etude phytochimique et activité antioxydante de l'huile
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/(épuMi9ue de Côte d1voire Union - Discipline - T ravai/
Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
l'NIVlil-<"'I r r: NANGUIABROGOUA
Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et
Appliquées (UFR-SFA)
Laboratoire de Chimie Bio-Organique et de Substances Naturelles
(LCBOSN)
Année Académique : 2015-2016
MEMOIRE DE MASTER DES SCIENCES FONDAMENTALES ET
APPLIQUEES
Mention : Chimie Option : Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles
Sujet
Etude Phytochimique et Activité Antioxydante de
l'Huile Essentielle de Origanum syriacum L.
(Lamiaceae) acclimaté en Côte d'Ivoire
Présenté par KOUAME Akissi Christelle Euphrasie
Encadré par Dr. OUATARA Zana Adama, Maître Assistant
Soutenu le 6 janvier 2017 devant le jury composé de :
Président du jury : Pr. Békro Yves-Alain, Professeur Titulaire
Directeur scientifique: Pr. MAMYRBEKOVA J. A. épse BEKRO, Professeur Titulaire
Examinateur : Dr. KODJO Charles, Maître de Conférences
TABLE DES MATIERES
DEDICACES iv
REMERCIEMENTS··································································································· V
LISTE DES FIGURES vii
LISTE DES TABLEAUX viii
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS ix
INTRODUCTION 1
Chapitre 1 : 2
Revue bibliographique 2
1. ORIGANUM SYRIACUM 3
1.1. Description de la plante 3
1.2. Position systématique 4
1.3. Usages 4
1.4. Travaux antérieurs réalisés sur le genre Origanum 5
li.GENERALITES SUR L'HE 7
11.1. Définition 7
11.2. Composition chimique des HE 8
11.2.1. Composés terpéniques 8
11.2.2. Composés aromatiques 9
11.2.3. Composés d'origines diverses 9
11.3. Biosynthèse des constituants des HE 9
11.4. Notion de chémotype 13
11.5. Procédés d'extraction des HE 13
11.5.1 Méthodes classiques 13
11.5.2 Méthodes innovantes 15
11.6. Méthode d'analyse des HE 17
11.6.1. Chromatographie sur Couche Mince (CCM) 17
11.6.2. Chromatographie en Phase gazeuse (CPG) 17
11.6.3. Couplage CPG-SM 18
11.6.4. Résonance Magnétique Nucléaire du 13C (RMN13C) 18
11.7. Activités antioxydantes des HE 20
Chapitre 11 : 22
Matériel et méthodes 22
1. MATERIEL 23
1.1. Matériel végétal 23
1.2. Matériel technique 23
1.3. Matériel chimique 24
li.METHODES D'ETUDE 24
11.1. Extraction de l'HE 24
11.2. Méthodes d'analyse des HE 25
11.2.1. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) 25
11.2.2. Dépistage de l'activité antioxydante des HE par CCM 26
11.2.3. Evaluation de l'activité antioxydante des HE par
spectrophotométrie 26
11.2.4. Analyse des HE par CPG 27
11.2.5. Analyse des HE par CPG-SM 28
11.2.6. Analyse des HE par RMN 29
Chapitre Ill: 31
Résultats et discussion 31
1. Rendements en HE 32
2. Différents profils chromatographiques CCM 33
ii
3. Illustration de .la méthode d'analyse par RMN 13C, CPG(lr) et CPG-SM : HE des
TFF de Origanum syricum 34
3.1. Identification par RMN 13C 36
3.2. Identification par CPG(lr) et CPG/SM 38
4. Effet du temps de séchage sur la composition chimique de l'HE de Origanum
syriacum 40
5. Evaluation de l'activité antioxydante des HE .45
5.1. Evaluation qualitative par CCM .45
5.2. Evaluation quantitative par spectrophotométrie .46
CONCLUSION ET PERSPETIVES 50
Références bibliographiques 51
Résumé : 60
Abstract. 61
iii
DEDICACES
A DIEU TOUT PUISSANT,
Maitre omniscient, pour m'avoir permis de mener à bien ce travail.
A ma famille ;
A mon père Mr KOUADIO Kouamé J'ai appris auprès de toi la patience et l'endurance dans le travail.
Ce travail est le tien. Que DIEU te garde plus longtemps auprès De nous.
A ma mère KOUAME Aya Suzanne Tu n'as ménagé aucun effort pour que j'arrive à ce niveau.
Tes prières m'ont sans cesse accompagnée. Maman merci pour ton dévouement et tes sages
Conseils à mon endroit. Reçois l'assurance de mon affection.
iv
REMERCIEMENTS
Tout d'abord je tiens à présenter mes sincères remerciements à ma directrice
scientifique, Mme MAMYRBEKOVA Janat Akhanovna épouse BEKRO,
Professeur Titulaire, Directrice du Pôle Pharmacopée Africaine et Substances
Naturelles, Responsable du Master de Chimie et Physico-chimie des Substances
Naturelles, pour avoir encadré ce mémoire. Recevez à travers ce mémoire ma
respectueuse gratitude pour votre simplicité, grande disponibilité et vos directives
qui m'ont permis de réaliser ce travail.
Mes remerciements vont également à l'endroit du Dr. OUATTARA Zana
Adama, qu'il trouve ici l'expression de ma profonde reconnaissance tant pour son
dévouement exemplaire et son encadrement sans faille que pour ses conseils
avisés et avis judicieux durant la réalisation de ce mémoire.
A M. BEKRO Yves-Alain, Professeur Titulaire, Directeur du Laboratoire de
Chimie Bio-Organique et Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Université Nangui
Abrogoua (UNA). Je vous remercie infiniment pour m'avoir accepté dans votre
laboratoire et pour vos riches enseignements dont j'ai bénéficié au cours de mon
cursus universitaire. Nous avons admiré vos immenses qualités humaines et
pédagogiques ainsi que l'intérêt particulier que vous portez à vos étudiants.
A M. TOMI Félix, Professeur Titulaire à l'Université de Corse pour nous avoir
permis de faire nos analyses dans son laboratoire.
A tous les autres enseignants du LCBOSN pour leur disponibilité, leur
sollicitude et leurs précieux conseils. A tous les doctorants du laboratoire et d'ailleurs particulièrement à GUESSAN
Bi Goblé Landry pour leurs soutiens et leurs entières disponibilités, qu'ils trouvent
ici l'expression de ma profonde gratitude.
A tous les étudiants de Master 2 (Option Chimie et Physico-Chimie de
Substances Naturelles) de l'année académique 2015-2016 pour l'esprit de
solidarité qui a prévalu durant toute l'année, je vous remercie pour tout.
A mon beau-frère Pasteur KANGA Kouakou Daniel et son épouse KOUAME Affoué Rosine, veuillez trouver l'expression de mon profond respect et mes
sincères remerciements pour tout ce que vous avez fait, faites et ferez pour moi.
V
A tous mes frères et sœurs, merci à vous pour vos soutiens et différentes prières.
Que nos liens de sang fassent de nous de véritables complices de la vie.
A tous les autres membres de la Famille, qui de loin ou de près et qui d'une
manière ou d'une autre m'ont soutenu. Soyez rassurés de toute mon affection et
reconnaissance.
vi
LISTE DES FIGURES
Figure 1 :Tiges feuillues de Origanum syriacum [27) .4
Figure 2: Quelques composés majoritaires des espèces du genre Origanum 7
Figure 3: principales voies de biosynthèse des composés volatils naturels 10
Figure 4: Mécanisme de biosynthèse de l'isoprénoïde: voie du mévalonate 11
Figure 5 Bibliothèque de spectres 19
Figure 6 : Tiges feuillues fraîches (A) et sèchées (B) de Origanum syriacum (photo prise par
Kouamé Christelle, 2016) 23
Figure 7: Montage d'hydrodistillation de type Clévenger (photo prise par Goblé Landry, 2013) 25
Figure 8 : Chromatographe en phase gazeuse ( Perkin-Elmer type Clarus 500) (photo prise par
Ouattara A. Zana, 2016) 28
Figure 9: chromatographe Perkin Elmer autosystem XL (photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)
.......................................................................................................................................................................... 29
Figure 10: chromatographe Perkin Elmer autosystem XL(photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)
.......................................................................................................................................................................... 30
Figure 11 : rendement des HE extraites à partir des tiges feuillues fraîches 32
Figure 12: Profils chromatographiques d'HE des tiges feuillues d'Origanium syrianum révélées à
l'UV/254 nm (A) et à la vanilline sulfurique dans le visible (8) 33
Figure 13 : Molécules majoritaires de l'HE des TFF de Origanum syricum 36
Figure 14 Spectre RMN 13C de l'échantillon TFF 37
Figure 15 : Signaux RMN 13C de référence et expérimentaux (en gras) du carvacrol 38
Figure 16: Chromatogramme (sur colonne apolaire) de l'HE de TFF de Origanum syriacum 39
Figure 17 : Spectre de masse en mode impact électronique du carvacrol 39
Figure 18 : différentes fragmentations de la molécule de caracrol 40
Figure 19 : Schéma réactionnel de la conversion du DPPH• ( oxydant) en DPPH-H (réducteur) .45
Figure 20 : Chromatogramme des HE révélées au DPPH• 46
Figure 21 : l'lnhibition du DPPH• en fonction de la concentration des HE et de la vitamine C .47
Figure 22 : Courbes de l'activité anti-oxydante des HE en fonction du pourcentage d'inhibition du
DPPH• par rapport à la vitamine C 48
Figure 23 : CEso des HE et de la vitamine C 49
vii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Résultats de la détection des HE extraites par CCM 34
Tableau 2: Composition chimique de l'HE des tiges feuillues fraîches 35
Tableau 3 : Composition chimique des HE de Origanum syriacum en fonction du
temps de séchage 41
Tableau 4 : Composition chimique des HE de Origanium syriacum récolté dans
différents pays 43
viii
LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS
AFNOR: Association Française de Normalisation
ASE: Accelerated Solvant Extraction
ATP: Adénosine Triphosphate CCM: Chromatographie sur Couche Mince
CDCb : cloroforme deuteré
CPG: Chromatographie en Phase Gazeuse
DMAPP: Diméthylallyldiphosphate
DPPH: 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle
FID : Free Induction Decay
FPP: Farnésyldiphosphate GGPP: Géranyl-géranyldiphosphate
GPP: Géranyldiphosphate HE: Huile Essentielle
IPP: lsopentenyldiphosphate
Ir: Indices de Rétention
ISO: International Organization for Standardization
MS: Spectrométrie de Masse
ND : non identifié NADPH: Nicotinamide Adénine Dinucléotide phosphate
NF: Norme Française
Rf: Rapport Frontal
RMN: Résonance magnétique nucléaire
TFF: Tiges feuillues fraiches TFS: Tiges feuillues séchées VIT C : vitamine C
ix
INTRODUCTION
Un grand nombre de plantes aromatiques possède des propriétés
biologiques très intéressantes qui trouvent leur application dans divers domaines.
En effet depuis des milliers d'années, elles servent fidèlement l'homme en
améliorant non seulement sa nourriture et sa beauté, mais occupent aussi une
place digne comme agents thérapeutiques [1]. Mais, afin d'utiliser correctement et
de manière compétente les plantes aromatiques, il est nécessaire de connaître
leurs propriétés, lesquelles dépendent de la présence de substances biologiques
très variées selon leur composition. Ainsi, l'étude de la composition chimique des
plantes demeure une tâche très importante. Par ailleurs, pour les plantes
aromatiques, l'huile essentielle (HE) représente un réservoir de ces composés
bioactifs. C'est pourquoi, l'objectif principal de notre travail est l'étude de l'HE issue
de Origanum syriacum L. acclimatée en Côte d' Ivoire. O. syriacum est une plante
aromatique, originaire du Moyen-Orient, dont l'HE a été beaucoup étudiée [2-19].
Cependant, il n'existe pas d'informations concernant l'HE de O. syriacum cultivée
dans les pays d'Afrique de l'Ouest. C'est à cet effet que nous avons décidé
d'étudier la composition chimique de l'HE de O. syriacum acclimaté en Côte
d'Ivoire et la comparer à celles publiées. Ainsi, nous avons :
- extrait les HE de O. syriacum à partir des tiges feuillues fraîches et
séchées par l'hydrodistillation à l'aide d'un extracteur de type Clévenger; - analysé la composition chimique des HE extraites par CPG (Ir), CPG-SM et
RMN 13C · ,
évalué l'activité antioxydante par spectrophotométrie au moyen du DPPH• ;
- comparé la composition chimique et le pouvoir antioxydant des HE en
fonction du temps de séchage ; - comparé les résultats que nous avons obtenus avec ceux précédemment
publiés sur les HE d'origine méditerranéenne.
1
Chapitre 1 :
Revue bibliographique
1
2
1
1. ORIGANUM SYRIACUM
Les Lamiacées sont une famille de plantes dicotylédones répandues dans le
monde entier. Ils sont pour la plupart des herbes ou des arbustes et comptent
environ 236 genres, lesquels contiennent entre 6 900 et 7 200 espèces [20]; mais
la banque de donnée en compte 7 534 espèces [21]. Le genre Origanum L. comprend 3 groupes, 10 sections, 38 espèces, 6 sous
espèces, 3 variétés et 16 hybrides, caractérisé par une diversité morphologique et
chimique importante [22, 23]. Ce genre est largement présent dans les îles
Canaries et les Açores, dans l'Europe du Nord et jusqu'à l'Est de l'Asie. Mais la
région méditerranéenne représente son aire de distribution la plus importante.
Environ 75% se trouvent dans l'Est méditerranéen et seulement quelques espèces
se produisent dans la partie occidentale de la Méditerranée [24]. Il contient des
plantes aromatiques et médicinales. Le nom origanum vient de 2 mots grecs, "oros"
qui veut dire montagne et "ganos" qui signifie éclat ; donc il signifierait "ornement
des montagnes" [25]. L'espèce Origanum Syriacum est très aromatique et est connu sous le nom
za'atar dans des pays du Maghreb et au Moyen-Orient. Son synonyme est
Majorana syriece [13].
1.1. Description de la plante Origanum syriacum L. (Lamiaceae) est une plante pérenne, atteignant une
hauteur de 0,8 à 1 m, sous-frutescente à la base, à tiges et rameaux dressés,
couverts de poils étalés. Ses feuilles sont pétiolées, souvent garnis de poils très
denses. Le limbe est ové (1-3 cm) ordinairement obtus, parfois subaigu, à marge
entière, ou, rarement, ondulée, pubescente, plus ou moins grisâtre, à nervures très
marquées. La floraison s'observe de juin à décembre suivant les régions. Les épis des
fleurs sont fasciculés avec les ramures axillaires au sommet et les tiges sont
portées par des pédoncules de longueur variable, ovés à cylindriques, dépassant
rarement 1 cm. Les bractées sont distiques, obtuses, fortement imbriquées,
occluant les calices. Le calice (1,5-2mm) est vert, pubescent, profondément
échancré à l'extérieur et à tube tenu [26].
3
Figure 1 :Tiges feuillues de Origanum syriacum [27]
1.2. Position systématique Embranchement :
Sous-embranchement :
Classe:
Sous-classe :
Série:
Super ordre :
Ordre:
Famille:
Sous-famille :
Genre:
Espèce:
Spermaphytes
Angiospermes
Dicotylédones
Gamopétales
Superovariées tétracycliques
Tubiflorales
Lamiales
Lamiaceae
Népétoïdées
Origanum
syriacum
1.3.Usages Origanum syriacum est employée dans le traitement de multiples troubles :
respiratoires (la toux, le rhume, la bronchite, l'asthme, l'angine), gastro-intestinal
(épigastralgie, météorisme), urinaire (infection urinaire) et cardiaque. Aussi, est
elle utilisée pour remédier aux dysménorrhées, céphalées, arthrite rhumatoïde.
Origanum syriacum possède des propriétés antiparasitaire, antiallergique. En
application locale, elle traite certaines affections de peau telles que les dermites 4
séborrhéiques, acnés, intertrigo, verrue, psoriasis, varice ; mais aussi les rages
dentaires et les douleurs musculaires. Dans le domaine culinaire Origanum
syriacum est utilisé comme épice et agent de conservation [28]
1.4. Travaux antérieurs réalisés sur le genre Origanum Le genre Origanum a fait l'objet de nombreuses études chimiques, les
principaux travaux réalisés sur les HE obtenues à partir des principales espèces
rapportent que : - le p-cymène (82,8%), le y-terpinène (6,2%), le p-cymène-8-ol (1,5%) et le
carvacrol (1,2%). sont les composés majoritaires de l'HE d'Origanum saccatum L.
[2] ; - les constituants majoritaires des HE des feuilles de cinq espèces du genre
Origanum de Turquie: O. vu/gare subsp. Hirtum, O. syriacum var. bevanii, O.
majorana, O. minutiflorum et O. onites sont le carvacrol (23,4-80,4%), le thymol
(0,01-39,8%) et le linalol (90,0-91,9%) [3] ; - les composés importants des HE d'Origanum glandu/osum récolté dans le
Nord-Est de Algérie sont le thymol (34,2% et 51, 1 %), le p-cymène (6,6% et 7,5%)
et le y-terpinène (13,4% et 14,5%) [4]; - le fractionnement chromatographique de l'HE d'Origanum d'Espagne a
permis d'identifier 25 monoterpènes, 9 sesquiterpènes, 5 composés aliphatiques, 2
composés phénoliques [5]. En ce qui concerne l'espèce Origanum syriacum sauvage et cultivé dans les
pays du nord d'Afrique et du Proche Orient, elle a été bien étudiée. Les auteurs de
nombreuses études ont rapporté sur les HE extraites de ses feuilles les
informations suivantes:
• La composition chimique de 117 échantillons appartenant à 11 différentes
régions de la Syrie a été étudiée par CPG-MS. La composition était dominée par le
carvacrol et / ou le thymol [6]. Aussi, la thymoquinone, un candidat anticancéreux
prometteur, à été identifié dans les différents échantillons avec les pourcentages
entre 0,04 et 23,7% [7]. • Des travaux successifs de plusieurs équipes de chercheurs ont mis en
évidence une variabilité de la composition chimique des HE en fonction des 5
saisons. Selon ces résultats, la teneur en HE et en monoterpènes phénoliques
diminue pendant la période de floraison tandis que sous de longues photopériodes,
cette teneur augmente, alors que celle du p-cymène diminue [8 - 10].
• L'analyse par CPG et CPG-MS de l'HE des feuilles cultivées en Turquie a
montré que sa composition chimique était dominée par les monoterpènes à
49,02%, monoterpènes oxygénés (36,60%) et sesquiterpènes (12,59%). Les
principaux composants étaient le y-terpinène, le carvacrol, le p-cymène et le 11-
caryophyllène. De plus, les tests de l'activité antioxydante réalisés ont montré que
l'HE de Origanum syriacum comporte des substances antioxydantes [11, 12]
• Les chercheurs du Liban ont montré que les HE des feuilles cultivées sont
riches en carvacrol tandis que celles des feuilles sauvages sont dominées par le
thymol [13]. • l'HE de feuilles récolté au Liban contient 36 composés et sa composition
chimique est dominée par le thymol (24. 7%) et le carvacrol ( 17 .6% ). Aussi, cette
HE a-t-elle manifesté une bonne activité antioxydante [14].
• De nombreux travaux ont été consacrés à l'étude des propriétés
pharmacologiques de l'HE de feuilles de Origanum syriacum. Il en ressort que,
l'extrait des feuilles induit un effet cytotoxique en réduisant la viabilité des cellules
leucémiques [15]. En plus, elle manifeste les activités antimicrobienne [16],
antioxydante [17], antifongique [18] et antiprotozoaire [19].
6
.OH OH
Carvacrol Linalol y-terpinène
OH
Thymol p-cymène 0
thymoquinone
Figure 2: Quelques composés majoritaires des espèces du genre Origanum
li.GENERALITES SUR L'HE
11.1. Définition
Il existe plusieurs définitions de l'HE en fonction de son aspect étudié,
lesquelles sont définies par des botanistes, des physico-chimistes, des industriels,
des parfumeurs ou des pharmacologues [29]. Bruneton a défini l'HE comme «des produits de composition généralement
assez complexe renfermant des principes volatils contenus dans les végétaux et
plus ou moins modifiés au cours de la préparation » [30]. Selon la norme française AFNOR NF T75-006 et ISO, l'HE est un : «produit
obtenu à partir d'une matière première d'origine végétale, après séparation de la
phase aqueuse par des procédés physiques : soit par entraînement à la vapeur
7
d'eau, soit par des procédés mécaniques à partir de l'épicarpe des Citrus, soit par
distillation sèche» [31 ]. Pour Belaiche [32], les HE sont des substances de consistance huileuse
mais sans corps gras, de densité très souvent inférieure à celle de l'eau, plus ou
moins fluides, voire résinoïdes, très odorantes, volatiles, souvent colorées, extraites
à partir d'une matière première végétale botaniquement définie, par des méthodes
de distillation, par enfleurage, par expression, par solvant ou par d'autres
méthodes. Les HE sont constitués des métabolites secondaires produits et utilisés par
les plantes aromatiques pour interagir avec leur environnement. En effet, elles
permettent d'éloigner les maladies, les parasites, mais aussi jouent un rôle
protecteur face aux rayonnements du soleil [33]. Ces substances sont largement
reparties dans le règne végétal, et certaines familles (lamiaceae, rutacées,
myrtacées) en sont très riches [34]. Les HE jouent un rôle important dans la reproduction et la dispersion des
espèces végétales puisqu'elles permettent d'attirer les insectes pollinisateurs [35].
Elles sont stockées dans tous les organes végétaux: fleurs, feuilles, écorces, bois,
racines, rhizomes, fruits ou graines. Elles peuvent être présentes à la fois dans
différents organes, et leur composition peut variée d'un organe à l'autre [28].
11.2. Composition chimique des HE Les HE sont des mélanges complexes et variés, constitués de composés
organiques de structures et de fonction chimique très diverses. Généralement, on
classe ces composés en deux groupes :
~ Les. terpénoïdes ou composés terpéniques, ce sont des molécules
composées d'un nombre variable d'unités d'isoprène [36]; ~ Les composés aromatiques dérivés du phénylpropane [36].
11.2.1. Composés terpéniques Ce sont des hydrocarbonés naturels de structure soit cyclique soit à chaîne
ouverte, formés d'un multiple pair ou impair d'unités de 2-méthylbuta-1,3-diène
(molécule de base) encore appelé l'isoprène (CsHs). La formule brute de ces
hydrocarbures terpéniques est (CsHx)n dont le x est variable en fonction du degré
8
d'insaturation de la molécule et n le nombre d'unités isopréniques allant de 1 à 8
sauf dans les polyterpènes ou n peut atteindre plus de 100 (le caoutchouc) [37].
Seuls les terpènes dont la masse moléculaire est relativement faible (mono - et
sesquiterpènes) sont rencontrés dans les HE leur conférant un caractère volatil et
aromatique [38,39].
11.2.2. Composés aromatiques Ils sont dérivés du phénylpropane (C6-C3), c'est pourquoi leur biogenèse est
totalement différente des terpènes [40]. Ils sont beaucoup moins fréquents dans
l'HE que les terpènes. Les composés en C6-C1 comme la vanilline ou l'anthranilate
de méthyle sont assez fréquents dans les HE. Les coumarines, lactones dérivées
des acides cinnamiques sont également présentes dans certaines HE [30].
11.2.3. Composés d'origines diverses Ce sont des produits résultant de la transformation de molécules non volatiles
entraînables par la vapeur d'eau. Il s'agit de composés issus de la dégradation
d'acides gras, de terpènes. D'autres composés azotés ou soufrés peuvent
subsister mais sont rares. Certaines plantes aromatiques produisent des HE dont
les composés terpéniques renferment l'élément azote. Parmi ces composés on cite
l'indole, qui se trouve dans HE de citron et des fleurs de jasmin [30].
11.3. Biosynthèse des constituants des HE La synthèse et l'accumulation des HE sont généralement associées à la
présence de structures histologiques spécialisées, souvent localisées à la surface
de la plante. Ce sont des poils sécréteurs dans le cas des Lamiaceae.
Plusieurs hypothèses ont été émises pour expliquer l'origine des HE dans la
plante. Actuellement, il est admis que deux voies métaboliques secondaires
conduisent à la formation des principaux constituants des HE (Figure 3). - la voie de l'acide mévalonique qui conduit aux terpènes (Figure 4); - la voie de l'acide shikimique, précurseurs des composés aromatiques [40].
9
COOH
0
OH
0 Acide pyruvique
OH acide shikimique
lCOOH
Acétyl CoA
HOOC
Acide mévalonique
l -monoterpènes (CI o) -sesquiterpènes (C15)
-diterpènes (C2o) -caroténoides (C40)
OH / X
ArC1
(Vanilline) (Acétophénone) (Anétho_le, Coumarine)
-ionones -damascénones
Figure 3: principales voies de biosynthèse des composés volatils naturels
Selon la règle isoprénique biogénétique, chaque groupe de terpènes est issu
de la condensation « tête à queue » d'un nombre variable d'unités isopréniques,
dont la formation se produit par la condensation de Claisen de trois acétyl-CoA
conduisant au 3-hydroxy-3-méthylglutarylCoA qui est ensuite réduit en mévalonate
[41]. La pyrophosphorylation du mévalonate par l'ATP est suivie d'une
décarboxylation et de la déshydratation conduisant à la formation du
pyrophosphate d'isopentényl (IPP), lequel par simple transfert de proton conduit au
pyrophosphate de diméthylallyle (DMAPP) (Figure 4):
10
2
NADPH
3
H3><H HOA __ .Joo9
SCoA
4
NADPH
2ATP 2ADP
\,__) . 5
Mevalonate
ATP ADP
"" /. H,~P
PPO) OÂ~ 0 6
Figure 4 : Mécanisme de biosynthèse de l'isoprénoïde: voie du mévalonate
Les deux intermédiaires en C5 réagissent alors l'un sur l'autre, pour conduire
au pyrophosphate de géranyle (GPP), point de départ de tous les monoterpènes et
monoterpénoïdes :
p
~~~~
H
0- p
Pyrophosphate de gérariyte
/ Monoterpènes / Terpènoïdes
11
La condensation suivant le même principe, entre l'IPP et le GPP conduit au
FPP, point de départ de tous les dérivées sesquiterpéniquess:
Ç\_p + ç • Gérany lpyrophosphate / F arnésylpyrophosphate
Sesquiterpènes/ Terpènoïdes
Par condensation d'un FPP avec un IPP, est obtenu le géranyl-géranyl
pyrophosphate (GGPP) point de départ de tous les diterpènes/ terpénoïdes:
+~ 0-P
F arnésylpyrophosphate
•
?,anylpy,ophosphate
Diterpènes / Terpénoïdes
Par contre la formation des tri et tétraterpènes / terpénoïdes s'obtient par
dimérisation réductrice à l'aide de NADPH de deux unités de FPP ou GGPP :
Farn.ésylpyrophosphate
+ P-0
Farnésylpyrophosphate
Triterpèn.es / Terpén.oïdes
SQUALENE 12
11.4. Notion de chémotype
Cette notion désigne une entité chimique distincte au sein d'une même
espèce, ayant la capacité différente de former certains produits chimiques
(métabolites), dont l'apparence est presque indiscernable. Les HE tiennent une
place prépondérante dans ce phénomène.
Ces variations chimiques des métabolites secondaires se produisent en
fonction des influences de leurs écosystèmes (altitude, humidité, ensoleillement,
biotope, etc.) sans transformation substantiellement de leur morphologie et leur
génétique, seul leur phénotype est mouvant. Il est important de noter que des HE à
chémotypes différents, présenteront non seulement des activités différentes mais
aussi des toxicités très variables. Les différents chémotypes sont identifiables par
CPG [42].
11.5. Procédés d'extraction des HE Les HE sont généralement présentes à de très faibles concentrations dans
les plantes à parfum. Avant de pouvoir utiliser ou analyser de telles substances, il
est nécessaire de les extraire de leur matrice. Pour se faire, plusieurs méthodes
d'extraction tels que l'hydrodistillation, l'entraînement à la vapeur, l'hydrodiffusion et
autres ont été mises au point [43].
11.5.1 Méthodes classiques
• Hydrodistillation L'hydrodistillation est un procédé au cours duquel, le matériel végétal est mis
en contact direct avec l'eau bouillante dans une enceinte. Le chauffage permet
l'éclatement des cellules et la libération des molécules volatiles contenues dans la
matière végétale. Les vapeurs hétérogènes sont condensées sur une surface froide
et l'HE se sépare par différence de densité [30, 44].
•Entrainement à la vapeur C'est la méthode la mieux adaptée à l'extraction des composés volatiles des
plantes aromatiques médicinales [45]. Le matériel végétal, dans ce cas, n'est pas
13
en contact avec l'eau. L'eau est bouillie dans un récipient situé en dessous, et à
une certaine distance, du matériel végétal supporté par une grille ou une plaque
perforée. A son passage, la vapeur d'eau saturante entraîne l'HE des plantes vers
un système de refroidissement. La vapeur d'eau saturée en composés volatils se
condense en un mélange hétérogène composé d'HE et d'hydrolat [46,30].
L'hydrolat est la phase aqueuse recueillie contenant des traces de composés
aromatiques, il est aussi appelé l'eau florale.
1
•Hydrodiffusion ou percolation
L'hydrodiffusion est une variante de l'entraînement à la vapeur. Dans ce cas,
le flux de vapeur n'est pas ascendant mais descendant. En effet, le végétal est
disposé dans un parallélépipède métallique grillagé. On soumet donc le végétal à
une pulsion de vapeur d'eau, saturée et humide, mais jamais surchauffée, de haut
en bas. Cette technique exploite ainsi l'action osmotique de la vapeur d'eau. Le
principe de cette méthode réside dans l'utilisation de la pesanteur pour dégager et
condenser le mélange dispersé dans la matière végétale [47]. Les substances
obtenues sont chargées en composants non volatils, on parle alors dans ce cas
d'essences de percolation et non d'HE.
•Expression à froid L'expression à froid est le procédé au cours duquel des tissus végétaux très
riches en HE sont compressés pour en extraire l'essence. Cette méthode
d'extraction est utilisée uniquement pour les zestes d'agrumes. Elle peut se faire à
la main ou après scarifications mécaniques [48, 30].
• Extraction par solvants organiques L'extraction se fait à l'aide de solvants organiques volatils dans des appareils
appelés extracteurs de Soxhlet. La mise en œuvre de cette technique est
indispensable lorsque les composés ne sont pas extractibles par distillation en
raison de leur faible volatilité ou pour les organes végétaux présentant une
concentration en huile essentielle relativement faible. Le principe repose sur le
pouvoir qu'ont certains solvants organiques à dissoudre les composants des HE.
14
Au cours de ce procédé, les végétaux sont épuisés successivement dans un
solvant volatil qui après évaporation donne une pâte très aromatique, la concrète.
La concrète est ensuite diluée dans de l'alcool éthylique puis cette solution est
filtrée et concentrée par distillation sous pression réduite afin d'éliminer l'alcool et
laisser place à l'absolut [49].
11.5.2 Méthodes innovantes Les composés volatils sont connus comme étant thermosensibles et
vulnérables aux réactions chimiques. La perte de certains constituants, la
dégradation de certains composés insaturés par effet thermique ou par hydrolyse,
ainsi que la présence de résidus de solvants organiques plus ou moins toxiques
peuvent être engendrés par certaines techniques d'extraction. Ces désavantages
ont stimulés la mise au point de nouvelles techniques d'extraction des HE plus
écologiques utilisant des solvants moins toxiques et en moins grande quantité en
vue d'optimiser la qualité des HE et d'améliorer leur rendement [50].
1 1 1 1 1 1 1
•Extraction assistée par micro-onde Le principe du procédé d'extraction par micro-onde consiste à extraire
l'essence aromatique à l'aide d'un rayonnement micro-onde d'énergie constante et
d'une séquence de mise sous vide. Sous l'effet conjugué du chauffage sélectif des
micro-ondes et de la pression réduite de façon séquentielle dans l'enceinte de
l'extraction, de l'eau présente dans la plante provoque l'éclatement des glandes
oléifères. Le contenu des cellules est donc plus aisément transféré vers l'extérieur
du tissu biologique, et l'essence est entraînée dans le mélange azéotropique formé
avec la vapeur d'eau propre à la plante traitée. Un essencier de type Clévenger
permet de condenser le distillat et de récupérer l'huile essentielle par simple
décantation en tenant compte la différence de densité. Ce procédé présente les
avantages suivants: rapidité, économie de temps, économie d'énergie, économie
d'eau, extrait sans solvant résiduel, etc. [51, 52]
15
•Extraction assisté par ultrason
La propagation des ondes sonores dans les cellules de la plante soumis aux
ultrasons induit en alternance des cycles de haute pression (compression) et des
cycles de basse pression (à basse pression). Les séries de ces cycles de
compressions et de raréfactions créent une pression acoustique responsable des
microcavitations. Le rendement et la vitesse d'extraction sont les principaux
avantages de cette méthode [53].
•Extraction par fluides supercritique Il s'agit du procédé le plus récent d'extraction à froid des matières premières
végétales. C'est. une méthode où on utilise comme solvant d'extraction un fluide
porté à l'état supercritique par un contrôle adéquat de la température et de la
pression. Les qualités dissolvantes des fluides supercritiques sont plus ou moins
sélectives selon la température, la pression et la nature des solutés. Le fluide le
plus fréquemment utilisé est le dioxyde de carbone. Car, bien qu'il fasse parfois
appelle à des co-solvants pour améliorer sa capacité à solubiliser les molécules
polaires, le C02 possède plusieurs atouts: paramètres critiques (P = 73,8 bars, T =
31, 1 °c), produit naturel, inerte chimiquement, ininflammable, atoxique, facile à
éliminer totalement, aisément disponible, prix modeste et sélectif [54].
•Extraction par eau sub-critique Ce procédé utilise les propriétés de l'eau, qui dans sa phase subcritique voit
ses propriétés de solvant modifiées et peut solubiliser des composés faiblement
polaires. Le procédé d'extraction en eau subcritique permet de travailler
directement sur la matière première humide sans étape de séchage et de proposer
une technique d'extraction sans utilisation de solvant chimique [55].
•Extraction par solvant accéléré (ASE) L'extraction par solvant accéléré connue sous le nom d'ASE (Accelerated
Solvant Extraction) utilise l'effet combiné d'une température élevée et de la
pression avec des solvants classiques pour augmenter l'efficacité du processus
16
d'extraction. li en résulte des temps d'extraction plus rapides et une réduction
significative de l'utilisation de solvants [56].
11.6. Méthode d'analyse des HE
11.6.1. Chromatographie sur Couche Mince (CCM) La CCM est une technique de chromatographie planaire. Elle est
couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d'analyse ou de
purification. La CCM repose principalement sur des phénomènes d'adsorption: la
phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long
d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille de matière
plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase
stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de
celle du solvant [57]. Après la migration, le repérage des molécules s'effectue soit
par ultra-violet (UV), soit par un révélateur spécifique ou encore par exposition aux
vapeurs d'iode. La distance de migration des composés est ensuite mesurée et
comparée à celle du front de la phase mobile, ceci permet de définir le rapport
frontal (Rf) caractéristique de chaque composé.
Rf = distance parcourue par un produit distance parcourue par le solvant
11.6.2. Chromatographie en Phase gazeuse (CPG) La CPG est la technique la mieux adaptée à l'analyse des HE. C'est une
technique de séparation limitée aux composés thermostables et suffisamment
volatils. Elle permet à la fois une analyse qualitative et quantitative. C'est une
méthode basée sur la séparation de composés à l'état gazeux suivant leur
coefficient de partage entre une phase stationnaire liquide imprégnée sur un
support solide inerte (colonne de chromatographie) et parcouru par une phase
mobile gazeuse (le gaz vecteur) [58]. Le mélange de constituants est introduit en tête de colonne où il est vaporisé
au niveau de l'injecteur. Les différents constituants sont élués à travers la colonne à une vitesse qui dépend de la vitesse linéaire du gaz vecteur, de leur solubilité dans
la phase stationnaire et de leur volatilité [59].Les substances séparées, toujours
sous forme gazeuse, quittent la colonne et traversent l'une après l'autre un
17
détecteur qui signale la proportion de chaque substance sur un enregistreur
intégrateur. L'enregistreur signale une succession de pics, caractérisés chacun par
un temps de rétention et une aire.
Les chromatographies sont généralement effectuées parallèlement sur deux
types de colonne, différents par la nature de leur phase stationnaire. Les colonnes
dites "polaires" sont caractérisées par des phases stationnaires de type
polyéthylèneglycol; Les colonnes dites "apolaires se distinguent par des phases de
type "méthylsilicone".
11.6.3. Couplage CPG-SM La technique de couplage CPG-MS est une technique d'analyse de référence
des HE. Elle permet de confirmer l'identification des composés préalablement
analysés par CPG car La mesure des temps de rétention ne constitue pas une
preuve formelle de la nature des composés. Le principe de cette méthode consiste
à transférer par le gaz vecteur (phase mobile) les composés séparés par
chromatographie en phase gazeuse dans le spectromètre de masse. A ce niveau,
ils vont être fragmentés en ions de masse variables dont la séparation sera en
fonction de leur masse. La comparaison informatique du spectre d'un pic inconnu
avec une ou plusieurs librairies de référence permet son identification à condition
que la similitude des spectres, inconnus et référence, soit suffisante et que les
indices de rétention soient identiques, dans des conditions opératoires
comparables [30,60]
11.6.4. Résonance Magnétique Nucléaire du 13C (RMN13C) Le principe de RMN consiste à observer dans le spectre du mélange les
raies de résonnance appartenant à un composé donné (dont on connaît la série de
déplacement chimique) et ce faisant de l'identifier. L'objectif est donc d'éviter, ou du
moins de réduire, les étapes longues et fastidieuses de purification des
constituants. L'originalité de cette méthode réside dans l'informatisation de la recherche,
grâce à un logiciel d'aide à l'identification développé au laboratoire de Chimie
Biomasse de l'Université de Corse. Celui-ci assure la comparaison des
déplacements chimiques de chacun des carbones du mélange avec ceux des
18
composés de références répertoriés dans des bibliothèques de spectres (Figure
5). L'enregistrement des spectres des composés de références et des mélanges
est réalisé dans des conditions expérimentales identiques (nature du solvant,
concentration, paramètres d'enregistrement des spectres) [61-64].
Afin d'identifier les constituants d'un mélange, il est indispensable de prendre
en compte trois paramètres directement accessibles par le logiciel:
- le nombre de pics observés par rapport au nombre de pics attendus pour
chaque molécule ;
- le nombre de superpositions pouvant se produire lorsque les différents
effets électroniques et/ou stériques font que deux carbones appartenant à deux
molécules différentes ont fortuitement le même déplacement chimique, ou lorsque
les molécules présentes ont une partie de leur squelette et de leur
fonctionnalisation très proche ;
- les variations des déplacements chimiques (66) des carbones dans le
spectre du mélange par rapport aux valeurs de référence.
SPECTRE DU 1\IÉLA:'liGE COMPLEXE BIBLIOTIIÈQUES DE SPECTRES
l ! , ... ' . '
170 80
----
-- ombre de carbones observés
ombre de superpositions
Variation des déplacements chimiques
IDE!'liTIFICATIO~
Figure 5 Bibliothèque de spectres
19
L'identification des composants individuels est basée sur :
i) la comparaison de leurs indices de rétention (Ir) de CPG sur colonnes
polaire et apolaire, déterminés par rapport aux temps de rétention d'une
série de n-alcanes avec interpolation linéaire, avec ceux des composés
de référence
ii) par la concordance spectrale avec les spectres de masses contenus
dans les bibliothèques du laboratoire et les bibliothèques de spectres
commerciales [65, 66]. iii) Sur la comparaison des signaux dans les spectres RMN 13c des HE avec
ceux des spectres de référence compilés dans la bibliothèque spectrale
de laboratoire avec l'aide d'un logiciel développé au laboratoire « Chimie
biomasse ».
Il. 7. Activités antioxydantes des HE Le stress oxydant est communément défini comme un déséquilibre entre les
systèmes oxydants et les capacités antioxydantes d'une cellule, d'un compartiment
cellulaire ou d'un organisme [67], il se produit dans la cellule quand la
concentration des espèces réactives excède les capacités antioxydantes de cette
cellule [68]. Ce stress oxydant est en relation avec l'apparition d'affections telles
que la maladie d'alzheimer [69], l'artériosclérose le vieillissement prématuré de la
peau [70] et le cancer [71]. Une façon de prévenir ce stress oxydatif qui
endommage et détruit les cellules est de rechercher, dans l'alimentation, un apport
supplémentaire de composés antioxydants (vitamine C, a-tocophérol, etc.) [72]. Un antioxydant, est toute molécule endogène ou exogène présente en faible
concentration qui est capable de prévenir, de retarder et de réduire l'ampleur de la
destruction oxydante des biomolécules. Ainsi, les récents et multiples travaux
portés sur les propriétés antioxydantes des HE ont révélés que celles-ci exercent
une excellente activité antioxydante dans les systèmes du DPPH• et de 11-
carotène/acide linoléique et que certaines HE tel que de Thymus vulgaris a un
pouvoir antioxydant élevé en comparaison à des antioxydants synthétiques [73].
D'autre part, l'activité antioxydante très élevée de certains constituants des HE est
non seulement en relation avec leur structure phénolique, mais également 20
attribuable à certains alcools, éthers, cétones et aldéhydes monoterpéniques: le
tinalool, le 1,8-cinéole, le géranial/néral, le citronellal, l'isomenthone, la menthone
et quelques monoterpènes: a-terpinène, y-terpinène et a-terpinolène [74].
21
Chapitre Il :
Matériel et méthodes
22
1. MATERIEL
1.1. Matériel végétal Le matériel végétal est constitué de tiges feuillues de Origanum syriacum.
Ces organes ont été récoltés le 30 juin 2016 à la Riviera M'Pouto (District
d'Abidjan) à 9 h environ. L'identification de ces plantes a été faite par comparaison
avec la description botanique des espèces de O. syriacum du Moyen-Orient
publiées [11-14) [27). Les tiges feuillues récoltées ont été divisées en 3 lots afin d'être utilisées sous forme de tiges feuillues fraîches et sèchées (Figure 6). Une
partie de la récolte a été séchée pendant 21 jours et l'autre 1 mois 14 jours à la
température ambiante dans une salle bien aérée.
1
Figure 6 : Tiges feuillues fraîches (A) et sèchées (8) de Origanum syriacum (photo prise par Kouamé Christelle, 2016)
1.2. Matériel technique Il est constitué d'appareils, de verreries et autres matériaux de laboratoire.
../ L'appareillage est composé de :
- un distillateur de type CLEVENGER
- un spectrophotomètre: WPA S 800 Diode Array
- un Chromatographe en Phase Gazeuse (CPG) Perkin-Elmer type
Clarus 500;
- un Chromatographe en Phase Gazeuse Perkin Elmer autosystem XL
associée à la Spectrométrie de Masse (CPG-SM) ;
- un spectromètre Bruker 400 AVANCE, 9.4 Tesla.
23
../ La verrerie et les autres materiels se composent de :
- des élévateurs ;
- des plaques chauffantes ;
- une balance de précision ;
- des pipettes pasteurs ;
- des micropipettes ;
- de pissettes ;
- des tubes à essais ;
- une éprouvette graduée ;
- des plaques CCM (gel de silice 60 F254 sur support en aluminium,
Merck);
- une lampe ultra-violette (254/366 nm (Min UVIS abnehmbar UV) ;
- des cuves en verre ;
- un portoir
- un séchoir électrique ;
1.3. Matériel chimique Le matériel chimique est constitué des produits suivants :
- acétone;
- éthanol à 96%;
- hexane;
- acétate d'éthyle;
- acide sulfurique;
-vanilline;
- acide ascorbique.
li.METHODES D'ETUDE
11.1. Extraction de l'HE Les HE ont été extraites par hydrodistillation dans un appareil de type
Clevenger (Figure 7) pendant 4 h. Une cocotte-minute de 10 L contenant 2 L d'eau
et du matériel végétal posé sur une grille est chauffé sur une plaque chauffante 24
jusqu'à ébullition du solvant. La vapeur d'eau entraîne les composants volatils vers
la colonne cylindrique et le réfrigérant où la phase gazeuse se condense. Le
mélange d'eau et d'HE obtenu est recueilli dans une burette en passant par
l'essencier. L'HE séparée de l'eau par décantation est prélevée à l'aide d'une
pipette Pasteur dans un tube et séchée sur du sulfate de sodium anhydre (NaSQ4).
Enfin, les HE sont récupérées dans des flacons de verre puis conservées au
réfrigérateur à 4 °C.
Les rendements en HE extraites sont calculés selon la formule suivante :
R(o/o) = massedel
1HE(g) X lOO
masseduvégétal (g)
Réfrigérant
Colonne cylindrique
en verre
Essencier
Cocotte-minute
Plaque chauffante Figure 7 : Montage d'hydrodistillation de type Clévenger
(photo prise par Goblé Landry, 2013)
11.2. Méthodes d'analyse des HE
11.2.1. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) Les HE sont déposées à l'aide d'un capillaire sous forme de points, distants
de 1 cm les uns des autres et de 0,8 cm des deux bords de la plaque
chromatographique et développées dans le système de solvants hexane/acétate
25
d'éthyle : 20/2 (v/v) dans une cuve de migration jusqu'à la ligne de front de
solvant, situé à 1 cm du bord supérieur de la plaque. Puis la plaque est retirée de
la cuve et séchée. Elle est visualisée au visible puis à l'UV (254 nm) avant d'être
pulvérisée par la vanilline sulfurique (solution de 0,5 g de vanilline et 1 ml d'acide
sulfurique dans 50 ml d'éthanol à 95%). Après pulvérisation, la plaque est séchée
et chauffée à 11 o'c pendant 5 min environ à l'aide d'un sèche-cheveux. Les
différentes colorations apparaissant sous forme de spots sont enregistrées et les
rapports frontaux (Rf) calculés. [75]
11.2.2. Dépistage de l'activité antioxydante des HE par CCM Après séchage, le chromatogramme préparé comme décrit ci-dessus est
pulvérisé avec une solution méthanolique de DPPH• à 1 % (m/v). En présence des
substances antioxydantes, le DPPH• est réduit et passe de la couleur violette à la
couleur jaune. Dans les chromatoplaques, les zones d'activité antiradicalaire
apparaissent en jaune-clair sur le fond violet au bout d'un temps optimal de 30 min
[76,77].
11.2.3. Evaluation de l'activité antioxydante des HE par spectrophotométrie L'activité antioxydante in vitro a été évaluée à l'aide d'un spectrophotomètre
par la mesure du pouvoir de piégeage du radical DPPH• (1, 1-Diphenyl-2-
picrylhydrazyle) selon la méthode décrite par Blois [78]. Le DPPH• est solubilisé dans l'éthanol absolu pour obtenir une solution de concentration 0,03 mg/ml.
Différentes gammes de concentrations de l'HE sont préparées dans l'éthanol
absolu (0,56 mg/ml, 0,28 mg/ml, 0, 14 mg/ml, 0,07 mg/ml, 0,035 mg/ml et
0,0175 mg/ml). Dans des tubes secs et stériles, sont introduits 2,5 ml d'extraits
préparés et 1 ml de solution éthanolique de DPPH•. Après une période
d'incubation de 30 min à la température du laboratoire et l'abri de la lumière,
l'absorbance est lue à 517 nm contre un blanc formé de 2,5 ml d'éthanol pur et 1
ml de solution de DPPH•. Le témoin positif de référence est la vitamine C préparé
dans les mêmes conditions que les extraits d'étude. Le pourcentage d'inhibition (1)
du radical DPPH· est calculé suivant la formule [79] :
26
l = (Ab - Ae) /Ab* 100 I : pourcentage d'inhibition (% );
Ab : absorbance du DPPH•;
Ae : absorbance de l'échantillon
Les concentrations efficaces à 50% (CE50) ont été déterminées avec le
logiciel Graph pad prism [80].
11.2.4. Analyse des HE par CPG L'analyse des HE extraites a été réalisée au moyen d'un chromatographe en
phase gazeuse (Perkin-Elmer type Clarus 500), équipé d'un injecteur diviseur, de
deux colonnes de silice apolaire et polaire de 50 x 0,22 mm de diamètre interne, de
0,25 µm d'épaisseur du film, garnies respectivement de polydiméthylsiloxane
(C2H50Si)n et de polyéthylène glycol, et de deux détecteurs à ionisation de flamme
(Figure 8). Les conditions opératoires sont les suivantes : le gaz vecteur est
l'hydrogène ; la pression en tête de colonne est de 20 psi ; la température de
l'injecteur et des détecteurs est de 250°C. La programmation de température est de
60° jusqu'à 220°C à raison de 2°C/min, avec un palier de 20 min à 220°C ;
l'injection à été faite par mode diviseur avec un rapport 1/60. La quantité
d'échantillon injectée est de 0,5 µI issue d'une solution contenant 50 µL de l'HE
dans 350 µL de CDCb. Les substances volatiles ont été identifiées grâce à la
comparaison de leurs indices de rétention (Ir) sur colonnes polaire et apolaire,
calculés à partir des temps de rétention des composes séparés et des n-alcanes
linéaires. [59]
27
Figure 8 : Chromatographe en phase gazeuse ( Perkin-Elmer type Clarus 500) (photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)
11.2.5. Analyse des HE par CPG-SM Les analyses ont été effectuées à l'aide d'un chromatographe Perkin Elmer
autosystem XL (Figure 9), doté d'un injecteur automatique et d'une colonne
apolaire (Rtx-1) (diamètre interne : 60 m x 0,22 mm; épaisseur du film : 0,25 µm),
couplé à un détecteur de masse Perkin Elmer Turbo Mass. Le gaz vecteur est
l'hydrogène (1 ml) et il exerce une pression en tête de colonne de 25 psi. La
température de l'injecteur est de 250°C et celle du détecteur 280°C. La
programmation de la température est de 60°suivie d'une augmentation jusqu'à230
°C à raison de 2°C/min, avec un palier de 45 min à 230°C. L'injection se fait par
mode split avec un rapport de division de 1/50. La quantité d'échantillon injectée
est de 0,2 µI. Les spectres de masse sont obtenus au moyen d'un détecteur à filtre
quadripolaire et l'ionisation est faite par impact électronique par un faisceau
électronique de 70 eV.
28
Figure 9 : chromatographe Perkin Elmer autosystem XL (photo prise par Ouattara A. Zana, 2016)
11.2.6. Analyse des HE par RMN Les spectres de RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker 400
AVANCE, 9,4 Tesla, opérant à 400, 132 MHz pour le 1 H et à 100,623 MHz pour le 13C (Figure 10). Les spectres ont été enregistrés avec une sonde de 5 mm. Le
solvant est le CDCb additionné de tétraméthylsilane (TMS). Les déplacements
chimiques sont donnés en ppm (o) par rapport au TMS pris comme référence
interne.
Les spectres du 13C ont été enregistrés avec les paramètres suivants : angle
d'impulsion 45°; temps d'acquisition = 2,7 s correspondant à une acquisition de 128
K avec une largeur spectrale (SW) de 24000 Hz (environ 240 ppm) ; délai de
relaxation 01 = 0, 1 s ; résolution digitale de 0, 183 Hz/pt. Pour l'enregistrement des
spectres, une masse de 40 mg d'huile essentielle et de 8 mg de fraction de
chromatographie est dissoute dans 0,5 ml de CDCb. Le nombre d'accumulation
est de 3000 pour chaque enregistrement. Les données du signal (FID) sont
multipliées avant la transformée de Fourrier par une fonction exponentielle (LB =
1,0 Hz).
29
Figure 10 : chromatographe Perkin Elmer autosystem XL(photo prise par Ouattara A.Zana,2016)
30
Chapitre 111 :
Résultats et discussion
31
1. Rendements en HE
L'huile essentielle de Origanum syriacum est un liquide très fluide, jaune
pâle, possédant une odeur forte.
Les rendements en HE extraites à partir des tiges feuillues de Origanum
syriacum sont représentés dans la figure 11
rendements 3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00 TFF TFS/21j TFS/lm 14j
• rendements
Figure 11 : rendement des HE extraites à partir des tiges feuillues fraîches
(TFF); séchées 21 jours (TFS/21j) et 1 mois 14 jours (TFS/lm 14j)
Au regard des histogrammes, nous constatons que le rendement en HE des
tiges feuillues fraîches (0,49%) est moins élevé que ceux des tiges feuillues
séchées pendant 21 jours (2,24%) et 1 mois 14 jours (2,73%). La durée de
séchage a été choisie de façon aléatoire. Toutefois, les rendements obtenus sont
en accord avec ceux publiés par plusieurs chercheurs sur les espèces
méditerranéennes. En effet, des feuilles fraîches récoltées à Amman et au Liban
ont fourni les HE avec les rendements respectivement de 0,85% [81] et de 0,5%
[82]. En ce qui concerne les rendements en HE des feuilles séchées, nous
constatons qu'ils sont comparables à ceux rapportés dans la littérature sur l'espèce
cultivée dans le sud de la Turquie (2,8%) [83].
32
2. Différents profils chromatographiques CCM
Les résultats de la détection des constituants des HE au moyen de la CCM
sont présentés dans la figure 12 et consignés dans le tableau 1. 1 mw1..,,&wJ<J,twh 0
Rf=0,95
Rf=0,78
Rf=0,65
Rf=0,62
Rf=0,35
Rf=0,11
Fl F2 F3 F4 FS F6 Fl F2 F3 F4 FS F6
Figure 12 : Profils chromatographiques d'HE des tiges feuillues d'Origanium
svrianum révélées à l'UV/254 nm (A) et à la vanilline sulfuriaue dans le visible (8)
Développant: hexane/acétate d'éthyle 20/2 (v/v)
1 En général, les constituants chimiques des HE appartiennent à la famille des
terpènes, dont les structures chimiques renferment des systèmes conjugués à au
moins 4 doubles liaisons, apparaissent à l'UV/254 nm sous forme de zones
sombres sur fond fluorescent vert clair dans la chromatoplaque [83). De ce point de vue, les HE de Origanum syriacum renferment des constituants terpéniques, car
leur profil chromatographique après la visualisation à l'UV/254 nm a montré environ
5 spots sombres (Figure 12A). En outre, la vanilline sulfurique étant un révélateur
des constituants des HE, a été employée pour les identifier dans nos échantillons.
En effet, la vanilline sulfurique les révèle en bleu, vert, rouge et marron, selon ce
qui est rapporté dans la littérature [84).
33
Tableau 1 : Résultats de la détection des HE extraites par CCM
Rf Couleur Composés
possibles
0,11 0 Bleu 0,35 Bleu 0,62 Rougeâtre 0,65 Bleu 0,72 Bleu 0;78 Violet
0,95 Marron
Terpène ---- Terpène Terpène Terpène Terpène Terpène ND
Développant : hexane/acétate d'éthyle 20/2 (v/v) ; Révélateur : vanilline sulfurique
Vu les résultats obtenus, nous pouvons dire que la composition chimique de
tous les échantillons analysés est semblable. Les échantillons ont des profils
chromatographiques similaires. Précisément, la composition chimique des HE des
TFF et séchées TFS de Origanum syriacum présente une similarité à la fois en
nombre de spots et de colorations bleue et violette rougeâtre et marron. Ces spots
bleus (Rf=O, 11; 0,35; 0,65; 0,72) et violet (Rf=0,78) sont des terpènes. Aussi, les
profils chromatographiques ne présentent-ils pas de variation en fonction du temps
de distillation. En somme, nous concluons que l'obtention des HE à partir du
matériel sec est plus intéressante vu que le rendement en HE dans ce cas est trois
fois plus élevé que dans le cas des TFF (Figure 11 ).
3. Illustration de la méthode d'analyse par RMN 13C, CPG{lr) et CPG-SM : HE
des TFF de Origanum syricum
La combinaison des méthodes d'analyses CPG (Ir), CPG-SM et RMN 13C
appliquée à l'HE de TFF de Origanum syriacum a permis d'identifier 30 composés
représentant 99,4% de la composition totale (Tableau Il). Cette HE est caractérisée
par une très forte proportion de monoterpènes (Figure13) parmi lesquels, le
carvacrol 28 (67,8%) (Figure13) est le composé majoritaire. A côté de ce
composé, le y-terpinène 18 (13,0%) (Figure13) est présent avec une teneur
appréciable tandis que le p-cymène 13 est identifié avec une proportion non
négligeable (4,3%) (Figure13). Les autres composés sont présents à des teneurs
34
inférieures à 2,3% (myrcène 9). Parmi ceux-ci, le ~-bisabolène 30 (1, 1 %) et le ~
caryophyllène 29 (0,3%) sont les seuls sesquiterpènes.
Tableau Il : Composition chimique de l'HE des tiges feuillues fraîches
No Composés Ira lrp TFF Mode d'identification
1 a-thujène 925 1015 1,8 Ir, SM, RMN 13C
2 a-pinéne 933 1013 0,7 Ir, SM, RMN 13C
3 camphène 946 1062 0, 1 Ir, SM
4 oct-1-èn-3-ol 963 1444 0,6 Ir, SM, RMN 13C
5 octan-3-one 966 1252 0, 1 Ir, SM
6 sabinène 967 1120 0,2 Ir, SM
7 p-pinène 973 1109 0,2 Ir, SM
8 octan-3-ol 981 1388 0,6 Ir, SM, RMN 13C
9 myrcène 983 1158 2,4 Ir, SM, RMN 13C
10 a-phellandrène 999 1162 0,3 Ir, SM
11 l1-3-carène 1007 1145 0, 1 Ir, SM
12 a-terpinène 1011 1177 2,2 Ir, SM, RMN 13C
13 p-cymène 1014 1268 4,3 Ir, SM, RMN 13C
14 limonène 1023 1198 0,3 Ir, SM
15 P-phelland rene 1023 1208 0,3 Ir, SM
16 (Z)-P-ocimène 1027 1229 0,1 Ir, SM
17 (E)- P-ocimène 1038 1246 0, 1 Ir, SM
18 y-terpinène 1051 1242 13,0 Ir, SM, RMN 13C
19 trans-hydrate de sabinene 1055 1460 0,3 Ir, SM
20 terpinolene 1080 1279 0, 1 Ir, SM
21 linalol 1085 1542 0,4 Ir, SM
22 bornéol 1151 1694 0,2 Ir, SM
23 terpinèn-4-ol 1163 1597 0,8 Ir, SM, RMN 13C
24 a-terpinéol 1174 1691 0,3 Ir, SM
25 carvone 1218 1730 0, 1 Ir, SM
26 carvacrol methyl oxide 1226 1588 0,2 Ir, SM
27 thymol 1270 2175 0,3 Ir, SM
28 carvacrol 1283 2205 67,8 Ir, SM, RMN 13C
29 P-caryophyllène 1418 1588 0,4 Ir, SM
30 P-bisabolène 1501 1717 1,1 Ir, SM, RMN 13C
Monoterpènes hydrocarbonés 26,4
Monoterpènes oxygénés 71,5
Sesquiterpènes 1,5
Total: 99,4
L'ordre d'élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire, excepté pour les composés suivis d'un
astérisque (colonne polaire). Ira et lrp : indices de rétention mesurés respectivement sur colonne apolaire (BP-1) et
polaire (BP-20).
35
OH
carvacrol y-terpinène p-cimène
myrcène
a-terpinène
Figure 13 : Molécules majoritaires de l'HE des TFF de Origanum syricum
Dans les paragraphes suivants nous présentons l'interprétation des résultats
de RMN 13C sur l'exemple du carvacrol, étant le composé majoritaire dans l'HE
d'étude.
3.1. Identification par RMN 13C Les composés présents dans l'HE des TFF ont été identifiés par
comparaison des déplacements chimiques de leurs atomes de carbone avec ceux
des composés de référence présents dans une bibliothèque de spectres à l'aide
d'un logiciel (Figure 15). Les composés ainsi identifiés par RMN 13C sont repérés
dans le chromatogramme de la CPG par leurs indices de rétention (IR) afin d'être
quantifiés. A titre d'exemple, nous indiquons dans le spectre RMN 13C du mélange
tous les 10 siqnaux du carvacrol (Figure 14).
36
7
1 2
3~ -----1-0H
1 Il 4~ ---6
5
1 8
9 --- -----1 0
C9+C10
C3 C4CG
Cl""
~ es
C8
C2
C7
210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ·10 rl(ppm)
Figure 14: Spectre RMN 13C de l'échantillon TFF
Les signaux des 6 carbones sp2 du noyau benzénique apparaissent à 153,65
ppm (C1); 148,40 ppm (CS); 130,83 ppm (C3); 121,00 ppm (C2); 118,72 ppm (C4) et 113,05 ppm (C6). Les deux carbones méthyliques de la chaîne latérale
résonnent à 23,99 ppm (superposition d'où l'intensité élevée du signal) tandis que
le carbone méthynique (CS) se trouve à 33,68 ppm. Le déplacement chimique du
carbone du méthyle (C7) est repéré à 15,36 ppm. Les variations entre les valeurs
théoriques et celles obtenues expérimentalement sont inférieures ou égales à 0,09
ppm (Figure 15).
37
15,30 15,36
OH 153,60 153,65
118,81~ .!,1113,10 118,72 ~ 113,05
148,44 148,40
23,97./" .}.},O / ......._ 23,97 23,99 33,68 23,99
Figure 15: Signaux RMN 13C de référence et expérimentaux (en gras) du carvacrol
3.2. Identification par CPG(lr) et CPG/SM La figure 16 représente le chromatogramme de l'HE des TFF de Origanium
syriacum. Chaque pic dans ce chromatogramme représente un composé ou des
composés en cas de co-élution. Ces composés passent ensuite dans le détecteur
de masse et les spectres de masse (en mode impact électronique) ainsi enregistrés
sont comparés avec ceux des composés de référence contenus dans les
bibliothèques de spectres. L'identification des molécules proposées par la
spectrométrie de masse est confirmée par une bonne concordance entre les Ir
(apolaire et polaire) expérimentaux obtenus à partir de la CPG et ceux contenus
dans la banque de données. Les numéros des composés identifiés sur les pics
sont les mêmes que ceux du tableau Il. A titre d'exemple, nous présentons
l'identification du carvacrol 28.
38
28
18
Ir
Figure 16: Chromatogramme (sur colonne apolaire) de l'HE de TFF de Origanum syriacum
La structure du carvacrol a été proposée par la spectroscopie de masse
(Figure 17) et son identification a été confirmée par une bonne correspondance
entre les Ir expérimentaux (lra/lrp 1283/2205) et ceux présents dans la banque de
données (lra/lrp 1278/2219).
135
91
121 127 133
150
m 30 ~ 50 w (wileyregistry8e) PHENOL, 2-METHYL-6-(1-METHYLETHYL)-
90 100 110 120 130 140 150 iso m/z
Figure 17 : Spectre de masse en mode impact électronique du carvacrol
39
Les fragmentations principales du carvacrol en CPG-MS observées sont: m/z 150
[Mr+; m/z 135 [M-15] '\ m/z 107 [M-43] ·+; m/z 91 [M-43-16] ·+. L'obtention de ces
fragmentations a été possible à partir de la structure du carvacrol par la rupture des
liaisons présentée ci-dessous (Figure 18) :
HO
* HO
f m/z 135 [M-15r+ Perte du fragment méthyle.
* m/z 91 [M-43-16r+ perte de fragment OH et isopropyle
m/z 107 [M-43]'+ Elimination d'un fragment [C3H1]
m/z 77 [M-43-29]'+ perte des fragments [C3H1] ·+et [CHO]'+ avec ouverture du cycle
Figure 18 : différentes fragmentations de la molécule de caracrol
4. Effet du temps de séchage sur la composition chimique de l'HE de
Origanum syriacum
Les compositions chimiques des HE provenant de TFF, TFS 21j et TFS 1 m
14j de Origanum syriacum sont reportés dans le tableau Ill.
40
Tableau Ill: Composition chimique des HE de Origanum syriacum en fonction du temps de séchage
Composés Ira lrp TFF TFS 21 j TFS 1m 14j
1 a-thujène 925 1015 1,8 1,04 1,9
2 a-pinéne 933 1013 0,7 0,6 0,9
3 camphène 946 1062 0,1 0,1 0,1
4 oct-1-en-3-ol 963 1444 0,6 0,7 0,9
5 octan-3-one 966 1252 0,1 0,1 0,1
6 sabinène 967 1120 0,2 0, 1 0,1
7 p-pinène 973 1109 0,2 0,2 0,2
8 octan-3-ol 981 1388 0,6 0,6 0,8
9 myrcène 983 1158 2,4 2,2 2,9
10 a-phellandrène 999 1162 0,3 0,3 0,4
11 li-3-carèn~ 1007 1145 0, 1 0,1 0,1
12 a-terpinène 1011 1177 2,2 2,1 2,8
13 p-cymène 1014 1268 4,3 4,8 6,8
14 P-phellandrène* 1023 1208 0,3 0,2 0,3
15 limonène* 1023 1198 0,3 0,2 0,3
16 (Z)-P-ocimène 1027 1229 0,1 0, 1 0,1
17 (E)- P-ocimène 1038 1246 0, 1 0, 1 0,1
18 y-terpinène 1051 1242 13,0 11,3 14,5
19 trans-hydrate de sabinène 1055 1460 0,3 0,8 1,1
20 Terpinolène 1080 1279 0, 1 0,1 0,1
21 cis-hydrate de sabinène 1084 1544 0,5
22 Linalol 1085 1542 0,4 0,4
23 bornéol 1151 1694 0,2 0,2 0,2
24 terpinèn-4-ol 1163 1597 0,8 0,4 0,6
25 a-terpinéol 1174 1691 0,3 0,2 0,2
26 Carvone 1218 1730 0, 1 0,1 0,1
27 carvacrol méthyloxyde 1226 1588 0,2 - 0,2
28 Thymol 1270 2175 0,3 0,4 0,3
29 Carvacrol 1283 2205 67,8 69,8 61,5
30 P-caryophyllène 1418 1588 0,4 0,5 0,3
31 P-bisabolène 1501 1717 1, 1 0,4 0,5
Monoterpènes hydrogénés 26,4 24,3 33,2
Monoterpènes oxygénés 71,5 72,9 64,9
Sesquiterpènes 1,5 0,9 0,8
Total: 99,4 98,1 98,9
L'ordre d'élution et les pourcentages sont donnés sur colonne apolaire, excepté pour les composés suivis d'un astérisque (colonne polaire). Ira et lrp: indices de rétention mesurés respectivement sur colonne apolaire (BP-1) et polaire (BP-20).
41
Durant la période de séchage, nous n'avons pas observé de variation notable
de la composition chimique au niveau qualitatif. Cependant, au niveau quantitatif
nous avons noté de légères variations au niveau des différentes classes de
composés : monoterpènes oxygénés (64,9%- 72,9%); sesquiterpènes (0,8%- 1,5%)
et monoterpènes hydrogénés (24,3%-33,2%). Le séchage à donc une influence
relativement faible sur la composition chimique de l'HE de Origanum syriacum.
Le tableau IV récapitule la comparaison des compositions chimiques des HE
de Origanum syriacum de Côte d'Ivoire et celles des autres régions du monde.
42
Tableau IV : Composition chimique des HE de Origanium syriacum récolté dans différents pays
Composés identifiés Jordanie [80] Turquie [83] Côte d'Ivoire
[81] Sauvage Cultivée TFF TFS 21 j TFS 1m14j [3] [13]
a-thujène 0,47 - 1,7 1,638 0,607 1,78 1,04 1,89
a-pinéne 0,38 1,22 1,6 0,871 0,317 0,67 0,63 0,87
camphéne 0,21 - o. 1 0,148 0,057 o. 11 0,10 0,13
oct-1-en-3-ol 0,36 - - 1,553 1,521 0,63 0,70 0,86
octan-3-one - - 1,3 - - 0,09 0,09 0,10
sabinène 0,35 - 0,3 - - 0,24 0,07 0,07
13-pinène 0,60 - 0,2 o. 112 0,087 0,18 0,17 0,22
octan-3-ol 0,33 - 0,3 3,139 2,368 0,56 0,62 0,79
myrcène - 1,38 1,9 3,918 2,164 2,37 2,18 2,89
1,8 - cineol 0,27 - - - - - - -
a-phellandrène - - - 0,732 0,034 0,27 0,28 0,38
li-3-carène 0,36 - 0,3 0,146 0,095 0,09 0,12 0,13
a-terpinène 0,37 2,94 2,5 5,327 2,140 2,24 2,12 2,85
p-cymène 30,22 15,69 8,7 10,17 5,53 4,32 4,83 6,79
13-phellandrene 0,35 - - 1,019 0,36 0,26 0,25 0,32
limonène - - 0,4 - - 0,27 0,19 0,33
(Z)-!3-ocimène - - - 0,373 - 0,05 0,06 0,06
(E)- 13-ocimène - - - - 0,112 0,13 o. 11 0,14
y-terpinène 4,27 27,79 12,6 15,67 9,039 13 11,31 14,50
trans-hydrate de sabinene - - 0,3 1,361 2,453 0,32 0,81 1,06
terpinolene 0,35 - 0,3 0,293 o. 181 0,12 0,10 o. 15 cis-hydrate de sabinène 3,22 - 0,2 - - - - 0,52
43
linalol 0,41 0,89 2,0 0,101 0,213 0,35 0,43 - P-thujone 0,38 - - - - - bornéol 0,31 - 0,3 0,085 0,206 0,15 0,18 0,15
terpinèn-4-ol 0,34 0,74 - 0,61 0,774 0,81 0,41 0,62
a-terpinéol - 0,01 0,7 - - 0,33 0,23 0,21
carvone 0,36 - 0,3 - - 0,10 o. 11 0,10
carvacrol méthyloxyde 0,23 4,57 0,9 0,092 0,055 0,18 - 0,21
thymol 0,43 2,12 24,7 43,28 2,93 0,32 0,38 0,32
carvacrol 44,10 26,97 17,6 4,26 58,88 67,76 69,81 61,47
P-caryophyllène 2,5 12,59 - 3,422 3,202 0,36 0,48 0,28
P-bisabolène 1501 - 1,5 - - 1, 11 0,43 0,47
a-humulène 0,43 - - 0,516 0,433 - - - bornylacétate 0,34 - - - - - - - camphor 0,77 - - - - - - - 2-lsopropyl-1-méthoxy-4-méthylbenzene - - 7,9 - - - - - a-copaène - - - - - - - - erémophilène - - 0,3 - - - - - cadinène - - 0,1 - - - - - a-cadinène - - 0,1 - - - - -
caryophyllène oxyde - - 0,2 - - - - -
spathulénol - - 0,3 0,179 0,353 - - - - - 0,1 0,073 0,124 - - -
Total: 96,78 98,21 90,6 99,14 98,03 98,82
44
1
Les HE de cette plante sont toujours dominées soit par le thymol soit par le
carvacrol accompagné parfois du p-cymène ou du y-terpinène. La composition à
dominance carvacrol de l'HE de la plante de Côte d'Ivoire est proche de celle de
Jordanie et du Liban. Les HE de ces deux pays présentent une composition
chimique relativement proche de celle de l'espèce acclimatée en Côte d'Ivoire au
niveau qualitatif mais pas au niveau quantitatif. Cela pourrait s'expliquer par la
différence des climats. En effet, dans le sud la Côte d'Ivoire où a été acclimaté
l'espèce Origanum syriacum que nous avons étudié, le climat est équatorial, donc
très humide avec une température relativement constante, entre 29 et 32°C. Ce
climat est très différent de celui de Jordanie et de celui du Liban où les plantations
de Origanum syriacum sont réalisées au printemps ou en début d'automne.
5. Evaluation de l'activité antioxydante des HE
5.1. Evaluation qualitative par CCM Le pouvoir réducteur et la capacité de piégeage des radicaux d'une
substance peuvent être un indicateur de son activité antioxydante. Le 2,2-diphényl-
1-picrylhydrazyle (DPPH•) est un radical libre stable qui accepte un radical
hydrogène pour devenir une molécule diamagnétique stable (Figure 19). Donc, le
potentiel réducteur des HE testées a été mis en évidence par un dépistage
préliminaire sur plaque CCM à l'aide du DPPH•, utilisé comme révélateur (Figure
20).
r- N02 J. ~N-N-0 + RH ~
02NVN02 donneur de H DPPH (Ox) violet
N02J:;;i _ R + ON·N-0
02N N02 DPPH-H (red) jaune
Figure 19 : Schéma réactionnel de la conversion du DPPH• (oxydant) en DPPH H (réducteur)
45
Rf=0,78
Rf=0,72
Rf=0,5
Rf=0,4
Fl F2 F3 F4 FS F6
Figure 20 : Chromatogramme des HE révélées au DPPH•
Développant : hexane/ acétate d'éthyle, 20:2 (v/v)
F1: TFF (3h); F2: TFF (4èmeh); F3: TFS 21J (3h); F4: TFS 1M 14J (30min); F5: TFS 1M 14J (3h);
F6: TFS 1M 14J (4ème h)
Les zones d'activités antiradicalaires apparaissent jaune-blanc sur fond
violet, témoin de la réduction du DPPH• par les constituants des HE testées. Au
regard des profils chromatographiques des HE (figure 15), nous pouvons dire que
tous les échantillons marquent une bonne propriété antiradicalaire probablement
due à la présence du composé révélé majoritaire en rouge par la vanilline
sulfurique, et des 3 autres composés de Rf=O, 78 ;Rf=O, 7 et Rf=0,5 (figure 15). Par
ailleurs, les HE des TFS (F3 et F4) contiennent une substance antioxydante
(Rf=0,4) de plus. Il est à révéler que sa séparation s'est fait dans les 30 premières
minutes d'extraction (F4). En effet, les HE de Origanum syriacum renferment des
composés antioxydants dont le potentiel peut être évalué quantitativement.
5.2. Evaluation quantitative par spectrophotométrie Les différents pourcentages d'inhibition du DPPH• par les HE des TFF et
TFS sont présentés dans la Figure 21. La capacité antioxydante des HE vis-à-vis du radical DPPH• est déterminée
par une diminution de l'absorbance induite par des substances antiradicalaires
présentes dans les échantillons de l'HE. Cette diminution se traduit par une chute
46
de l'absorbance du DPPH• dans un intervalle des concentrations de l'HE (Figure
21).
%1 • Fl:TFF (3h)
• F2:TFF {4ème h)
• F3:TFS 21J {3h)
• F4:TFS lM 14J (30min)
• F5: TFS lM 14J (3h)
• F6:TFS lM 14J (4ème h)
C aVITC
0,56 0,28 0,14 0,07 0,035 0,0175
Figure 21 : !'Inhibition du DPPH• en fonction de la concentration des HE et de la vitamine C
Ces résultats montrent qu'aux petites concentrations, les HE extraites ont
présenté une activité antioxydante relativement faible par rapport à la vitamine C.
Cependant, à 0, 14 mg/ml l'HE extraite à partir des TFF a manifesté une bonne
activité avec un pourcentage d'inhibition de 61,35% lequel s'accroît jusqu'à 81,25%
pour la concentration de 0,56 mg/ml. Par ailleurs, à cette concentration, tous les
échantillons des HE ont montré des pourcentages d'inhibition significatifs, par
exemple 89, 78% pour les TFS, ce qui est plus ou moins proche de celle de la
vitamine C (96,07%). Un pourcentage d'inhibition similaire (82, 1 %) de l'HE de
Origanum syriacum du Liban a été obtenu par des chercheurs libanais [81]. Pour une meilleure appréciation, il est préférable que l'activité antioxydante
soit exprimée en concentration efficace (CEso) laquelle est définie comme étant la
concentration d'un substrat qui cause la perte de 50% de l'activité de DPPH•. Donc,
la CEso traduit l'efficacité d'un extrait. Plus cette concentration est faible, plus
l'extrait est efficace. Les CEso des HE testées ont été déterminées graphiquement
(Figure 22) au moyen du logiciel Graph Pad prism.
47
. FI
150 • F2 . F3 = .g . F4 - 100 :s :ë • F5 = • ~- ::c ( • F6 "O i:.. ~ ,:.. 50 :Q • Vitamine C - = ~ u
0 ,.. = e _5J
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 ,:.. -log (concentration)
Figure 22 : Courbes de l'activité anti-oxydante des HE en fonction du pourcentage d'inhibition du DPPH• par rapport à la vitamine C
F1: TFF (3h); F2: TFF (4èmeh);F3: TFS 21J (3h); F4: TFS 1M 14J (30min); FS: TFS 1M 14J (3h); F6: TFS 1M 14J (4ème h)
Les résultats relatifs aux CEso sont présentés dans la Figure 23. Nous
constatons que les valeurs des CEso des HE sont plus élevées que celle de la
vitamine C (0,0194 mg/ml) ; ce qui traduit une efficacité relativement inférieur à
celle de la vitamine C. Cependant, les organes frais (F2) manifestent un effet
antioxydant (0,0776 mg/ml) plus important que les organes secs.
48
CESO
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0 Vit C Fl F2 F3
•VitC
• Fl
• F2
• F3
• F4
• FS
• F6 F4 FS F6
Figure 23 : CEso des HE et de la vitamine C
Toutefois, une activité antioxydante similaire à nos résultats a déjà été
rapportée dans la littérature. En effet, l'effet de piégeage du DPPH• par l'HE de
Origanum syriacum a été évaluée par des chercheurs Libanais, qui ont démontré
une activité significative (CEso de 1,7 µg / ml) par rapport à la vitamine C (CEso=
1,0 µg/ml) [81] de l'espèce libanaise.
49
CONCLUSION ET PERSPETIVES
Le principal but du présent travail a été l'étude de l'HE issue de Origanum
syriacum acclimatée en Côte d' Ivoire. A notre connaissance, aucune étude n'a
encore été réalisée sur l'HE de cette espèce. C'est pourquoi, nous nous sommes
intéressés à cette HE afin de connaître sa composition chimique et de la comparer
avec celle cultivée au Moyen-Orient rapportée dans la littérature. En vue d'étudier
cette composition chimique en fonction du temps de séchage, les tiges feuillues
fraîches et séchées de cette espèce ont été utilisées.
Ainsi, les HE ont été obtenues par l'hydrodistillation à l'aide d'un
hydrodistillateur de type Clévenger avec les rendements de 2,73 % pour les tiges
feuillues séchées et de 0,49 % pour les tiges feuillues fraîches. Ces valeurs sont
comparables à celles des HE extraites des espèces méditerranéennes.
L'analyse par CPG, CPG-MS et RMN 13C montrent que la composition
chimique de l'HE étudiée est similaire à celles déjà publiées par d'autres
chercheurs. Aussi, le séchage des feuilles n'influence que très faiblement cette
composition. Les composés majoritaires sont le carvacrol (61,5 - 61,8%) et le y
terpinène (11,3 -14,5%). Ces résultats indiquent que Origanum syriacum aclimatée
en Côte d'Ivoire appartient au chémotype carvacrol.
Le piégeage du radical DPPH• par l'HE aux petites concentrations a été
relativement plus faible que celui par la vitamine C. Néanmoins, à 0, 14 mg/ml l'HE
extraite à partir des tiges feuillues fraîches a manifesté une bonne activité avec un
pourcentage d'inhibition de 61,35%, lequel croit jusqu'à 81,25% à 0,56 mg/ml.
Cette activité peut être attribuée principalement à la forte teneur en carvacrol
(composé phénolique). Par conséquent, nous pouvons suggérer que cette HE peut
être utilisée comme un bon antioxydant.
En perspective, il serait intéressant de réaliser des tests biologiques sur l'HE
de Origanum syriacum afin de mettre en évidence les éventuelles propriétés
pharmacologiques mentionnées dans la littérature pour les espèces
méditerranéennes.
50
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59
Résumé
La présente étude s'inscrit dans le cadre de valorisation des HE de Origanum
syriacum, une plante aromatique du Moyen-Orient acclimatée en Côte d'Ivoire. Les
HE des tiges feuillues fraîches et séchées ont été obtenues par hydrodistillation à
l'aide d'un extracteur de type Clévenger. L'extraction a donné de différents
rendements en HE en fonction du temps de séchage. Les tiges feuillues sèchées
ont produit plus d'HE (0,49%) que les tiges feuillues fraîches (2,73%). La
composition chimique des HE a été analysée par CPG, CPG-SM et RMN 13C, qui
ont permis de montrer qu'elles contiennent 24,3-33,2% de monoterpènes
hydrogénés, 64,9-72,9% de monoterpènes oxygénés et 0,8-1,5% de
sesquiterpènes. Les composants principaux sont les suivants: carvacrol (61,5 -
69,8%), y-terpinène (11,3- 14,5%), p-cymène (4,3 - 6,8%) et myrcène (2,2 -2,9%).
Le test de réduction du radical 2,2-diphenyl -1-picrilhydrazyle a été employé
pour mesurer le pouvoir antioxydant des HE, en comparaison à la vitamine C prise
comme référence. En général, les HE extraites de Origanum syriacum ont signé
une activité antioxydante significative, mais relativement inférieure à la propriété
antioxydante de la vitamine C. L'HE de Origanum syriacum peut être considérée
comme un antioxydant naturel à fort potentiel.
Mots clés : Origanum syriacum, HE, Activité antioxydante, Composition chimique,
Carvacrol
60
Abstract
The present study is part of the valorization of the essential oils of Origanum
syriacum, an aromatic plant of the Middle East acclimatized in Côte d'Ivoire. The
essential oils of the fresh and dried leaf stems were obtained by hydrodistillation
using a Clevenger extractor. The extraction gave different yields of essential oil
according to the time of drying. Dry leafy stems produced more essential oil
(0.49%) than fresh leafy stems (2.73%). The chemical composition of the essential
oils was analyzed by GC, GC-MS and 13C-NMR, which showed that they contained
24.3-33.2% hydrogenated monoterpenes, 64.9-72.9% oxygenates monoterpenes
and 0.8-1 .4% sesquiterpenes. The main components are carvacrol (61.5 - 69.8%),
y-terpinene (11.3-14.5%), p-cymene (4.3-6.8%) and myrcene (2.18 -2.89%).
The reduction test of the 2,2-diphenyl-1-picrilhydrazyl radical was used to
measure the antioxidant power of essential oils, in comparison with the vitamin C
taken as reference. ln general, essential oils extracted from Origanum syriacum
have a significant antioxidant activity, but relatively less than the antioxidant
properties of vitamin C. The essential oil of Origanum syriacum can be considered
a natural antioxidant with high potential.
Key words: Origanum syriacum, HE, Antioxidant activity, Chemical composition, Carvacrol
61
;{?~ ~ @û, d ''Juoûze ~ - 1)~ - ?'tM<U!,
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l'iAl'iGUIABROGOUA
Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UF-.R-Si;A)
Laboratoire de Chimie Bio-Organique et.de Substances Naturelles (LCBOSN)
Année Académique 2015-2016
ATTESTATION DE CQ.RRECTIO.N
Je soussigné, Mr BEKRO Yves-Alain, Professeur Titulaire à l'Université Nangui
Abrogoua, Président du jury de soutenance de mémoire de MASTER de Mlle
KOUAME,-Akissi Christelle Euphrasie, atteste que l'impétrant a pris en compte
toutes tes observations faites dans le cadre de la correction de son mémoire.
En foi de quoi, je lul délivre la présente attestation pour servir et valoir ce que de
droit.
Fait à Abidjan le ~o'1/<-=t: