinn des MSX2 Gens vor (DECIPHER IDs: 282073, 273674, 285499,

280719, 282379, 278114, 284051). Aufgrund der bei Patientin CRA_32 vorliegenden

Kombination von zwei terminalen Aberrationen (Zugewinn und Verlust) kann man von einer

unbalancierten Translokation ausgehen. Für eine Bestätigung durch FISH stand keine

entsprechende Blutprobe der Patientin zur Verfügung.

3. ERGEBNISSE

57

Abbildung 3.6: Array-CGH Profil der Chromosomen 2 und 5 der Patientin CRA_32. Das log2ratio Profil zeigt einen 1,55 Mb große, heterozygote Verlust von 2q37.3-qter (roter Balken) sowie eine 7,85 Mb Duplikation von 5q35.2-qter (blauer Balken). Die Position des MSX2 Gens auf Chromosom 5 ist gekennzeichnet.

3.1.4 Zugewinn 2q34-qter und Verlust 17q25.3

Die Geburtsmaße von Patientin CRA_35 nach 40 Schwangerschaftswochen (SSW) lagen bei

3050 g (<25. P.), 53 cm Körpergröße (>50. P.) sowie 33 cm Kopfumfang (>5. P.). Bei ihr liegt der

Verdacht auf einen vorzeitigen Verschluss der linken und teilweise auch der rechten

Koronarnaht vor. Weitere kraniofaziale Auffälligkeiten sind eine prominente Stirn, kleine Ohren

mit ausgeprägtem Relief und einer Vorverlagerung des linken Ohrs, eine dünne Oberlippe,

Retrognathie sowie eine Orbitostenose ohne Mittelgesichtshypoplasie, die zu Exophthalmus

führte. Zusätzlich wurde ein Antitrypsinmangel sowie beidseitig ein Glaukom festgestellt. Eine

Magnetresonanztomographie (MRT) zeigte einen normalen Befund. Der Neugeborenen Hörtest

war auffällig, nach einer Durchführung einer Parazentese im Alter von 2 Jahren ließ sich das

Du

pli

kat

ion

Del

etio

n

Chr2

Chr5

2q37.3-qter

5q35.2-qter

MSX2

3. ERGEBNISSE

58

Hörvermögen jedoch als gut einstufen. Ihre Eltern sowie ihre beiden Geschwister zeigen keine

kraniofazialen Auffälligkeiten (Abb. 3.7 A).

Vom humangenetischen Diagnostiklabor wurden Exon 7 von FGFR3 sowie das Gen TCF12

analysiert und waren ohne Befund. Aufgrund des syndromalen Phänotyps wurde im Rahmen

des Forschungsprojekts eine Array-CGH Analyse der gDNA von Patientin CRA_35 durchgeführt.

Die Auswertung des Array Profils ergab zwei klinisch relevante Aberrationen: ein 29,5 Mb

großer Zugewinn an genetischem Material von 2q34-qter und ein 111 kb großer, heterozygoter

Verlust von 17q25.3-qter (Abb. 3.7 B; [arr[hg19] 2q34q37.2(213,479,146-243,041,364)x3,

17q25.3(80,998,255-81,109,817)x1]). Die Duplikation auf Chromosom 2 betrifft über 200 Gene

und die Deletion auf Chromosom 17 zwei Gene. In der Datenbank DECIPHER sind für den

Bereich der 2q Duplikation Einträge mit überlappenden Duplikationen gelistet, allerdings sind

die meisten deutlich kleiner (<10 Mb) und haben andere zusätzlich, potentiell pathogene

chromosomale Aberrationen (Anhang E). Ein Abgleich der Datenbank mit der 17q25.3

Monosomie ergab überlappende Monosomien, die jedoch deutlich größer als 111 kb und

hauptsächlich mit Intelligenzminderung assoziiert sind (Anhang E). Innerhalb der Datenbank

wies nur die Patientin 265082 ähnliche Aberrationen wie Patientin CRA_35 auf. Bei Patientin

265082 liegt ein 11,2 Mb Zugewinn von 2q37.1-q37.3 (GRCh37/hg19; chr2:231.783.632-

243.007.359, 165 Gene) und ein 334 kb Verlust von 17q25.3 (GRCh37/hg19; chr17:80.695.764-

81.029.941, vier Gene) vor. Diese Bereiche überschneiden sich teilweise mit den bei Patientin

CRA_35 detektierten Aberrationen (Abb. 3.7 B). Des Weiteren wurde ein 442,7 kb Verlust von

7q31.32-q31.33 (GRCh37/hg19; chr7:123.627.320-124.070.096) vermerkt.

Validierung

Die Kombination der terminalen, chromosomalen Veränderungen lässt eine unbalancierte

Translokation vermuten. Daher wurde zur Validierung der detektierten Aberrationen eine FISH

auf Metaphase Chromosomen der Patientin CRA_35 durchgeführt. Für das Chromosom 2 wurde

der Sondenmix TeloMark 2 (Aquarius CytoCell, 2p grünes Signal, 2q rotes Signal, Xq/Yq orange

und grünes Signal, DXZ1 weißes Signal) und für Chromosom 17 eine 17pter Subtelomer Sonde

(Kreatech, grünes und rotes Signal) verwendet. Durch diese Sonden Kombination konnte gezeigt

werden, dass das duplizierte genetische Material von 2q auf 17q lokalisiert ist (Abb. 3.7 C). Dies

bestätigt die Annahme, dass bei Patientin CRA_35 eine unbalancierte Translokation zwischen 2q

und 17q [t[2;17)] vorliegt. Eine Analyse der parentalen Chromosomen war mangels der dafür

benötigten Blutproben nicht möglich.

3. ERGEBNISSE

59

Abbildung 3.7: Stammbaum und Ergebnisse von Patientin CRA_35. A Stammbaum der Familie. Patientin CRA_35 (II-3) ist die einzige Betroffene in der Familie. B Array-CGH Profile der Chromosomen 2 und 17. Das log2ratio Profil zeigt eine 29,5 Mb Duplikation von 2q34-qter (blauer Balken) sowie eine 111 kb heterozygote Deletion von 17q25.3-qter (roter Balken). Vergrößerungen der Aberrationen sind jeweils rechts dargestellt. C FISH Analyse an Metaphase Chromosomen von Patientin CRA_35. Die Hybridisierung mit dem Sondenmix für Chromosom 2 (2p grünes Signal, 2q rotes Signal) und das X Chromosom (weißes und orange-grünes Signal) sowie mit der Subtelomer Sonde 17p (grünes und rotes Signal) ergab, dass der Zugewinn von 2q auf Chromosom 17q lokalisiert ist (siehe Pfeil).

3.1.5 Zugewinn 5q34-qter und Verlust 8p23.3-pter

Bereits pränatale Ultraschalluntersuchungen zeigten einen Kleeblattschädel bei Patientin

CRA_58. Nach der Geburt wurden neben einer Pansynostose noch ein Hydrozephalus,

Mittelgesichtshypoplasie, Exophthalmus, Antepositio ani sowie Klitoromegalie beschrieben. Ein

MRT ergab zusätzlich eine Chiari Malformation Typ II mit Syringomyelie sowie Corpus callosum

Agenesie. In ihren ersten beiden Lebensjahren waren mehrere Operationen wie osteoclastische

Trepanationen, das Platzieren eines ventriculo-pleuralen Shunts, Laminectomie und occipitale

Kranioektomie notwendig. Im Alter von 2 Jahren liegen ihr Gewicht, Körpergröße und

Kopfumfang bei 8.270 g (<3. P.), 72 cm (<3. P.) und 42 cm (<3. P.). Kraniofaziale Auffälligkeiten

sind Epikanthus, Lagophthalmus, ein hoher Gaumen und tief-sitzende Augen. Ihre allgemeine

Entwicklung ist verzögert. Ihre nicht miteinander verwandten Eltern und ihre beiden

Schwestern zeigen keine Auffälligkeiten (Abb. 3.8 A).

Del

etio

nD

up

lik

atio

n

Chr2

Chr17

2q34-qter

17q25.3-qter

BA

C

3. ERGEBNISSE

60

Aufgrund des syndromalen Phänotyps wurde eine Array-CGH Analyse der gDNA von Patientin

CRA_58 durchgeführt. Zuvor fanden keine molekulargenetischen Analysen durch das

humangenetische Diagnostiklabor statt. Es wurden zwei Aberrationen mit klinischer Relevanz

detektiert (Abb. 3.8 B, [arr[hg19] 5q34q35.3(166,722,274-180,712,263)x3,

8p23.3p23.2(161,472-4,239,792)x1]).

Abbildung 3.8: Stammbaum, Array-CGH Analyse und FISH von Patientin CRA_58. A Stammbaum der Familie. Patientin CRA_58 (II-3) ist die einzige Betroffene in der Familie. B Array-CGH log2ratio Profile der Chromosomen 5 und 8. Das Profil von Chromosom 5 zeigt eine 14 Mb Duplikation von 5q34-qter (blauer Balken). Eine Vergrößerung dieses Bereichs sowie die Position des Gens MSX2 ist auf der rechten Seite dargestellt. Eine 4 Mb große, heterozygote Deletion (roter Balken) wurde auf Chromosom 8 detektiert. C FISH Analyse an Metaphase Chromosomen. Die Aufnahme zeigt beispielhaft eine Metaphase, die mit den Subtelomer Sonden 5q (rotes Fluoreszenzsignal) und 8q (grünes Fluoreszenzsignal) hybridisiert wurde. Der Pfeil kennzeichnet das zusätzliche rote Fluoreszenzsignal auf Chromosom 8.

Der 14 Mb große, terminale Zugewinn auf dem q-Arm des Chromosoms 5 betrifft über 100 Gene,

unter anderem das Kraniosynostose Gen MSX2 (Abb. 3.8 B oben). Bei der zweiten Aberration

handelt es sich um ein 4 Mb großen, heterozygoten Verlust auf dem p-Arm des Chromosoms 8

(Abb. 3.8 B unten). Von der terminalen Deletion sind 16 Gene betroffen. Ein Abgleich mit der

Datenbank DECIPHER ergab keinen Patienten, der die gleiche Kombination an chromosomalen

Veränderungen aufweist. Für die 5q34-qter Trisomie waren 35 Patienten gelistet, die partiell

überlappende Trisomien aufweisen, die als pathogen oder mit unklarer Signifikanz eingestuft

A B

C

Du

pli

kat

ion

chr5 5q34-qter

chr8 8p23.2-pter

Del

etio

n

MSX2

3. ERGEBNISSE

61

wurden. Hierbei sind es, wie bei Patientin CRA_32, 7 Patienten, bei denen MSX2 innerhalb des

Zugewinns liegt (DECIPER IDs: 282073, 273674, 285499, 280719, 282379, 278114, 284051).

Die 8p23.3-pter Monosomie überlappt mit meist größeren Deletionen von 70 Patienten, von

denen 48 noch zusätzliche chromosomale Aberrationen aufweisen (Anhang E).

Validierung

Die detektierten terminalen Aberrationen deuten auf eine unbalancierte Translokation hin. Da

die Array-CGH keine Information über die strukturelle Veränderung gibt, wurde eine FISH an

Metaphase Chromosomen der Patientin durchgeführt. Es wurden Kreatech Subtelomer Sonden

für 5q (rotes Fluoreszenzsignal) und 8q (grünes Fluoreszenzsignal) verwendet. Mit dieser

Sonden Kombination kann zwar nicht der Verlust auf 8p nachgewiesen werden, allerdings ist es

so möglich zu zeigen, dass das duplizierte Material dort lokalisiert ist. Abbildung 3.8 C zeigt, dass

drei Signale der 5q Sonde vorliegen sowie, dass das zusätzliche Signal auf Chromosom 8

vorhanden ist. Dies bestätigt das Array-CGH Ergebnis und die Annahme, dass bei der Patientin

CRA_58 eine unbalancierte Translokation vorliegt. Eine Untersuchung der Eltern auf eine

balancierte Translokation war nicht möglich, da hierfür keine entsprechenden Blutproben zur

Verfügung standen.

3.1.6 Verlust 7q21.13-q21.3

Bei Patient CRA_59 sind die Sagittal-, Frontal- sowie die Koronarnähte vorzeitig fusioniert, was

klinisch zu einem Oxyzephalus mit lateral vorgezogener Orbita und verminderter

Stirnüberdachung führt. Im Alter von 10 Monaten waren seine Körpermaße: Gewicht 7650 g (3.-

10. P.), Körpergröße 68 cm (<3. P.) und Kopfumfang 43,5 cm (<3. P.). In diesem Alter erfolgte

eine Kraniektomie sowie ein frontoorbitales Advancement mit frontaler Remodellierung. Er

zeigt eine leichte Sprach- und Entwicklungsverzögerung. Seine Eltern zeigen keine

kraniofazialen Auffälligkeiten (Abb. 3.9). Die Mutter war zum Zeitpunkt der Analyse des Index

Patienten schwanger. Informationen zu diesem Kind liegen nicht vor.

Abbildung 3.9: Stammbaum der Familie von Patient CRA_59 (II-1).

3. ERGEBNISSE

62

Es fanden keine molekulargenetischen Voruntersuchungen durch das Diagnostiklabor statt. Die

gDNA des Patienten wurde im Rahmen des Forschungsprojekts durch Array-CGH analysiert. Das

Array-CGH Profil ergab eine heterozygote, möglicherweise pathogene Kopienzahlveränderung

auf Chromosom 7. Die 3,7 Mb große interstitielle Deletion von 7q21.13-q21.3 umfasst ca. 30

Gene (Abb. 3.10 A; [arr[hg19] 7q21.13-q21.3(90,673,226-94,370,074)x1]). Ein Abgleich mit der

DECIPHER Datenbank ergab einen Fall (DECIPER ID: 251554) mit einer ähnlich großen Deletion

(3,4 Mb) an dieser Position. Darüber hinaus sind 9 weitere Patienten gelistet, die teilweise

überlappende Deletionen aufweisen, die FZD1 betreffen, (DECIPER IDs: 321, 806, 811, 854, 855,

4100, 285920, 306535 und 315074; Anhang E). Die meisten dieser Deletionen sind größer als

10 Mb.

Validierung

Zur Bestätigung der heterozygoten Deletion erfolgte eine Analyse der gDNA von Patient CRA_59

durch qPCR. Parallel wurde die gDNA der Eltern analysiert, um zu überprüfen, ob die Aberration

de novo entstanden ist oder von einem Elternteil vererbt wurde. Hierfür wurden Primer für

Amplikons in drei Genen (7q_B: FZD1, 7q_C: PEX1,7q_D: COL1A2), die innerhalb der Deletion

liegen, sowie für zwei Kontrollamplikons außerhalb des Deletionsbereichs (7q_A, 7q_E: DLX5)

erstellt (Anhang A). Für die endogene Kontrolle wurde ein Primerpaar für das autosomale

Haushaltsgen ALB und für die Kontrolle des Geschlechts ein Primerpaar für das X-chromosomale

Gen F8 verwendet. Die Auswertung der qPCR von Patient CRA_59 (Index) zeigt bei den

untersuchten Amplikons 7q_B, 7q_C und 7q_D eine reduzierte Kopienzahl im Verhältnis zur

weiblichen Kontroll-DNA (female), wodurch die durch Array-CGH detektierte Deletion validiert

ist (Abb. 3.10 B). Beide Elternteile zeigen für die untersuchten Amplikons eine normale

Kopienzahl (Abb.3.10 B), d.h. die Deletion ist bei Patient CRA_59 de novo entstanden.

3. ERGEBNISSE

63

Abbildung 3.10: Array-CGH Profil und qPCR Ergebnis von Patient CRA_59 und Eltern. A Log2ratio Profil von Chromosom 7. Eine 3,7 Mb große, heterozygote Deletion von 7q21.13-q21.3 wurde detektiert (roter Balken). Das rechte Panel zeigt den deletierten Bereich in Vergrößerung. B Auswertung der qPCR. Die Amplikons 7q_A und 7q_E liegen außerhalb der mit Array-CGH detektierten Aberration, Amplikons 7q_B, 7q_C und 7q_D innerhalb. Das Amplikon F8 dient der Kontrolle des Geschlechts. Die erhaltenen Ct-Werte wurden mit der endogenen Kontrolle Albumin verrechnet und zur weiblichen Kontroll-DNA (female) ins Verhältnis gesetzt. Die erhaltenen RQ-Werte sind logarithmisch als Balkendiagramm mit Standardabweichung dargestellt. Eine Reduktion der Kopienzahl für die Amplikons 7q_B, 7q_C und 7q_D liegt bei Patient CRA_59 (Index) vor. Die Eltern zeigen für diesen Bereich eine normale Kopienzahl.

Del

etio

n

Chr7 7q21.13-q21.3A

B

3. ERGEBNISSE

64

3.2 Kraniosynostose NGS Genpanel

Wie in der Einleitung beschrieben, können die Phänotypen von Kraniosynostose Syndromen

überlappen, sodass mitunter ein direkter Rückschluss auf die genetische Ursache über den

Phänotyp nicht möglich ist. Des Weiteren kommen z.B. für Koronarnaht Synostosen mehrere

Gene in Frage. Dies hat meist zur Folge, dass in der humangenetischen Diagnostik mehrere Gene

separat analysiert werden müssen, was sehr zeitintensiv sein kann. Ein hilfreiches

diagnostisches Tool ist hierbei NGS, das die parallele Sequenzierung von vielen Genen

ermöglicht. Hierfür wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Kranio Panel designt, das 65 bzw. 67

Gene umfasst (siehe 2.3.5 a und Anhang C). Ziel war es mit einem diagnostischen Tool auch

große und seltene Kraniosynostose Gene analysieren zu können und gleichzeitig das

Mutationsspektrum in bekannteren Genen zu erweitern. Im Rahmen dieses Projekts wurde die

erste Version, nach Verbrauch der Reagenzien, modifiziert und aktualisiert. Beide erstellten

Kranio Panel Versionen wurden durch die Sequenzierung von Patientenproben mit bekannten

Mutationen validiert (Tabelle 3.2).

Tabelle 3.2: Verwendete NGS Kontrollproben

Panel Version 1

Kontroll ID Gen Mutation detektiert

K1 TCF12 c.5A>G1, p.Y2C + Deletion

K2 EFNB1 c.339G>C, p.K113N

K3 FGFR1 c.848C>G, p.P283R

K4 FGFR2 c.940-2A>G


Panel Version 2

Kontroll ID Gen Mutation detektiert

K1 TCF12 c.5A>G1, p.Y2C + Deletion


K7 MEGF8 c.828G>A, p.P276P

K8 TWIST1 c.524_537del, p.C175Sfs*58

1 TCF12 Transkript NM_207040

Alle Mutationen der Kontrollproben konnten mit den Standardfiltereinstellungen identifiziert

werden. Bei Probe K1 handelt es sich um die gDNA von Patient CRA_1. Wie unter 3.1.1

beschrieben weist dieser Patient zum einen eine Variante im alternativen Transkript von TCF12

(NM_207040) auf und zum anderen eine Deletion, die unter anderem Exon 6 bis Exon 21 von

TCF12 (NM_207037.1) betrifft. Diese Patientenprobe wurde verwendet, um zu analysieren, ob

3. ERGEBNISSE

65

und wie sich Kopienzahlveränderungen durch die generierten NGS Daten darstellen lassen. Die

Analyse erfolgte über die CNV Analyse Funktion von GensearchNGS. Hierbei wurde die

durchschnittliche Abdeckung der Probe K1 mit der durchschnittlichen Abdeckung von 11

anderen Proben des gleichen Sequenzierlaufs verglichen. Die Analyseeinstellungen wurden

folgendermaßen gesetzt: minimale Differenz: 20%, minimale Abdeckung: 0, minimale

Regionenlänge: 50 bp, und Berechnung aus dem Durchschnitt. Das Ergebnis der Analyse wird

zum einen in Tabellenform (Tabelle 3.3) und zum anderen für jedes Exon der Unterschied der

Abdeckung in einem Boxplot Diagramm dargestellt (Abb. 3.11). Tabelle 3.3 zeigt, dass mit der

CNV Analyse die Deletion, die die kodierenden Exons 6-20 von TCF12 betrifft, nachgewiesen

werden konnte.

Tabelle 3.3: Ergebnis der CNV Analyse für TCF12 mit GensearchNGS

Gen Exon ∅ Abdeck.

Ref. ∅ Abdeck.

K1 x-fache

Änderung Differenz

(%) p-Wert Kategorie

TCF12 6 1467,5 717,2 0,49 -51,13% 3,99E-08 Deletion (het.)



TCF12 9A 838,2 469,1 0,56 -44,03% 1,07E-07 Deletion (het.)













∅ Abdeck. = durchschnittliche Abdeckung; het. = heterozygot; Ref. = 11 verrechnete Proben aus dem gleichen Lauf

3. ERGEBNISSE

66

Abbildung 3.11: Ergebnis des CNV Tools von GensearchNGS für Exon 6 von TCF12. Der Vergleich der durchschnittlichen, normalisierten Abdeckungen von K1 mit 11 anderen Proben des gleichen Laufs für das Exon 6 von TCF12 ist als Boxplot dargestellt. Die Exon 6 Abdeckung von K1 ist um die Hälfte geringer als die von den anderen Proben.

Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit 66 Kraniosynostose Patientenproben mit dem

selbst designten Kranio Panel analysiert. Hierbei wurden Proben sowohl von Patienten mit

isolierter Kraniosynostose als auch mit zusätzlichen klinischen Auffälligkeiten untersucht. Bei 9

Patienten wurden bekannte Kraniosynostose Mutationen identifiziert (Tabelle 3.4). Am

häufigsten wurde die FGFR3 Mutation detektiert, die mit dem Muenke Syndrom assoziiert ist.

Tabelle 3.4: Patienten mit bekannten Kraniosynostose Mutationen

Patienten ID

Kranio-synostose


Gen Mutation Syndrom

CRA_26 + N/A FGFR3 c.749C>G, p.P250R Muenke Syndrom


CRA_54 + N/A FGFR3 c.1172C>A, p.A391E Crouzonodermo-skeletales Syndrom


CRA_62 koronar, lambda

+ FGFR1 c.755C>G, p.P252R Pfeiffer Syndrom Jackson-Weiss Syndrom

CRA_65 + N/A FGFR2 c.1052C>G, p.S351C Pfeiffer Syndrom Antley-Bixler Syndrom


CRA_75 koronar bilateral

+ TWIST1 c.392T>C, p.L131P Saethre-Chotzen Syndrom

CRA_82 koronar + FGFR3 c.749C>G, p.P250R Muenke Syndrom

+: ja; N/A: nicht bekannt

Chr15: 57.458.573-57.458.689; TCF12 Exon 6

K111 Proben des gleichen Laufs

0

1752,1

Ab

dec

ku

ng

(Rea

dan

zah

l)

876

3. ERGEBNISSE

67

Bei 12 Patienten wurden neue bzw. sehr seltene Varianten identifiziert, die möglicherweise

pathogen sind (Tabelle 3.5). Im Folgenden wird der Phänotyp dieser Patienten und die

Auswertung der NGS Daten ausführlicher beschrieben.

Tabelle 3.5: Patienten mit potentiell pathogenen Varianten

Patienten ID Kraniosynostose weitere

Auffälligkeiten Gen Variante

CRA_6 lambda + POR hom. c.902G>A, p.R301H

CRA_14 metopisch, lambda + HUWE1 hem. c.329G>A, p.R110Q1

CRA_18/_19 sagittal + MEGF8 hom. c.828G>A, p.P276P

CRA_29 koronar bilateral + FGFR2 het. c.1150G>A, p.G384R2

CRA_34 sagittal + ERF het. c.151delG, p.D51Tfs*26

CRA_43 metopisch + PTCH1 het. c.3436G>A, p.D1146N

CRA_48 lambda + MSX2 het. c.442C>G, p.P148A

CRA_49 metopisch + MEGF8 het. c.5210C>A, p.S1737*

CRA_56 koronar bilateral - TCF12 het. c.1885C>T, p.Q629*

CRA_64 multiple + TCF12 het. c.825delG, p.S276Vfs*12

CRA_80 koronar + TCF12 het. c.1036-1G>C

+: ja; -: nein; del: Deletion; fs: frameshift, Leserasterverschiebung; hem.: hemizygot; het.: heterozygot; hom.: homo-zygot; *: vorzeitiges Stopcodon, 1: (TAYLOR et al. 2015), 2: (PULLEYN et al. 1996)

3.2.1 Homozygote Missense-Variante in POR - c.902G>A

Bei Patient CRA_6 lag eine vorzeitige Fusion der Lambdanaht vor, was zu einem Turrizephalus

führte. Seine Maße bei Geburt in der 41. SSW lagen bei 3050 g Gewicht (25.-50. P.), 48 cm

Körperlänge (10. P.) und 35 cm Kopfumfang (50. P.). Des Weiteren wurde Hypertelorismus,

Strabismus, eine rechtsseitige Hornhautnarbe, tiefsitzende nach hinten rotierte Ohren sowie

eine muskuläre Hypotonie festgestellt. Ein MRT ergab eine vollständige Agenesie des Corpus

callosum und eine Verbreiterung des dritten Hirnventrikels. Kraniofaziales Advancement

erfolgte im Alter von 6 Monaten und hatte eine teilweise rechtsseitige Hemiparese zur Folge.

Eine Untersuchung im Alter von 15 Jahren ergab folgende Körpermaße: 48 kg Gewicht (10.-25.

P.), 161 cm Körpergröße (3.-10. P.) und 54 cm Kopfumfang (10. P.). Zusätzlich zu den bereits

bekannten Merkmalen wurden als kraniofaziale Auffälligkeiten eine flache Stirn, bogenförmige

Augenbrauen, lateral abfallende Lidachsen und eine angehobene Nasenbodenebene

beschrieben. Hinzu kommt noch ein kurzes Philtrum, eine offene zeltförmige Mundstellung, ein

hoher Gaumen sowie Zahnfehlstellungen. Eine Schwerhörigkeit des linken Ohrs wurde

festgestellt. Der Patient weist zudem eine milde Streckkontraktur der Ellenbogengelenke und

eine Zerebralparese mit ataktischen Bewegungskomponenten auf. Es liegt eine komplexe

3. ERGEBNISSE

68

Entwicklungsverzögerung vor: laufen konnte er mit 7 Jahren, mit 15 Jahren bestand sein

Wortschatz aus drei Wörtern und er hatte Schwierigkeiten selbstständig zu essen. Seine drei

Geschwister und seine Eltern sind gesund. Die Eltern sind konsanguin (3. Grades, Abb. 3.12 A).

Abbildung 3.12: Stammbaum und NGS Ergebnis des Patienten CRA_6. A Stammbaum der Familie. Die Eltern sind konsanguin und Patient CRA_6 (II-3) ist das einzig betroffene Kind. B POR Variantenansicht der Software GensearchNGS. Dargestellt ist sowohl die Referenzsequenz als auch die POR Variante auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.). Einzelne Reads sind als schwarze Balken abgebildet und innerhalb dieser sind Abweichungen von der Referenzsequenz grün markiert. Das untere Diagramm gibt Auskunft über die genomische Position auf Chromosom 7, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante.

Vor der Aufnahme in die Kraniosynostose-Kohorte wurden Exon 5 von FGFR1, Exon 7 und 8 von

FGFR2, Exon 7 von FGFR3 sowie TWIST1 der Patienten gDNA durch das humangenetische

Diagnostiklabor analysiert und klassische Kraniosynostose Syndrome ausgeschlossen. Eine

Array-CGH Analyse durch ein externes Diagnostiklabor ergab einen normalen Befund. Daraufhin

erfolgte die Anreicherung der Zielsequenzen für das Kranio Panel mit dem Nextera Rapid

Capture Kit. Nach der Sequenzierung wurde das Alignment mit der humanen Referenzsequenz

(GRCh37/hg19) durch den MiSeq Reporter durchgeführt. 97,7% der Zielsequenzen waren

mindestens 20x abgedeckt. Exons, die nicht vollständig abgedeckt waren, sind im Anhang D

gelistet. Die lückenhaften Stellen wurden nicht mit Sanger Sequenzierung kontrolliert. Nach

Filterung mit den Standardeinstellungen durch die Software GensearchNGS blieben 8 Varianten

zur weiteren Bewertung übrig. Davon wurden 4 als Sequenzierartefakte und 3 als Klasse I

Varianten eingeordnet. Übrig blieb eine homozygote Variante c.902G>A in Exon 9 des Gens POR

(NM_000941.2, Abb. 3.12 B). Diese verursacht auf Proteinebene einen Aminosäureaustausch von

Arginin 301 nach Histidin (p.R301H). Dieser Variante ist eine rs-Nummer (rs78215318)

zugeordnet, allerdings ist sie in der Populationsdatenbank ExAC nur mit einer geringen

Frequenz (0,002437%) gelistet. Die Vorhersageprogramme MutationTaster, SIFT (score: 0) und

POR c.902G>A, p.R301H

BA

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

3. ERGEBNISSE

69

PolyPhen-2 (score: 0,956) stufen diese Variante einheitlich als möglicherweise pathogen ein. Die

Variante wurde durch Sanger Sequenzierung bestätigt. Eine Analyse der Eltern oder Geschwister

konnte nicht durchgeführt werden, da keine DNA Proben zur Verfügung standen.

3.2.2 Hemizygote Missense-Variante in HUWE1 – c.329G>A

Eine vorzeitige Fusion der Frontal-, Lambda- und Koronarnähte liegt bei Patient CRA_14 vor.

Dies führte zur Ausbildung eines Turrizephalus. Seine Geburt erfolgte in der 36. SSW. Seine

Geburtsmaße waren folgendermaßen: Gewicht 2840 g (50. P.), 48 cm Körperlänge (>30. P.) und

30 cm Kopfumfang (<3. P.). Fazial auffällig waren ein flaches Mittelgesicht, Exophthalmus, nach

unten abfallende Lidachsen, eine breite Nasenwurzel sowie antevertierte Nares. Zudem wurden

ein tiefer Ansatz des rechten Ohres, ein langes Philtrum und ein kleiner Mund mit schmalem

Oberkiefer und hohem Gaumen beschrieben. Des Weiteren wurde eine Hörstörung festgestellt.

Der MRT Scan zeigte keine intrakraniellen Auffälligkeiten. Im Alter von 3 Monaten erfolgte eine

frontoorbitale Remodellierung. Die Eltern des Patienten zeigen keine kraniofaziale

Auffälligkeiten (Abb. 3.13 B).

Durch das humangenetische Diagnostiklabor wurden zuvor Exon 7 von FGFR2, Exon 7 und 8 von

FGFR3 sowie TWIST1 analysiert und waren unauffällig. Eine Array-CGH Analyse durch ein

externes Diagnostiklabor ergab keine klinisch relevanten CNVs. Im Rahmen dieses Projekts

wurde die gDNA des Patienten CRA_14 mit dem Kranio NGS Panel untersucht. Die Anreicherung

erfolgte mit dem SureSelectQXT Kit, die Sequenzierung mit dem MiSeq und der Abgleich mit dem

Referenzgenom (GRCh37/hg19) mit GensearchNGS. Mindestens 20x abgedeckt waren 99,8%

der Zielsequenzen. Eine Auflistung der Lücken befindet sich im Anhang D. Es erfolgte keine

Nachsequenzierung der nicht abgedeckten Stellen.

Die Standardfiltereinstellungen für die anschließende Variantendetektion wurden so verändert,

dass Varianten Balance >5 festgelegt wurde. Dies ergab 26 Varianten, von denen 14 als Artefakte

und 11 als Klasse I Varianten eingestuft wurden. Die hemizygote Variante in Exon 6 des HUWE1

Gens (NM_031407.5) wurde als sehr wahrscheinlich pathogen (Klasse IV) bewertet. Der

Basenaustausch c.329G>A führt zu der Substitution der konservierten Aminosäure Arginin 110

durch Glutamin (p.R110Q) und wird sowohl von MutationTaster, SIFT (score: 0) als auch

PolyPhen-2 (score: 0,998) als krankheitsverursachend eingeordnet. Für diese Variante ist kein

Eintrag in der ExAC Datenbank und keine rs-Nummer vorhanden. Jedoch ist sie bereits als

pathogen in den Datenbanken HGMD (CM155939) und ClinVar (RCV000497788.1) gelistet und

von Taylor et al. im Zusammenhang mit Kraniosynostose beschrieben (TAYLOR et al. 2015). In

ClinVar ist die Variante in Assoziation mit mentaler Retardierung vermerkt, in HGMD mit

Kraniosynostose. Da es sich um ein X chromosomales Gen handelt und der Patient männlich ist,

wurde nur die gDNA der Mutter analysiert. Sie besitzt die wildtypische Sequenz (Abb. 3.13 B).

Die HUWE1 Variante ist folglich de novo bei Patient CRA_14 entstanden.

3. ERGEBNISSE

70

Abbildung 3.13: NGS Ergebnis des Patienten CRA_14 und Sanger Sequenzierung. A HUWE1 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.) ist sowohl die Referenzsequenz als auch die Sequenzänderung dargestellt. Einzelne Reads sind als schwarze Balken abgebildet. Der Basenaustausch ist grün hervorgehoben. Das untere Diagramm gibt Auskunft über die genomische Position auf Chromosom X, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante. B Stammbaum und Sangeranalyse. Die Variante konnte validiert werden. Die Mutter ist wildtypisch an dieser Position, d.h. die Variante ist bei dem Patienten de novo entstanden.

3.2.3 Homozygote Spleißvariante in MEGF8 – c.828G>A

Bei den Patienten CRA_18 und CRA_19 handelt es sich um Brüder und bei beiden liegt eine

syndromale Form der Kraniosynostose vor. Bei dem älteren Bruder CRA_18 resultiert die

Kraniosynostose in einer deutlichen Gesichtsasymmetrie. Hypertelorismus, Epikanthus, eine

breite Nasenwurzel und große, tief-sitzende und revertierte Ohren sind weitere faziale

Auffälligkeiten. An den Händen wurden beidseitig verbreiterte Daumenendglieder, linksseitig

ein bifides Endglied, beidseitige partielle Syndaktylie der Finger II/III und III/IV sowie

Klinodaktylie der kleinen Finger mit vorliegender Brachymesophalangie festgestellt. Beide

Großzehen waren verdoppelt und alle Zehen miteinander verwachsen. Darüber hinaus wurde

ein beidseitiger Hodenhochstand beschrieben. Die Syndaktylien und der Hodenhochstand

wurden operativ korrigiert. Im Alter von 7 Jahren lagen seine Körpermaße bei 128,8 cm

Körpergröße (>90. P.), Gewicht 29,5 kg (>90. P.) und 51,8 cm Kopfumfang (25.-50. P.).

Fehlstellungen des Kniegelenks und der Fußgelenke wurden chirurgisch korrigiert. Es zeigte

sich eine psychomotorische und feinmotorische Störung bei muskulärer Hypotonie sowie eine

sprachliche Entwicklungsstörung. Des Weiteren besteht der Verdacht auf Dihydropyrimidin-

Dehydrogenase-Mangel bei erhöhter Konzentration von Thymin und Uracil im Urin. Allerdings

BA

HUWE1 c.329G>A, p.R110Q

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

c.329G>A

wt

3. ERGEBNISSE

71

wurde eine Mutation im ursächlichen DPD Gen ausgeschlossen. Ein MRT Scan zeigte eine

Auffälligkeit im Bereich von Corpus pinealis und bedarf noch weiterer Abklärung.

Der jüngere Bruder CRA_19 wurde in der 36. SSW geboren und hatte bei Geburt folgende

Körpermaße: 51 cm Körperlänge (>70. P.), Gewicht 4300 g (>97. P.), 36 cm Kopfumfang

(>90. P.). Es lag eine muskuläre Hypotonie vor. Die Operation der Sagittalnahtsynostose erfolgte

im Alter von 5 Monaten. Faziale Auffälligkeiten wurden nicht im Detail beschrieben, einzig tief-

sitzende und revertierte Ohren wurden vermerkt. Wie auch sein Bruder hatte Patient CRA_19

Auffälligkeiten der Extremitäten. Beide Hände hatten verbreiterte Daumenendglieder,

Syndaktylie der Finger I/II und Kamptodaktylie der Zeigefinger. Die Füße hatten die gleiche

Synpolydaktylie, wie sein Bruder. Diese Auffälligkeiten wurden ebenfalls chirurgisch korrigiert.

Auch bei ihm liegt ein beidseitiger Hodenhochstand vor. Im Alter von 2,5 Jahren zeigte er eine

altersentsprechende Entwicklung. Die Eltern der Geschwister sind konsanguin (Abb. 3.14 C).

Aufgrund der phänotypischen Ähnlichkeit zum Carpenter Syndrom wurde vom

humangenetischen Diagnostiklabor das Gen RAB23 sequenziert. Dies zeigte nur die wildtypische

Sequenz. Daraufhin erfolgte die Aufnahme in die Kraniosynostose Kohorte. Aufgrund des

syndromalen Phänotyps wurde zunächst eine Array-CGH Analyse mit der gDNA von Patient

CRA_18 durchgeführt. Diese ergab keine klinisch relevanten CNVs, sodass mit der gDNA der

Geschwister eine Anreicherung mit dem Nextera Rapid Capture Kit für das Kranio Panel erfolgte.

Die Sequenzierung und das anschließende Alignment wurde auf dem MiSeq durchgeführt. Von

den Zielsequenzen waren bei beiden 98% mindestens 20x abgedeckt. Im Anhang D sind die

nicht vollständig abgedeckten Exons aufgeführt. Eine Nachsequenzierung der lückenhaften

Stellen erfolgte nicht. Aufgrund des konsanguinen Stammbaums der Familie wurde zusätzlich zu

den Standardvariantenfiltern nach homozygoten Varianten gefiltert, die in beiden Datensets

enthalten sind. Übrig blieben zwei Varianten im Gen MEGF8, die die Geschwister gemeinsam

haben. Sowohl Variante 1 in Exon 5 (c.828G>A, NM_001410) als auch Variante 2 in Exon 42

(c.7713G>A, NM_001271938) bewirken keine Änderung auf Proteinebene (p.P276P; p.P2571P).

Variante 2 betrifft allerdings nur das seltenere Transkript NM_001271938. Beide Varianten

wurden mit der Populationsdatenbank ExAC abgeglichen und mit der Spleißvorhersage

Funktion der Software Alamut analysiert. Variante 2 besitzt eine rs-Nummer (rs200748447)

und eine MAF von 0,0136% (ExAC). Der Basenaustausch führt zu keiner Änderung von

Spleißstellen, sodass diese als Klasse I eingestuft wurde. Variante 1 tritt noch seltener in der

Bevölkerung auf (0,0008129% ExAC). Die Spleißvorhersage von Alamut zeigt einen möglichen

Verlust des Spleißdonors von Exon 5 an (Abb. 3.14 B).

3. ERGEBNISSE

72

Abbildung 3.14: NGS Ergebnis der Patienten CRA_18 und CRA_19, Spleißvorhersage und Segregationsanalyse. A MEGF8 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Dargestellt ist die Referenzsequenz und die MEGF8 Variante 1 auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.). Schwarze Balken stellen die einzelnen Reads dar. Abweichungen von der Referenzsequenz sind grün markiert. Die genomische Position auf Chromosom 19, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante können dem Diagramm entnommen werden. B Ansicht der Spleißvorhersage in der Software Alamut. Der obere Bereich zeigt die Vorhersage für die Referenzsequenz, unten für die veränderte Sequenz. Variante 1 führt dazu, dass die Spleißdonorstelle von Exon 5 schwächer eingestuft oder nicht mehr erkannt wird (blaue Balken). C Segregationsanalyse in der Familie. Die Eltern (I-1, I-2) sind konsanguin. Die Sanger Sequenzierung bestätigt die homozygote Variante 1 in MEGF8 bei den Brüdern (II-1, II-2), bei den Eltern liegt die Variante heterozygot vor.

c.828 G>Aheterozygot

c.828 G>Aheterozygot

c.828 G>Ahomozygot

c.828 G>Ahomozygot

A

C

B

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

MEGF8 c.828G>A, p.P276P

Spleißvorhersage

3. ERGEBNISSE

73

Die wildtypische und die veränderte Spleißdonorsequenzen (wt: CCG/GUAUGGAC, var:

CCA/GUAUGGAC) wurden zusätzlich noch mit den Spleißvorhersage Programmen Fruitfly und

HBond untersucht. Es wird die Bindung der U1snRNA mit der potentiellen 5‘Spleißstelle

bewertet. Für die Konsensussequenz eines Spleißdonors (kon: CAG/GUAAGUAU) liegt der Wert

von Fruitfly bei 1,0 und von HBond bei 23,8. Die wildtypische 5‘Spleißstelle von Exon 5 wurde

mit 0,98 bzw. 12,10 bewertet. Die veränderte Sequenz führte bei der Fruitfly Analyse dazu, dass

kein Spleißdonor mehr erkannt wurde und HBond bewertete die veränderte Sequenz mit 8,90.

Diese Ergebnisse unterstützen die Vorhersage der in Alamut verwendeten Programme, dass der

Basenaustausch c.828G>A dazu führt, dass der Spleißdonor möglicherweise schlechter oder gar

nicht vom Spleißosom erkannt wird. Es folgte eine Segregationsanalyse in der Familie für

Variante 1, die zum einen den Basenaustausch bei den Brüdern bestätigte und zum anderen

zeigte, dass die gesunden Eltern heterozygot für diese Variante sind (Abb. 3.14 C). Die NGS Daten

der Brüder wurden auch auf gemeinsame heterozygote Varianten der Klasse III-V hin analysiert,

und ergaben kein Ergebnis. Aufgrund aller Daten wurde die Variante 1 in MEGF8 als Klasse IV

Variante eingestuft. Um zu untersuchen welche Auswirkung die Sequenzänderung auf das

Spleißen hat, wurde ein in vitro Spleißtest mit einem Minigen-Konstrukt durchgeführt (siehe

3.4.1 a).

3.2.4 Heterozygote Missense-Variante in FGFR2 – c.1150G>A

Beide Koronarnähte waren bei Patient CRA_29 von einer vorzeitigen Fusion betroffen. Dies

führte zu einer Brachyturrizephalie. Pränatal wurde bereits ein Hydrozephalus festgestellt. Ein

MRT ergab folgende Befunde: Hydrozephalus internus mit Balkenhypoplasie, abnorme

Gyrierung im Bereich des Corpus callosum, Erweiterung der externen Liquorräume sowie ein

Tiefstand der Kleinhirntonsillen. Mit 5 ½ Jahren besaß er folgende Körpermaße: 105 cm

Körpergröße (<3. P.), Gewicht 13 kg (<3. P.) und 47 cm Kopfumfang (<3. P.). Nach einer

kraniofazialen Operation in seinem ersten Lebensjahr lag noch eine mäßige Brachyturrizephalie

vor. Zudem war eine hohe Stirn, eine eingezogene Nasenwurzel, ein flaches Mittelgesicht, milder

Exophthalmus sowie eine vorstehende Unterlippe klinisch auffällig. Hände und Füße des

Patienten CRA_29 zeigen keine Auffälligkeiten. Seine motorische und sprachliche Entwicklung

ist verzögert, zudem zeigt er Verhaltensauffälligkeiten. Bei ihm liegt eine muskuläre Hypotonie

vor. Innerhalb der Familie gibt es weitere Betroffene mit kraniofazialen Auffälligkeiten. Bei

Mutter sowie Großmutter des Patienten liegen Brachyzephalie, ein eingesunkenes Mittelgesicht

und sehr kurze Daumen vor. Eine Kraniosynostose ist jedoch nicht beschrieben. Der Vater zeigt

keine kraniofazialen Auffälligkeiten (Abb. 3.15 B).

3. ERGEBNISSE

74

Abbildung 3.15: NGS Ergebnis des Patienten CRA_29 und Segregationsanalyse. A FGFR2 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Dargestellt ist sowohl die Referenzsequenz als auch die veränderte Sequenz auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.). Einzelne Reads sind als schwarze Balken abgebildet, in denen das veränderte Nukleotid grün markiert ist. Die genomische Position auf Chromosom 10, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante sind im Diagramm dargestellt. B Segregationsanalyse für FGFR2 c.1150G>A. Die Mutter zeigt kraniofaziale Auffälligkeiten, jedoch weisen die Eltern die wildtypische Sequenz auf. Die Variante ist bei Patient CRA_29 de novo entstanden.

Aufgrund des im Ultraschall festgestellten Hydrozephalus wurde pränatal ein Karyogramm

erstellt, das unauffällig war. Nach seiner Geburt wurde vom humangenetischen Diagnostiklabor

Exon 7 und 8 von FGFR2, Exon 7 und 10 von FGFR3, TWIST1 sowie TCF12 analysiert und waren

ohne Befund. Damit wurden die häufigsten genetischen Ursachen für Kraniosynostose

ausgeschlossen. Daraufhin wurde die Patienten gDNA mit dem Nextera Rapid Capture Kit

angereichert, auf dem MiSeq sequenziert und die Sequenzierdaten mit dem Referenzgenom

(GRCh37/hg19) durch den MiSeq Reporter alignt. Mindestens 20x abgedeckt waren 97,2% der

Zielsequenzen. Eine Auflistung der Exons, die nicht vollständig abgedeckt sind, befindet sich im

Anhang D. Die lückenhaften Stellen wurden nicht durch Sanger Sequenzierung kontrolliert. Die

Standardvariantenfilter in GensearchNGS ergaben 15 Varianten, von denen 6 als

Sequenzierartefakte, 8 als Klasse I/II Varianten und eine als Klasse III Variante bewertet

wurden. Die heterozygote Klasse III Variante liegt in dem Gen FGFR2 (c.1150G>A, p.G384R;

NM_000141.4, Abb. 3.15 A). In der Populationsdatenbank ExAC ist sie nicht gelistet. Der Effekt

auf Proteinebene wird von den Programmen SIFT (toleriert, score: 0,08) und PolyPhen-2

(probably damaging, score: 0,937) widersprüchlich bewertet. Von MutationTaster wird sie als

krankheitsverursachend eingestuft, allerdings bezieht sich diese Bewertung hauptsächlich auf

einen HGMD Eintrag (CM960654). Jedoch sind auch in HGMD zwei widersprüchliche

Bewertungen der Variante hinterlegt. So wird sie nach Pulleyn et al. als pathogen und assoziiert

mit unbekannter Kraniosynostose beschrieben (PULLEYN et al. 1996). Aufgrund von

BA

FGFR2 c.1150G>A, p.G384R

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

c.1150G>A

wt wt

3. ERGEBNISSE

75

bioinformatischen Vorhersagen wurde sie dagegen 2013 von Doss et al. als SNP eingestuft (DOSS

et al. 2013). In der ClinVar Datenbank wurde sie 2017 in Assoziation mit Kraniosynostose als

pathogen vermerkt (RCV000525216.1). Diese gegensätzlichen Bewertungen des

Basenaustauschs führten bei Patient CRA_29 zur Einstufung als Klasse III Variante. Die gDNAs

der Eltern wurden durch Sanger Sequenzierung analysiert und zeigen die wildtypische Sequenz

für diese Position (Abb. 3.15 B). Folglich ist der Basenaustausch bei Patient CRA_29 de novo

entstanden.

3.2.5 Heterozygote Frameshift-Variante in ERF – c.151delG

Eine Kraniosynostose der Sagittalnaht führte bei Patientin CRA_34 zu einem Dolichozephalus.

Weitere phänotypische Merkmale sind Hypertelorismus, beidseitiger Exophthalmus, revertierte

Ohren und volle Lippen. Ihre Körpermaße im Alter von 10 Jahren und 7 Monaten waren: 130 cm

Körpergröße (<3. P.), Gewicht 22,9 kg (<3. P.) und 52,2 cm Kopfumfang (25.-50. P.). Mit ihrer

Köpergröße unter der 3. Perzentile ist sie als kleinwüchsig zu bezeichnen. Bei ihr wurde

außerdem eine Lernstörung mit mangelnder Konzentrationsfähigkeit festgestellt. Die jüngere

Schwester der Index Patientin zeigt einen sehr ähnlichen Phänotyp mit Dolichozephalus,

Hypertelorismus, linkseitigem Exophthalmus, Fehlsichtigkeit und etwas breite Großzehen. Im

Alter von 7 Jahren und 5 Monaten ist sie 114,5 cm (<3. P.) groß, 16,8 kg (<3. P.) schwer und hat

einen Kopfumfang von 50,5 cm (10.-25. P.). Die motorische und sprachliche Entwicklung ist bei

ihr leicht verzögert. Wie ihre Schwester hat sie eine Lernstörung mit Konzentrationsproblemen.

Beide Eltern sind als phänotypisch unauffällig beschrieben (Abb. 3.16 B). Innerhalb der

mütterlichen Familie gibt es jedoch noch weitere Personen, die von Exophthalmus betroffen

sind.

Vor der Aufnahme in die Kraniosynostose Kohorte wurden bereits die kodierende Sequenz von

FGFR2 und Exon 7 von FGFR3 durch das Diagnostiklabor ohne Befund sequenziert. Im Rahmen

dieser Arbeit erfolgte die Anreicherung mit dem Nextera Rapid Capture Kit mit anschließender

Sequenzierung und Alignment mit dem Referenzgenom (GRCh37/hg19) auf dem MiSeq. Von den

Zielsequenzen des Kranio Panels waren 97,2% mindestens 20x abgedeckt. Im Anhang D sind die

Exons der Gene gelistet, die nicht vollständig abgedeckt waren. Die Lücken wurden nicht

nachsequenziert. 19 Varianten wurden mit den Standardeinstellungen gefiltert. Als Klasse I

Varianten wurden 9 bewertet und 9 als Artefakte identifiziert. Bei der verbliebenen Variante

handelt es sich um eine heterozygote Nukleotiddeletion in Exon 2 von ERF (c.151delG,

NM_006494, Abb. 3.16 A). Die Deletion hat eine Verschiebung des Leserasters zur Folge, sodass

ein vorzeitiges Stopcodon entsteht (p.D51Tfs*26). Das verkürzte Protein wäre nur 76

Aminosäuren lang anstatt 549. Die Variante wird von MutationTaster als

krankheitsverursachend bewertet. Da bei der Schwester der Patientin ein ähnlicher Phänotyp

vorliegt, wurde eine Segregationsanalyse für diese Variante in der Familie durchgeführt

3. ERGEBNISSE

76

(Abb. 3.16 B). Die Sanger Sequenzierung bestätigte bei Patientin CRA_34 die Deletion. Innerhalb

der Familie weisen die betroffene Schwester sowie der phänotypisch unauffällige Vater die

Variante ebenfalls auf.

Abbildung 3.16: NGS Ergebnis der Patientin CRA_34 (II-1) und Segregationsanalyse. A ERF Variantenansicht der Software GensearchNGS. Auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.) ist sowohl die Referenzsequenz als auch die ERF Variante dargestellt. Einzelne Reads sind als schwarze Balken abgebildet. Grüne Striche in den Reads repräsentieren die Deletion des Nukleotids. Das Diagramm gibt Auskunft über die genomische Position auf Chromosom 19, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante. B Segregationsanalyse für ERF c.151delG. Die betroffenen Schwestern (II-1, II-2) sowie der phänotypisch unauffällige Vater haben die heterozygote Variante. Bei der Mutter liegt die wildtypische Sequenz vor.

3.2.6 Heterozygote Missense-Variante in PTCH1 – c.3436G>A

Eine syndromale Form von Kraniosynostose lag bei Patient CRA_43 vor. Betroffen von der

vorzeitigen Synostose war die Frontalnaht. An beiden Füßen waren die II. und III. Zehe

miteinander verwachsen. Zusätzlich bestand eine Hexadaktylie des rechten Fußes. Weitere

klinische Informationen lagen nicht vor. Soweit bekannt sind die Eltern gesund und nicht

miteinander verwandt. Das Vorhandensein der Muenke Mutation in Exon 7 von FGFR3 wurde

durch das Diagnostiklabor ausgeschlossen. Die Zielsequenzen des Kranio Panels wurden mit

dem Nextera Rapid Capture Kit angereichert. Die Sequenzierung und das Alignment mit der

Referenzsequenz erfolgte mit dem MiSeq. Von den Zielsequenzen waren 96,6% mindestens 20x

abgedeckt. Gene, in denen Lücken vorlagen, sind im Anhang D aufgeführt. Die lückenhaften

Stellen wurden nicht nachsequenziert.

ERF c.151delG, p.D51Tfs*26

A B

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

c.151delG c.151delG

c.151delG wt

3. ERGEBNISSE

77

Abbildung 3.17: NGS Ergebnis und Stammbaum des Patienten CRA_43. A PTCH1 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Dargestellt sind sowohl die Referenzsequenz als auch die veränderte Sequenz auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.) von PTCH1. Einzelne Reads sind als schwarze Balken abgebildet, in denen das veränderte Nukleotid grün markiert ist. Die genomische Position auf Chromosom 9, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante können dem Diagramm entnommen werden. B Stammbaum des Patienten. Der Basenaustausch wurde mit Sanger Sequenzierung bei Patient CRA_43 (II-1) bestätigt.

Die Variantenfilterung ergab 6 Varianten. Von diesen wurde eine Variante als Klasse III

eingestuft, die restlichen in Klasse I/II. Der heterozygote Basenaustausch c.3436G>A liegt in

Exon 20 des Gens PTCH1 (NM_000264.4) und bewirkt eine Substitution der Aminosäure

Asparaginsäure 1146 zu Asparagin (Abb. 3.17 A). Der Veränderung ist eine rs-Nummer

zugeordnet (rs749542089), allerdings ist ihre Frequenz in der Bevölkerung sehr gering

(0,001444% ExAC). Zu der Variante findet sich auch ein Eintrag in der ClinVar Datenbank

(RCV000459818.1). Hier wird sie im Zusammenhang mit Gorlin Syndrom als Klasse III

eingestuft. Die Vorhersageprogramme MutationTaster, SIFT (score: 0,04) und PolyPhen-2 (score:

0,861) bewerten die Substitution als krankheitsverursachend. Eine Analyse der elterlichen

gDNAs war nicht möglich, sodass nicht geklärt werden konnte, ob die Variante vererbt wurde

oder de novo entstanden ist. Die Variante konnte mit Sanger Sequenzierung bei Patient CRA_43

bestätigt werden (Abb. 3.17 B).

3.2.7 Heterozygote Missense-Variante in MSX2 – c.442C>G

In der Familie von Index Patient CRA_48 (II-3) gibt es insgesamt drei Betroffene, die einen sehr

ähnlichen Phänotyp, bestehend aus Kraniosynostose, Sehschwäche und verkürzten distalen

Phalangen der Daumen, zeigen (Abb. 3.18 B). Patient CRA_48 hat eine Kraniosynostose der

Lambdanaht, die nicht operativ korrigiert wurde und zu einem Turrizephalus mit fazialer

BA

PTCH1 c.3436G>A, p.D1146N

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

c.3436G>A

3. ERGEBNISSE

78

Asymmetrie führte. Sein Mittelgesicht ist flach. Die distalen Phalangen seiner Daumen wirken

verkürzt. Röntgenbilder zur Bestätigung lagen jedoch nicht vor. Seine Sehschwäche äußert sich

in Weitsichtigkeit, jedoch in unterschiedlicher Ausprägung bei beiden Augen. Sein Hörvermögen

ist normal. Im Alter von 7 Jahren lagen seine Körpermaße bei: 117,7 cm Körpergröße (10. P.),

Gewicht 21 kg (25. P.) und 48,2 cm Kopfumfang (<3. P.). Ein MRT Scan des Kopfes zeigte eine

Pachygyrie des rechten hemisphären Cortex. Seine sprachliche und motorische Entwicklung war

verzögert. Zudem zeigt er Lernschwierigkeiten.

Bei seiner betroffenen Schwester (II-1) waren die Koronarnähte von der vorzeitigen Fusion

betroffen. Eine Operation erfolgte im Alter von 2 Jahren. Ein Kopf MRT war unauffällig. Ihre

Körpermaße im Alter von 14 Jahren waren: 157,1 cm Körpergröße (<25. P.), Gewicht 62 kg

(>75. P.) und 52 cm Kopfumfang (<3. P.). Kraniofazial auffällig waren bei ihr eine milde

Mikrozephalie, eine hohe Stirn, lateral abfallende Lidachsen sowie tief-sitzende Augen. Bei der

augenärztlichen Untersuchung wurde bei ihr Weitsichtigkeit, Strabismus und Nystagmus

festgestellt. Die distalen Phalangen von Daumen und Großzehen scheinen bei ihr ebenfalls

verkürzt. Ihre Sprachentwicklung war verzögert und es liegt eine Lernschwäche vor.

Eine vorzeitige Fusion der Koronarnähte lag ebenfalls beim Vater (I-1) der beiden Geschwister

vor. Auffällig waren bei ihm eine verknöcherte Foramina frontale, eine hohe Stirn, faziale

Asymmetrie und lateral abfallende Lidachsen. Wie seine Kinder hat er eine Sehschwäche und

verkürzte distale Phalangen der Daumen.

Das dritte Kind (II-2) und die Mutter (I-2) haben weder Kraniosynostose oder andere

kraniofaziale Auffälligkeiten, noch verkürzte distale Phalangen der Daumen. Der Bruder hat

jedoch wie seine betroffenen Geschwister eine Lernschwäche. Die Eltern sind nicht miteinander

verwandt. Der Stammbaum der Familie (Abb. 3.18 B) lässt einen autosomal dominanten

Erbgang vermuten.

Häufige Kraniosynostose Syndrome wurden bei Patient CRA_48 durch das Diagnostiklabor

durch die Sequenzierung der Gene TWIST1, FGFR2 und Exon 7 von FGFR3 ausgeschlossen.

Daraufhin erfolgte die Analyse seiner gDNA durch das NGS Kranio Panel. Angereichert wurden

die Zielsequenzen mit Nextera Rapid Capture, die anschließend auf dem MiSeq sequenziert und

die Sequenzierdaten mit Referenzsequenzen durch den MiSeq Reporter alignt wurden. Von den

Zielsequenzen waren 96,1% mindestens 20x abgedeckt. Die Lücken sind im Anhang D gelistet

und wurden nicht durch Sanger Sequenzierung überprüft. 16 Varianten ergab die

Variantenfilterung mit GensearchNGS, von denen 8 als Sequenzierartefakte identifiziert wurden.

Weitere 7 Varianten wurden als Klasse I bewertet. Der Nukleotidaustausch c.442C>G in Exon 2

von MSX2 (NM_002449.4) hingegen wurde von MutationTaster, SIFT (score: 0,04) sowie

PolyPhen-2 (score: 0,998) als möglicherweise pathogen bewertet. Die konservierte Aminosäure

Prolin 148 wird durch den Basenaustausch zu Alanin (Abb. 3.18 A). Es gibt keinen Eintrag in der

Populationsdatenbank ExAC oder in ClinVar zu dieser Variante. Da der Vater und die Schwester

3. ERGEBNISSE

79

des Patienten CRA_48 einen ähnlichen Phänotyp haben, wurde bei der Familie eine

Segregationsanalyse für die MSX2 Variante durchgeführt (Abb. 3.18 B). Alle betroffenen

Familienmitglieder haben ebenfalls heterozygot die Basensubstitution, der gesunde Bruder (II-

2) hat jedoch die wildtypische Sequenz. Die Variante segregiert innerhalb der Familie mit dem

Phänotyp und wurde von dem Vater an seine beiden betroffenen Kinder vererbt.

Abbildung 3.18: NGS Ergebnis des Patienten CRA_48 (II-3) und Segregationsanalyse. A MSX2 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.) ist sowohl die Referenzsequenz als auch die Änderung in MSX2 (c.442C>G, p.P148A) dargestellt. Einzelne Reads sind als schwarze Balken abgebildet. Der Basenaustausch nach Guanin ist grün hervorgehoben. Das untere Diagramm enthält Informationen über die genomische Position auf Chromosom 5, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante. B Stammbaum und Segregationsanalyse. Die beiden Geschwister II-1 und II-3 und der Vater I-1 sind klinisch betroffen und haben alle die heterozygote Veränderung. Der gesunde Bruder II-2 zeigt die wildtypische Sequenz.

3.2.8 Heterozygote Missense-Variante in MEGF8 – c.5210C>G

Eine syndromale Form von Kraniosynostose besteht bei Patient CRA_49. Neben einer

Trigonozephalie, abfallenden Lidachsen und stark gebogenen Augenbrauen waren besonders

seine Hände und Füße auffällig. Die Finger II-V beider Hände waren von komplexen

Syndaktylien betroffen. Die verdoppelten Daumen waren vollständig mit dem Zeigefinger

verwachsen. Ebenfalls beidseitig lag eine rudimentäre ulnare Kleinfingerdopplung vor. An den

Füßen waren die Großzehen verdoppelt und alle Zehen miteinander verwachsen. Zusätzlich fiel

ein weiter Mamillenabstand, ein Hochstand beider Hoden sowie ein kleiner Penis auf. Seine

beiden älteren Schwestern und die Eltern sind phänotypisch unauffällig.

Vor der Aufnahme in die Kraniosynostose Kohorte wurden verschiedene molekulargenetische

Analysen durchgeführt. Die Syndaktylien an Händen und Füßen ließen eine Typ IV Syndaktylie

BA

MSX2 c.442C>G, p.P148A

c.442C>G

c.442C>G c.442C>Gwt

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

3. ERGEBNISSE

80

oder das Laurin-Sandrow Syndrom vermuten. Ursächlich hierfür sind Kopienzahlveränderungen

in der SHH regulierenden Region ZRS in Intron 5 von LMBR1. Diese Region wurde durch qPCR

und Sanger Sequenzierung analysiert und ergab einen unauffälligen Befund. In Folge wurde das

Gen GLI3 sequenziert. Mutationen in GLI3 sind assoziiert mit Greig Zephalopolysyndaktylie

Syndrom. Patienten mit diesem Syndrom haben Kraniosynostose und Polysyndaktylien. Die

Sequenzierung bei Patient CRA_49 zeigte die wildtypische GLI3 Sequenz. Im Rahmen dieser

Arbeit wurde anschließend eine Array-CGH Analyse durchgeführt, deren Auswertung einen

unauffälligen männlichen Befund ergab. Im nächsten Schritt wurden die Zielsequenzen des

Kranio Panels in der Patienten gDNA durch das SureSelectQXT Kit angereichert, mit dem MiSeq

sequenziert und die Sequenzierdaten mit GensearchNGS mit dem Referenzgenom

(GRCh37/hg19) alignt und ausgewertet. Mindestens 20x abgedeckt waren 99,6% der

Zielsequenzen. Lückenhafte Stellen sind im Anhang D aufgeführt und wurden mit Ausnahme von

Exon 39 in MEGF8, nicht nachsequenziert. Die Filtereinstellungen für die Variantendetektion

wurden so verändert, dass Varianten Balance > 5 festgelegt wurde. Von den 18 Varianten

wurden 8 als Sequenzierartefakte und 9 als Klasse I-II Varianten eingestuft. Der heterozygote

Basenaustausch c.5210C>A in dem Gen MEGF8 (NM_001410) führt zu einem vorzeitigen

Stopcodon in Exon 30, sodass das entstehende Protein nur 1737 AS statt 2779 AS lang wäre

(p.S1737*, Abb. 3.19 A). Diese Variante hat keinen Eintrag in der Populationsdatenbank ExAC

oder dbSNP und wird von MutationTaster als krankheitsverursachend bewertet. In der Literatur

sind bisher keine Fälle mit heterozygoten Mutationen in MEGF8 beschrieben, die mit

Kraniosynostose assoziiert sind (TWIGG et al. 2012). Eine weitere, potentiell pathogene Variante

im kodierenden Bereich von MEGF8 liegt bei Patient CRA_49 allerdings nicht vor. Die CNV

Analysefunktion von GensearchNGS wurde verwendet um einen Hinweis auf eine partielle

Deletion von MEGF8 zu erhalten. Hierbei wurde die durchschnittliche Abdeckung der

Zielsequenzen bei Patient CRA_49 mit der von anderen Patienten verglichen. Es zeigten sich für

MEGF8 jedoch keine Unterschiede, die auf eine Deletion hindeuten könnten. Eine größere

Deletion wurde bereits durch die Array-CGH Analyse ausgeschlossen.

Für die Variante c.5210C>A wurde eine Segregationsanalyse in der Familie durchgeführt. Die

Schwestern des Patienten wurden jedoch nicht getestet. Die Auswertung ergab, dass die

phänotypisch unauffällige Mutter ebenfalls Träger der Variante ist (Abb. 3.19 B). In Folge wurde

untersucht, ob aufgrund des vorzeitigen Stopcodons ein Abbau der mRNA stattfindet und somit

bei Patient und Mutter weniger MEGF8 mRNA vorliegt oder ob trotz gleicher Variante ein

Unterschied in der RNA Menge zwischen beiden besteht. Dies wurde durch qPCR untersucht.

Hierfür wurde mRNA aus frischen peripheren Blutproben der Eltern und des Patienten isoliert

und durch Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben. Für die qPCR wurden Exon

übergreifende Amplikons für Exon 8, Exon 12a und Exon 30 erstellt. Exon 12a ist nur in

Transkript NM_001271938 vorhanden. Für die endogenen Kontrollen wurden Amplikons in den

3. ERGEBNISSE

81

Haushaltsgenen GAPDH und RPLPO verwendet. Die cDNA des Vaters diente als Referenz. Nach

der Auswertung zeigte sich, dass bei Patient CRA_49 und seiner Mutter eine reduzierte Menge an

MEGF8 mRNA im Blut vorhanden ist, es aber zwischen den beiden keinen Unterschied gibt (Abb.

3.19 C). Aufgrund der vorliegenden Daten wird der Basenaustausch als Variante mit unklarer

klinischer Relevanz eingestuft (Klasse III).

Abbildung 3.19: NGS Ergebnis von Patient CRA_49, Segregationsanalyse und MEGF8 Expressionsanalyse. A MEGF8 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Dargestellt sind sowohl die Referenzsequenz als auch die MEGF8 Variante c.5219C>A auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.). Das veränderte Nukleotid ist grün in den einzelnen Reads markiert. Die genomische Position auf Chromosom 19, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante sind im Diagramm dargestellt. B Segregationsanalyse. Die Eltern und beide Schwestern sind gesund. Sequenziert wurden nur die Eltern und Patient CRA_49 (II-3). Die Mutter besitzt den gleichen heterozygoten Basenaustausch wie ihr Sohn. C Expressionsanalyse von MEGF8 in peripherem Blut. Zur Detektion der MEGF8 Transkripte (NM_001410/NM_001271938) wurden drei Amplikons erstellt (Ex8/9, Ex12a, Ex30). Die erhaltenen Ct-Werte wurden mit den endogenen Kontrollen GAPDH und RPLPO verrechnet und zu den Werten des Vaters ins Verhältnis gesetzt. Die erhaltenen RQ Werte sind logarithmisch als Balkendiagramm mit Standardabweichung dargestellt.

BA

MEGF8 c.5210C>A, p.S1737*

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

c.5210C>A

wt c.5210C>A

C

nicht analysiert

nicht analysiert

3. ERGEBNISSE

82

3.2.9 Heterozygote Nonsense-Variante in TCF12 – c.1885C>T

Der Schädel von Patient CRA_56 hatte die Form eines Turribrachyzephalus durch den

vorzeitigen Verschluss beider Koronarnähte. Die Kraniosynostose wurde im Alter von 10

Monaten operiert. Neben einer eingesunkenen Nasenwurzel hat er keine weiteren klinischen

Auffälligkeiten. Seine Eltern sind beide gesund und nicht miteinander verwandt. Durch das

Diagnostiklabor wurden die häufigsten genetischen Ursachen, die mit Koronarnaht

Kraniosynostose assoziiert sind, durch die Sequenzierung der Gene FGFR2, TWIST1 und Exon 7

von FGFR1 und FGFR3 ausgeschlossen. Daraufhin wurde die gDNA des Patienten durch das

Kranio Panel analysiert. Die Anreicherung wurde mit dem Nextera Rapid Capture Kit

durchgeführt. Eine 20x Abdeckung hatten 95,9% der Zielsequenzen. Die Stellen, die Lücken

aufwiesen, wurden nicht zusätzlich mit Sanger Sequenzierung kontrolliert (Anhang D). Die

verwendeten Standardfilter in GensearchNGS ergaben 18 Varianten, von denen nur eine

Variante als Klasse IV bewertet wurde. Eine heterozygote Nukleotidsubstitution (c.1885C>T) in

Exon 19 des Gens TCF12 (NM_207037.1) führt zu einem vorzeitigen Stopcodon (p.Q629*,

Abb. 3.20 A). Die Variante ist nicht in ExAC gelistet und wird von MutationTaster als

krankheitsverursachend eingestuft. Exon 19 wurde auch bei den Eltern des Patienten CRA_56

sequenziert. Die Variante ist bei dem Patienten de novo entstanden (Abb. 3.20 B).

Abbildung 3.20: NGS Ergebnis des Patienten CRA_56 und Segregationsanalyse. A TCF12 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Dargestellt sind sowohl die Referenzsequenz als auch die veränderte Sequenz auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.) von TCF12. Einzelne Reads sind als schwarze Balken abgebildet. Der Basenaustausch C>T ist grün markiert. Im Diagramm ist die genomische Position auf Chromosom 15, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante dargestellt. B Stammbaum und Segregationsanalyse. Der Basenaustausch ist bei Patient CRA_56 (II-1) de novo entstanden.

BA

TCF12 c.1885C>T, p.Q629*

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

c.1885C>T

wt wt

3. ERGEBNISSE

83

3.2.10 Heterozygote Frameshift-Variante in TCF12 – c.825delG

Phänotypisch besonders auffällig war bei Patientin CRA_64 ihr Kleeblattschädel, der durch den

Verschluss mehrerer Schädelnähte entstand. Zusätzlich lag bei ihr eine milde

Mittelgesichtshypoplasie und beidseitiger Exophthalmus vor. Im Alter von 2 Monaten hatte sie

ein Gewicht von 3.800 g (<3. P.), eine Körperlänge von 52 cm (<3. P.) und einen Kopfumfang von

37,7 cm (10.-50. P.). Eine Chiari Malformation mit Kleinhirntonsillen Tiefstand wurde durch eine

MRT Untersuchung festgestellt. Sie ist das Kind phänotypisch unauffälliger und nicht

miteinander verwandter Eltern. Molekulargenetisch wurden durch das Diagnostiklabor FGFR2

und Exon 7 von FGFR3 untersucht und waren unauffällig. Es folgte im Rahmen dieser Arbeit die

Anreicherung der Kranio Panel Zielsequenzen mit dem SureSelectQXT Kit (Agilent). Das Alignment

der Sequenzierdaten mit dem Referenzgenom (GRCh37/hg19) und Auswertung der Abdeckung

durch GensearchNGS ergab, dass 99,7% der Zielsequenzen mindestens 20x abgedeckt sind. Im

Anhang D sind alle Exons aufgeführt, die nicht vollständig abgedeckt waren. Es erfolgte keine

Nachsequenzierung von diesen Lücken. Von den 25 detektierten Varianten waren 11 Artefakte

und 13 Klasse I-II Varianten.

Die verbliebene Variante ist eine heterozygote Basendeletion an cDNA Position 825 von TCF12

(NM_207037.1). Die Deletion betrifft das letzte Nukleotid von Exon 10 (Abb. 3.21 A). Durch den

Nukleotidverlust sind zwei loss-of-function Effekte möglich: aberrantes Spleißen durch

Änderung der Spleißstelle oder eine Verschiebung des Leserasters. Die Spleißvorhersage der

Software Alamut zeigt, dass ein Verlust des Spleißdonors möglich sein könnte. Auch das

Programm HBond bewertet die wildtypische Spleißstelle (wt: UUG/GUAGGCUA) mit 11,90 höher

als die veränderte Sequenz (var: UU_/GUAGGCUA) mit 8,90. Ein möglicher Effekt auf das

Spleißen wurde durch Minigen Konstrukte untersucht (siehe 3.4.1 b). Bei einer Verschiebung

des Leserasters käme es nach 13 Aminosäuren zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation

(p.S276Vfs*12). Die Variante hat weder in ExAC noch dbSNP einen Eintrag. Von MutationTaster

wird sie als krankheitsverursachend bewertet. Die Analyse der elterlichen gDNA ergab, dass die

Variante bei der Tochter de novo entstanden ist (Abb. 3.21 B). Unter Berücksichtigung aller

Daten wurde die Variante in Klasse IV eingestuft.

3. ERGEBNISSE

84

Abbildung 3.21: NGS Ergebnis von Patientin CRA_64, Spleißvorhersage und Segregationsanalyse. A TCF12 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Dargestellt ist die Referenzsequenz und die TCF12 Variante auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.). Schwarze Balken stellen die einzelnen Reads, auf denen die Deletion mit einem grünen Strich gekennzeichnet ist, dar. Das Diagramm gibt Auskunft über die genomische Position auf Chromosom 15, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante. B Ansicht der Spleißvorhersage der Software Alamut. Der obere Bereich zeigt die Vorhersage für die Referenzsequenz, unten für die veränderte Sequenz. Die Nukleotiddeletion führt dazu, dass die verwendeten Vorhersageprogramme die Spleißdonorstelle von Exon 10 schwächer einstufen oder nicht mehr erkennen (blaue Balken). C Segregationsanalyse in der Familie. Die Variante entstand bei Patientin CRA_64 (II-1) de novo.

A B

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

TCF12 c.825delG, p.S276Vfs*12 Spleißvorhersage

wt

c.825delG

C

wt

3. ERGEBNISSE

85

3.2.11 Heterozygote Spleißvariante in TCF12 – c.1036-1G>C

Ein Verdacht auf syndromale Kraniosynostose besteht bei Patientin CRA_80. Die Koronarnähte

sind bei ihr vorzeitig fusioniert. Zusätzlich ist ihre sprachliche Entwicklung verzögert und sie hat

Schwierigkeiten beim Lernen. Weitere klinische Informationen zu ihr oder ihren Eltern lagen

nicht vor. Eine Karyotypisierung und FGFR2 Sequenzierung ergaben normale Befunde. Die

Anreicherung für das Kranio Panel erfolgte daraufhin mit SureSelectQXT (Agilent).

Abbildung 3.22: NGS Ergebnis von Patientin CRA_80, Spleißvorhersage und Segregationsanalyse. A TCF12 Variantenansicht der Software GensearchNGS. Die Referenzsequenz und die TCF12 Variante sind auf DNA- (DNA Seq.) und Proteinebene (AS Seq.) dargestellt. Der Basenaustausch G>C ist in den einzelnen Reads (schwarze Balken) grün markiert. Die genomische Position auf Chromosom 15, die Abdeckung, die Qualität und die Häufigkeit der Variante sind im Diagramm dargestellt. B Ansicht der Spleißvorhersage der Software Alamut. Der obere Bereich zeigt die Vorhersage für die Referenzsequenz, unten für die veränderte Sequenz. Die Basensubstitution führt dazu, dass die verwendeten Vorhersageprogramme den Spleißakzeptor von Exon 13 als nicht vorhanden einstufen (grüne Balken).

Nach der Sequenzierung wurden die Sequenzen mit GensearchNGS alignt und ausgewertet. Es

zeigte sich, dass 99,4% der Zielsequenzen 20x abgedeckt sind. Eine Auflistung aller Lücken

befindet sich im Anhang D. Sie wurden nicht nochmal mit Sanger Sequenzierung überprüft.

Insgesamt wurden 31 Varianten herausgefiltert, von denen jedoch 17 Sequenzierartefakte und

13 Klasse I-II Varianten sind. Eine Variante in TCF12 wurde in Klasse IV eingeordnet (Abb. 3.22

A). Der heterozygote Basenaustausch c.1036-1G>C liegt in Intron 12-13 (NM_207037.1) und

bewirkt, dass der Spleißakzeptor so verändert wird, dass er möglicherweise von dem

Spleißosom nicht mehr erkannt wird (Abb. 3.22 B). Zu der Variante sind keine Einträge in ExAC

A B

AS Seq.

Transkript

DNA Seq.

Reads

TCF12 c.1036-1G>C Spleißvorhersage

3. ERGEBNISSE

86

und dbSNP vorhanden. Eine Segregationsanalyse war nicht möglich, da keine gDNA der Eltern

zur Verfügung stand. Der mögliche Einfluss der Variante auf das Spleißen wurde in einem in

vitro Spleißsystem untersucht (siehe 3.4.1 c).

3.3 Sequenzierung des SMAD6 Gens und des BMP2 Risikoallels

Nicht-syndromale Kraniosynostosen, die die Frontal- und Sagittalnaht betreffen, machen ca.

50% aller Kraniosynostose Fälle aus (WILKIE et al. 2017). Eine genetische Ursache ist jedoch in

den seltensten Fällen bekannt. Timberlake et al. untersuchten eine Patientengruppe mit

vorzeitiger Fusion der Frontal- oder Sagittalnaht mittels Exom Sequenzierung (TIMBERLAKE et al.

2016). Bei 7% der Patienten wurden mögliche pathogene Varianten in dem Gen SMAD6 in

Kombination mit einem Risikoallel in der Nähe des Gens BMP2 (rs1884302 T>C) identifiziert,

sodass eine digene Vererbung vermutet wurde. Da dies die erste Studie war, die diesen

Zusammenhang zeigte, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kohorte aus 96 Patienten mit

isolierter sagittal oder metopischer Kraniosynostose aus dem Kollektiv des humangenetischen

Instituts erstellt. Von diesen Patienten hatten 51 eine Fusion der Sagittalnaht, 39 der

Frontalnaht und 4 eine Fusion beider Nähte. Bei den Patienten P30 und P67 war unklar welche

Suture neben der Sagittalnaht noch betroffen ist. Per Sanger Sequenzierung wurden die 4 Exons

von SMAD6 und der SNP rs1884302 der 96 Patientenproben analysiert. Beim Abgleich mit der

SMAD6 Referenzsequenz (NM_005585) wurden auch jeweils 25 bp der intronischen Sequenzen

berücksichtigt, um eventuelle Spleißvarianten zu identifizieren. Im Anhang F sind von jedem

Patienten die detektierten Varianten gelistet. Das BMP2 Risikoallel „C“ tragen 68 der Patienten

(70,8%). Die MAF des SNPs ist in der Populationsdatenbank 1000Genomes mit 42% angegeben.

In der SMAD6-Kohorte trat das Allel deutlich häufiger auf. Insgesamt wurden 11 verschiedene

SMAD6 Varianten detektiert. Diese sind mit ihrer Häufigkeit, rs-Nummer und Bewertung durch

die Vorhersageprogramme MutationTaster, PolyPhen-2 und SIFT in Tabelle 3.6 gelistet. Von

diesen wurden 7 in Klasse I-II und 4 in Klasse IV eingestuft. Die Klasse IV Varianten sind in

Tabelle 3.6 hervorgehoben und werden im Folgenden ausführlicher beschrieben.

Tabelle 3.6: SMAD6 Varianten der SMAD6-Kohorte

Variante Häufigkeit MAF1 rs-Nummer MntTaster PolyPhen-

2 SIFT ClinVar/HGMD

c.1-24insA 1/96 - - - - - -

c.120C>T, p.G40G

9/96 3,50% rs149612008 - - - RCV000231139.3

c.253C>T, p.R85C

3/96 - rs1056072996 D PD (0,483) T (0,13) RCV000549271.1

c.264C>G, p.G88G

1/96 0,03% rs547033777 - - - RCV000234214.1

3. ERGEBNISSE

87

c.465-471del, p.G156Vfs*23

1/96 - - - - - CD17121333

c.587A>G, p.E196G

1/96 - rs746122297 D D (0,997) D (0,03) -

c.619C>T, p.L207L

1/96 - - - - - -

c.711C>T, p.H237H

4/96 1% rs144415105 - - - RCV000470932.2

c.802C>G, p.R268G

1/96 - rs780080560 D D (1,000) D (0,02) -

c.875-22C>A 52/96 22,7% rs2278604 - - - -

c.1172T>C, p.I391T

1/96 - - D D (0,872) D (0,01) -

1 = ExAC; - = keine Daten/keine Bewertung möglich; D = damaging, PD = possibly damaging

a) Patient P06

Eine vorzeitige Fusion der Frontalnaht lag bei Patient P06 vor. Das humangenetische

Diagnostiklabor hatte eine FGFR3 Sequenzierung durchgeführt, die unauffällig war. Die

Sequenzierung des SMAD6 Gens ergab die drei Varianten c.120C>T, c.802C>G und c.875-22C>A.

Die Varianten c.120 und c.875-22 sind als SNPs einzustufen. Der heterozygote Basenaustausch

an cDNA Position 802 führt auf Proteinebene zu einem Austausch von Arginin 268 nach Glycin.

Dies wird von MutationTaster, PolyPhen-2 (score: 1,0) und SIFT (score: 0,02) einheitlich als

möglicherweise pathogen bewertet. Die Aminosäure ist sehr konserviert, unter anderem in

Maus, Zebrafisch, Drosophila oder C. elegans. Zu der Variante sind keine MAF Daten in ExAC

hinterlegt. Die Auswertung der BMP2 Risikoallel Sequenzierung ergab, dass der Patient P06 an

dieser Position das wildtypische Allel „T“ besitzt. Eine Analyse der Eltern war nicht möglich.

b) Patientin P16

Patientin P16 ist ebenfalls von einer Frontalnahtsynostose betroffen. Die

Standardsequenzierung von FGFR1, FGFR2 und FGFR3 durch das Diagnostiklabor war ohne

Befund. Neben dem SNP c.120C>T wurde bei ihr noch eine heterozygote Deletion von 7 bp in

SMAD6 detektiert. Die Deletion c.465-471 bewirkt eine Leserasterverschiebung, sodass bei der

Translation 23 Aminosäure später ein Abbruch erfolgt (p.G156Vfs*23). In der

Mutationsdatenbank HGMD ist diese Variante bereits aufgeführt (CD17121333) und wurde von

Timberlake et al. publiziert (TIMBERLAKE et al. 2017). Die Patientin hat das BMP2 Risikoallel. Eine

Segregationsanalyse bezüglich der Varianten konnte nicht durchgeführt werden, da keine

elterlichen Proben zur Verfügung standen.

3. ERGEBNISSE

88

c) Patient P75

Eine Kraniosynostose der Sagittalnaht wurde bei Patient P75 festgestellt. Die Sequenzierung der

Gene FGFR1, FGFR2, FGFR3 und TWIST1 durch das Diagnostiklabor ergaben keine pathogenen

Varianten. Die Auswertung der SMAD6 Sequenzierung ergab neben den SNPs c.619C>T und

c.875-22C>A zwei Varianten, die als Klasse IV einstuft wurden (c.587A>G, c.1173T>C). Der

Basenaustausch c.587A>G führt auf Proteinebene zu einem Aminosäureaustausch p.E196G, der

von MutationTaster, PolyPhen-2 (score: 0,997) und SIFT (score: 0,03) als möglicherweise

pathogen eingestuft wird. Die Aminosäure Glutaminsäure an 196 ist konserviert in Maus und

Zebrafisch. In ExAC ist zu dieser Variante noch kein Eintrag vorhanden. Die zweite Variante

c.1172T>C wird ebenfalls von MutationTaster, PolyPhen-2 (score: 0,872) und SIFT (score: 0,01)

als schädigend bewertet und resultiert in einem Austausch der Aminosäure Isoleucin 391 durch

Threonin (p.I391T). Bei Maus, Huhn und Xenopus ist Isoleucin an dieser Position konserviert.

Die Aminosäure ist in der MH2 Domäne des Proteins lokalisiert. Diese Domäne vermittelt die

Heterodimerbildung von SMAD6 mit Rezeptor-SMADs und ist somit wichtig für die Inhibition

der BMP vermittelten SMAD-Signalübertragung. Ein Aminosäureaustausch an Position 390

(p.G390C) wurde bereits bei einem anderen Patienten mit Frontalnahtsynostose detektiert

(TIMBERLAKE et al. 2017). Patient 75 besitzt zusätzlich das BMP2 Risikoallel. Elterliche gDNAs

waren für eine Analyse nicht vorhanden.

3.4 Funktionelle Analysen

Um Sequenzvarianten oder Kopienzahlveränderungen besser beurteilen zu können, wurden für

einige erste funktionelle Analysen durchgeführt. Potentielle Spleißvarianten wurden mit einem

Minigensystem untersucht. Für die Gene FGF10 und HUWE1 wurden Analysen mit dem

Tiermodell Danio rerio durchgeführt.

3.4.1 Analyse von Spleißsequenzvarianten durch ein in vitro Minigensystem

Von den 66 durch das Kranio Panel analysierten Fällen wurden bei drei Patienten Varianten

detektiert, die Spleißstellen betreffen und als potentiell pathogen eingestuft wurden. Grundlage

für die Klassifizierung waren bioinformatische Vorhersageprogramme, die in den meisten Fällen

eine Abweichung von der Konsensussequenz der Spleißstelle beurteilen. Überprüfen lässt sich

ein Effekt auf das Spleißmuster durch eine Analyse der Patienten mRNA. In vielen Fällen ist es

jedoch nicht möglich eine weitere Blutprobe des Patienten zu erhalten oder das Gen wird nicht

im Blut exprimiert, sodass eine solche Untersuchung nicht möglich ist. Mit Hilfe eines

Minigensystems kann in vitro die Auswirkungen der Sequenzänderung auf das Spleißen

analysiert werden. Der Vektor pSPL3b enthält zwei artifizielle Exons (A und B), zwischen die

weitere Exon- und Intronsequenzen eingebracht werden können. Hierbei findet immer ein

3. ERGEBNISSE

89

Vergleich der wildtypischen Spleißsstelle mit der veränderten Stelle statt, sodass es nötig ist für

jede Variante zwei Konstrukte zu erstellen. Nach der Transfektion in humane Zellen und der

Isolation der mRNA, können durch PCR und Sequenzierung Effekte durch die Sequenzänderung

auf das Spleißen innerhalb dieses Systems analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden

drei Sequenzvarianten mit diesem Minigensystem untersucht.

a) Variante MEGF8 c.828G>A

Die Brüder CRA_18 und CRA_19 haben eine homozygote Spleißvariante in MEGF8 (c.828G>A;

NM_001410; siehe 3.2.3). Die Nukleotidveränderung bewirkt, dass Vorhersageprogramme den

Spleißdonor von Exon 5 als schwächer bewerten und dieser möglicherweise vom Spleißosom

nicht mehr erkannt wird. Eine Blutprobe der Patienten für die Präparation von RNA stand nicht

zur Verfügung, sodass für Exon 5 Minigen-Konstrukte erstellt wurden. Hierfür wurde sowohl ein

wildtypisches (WT: c.828G) als auch ein verändertes (Var: c.828A) 386 bp Fragment

amplifiziert, das aus 73 bp Intron 4-5, 89 bp Exon 5 und 224 bp Intron 5-6 bestand, und in den

pSPL3b Vektor eingebracht (Abb. 3.23 A; Anhang G). Der Leervektor diente als Kontrolle. Nach

Transfektion, RNA Isolation und cDNA Synthese wurde eine PCR mit den Vektor-spezifischen

Primern SD6 und SA2 durchgeführt. Die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR Produkte

lässt erste Rückschlüsse auf das Spleißverhalten zu: RNA, die nur die beiden artifiziellen Exons A

und B enthält, ergibt ein ca. 260 bp großes Fragment; ist zusätzlich noch das MEGF8 Exon 5

enthalten, so liegt die Größe des PCR Produkts bei ca. 350 bp. Die Kontrolle zeigte in der

Gelelektrophorese eine ungefähr 300 bp große Bande (Abb. 2.23 B). Ein größeres und kleineres

Fragment lag bei WT vor, bei Var hingegen war nur die kleinere Bande sichtbar (Abb. 3.23 B).

Dies zeigt, dass die Variante im Vergleich zur wildtypischen Sequenz eine Spleißänderung im in

vitro System bewirkt. Die PCR Produkte wurden für eine genauere Analyse sequenziert. Hierfür

wurden die beiden Banden von WT gelelektrophoretisch aufgereinigt. Die Sequenzierung zeigte,

dass es sich bei den ca. 300 bp großen Produkten aller Konstrukte um die Exons A und B des

Vektors handelt (Abb. 3.23 C Var). Die große Bande von WT hingegen enthielt die vollständige

Sequenz von MEGF8 Exon 5 flankiert von den Exons A und B (Abb. 3.23 C). Die Variante

c.828G>A bewirkt somit im in vitro System, dass das Spleißmuster so geändert wird, dass Exon 5

herausgespleißt wird (engl. exon skipping). Allerdings findet dies auch zum Teil mit dem

wildtypischen Spleißdonor statt, da WT auch das kleinere Spleißprodukt aufwies.

3. ERGEBNISSE

90

Abbildung 3.23: In vitro Spleißanalyse der Variante MEGF8 c.828G>A. A Schematische Darstellung von pSPL3b_MEGF8. In das Minigenkonstrukt wurde Exon 5 von MEGF8 und flankierende intronische Sequenzen einkloniert (NM_001410). Es wurde sowohl die wildtypische (WT) als auch die veränderte (Var) Sequenz eingebracht. Mögliche Spleißmuster sind durch gestrichelte Linien dargestellt. HEK293T Zellen wurden mit den Plasmiden transfiziert, anschließend die mRNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. B Auswertung durch Gelelektrophorese. Die cDNA von Zellen des Kontroll-Plasmids (K), WT und Var diente als Template für eine PCR mit den Vektor-spezifischen Primern SD6 und SA2. WT zeigt zwei unterschiedlich große Banden. Var eine Bande der gleichen Größe wie K. C Auswertung durch Sequenzierung. Die PCR Produkte wurden aufgereinigt und sequenziert. Ein Vergleich der Variante und des WT zeigt, dass bei der Variante c.828G>A nur Vektorsequenzen vorliegen.

b) Variante TCF12 c.825delG

In dem Gen TCF12 wurde bei Patientin CRA_64 eine 1 bp Deletion identifiziert (c.825delG). Der

Nukleotidverlust betrifft das letzte Nukleotid von Exon 10. Neben einer Leserasterverschiebung

(p.S276Vfs*12) wäre auch eine Änderung des Spleißmusters möglich, da durch den Verlust die

Spleißdonor Sequenz verändert wird (siehe 3.2.10). Das Spleißverhalten wurde daraufhin in

dem Minigensystem untersucht. Dafür wurde Exon 10 sowie 491 bp des Introns 9-10 und

213 bp des Introns 10-11 amplifiziert und in den Vektor pSPL3b eingebracht. Es wurde sowohl

ein wildtypisches als auch ein verändertes Konstrukt erstellt (Abb. 3.24 A, Anhang G). Es folgte

die Transfektion von HEK293T Zellen, RNA Isolation und cDNA Synthese. Der Leervektor wurde

als Kontrolle verwendet. Die Produkte der PCR aus cDNA und Vektorprimern SD6 und SA2

wurden zunächst gelelektrophoretisch aufgetrennt (Abb. 3.24 B). Hierbei zeigte sich, dass

sowohl bei WT als auch bei Var zwei Banden vorliegen: eine ca. 260 bp Bande, die der Bande der

Kontrolle entsprechen könnte, und eine ca. 400 bp Bande, die Exon 10 enthalten könnte. Die

gelelektrophoretische Analyse zeigte kein Unterschied zwischen WT und Var. Daraufhin erfolgte

eine Gelaufreinigung der einzelnen Banden und anschließend die Sequenzierung dieser. Die

Auswertung ergab, dass die ca. 260 bp Bande bei allen Konstrukten den Exons A und B des

Vektors entspricht. Ein Unterschied zeigte sich jedoch bei den größeren Spleißprodukten. Die

vollständige Exon 10 Sequenz flankiert von Exon A und B konnte bei WT nachgewiesen werden

A

B

CMEGF8 WT: c.828GVar: c.828A

Exon 5SA2SD6

Exon A Exon B

pSPL3b_MEGF8

VarExon BExon A

Exon BExon 5

WT350 bp

200

400

600

800

[bp] M K WT Var

Exon A Exon 5 ~350 bp

Exon A ~260 bpExon B

Exon B

3. ERGEBNISSE

91

(Abb. 3.24 C). Der Nukleotidverlust in dem Var Konstrukt hingegen führt dazu, dass ein

alternativer Spleißdonor verwendet wird. Dieser bewirkt, dass 22 bp des Introns 10-11 im

Spleißprodukt enthalten sind (Abb. 3.24 C). Innerhalb dieser Sequenz würde ein vorzeitiges

Stopcodon (*) entstehen.

Abbildung 3.24: In vitro Analyse der potentiellen Spleißvariante TCF12 c.825delG. A Schema von pSPL3b_TCF12_Ex10. Exon 10 und umgebende Intron-Sequenzen des Gens TCF12 (NM_207037.1) wurden in den Vektor pSPL3b einkloniert. Es wurde ein wildtypisches (WT) und ein verändertes (Var) Konstrukt erstellt, mit denen HEK293T Zellen transfiziert wurden. Anschließend wurde aus diesen Zellen mRNA isoliert und eine cDNA Synthese erfolgte. Der Leervektor diente als Kontrolle (K). Theoretische Spleißprodukte sind durch gestrichelte Linien gekennzeichnet. B Gelelektrophoretische Auswertung. Die Produkte der PCR mit den Vektorprimern SD6 und SA2 wurden auf einem 1,5%igem Agarosegel aufgetrennt. WT und Var zeigen je zwei Banden (ca. 260 bp und ca. 400 bp), von denen die untere Bande auf Höhe der Kontrolle läuft. C Sanger Sequenzierung der Spleißprodukte. Die ca. 260 bp große Bande aller Konstrukte entspricht den Vektor spezifischen Exons A und B. Der Vergleich der ca. 400 bp großen Bande von WT und Var zeigt, dass durch den Nukleotidverlust ein alternativer Spleißdonor genutzt wird. Das entstehende Spleißprodukt beinhaltet 22 bp intronische Sequenz, die ein vorzeitiges Stopcodon (*) enthält.

c) Variante TCF12 c.1036-1G>C

Mit der Klasse IV Variante von Patientin CRA_80 (3.2.11) wurde ebenfalls eine Spleißanalyse

durchgeführt. Der Basenaustausch liegt im Intron 12-13 von TCF12 (c.1036-1G>C,

NM_207037.1) und verändert die Spleißakzeptor Sequenz so, dass Spleißvorhersage

A B

C

TCF12 WT: c.825GVar: c.825delG

Exon 10SA2SD6

Exon A Exon B

pSPL3b_TCF12_Ex10

Exon BExon AK

Var∼400bp

Exon 10WT ∼400bp

200

400

600

800

[bp] M K WT Var

~400 bp~260 bp

Exon B

Exon 10 Exon B22 bp Intron 10-11

*

3. ERGEBNISSE

92

Programme die veränderte Sequenz nicht mehr als Akzeptorstelle erkennen. Eine Änderung im

Spleißmuster ist zu erwarten. Für das Minigensystem wurde das 79 bp große Exon 13 und

jeweils ca. 500 bp der umgebenden Introns amplifiziert und in den Vektor pSPL3b einkloniert.

Es wurde ein wildtypisches (WT, c.1036-1G) und ein verändertes (Var, c.1035-1C) Konstrukt

erstellt (Abb. 3.25 A, Anhang G). Als Kontrolle wurde der Leervektor verwendet. U2OS Zellen

wurden mit den Konstrukten transfiziert, nach 24 h RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben.

Nach der PCR mit den Primern SD6 und SA2 wurden die Produkte zunächst gelelektrophoretisch

aufgetrennt (Abb. 3.25 B). Die Kontrolle zeigte eine Bande, deren Größe dem erwarteten

Produkt von Exon A und B entsprach (ca. 260 bp). Die PCR-Produkte von WT und Var waren

größer als die Kontroll-Bande. Es hatte jedoch den Anschein, dass diese beiden nicht gleich groß

sind, sondern das PCR Produkt von Var kleiner als das von WT ist. Für die Analyse, ob zwischen

den WT und Var Spleißprodukten ein Unterschied besteht, wurden die PCR Fragmente

sequenziert. Die Kontrolle enthält nur Exon A und B Sequenzen, WT noch zusätzlich die

vollständige Sequenz von Exon 13 (Abb. 3.25 C). Es zeigte sich jedoch, dass die Sequenzierung

des Var Fragments überlagerte Sequenzen ergab, die nicht auswertbar waren. Daraufhin wurden

die Var Produkte über unspezifische TA-Klonierung in den pCRII Vektor ligiert, um so die

vorliegenden Spleißprodukte identifizieren zu können. DH5α Bakterien wurden mit dem

Ligationsansatz transformiert und über Nacht auf Ampicillin LB-Agarplatten selektioniert. Eine

PCR und anschließende Sequenzierung erfolgte mit den Primern M13fwd und M13rev und den

Einzelkolonien als Template. Die Analyse von 22 Kolonien ergab, dass der Basenaustausch

c.1036-1G>C das Spleißmuster in vitro ändert und zwei alternative Spleißprodukte entstehen

(Abb. 3.25 C Var1/Var2). Bei beiden wird Exon 13 verkürzt und sie unterscheiden sich um drei

Nukleotide. Mit dem Human Splicing Finder (HSF3) Programm wurde die Exon 13 Sequenz auf

kryptische Spleißstellen hin analysiert. Hierbei werden potentielle Spleißstellen verglichen mit

der Konsensussequenz eines Akzeptors (kon: (C/U)12-17NCAG/G) und bewertet (kon: 100). Das

Programm identifizierte 4 kryptische Akzeptorstellen in Exon 13 mit der potentiell neuen

Exongrenze an folgenden cDNA Positionen: 1) c.1059 (HSF3: 80,25), 2) c.1062 ( HSF3: 81,85),

3) c.1065 (HSF3: 72,81) und 4) c.1091 (HSF3: 80,61). Im in vitro System wurden nur die

alternativen Stellen 1) und 2) genutzt, dies entspricht genau den Spleißprodukten Var1 und

Var2 (Abb. 3.25 C). Von den 22 analysierten Kolonien hatten 9 ein Plasmid mit Var1 und 13 ein

Plasmid mit Var2 aufgenommen. Dies passt zu den bioinformatischen Ergebnissen von HSF3,

das die beiden kryptischen Akzeptorstellen als ungefähr gleich stark bewertete. Die Nutzung des

Akzeptor 1) hätte eine Leserasterverschiebung zur Folge (p.S353Qfs*1), wohingegen ein

Stopcodon (p.S354*) durch Akzeptor 2) entstehen würde. In beiden Fällen würde TCF12

verkürzt vorliegen. Mit dem Minigensystem konnte gezeigt werden, dass die Variante von

Patientin CRA_80 zu einem geänderten Spleißmuster führt und unterstützt die Einstufung des

Basenaustauschs als krankheitsverursachende Variante.

3. ERGEBNISSE

93

Abbildung 3.25: In vitro Spleißanalyse der Variante TCF12 c.1036-1G>C. A Schema von pSPL3b_TCF12_Ex13. In den Vektor pSPL3b wurde Exon 13 und umgebende Intron-Sequenzen des Gens TCF12 (NM_207037.1) eingebracht. Es wurde ein wildtypisches (WT) und ein verändertes (Var) Konstrukt erstellt, U2OS Zellen transfiziert und anschließend mRNA isoliert. Als Kontrolle (K) wurde der Leervektor verwendet. Mögliche Spleißprodukte sind durch gestrichelte Linien gekennzeichnet. B Gelelektrophoretische Auswertung. Die Produkte der PCR mit den Vektorprimern SD6 und SA2 wurden auf einem 1,5%igem Agarosegel aufgetrennt. Die Kontrolle zeigt eine ca. 260 bp große Bande. Die Banden von WT und Var laufen deutlich höher, unterscheiden sich jedoch beide leicht in ihrer Größe. C Sanger Sequenzierung der Spleißprodukte. Die Kontrolle enthält nur die Sequenz der Exons A und B, WT hingegen enthält zusätzlich die vollständige Sequenz von Exon 13 von TCF12. Das PCR Produkt von Var wurde für die Sequenzierung in den Vektor pCRII einkloniert. Die Sequenzauswertung ergab, dass durch die Variante c.1036-1G>C zwei unterschiedliche Spleißprodukte (Var1 und Var2) entstehen, die beide ein verkürztes Exon 13 beinhalten.

A B

C

TCF12 WT: c.1036-1GVar: c.1036-1C

Exon 13SA2SD6

Exon A Exon B

pSPL3b_TCF12_Ex13

Exon BExon AK

Var1

Exon A Exon 13WT

Exon A Exon 13

Var2 Exon A Exon 13

200

300

400

500

[bp] M KWT Var

~340 bp~260 bp

3. ERGEBNISSE

94

3.4.2 Expressionsmuster und Überexpression von fgf10a in Danio rerio

Durch Array-CGH wurde eine 28,2 Mb große Duplikation auf Chromosom 5 bei Patient CRA_10

detektiert (3.1.2). Von der Duplikation sind über 130 Gene betroffen. Im Bezug auf die

vorliegende Kraniosynostose ist vor allem das Gen FGF10 interessant. FGF10 ist unter anderem

ein Ligand des Rezeptors FGFR2. Gain-of-function Mutationen des Rezeptors sind mit mehreren

Kraniosynostose-Syndromen assoziiert wie z.B. Crouzon Syndrom und Pfeiffer Syndrom. Daraus

ergibt sich die Überlegung, dass eine Überexpression von FGF10 einen ähnlichen Effekt haben

könnte wie ein überaktiver Rezeptor. Hierfür wurden erste Versuche im Modellorganismus

Danio rerio durchgeführt. Durch eine Genomduplikation gibt es im Zebrafisch zwei orthologe

Gene: fgf10a und fgf10b. Aufgrund der konservierten Syntänie zum humanen FGF10 Genlocus

wurden die Analysen im Zebrafisch mit fgf10a durchgeführt. Die humane und die Zebrafisch

cDNA haben eine Sequenzähnlichkeit von 58%.

a) Expressionsanalyse von fgf10a

Die generelle Expression von fgf10a wurde in verschiedenen Entwicklungsstadien und Geweben

untersucht. Hierfür wurde mittels PCR Stadien- und Gewebe-cDNAs von Danio rerio analysiert.

Als Amplifikationskontrolle wurde das Haushaltgen act1a1 (aktin) verwendet. Es wird zu allen

Zeitpunkten und in allen Geweben exprimiert. Die amplifizierten Produkte für fgf10a (ca.

300 bp) und aktin (ca. 250 bp) sind in Abbildung 3.26 dargestellt. Die aktin Expression erfolgt in

allen Entwicklungsstadien und in allen Geweben. Die Konzentrationen der eingesetzten cDNAs

scheinen allerdings nicht gleich zu sein, um eine tendenzielle Aussage zu treffen ist dies jedoch

ausreichend. In 24 hpf, 32 hpf und 48 hpf alten Embryonen sowie in allen getesteten Geweben

wird fgf10a stark exprimiert.

Abbildung 3.26: fgf10a und fgfr2 Expressionsanalyse in verschiedenen Entwicklungsstadien und Geweben des Zebrafischs. Von unterschiedlichen Entwicklungsstadien und Geweben adulter Zebrafische wurde cDNA für die Analyse verwendet. Die amplifizierten Produkte für fgf10a, fgfr2 und aktin wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Hierbei dient aktin der cDNA Kontrolle. Als Positivkontrolle (+) wurde ein Mix aus Stadien- bzw. Gewebe-cDNA und als Negativkontrolle (-) Wasser verwendet.

200

400

600

[bp] +-

fgf10a200

400600

+-

aktin

3. ERGEBNISSE

95

Daraufhin wurde das Expressionsmuster von fgf10a und des Rezeptors fgfr2 in 24 hpf und 48

hpf Embryonen untersucht. Hierfür wurde die fgf10a kodierende Sequenz in den pCRII Vektor

eingebracht und eine mit DIG markierte, komplementäre RNA Sonde erstellt. Die Sonden für

fgfr2 und die anschließende in-situ Hybridisierung wurden von A. Kirschbauer durchgeführt.

Abbildung 3.27: Expressionsmuster von fgf10a und fgfr2 in Danio rerio Embryonen. Hybridisierungssonden der Gene fgf10a (A) und fgfr2 (B) wurden für die Expressionsanalyse in 24 hpf und 48 hpf alten nac-/-tra-/- Embryonen verwendet. Von den Embryonen wurden sowohl laterale als auch dorsale Aufnahmen mit 5x Vergrößerung unter dem Stereomikroskop aufgenommen. Gefärbte Strukturen sind mit Pfeilen gekennzeichnet. F = Flossenansätze, Kb = posteriore Kiemenbögen, Kba = posteriore Kiemenbögenanlagen, Mh = Mittelhirn, MNG = Mittelhirn-Nachhirn Grenze, S = Schwanzknospe, V = Vorderhirn.

Abbildung 3.27 zeigt die Aufnahmen der in-situ Hybridisierung der Embryonen mit einem

Stereomikroskop. Die Expression von fgf10a konnte sowohl in 24 hpf also auch in 48 hpf alten

Embryonen vor allem in der Schwanzknospe, den Flossenansätzen und den posterioren Anlagen

der Kiemenbögen nachgewiesen werden (Abb. 3.27 A). Das fgfr2 Expressionsmuster

unterscheidet sich hiervon (Abb. 3.27 B). So findet in 24 hpf alten Embryonen hauptsächlich im

Vorder- und Mittelhirn fgfr2 Expression statt. Auch eine Expression im Bereich der Mittelhirn-

3. ERGEBNISSE

96

Nachhirn Grenze ist deutlich erkennbar. Auch in 48 hpf Embryonen lässt sich fgfr2 in diesem

Bereich nachweisen. Die einzige Region, in der sowohl fgf10a als auch fgfr2 exprimiert werden,

sind die Flossenansätze in 48 hpf alten Embryonen.

b) Überexpression von fgf10a

Im Folgenden soll untersucht werden, welche Folgen eine ubiquitäre Überexpression von fgf10a

auf die Entwicklung von Zebrafisch Embryonen hat. Die vollständige kodierende Sequenz von

fgf10a wurde in das in vitro Transkriptionsplasmid pCS2 eingebracht und die fgf10a RNA

hergestellt (Anhang G). Eine Verdünnung von 100 ng/µl der RNA wurde zusammen mit FITC

Dextran und Phenolrot in die erste Zelle von nac-/-tra-/- Embryonen injiziert, um eine ubiquitäre

Überexpression zu simulieren. Die Embryonen wurden zusammen mit unbehandelten

Kontrollen bei 28°C großgezogen und über drei Tage deren Phänotyp dokumentiert. Insgesamt

wurde in 285 Embryonen RNA injiziert, davon starben 225 innerhalb der ersten 24 h. Die

meisten von diesen zeigten schwere Entwicklungsdefekte. 23 Embryonen entwickelten sich

normal. Fehlbildungen in unterschiedlichem Schweregrad wiesen 37 Embryonen auf.

Abbildung 3.28 zeigt exemplarisch Aufnahmen von Embryonen nach 24 h, 48 h und 72 h. Die

häufigsten Fehlbildungen betrafen die Augen und das Gehirn. Bei älteren Stadien war auch ein

vergrößertes Herz sowie das otische Vesikel auffällig. Aufgrund des schweren Phänotyps wurde

das Experiment jeweils nach drei Tagen beendet.

Abbildung 3.28: fgf10a RNA Injektion in Zebrafisch Embryonen. Aufnahmen von wildtypischen und injizierten nac-/-tra-/- Embryonen zu den Zeitpunkten 24 hpf, 48 hpf und 72 hpf. Gravierende phänotypische Veränderungen der injizierten Embryonen sind mit Pfeilen gekennzeichnet. A = Auge, G = Gehirn, H = Herz, oV = otisches Vesikel.

WT + fgf10a RNA

24

hp

f4

8 h

pf

72

hp

f

AG

A

G

A

G

H

oVoV

3. ERGEBNISSE

97

3.4.3 Expressionsmuster von huwe1 in Danio rerio

Bei Patient CRA_14 wurde die Variante c.329G>A von HUWE1 als möglicherweise

krankheitsverursachend eingestuft. HUWE1 ist ein erst seit kurzem mit Kraniosynostose

assoziiertes Gen (TAYLOR et al. 2015). Dem entsprechend sind noch wenig funktionelle Analysen

durchgeführt worden. Für ein mögliches Projekt mit dem Modellorganismus Zebrafisch wurden

Expressionsanalysen mit cDNA verschiedener Entwicklungsstadien und Geweben sowie in situ

Hybridisierungen auf Zebrafisch Embryonen durchgeführt. Das Gen huwe1 liegt auf Chromosom

23 von Danio rerio und ist von der Genomduplikation nicht betroffen, weswegen nur ein

Ortholog zum humanen Gen vorliegt. Die Sequenzähnlichkeit von humaner und Zebrafisch

Sequenz liegt bei 81%. Um zu untersuchen zu welchen Zeitpunkten und in welchen Geweben

huwe1 exprimiert wird, wurde eine PCR mit huwe1 Primern auf cDNA unterschiedlicher

Zebrafisch Entwicklungsstadien und Geweben adulter Fische durchgeführt. Die cDNA Das

Haushaltsgen aktin wird zu allen Entwicklungszeitpunkten ubiquitär exprimiert und wurde als

Kontrolle für die cDNA verwendet. Abbildung 3.29 zeigt die gelelektrophoretische Auftrennung

der PCR Produkte für huwe1 (ca. 500 bp) und aktin (ca. 250 bp). Wie erwartet wird aktin zu

allen Zeitpunkten und in allen Geweben exprimiert, auch wenn sich hier zeigt, dass die cDNA

nicht in allen gleich konzentriert ist. Im Dome- und 1-3 Somiten Stadium wird huwe1 kaum

exprimiert. In 32 hpf und 48 hpf Embryonen scheint die Expression schwächer zu sein als zum

Zeitpunkt 24 hpf. Im adulten Fisch wird huwe1 in allen getesteten Geweben exprimiert.

Abbildung 3.29: huwe1 Expressionsanalyse in verschiedenen Entwicklungsstadien und Geweben von Danio rerio. Für die Analyse wurden cDNAs unterschiedlicher Entwicklungsstadien und Geweben adulter Zebrafische verwendet. Die amplifizierten Produkte für huwe1 und aktin wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Hierbei dient aktin der cDNA Kontrolle. Als Positivkontrolle (+) wurde ein Mix aus Stadien- bzw. Gewebe-cDNA und als Negativkontrolle (-) Wasser verwendet.

Für die Analyse des Expressionsmusters in 24 hpf und 52 hpf Embryonen wurde eine in-situ

Hybridisierung durchgeführt. Die Klonierung, Erstellung der Riboprobe und Hybridisierung auf

24 hpf und 52 hpf Embryonen wurden gemeinsam mit der Praktikantin J. Seidler durchgeführt.

Die Aufnahmen in Abbildung 3.30 zeigen eine basale Expression von huwe1 im gesamten 24 hpf

200

400

600

800

[bp] +-

huwe1

200

400

600

+-

aktin

3. ERGEBNISSE

98

Embryo. Eine besonders starke Expression ist in den Gehirnregionen erkennbar. Dies ist auch

bei 52 hpf Embryonen der Fall, besonders im Bereich des Mittelhirns. Des Weiteren ist eine

deutliche Färbung des otischen Vesikels und der Flossenansätze zu erkennen.

Abbildung 3.30: Expressionsanalyse von huwe1 in Danio rerio Embryonen. Laterale und dorsale Aufnahmen von 24 hpf und 52 hpf nac-/-tra-/- Embryonen nach in situ Hybridisierung mit einer huwe1 Sonde. Bei den 24 hpf Embryonen wurde zur bessern Sichtbarkeit der Färbung der Dottersack entfernt. Pfeile kennzeichnen stark gefärbte Strukturen. F = Flossenansätze, Mh = Mittelhirn, oV = otisches Vesikel.

24

hp

f

huwe1

52

hp

f

lateral dorsal

FMh

oV

4. DISKUSSION

99

4. DISKUSSION

Zur weiteren Aufklärung der Pathogenese von Kraniosynostosen wurden in dieser Arbeit 83

Kraniosynostose Patienten molekulargenetisch untersucht. Bei 33 Patienten erfolgte eine

genomweite Analyse der gDNA nach CNVs durch hochauflösende Array-CGH. Dabei konnten bei

6 Patienten Veränderungen detektiert werden, die als potentiell pathogen bzw. als pathogen

bewertet wurden. Es handelt sich sowohl um unbalancierte Translokationen als auch um

isolierte Duplikationen und Deletionen. Bei keinem der 33 analysierten Fälle wurden CNVs in

nicht-kodierenden Regionen als potentiell pathogen eingestuft. Möglicherweise war die Anzahl

an analysierten Fällen dafür zu gering. In einer Studie mit 340 Probanden zu CNVs bei isolierten

Extremitäten Fehlbildungen konnten in ca. 5% der Fälle regulatorische, nicht-kodierende CNVs

als genetische Ursache festgestellt werden (FLOTTMANN et al. 2018). Würde man bei

Kraniosynostose in etwa die gleiche Häufigkeit erwarten, so wären es bei der Anzahl an

analysierten Fälle ein bis zwei Patienten. Es sollten noch weitere Fälle untersucht werden, um

die Häufigkeit solcher CNVs für Kraniosynostosen zu bestimmen.

In 18% der mit Array-CGH analysierten Fälle und somit bei ca. 7% der gesamten

Kraniosynostose Kohorte konnten potentiell pathogene CNVs identifiziert werden. Im Vergleich

dazu liegt der Anteil in einer Studie mit 666 Patienten bei 2,4% (WILKIE et al. 2017). Der Anteil

an potentiell pathogenen CNVs in unserer Kohorte zeigt, wie wichtig eine genomweite CNV

Analyse bei Kraniosynostose Patienten ist.

Neben den Array-CGH Analysen wurden auch NGS Analysen durchgeführt. Hierfür wurde

zunächst ein Kraniosynostose Genpanel erstellt und erfolgreich validiert. Anschließend erfolgte

die Analyse von 66 Patienten gDNAs. Nach Auswertung und Bewertung der Sequenzierdaten

wurde bei 21 Patienten eine potentiell pathogene Variante festgestellt, was einer Detektionsrate

von 32% entspricht. Bei 12 dieser Varianten handelt es sich um neue bzw. sehr seltene

Varianten in den Genen ERF, FGFR2, HUWE1, MEGF8, MSX2, POR, PTCH1 und TCF12. Im Rahmen

dieser Arbeit konnte so das Mutationsspektrum dieser Gene erweitert werden. Soweit möglich

wurden für alle Varianten Segregationsanalysen durchgeführt. Mit einem Minigen-Spleißsystem

wurden Auswirkungen von Spleißvarianten auf das Spleißmuster analysiert. Zusätzlich erfolgte

für HUWE1, das erst in wenigen Fällen beschriebene wurde, Expressionsanalysen in Danio rerio.

Innerhalb dieser Arbeit wurden auch 8 bereits beschriebene FGFR Mutationen (FGFR1: 1x,

FGFR2: 1x und FGFR3: 6x) durch das Kraniosynostose Genpanel detektiert. Dies entspricht 12%

der durch NGS analysierten Patientenproben. Da bei den meisten Patienten zuvor eine Analyse

von einem oder mehreren Genen durch das humangenetische Diagnostiklabor des Instituts

durchgeführt wurde, ist der Anteil an bekannten Mutationen unerwartet hoch. Dies zeigt, dass

eine klinische Zuordnung zu einem Syndrom aufgrund der überlappenden phänotypischen

4. DISKUSSION

100

Merkmale oft schwierig ist und in der Routinediagnostik häufig die Sequenzierung von

mehreren Genen erfordert. Durch das Genpanel können diese Gene parallel analysiert werden,

was vor allem bei Patienten mit unklarer klinischer Diagnose eine Zeitersparnis darstellt.

4.1 Varianten im Kontext der Osteoblasten Differenzierung

Im Folgenden werden die genetischen Veränderungen, die als potentiell pathogen eingestuft

wurden, im Kontext der Osteoblasten Differenzierung und der Wachstumsregulation der

Suturen diskutiert. Abbildung 4.1 greift die Darstellung der Signalwege aus Kapitel 1.4 auf und

wurde um die Faktoren, in denen Varianten identifiziert wurden, ergänzt. Viele der betroffenen

Faktoren lassen sich den Signalwegen WNT, BMP, FGF und IHH zuordnen.

Abbildung 4.1: Schematische Darstellung der Signalwege der Osteoblasten Differenzierung. Zur Vereinfachung wurden einige Signalproteine der Signalwege nicht eingezeichnet. Die Faktoren, die von den detektierten genetischen Veränderungen betroffen sind, sind farblich markiert.

4.1.1 FGF Signalweg

Bei der Osteoblasten Differenzierung und der Wachstumsregulation innerhalb der Suturen spielt

der FGF Signalweg eine wichtige Rolle (siehe Kapitel 1.4.2 und 1.5). Mutationen in den Genen

FGFR1-3 sind mit unterschiedlichen Kraniosynostose Syndromen assoziiert und sind die am

häufigsten identifizierten, genetischen Ursachen bei Kraniosynostose Patienten. Innerhalb

WNT BMP FGF

Osteoblasten Marker

GSK-3APC

LEF/TCF

Axi

n

DSH

WNT

LRP5/6 FZD

BMP

CKI

BMPR

SMAD1/5/8

SMAD1/5/8

PP

β-Catenin

P

SMAD1/5/8

P

SMAD1/5/8

P

SMAD4

SMAD4

FGFR2FGF10

HS

RAF

MEK1/2

ERK1/2

RAS

PTCH1SMO

IHH

IHH

GLI2

GLI2A GLI3R

GLI3

ZY

TO

PL

ASM

AE

XT

RA

ZE

LL

UL

ÄR

EM

AT

RIX

NUKLEUS

RUNX2MSX2

SMAD6

ERK1/2

TCF12TWIST1

ERF

ERF

ERF

TCF12TWIST1

β-Catenin

β-Catenin

β-Catenin

4. DISKUSSION

101

dieser Arbeit wurden 8 bereits beschriebene FGFR Mutationen (FGFR1: 1x, FGFR2: 1x und

FGFR3: 6x) durch das Kraniosynostose Genpanel detektiert.

Eine weitere Variante in FGFR2 (c.1150G>A, p.G384R) wurde nach dem Abgleich mit

Datenbanken und Analysen durch Vorhersageprogramme als Variante unklarer Signifikanz

eingestuft (siehe 3.3.4). Sie wurde bisher einmalig bei einem Patienten mit unklarem

Kraniosynostose Syndrom beschrieben und im Rahmen dieser Arbeit von den

Vorhersageprogrammen widersprüchlich bewertet (PULLEYN et al. 1996). Mutationen im FGFR2

Gen sind mit allen klassischen Kraniosynostose Syndromen assoziiert. Dabei sind die

Mutationen hauptsächlich in der IgIII Domäne und der Tyrosin Kinase Domäne lokalisiert.

Aminosäure Substitutionen in der IgIII Domäne können zu Änderungen der Bindeaffinität und -

spezifität führen. Eine Liganden unabhängige Aktivierung kann die Folge von Substitutionen in

den Kinase Domänen sein (RICE 2008). Die jeweiligen Veränderungen können somit einen

Funktionsgewinn des Rezeptors bewirken. Die G384R Variante des Patienten CRA_29 ist in der

Transmembran (TM) Domäne von FGFR2 lokalisiert. Die TM Domäne besteht aus 21

Aminosäuren (p.378-398, Uniprot P21802). Die betroffene Aminosäure Glycin an Position 384

ist konserviert in Mensch, Maus, Huhn und Zebrafisch. Li et al. konnten in Zellkultur zeigen, dass

Veränderungen in der TM Domäne von FGFR2 (p.C382R, p.C382D oder p.V392R) zu einer

Liganden unabhängigen Aktivierung des Rezeptors führen (LI et al. 1997). Es ist jedoch weder

bekannt, ob diese TM Veränderungen im Menschen mit Erkrankungen assoziiert sind, noch

wurden sie im Tiermodell untersucht. Es wäre jedoch interessant die G384R Variante des

Patienten CRA_29 mit diesem Zellkultursystem zu analysieren, um zu untersuchen, ob diese

Variante einen ähnlichen Effekt auf den Rezeptor hat. Die Folge einer FGFR2 Daueraktivierung

könnte eine verstärkte Proliferation der Vorläuferzellen in den Suturen sein, die letztendlich zu

einer vorzeitigen Fusion der Schädelplatten führen kann. Dieser Mechanismus liegt auch bei

einer mit Crouzon Syndrom assoziierten FGFR3 Mutation vor. Mehrere Studien konnten zeigen,

dass die Mutation A391E in der TM Domäne die Liganden unabhängige Dimerisierung von

FGFR3 fördert (LI et al. 2006; CHEN et al. 2011; SARABIPOUR AND HRISTOVA 2013; DEL PICCOLO et al.

2017).

Bisher sind nur zwei weitere Mutationen der FGFR2 TM Domäne beschrieben. Die Mutationen

p.Y381D und p.M391R sind mit dem letalen Bent Bone Dyplasia Syndrom (BBDS, OMIM 614592)

assoziiert (MERRILL et al. 2012; SCOTT et al. 2014; STICHELBOUT et al. 2016). Die Patienten werden

mit komplexen Skelettfehlbildungen, die unter anderem Kraniosynostose und gebogene

Röhrenknochen beinhalten, geboren. Pränatale Zähne, faziale Dysmorphien sowie

Klitoromegalie wurden ebenfalls beschrieben. Merrill et al. postulieren als Pathomechanismus

für BBDS einen loss-of-function Effekt für die p.M391R Mutation. Die Mutation führt dazu, dass

FGFR2 nicht mehr in der Plasmamembran lokalisiert ist (MERRILL et al. 2012). Dieser

Mechanismus ist für Patient CRA_29 jedoch aufgrund der gravierenden phänotypischen

4. DISKUSSION

102

Unterschiede unwahrscheinlich. Für die bessere Einstufung der vorliegenden G384R Variante

wäre eine Analyse der zellulären Lokalisation von FGFR2 sowie der Rezeptordimerisierung

hilfreich.

Zusätzlich zu Varianten in den Rezeptoren wurde durch Array-CGH ein Zugewinn von 5p15.1-

p12 detektiert, der das Gen für den Liganden FGF10 betrifft (siehe Abb. 3.4). Der 28,4 Mb

Zugewinn von Patient CRA_10 umfasst mehr als 130 Gene. In Bezug auf die vorliegende

Kraniosynostose ist FGF10 als Ligand des FGF Signalwegs interessant (Abb. 4.1). FGF10 wird in

mesenchymalen Zellen exprimiert und bindet bevorzugt an den epithelialen Rezeptor FGFR2b

(ORNITZ et al. 1996). FGF10 ist an der Entwicklung vieler Organe beteiligt, wie beispielsweise

von Herz und Lunge (VOLCKAERT AND DE LANGHE 2015; ITOH et al. 2016). Fgf10-/- Mäuse sterben

kurz nach der Geburt aufgrund der fehlenden Lungenentwicklung. Zusätzlich bilden sich bei

diesen Mäusen keine Extremitäten aus (SEKINE et al. 1999). Dies zeigt, dass FGF10 vermittelte

Signaltransduktion bereits früh eine wichtige Rolle bei der Extremitätenbildung spielt. Die

Schädelentwicklung hingegen ist bei Fgf10-/- Mäusen normal, da in mesodermalen Geweben die

Isoform FGFR2c exprimiert wird. Dass FGF10 dennoch eine Rolle bei Kraniosynostose spielen

kann, zeigt eine Studie im Mausmodell für das Apert Syndrom. In diesen Mäusen wurde die

Fgfr2c Isoform heterozygot deletiert (IIIc+/Δ), was zu einem Apert-ähnlichen Phänotyp führte

(HAJIHOSSEINI et al. 2001). Die Deletion hat zur Folge, dass verstärkt Isoform Fgfr2b auch in den

Suturen exprimiert wird. Ein zusätzlicher Knockout des Liganden Fgf10 in den IIIc+/Δ Mäusen

verhindert die vorzeitige Fusion der Suturen (HAJIHOSSEINI et al. 2009). Dies ist nicht nur bei

einer homozygoten Fgf10 Deletion der Fall, sondern auch bei einer heterozygoten Deletion.

Diese Studie zeigt, wenn auch in einem Krankheitsmodell, wie die Verfügbarkeit von Liganden

zur Regulation in den Suturen beitragen kann. Aufgrund dessen wurden im Rahmen dieses

Projekts erste funktionelle Analysen zu FGF10 Überexpression im Tiermodell Danio rerio

durchgeführt (siehe 3.4.2). Zunächst wurde das Expressionsmuster von fgf10a mit dem von fgfr2

verglichen. Hier zeigte sich, dass beide in den Flossenansätzen in 48 hpf Embryonen exprimiert

werden (siehe Abb. 3.27). Dies passt zu den bereits erwähnten Studien der Fgf10-/- Mäusen, die

zeigten, dass Fgf10 wichtig für die Extremitätenbildung ist. Daraufhin wurde die fgf10a mRNA in

Embryonen des 1-Zell Stadiums injiziert, um eine ubiquitäre Überexpression zu simulieren.

Schwere Entwicklungsdefekte waren die Folge, die Augen, Gehirn, Herz und otische Vesikel

betrafen (siehe Abb. 3.28). Fehlbildungen der Flossen gehörten allerdings nicht dazu. Vega-

Hernández et al. konnten zeigen, dass für die Herzentwicklung die Signaltransduktion durch

FGF10/FGFR2b notwendig ist (VEGA-HERNANDEZ et al. 2011). Dies könnte den vergrößerten

Herzsack der behandelten Fische erklären. Diese Vorexperimente zeigen, dass Danio rerio ein

geeignetes Tiermodell ist, um Untersuchungen zu FGF10 durchzuführen. Hierbei wäre es

interessant zu analysieren, wie sich eine gewebespezifische Überexpression von fgf10a auf die

Knochenbildung und im Besonderen auf die Schädelbildung auswirken kann. Dazu könnte eine

4. DISKUSSION

103

transgene Fischlinie mit der fgf10a kodierenden Sequenz unter der Kontrolle des Osx Promotors

erstellt werden, sodass die verstärkte Expression spezifisch in Osteoblasten stattfindet. Durch

die Erstellung einer Fischlinie bestünde auch die Möglichkeit Effekte in älteren Fischen zu

untersuchen, da sich durch die einmalige RNA Injektion der Einfluss nur für frühe Stadien und

für einen kurzen Zeitraum analysieren lässt.

In der Literatur sind mehrere Fälle mit partieller 5p Trisomie beschrieben, allerdings ohne eine

Assoziation mit Kraniosynostose. Hierbei sind sowohl die Größen der Trisomien als auch der

Phänotyp sehr variabel. Eine grobe Genotyp-Phänotyp Korrelation ergibt sich aus den

beschriebenen Fällen. Distale Trisomien (5p13.3-pter) sind mit einem milderen Phänotyp

assoziiert. Die Patienten haben häufig faziale Dysmorphien, tief-sitzende Ohren und Klumpfüße.

Der Phänotyp von Patienten mit proximalen Trisomien (5p11-p13.2) hingegen ist häufig

schwerwiegender und komplexer. Herzdefekte, Auffälligkeiten der Extremitäten, intestinale

oder renale Fehlbildungen sowie mentale Retardierung sind Beispiele für gravierendere

klinische Merkmale (AVANSINO et al. 1999; VASQUEZ-VELASQUEZ et al. 2011; IZZO et al. 2012;

WALTERS-SEN et al. 2015; CAMEROTA et al. 2017). Die 5p15.1-p12 Duplikation von Patient CRA_10

überlappt mit beiden Bereichen. Dennoch zeigt er einen eher milden Phänotyp mit

Kraniosynostose, fazialen Auffälligkeiten, Entwicklungsverzögerung und Lernschwäche. In der

Datenbank DECIPHER sind 15 Patienten aufgeführt, die mit der detektierten 28,4 Mb Aberration

überlappende 5p Trisomien aufweisen (Anhang E). Bei vier Patienten ist FGF10 von der

Duplikation betroffen. Die klinischen Merkmale sind auch bei diesen Patienten sehr variabel.

Kraniosynostose wurde auch hier bei keinem Patienten vermerkt. Allerdings wurde bei Patient

255925 ein Dolichozephalus festgestellt, sodass möglicherweise bei diesem Patienten die

Sagittalnaht vorzeitig fusioniert ist. Die Duplikation dieses Patienten ist mit 3,7 Mb im Vergleich

zu anderen 5p Trisomien relativ klein (GRCh37/hg19, chr5:35.589.089-39.328.506) und betrifft

FGF10 nicht.

In dem Fall von Patient CRA_10 lässt sich nicht abschließend eine Hypothese zu der

Pathogenese, die zur vorliegenden Kraniosynostose führt, aufstellen. Hier könnten Analysen

eventuell in einem Tiermodell, wie z.B. Danio rerio, zur weiteren Aufklärung beitragen.

4.1.2 BMP Signalweg

Im Gegensatz zu syndromalen Kraniosynostosen, sind für isolierte Kraniosynostosen nur wenige

genetische Ursachen bekannt. Von Timberlake et al. wurde eine Patienten Kohorte mit

metopischer und/oder sagittaler Kraniosynostose molekulargenetisch untersucht und dabei

Varianten im SMAD6 Gen als mögliche genetische Ursache identifiziert (TIMBERLAKE et al. 2016;

TIMBERLAKE et al. 2017). Die heterozygoten loss-of-function Varianten zeigten jedoch eine

reduzierte Penetranz, da manche elterliche Anlagenträger nicht von Kraniosynostose betroffen

sind. Ein möglicher Zusammenhang eines häufigen SNPs (rs1884302 T>C, MAF = 42%), der

4. DISKUSSION

104

345 kb 3‘ von dem Gen BMP2 lokalisiert ist, mit sagittaler Kraniosynostose wurde bereits in

einer anderen Studie gezeigt (JUSTICE et al. 2012). Daraufhin wurden bei allen Familien mit

identifizierten SMAD6 Varianten untersucht, ob an dieser Position das wildtypische (T)oder das

veränderte (C) Nukleotid vorliegt. Es zeigte sich, dass die Mehrheit der Patienten sowohl eine

SMAD6 Variante als auch die Substitution T>C tragen. Allerdings liegt bei keinem phänotypisch

unauffälligen Familienmitglied diese Kombination vor. Dies führte zu der Annahme, dass Cystein

an dieser Position ein Risikoallel für Frontal- bzw. Sagittalnahtsynostosen darstellt und eine

digene Vererbung vorliegt (TIMBERLAKE et al. 2016). Um zu untersuchen wie relevant SMAD6

Mutationen bei isolierten Kraniosynostosen sind, wurden innerhalb dieser Arbeit 96 gDNAs von

Patienten mit metopischer oder sagittaler Kraniosynostose analysiert. Es konnten vier potentiell

pathogene Varianten in drei Patienten identifiziert werden, von denen eine Variante bereits von

Timberlake et al. beschrieben wurde (siehe Tabelle 3.6 und Abb. 4.2). Dies entspricht einem

Anteil von 3,1% innerhalb der Patienten Kohorte. Alle Veränderungen sind in den Domänen des

Proteins lokalisiert. Bei zwei Patienten liegt auch das BMP2 Risikoallel „C“ vor. Potentiell

pathogene SMAD6 Varianten scheinen eher selten zu sein, wenn man die Häufigkeit an isolierten

Frontal- und Sagittalnahtsynostosen bedenkt. Allerdings wurde in dieser Arbeit auch eine relativ

kleine Kohorte untersucht. Studien mit einer größeren Patientenanzahl könnten dazu beitragen,

die Häufigkeit von möglichen pathogenen Varianten in SMAD6 genauer zu bestimmen.

Abbildung 4.2: Lokalisation der detektieren SMAD6 Varianten. Die Aminosäureveränderungen liegen alle in der MH1 und MH2 Domäne von SMAD6. Die Leserasterverschiebung wurde bereits von Timberlake et al. publiziert (TIMBERLAKE et al. 2017).

SMAD6 und SMAD7 sind inhibitorische SMADs der BMP und TGF-β Signalwege. Sie verhindern

die Phosphorylierung der regulatorischen SMADs durch die aktivierten Rezeptoren (Abb. 4.1).

Außerdem konnte gezeigt werden, dass SMAD6 aktiviertes SMAD1 bindet und so eine

Komplexbildung mit SMAD4 verhindern kann und somit die Signaltransduktion unterbindet

(HATA et al. 1998). Zusätzlich kann SMAD6 einen Komplex mit SMURF1 bilden, das dadurch die

Ubiquitinierung und Degradation des Rezeptors und der regulatorischen SMADs induziert

(MURAKAMI et al. 2003). SMAD6 defiziente Mäuse entwickeln einen stark gewölbten Schädel und

zeigen Knochenablagerungen im Bereich der Frontalnaht (ESTRADA et al. 2011). Obwohl keine

Kraniosynostose nachgewiesen wurde, zeigt dies die Beteiligung von SMAD6 an einer normalen

Schädelentwicklung. SMAD6 ist ein wichtiger Regulator des BMP Signalwegs während der

Osteoblasten Differenzierung. Dennoch sind weitere Analysen notwendig, um den

p.G156Vfs*23 p.R268G

MH1 MH2

p.E196G p.I391T

1 148 275 331 496

SMAD6 Protein

4. DISKUSSION

105

Zusammenhang mit isolierten Kraniosynostosen aufzuklären. Dass BMP2 eine wichtige Rolle

während der Osteoblasten Differenzierung spielt, ist bereits bekannt (LEE et al. 2003; LUU et al.

2007; WANG et al. 2010). Es stellt sich nun die Frage wie ein 345 kb entfernt liegender SNP

Einfluss auf die BMP Expression nehmen kann und dazu führt, dass zusammen mit einer

möglichen SMAD6 Haploinsuffizienz die Frontal- bzw. Sagittalnaht vorzeitig fusionieren. Justice

et al. postulieren, dass der SNP in einer BMP2 regulatorischen Region liegt und dass das

Risikoallel „C“ eine leichte Änderung der Regulation bewirkt und so zu einer geänderten BMP2

Expression beiträgt (JUSTICE et al. 2012). Bisher wurden dazu noch keine funktionellen Analysen

durchgeführt. Der BMP2 Lokus ist allerdings bekannt dafür, dass die BMP2 Expression durch

weit entfernte Regulatorregionen beeinflusst werden kann. So ist beispielsweise eine

Duplikation einer nicht-kodierenden Region, die 110 kb 3‘ von BMP2 lokalisiert ist, assoziiert

mit Brachydaktylie Typ A2. Die duplizierte Region enthält hoch konservierte Bereiche und kann

in einem Reportersystem die spezifische Expression des Reporters in den Extremitäten

vermitteln (DATHE et al. 2009; SU et al. 2011). Eine Analyse der Region des BMP2 Risikoallels

durch den ECR Browser zeigte jedoch, dass der SNP nicht in einer evolutionär konservierten

Region lokalisiert ist. Es sind weiter Studien notwendig, um die Hypothese einer gesteigerten

bzw. veränderten BMP2 Expression durch das Risikoallel zu bestätigen.

4.1.3 WNT Signalweg

Durch Array-CGH wurde bei Patient CRA_59 ein heterozygoter, 3,7 Mb großer Verlust von

7q21.13-q21.3 detektiert. Dieser ist bei dem Patienten de novo entstanden (siehe Abb. 3.10). Bis

auf die Lambdanaht waren alle Schädelnähte vorzeitig fusioniert. Zusätzlich wurde eine leichte

Sprach- und Entwicklungsverzögerung beschrieben (siehe 3.1.6). Von der interstitiellen Deletion

sind über 30 Gene betroffen. Darunter FZD1 und COL1A2. Heterozygote loss-of-function

Mutationen von COL1A2 sind assoziiert mit Osteogenesis Imperfecta (OMIM 259420, 166210,

166220) und Ehlers-Danlos Syndrom Typ 2 (OMIM 617821). Klinisch sind diese Erkrankungen

jedoch nicht passend. Auch sind in der Osteogenesis Imperfecta Variant Database keine

vollständigen Deletionen von COL1A2 aufgeführt. Vermutlich entsteht der Phänotyp eher durch

fehlgebildete Kollagen I Moleküle als durch eine Dosisänderung. FZD1 kodiert für einen Rezeptor

der WNT Liganden und wird in Osteoblasten exprimiert (ZHANG et al. 2010). Der Rezeptor

vermittelt die Signaltransduktion, die dazu führt, dass β-Catenin im Zytoplasma akkumuliert, in

den Zellkern gelangt und die Transkription von Osteoblasten Marker vermittelt (Abb. 4.1). FZD1

könnte somit an dem Gleichgewicht aus Proliferation und Differenzierung in den Osteoblasten

beteiligt sein und wäre eine mögliche Ursache für die beim Patienten vorliegende komplexe

Kraniosynostose. In Zellkultur hat die Reduktion von FZD1 zur Folge, dass die Osteoblasten

Differenzierung und folglich die Mineralisierung der Zellen inhibiert wird (YU et al. 2015; YU et

al. 2016). In vivo hat der Verlust jedoch keinen Effekt, Fzd1-/- Mäuse sind gesund und

4. DISKUSSION

106

phänotypisch unauffällig (YU et al. 2010; LAPOINTE et al. 2012). Diese Studien deuten darauf hin,

dass eine Haploinsuffizienz von FZD1 nicht zu einer Kraniosynostose führt, dennoch kann nicht

ausgeschlossen werden, dass der heterozygote Verlust von FZD1 die Osteoblasten Proliferation

oder Differenzierung beeinflusst.

Es sind sehr wenige Fälle publiziert, die eine interstitielle Deletion der Zytobande 7q21

aufweisen. Die meisten beschriebenen heterozygoten Deletionen betreffen 7q11-q21.3 und sind

somit deutlich größer als der Verlust, der bei Patient CRA_59 detektiert wurde. Es ist schwierig

eine Genotyp-Phänotyp Korrelation zu erstellen, da bei vielen Fällen aufgrund der verwendeten

Analysemethoden nur grobe Angaben der Zytobanden vorhanden sind. Häufig liegt bei den

Patienten eine Entwicklungsverzögerung oder eine Intelligenzminderung sowie verzögertes

Größenwachstum vor. Gemeinsame kraniofaziale Auffälligkeiten sind eine hohe Stirn,

Hypertelorismus, faziale Asymmetrie, tief-sitzende Ohren und Mikrognathie. Bei keinem

Patienten wurde Kraniosynostose festgestellt (COURTENS et al. 2005; KIM et al. 2014). Der Patient

251554 in der DECIPHER Datenbank hat eine heterozygote, 3,4 Mb große Deletion, die

vollständig innerhalb des deletierten Bereichs von Patient CRA_59 liegt. Zu Patient 251554 sind

allerdings keine klinischen Daten vermerkt. Darüber hinaus sind 9 weitere Patienten mit

überlappenden Deletionen, die ebenfalls FZD1 betreffen, in der DECIPHER Datenbank aufgeführt

(Anhang E). Alle Deletionen sind deutlich größer (>10 Mb) als die bei Patient CRA_59 detektierte

Deletion. Die klinischen Auffälligkeiten sind sehr variabel und ergeben keinen spezifischen

Phänotyp. Häufig sind faziale Dysmorphien, Mikrozephalie, Intelligenzminderung, Minderwuchs

sowie Extremitäten Fehlbildungen. Abschließend lässt sich die genaue Ursache für die komplexe

Kraniosynostose bei Patient CRA_59 nicht bestimmen.

4.1.4 IHH Signalweg

Bei einer Patientin CRA_35, die eine syndromale Form der Kraniosynostose hat, wurde eine

unbalancierte Translokation detektiert (siehe 3.1.4). Es liegt ein 29,5 Mb Zugewinn von 2q34-

qter sowie ein 111 kb Verlust von 17q25.3 vor (siehe Abb. 3.8). Die Gene B3GNTL1 und METRNL

sind von dem heterozygoten Verlust betroffen und wurden nicht als klinisch relevant eingestuft.

Von den über 200 Genen innerhalb der Duplikation gibt es bei drei Genen Hinweise auf eine

Assoziation mit Skeletterkrankungen. Hierbei handelt es sich um die Gene PAX3, EPHA4 und IHH.

Loss-of-function Mutationen und Deletionen von PAX3 sind mit dem Waardenburg Syndrom

(OMIM 193500) assoziiert, das sich zusätzlich zu skelettalen Auffälligkeiten durch

Pigmentstörungen und Taubheit auszeichnet, allerdings nicht mit Kraniosynostose in

Verbindung gebracht wird (PINGAULT et al. 2010). In diesem Fall kann das Syndrom

ausgeschlossen werden, da hier ein Zugewinn vorliegt und Patientin CRA_35 weder eine

Pigmentstörung noch eine sensorineurale Hörstörung aufweist. In Mäusen führt der Verlust von

EphA4 zu Koronarnahtsynostosen, bisher wurden jedoch noch keine Mutationen im Menschen

4. DISKUSSION

107

beschrieben (TING et al. 2009). Die wahrscheinlichste Ursache für die bei Patientin CRA_35

vorliegende Kraniosynostose ist der Zugewinn von IHH. Die Signaltransduktion durch IHH ist

hauptsächlich bekannt für die Beteiligung an der Chondrozyten Proliferation und dem

Längenwachstum der Röhrenknochen (BILEZIKIAN et al. 2002). IHH wird jedoch auch in den

Suturen exprimiert und Ihh defiziente Mäuse weisen kleinere Schädelplatten als Kontrollmäuse

auf, was die Vermutung nahelegt, dass IHH auch an der Wachstumsregulation innerhalb der

Suturen beteiligt ist (JACOB et al. 2007; LENTON et al. 2011). Die Signaltransduktion über IHH

verhindert die Bildung der Repressor Form von GLI3 (Abb. 4.1). GLI3R wiederum beeinflusst die

Osteoblasten Differenzierung durch die negative Regulation von RUNX2 (OHBA et al. 2008;

LOPEZ-RIOS et al. 2012). Wie wichtig diese Regulation in Suturen ist, zeigt sich in Gli3-/- Mäusen,

die unter anderem Kraniosynostose entwickeln (RICE et al. 2010). Die Dosisänderung von IHH

durch den Zugewinn bei Patientin CRA_35 könnte also dazu führen, dass die Bildung des

Repressors GLI3R verhindert wird und dadurch die Osteoblasten Differenzierung gesteigert

wird. Unterstützt wird diese These von Studien von Klopocki et al. und Will et al., die zeigen

konnten, dass eine gesteigerte IHH Expression durch Duplikation einer Enhancer Region bei

Patienten und Mäusen zu Kraniosynostose und Syndaktylien führt (KLOPOCKI et al. 2011; WILL et

al. 2017). Den gegenteiligen Effekt zeigt jedoch eine spezifische Ihh Überexpression in kranialen

NLZ. Die Mäuse entwickeln kraniofaziale Malformationen mit Lippen- und Kieferspalten und

bilden keine Schädelplatten (YANG et al. 2016). Dies zeigt allerdings auch, dass IHH an der

Regulation des Schädelwachstums beteiligt ist, auch wenn noch weitere Studien nötig sind, um

zu untersuchen, ob es eventuell eine kritische Grenze für einen IHH Dosis abhängigen Effekt gibt.

In der Literatur sind mehrere Fälle von partiellen 2q Trisomien mit assoziierten Monosomien

anderer Chromosomen beschrieben, allerdings bisher nicht in der Kombination wie sie bei

Patientin CRA_35 vorliegt. Isolierte Trisomien von 2q33-qter sind sehr selten und zeigen je nach

Größe der Region variable, aber auch einige gemeinsame, klinische Merkmale. Zu den häufigsten

Auffälligkeiten zählen faziale Dysmorphien, Extremitätenfehlbildungen, Wachstums- und

Entwicklungsverzögerungen sowie mentale Retardierung. Hypertelorismus, Epikanthus, eine

breite Nasenwurzel, ein langes Philtrum, eine schmale Oberlippe, tief-sitzende Ohren sowie

Mikrognathie sind charakteristische faziale Auffälligkeiten (SLAVOTINEK et al. 2003; ELBRACHT et

al. 2009; PONNALA et al. 2012; MA et al. 2015). Der Phänotyp der Patientin CRA_35 passt in dieses

Phänotypspektrum. Obwohl bei vielen Fällen IHH von der Trisomie betroffen ist, wurde bisher

keine Kraniosynostose bei diesen Patienten beschrieben. Eine prominente Stirn war die

häufigste vermerkte Auffälligkeit des Schädels. Drei Patienten der DECIPHER Datenbank (ID

260838, 265082, 331143) haben ähnlich große Zugewinne, der Großteil der Patienten jedoch

deutlich kleinere, bei denen IHH nicht betroffen ist. Die drei Patienten haben zusätzliche,

klinisch relevante Aberrationen auf den Chromosomen 4, 7, 9 und 17. Der Phänotyp von Patient

260838 ist mit Glaukom und Intelligenzminderung und der von Patient 265082 mit Katarakt,

4. DISKUSSION

108

Nystagmus, Iris Kolobom, Mikrokornea, Mikrophthalmie sowie sekundärer Amenorrhoe

beschrieben. Bei Patientin CRA_35 wurde ebenfalls Glaukom beider Augen diagnostiziert.

Neben IHH wurde in der Kraniosynostose Kohorte auch eine Variante in dessen Rezeptor PTCH1

als mögliche genetische Ursache für eine syndromale Form der Kraniosynostose identifiziert.

Zusätzlich zur Frontalnahtsynostose lagen Syn- und Polydaktlien der Füße vor (siehe 3.2.6). Die

Variante c.3436G>A führt zu einem Aminosäureaustausch von Asparaginsäure 1146 nach

Asparagin (siehe Abb. 3.17). PTCH1 ist ein Transmembran Protein mit 12 Transmembran-

domänen, zwei größeren extrazellullären Proteinloops, die die Bindung mit den HH Liganden

vermitteln, sowie zwei intrazellulärer Domänen (JOHNSON et al. 1996; MARIGO et al. 1996; GONG et

al. 2018). Durch die Ligandenbindung wird die Inhibition des Transmembranproteins SMO

aufgehoben und die Signaltransduktion ins Zytoplasma vermittelt, die, wie bereits erwähnt, dazu

führt, dass die Bildung von GLI3R verhindert wird (Abb. 4.1). Der Aminosäureaustausch

p.D1146N ist in einer hoch konservierten extrazellulären Region (p.1142-1154) lokalisiert.

Mutationen, die zur Haploinsuffizienz von PTCH1 führen, sind assoziiert mit dem Basalzellnävus

Syndrom (BCNS, OMIM 109400). Angeborene Fehlbildungen können bei diesen Patienten sein:

Makrozephalie, mandibuläre Prognathie, ein hoher Gaumen, Rippenanomalien sowie Syn- und

Polydaktylien. Kraniosynostose wurde bisher noch nicht im Zusammenhang mit BCNS

beschrieben. Einige klinische Symptome entwickeln sich erst im Jugend- oder Erwachsenenalter

wie beispielsweise Basalzellkarzinome und Kieferzysten (FUJII AND MIYASHITA 2014).

Homozygote Ptch1 Mutationen in Mäusen sind embryonal letal (GOODRICH et al. 1997; HAHN et al.

1998). Heterozygote Ptch1+/- Mäuse hingegen zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie BCNS

Patienten. Zusätzlich konnte eine gesteigerte Knochenbildung festgestellt werden (GOODRICH et

al. 1997; HAHN et al. 1998; OHBA et al. 2008). Feng et al. beschreiben jedoch auch

Kraniosynostose der Lambdanaht bei Mäusen mit einer Ptch1 Spleißmutation (FENG et al. 2013).

In Zellkultur konnte gezeigt werden, dass Ptch1+/- Vorläuferzellen verstärkt zu Osteoblasten

differenzieren. Des Weiteren wurde eine Reduktion von GLI3R festgestellt (OHBA et al. 2008). Die

genannten Studien, der Zusammenhang von IHH mit Kraniosynostose sowie ein phänotypischer

Vergleich machen es wahrscheinlich, dass die detektierte PTCH1 Variante ursächlich für den

Phänotyp von Patient CRA_43 ist. Eine Änderung der PTCH1 Funktion oder Dosis könnte dazu

führen, dass die Inhibition von SMO reduziert wird und somit verstärkte Signaltransduktion

stattfinden kann. Dadurch wiederum wird die Bildung des Repressors GLI3R verhindert und es

erfolgt eine Änderung in der Kontrolle der Osteoblasten Differenzierung. Da nicht

ausgeschlossen werden kann, dass bei dem Patienten CRA_43 BCNS mit Kraniosynostose

vorliegt, sollte regelmäßige Krebsvorsorge erfolgen. Zum letzten uns bekannten

Untersuchungszeitpunkt zeigte der Patient noch keine Anzeichen für Kieferzysten oder

Basalzellkarzinome.

4. DISKUSSION

109

4.1.5 Transkriptionsfaktoren

Es wurden neue potentiell pathogene Varianten in den Transkriptionsfaktoren MSX2, TCF12

und ERF identifiziert. Diese Transkriptionsfaktoren sind alle an der Osteoblasten

Differenzierung beteiligt und Mutationen ihrer kodierenden Sequenzen sind bereits mit

Kraniosynostose assoziiert. Ihre Pathogenese ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt.

MSX2

Das Gen, das 1993 als erste genetische Ursache für Kraniosynostose identifiziert wurde, ist

MSX2. In einer Familie mit 19 betroffenen Personen über drei Generationen wurde zunächst die

distale Region von 5q mit der Erkrankung assoziiert (MULLER et al. 1993). MSX2 ist auf 5q35.2

lokalisiert und eine Sequenzierung ergab, dass alle Betroffenen die Mutation c.443C>A, p.P148H

tragen (JABS et al. 1993). Die häufigsten phänotypischen Auffälligkeiten sind Kraniosynostose,

starke Kopfschmerzen und Sehschwächen. Seltener sind milde Auffälligkeiten der Hände und

Füße beschrieben (WARMAN et al. 1993). Der Phänotyp der Familie wurde als Kraniosynostose

Typ Boston bezeichnet (Kraniosynostose 2, OMIM 604757). Lange Zeit waren die Betroffenen

dieser Familien die einzigen Kraniosynostose Patienten, in denen eine MSX2 Mutation

nachgewiesen wurde. Erst 2013 und 2017 wurden drei weitere Familien mit Kraniosynostose

und einer möglichen pathogene MSX2 Variante beschrieben (FLORISSON et al. 2013; JANSSEN et al.

2013; MILLER et al. 2017).

Tabelle 4.1: Phänotypischer Vergleich von Kraniosynostose Patienten mit MSX2 p.P148 Substitution

MSX2 Mutation

Schädeldeformation Skelettauffälligkeiten zusätzliche Auffälligkeiten

Familie

CRA_48

3 Patienten

c.442C>G, p.P148A

Koronarnaht-

synostose 2/3

Lambdanahtsynostose 1/3

verkürzte Phalangen

der Daumen 2/3

Sehschwäche 3/3

abfallende

Lidachsen 2/3

Warman et al.

1993

19 Patienten

c.443C>A,

p.P148H

frontoorbitale

Rezession 8/19

prominente Stirn 2/19

Turribrachy-

zephalus 7/19

Kleeblattschädel 2/19

dreigliedriger

Daumen 1/19

verkürzte

Mittelfußknochen 3/19

Weichgaumenspalte 1/19

Sehschwäche 19/19

Kopfschmerzen 5/19

Krampfanfälle 2/19

Florisson et al.

2013

8 Patienten

c.443C>T,

p.P148L

Brachyzephalus 2/8

Turricephalus 2/8

Einzelnahtsynostose 3/8

multiple Synostose 1/8

Brachydaktylie 1/8

Hypertelorismus 2/8

verkürzte Phalangen 3/8

-

Janssen et al.

2013

4 Patienten

c.443C>T,

p.P148L

Skaphozephalus 2/4

Trigonozephalus 1/4

multiple Synostose 1/4

milde Klinodaktylie 1/4 Exophthalmus 2/4

Syndaktylie 2/4

Miller et al.

2017

2 Patienten

c.443C>T,

p.P148L

Koronarnaht-

synostose 2/2

kurze, breite Daumen 1/2

kurzer Kleinfinger 1/2

Klinodakytlie 1/2

Strabismus 1/2

4. DISKUSSION

110

Bei allen Patienten dieser Familien ist auch Prolin an der Position 148 von der Substitution

betroffen (c.443C>T, p.P148L). Innerhalb dieses Projekts konnte bei Patient CRA_48 an gleicher

Aminosäureposition ein Austausch nachgewiesen werden, der innerhalb der Familie mit der

Erkrankung segregiert (siehe Abb. 3.18). Hier erfolgt der Austausch von Prolin nach Alanin

(c.442C>G, p.P148A). Tabelle 4.1 zeigt den Vergleich der beschriebenen klinischen Merkmale

aller Familien. Hier zeigt sich, dass auch intrafamiliär eine hohe phänotypische Variabilität

vorliegt. Neben Kraniosynostosen haben viele der Patienten milde Auffälligkeiten an den

Händen und/oder Füßen sowie Sehschwächen.

MSX1 und MSX2 zählen zu den Homöobox Proteinen und sind Transkriptionsfaktoren. Während

der Embryonalentwicklung wird MSX2 unter anderem in den kranialen NLZ und an den

Wachstumsfronten in den Suturen exprimiert (HILL et al. 1989; MACKENZIE et al. 1991; LIU et al.

1996). Die Bindung an DNA erfolgt über die Homöodomäne des Proteins. Die Domäne ist 60

Aminosäuren lang (MSX2 p.141-201) und bildet drei α-Helices aus, von denen zwei eine helix-

loop-helix Struktur formen. Die Aminosäuresequenz der Homöodomäne ist evolutionär hoch

konserviert (Abb. 4.3). In allen Kraniosynostose 2 Fällen ist die Aminosäure Prolin an der

Position 148 von einem Austausch betroffen (Abb. 4.3 gelbe Markierung). Dieser N-terminale

Bereich interagiert während der DNA-Bindung mit der kleinen Furche der DNA (HOVDE et al.

2001). Es konnte in vitro gezeigt werden, dass das veränderte P148H Protein eine höhere DNA

Bindeaffinität hat als das wildtypische Protein (MA et al. 1996). Des Weiteren führt die transgene

Expression des P148H Proteins in Mäusen zu einem gesteigerten Wachstum der parietalen

Schädelplatten und letztendlich zu deren Fusion (LIU et al. 1995). Dies lässt einen

Funktionsgewinn durch die Mutation P148H vermuten. Möglicherweise liegt bei P148L und

P148A der gleiche Mechanismus vor, allerdings wurden dazu noch keine funktionellen Analysen

durchgeführt. Interessant wäre, neben der Analyse der DNA Bindeaffinität, auch die

Untersuchung des Einfluss der Varianten auf die transkriptionelle Aktivität von MSX2, durch

beispielsweise Luziferase-Reporter Assays. Zellkultursysteme mit Osteoblasten Vorläufern

könnten zur Analyse der Auswirkungen der MSX2 Varianten auf die Osteoblasten

Differenzierung verwendet werden. In vivo könnten die Varianten z.B. im Tiermodell Danio rerio

untersucht werden.

Im Gegensatz zur transgenen Msx2-P148H Expression zeigen Msx2 defiziente Mäuse eine

verzögerte Ossifikation des Schädels durch eine gestörte Proliferation der Osteoblasten

Vorläuferzellen (SATOKATA et al. 2000). Diese Studie verdeutlicht, dass MSX2 eine wichtige Rolle

in der Regulation der Osteoblasten Differenzierung einnimmt. Auch im Menschen führen

heterozygote loss-of-function Mutationen oder Deletionen von MSX2 zu einer defekten

Ossifikation der Os parietale (WILKIE et al. 2000; WUYTS et al. 2000; GARCIA-MINAUR et al. 2003;

MAVROGIANNIS et al. 2006). Diese Erkrankung wird als Parietale Foramina 1 (OMIM 168500)

bezeichnet. Die meisten Mutationen sind hierbei ebenfalls in der Homöodomäne lokalisiert (Abb.

4. DISKUSSION

111

4.2). Wilkie et al. konnten in vitro für die Mutationen p.159-160RKdel und p.R172H eine deutlich

verringerte DNA Bindeaffinität zeigen (WILKIE et al. 2000).

Abbildung 4.3: Aminosäure Alignment der MSX2 Homöodomäne verschiedener Spezies. Der Vergleich der MSX2 Homöodomäne-Sequenzen von Mensch, Maus, Huhn, Zebrafisch und Fruchtfliege zeigt, dass die Domäne evolutionär hoch konserviert ist. Prolin 148, die beschriebenen Mutationen und die Variante der Familie CRA_48 sind markiert. Des Weiteren sind beispielhaft vier Mutationen der Domäne aufgeführt, die mit Parietale Foramina 1 assoziiert sind.

Der Einfluss von MSX2 auf die Osteoblasten Differenzierung scheint komplex zu sein und der

genaue Mechanismus ist noch nicht vollständig geklärt. Die bereits genannten Studien führen zu

der Annahme, dass MSX2 fördernd auf die Osteoblasten Differenzierung wirkt. Wie bereits

erwähnt, ist die Proliferation von Osteoblasten Vorläuferzellen in Msx2-/- Mäusen reduziert.

Damit verbunden ist eine Reduktion der Runx2 Expression (SATOKATA et al. 2000). Msx2

reguliert die Runx2 Expression in der frühen Phase der Osteoblasten Differenzierung. Ichida et

al. konnten außerdem zeigen, dass in den Vorläuferzellen die Adipozyten Differenzierung

inhibiert und damit die Differenzierung zu Osteoblasten begünstigt wird (ICHIDA et al. 2004).

Zusätzlich kann MSX2 die Proliferation der Vorläuferzellen stimulieren (DODIG et al. 1996; LIU et

al. 1999; ISHII et al. 2003). Weitere in vitro Studien zeigen jedoch, dass MSX2 auch einen

negativen Effekt auf die Differenzierung bzw. die Expression von Osteoblasten Markern haben

kann. Beispiel hierfür ist die Bindung von Msx2 an den Osteocalcin Promotor und der damit

verbundenen Transkriptionsinhibition von Osteocalcin. Gleiches konnte auch für Typ I Kollagen

gezeigt werden (TOWLER et al. 1994; DODIG et al. 1996; HOFFMANN et al. 1996; NEWBERRY et al.

1997). Diese Gene werden allerdings erst in der späteren Phase der Differenzierung exprimiert.

Im Gegensatz zum fördernden Einfluss auf die Runx2 Expression, steht die Inhibition der Runx2

Aktivität durch die direkte Bindung von Msx2 an Runx2 (SHIRAKABE et al. 2001). Diese

gegensätzlichen Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass MSX2 in der frühen und späten Phase

der Osteoblasten Differenzierung unterschiedliche Funktionen hat und somit eine wichtige Rolle

bei der Erhaltung der Balance von Proliferation und Differenzierung innerhalb der Suturen

einnimmt. Wie wichtig in diesem Gleichgewicht die Dosis von MSX2 ist, zeigte die

humanFamilie CRA_48 Jabs et al. 1993Florisson et al. 2013Janssen et al. 2013MausHuhnZebrafischFruchtfliege

loss-of function Mutationen assoziiert mit Parietaler Foramina 1

Wilkie et al. 2000Wilkie et al. 2000Wuyts et al. 2000Mavrogiannis et al. 2006

NRKPRTPFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTAFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTHFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTLFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTLFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTPFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTPFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTPFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLTLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTPFTTQQLLSLEKKFREKQYLSIAERAEFSSSLRLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQ

NRKPRTPFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAEHAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTPFTTSQLLALE FRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTPFTTSQPLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQNRKPRTPFTTSQLLPAPRPGAQVPSETVPLHCRACRVLQLSEPHRDPGQNLVPEPKGQGE

MSX2 Homöodomäne (60 AS)

4. DISKUSSION

112

Überexpression von wildtypischem Msx2 in Mäusen. Eine gesteigerte Proliferation der

Osteoblasten Vorläufer und Fusion der Schädelplatten waren die Folgen in diesen Mäusen (LIU et

al. 1995; LIU et al. 1999). Innerhalb der Kraniosynostose Kohorte wurde bei den beiden

Patientinnen CRA_32 und CRA_58 partielle Trisomien von 5q durch Array-CGH nachgewiesen

(siehe Abb. 3.6 und 3.8). Beide Aberrationen führen zu einem Zugewinn von MSX2 und einigen

anderen Genen. Bei Patientin CRA_32 wurde neben dem ca. 8 Mb Zugewinn von 5q auch ein 1,5

Mb Verlust von 2q detektiert, der als pathogen eingestuft wurde. Phänotypisch zeigten sich

Fusion multipler Suturen, faziale Dysmorphien und eine Entwicklungsverzögerung (siehe 3.1.3)

(KÖNIG et al. 2015). Eine unbalancierte Translokation mit 14 Mb großer, partieller 5q Trisomie

und 4 Mb großer, partieller 8q Monosomie wurde bei Patientin CRA_58 nachgewiesen.

Zusätzlich zur Pansynostose und fazialen Dysmorphien wurden bei ihr ein Hydrozephalus,

Mittelgesichtshypoplasie und eine Chari II Malformation festgestellt (siehe 3.1.5). Bei beiden

Patientinnen ist die vorzeitige Fusion von Schädelnähten sehr wahrscheinlich auf einen

Zugewinn von MSX2 zurückzuführen. In der Literatur sind mehrere Fälle von partieller 5q

Trisomie, sowohl isoliert als auch in Kombination mit weiteren chromosomalen Aberrationen,

beschrieben. Die Patienten zeigen einen sehr variablen Phänotyp mit Kleinwuchs,

Mikrozephalie, kraniofazialen Auffälligkeiten und mentaler Retardierung. Seltener sind auch

Fehlbildungen der Extremitäten, Herzerkrankungen oder Hernien beschrieben (RODEWALD et al.

1980; KUMAR et al. 1987; HUNTER et al. 2005; CHEN et al. 2006; KARIMINEJAD et al. 2009). Bei 13

dieser Patienten liegt nachgewiesen eine Kraniosynostose vor (KUMAR et al. 1987; ELIAS-JONES et

al. 1988; VAN DER BURGT et al. 1992; SCHIMMENTI et al. 1995; WYSOCKA et al. 2002; SHIIHARA et al.

2004; BERNARDINI et al. 2007; WANG et al. 2007b; KARIMINEJAD et al. 2009; VASQUEZ-VELASQUEZ et

al. 2011; PELEGRINO KDE et al. 2012).

Abbildung 4.4: Vergleich partieller 5q Trisomien von Kraniosynostose Patienten. Der Bereich 5q33.3-qter ist vergrößert dargestellt und die Position von MSX2 auf Chromosom 5 gekennzeichnet. Die Duplikationen der Patientinnen CRA_32 und CRA_58 sind hervorgehoben. Die Trisomien wurden durch Karyogramme, CGH oder Array-CGH detektiert.

Chromosom 5

Shiihara et al. 2004

180.000.000

5q345q33.3 5q35.25q35.1 5q35.3

175.000.000170.000.000165.000.000160.000.000

MSX2

Bernardini et al. 2007

Wang et al. 2007, Patient 1

Wang et al. 2007, Patient 2

Kariminejad et al. 2009

Pelegrino et al. 2012

Patientin CRA_32

Patientin CRA_59

DECIPHER ID 273674

DECIPHER ID 284051

[hg19]

4. DISKUSSION

113

Abbildung 4.4 zeigt einen Vergleich der partiellen 5q Trisomien von 6 dieser Kraniosynostose

Patienten mit denen von den Patientinnen CRA_32 und CRA_58 sowie beispielhaft von zwei

DECIPHER Patienten (ID 273674 und 284051). Die phänotypischen Merkmale werden in Tabelle

4.2 verglichen. Bei den 5q Aberrationen handelt es sich hauptsächlich um distale Trisomien der

Zytobanden 5q33-qter, die alle auch MSX2 betreffen. Insgesamt sind in DECIPHER 7 Patienten

gelistet, bei denen dies auch der Fall ist (DECIPHER IDs 282073, 273674, 285499, 280719,

282379, 278114, 284051). Patient 273674 weist als einziger eine Kraniosynostose auf.

Abgesehen von Patient 284051, für den eine abnormale Gesichtsform vermerkt ist, wurden bei

den anderen Patienten keine kraniofazialen Auffälligkeiten beschrieben. Proximal gelegenere

Trisomien sind bisher nicht mit Kraniosynostose assoziiert. Allerdings ist Kraniosynostose auch

nicht bei allen Patienten mit distalen Trisomien mit MSX2 beschrieben. Häufig sind bei diesen

jedoch auch auffällige Kopfformen vermerkt. Die Daten von gain-of-function und loss-of-function

Mutationen sowie Überexpression von MSX2 zeigen, dass für eine normale Schädelentwicklung

eine korrekte MSX2 Funktion und Dosis notwendig ist.

Tabelle 4.2: Klinische Auffälligkeiten von Patienten mit partieller 5q Trisomie

5q Trisomie

weitere Aberration

Kranio-synostose

kraniofaziale Dysmorphien zusätzliche Auffälligkeiten

Patientin CRA_32

5q35.2-qter Monosomie 2q37.3-qter

koronar, lambda

Plagiozephalus / Mikrozephalus / Strabismus / abfallende Lidspalten / spitze Nase / flaches Philtrum / schmale Oberlippe / kleiner Mund / weit auseinanderstehende Zähne

Hypotonie / breite Daumen / Entwicklungs-verzögerung

Patientin CRA_58

5q34-qter Monosomie 8p23.3-pter

Kleeblatt-schädel

Mittelgesichtshypoplasie / Exophthalmus / Epikanthus / tief-sitzende Augen / hoher Gaumen

Chiari II Malformation / Antepositio ani / Klitoromegalie

Shiihara et al. 2004

5q33.3-qter Monosomie13q34-qter

sagittal, lambda

Turrizephalus / Hypertelorismus / schmale Unterlippe / kleiner Mund / hoher Gaumen / tief-sitzende Ohren

Herzfehler

Bernardini et al. 2007

5q35-qter - metopisch, sagittal, lambda

milder Exophthalmus / abfallende Lidspalten / kleine Nase / langes Philtrum / kleiner Mund / schmale Unterlippe / hoher Gaumen / tief-sitzende. rotierte Ohren

Herzfehler / Hypotonie / Wachstums-verzögerung / Leistenhernie / schwerer Reflux / Entwicklungs-verzögerung

Wang et al. 2007 Patient 1

5q33-qter Monosomie 10q26.3-qter

metopisch, sagittal, lambda

Brachyzephalus / hohe Stirn / abfallende Lidspalten / kurze Nase / langes Philtrum / schmale Unterlippe / tief-sitzende, rotierte Ohren

breite Daumen + Großzehe / Syndaktylie der II.-III. Zehen / Entwicklungs-verzögerung

4. DISKUSSION

114

Wang et al. 2007 Patient 2

5q35.1-qter Monosomie17p13.3-pter

metopisch Epikanthus / kurze Nase / hoher Gaumen / kleiner Mund

Brachyklino-daktylie V. Finger / milde Syndaktylie der II.-III. Zehen

Kariminejad et al. 2009

5q34-qter Monosomie 2q37

metopisch, koronar

Hypertelorismus / abfallende Lidachsen / Epikanthus / kleine Nase / langes Philtrum / kleiner Mund / schmale Lippen / hoher Gaumen

Leistenhernie / Entwicklungs-verzögerung

Pelegrino et al. 2012

5q35.2 Monosomie 4q22.1, 8p24.3, 9q34, 2q34.3

koronar Strabismus / ansteigende Lidachsen / hoher Gaumen / tief-sitzende, rotierte Ohren / Retrognathie

Hypotonie / Hyponatriämie / Entwicklungs-verzögerung

DECIPHER ID 273674

5q35.1-qter Monosomie 5p14.3-pter

metopisch Mikrozephalie / Mittelgesichts-hypoplasie / Hypotelorismus / Strabismus / ansteigende Lidspalten / schmale Lippen / langes Philtrum / hoher Gaumen

Kniefehlstellung / Klinodaktylie V. Finger / Intelligenz-minderung

Der Phänotyp der Patientinnen CRA_32 und CRA_58 wird wahrscheinlich nicht nur durch die

partielle 5q Trisomie verursacht, sondern die detektierten Monosomien tragen ebenfalls dazu

bei. Partielle Monosomien von 2q und 8p wurden in der Literatur häufig beschrieben.

Auch wenn der Phänotyp variabel ausgeprägt ist, so zeigen Patienten mit 2q37

Deletionssyndrom (OMIM 600430) gemeinsame kraniofaziale Dysmorphien, wie eine

prominente Stirn, eine eingesunkene Nasenwurzel, tief-sitzende Augen mit aufwärts zeigenden

Lidspalten, volle Wangen und eine dünne Unterlippe. Zusätzlich sind kardiale, gastrointestinale

oder renale Fehlbildungen in ca. 30% der Patienten beschrieben. Bisher ist bei keinem Patienten

Kraniosynostose festgestellt worden (FALK AND CASAS 2007). Vor allem kraniofazial zeigt

Patientin CRA_32 eine phänotypische Überlappung mit dem 2q37 Deletionssyndrom (siehe

3.1.3). Kariminejad et al. beschreiben einen Patienten, der die gleiche Kombination an

chromosomalen Aberrationen zeigt wie Patientin CRA_32 (KARIMINEJAD et al. 2009). Wie in

Tabelle 4.2 gezeigt, haben beide einen sehr ähnlichen Phänotyp.

In der Zytobande 8p23.1 sind segmentale Duplikationen lokalisiert, die dazu führen, dass

chromosomale Veränderungen der distalen 8p Region relativ häufig sind (HOLLOX et al. 2008). In

der Literatur sind ca. 50 Fälle von terminalen 8p Monosomien beschrieben, die in ihrer Größe

jedoch stark variieren und damit auch der assoziierte Phänotyp. Fünf Patienten mit isolierter

8p23.1-pter Monosomie zeigen gemeinsame klinische Merkmale wie Wachstumsverzögerung,

Mikrozephalie und milde faziale Dysmorphien. Intelligenzminderung, Verzögerung der

sprachlichen Entwicklung und Verhaltensauffälligkeiten wurden ebenfalls beschrieben,

allerdings keine Kraniosynostose (CHIEN et al. 2010; WU et al. 2010; BURNSIDE et al. 2013; SHI et

al. 2017). Einige dieser klinischen Merkmale zeigt auch Patientin CRA_58 (siehe 3.1.5).

4. DISKUSSION

115

TCF12

TCF12 gehört zusammen mit TCF3 und TCF4 zu der Familie der E Proteine (Murre 1989). Neben

einer basic helix-loop-helix (bHLH) Domäne besitzt TCF12 eine Repressordomäne und zwei

Aktivierungsdomänen. Neben dem Haupttranskript NM_207037.1, das 21 Exons umfasst, kann

auch ein alternatives, verkürztes Transkript NM_207040 durch einen alternativen

Transkriptionsstart am sogenannten Exon 9A, sowie Spleißvarianten dieser Transkripte gebildet

werden (WANG et al. 2006). Exon 9A ist in dem längeren Transkript nicht enthalten. Von beiden

Transkripten entstehen funktionelle Proteine, die unterschiedliche Funktionen haben können

(WANG et al. 2006). Verschiedene Studien deuten auf eine TCF12 Beteiligung an der T-Zell

Entwicklung, Neurogenese, Myogenese sowie der Metastasenbildung bei Dickdarmkrebs hin (HU

et al. 1992; NEUMAN et al. 1993; BARNDT et al. 2000; WANG et al. 2006; LEE et al. 2012). 2013

wurde TCF12 erstmals mit Kraniosynostose assoziiert. Sharma et al. identifizierten 36

unterschiedliche, heterozygote TCF12 Mutationen in Patienten mit unilateraler oder bilateraler

Kraniosynostose (SHARMA et al. 2013). Daraufhin wurde das TCF12 Mutationsspektrum durch

Studien von di Rocco et al. und Paumard-Hernandez et al. erweitert (DI ROCCO et al. 2014;

PAUMARD-HERNANDEZ et al. 2015). Hierbei handelt es sich bei den Mutationen um loss-of-function

Mutationen, die hauptsächlich zwischen Exon 10 und Exon 19 lokalisiert sind. Die Exons in

diesem Bereich kodieren für die Aktivierungsdomäne 2, die Repressordomäne und die bHLH

Domäne (Abb. 4.5). TCF12 Mutationen führen bei fast alle Patienten zu Koronarnahtsynostosen.

Sofern weitere klinische Merkmale vorhanden sind, sind diese sehr variabel und können mit den

klinischen Auffälligkeiten des Saethre-Chotzen Syndroms überlappen. So sind neben fazialen

Dysmorphien Auffälligkeiten der Extremitäten sowie Entwicklungsverzögerung oder

Lernschwächen beschrieben (SHARMA et al. 2013; DI ROCCO et al. 2014; PAUMARD-HERNANDEZ et al.

2015; LEE et al. 2017). Des Weiteren zeigte sich, dass klinisch unauffällige Familienmitglieder die

gleiche Mutation tragen können wie das betroffene Mitglied. Die unvollständige Penetranz lag in

der Studie von Sharma et al. bei 53% (SHARMA et al. 2013).

Innerhalb dieser Arbeit wurden durch das Kraniosynostose Panel bei drei Patienten potentiell

pathogene TCF12 Varianten detektiert (siehe 3.2.9, 3.2.10 und 3.2.11). Alle drei Varianten führen

sehr wahrscheinlich zu einer Haploinsuffizienz von TCF12 durch eine Leserasterverschiebung

(c.825delG, p.S276Vfs*12), eine veränderte Spleißstelle (c.1036-1G>C) und ein vorzeitiges

Stopcodon (c.1885C>T, p.Q629*) (NM_207037.1).

4. DISKUSSION

116

Abbildung 4.5: Lokalisation der detektieren TCF12 Varianten. Die Varianten der Patienten CRA_56, CRA_64 und CRA_80 sind sowohl im Gen als auch im Protein gekennzeichnet. Die Spleißvariante c.1036-1G>C wird im Protein jedoch nicht dargestellt. TCF12 besitzt 21 Exons, von denen Exon 1 und 21 nicht kodierend sind (weiß). Der alternative Transkriptionsstart Exon 9A ist in grau dargestellt und ist in dem Haupttranskript NM_207037.1 nicht enthalten. Das Protein besteht aus 706 Aminosäuren und enthält zwei Aktivierungsdomänen (AD1 und AD2), eine Repressordomäne (Rep) und eine bHLH Domäne.

Das Stopcodon entsteht innerhalb der bHLH Domäne und führt dazu, dass diese nicht mehr

vollständig im Protein enthalten ist (Abb. 4.5).

Der Nukleotidaustausch am Spleißakzeptor von Exon 13 (c.1036-1G>C) ändert laut Vorhersage-

programmen dessen Sequenz so, dass das Spleißosom den Akzeptor nicht mehr erkennen würde

(siehe Abb. 3.22). Da eine Analyse der Patienten mRNA auf ein verändertes Spleißmuster nicht

möglich war, wurde die Variante in einem in vitro Spleißsystem analysiert (siehe 3.4.1 C). Hier

zeigte sich, dass die Variante eine Änderung des Spleißmusters bewirkt. Es werden zwei

alternative Spleißakzeptoren innerhalb von Exon 13 genutzt (siehe Abb. 3.25). Die alternativen

Exongrenzen lägen bei c.1059 und c.1062. Dies hätte in beiden Fällen eine

Leserasterverschiebung mit einem vorzeitigen Stopcodon zur Folge. Große Teile der

Aktivierungsdomäne 2, die Repressordomäne sowie die bHLH Domäne würden in den

trunkierten Proteinen fehlen und somit würde eine Haploinsuffizienz von TCF12 vorliegen.

Bei Patientin CRA_64 ist das letzte Nukleotid von Exon 10 deletiert (c.825delG), wodurch zwei

loss-of-function Effekte möglich sind (siehe Abb. 3.21). Zum einen führt die Deletion zu einer

Leserasterverschiebung mit einem vorzeitigen Stopcodon (p.S276Vfs*12). Das verkürzte

Proteine würde nur die Aktivierungsdomäne 1 enthalten und wäre somit nicht funktionell. Zum

anderen könnte die Deletion auch das Spleißverhalten beeinflussen, da dadurch der Spleißdonor

geschwächt wird. Die in vitro Analyse in dem Minigensystem zeigte, dass ein kryptischer

Spleißdonor in Intron 10-11 genutzt wird und das Transkript 22 bp intronische Sequenz enthält,

was zu einem vorzeitigen Stopcodon führt (siehe Abb. 3.24). Somit scheint die Variante

c.825delG in jedem Fall in eine TCF12 Haploinsuffizienz zu resultieren. Im in vitro Spleißsystem

führten jedoch sowohl Wildtyp als auch Variante in manchen Transkripten zu einem Exon

Skipping von Exon 10. Möglicherweise wurden in den Vektor nicht alle intronischen

10 kb

130 kb 63 kb1 10 13 19 21

c.825delG c.1036-1G>C c.1885C>T

TCF12 Gen

TCF12 Protein

9A

1 109 160 329 523 540 570 599 655 706

p.S276Vfs*12 p.Q629*

AD1 AD2 Rep bHLH

4. DISKUSSION

117

Sequenzelemente, die für das effiziente Spleißen von Exon 10 notwendig sind, eingebracht. Mit

dem in vitro System kann nur ein kleiner Teil der prämRNA dargestellt werden.

Der Phänotyp der drei Patienten variiert stark, von isolierter bilateraler Koronarnahtsynostose

bis zu Kleeblattschädel mit zusätzlichen klinischen Auffälligkeiten.

Neben den drei Sequenzvarianten konnte durch Array-CGH eine heterozygote, partielle Deletion

von TCF12 bei den Zwillingsbrüdern CRA_1 und CRA_2 detektiert werden (Abb. 4.6). Die 193 kb

große Deletion wurde durch qPCR validiert und betrifft Exon 6 bis Exon 21 von TCF12 (siehe

Abb. 3.2) Das entstehende Protein wäre stark verkürzt und alle wichtigen Domänen würden

fehlen, sodass in diesem Fall auch eine Haploinsuffizienz von TCF12 vorliegt. Die Aberration

wurde maternal vererbt. Patient CRA_1 hat eine unilaterale und Patient CRA_2 bilaterale

Koronarnahtsynostose. Die Mutter hingegen ist phänotypisch unauffällig, sodass man davon

ausgehen kann, dass in dieser Familie auch unvollständige Penetranz vorliegt. In der Literatur

sind weitere Kraniosynostose Fälle mit chromosomalen Veränderungen, die TCF12 betreffen,

beschrieben (Abb. 4.6).

Abbildung 4.6: Positionsvergleich von TCF12 Deletionen und Duplikationen assoziiert mit Kraniosynostose. Das TCF12 Gen ist auf Chromosom 15 (15q21.3) lokalisiert. Bereits publizierte Fälle weisen sowohl intragenische Deletionen und Duplikationen als auch Deletionen des ganzen Gens auf (HIRAKI et al. 2008; LE TANNO et al. 2014; GOOS et al. 2016). Dabei sind die intragenischen Veränderungen nur am 3’Ende des Gens lokalisiert.

Hierbei handelt es sich sowohl um intragenische Deletionen und Duplikationen, die nur wenige

Exons betreffen, als auch um größere Deletionen, die mehrere Gene umfassen (FUKUSHIMA et al.

1990; HIRAKI et al. 2008; LE TANNO et al. 2014; GOOS et al. 2016). Die heterozygoten,

intragenischen Deletionen betreffen entweder die Aktivierungsdomäne 2 oder die bHLH

Domäne und führen somit zu einem nicht-funktionellen Protein (GOOS et al. 2016). Die

betroffenen Kraniosynostose Patienten zeigen, wie auch die Patienten mit TCF12 Mutationen,

einen variablen Phänotyp. Dadurch lässt sich keine Genotyp-Phänotyp Korrelation feststellen.

Chromosom 15

193 kb DEL Patienten CRA_1 und CRA_2

15q21.3

57.300.00057.250.000[hg19] 57.350.000 57.400.000 57.450.000 57.500.000 57.550.000 57.600.000

TCF12

3,64 Mb DEL Le Tanno et al. 2013

17,7 Mb DEL Hiraki et al. 2008

85 kb DEL Patient 1 Goos et al. 2016

5,3 kb DEL Patient 3 Goos et al. 2016

8,5 kb DEL Patient 2 Goos et al. 2016

11,3 kb DUP Patient 4 Goos et al. 2016

4. DISKUSSION

118

Manche Patienten mit nur kleinen Deletionen zeigen einen syndromalen Phänotyp, andere

Patienten, bei denen die gleiche Region oder das gesamte TCF12 Gen betroffen ist, zeigen einen

milderen Phänotyp (FUKUSHIMA et al. 1990; HIRAKI et al. 2008; LE TANNO et al. 2014; GOOS et al.

2016). Des Weiteren beschriebt Piard et al. eine Patientin ohne Kraniosynostose, die eine 120 kb

Deletion besitzt, die Exon 19 bis 21 von TCF12 betrifft. Bei ihr wurden faziale Asymmetrie,

Entwicklungsverzögerung sowie Intelligenzminderung festgestellt (PIARD et al. 2015). Die

Datenbank DECIPHER ergab 12 Patienten, die überlappende Deletionen für diesen

Chromosomen Abschnitt besitzen. Alle Deletionen sind deutlich größer (>500 kb) als die von

den Patienten CRA_1 und CRA_2 (Anhang E). Für 8 Patienten sind klinische Daten hinterlegt

worden. Diese Beschreibungen beinhalten jedoch weder Kraniosynostose noch den Vermerk

einer auffälligen Kopfform. Das häufigste Merkmal ist Intelligenzminderung.

Die Pathogenese von TCF12 Haploinsuffizienz ist noch nicht vollständig geklärt. Yi et al. konnten

jedoch zeigen, dass eine TCF12 Überexpression die Osteoblasten Differenzierung von

mesenchymalen Stammzellen inhibiert. Die Herunterregulierung von TCF12 hingegen fördert

die Differenzierung und ist mit einem Anstieg an BMP Signalen verbunden (Yi 2017). Hierbei

scheint die Heterodimerbildung mit TWIST1 eine wichtige Rolle zu spielen (Abb. 4.1). Wie in

Kapitel 1.4 erläutert, kann TWIST1 Heterodimere mit E Proteinen bilden (T/E) und tut dies auch

nachweislich mit TCF12 (CONNERNEY et al. 2006). Zusätzlich konnte in vitro gezeigt werden, dass

TWIST1 und TCF12 zusammen eine deutlich höhere transkriptionelle Aktivität zeigen als die

jeweiligen einzelnen Proteine (SHARMA et al. 2013). T/E Dimere sind vor allem in Bereichen der

Wachstumsfronten lokalisiert, an denen sie die Expression von FGFR2 und damit die

Proliferation der Zellen inhibieren. Sie tragen somit zu dem Gleichgewicht aus Proliferation und

Differenzierung in den Suturen bei. Dies führt zur Annahme, dass Haploinsuffizienzen der

Dimerpartner TWIST1 und TCF12 ein Ungleichgewicht innerhalb der Suturen bewirken, was

wiederum zu einer vorzeitigen Fusion führen kann. Wie wichtig TWIST1 und TCF12 zusammen

für die Erhaltung der Suturen sind, wurde in Mausstudien gezeigt. Beide Koronarnähte waren

bei fast allen Twist1+/-, Tcf12flox/+ Mäusen vollständig fusioniert. Dahingegen trat bei Twist+/-

Mäusen eine Fusion nur partiell und bei Tcf12flox/+ Mäusen keine Fusion auf (SHARMA et al. 2013).

Die Diskrepanz zwischen Haploinsuffizienz in Mäusen und im Menschen könnte daran liegen,

dass die humanen Koronarnähte sensitiver auf Dosisänderungen von TCF12 reagieren. Ein

Knockout von Tcf12 in Mäusen führt zu Defekten in der Entwicklung des Immunsystems (WANG

et al. 2006; WOJCIECHOWSKI et al. 2007). Sharma et al. konnten allerdings weder eine erhöhte

Infektanfälligkeit noch Änderungen der Zellen des Immunsystems bei TCF12 Patienten

feststellen (SHARMA et al. 2013). Zur weiteren Aufklärung der TCF12 Funktion werden in unserer

Arbeitsgruppe von R. Blümel verschiedene Zebrafischlinien erstellt und in einem Reporter

System die Auswirkungen der humanen TCF12 Mutationen auf die transkriptionelle Aktivität

untersucht.

4. DISKUSSION

119

ERF

ERF (ETS2) gehört zu der Familie der ETS Transkriptionsfaktoren und wirkt als

transkriptioneller Repressor. Neben einer Repressordomäne und einer DNA-Bindedomäne

besitzt ERF auch eine ERK Bindedomäne. ERF wird ubiquitär, unter anderem an den

Wachstumsfronten der Schädelplatten, exprimiert und ist an der Regulation der zellulären

Proliferation beteiligt (LE GALLIC et al. 1999; HOLLENHORST et al. 2011; TWIGG et al. 2013). Twigg

et al. assoziierten heterozygote loss-of-function Mutationen von ERF mit Kraniosynostose (TWIGG

et al. 2013). Hierbei sind häufig multiple Suturen von einer Fusion betroffen. Kraniofaziale

Auffälligkeiten wie Hypertelorismus oder eine prominente Stirn, Chiari Malformation sowie

sprachliche Entwicklungsverzögerung gehören ebenfalls zum phänotypischen Spektrum (TWIGG

et al. 2013; CHAUDHRY et al. 2015). Durch NGS Panel Analyse wurde bei Patientin CRA_34 eine

1 bp Deletion im ERF Gen detektiert, die zu einer Verschiebung des Leserasters und folglich zu

einem vorzeitigen Stopcodon führt (c.151del G, p.D51Tfs*26; siehe Abb. 3.16). Von dem

vorzeitigen Stopp sind alle ERF Proteindomänen betroffen, sodass davon ausgegangen werden

kann, dass die Variante zu einer ERF Haploinsuffizienz bei der Patientin führt. Die klinisch

ebenfalls betroffene Schwester trägt die gleiche Variante. Bei beiden liegt eine

Sagittalnahtsynostose, Hypertelorismus, Exophthalmus, eine sprachliche

Entwicklungsverzögerung sowie eine Lernstörung vor. Der Phänotyp passt zu den bereits

beschriebenen Patienten mit ERF Mutation. Die Segregationsanalyse wies die Variante auch bei

dem phänotypisch unauffälligen Vater nach. Dennoch wird die Variante als wahrscheinlich

pathogen eingestuft, da in der Studie von Twigg et al. ebenfalls Familienmitglieder beschrieben

sind, die Anlageträger sind, aber nur milde kraniofaziale Auffälligkeiten zeigen, sodass

vermutlich unvollständige Penetranz vorliegt (TWIGG et al. 2013). In Mäusen führt der

heterozygote Verlust von Erf zu keinem Phänotyp. Im Gegensatz dazu ist der homozygote

Verlust schon embryonal letal (PAPADAKI et al. 2007). Um die embryonale Sterblichkeit zu

umgehen wurde ein Allel konditionell deletiert. Bei diesen ErffloxP/- Mäusen sind mehrere Suturen

von Kraniosynostose betroffen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass ERF in der Nähe von

RUNX2 Bindestellen an die DNA bindet und die transaktivierende Aktivität von RUNX2 hemmen

kann (Abb. 4.1) (TWIGG et al. 2013). Möglicherweise hat die ERF Bindung Einfluss auf die Bildung

regulatorischer Komplexe anderer Transkriptionsfaktoren wie RUNX2 und beeinflusst dadurch

die Transkription von Osteoblasten Markern. Eine ERF Haploinsuffizienz könnte zu einer

Aufhebung der transkriptionellen Suppression und damit einer unregulierten Proliferation und

Differenzierung führen. Es sind jedoch weitere Studien nötig um die genaue Interaktion von ERF

mit RUNX2 aufzuklären. Die Wirkung von ERF kann durch die Effektorkinase ERK1 und somit

auch durch den FGF Signalweg, reguliert werden. ERF kann an ERK1 binden und wird von dieser

an mehreren Stellen phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt den Export von ERF aus dem

Zellkern (Abb. 4.1) (LE GALLIC et al. 2004; POLYCHRONOPOULOS et al. 2006).

4. DISKUSSION

120

4.1.6 weitere Faktoren

MEGF8

Twigg et al. identifizierten homozygote und compound heterozygote Mutationen in dem Gen

MEGF8 als genetische Ursache für einen syndromalen Phänotyp bei vier Patienten. Neben

Kraniosynostose und fazialen Dysmorphien können bei den Patienten auch Polysyndaktylien,

Adipositas, Hodenhochstand, Herzdefekte und Lateralisierungsdefekte vorliegen (Tabelle 4.3)

(TWIGG et al. 2012). Da die klinischen Merkmale mit dem Carpenter Syndrom überlappen, wird

der Phänotyp dieser Patienten als Carpenter Syndrom 2 (OMIM 614976) bezeichnet. Es handelt

sich um ein sehr seltenes Syndrom. Bisher wurden keine weiteren Patienten in der Literatur

beschrieben. In der hier untersuchten Kraniosynostose Kohorte wurden zwei neue, potentiell

pathogene MEGF8 Varianten bei drei Patienten identifiziert (NM_001410, Abb. 4.7). Die

Phänotypen der Patienten CRA_18, CRA_19 und CRA_49 werden in Tabelle 4.3 mit den

klinischen Merkmalen der publizierten Fälle verglichen. Im Gegensatz zu diesen Fällen zeigen

die drei Patienten keine Lateralisierungs- oder Herzdefekte.

Tabelle 4.3: Phänotypischer Vergleich von Patienten mit MEGF8 Varianten

CRA_18 CRA_19 CRA_49 Twigg et al. 2012

Geschlecht M M M 3xM, 1xW

Kraniosynostose + sagittal metopisch (4/4)

Kraniosfaziale Auffälligkeiten

Hypertelorismus / Epikanthus / breite Nasenwurzel / große, tief-sitzende und revertierte Ohren

tief-sitzende und revertierte Ohren

abfallende Lidachsen / gebogene Augenbrauen

(4/4)

Akrale Auffälligkeiten

verbreiterte Daumenendglieder / Klinodakylie des V. Fingers

verbreiterte Daumenendglieder / Kamptodaktylie der II. Finger

- (4/4)

Syndaktylie Partiell II.-III. und III.-IV. Finger I.-V. Zehe

I.-II. Finger I.-V. Zehe

I.-II. Finger I.-V. Zehe

(4/4)

Polydaktylie Hexadaktylie der Füße

Hexadaktylie der Füße

Hexadaktylie der Hände und Füße

(2/4)

Lateralisierungs-defekte

- - - (3/4)

Herzdefekt - - - (4/4)

Genitalien Hodenhochstand Hodenhochstand Hodenhochstand (3/3)

weiter Mamillenabstand

- - + (4/4)

Entwicklungs-verzögerung

+ - ? (2/3)

4. DISKUSSION

121

Bei den Brüdern CRA_18 und CRA_19 wurde die homozygote Variante c.828G>A detektiert, die

keine Änderung der Aminosäure bewirkt (p.P276P), aber die Spleißdonorsequenz von Exon 5

ändert. Die konsanguinen Eltern sind heterozygot für die Variante (siehe Abb. 3.14).

Spleißvorhersage Programme bewerten die Veränderung als einen Verlust des Spleißdonors.

Mit einem Minigen-System wurde daraufhin der Einfluss der Variante auf das Spleißmuster

untersucht (siehe 3.4.1 a). Es zeigte sich, dass durch die Variante ein Exon Skipping von Exon 5

erfolgt (siehe Abb. 3.23). Dadurch würde es zu einer Verschiebung des Leserasters kommen, was

in einem vorzeitigen Stopcodon resultiert (p.Q248Cfs*20). Exon Skipping trat allerdings auch bei

einem Teil der Transkripte mit der wildtypischen Sequenz auf. Eine mögliche Erklärung ist, dass

der Wildtyp Spleißdonor auch nicht optimal von dem Spleißosom erkannt wird. In dem in vitro

System wird jedoch auch nur ein kleiner Teil der prämRNA analysiert, sodass es möglich ist,

dass sich das in vitro Spleißmuster von dem in vivo unterscheidet.

Abbildung 4.7: Lokalisation der MEGF8 Varianten auf Genom- und Protein Ebene. Das Gen besteht aus 42 Exons und es werden zwei alternative Transkripte gebildet. Das alternative Exon 12A ist grau markiert. Das Transkript NM__001410.2 wurde als Referenz verwendet. Die von Twigg et al. publizierten homozygoten bzw. compound heterozygoten Mutationen sind kursiv dargestellt (TWIGG et al. 2012). Die in dieser Arbeit identifizierten Varianten sind hervorgehoben, die Spleißvariante auf Protein Ebene jedoch nicht gekennzeichnet. Das Protein besteht aus verschiedenen Domänen: einer CUB Domäne, 5 EGF Domänen, einer EGF-CA Domäne, drei EGF-like Domänen, zwei Laminin EGF-like Domänen, zwei Kelch Domänen, 5 PSI Domänen sowie einer Transmembrandomäne. Die bisher beschrieben Mutationen sind über das gesamte Gen bzw. Protein verteilt.

Eine Stopmutation wurde bei Patient CRA_49 identifiziert (c.5210C>G, p.S1737*), dessen

Phänotyp in das klinische Spektrum von Carpenter Syndrom 2 passt (Tabelle 4.3). Die Variante

liegt allerdings nur heterozygot vor und wurde von seiner klinisch unauffälligen Mutter vererbt

(siehe Abb. 3.19). Die bisher beschriebenen Fälle tragen alle homozygote oder compound

heterozygote Mutationen und ihre heterozygoten Familienmitglieder sind phänotypisch

unauffällig (TWIGG et al. 2012). Eine zweite, potentiell pathogene Variante in der kodierenden

Sequenz von MEGF8 sowie eine größere Deletion wurden ausgeschlossen. Daraufhin wurde

untersucht, ob es trotz gleicher Variante Unterschiede in der MEGF8 Expression zwischen

MEGF8 Protein

KELCH KELCHCUB EG

F

PSI

EG

F

PSI

PSI

EG

F-l

EG

F-l

EG

F-C

A

EG

F

L E

GF

-l

PSI

PSI

EG

FE

GF

EG

F-l

L E

GF

-l

TM

27782233179411925431

p.G199R p.R448* p.R1499H p.S2376G

1

c.595G>C c.1342C>T c.3349+3_3349+4dupAA

10 12A 20 30 40 42

c.4496G>A c.7069-2A>Gc.7099A>G

MEGF8 Gen

c.828G>A c.5210C>A

1 kb

p.S1737*

4. DISKUSSION

122

Mutter und Sohn gibt. Es zeigte sich, dass bei beiden die mRNA Menge reduziert ist und kein

Unterschied zwischen Mutter und Sohn besteht (siehe Abb. 3.19 C). Dies macht es

unwahrscheinlicher, dass die Variante von Patient CRA_49 die alleinige genetische Ursache für

seinen Phänotyp ist. Da jedoch über MEGF8 und seine Funktion bisher sehr wenig bekannt ist,

wird die Variante weiterhin als Variante mit unklarer klinischer Relevanz eingestuft.

Es ist bekannt, dass MEGF8 multiple Proteindomänen besitzt, von denen manche Protein-

Protein-Interaktionen eingehen können (Abb. 4.7). Trotz einer Transmembrandomäne ist

MEGF8 nicht in der Zellmembran, sondern im Zytoplasma und im Zellkern lokalisiert (ZHANG et

al. 2009). Welche Funktion es dort hat, ist noch unbekannt. Sowohl in Mäusen als auch im

Zebrafisch wird Megf8 ubiquitär exprimiert (ZHANG et al. 2009; ENGELHARD et al. 2013). Mäuse

mit homozygoten Megf8 Mutationen zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie die Patienten:

Polydaktylien aller Extremitäten, verzögerte Ossifikation der Rippen, Lateralisierungsdefekte

und angeborene Herzfehler (ZHANG et al. 2009; ENGELHARD et al. 2013). Auch im Zebrafisch

kommt es zu einer Störung der Lateralisierung von Herz und Darm (ZHANG et al. 2009). Der

homozygote Verlust des Drosophila MEGF8 Homologs ist bereits im Larven Stadium letal (LLOYD

et al. 2018). Es gibt sowohl in Mäusen, als auch in Drosophila erste Hinweise darauf, dass MEGF8

am BMP Signalweg beteiligt sein könnte (ENGELHARD et al. 2013; LLOYD et al. 2018). Weitere

Studien sind nötig, um die Funktion und die Interaktionspartner von MEGF8 aufzuklären.

Möglicherweise liegt bei Patient CRA_49 noch zusätzlich eine Veränderung innerhalb des

Wirkmechanismus von MEGF8 vor, sodass dies zusammen mit der MEGF8 Variante den

Phänotyp des Patienten verursacht.

HUWE1

Das X-chromosomale Gen HUWE1 kodiert für eine E3 Ubiquitin Protein Ligase. Das 4374

Aminosäure große Protein wird ubiquitär exprimiert. Es wurde gezeigt, dass HUWE1 an der

Neurogenese, Spermatogenese, Genomstabilität und Tumorgenese beteiligt ist (CHEN et al. 2005;

ZHAO et al. 2008; PARSONS et al. 2009; ZHAO et al. 2009; D'ARCA et al. 2010; CHOE et al. 2016; BOSE

et al. 2017; FOK et al. 2017; MYANT et al. 2017). Mutationen sowie Mikroduplikationen von

HUWE1 sind vor allem in männlichen Patienten assoziiert mit Intelligenzminderung, fazialen

Dysmorphien und Minderwuchs (FROYEN et al. 2008; MOORTGAT et al. 2018). Deletionen sind

jedoch bisher nicht beschrieben und könnten möglicherweise letal sein, da Huwe1-/- Mäuse

embryonal eine hohe Sterblichkeit aufweisen (ZHAO et al. 2008; ZHAO et al. 2009). Durch das NGS

Kraniosynostose Genpanel wurde bei Patient CRA_14 eine HUWE1 Variante (c.329G>A, p.R110Q,

siehe Abb. 3.13) detektiert. In der Literatur sind bisher nur vier weitere Kraniosynostose

Patienten mit HUWE1 Mutationen beschrieben (AVANSINO et al. 1999; TAYLOR et al. 2015; ZHU et

al. 2015; MILLER et al. 2017; MOORTGAT et al. 2018). Bei allen ist die gleiche, evolutionäre hoch

konservierte Aminosäure Arginin an Position 110 von einer Substitution betroffen. Diese liegt in

4. DISKUSSION

123

der DUF908 Domäne des Proteins, deren Funktion noch unbekannt ist. Die Phänotypen aller

Patienten mit HUWE1 p.R110 Mutationen sind in Tabelle 4.4 miteinander verglichen.

Moortgat et al. publizierten eine Patientin (P1), die ebenfalls die p.R110Q Mutation hat, jedoch

keine Kraniosynostose entwickelt hat (MOORTGAT et al. 2018). Patient CRA_14 und Patientin P3

waren noch zu jung, um eine Beurteilung ihrer Intelligenz durchzuführen. Insgesamt scheinen

Substitutionen von p.R110 ursächlich für einen spezifischen Phänotyp aus Intelligenzminderung,

fazialen Dysmorphien und Kraniosynostose zu sein. Bei allen Patientinnen wurde die X-

Inaktivierung untersucht und dabei festgestellt, dass präferentiell die Expression des mutierten

Allels erfolgt (>90%) (TAYLOR et al. 2015; MOORTGAT et al. 2018). Bisher ist die Pathogenese von

HUWE1 noch unklar. HUWE1 scheint in unterschiedlichen Zellen verschiedene Zielproteine zu

haben, die polyubiquitiniert werden (D'ARCA et al. 2010; VAUGHAN et al. 2015; MANDEMAKER et al.

2017; QU et al. 2018). In humanen 293T Zellen, murinen intestinalen Stammzellen, Drosophila

mel. und C. elegans konnte gezeigt werden, dass HUWE1 mit dem WNT Signalweg interagiert

und hier eine regulatorische Funktion einnimmt (VANDEWALLE et al. 2013; DE GROOT et al. 2014;

DOMINGUEZ-BRAUER et al. 2017). Es sind jedoch noch weitere Studien notwendig, um zu klären,

wie HUWE1 Mutationen zu diesem Phänotyp und im Speziellen wie die p.R110Q/W Mutationen

zu Kraniosynostose führen.

Tabelle 4.4: Phänotypischer Vergleich von Patienten mit HUWE1 p.R110Q bzw. p.R110W Mutation

HUWE1 Variante

Kranio-synostose kraniofaziale Dysmorphien


Patient CRA_14

c.329G>A p.R110Q

metopisch / koronar bilateral / lambda

Turrizephalus / flaches Mittelgesicht / Exophthalmus / abfallende Lidachsen / breite Nasenwurzel / antevertierte Nares / tief-sitzendes rechtes Ohr / langes Philtrum / kleiner Mund mit schmalem Oberkiefer / hoher Gaumen

Hörstörung

Moortgat et al. 2017 Patientin P1

c.329G>A p.R110Q

- hohe Stirn / flaches Mittelgesicht / abfallende Lidachsen / kleine Nase / tief-sitzende rotierte Ohren / kurzes Philtrum / schmale Oberlippe / dentale Anomalien

Skoliose / Brachydaktylie / kurze distale Phalangen / milde Intelligenzminderung

Moortgat et al. 2017 Patientin P3

c.329G>A p.R110Q

metopisch / koronar

Mikrozephalie / hohe Stirn / Hypertelorismus / Strabismus / kleine Nase / schmale Oberlippe

Syndaktylie II.-III. Zehe / motorische Entwicklungsverzögerung

Miller et al. 2016 Patient 14

c.328C>T p.R110W

metopisch faziale Dysmorphien / dentale Anomalien

Pectus excavatum / Skoliose / Chiari Malformation / mittlere-schwere Intelligenzminderung

4. DISKUSSION

124

Taylor et al. 2015 Patientin CRS_4659

c.329G>A p.R110Q

multiple hohe Stirn / flaches Mittelgesicht / Epikanthus / abfallende Lidachsen / Strabismus / kleine Nase / schmale Oberlippe / hoher Gaumen / dentale Anomalien

Hörstörung / Brachydaktylie / kurze distale Phalangen / Hypotonie / Chiari Malformation / sprachliche Entwicklungsverzögerung / milde Intelligenzminderung

Zhu et al. 2015 Patient 99

c.328C>T p.R110W

koronar unilateral

Strabismus Hörstörung / Chiari I Malformation / Entwicklungsverzögerung

Mit Patient CRA_14 konnte dazu beigetragen werden Substitutionen von p.R110 als genetische

Ursache für einen spezifischen Phänotyp aus Intelligenzminderung und Kraniosynostose zu

bestätigen. Um die Pathogenese von HUWE1 zu untersuchen, wurden erste Versuche in Danio

rerio durchgeführt. HUWE1 ist ein evolutionär konserviertes Gen, das 81% Sequenzähnlichkeit

zwischen Mensch und Zebrafisch aufweist. Die Expressionsanalyse in verschiedenen

Entwicklungsstadien und Geweben ergab, dass huwe1 zu fast allen Zeitpunkten und in allen

Geweben stark exprimiert wird (siehe 3.4.3). Daraufhin wurde das Expressionsmuster in 24 hpf

und 52 hpf Embryonen analysiert. Eine besonders starke Expression ließ sich im Gehirn

feststellen. Dies passt zu den Beobachtungen, dass HUWE1 an der embryonalen Neurogenese

beteiligt ist. Bei 52 hpf Embryonen ließ sich zudem eine Expression im otischen Vesikel und den

Flossenansätzen nachweisen. Bei einigen HUWE1 Patienten, u.a. CRA_14, wurden Hörstörungen

und milde Malformationen der Hände und Füße festgestellt. Danio rerio eignet sich somit als

Modellsystem für Analysen zu HUWE1. Weitere Schritte wären nun Fischlinien mit humanen

Mutationen zu erstellen, deren Phänotyp zu analysieren und zu untersuchen, wie sich die

p.R110Q/W Mutation von anderen Mutationen unterscheidet.

POR

Homozygote und compound heterozygote Mutationen in dem Gen POR sind assoziiert mit dem

Antley-Bixler ähnlichen Syndrom (OMIM 201750). Der Phänotyp ist charakterisiert durch

Kraniosynostose, weiteren Skelettfehlbildungen, Anomalien der Genitalien, sowie einer

gestörten Steroidogenese (HUANG et al. 2005). Das Gen POR kodiert für die NADPH Cytochrom

P450 Oxidoreduktase, die im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist. Dort ist POR unter

anderem notwendig für die Aktivierung von CYP-Monooxygenasen (SUE MASTERS AND MAROHNIC

2006). Mutationen, die eine Funktionsänderung oder -verlust von POR bewirken, haben unter

anderem Einfluss auf den Retinolsäuremetabolismus oder die Steroidogenese (SIMPSON et al.

1994; OTTO et al. 2003). Der homozygote Verlust von Por ist in Mäusen letal (SHEN et al. 2002;

OTTO et al. 2003). Der konditionelle Knockout von Por in Osteoblasten Vorläufern hingegen führt

zu kraniofazialen Fehlbildungen und einem reduzierten Wachstum der langen Röhrenknochen

(PANDA et al. 2013).

4. DISKUSSION

125

Bei Patient CRA_6 wurde eine homozygote POR Variante (c.902G>A, p.R301H) identifiziert und

aufgrund der Vorhersageprogramme als potentiell pathogen eingestuft (siehe Abb. 3.12). Die

klinischen Auffälligkeiten zeigen Überlappungen mit dem Antley-Bixler Syndrom. Jedoch liegen

bei Patient CRA_6 weder genitale Auffälligkeiten noch Änderungen in der Steroidogenese vor.

Eine molekulargenetische Analyse in einem anderen Diagnostiklabor zeigte, dass die Eltern

heterozygot für diese Variante sind. Daraufhin wurde die gDNA eines gesunden Bruders

sequenziert und festgestellt, dass dieser die Variante ebenfalls homozygot trägt. Dadurch ist es

unwahrscheinlich, dass die Variante ursächlich für den Phänotyp des Patienten CRA_6 ist. Durch

ein anderes Diagnostiklabor wurde eine Exom Sequenzierung (SureSelect Human All Exon V6,

Agilent) durchgeführt, deren Auswertung, nach unserem Kenntnisstand, jedoch keine anderen,

klinisch relevanten Varianten ergab. Ebenso wurden zuvor größere chromosomale Aberrationen

ausgeschlossen. Aufgrund des schweren und komplexen Phänotyps ist jedoch eine genetische

Ursache wahrscheinlich, sodass man in Erwägung ziehen könnte bei diesem Patienten eine

Genomsequenzierung durchzuführen. Eventuell sind auch Veränderungen in zwei

unterschiedlichen Genen für den Phänotyp verantwortlich.

4.2 Fazit & Ausblick

Für 30% der Patienten der Kraniosynostose Kohorte konnte im Rahmen dieser Arbeit eine

genetische Ursache identifiziert werden. Davon waren 23% chromosomale Veränderungen. Dies

zeigt, dass eine CNV Analyse bei Kraniosynostose Patienten, vor allem bei syndromalen Fällen,

erfolgen sollte. Neben größeren Aberrationen konnte auch eine intragenische, pathogene CNV in

TCF12 nachgewiesen werden. Diese konnte auch in den NGS Daten durch einen Vergleich der

Anzahl der Reads gezeigt werden. Zum Nachweis größerer CNVs ist jedoch nach wie vor die

Array-CGH die Analyse Methode der Wahl. 77% der genetischen Ursachen wurden durch das im

Rahmen dieser Arbeit erstellte Kraniosynostose Panel identifiziert. Das Genpanel stellt somit ein

effizientes Tool in der Diagnostik von Kraniosynostose Patienten dar. Die Anzahl an

Kraniosynostose assoziierten Genen steigt jedoch mit der allgemeinen Zunahme an NGS Exom

Analysen beständig. Bespiele hierfür sind die Gene HUWE1, ZIC1 und CDC45 (TAYLOR et al. 2015;

FENWICK et al. 2016; ARUGA AND MILLEN 2018). Mutationen in diesen Genen sind zwar selten,

dennoch wurde im Rahmen dieser Arbeit auch eine mögliche pathogene HUWE1 Variante

detektiert. Dies macht eine ständige Aktualisierung des Genpanels erforderlich. Da die Kosten

für eine Exom Sequenzierung in den letzten Jahren deutlich gesunken sind, wäre eine Exom

Sequenzierung nun die Alternative zu dem Genpanel. Für die Auswertung dieser Daten würde

für den diagnostischen Ansatz ein in silico Panel mit den zum Zeitpunkt der Analyse bekannten

Genen angewendet werden. Gleichzeitig stünden für etwaige Forschungsprojekte jedoch auch

die gesamten Exom Daten zur Verfügung. Zusätzlich würde die Anwendung der Exom

4. DISKUSSION

126

Sequenzierung innerhalb der Diagnostik eine Zeitersparnis von Probeneingang bis Befundung

bedeuten. Ein Sammeln der Proben für einen vollständigen Lauf (12 Proben) würde entfallen.

Die Anreicherung kann parallel mit der Anreicherung von Patientenproben anderer

Erkrankungen erfolgen.

Eine 30%ige Detektionsrate insgesamt bedeutet allerdings gleichzeitig auch, dass bei 70% der

Patienten über den gewählten Ansatz keine genetische Ursache identifiziert werden konnte. Für

eine weitere Analyse dieser Patienten wäre die Exom Sequenzierung eine Möglichkeit. Hilfreich

bei der Auswertung der Sequenzierdaten wäre hierbei eine interne Datenbank von Exom Daten,

die es ermöglicht häufige Sequenzierfehler der Sequenziermaschine sowie häufig auftretende

SNPs innerhalb der Patienten Kohorte herauszufiltern. Bei der Auswertung von Einzelfällen

kann es relativ schwierig werden Varianten bei einer sowohl genetisch als auch klinisch so

heterogenen Erkrankung wie Kraniosynostose zuverlässig zu bewerten. Ein Beispiel hierfür sind

HUWE1 Mutationen, die bisher hauptsächlich mit isolierter Intelligenzminderung assoziiert sind.

Substitutionen der Aminosäure p.R110 scheinen jedoch ursächlich für einen spezifischen,

kombinierten Phänotyp aus Kraniosynostose und Intelligenzminderung zu sein (TAYLOR et al.

2015; MILLER et al. 2017; MOORTGAT et al. 2018). Hier sind weitere Patienten hilfreich, um die

Kausalität einer Variante zu bestärken. Internationales Data Sharing und ein Abgleich mit diesen

Daten könnte die Suche nach weiteren Patienten und die Bewertung von Varianten erleichtern.

Ein nützliches Online-Tool hierfür ist GeneMatcher. Die Plattform vermittelt den Kontakt

zwischen Forschergruppen oder Ärzten, die ein Interesse an dem gleichen Kandidaten-Gen

haben (SOBREIRA et al. 2015). Eine weitere Herausforderung bei der Analyse der bisher

ungelösten Fälle ist die Möglichkeit einer digenischen Vererbung oder von sogenannten Modifier

Effekten. Ein Beispiel hierfür ist der mögliche Zusammenhang von SMAD6 Mutationen mit einem

Risiko-SNP in der Nähe von BMP2 bei isolierten Frontal- und Sagittalnahtsynostosen

(TIMBERLAKE et al. 2016). Dies macht eine Auswertung komplex und erschwert die Bewertung

von Varianten, da SNPs in der Auswertung in der Regel aufgrund der Frequenz in der

Normalbevölkerung herausgefiltert werden. Diese komplexen Vererbungsmuster erfordern

Studien mit größeren Kohorten z.B. über internationale Netzwerke.

Für manche Varianten, insbesondere solche die in Genen lokalisiert sind, die bisher noch nicht

mit Kraniosynostose assoziiert wurden, sind funktionelle Analysen notwendig, um ihre

Pathogenität zu bekräftigen. Hierbei können Analysen der Patienten mRNA hilfreich sein, um

eventuelle Auswirkungen auf die Genexpression von potentiellen loss-/gain-of-function

Varianten oder auf das Spleißen zu untersuchen. Sofern OP Material von Patienten Calvarien zur

Verfügung steht, könnte damit, neben der Gewinnung von mRNA, eine Zellkultur für

weiterführende Analysen angelegt werden. Besteht keine Möglichkeit entsprechendes

Patientenmaterial zu erhalten, so eignet sich, wie in dieser Arbeit gezeigt, für die Analyse von

Spleißvarianten z.B. ein in vitro Spleißsystem. Des Weiteren lassen sich durch die CRISPR/Cas

4. DISKUSSION

127

Methode sowohl Zellen als auch Tiermodelle, wie beispielsweise Danio rerio, genetisch so

verändern, dass auch Einzelnukleotidveränderungen der Patienten eingebracht werden können

(Knock-in). Anschließend wären damit funktionelle Studien wie Protein- und Phänotypanalysen

möglich.

Abschließend bleibt noch die Frage zu klären, warum es bei einer Erkrankung wie

Kraniosynostose, deren momentane einzige therapeutische Möglichkeit ein chirurgischer

Eingriff ist, wichtig ist die genetische Ursache und die zugrundeliegende Pathogenese zu

identifizieren. Zum einen kann es für die Familienplanung der Eltern oder des Patienten selbst

relevant sein das jeweilige Vererbungsrisiko zu kennen. Zum anderen kann die genetische

Diagnose Einfluss auf die medizinische Betreuung haben sowie den Familien eine Auskunft zu

Langzeitprognosen ermöglichen. In einigen Fällen kann ein zweiter chirurgischer Eingriff

notwendig werden, da die betroffenen Suturen trotz Operation wieder vorzeitig fusionieren

können. Retrospektive Studien zeigen, dass dieses Risiko beispielswiese für Patienten mit einer

nachgewiesenen FGFR3 p.P250R Mutation erhöht ist im Vergleich zu Patienten ohne geklärte

genetische Ursache (THOMAS et al. 2005; WILKIE et al. 2010). Die Aufklärung der Pathogenese von

Kraniosynostosen kann dazu beitragen neue Therapieformen zu entwickeln, um den invasiven

Eingriff so gering wie möglich zu halten. Erste Studien dazu gibt es bereits. Ratten, denen

humane, FGFR2 mutierte Osteoblasten in die Dura mater unterhalb der Koronarnähte

transplantiert wurden, entwickelten Kraniosynostosen. Die betroffenen Suturen zeigten eine

Reduktion des BMP Inhibitors Noggin. Die gleichzeitige lokale Platzierung von Beads mit Noggin

verhinderte jedoch eine Fusion der Schädelnähte (SHEN et al. 2009). Cooper et al. führten

ähnliche Studien in Mäusen durch und konnten zeigen, dass an den mit Noggin behandelten

Suturen die Ossifikation inhibiert wurde (COOPER et al. 2009). Die lokale Implanation von

Inhibitorbeads könnte also unterstützend zur Operation eingesetzt werden, um das Risiko einer

erneuten vorzeitigen Fusion und somit einer weiteren Operation zu minimieren. Ein anderer

Ansatz ist die Verwendung von MEK1/ERK1 Kinaseinhibitoren bei gesteigerter FGF

Signaltransduktion, wie es beispielsweise bei Crouzon oder Apert Syndrom Patienten der Fall

ist. Shukla et al. injizierten intraperitoneal einen Kinaseinhibitor in trächtige Mäuse, deren

Nachwuchs die Fgfr2 Mutation S252W, ursächlich für das Apert Syndrom, aufweist. Zusätzlich

wurde die Inhibitor Injektion bis zu 18 Tage postnatal fortgesetzt. Die Ausbildung des „Apert-

Phänotyps“ konnte dadurch zum Teil verhindert werden (SHUKLA et al. 2007). Dieser Ansatz

birgt jedoch einige Probleme, so ist sowohl der Zeitpunkt der Verabreichung als auch die Dosis

kritisch. Mit der Identifikation neuer genetischer Ursachen könnten auch neue mögliche Ziele für

eine alternative oder unterstützende Therapie identifiziert werden.

5. LITERATURVERZEICHNIS

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Yoon, W. J., Y. D. Cho, W. J. Kim, H. S. Bae, R. Islam et al., 2014 Prolyl isomerase Pin1-mediated conformational change and subnuclear focal accumulation of Runx2 are crucial for fibroblast growth factor 2 (FGF2)-induced osteoblast differentiation. J Biol Chem 289: 8828-8838.

Yoshida, C. A., T. Furuichi, T. Fujita, R. Fukuyama, N. Kanatani et al., 2002 Core-binding factor beta interacts with Runx2 and is required for skeletal development. Nat Genet 32: 633-638.

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143

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Zhao, X., D. A. D, W. K. Lim, M. Brahmachary, M. S. Carro et al., 2009 The N-Myc-DLL3 cascade is suppressed by the ubiquitin ligase Huwe1 to inhibit proliferation and promote neurogenesis in the developing brain. Dev Cell 17: 210-221.

Zhao, X., J. I. Heng, D. Guardavaccaro, R. Jiang, M. Pagano et al., 2008 The HECT-domain ubiquitin ligase Huwe1 controls neural differentiation and proliferation by destabilizing the N-Myc oncoprotein. Nat Cell Biol 10: 643-653.

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DANKSAGUNG

XII

DANKSAGUNG

Ein GROßES UND HERZLICHES DANKESCHÖN an PROF. DR. EVA KLOPOCKI! Danke, dass du mir die

Chance gegeben hast das spannende Feld der Humangenetik kennenzulernen! Danke für dein

Vertrauen in mich und die Bereitstellung des außerordentlich interessanten Themas. Vielen

Dank für deine großartige Unterstützung und gleichzeitig den Freiraum eigenverantwortlich

arbeiten zu können!

Ein HERZLICHES DANKESCHÖN an PROF. DR. FRANZ JAKOB und PROF. DR. CHRISTIAN STIGLOHER für die

Begleitung meiner Doktorarbeit im Rahmen des Promotionskomitees! Danke, dass Sie sich die

Zeit für die alljährlichen Treffen genommen und mit konstruktiven Ratschlägen zu dieser Arbeit

beigetragen haben. Ausdrücklich danken möchte ich PROF. DR. FRANZ JAKOB auch für die

Übernahme des Zweitgutachtens!

VIELEN DANK an alle ÄRZTE, die Patienten für die Kraniosynostose Kohorte rekrutiert haben und

damit die Arbeit in diesem Umfang ermöglicht haben. Besonders danken möchte ich in diesem

Zusammenhang OA PD DR. TILMANN SCHWEITZER von der Pädiatrischen Neurochirurgie der

Universitätsklinik Würzburg (Direktor Neurochirurgische Klinik: Prof. Dr. Ralf-Ingo Ernestus)

für die gute Zusammenarbeit!

VIELEN LIEBEN DANK an alle aktuellen und ehemaligen Mitglieder der Arbeitsgruppe Klopocki!

Ein RIESIGES DANKESCHÖN besonders an DANIEL, ISABELL, RABEA UND SABINE für die schöne Zeit mit

euch! Danke für eure fachliche, und ganz besonders Danke für eure emotionale Unterstützung!

Dankeschön für schöne Laborausflüge, für leckeren Kuchen und laute Labormusik! Ich war

immer sehr gerne ein Teil dieses wunderbaren Teams!

Ein HERZLICHES DANKESCHÖN an das gesamte HUMANGENETIK INSTITUT für die freundliche

Aufnahme, tolle Zusammenarbeit und hilfsbereite Unterstützung während der gesamten Zeit!

Ein GANZ BESONDERES DANKESCHÖN geht hierbei an CHRISTIN, ISABELL, JULIA, KERSTIN UND TIMO!

Danke für die freundschaftliche Atmosphäre, die fachlichen Diskussionen sowie für Wrapwoch,

Dönerstag und Osterbrunch! Es war mir eine Ehre euch zu Kollegen zu haben!

Meinen ELTERN möchte ich GANZ BESONDERS danken. DANKESCHÖN für eure Motivation, euer

Vertrauen in mich und eure bedingungslose Unterstützung in allen Lebenslagen! VIELEN LIEBEN

DANK an meine Brüder SEBASTIAN und FLORIAN, dass ihr euch die Zeit genommen habt meine

Dissertation Korrektur zu lesen!

OLIVER – MEIN HELD, BESTER FREUND & EHEMANN – DANKE! Danke für ALLES trifft es eigentlich am

besten! DANKE für deine Liebe, deinen Optimismus, deine Unterstützung, deine gute Laune, dein

Verständnis und dein Glaube an mich!

CURRICULUM VITAE

XIII

CURRICULUM VITAE

PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE

XIV


PUBLIKATIONEN

Use of targeted high-throughput sequencing for genetic classification of platelet disorders in patients with bleeding diathesis. Andres O, König EM, Knöfler R., Streif W, Althaus K, Bakchoul T, Bugert P, Eber S, Kunstmann E, Meyer O, Strauß G, Wiegering V, Manukjan G, Klopocki E, Schulze H Thrombosis and Haemostasis-Thieme Medical Publishers, Submitted

Interstitial deletion of 5q22.2-23.1 including APC and TSSK1B in a patient with adenomatous polyposis and asthenoteratozoospermia. Kadiyska T, Tourtourikov I, Petrov A, Chavoushian A, Antalavicheva M, König EM, Klopocki E, Vessela N, Stanislavov R. Molecular Syndromology; Submitted

Recessive grey platelet-like syndrome with unaffected erythropoiesis in the absence of the splice isoform GFI1B-p37. Schulze H, Schlagenhauf A, Manukjan G, Beham-Schmid C, Andres O, Klopocki E, König EM, Haidl H, Panzer S, Althaus K, Muntean WE, Schwinger W, Urban C, Greinacher A, Bakchoul T, Seidel MG. Haematologica. 2017 Sep;102(9):e375-e378. doi: 10.3324/haematol.2017.167957.

A novel two-nucleotide deletion in HPS6 affects mepacrine uptake and platelet dense granule secretion in a family with Hermansky-Pudlak syndrome. Andres O, Wiegering V, König EM, Schneider AL, Semeniak D, Stritt S, Klopocki E, Schulze H. Pediatr Blood Cancer. 2017 May;64(5). doi: 10.1002/pbc.26320.

Craniosynostosis associated with Partial Monosomy 2q37.3 and Partial Trisomy 5q35 including MSX2. König EM, Engmann L, Kress W, Quattländer A, Schweitzer A, E. Klopocki J Rare Dis Diagn Ther. 2015 doi:10.21767/2380-7245.100013

U1snRNP-mediated suppression of polyadenylation in conjunction with the RNA structure controls poly (A) site selection in foamy viruses. Schrom EM, Moschall R, Hartl MJ, Weitner H, Fecher D, Langemeier J, Bohne J, Wöhrl BM, Bodem J. Retrovirology. 2013 May 29;10:55. doi: 10.1186/1742-4690-10-55.

Regulation of retroviral polyadenylation. Schrom EM, Moschall R, Schuch A, Bodem J. Adv Virus Res. 2013;85:1-24. doi: 10.1016/B978-0-12-408116-1.00001-X

A complex immunodeficiency is based on U1 snRNP-mediated poly(A) site suppression. Langemeier J, Schrom EM, Rabner A, Radtke M, Zychlinski D, Saborowski A, Bohn G, Mandel-Gutfreund Y, Bodem J, Klein C, Bohne J. EMBO J. 2012 Oct 17;31(20):4035-44. doi: 10.1038/emboj.2012.252.

Construction of a high titer infectious HIV-1 subtype C proviral clone from South Africa. Jacobs GB, Bock S, Schuch A, Moschall R, Schrom EM, Zahn J, Reuter C, Preiser W, Rethwilm A, Engelbrecht S, Kerkau T, Bodem J. Viruses. 2012 Sep;4(9):1830-43. doi: 10.3390/v4091830.


XV

PUBLIKATIONEN IN VORBEREITUNG

MSX2 nucleotide variant and chromosomal rearrangements in 5q are associated with Craniosynostosis König EM, Platzer K, Schweitzer T, Klopocki E

TCF12 mutations in coronal craniosynostosis – spectrum and frequency Köblitz I, König EM, Graul-Neumann LM, Tzschach A, Collmann H, Schweitzer T, Kress W, Klopocki E

Novel Pathogenic Variants in Craniosynostosis Genes Identified by NGS König EM, Platzer K, Spier I, Spranger S, Tzschach A, Zirn B, Schweitzer T, Kress W, Klopocki E

KONGRESSBEITRÄGE

03/2018 MSX2 nucleotide variant and chromosomal rearrangements in 5q are associated with

Craniosynostosis

E.-M. König, K. Platzer, T. Schweitzer, E. Klopocki Posterpräsentation, Jahrestagung der Gesellschaft für Humangenetik (GfH), Münster, Deutschland

10/2017 Novel Pathogenic Variants in Craniosynostosis Genes Identified by NGS

E.-M. König, K. Platzer, I. Spier, S. Spranger, A. Tzschach, B. Zirn, T. Schweitzer, W. Kress, E. Klopocki Posterpräsentation, Jahrestagung der American Society of Human Genetics (ASHG), Orlando, Florida

03/2016 Targeted NGS for analysis of craniosynostosis identifies a novel mutation in MEGF8

aktualisiert E.-M. König, S. Spranger, A. Tzschach, A. Dufke, I. Spier, T. Schweitzer, W. Kress, E. Klopocki

Posterpräsentation, Jahrestagung der Gesellschaft für Humangenetik (GfH), Lübeck, Deutschland

06/2015 Targeted NGS for analysis of craniosynostosis identifies a novel mutation in MEGF8

E.-M. König, S. Spranger, T. Schweitzer, W. Kress, E. Klopocki Posterpräsentation, Jahrestagung der European Society of Human Genetics (ESHG), Glasgow, UK

03/2014 Partial trisomy 5p associated with sagittal craniosynostosis

E.-M. Schrom, L. Engmann, T. Schweitzer, W. Kress, E. Klopocki Posterpräsentation, Jahrestagung der Gesellschaft für Humangenetik (GfH), Essen, Deutschland

ANHANG

XVI

ANHANG

A) Primersequenzen

Name Sequenz 5'-3'

hu_cDNA_TCF12_Ex10_fwd1 ATGGGACCCACAATTCTTCT

hu_cDNA_TCF12_Ex10_fwd2 GACCCACAATTCTTCTGACCTT

hu_cDNA_TCF12_Ex10_fwd2 GACCCACAATTCTTCTGACCTT

hu_cDNA_TCF12_Ex11_fwd AGTTATCCTCCACACTCAGTTT

hu_cDNA_TCF12_Ex11_fwd AGTTATCCTCCACACTCAGTTT

hu_cDNA_TCF12_Ex11_rev CTAGAATGCTGTCTGATCCATT

hu_cDNA_TCF12_Ex11_rev CTAGAATGCTGTCTGATCCATT

hu_cDNA_TCF12_Ex12_rev TGTCTGTGAGCTTCCAGCAG

hu_cDNA_TCF12_Ex12_rev TGTCTGTGAGCTTCCAGCAG

hu_cDNA_TCF12_Ex7_fwd CAAGATCTGGGGCTTGGGAG

hu_cDNA_TCF12_Ex7_fwd CAAGATCTGGGGCTTGGGAG

hu_gDNA_BMP2_Ex1_fwd TCCAGGGGTGGGCTAAGAG

hu_gDNA_BMP2_Ex1_rev CCAAGATGGCGAACTCACATC

hu_gDNA_ERF_Ex2_fwd GTCGTAATTCATCTGGGGCT

hu_gDNA_ERF_Ex2_rev CTGACCCCAGGCCACTCCCT

hu_gDNA_FGFR2_Ex9_fwd CGCACATGGAAGCTCACAGAA

hu_gDNA_FGFR2_Ex9_rev GGTTGTGCTATGATGCGTCA

hu_gDNA_FGFR3_Ex7_fwd GCAGTGGCGGTGGTGGTGA

hu_gDNA_FGFR3_Ex7_rev CTTGAGCACGGTAACGTAGG

hu_gDNA_HUWE1_Ex6_fwd GAAAAGGCAAAGCAAAGGTG

hu_gDNA_HUWE1_Ex6_rev GGTGGGACGTGAACTTGTCT

hu_gDNA_MEGF8_Ex30_fwd GGTTCCGGGAAGTCAGGAAG

hu_gDNA_MEGF8_Ex30_rev GGCATGTCCTGGTGTTCAGA

hu_gDNA_MEGF8_Ex39_fwd AGAGGTGGGGGTCTTGAACT

hu_gDNA_MEGF8_Ex39_rev1 TACTTGGTGCACTTCCCGTC

hu_gDNA_MEGF8_Ex39_rev2 TCATCCTCTCCTGACTGGGG

hu_gDNA_MEGF8_Ex5_fwd TTTGTGCCCTGTCTGTCTCA

hu_gDNA_MEGF8_Ex5_rev GCAACAGGAGACACATGGAA

hu_gDNA_MSX2_Ex2_fwd GAGGCCCGAAAGGAAAAA

hu_gDNA_MSX2_Ex2_rev ACAGGTGGTACATGCCATATC

hu_gDNA_POR_Ex9_fwd CTGGGAGAGCCCTTGATGTA

hu_gDNA_POR_Ex9_rev TTGCTTGGGATCCTGTAACC

hu_gDNA_PTCH1_Ex20_fwd CCAGCAACCTGATCTTGTGA

hu_gDNA_PTCH1_Ex20_rev ACGAGGTGCTGCAATCTACC

hu_gDNA_SMAD6_Ex1_1_fwd CCCCTTCGACGACAGGCT

hu_gDNA_SMAD6_Ex1_1_rev CGAGTACGTGACGGTTTTGAG

hu_gDNA_SMAD6_Ex1_2_fwd TGCTGTCTCTTTTCGGAGCG

hu_gDNA_SMAD6_Ex1_2_rev CAGAGAGAAGGGCACGGAAG

hu_gDNA_SMAD6_Ex2_1_fwd TGTTGAGGGGATTTGGGCAG

hu_gDNA_SMAD6_Ex2_1_rev TTTCACAGCAACCAGTCCGG

hu_gDNA_SMAD6_Ex3_fwd AAGTTGGGAGGGACATGCTG

hu_gDNA_SMAD6_Ex3_rev GCAACCTTCCCATCCAAGGA

hu_gDNA_SMAD6_Ex4_fwd CTTACCCAGCTCCCACTGTG

hu_gDNA_SMAD6_Ex4_rev CTGTGTCTCTGGGCATCGG

hu_gDNA_TWIST1_fwd GTCTCCGGCCCTGCTGAG

hu_gDNA_TWIST1_rev CCCGCTCTTCTCCTCTGC

hu_MEGF8_Ex5_BamHI_rev ATTGGATCCGCAACAGGAGACACATGGAA

hu_MEGF8_Ex5_XhoI_fwd ATTCTCGAGATGGGGCGAGTATCTGGGATC

hu_TCF12_Ex10_BamHI_rev ATTGGGATCCTGATAACAGGTCAAAAAGAGCA

hu_TCF12_Ex10_XhoI_fwd ATTGCTCGAGAGTGGAGTCATTGCTGACACA

ANHANG

XVII

Name Sequenz 5'-3'

hu_TCF12_Ex13_BamHI_rev ATTGGATCCTCAAGACTAGGCTGGGCAAC

hu_TCF12_Ex13_XhoI_fwd ATTCTCGAGTTGGCAAAAATGTGGTTGAT

hu_TCF12_M13_Ex10_fwd TGTAAAACGACGGCCAGTTGGAGGGTACCCCTTGAATTTT

hu_TCF12_M13_Ex10_rev CAGGAAACAGCTATGACCTTGGTGAAACTGAGTGTGGAGG

hu_TCF12_M13_Ex13_fwd TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAAGTCTTAGGGGTGACAACT

hu_TCF12_M13_Ex13_rev CAGGAAACAGCTATGACCTCTTCATTCCAATTGCCTGG

hu_TCF12_M13_Ex19_fwd TGTAAAACGACGGCCAGTTCACATTTTGTGTAGCAAGGTGC

hu_TCF12_M13_Ex19_rev CAGGAAACAGCTATGACCTCTCCAAGCAGAGCAACTG

M13_fwd GTAAAACGACGGCCAG

M13_rev CAGGAAACAGCTATGAC

qPCR_7q_A_fwd GCAACGGGAATTTGCTCGAA

qPCR_7q_A_rev GCCAGCTGATGAAGTCGTTT

qPCR_7q_B_fwd TCACGGTGCTTACGTACCTG

qPCR_7q_B_rev CGTGTAACAGCCGGACAAGA

qPCR_7q_C_fwd TATTCTCTTTGGCTCGGCGT

qPCR_7q_C_rev TGCACTAATACCAGCTGCCT

qPCR_7q_D_fwd GGTGTAAGCGGTGGTGGTTA

qPCR_7q_D_rev TGGGTCTGAGAGAAGGTGCT

qPCR_7q_E_fwd GCTGAAGACTCGGGCAAAGT

qPCR_7q_E_rev GACTTCCAAGCTCCGTTCCA

qPCR_ALB_Ex12_fwd TGTTGCATGAGAAAACGCCA

qPCR_ALB_Ex12_rev GTCGCCTGTTCACCAAGGAT

qPCR_cDNA_GAPDH_Ex7/8_fwd TGCACCACCAACTGCTTAGC

qPCR_cDNA_GAPDH_Ex7/8_rev GGCATGGACTGTGGTCATGAG

qPCR_cDNA_MEGF8_Ex12A_fwd GCACTTGCTCACCTTTCAGC

qPCR_cDNA_MEGF8_Ex12A_rev TGTTAGGGTGATGGTCGTGC

qPCR_cDNA_MEGF8_Ex30_fwd GGGCAAAGCGAGATCGTATG

qPCR_cDNA_MEGF8_Ex30_rev CATGACCCAGGCTGCTCC

qPCR_cDNA_MEGF8_Ex8/9_fwd CAATGGGTGTCAGGAGCTGA

qPCR_cDNA_MEGF8_Ex8/9_rev ATGTGAGTACCGACCACTGG

qPCR_cDNA_RPLP0_fwd GAACACCATGATGCGCAAGG

qPCR_cDNA_RPLP0_rev CCCGGATATGAGGCAGCA

qPCR_F8_Ex8_fwd GCCAAGAAGCATCCTAAAACTTG

qPCR_F8_Ex8_rev GGCGAGGACTAAGGGAGCAT

qPCR_TCF12_A_fwd TGAGCTCTCAGGACTTACAGTT

qPCR_TCF12_A_rev GCTGGCAACCTAACAGGAGA

qPCR_TCF12_B_fwd TTGGCATGATCTGGAGCTGA

qPCR_TCF12_B_rev ACGTCAGTCATGTAGCCTCAC

qPCR_TCF12_C_fwd CATCGGGAAGACTCTGTCAGT

qPCR_TCF12_C_rev TGGTTCAGGTCTGTGCTTGA

qPCR_TCF12_D_fwd AGGAAGCCTCACCAAATTAGTAA

qPCR_TCF12_D_rev TTTCCACATGCGCTGGAAAT

qPCR_TCF12_E_fwd AGCTCCTGTTGCCTCACATC

qPCR_TCF12_E_rev TGCCACTGCACACCTATGAG

SA2 ATCTCAGTGGTATTTGTGAGC

SD6 TCTGAGTCACCTGGACAACC

zf_actin_fwd CCAACAACGTCCTTTCTGGT

zf_actin_rev GAGGGACCTGCCTCATCATA

zf_fgf10a_BamHI_fwd TTCAGGTACCATGTGCAAATGGAAAGTGACTAA

zf_fgf10a_XhoI_rev TTCTACTCGAGCTACACGATAGGAATGGGGAGA

zf_fgf10a_utr_fwd AGGAAAGGTTGGACACATGG

zf_fgf10a_utr_rev ATTCGGATGGTAGGATGCTG

zf_fgfr2_ribo_fwd TCAGACTCCAGCTCCTCCAT

zf_fgfr2_ribo_rev TCCCACATTAAAACCCCAAA

zf_huwe1_ribo_fwd GGAAGAAGCTCGTTGTCTGG

zf_huwe1_ribo_rev CTTCTGCTCTTTGGCAGCTT

ANHANG

XVIII

B) Ethikvotum

ANHANG

XIX

ANHANG

XX

C) Genliste Kraniosynostose Panel

Tabelle C.1: Kraniosynostose Panel Version 1 (Illumina Nextera Rapid Capture Kit)

Gen Transkript (RefSeq)

OMIM # Gen Transkript (RefSeq)

OMIM #

ALX4 NM_021926.3 605420 IL11RA NM_001142784 600939

BMP2 NM_001200 112261 JAG1 NM_000214 601920

BMP2 Enhancer 112261 LBX1 NM_006562 604255

BMP4 NM_001202 112262 MEGF8 NM_001271938 604267

BMPR1B NM_001203 603248 MSX2 NM_002449.4 123101

CYP26A1 NM_019885 602239 NOG NM_005450 602991

EFNA1 NM_004428 191164 PITX1 NM_002653 602149

EFNA2 NM_001405.3 602756 POR NM_000941 124015

EFNA3 NM_004952 601381 PTCH1 NM_000264 601309

EFNA4 NM_005227 601380 PTCH2 NM_003738 603673

EFNB1 NM_004429.4 300035 PTHLH NM_198964 168470

ERF NM_006494 611888 RAB23 NM_183227.2 606144

ERK1 NM_002746 601795 RALDH1 NM_000689 100640

ERK2 NM_002745 176948 RALDH2 NM_003888 603687

ESCO2 NM_001017420 609353 RALDH3 NM_000693 600463

FBN1 NM_000138.4 134797 RARA NM_00964 180240

FGF10 NM_004465.1 602115 RBP4 NM_006744 180250

FGF18 NM_003862 603726 RECQL4 NM_004260.3 603780

FGF2 NM_002006 134920 ROR2 NM_004560 602337

FGF22 NM_020637 605831 RUNX2 NM_001024630 600211

FGF3 NM_005247 164950 RXRA NM_002957 180245

FGF4 NM_020996 164980 SHH NM_000193 600725

FGF6 NM_020996 134921 SKI NM_003036 164780

FGF8 NM_033163 600483 SMO NM_005631 601500

FGF9 NM_002010 600921 SOX9 NM_000346 608160

FGFR1 NM_023110.2 136350 TBX3 NM_016569 601621

FGFR2 NM_000141.4 176943 TBX5 NM_000192 601620

FGFR3 NM_000142.4 134934 TCF12 NM_207037.1 600480

FREM1 NM_144966 608944 TGFBR1 NM_004612.2 190181

GDF5 NM_000557 601146 TGFBR2 NM_003242.5 610168

GDF6 NM_001001557 601147 TP63 NM_001114978 603273

GLI3 NM_000168.5 165240 TWIST1 NM_000474.3 601622

IHH NM_002181 600726 ZRS 605522

IHH Regulator chr2:219974365-219965112

ANHANG

XXI

Tabelle C.2: Kraniosynostose Panel Version 2 (Agilent SureSelectQXT Kit)

Gen Transkript (RefSeq)

OMIM # Gen Transkript (RefSeq)

OMIM #

ALPL NM_000478.4 146300 HUWE1 NM_031407 300697

ALX4 NM_021926.3 605420 IFT122 NM_052985 606045

ASXL1 NM_015338 612990 IFT43 NM_052873 614068

AXIN2 NM_004655 604025 IHH NM_002181 600726

BMP2 NM_001200 112261 IHH Regulator chr2:219974365-219965112

BMP2 Enhancer 112261 IL11RA NM_001142784 600939

BMP4 NM_001202 112262 JAG1 NM_000214 601920

BMPR1B NM_001203 603248 LBX1 NM_006562 604255

CDC45 NM_001178010 603465 MEGF8 NM_001271938 604267

CYP26B1 NM_019885 605207 MSX2 NM_002449.4 123101

EFNA2 NM_001405.3 602756 NOG NM_005450 602991

EFNA4 NM_005227 601380 PDGFR-A NM_006206 173490

EFNB1 NM_004429.4 300035 PITX1 NM_002653 602149

EphA4 NM_004438.3 602188 POR NM_000941 124015

ERF NM_006494 611888 PTCH1 NM_000264 601309

ESCO2 NM_001017420 609353 PTCH2 NM_003738 603673

FBN1 NM_000138.4 134797 PTHLH NM_198964 168470

FGF10 NM_004465.1 602115 RAB23 NM_183227.2 606144

FGF18 NM_003862 603726 RECQL4 NM_004260.3 603780

FGF2 NM_002006 134920 ROR2 NM_004560 602337

FGF22 NM_020637 605831 RUNX2 NM_001024630 600211

FGF3 NM_005247 164950 SHH NM_000193 600725

FGF4 NM_020996 164980 SKI NM_003036 164780

FGF6 NM_020996 134921 SOX9 NM_000346 608160

FGF8 NM_033163 600483 TBX3 NM_016569 601621

FGF9 NM_002010 600921 TBX5 NM_000192 601620

FGFR1 NM_023110.2 136350 TCF12 NM_207037.1 600480

FGFR2 NM_000141.4 176943 TGFBR1 NM_004612.2 190181

FGFR3 NM_000142.4 134934 TGFBR2 NM_003242.5 610168

FLNA NM_001110556 300017 TP63 NM_001114978 603273

FREM1 NM_144966 608944 TWIST1 NM_000474.3 601622

GDF5 NM_000557 601146 WDR19 NM_025132 608151

GDF6 NM_001001557 601147 WDR35 NM_001006657 613602

GLI3 NM_000168.5 165240 ZIC1 NM_003412 600470

HOXD13 NM_000523 142989 ZRS 605522

ANHANG

XXII

D) Auflistung Bereiche mit lückenhafter Abdeckung

Tabelle D.1: lückenhaft abgedeckte Bereiche der Patienten CRA_6, 14, 18, 19, 29, 34, 43, 48, 49, 56, 64 und 80 [hg19]

Patient CRA_6

Chr Position Start Position Ende Gen Chr Position Start Position Ende Gen

1 2160180 2161199 SKI 9 94712123 94712295 ROR2

1 45308507 45308629 PTCH2 9 98270417 98270668 PTCH1

1 155051392 155051570 EFNA3 9 98278700 98278880 PTCH1

2 219924849 219925214 IHH 10 94833666 94833905 CYP26A1

2 219965137 219974340 NHEJ1 10 102987001 102987572 LBX1

4 123747905 123748532 FGF2 11 44331121 44331637 ALX4

5 134364443 134365036 PITX1 12 115109620 115110132 TBX3

6 45390288 45390719 RUNX2 12 115111944 115112665 TBX3

7 19156310 19156969 TWIST1 19 639900 640164 FGF22

7 42003902 42006264 GLI3 19 643384 643629 FGF22

7 128828967 128829348 SMO 19 42752591 42753915 ERF

7 155595568 155596445 SHH 20 6808104 6866049 Enhancer BMP2 8 97156765 97157777 GDF6

Patient CRA_14


4 123747892 123748549 FGF2 9 101867446 101867625 TGFBR1

7 19156309 19157030 TWIST1 10 103535600 103535779 FGF8

9 98270420 98270659 PTCH1 19 1286118 1286357 EFNA2

Patient CRA_18


1 2160180 2161199 SKI 9 98270417 98270668 PTCH1

2 219924849 219925214 IHH 9 98278700 98278880 PTCH1

2 219965137 219974340 NHEJ1 10 94833666 94833905 CYP26A1

4 123747905 123748532 FGF2 10 102987001 102987572 LBX1

5 134364443 134365036 PITX1 10 102988222 102988597 LBX1

5 174151637 174152066 MSX2 10 103530060 103530401 FGF8

6 45390288 45390719 RUNX2 11 44286378 44286758 ALX4

7 19156310 19156969 TWIST1 11 44331121 44331637 ALX4

7 42003902 42006264 GLI3 12 115109620 115110132 TBX3

7 128828967 128829348 SMO 12 115111944 115112665 TBX3

7 155595568 155596445 SHH 17 54671559 54672308 NOG

8 38287174 38287491 FGFR1 17 70119658 70120553 SOX9

8 97156765 97157777 GDF6 19 643384 643629 FGF22

9 94712123 94712295 ROR2 19 42752591 42753915 ERF

9 98211325 98211630 PTCH1 Patient CRA_19


1 2160180 2161199 SKI 9 94712123 94712295 ROR2

1 2237990 2238229 SKI 9 98270417 98270668 PTCH1

1 45292134 45292465 PTCH2 9 98278700 98278880 PTCH1

1 45308507 45308629 PTCH2 9 137218380 137218545 RXRA

1 155051392 155051570 EFNA3 10 94833666 94833905 CYP26A1

2 219924849 219925214 IHH 10 102987001 102987572 LBX1

2 219965137 219974340 NHEJ1 10 102988222 102988597 LBX1

4 123747905 123748532 FGF2 10 103530060 103530401 FGF8

ANHANG

XXIII

5 134364443 134365036 PITX1 11 44286378 44286758 ALX4

5 174151637 174152066 MSX2 11 44331121 44331637 ALX4

6 45390288 45390719 RUNX2 12 115109620 115110132 TBX3

7 19156310 19156969 TWIST1 12 115111944 115112665 TBX3

7 42003902 42006264 GLI3 12 115120591 115121030 TBX3

7 128828967 128829348 SMO 17 54671559 54672308 NOG

7 155595568 155596445 SHH 17 70119658 70120553 SOX9

8 38287174 38287491 FGFR1 19 643384 643629 FGF22

8 97156765 97157777 GDF6 19 42752591 42753915 ERF

9 94495378 94495743 ROR2 22 22221586 22221755 MAPK1

Patient CRA_29


1 2160180 2161199 SKI 10 94833666 94833905 CYP26A1

2 219924849 219925214 IHH 10 102987001 102987572 LBX1

4 123747905 123748532 FGF2 10 102988222 102988597 LBX1

5 134364443 134365036 PITX1 10 103530060 103530401 FGF8

5 134364443 134365036 PITX1 11 44331121 44331637 ALX4

7 19156310 19156969 TWIST1 12 115109620 115110132 TBX3

7 42003902 42006264 GLI3 12 115111944 115112665 TBX3

7 128828967 128829348 SMO 17 54671559 54672308 NOG

7 155595568 155596445 SHH 17 70119658 70120553 SOX9

8 97156765 97157777 GDF6 19 643384 643629 FGF22

9 94712123 94712295 ROR2 19 42752591 42753915 ERF

9 98270417 98270668 PTCH1 20 6808104 6866049 Enhancer BMP2 9 98278700 98278880 PTCH1

Patient CRA_34


1 2160180 2161199 SKI 9 98270417 98270668 PTCH1

2 219924849 219925214 IHH 9 98278700 98278880 PTCH1

2 219965137 219974340 NHEJ1 10 94833666 94833905 CYP26A1

4 123747905 123748532 FGF2 10 102987001 102987572 LBX1

5 134364443 134365036 PITX1 10 102988222 102988597 LBX1

5 134364443 134365036 PITX1 10 103530060 103530401 FGF8

7 19156310 19156969 TWIST1 11 44331121 44331637 ALX4

7 42003902 42006264 GLI3 12 115109620 115110132 TBX3

7 128828967 128829348 SMO 12 115111944 115112665 TBX3

7 155595568 155596445 SHH 17 70119658 70120553 SOX9

8 38287174 38287491 FGFR1 19 643384 643629 FGF22

8 97156765 97157777 GDF6 19 42752591 42753915 ERF 9 94712123 94712295 ROR2 20 6808104 6866049 Enhancer

BMP2

Patient CRA_43


1 2160180 2161199 SKI 9 98270417 98270668 PTCH1

1 45292134 45292465 PTCH2 9 98278700 98278880 PTCH1

1 45308507 45308629 PTCH2 10 94833666 94833905 CYP26A1

2 219924849 219925214 IHH 10 102987001 102987572 LBX1

2 219965137 219974340 NHEJ1 10 102988222 102988597 LBX1

4 123747905 123748532 FGF2 10 103530060 103530401 FGF8

5 134364443 134365036 PITX1 11 44286378 44286758 ALX4

ANHANG

XXIV

5 174151637 174152066 MSX2 11 44331121 44331637 ALX4

6 45390288 45390719 RUNX2 11 69588766 69588920 FGF4

7 19156310 19156969 TWIST1 12 115109620 115110132 TBX3

7 42003902 42006264 GLI3 12 115111944 115112665 TBX3

7 128828967 128829348 SMO 17 54671559 54672308 NOG

7 155595568 155596445 SHH 17 70119658 70120553 SOX9

8 38287174 38287491 FGFR1 19 643384 643629 FGF22

8 97156765 97157777 GDF6 19 42752591 42753915 ERF

9 94712123 94712295 ROR2 19 42856334 42856633 MEGF8

9 94495378 94495743 ROR2 Patient CRA_48


1 2160180 2161199 SKI 10 103530060 103530401 FGF8

1 45292134 45292465 PTCH2 10 103535600 103535682 FGF8

2 219924849 219925214 IHH 11 44286378 44286758 ALX4

2 219965137 219974340 NHEJ1 11 69588766 69588920 FGF4

5 134364443 134365036 PITX1 12 115109620 115110132 TBX3

5 174151637 174152066 MSX2 12 115111944 115112665 TBX3

6 45390288 45390719 RUNX2 12 115120591 115121030 TBX3

7 19156310 19156969 TWIST1 17 38512235 38512503 RARA

7 42003902 42006264 GLI3 17 54671559 54672308 NOG

7 128828967 128829348 SMO 17 70119658 70120553 SOX9

7 155595568 155596445 SHH 19 643209 643363 FGF22

8 38287174 38287491 FGFR1 19 643384 643629 FGF22

8 97156765 97157777 GDF6 19 1295518 1295882 EFNA2

9 94712123 94712295 ROR2 19 42752591 42753915 ERF

9 98209168 98209758 PTCH1 19 42856334 42856633 MEGF8

9 98270417 98270668 PTCH1 19 42872581 42872839 MEGF8

9 98278700 98278880 PTCH1 19 42879633 42880952 MEGF8 9 101867462 101867609 TGFBR1 20 6808104 6866049 Enhancer

BMP2

10 94833666 94833905 CYP26A1 20 34021681 34022606 GDF5

10 102987001 102987572 LBX1 22 22221586 22221755 MAPK1

10 102988222 102988597 LBX1

Patient CRA_49


4 123747892 123748549 FGF2 10 103535600 103535779 FGF8

7 19156309 19157030 TWIST1 19 639913 640152 FGF22

8 97156753 97157777 GDF6 19 1286118 1286357 EFNA2

9 98270420 98270659 PTCH1 19 42874835 42875014 MEGF8

9 98278662 98278957 PTCH1 X 53652593 53653099 HUWE1

9 101867446 101867625 TGFBR1 Patient CRA_56


1 2160180 2161199 SKI 10 102988222 102988597 LBX1

1 45292134 45292465 PTCH2 10 103530060 103530401 FGF8

1 45308507 45308629 PTCH2 11 44286378 44286758 ALX4

2 219919903 219920612 IHH 11 44331121 44331637 ALX4

2 219924849 219925214 IHH 11 69588766 69588920 FGF4

2 219965137 219974340 NHEJ1 12 115109620 115110132 TBX3

ANHANG

XXV

5 134364443 134365036 PITX1 12 115111944 115112665 TBX3

5 174151637 174152066 MSX2 12 115118658 115118976 TBX3

6 45390288 45390719 RUNX2 17 54671559 54672308 NOG

7 19156310 19156969 TWIST1 17 70119658 70120553 SOX9

7 42003902 42006264 GLI3 19 643384 643629 FGF22

7 155595568 155596445 SHH 19 1295518 1295882 EFNA2

8 38287174 38287491 FGFR1 19 42752591 42753915 ERF

8 97156765 97157777 GDF6 19 42838133 42838390 MEGF8

9 94712123 94712295 ROR2 19 42854274 42854561 MEGF8

9 98209168 98209758 PTCH1 19 42856334 42856633 MEGF8

9 98270417 98270668 PTCH1 19 42872581 42872839 MEGF8

9 98278700 98278880 PTCH1 19 42879633 42880952 MEGF8 10 94833666 94833905 CYP26A1 20 6808104 6866049 Enhancer

BMP2

10 102987001 102987572 LBX1 20 34021681 34022606 GDF5

Patient CRA_64


4 123747892 123748549 FGF2 19 639913 640152 FGF22

7 19156309 19157030 TWIST1 19 1286118 1286357 EFNA2

9 101867446 101867625 TGFBR1 19 42874835 42875014 MEGF8

10 103535600 103535779 FGF8 Patient CRA_80


4 123747892 123748549 FGF2 10 103535600 103535779 FGF8

7 19156309 19157030 TWIST1 19 1286118 1286357 EFNA2

9 98270420 98270659 PTCH1 19 42874835 42875014 MEGF8

9 98278662 98278957 PTCH1 20 30946517 30946696 ASXL1

9 101867446 101867625 TGFBR1

E) DECIPHER Patienten mit überlappenden Aberrationen

Tabelle E.1: DECIPHER Patienten mit überlappenden 15q21.3 Monosomien, die TCF12 betreffen (zusätzliche chromosomale Aberrationen werden nicht aufgeführt; Stand Juli 2018)

DECIPHER ID chr. Position [hg19] Phänotyp

332881 15:49716395-60143976 - 965 15:49896865-60460116 Intelligenzminderung, Corpus callosum Hypoplasie,

Koarktation der Aorta

256795 15:50183964-58519952 -

299906 15:51407592-64015525 globale Entwicklungsverzögerung

266272 15:51504485-63814786 Polydaktylie Füße, multiple Nierenzyten 250024 15:51735068-57724096 Hypertelorismus, Ptose, abfallende Lidspalten, tief-

sitzende Ohren, Zahnfehlstellung, Situs inversus, Intelligenzminderung

284754 15:52851404-65115971 Hypermetropie, Strabismus, offener Mund, Plattfuß, neonatale Hypotonie, motorische Entwicklungsverzögerung

262196 15:54254351-60857397 Adipositas, Makrozephalie, Intelligenzminderung

271644 15:55951100-62484416 Intelligenzminderung


262662 15:57024476-57543522 -

278460 15:56547697-60188065 -

ANHANG

XXVI

Tabelle E.2: DECIPHER Patienten mit überlappenden 5p15.1-p12 Trisomien (zusätzliche chromosomale Aberrationen werden nicht aufgeführt; Stand Juli 2018)


314621 5:1-42573850 -

269509 5:71704-35463036 siehe Datenbank

268568 5:25942-25196251 siehe Datenbank

285458 5:6262981-27692374 -

4119 5:7521238-43644925 siehe Datenbank

255566 5:14339427-28281053 siehe Datenbank

283397 5:22308449-34002057 -

314656 5:32230408-37392200 siehe Datenbank

255925 5:35589089-39328506 siehe Datenbank

317726 5:35861979-42250628 siehe Datenbank

1227 5:36240080-42862390 siehe Datenbank

FGF10 betroffen

283637 5:38542259-54415610 -

305917 5:25801713-52322105 Epikanthus, verzögerte Sprachentwicklung, milde globale Entwicklungsverzögerung

288085 5:27103225-46202807 lange Zehen


Tabelle E.3: DECIPHER Patienten mit überlappenden 2q37.3-qter Monosomien (zusätzliche chromosomale Aberrationen sowie der Phänotyp werden nicht aufgeführt; Stand Juli 2018)

DECIPHER ID mit isolierten, partiellen 2q Monosomien

252472 // 301123 // 258634 // 333250 // 249331 // 331076 // 249751 // 254923 // 249934 // 273993 // 296349 // 278203 // 280666 // 261798 // 294708 // 294406 // 249494 // 263211 // 252496 // 324169 // 285991 // 305886 // 251241 // 250622 // 248458 // 290061 // 250317 // 277875 // 326587 // 333551 // 248705 // 262608 // 331574 // 282765

DECIPHER ID mit partiellen 2q Monosomien und zusätzlichen Aberrationen

292073 // 265197 // 283249 // 283212 // 255789 // 257099 // 257505 // 285992 // 248461 // 314714 // 255105 // 278624 // 257439 // 250715 // 296432 // 865 // 269574 // 327862// 252280 // 1379 //283821 // 340921 // 281648

Tabelle E.4: DECIPHER Patienten mit überlappenden 8p23.3-pter Monosomien (zusätzliche chromosomale Aberrationen sowie der Phänotyp werden nicht aufgeführt; Stand Juli 2018)

DECIPHER ID mit isolierten, partiellen 8p Monosomien

317196 // 269522 // 251426 // 328437 // 322108 // 277848 // 317193 // 288410 // 273410 // 314825 // 295087 // 269276 // 338954 // 303661 // 338097 // 294526 // 263448 // 266826 // 281204 // 280996 // 268285 // 254459 // 323665

DECIPHER ID mit partiellen 8p Monosomien und zusätzlichen Aberrationen

260186 // 283051 // 254627 // 276226 // 251470 // 251369 // 270537 // 288865 // 288139 // 331178 // 288140 // 288975 // 289112 // 249297 // 256909 // 254484 // 259621 // 252481 // 257200 // 257198 // 254962 //253195 // 253194 // 299664 // 258847 // 271197 // 264850 // 256501 // 264516 // 254177 // 277536 // 4088 // 272067 // 271695 // 300689 // 281469 // 275084 // 274900 // 262600 // 326869 // 277938 // 285995 // 286143 // 285667 // 285797 // 286197 // 2841 // 337882

ANHANG

XXVII

Tabelle E.5: DECIPHER Patienten mit überlappenden 5q34-qter Trisomien (zusätzliche chromosomale Aberrationen sowie der Phänotyp werden nicht aufgeführt, Patienten mit MSX2 Zugewinn sind hervorgehoben; Stand Juli 2018)

DECIPHER ID mit isolierten, partiellen 5q Trisomien

278114 // 264221 // 331567 // 289877 // 252793 // 249567 // 248956 // 293742 // 338770 // 292632 // 300677 // 284463 // 319416 // 308800 // 285747 // 267309 // 315077 // 262602 // 336847 // 337182 // 306149 // 306459 // 303663 // 258658 // 258631 // 338708 // 300119 // 319580 // 306987 // 295585 // 284791 // 306529 // 296528 // 305306

DECIPHER ID mit partiellen 5q Trisomien und zusätzlichen Aberrationen

282073 // 273674 // 285499 // 280719 // 282379 // 284051 // 264214 // 274319 // 254931 // 289031 // 289790 // 253167 // 250838 // 256565 // 331005 // 264563 // 253147

Tabelle E.6: DECIPHER Patienten mit überlappenden 2q34-qter Trisomien (zusätzliche chromosomale Aberrationen sowie der Phänotyp werden nicht aufgeführt; Stand Juli 2018)

DECIPHER ID mit partiellen 2q Trisomien

265082 // 294902 // 304173 // 331143 // 267729 // 262585 // 288203 // 326498 // 308661 // 1464 // 256295 // 1496 // 257099 // 296348 // 2024 // 267729 // 259590 // 252280 // 285957 // 285689 // 271370 // 274172 // 255106 // 327862 // 293310

IHH betroffen DECIPHER ID chr. Position [hg19] Phänotyp

259205 2:209072197-220561675 Atopisches Ekzem, kognitive Beeinträchtigung, Genu valgum, Pterygium colli

282992 2:213255835-220275950 ADHS, Koordinationsstörung, verzögerte Sprach-entwicklung, Zahnauffälligkeiten, Mikrognathie, Übergewicht

286233 2:95530631-243068396 - 260838 2:216527137-242783384 Glaukom, Intelligenzminderung 304173 2:219713606-221090946 Syndaktylie Finger I-II

Tabelle E.7: DECIPHER Patienten mit überlappenden 7q21.13-q21.3 Monosomien (zusätzliche chromosomale Aberrationen werden nicht aufgeführt; Stand Juli 2018)


255823 7:93515492-94229044 -

289126 7:91558571-91777875 Autismus, verzögerte Sprachentwicklung 289274 7:91997684-97905676 Intelligenzminderung, Mikrognathie, Minderwuchs 273170 7:92443586-94215634 breite Stirn, Mikrozephalie, triangulares Gesicht,

Klinodaktylie des Kleinfingers, Minderwuchs, Verstopfung, Hyperhidrose

257117 7:93633040-94931564 -

FZD1 betroffen DECIPHER ID chr. Position [hg19] Phänotyp

806 7:77803224-93290138 Minderwuchs, Anfälle, verzögerte Sprachentwicklung, Intelligenzminderung

289274 7:91997684-97905676 Minderwuchs, Mikrognathie, Intelligenzminderung

811 7:67230978-92831897 verzögerte Sprachentwicklung, Epilepsie, mukuläre Hypotonie, Intelligenzminderung, Verstopfung, Optikus Hypoplasie

ANHANG

XXVIII

854 7:65621477-101019060 Gaumenspalte, abfallende Lidspalten, Epikanthus, Hydrozephalus, Hypertelorismus, Mikrozephalie, Mikrognathie, Intelligenzminderung, Spalthand und -fuß, Herzdefekt, Inguinalhernie

855 7:81425451-98445563 Spaltfuß, Mikrozephaliem Minderwuchs, Intelligenzminderung


4100 7:85976320-94268253 Abnormale Genitalien, Haut und Oberlippe; Autismus, breiter Daumen, Epikanthus, Intelligenzminderung, verzögerte Sprachentwicklung, Mikrozephalie, tief-sitzende Ohren, Skoliose, kurzes Philthrum

321 - -

306535 7:80270442-104087437 -

285920 7:86574084-94631377 Gaumenspalte, faziale Dysmorphien, Mikrozephalie, Herzdefekte, Lungenstenose

331982 - -

251554 - -

F) Auswertung SMAD6 Sequenzierungsprojekt

Tabelle F.1: Aufführung der detektierten SMAD6 Varianten von jedem Patienten (ohne Bewertung)

Patienten- ID

SMAD6 Varianten BMP2 SNP Patienten- ID

SMAD6 Varianten BMP2 SNP

P01 - P49 c.253C>T, p.R85C c.711C>T, p.H237H c.875-22C>A

-

P02 c.264C>G, p.G88G, c.875-22C>A

P50 c.120C>T, p.G40G

P03 c.120C>T, p.G40G P51 c.875-22C>A

P04 c.875-22C>A - P52 c.875-22C>A

P05 - P53 c.875-22C>A -

P06 c.120C>T, p.G40G c.802C>G, p.R268G c.875-22C>A

- P54 c.875-22C>A

P07 c.875-22C>A P55 c.120C>T, p.G40G c.875-22C>A

P08 c.875-22C>A - P56 c.875-22C>A

P09 - P57 c.875-22C>A

P10 c.875-22C>A - P58 c.875-22C>A -

P11 - P59 c.120C>T, p.G40G

P12 c.120C>T, p.G40G - P60 - -

P13 c.875-22C>A P61 - -

P14 - P62 c.875-22C>A

P15 c.875-22C>A - P63 -

P16 c.120C>T, p.G40G c.465-471del, p.G156Vfs*23

P64 -

P17 c.875-22C>A P65 c.875-22C>A

P18 c.875-22C>A - P66 c.120C>T, p.G40G c.875-22C>A

P19 c.875-22C>A - P67 c.875-22C>A

P20 - P68 c.875-22C>A -

P21 c.875-22C>A P69 c.875-22C>A -

P22 c.1-24insA, c.875-22C>A

P70 c.875-22C>A

P23 c.875-22C>A P71 - -

ANHANG

XXIX

P24 c.875-22C>A P72 c.253C>T, p.R85C

P25 c.875-22C>A P73 c.253C>T, p.R85C

P26 c.875-22C>A P74 c.875-22C>A

P27 - P75

c.587A>G, p.E196G c.619C>T, p.L207L c.875-22C>A c.1173T>G. p.I391T

P28 - P76 c.875-22C>A

P29 c.875-22C>A P77 -

P30 - P78 c.875-22C>A -

P31 - P79 c.711C>T, p.H237H -

P32 - - P80 -

P33 - P81 -

P34 - - P82 c.875-22C>A

P35 c.875-22C>A - P83 c.875-22C>A -

P36 - - P84 c.711C>T, p.H237H

P37 c.120C>T, p.G40G - P85 c.875-22C>A

P38 - P86 c.875-22C>A

P39 c.120C>T, p.G40G P87 c.875-22C>A

P40 - P88 c.875-22C>A -

P41 - P89 -

P42 c.875-22C>A P90 -

P43 c.875-22C>A P91 c.875-22C>A

P44 c.875-22C>A P92 - -

P45 - P93 -

P46 c.875-22C>A P94 -

P47 - - P95 c.875-22C>A

P48 c.875-22C>A P96 - -

G) Vektorkarten

ANHANG

XXX

ANHANG

XXXI

ANHANG

XXXII

eva-maria Önig - opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de · 1.5 suturen – anatomie, ... abbildung 2.1:...

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