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GIOVANA VECHI
ESTUDOS QUMICOS E BIOLGICOS in vitro E in vivo DE
DIFERENTES PARTES DE Eugenia mattosii
Itaja (SC)
2018
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS
FARMACUTICAS
REA DE CONCENTRAO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTNCIAS SINTTICAS BIOATIVAS
GIOVANA VECHI
ESTUDOS QUMICOS E BIOLGICOS in vitro E in vivo DE
DIFERENTES PARTES DE Eugenia mattosii
Tese submetida Universidade do Vale do
Itaja como parte dos requisitos para a
obteno do grau de Doutor em Cincias
Farmacuticas.
Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Itaja (SC)
Maro, 2018
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Ficha Catalogrfica
V494e Vechi, Giovana, 1987-
Estudos qumicos e biolgicos in vitro e in vivo de diferentes partes de Eugenia mattosii [Manuscrito] / Giovana Vechi. - Itaja, SC. 2018.
194 f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig.
Bibliografias f. 173-194 (Cpia de computador (Printout(s)).
Tese submetida Universidade do Vale do Itaja como parte dos requisitos
para a obteno do grau de Doutor em Cincias Farmacuticas.
Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho.
1. Eugenia (Planta). 2. Plantas medicinais. 3. Farmacologia.
I. Universidade do Vale do Itaja. II. Ttulo.
CDU: 615.32
Bibliotecria Eugenia Berlim Buzzi CRB - 14/963
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Dedico essa conquista aos meus familiares, que nunca mediram esforos para que meus
sonhos se tornassem realidade.
Obrigada por estarem sempre presentes!
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AGRADECIMENTOS
Ao Professor Valdir Cechinel Filho, por me acompanhar nessa
trajetria como professor e amigo, e confiar em mim em todos os
momentos.
Aos meus pais Jane e Juca, por sempre me apoiarem e
incentivarem meus estudos, me deram amor e carinho e me ajudaram a
me tornar a pessoa que sou.
toda minha famlia e amigos pelo apoio, carinho e amor em
tantos momentos importantes.
Aos membros da banca, Prof. Dr. Rivaldo Niero, ProfaDr Priscila
de Souza, Prof. Dr. Caio Maurcio Mendes de Crdova e Profa Dr. Maria
de Lourdes Leite de Moraes.
Aos meus colegas do laboratrio, s minhas amigas Cechinets
(Adriana, Adrielli, Camila, Fabile e Lusa) e todas as amizades que esse
caminho me proporcionou.
Aos colaboradores e coordenao do Programa de Ps-
Graduao em Cincias Farmacuticas, Prof. Dr. Clvis Antonio
Rodrigues, Juliano dos Santos e Helenise Heyse Moreria.
todas as pessoas que enriqueceram este trabalho com sua
disponibilidade na realizao dos testes biolgicos in vivo e in vitro.
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os professores (Prof. Dr Srgio Faloni de Andrade, Lusa Motta
da Silva e Priscila de Souza), Ps-doutoranda Rita de Cssia M. V de
A. F da Silva, e aos alunos do laboratrio de farmacologia.
Ao prof. Dr. Luiz Carlos Klein Jr. e a Profa. Dra. Ftima de
Campos-Buzzi e seus respectivos alunos.
s instituies parceiras que auxiliaram nas avaliaes do
potencial antiproliferativo (Universidade de So Paulo USP),
antimicoplasmtico (Universidade Regional de Blumenau) e
antiparasitria (Universidad Mayor de San Andrs, La Paz, Bolvia)
Ao Prof. Thodoro Marcel Wagner, Pedro Pablo Perez Netto e
Prof. Rogrio Corra pela ajuda nas tcnicas de CLAE, RMN e CG/EM,
e ao prof. Dr. Franco Delle Monache (Roma/Itlia) pela inestimvel ajuda
na elucidao estrutural de algumas molculas.
s pessoas que me acompanharam e auxiliaram nos quatro
meses de doutora-sanduche no CIPRONA (San Jos Costa Rica), em
especial aos que acompanharam e auxiliaram meu trabalho, Lorena
Hernandez-Gmez, Alice L. Prez, Rosaura Romero, Victor Vsquez e
Godofredo Solano.
s agncias de fomento: CAPES, pela concesso da minha
bolsa e CNPq e FAPESC pelo auxlio financeiro ao laboratrio.
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Talvez no tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para
que o melhor fosse feito. No sou o que deveria ser, mas graas a
Deus, no sou o que era antes
(Marthin Luther King)
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ESTUDOS QUMICOS E BIOLGICOS in vitro E in vivo DE
DIFERENTES PARTES DE Eugenia mattosii Giovana Vechi
Maro/2018
Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
rea de Concentrao: Produtos naturais e substncias sintticas bioativas
Nmero de Pginas: 194
As plantas medicinais produzem compostos bioativos com grande potencial
farmacolgico e teraputico sendo amplamente utilizadas na medicina
tradicional para tratar diversas enfermidades. O gnero Eugenia apresenta
metablitos importantes associados diversas atividades biolgicas. Tendo em
vista os escassos dados na literatura sobre a Eugenia mattosii, conhecida como
cambu, o objetivo deste trabalho foi avaliar a sua composio qumica, variao
sazonal e potencial biolgico/farmacolgico. Folhas e caules passaram por
extrao e partio com solventes de diferentes polaridades, e as respectivas
fraes acetato de etila e clorofrmio passaram por processos cromatogrficos,
levando ao isolamento de seis substncias: pinostrobin, cryptostrobin, fitol, cido
urslico, avicularin e (-)-catequina. Os extratos, fraes e substncias isoladas
foram avaliadas em relao ao seu potencial biolgico in vivo (atividade
antinociceptiva, gastroprotetora e vasorelaxante) e in vitro (antiproliferativa,
anticolinestersica, antiparasitria e antimicoplasmtica). O pinostrobin e
algumas fraes de E. mattosii apresentaram promissora atividade
antimicoplasmtica. Ambos extratos brutos e as fraes apresentaram potencial
antinociceptivo, assim como as substncias isoladas, especialmente o avicularin.
A avaliao da atividade gastroprotetora no apresentou resultados promissores.
O extrato e a frao clorofrmio das folhas apresentam atividade antiproliferativa
significativa, sendo esta influenciada pela presena de pinostrobin e
cryptostrobin. Atividade anticolinestersica foi observada para ambos extratos e
fraes acetato de etila. Resultados significativos foram evidenciados para os
extratos, fraes das folhas, (-)-catequina e cryptostrobin com relao ao efeito
vasorelaxante em animais normotensos e espontaneamente hipertensos.
Atividade antiparasitria para leishmaniose foi demonstrada pela frao
clorofrmio e para giardase pelo pinostrobin. Concluindo, pode-se afirmar que
a planta avaliada tem grande potencial biolgico e mais estudos podem ser
realizados a fim de descobrir novas atividades para folhas e caules de E. Mattosii,
bem como a presena de outros princpios ativos produzidos em menores
propores.
Palavras-chave: Eugenia mattosii, fitoqumica, flavonoides, potencial
antimicoplasmtico, atividade antinociceptiva, gastroproteo, efeito
vasorelaxante, anticncer, ao antiparasitria, atividade anticolinestersica.
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CHEMICAL AND BIOLOGICAL in vitro AND in vivo STUDIES
OF DIFFERENT PARTS OF Eugenia mattosii
Giovana Vechi
March/2018
Advisor: Valdir Cechinel Filho, Doctor
Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive compounds
Number of Pages: 194
Medicinal plants produce bioactive compounds with good pharmacological and
therapeutic potential, and for this reason they are used in traditional medicine to
treat various diseases. The Eugenia genus presents important metabolites
associated with several biological activities. Considering the scarce data in the
literature on Eugenia mattosii, known as Cambui, the aim of this study was to
evaluate its chemical composition, seasonal variation and pharmacological
potential. Leaves and stems were extracted and partitioned with solvents of
different polarities, and the respective ethyl acetate and chloroform fractions
submitted to chromatographic processes, leading to the isolation of six
compounds: pinostrobin, cryptostrobin, phytol, ursolic acid, avicularin and (-)-
catechin. The extracts, fractions and isolated substances were evaluated for their
biological potential in vivo (antinociceptive, gastroprotective and vasorelaxant
activity) and in vitro (antiproliferative, anticholinesterase, antiparasitic and
antimycoplasmic). Pinostrobin and some fractions of E. mattosii showed
promising antimycoplasmic activity. Both extracts and fractions presented
antinociceptive potential, as did the isolated substance avicularin. The evaluation
of gastroprotective activity did not present promising results. The extract and
chloroform fraction of the leaves presented significant antiproliferative activity,
being influenced by the presence of pinostrobin and cryptostrobin.
Anticholinesterasic activity was observed for both extracts and ethyl acetate
fractions. Significant results were evidenced for the extracts, leaf fractions, (-)-
catechin and cryptostrobin in relation to its vasorrelaxant effect in normotensive
and spontaneously hypertensive animals. Antiparasitic activity for leishmaniosis
was demonstrated for the chloroform fraction and for giardiasis by pinostrobin.
In conclusion, it can be stated that the evaluated plant has good biological
potential, and further studies are needed to discover new activities for the leaves
and stems of E. Mattosii, as well as the presence of other active principles
produced in smaller proportions.
Keywords: E. mattosii, phytochemistry, flavonoids, antimycoplasmic potential,
antinociceptive activity, gastroprotection, vasorelaxant effect, anticancer,
antiparasitic action, antycholinesterasic activity.
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LISTA DE ABREVIATURAS
ABIFISA Associao brasileira de empresas do setor fitoterpico, suplemento
alimentar e de promoo da sade
ACh Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterase
AINE anti-inflamatrio no-esteroidal
AM Azul de metileno
ANVISA - Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
ATCC - American Type Culture Collection (Coleo de tipos de cultura
Americana)
BPI base peak intensity (intensidade do pico base)
CAT extrato de alcaloides padronizado de Galipea longiflora
CC coluna cromatogrfica
CCD cromatografia em camada delgada
CIM concentrao inibitria mnima
CG/EM cromatografia gasosa acoplada espectro de massas
cGMP - Guanosina monofosfato cclica
DA Doena de Alzheimer
DMEM - meio de cultura Dulbeccos modified Eagles
DMSO dimetilsulfxido
EARP software de anlise de imagens
EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid (cido etilenodiamino tetra-actico)
EMB extrato metanlico bruto
FAE frao acetato de etila
FCL frao clorofrmio
FE Fenilefrina
FURB Universidade Regional de Blumenau
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IASP International Association for the Study of pain (Associao Internacional
para o Estudo da Dor)
INCA Instituto nacional do Cncer
i.p. via intraperitoneal
L-NAME - N()-nitro-L-arginina metil ester
MTT Metil-tiazolil-tetrazlio
NIQFAR Ncleo de Investigaes Qumico-Farmacuticas
NRT Ratos wistar normotensos
OMS Organizao Mundial da Sade
PPGCF Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas
PBS Physiological buffered saline (Tampo salina fosfato)
PMS - Metossulfato de fenazina
PSS Physiological saline solution (Soluo salina fisiolgica)
RMN H ressonncia magntica nuclear de hidrognio
RMN C ressonncia magntica nuclear de carbono
RPMI - Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute
SBF Soro bovino fetal
SHR Ratos wistar espontaneamente hipertensos
SNC Sistema nervoso central
SUS Sistema nico de sade
TYI-S-33 Meio de cultura para Giardia
UPLC - Ultra performance liquid chromatography (Cromatografia lquida de alta
performance)
UV ultravioleta
v.o. Via oral
XTT Tetrazolium Salt (Sal de tetrazlio)
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SUMRIO
CAPTULO I ................................................................................................... 19
1 INTRODUO ............................................................................................. 21
2 OBJETIVOS .................................................................................................. 23
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 23
2.2 Objetivos Especficos .................................................................................. 23
CAPTULO II ................................................................................................. 25
1 PLANTA MEDICINAIS E FITOTERAPIA ............................................................... 27
1.1 Aspectos gerais ........................................................................................... 27
1.2 Mercado ...................................................................................................... 30
2 ASPECTOS RELACIONADOS PLANTA EUGENIA MATTOSII ................................ 33
2.1 A famlia Myrtaceae ................................................................................... 33
2.2 O gnero Eugenia ....................................................................................... 33
2.3 A espcie Eugenia mattosii ......................................................................... 39
3 POTENCIAL BIOLGICO DE PLANTAS MEDICINAIS ............................................ 41
3.1 Ativiadade antibaceriana ............................................................................ 41
3.2 Atividade gastroprotetora ........................................................................... 43
3.3 Atividade antinociceptiva ........................................................................... 45
3.4 Atividade antiproliferativa .......................................................................... 48
3.5 Atividade anticolinestersica ...................................................................... 50
3.6 Atividade hipotensiva .................................................................................. 52
3.7 Atividade antiparasitria ............................................................................ 54
CAPTULO III ............................................................................................... 57
1 ANLISE FITOQUMICA .................................................................................... 59
2 IDENTIFICAO E QUANTIFICAO DE SUBSTNCIAS ISOLADAS POR UPLC-
PDA/ESI -QTOF ................................................................................................... 69
CAPTULO IV ................................................................................................ 71
COMPOSIO QUMICA E ATIVIDADE ANTIMICOPLASMTICA DE
EXTRATOS, FRAES E SUBSTNCIAS ISOLADAS DAS FOLHAS E
CAULES DE Eugenia mattosii ............................................................................
CAPTULO V ................................................................................................. 85
AVALIAO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E
GASTROPROTETORA DE EXTRATOS, FRAES E SUBSTNCIAS
ISOLADAS DAS FOLHAS E CAULES DE Eugenia mattosii ..
-
CAPTULO VI ............................................................................................. 101
ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA in vitro DO EXTRATO
METANLICO, FRAES E COMPOSTOS ISOLADOS DAS FOLHAS DE
Eugenia mattosii ..................................................................................................
CAPTULO VII ............................................................................................ 113
ATIVIDADE ANTICOLINESTERSICA DO EXTRATO METANLICO,
FRAES E SUBSTNCIAS ISOLADAS DAS FOLHAS E CAULES DE
Eugenia mattosii ...................................................................................................
CAPTULO VIII .......................................................................................... 133
EFEITO VASORELAXANTE DOS EXTRATOS, FRAES E COMPOSTOS
ISOLADOS DAS FOLHAS E CAULES DE Eugenia mattosii...........................
CAPTULO IV ............................................................................................. 159
ATIVIDADE ANTIPARASITRIA in vitro DE EXTRATO, FRAES E
COMPOSTOS ISOLADOS DAS FOLHAS DE Eugenia mattosii.......................
CAPTULO X ................................................................................................169
CONSIDERAES FINAIS ....................................................................... ..169
REFERNCIAS ........................................................................................... ..173
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19
CAPTULO I
Introduo e Objetivos
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20
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21
1 INTRODUO
O tratamento de enfermidades com o uso de plantas medicinais to
antigo quanto a prpria humanidade e as evidncias desta utilizao vo desde
documentos escritos at monumentos muito bem preservados. Este uso o
resultado de anos de luta contra diferentes doenas, onde o homem aprendeu a
buscar medicamentos em cascas, sementes, razes, frutos, folhas e flores de
diferentes plantas (ALVES; PONTES, 2017; PETROVSKA, 2012).
Alguns exemplos desta utilizao so o pio (Papaver somnniferum)
e a maconha (Cannabis sativa), utilizados h mais de 4.000 anos. O estudo dos
constituintes das plantas, no entanto, se iniciou apenas no sculo 19, quando
vrias substncias importantes comearam a ser isoladas e estudadas, incluindo
a morfina, codena, cafena, atropina, salicina, entre outros (CECHINEL FILHO;
YUNES, 2016).
Segundo Newman e Cragg (2016), a maior parte dos medicamentos
disponveis no mercado farmacutico atualmente foram desenvolvidos a partir
de produtos naturais. O percentual de medicamentos naturais ou derivados de
produtos naturais muito significativo, sendo que nas reas de agentes
neoplsicos e antimicrobianos, o percentual de 75% e 73%, respectivamente.
A qumica medicinal moderna vem identificando e validando a ao
de diversas plantas utilizadas em tratamentos tradicionais por meio da pesquisa
fitoqumica e farmacolgica, e inmeros medicamentos derivados de produtos
naturais j so utilizados na medicina convencional (CECHINEL FILHO;
YUNES, 2016; PETROVSKA, 2012).
O desenvolvimento destes medicamentos pode se dar por meio de
extratos, fraes, substncias isoladas, modificaes estruturais feitas a partir de
sua estrutura qumica ou tambm por sntese de anlogos. Os avanos da cincia
nesta rea so grandes, porm o alto custo com as pesquisas um fator limitante.
Por esta razo ainda existem muitas espcies que so utilizadas popularmente
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22
sem respaldo cientfico quanto sua eficcia e segurana (NEWMAN; CRAGG,
2012).
O Brasil o pas detentor da maior biodiversidade vegetal do planeta,
alm de possuir um vasto conhecimento popular em relao ao uso de plantas
medicinais e ter tradio em pesquisa fitoqumica, rea em que os cientistas
brasileiros vem publicando muitos artigos. Por outro lado, falta apoio e interesse
de indstrias farmacuticas brasileiras em obter parcerias com universidades e
avanar nos estudos para o desenvolvimento de novos medicamentos de origem
vegetal (DUTRA et al., 2016; CECHINEL FILHO, 2017).
A famlia Myrtaceae uma das mais importantes da biodiversidade
brasileira, pois abriga grande variedade de plantas medicinais com importantes
metablitos secundrios, como terpenos, flavonoides e taninos. O gnero
Eugenia um dos mais importantes desta famlia e conta com espcies de alto
potencial farmacolgico, como a E. uniflora, E. dysenterica, E. jambolana, E.
brasiliensis, E. umbelliflora e E. fruticosa. Muitas destas espcies apresentam
propriedades biolgicas, tais como: atividade antioxidante, diurtica,
antimicrobiana, gastroprotetora, antiproliferativa, antinociceptiva, anti-
inflamatria, anti-hipertensiva, antidiarreica, antidepressiva e hipoglicemiante
(BAG et al., 2012; BASTING et al, 2014; MAGINA, 2008; PRADO et al., 2014;
SHAMS-UD-DOHA et al, 2012, TENFEN et al., 2017, CHAREPALLI et al.,
2016, MEYRE-SILVA et al., 2009).
Tendo em vista o potencial fitoquimico e farmacolgico do gnero
Eugenia, surge a hiptese de encontrar novas substncias bioativas na espcie
Eugenia mattosii, uma planta comum da regio sul do Brasil, popularmente
conhecida como cambu ou pitanguinha de mattos e que ainda no foi avaliada
quanto ao seu potencial biolgico (LEGRAND, 1969; SOBRAL et al., 2009).
Desta forma, o objetivo dopresente trabalho foi avaliar a composio
qumica e o potencial farmacolgico de diferentes partes de Eugenia mattossii.
-
23
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Isolar e identificar princpios ativos de diferentes partes de Eugenia
mattosii, verificar a variao sazonal dos seus metablitos secundrios e avaliar
o seu potencial biolgico.
2.2 Objetivos Especficos
- Preparar extratos e fraes das diferentes partes de Eugenia mattosii
(caules e folhas) e avaliar em diferentes modelos experimentais in vivo e in vitro.
- Selecionar as fraes mais ativas para isolamento de princpios ativos
via mtodos de cromatografia convencionais (colunas cromatogrficas,
cromatografia em camada delgada);
- Identificar os princpios ativos obtidos por tcnicas espectroscpicas
usuais (CG/EM e RMN);
- Realizar estudos de controle de qualidade considerando a variao
sazonal dos extratos por UPLC-PDA/ESI+ - QTOF;
- Avaliar a atividade biolgica das substncias obtidas em diferentes
modelos experimentais in vitro como: atividade antiproliferativa, atividade
antibacteriana, antiparasitria e anticolinestersica;
- Avaliar a atividade biolgica das substncias obtidas em diferentes
modelos experimentais in vivo como: atividade antinociceptiva, efeito
gastroprotetor e efeito vasorrelaxante;
- Comparar o efeito biolgico dos princpios ativos obtidos com
medicamentos usados na clnica.
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24
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25
CAPTULO II
Reviso Bibliogrfica
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1 PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERAPIA
1.1 ASPECTOS GERAIS
As plantas medicinais vm sendo utilizadas como agentes teraputicos
em muitas culturas desde a antiguidade. Evidncias histricas e arqueolgicas
demostram a utilizao de produtos naturais na medicina tradicional de diversas
civilizaes antigas como: China, ndia, Egito e Grcia. Os relatos mais
consistentes so da medicina tradicional chinesa e da medicina ayurvdica, que
at os dias atuais guiam muitas pesquisas cientficas (ALVES; PONTES, 2017;
BRUSOTTI et al., 2014).
Segundo a OMS, cerca de 65-80% da populao mundial utiliza plantas
medicinais como primeiro recurso teraputico no tratamento de doenas. Essa
utilizao se d principalmente porque as plantas apresentam efeitos benficos
para o tratamento de diversas doenas e na maior parte das vezes possuem poucos
efeitos colaterais e baixo custo (MAZZARI; PRIETO, 2014; RAHMAN;
SINGHAL, 2002). No Brasil, a realidade semelhante, uma vez que 66% dos
brasileiros no tem acesso aos medicamentos tradicionais (TROJAN-
RODRIGUES et al., 2012).
No Brasil, o uso de plantas medicinais iniciou-se na poca dos ndios, e
logo em seguida houve a insero dos conhecimentos dos negros e europeus
(principalmente portugueses) na medicina popular brasileira. A fitoterapia se
fazia muito importante naquela poca porque nas reas rurais do pas, os mdicos
eram escassos. O conhecimento tradicional dessas culturas ainda hoje de grande
importncia para a etnofarmacologia, guiando os primeiros passos de muitas
pesquisas na rea das plantas medicinais (ALVES, 2013; NEWMANN;
CRAGG, 2012).
As plantas possuem uma vasta diversidade de molculas qumicas, uma
vez que produzem metablitos secundrios importantes para sua prpria
-
28
sobrevivncia. Estes metablitos possuem uma infinita diversidade de estruturas
qumicas e so os responsveis por grande parte das atividades biolgicas
descobertas e j descritas para as plantas medicinais. Estima-se que j foram
identificados aproximadamente 120 mil compostos naturais provenientes de
plantas de todo o mundo (CECHINEL FILHO; YUNES, 2016).
As plantas so capazes de desenvolver estratgias de proteo contra
diferentes fatores estressantes. Como mecanismos de defesa, desenvolvem
barreiras fsicas (produzem espinhos e pelos glandulares, por exemplo), e
barreiras qumicas, como os metabolitos secundrios. Estes compostos atuam na
defesa contra predadores e agentes patognicos, inibindo o crescimento e
desenvolvimento de insetos, aumentando a atrao de polinizadores, resistncia
a vrus, proteo contra a radiao e como agentes antioxidantes. Os metablitos
secundrios variam qualitativamente e quantitativamente entre diferentes pocas
do ano (MASA et al., 2016).
Estes compostos qumicos servem para o desenvolvimento de
medicamentos, pois assim como atuam na defesa das plantas, podem atuar na
defesa dos seres vivos. Atualmente 44% dos medicamentos disponveis no
mercado so provenientes de produtos naturais ou derivados dos mesmos, e este
nmero tende a crescer ainda mais. A cincia tm ajudado a comprovar a eficcia
do uso tradicional de muitas plantas e estruturado sua utilizao de forma segura
para a populao. Atenta a este fato, a indstria farmacutica mundial vem
percebendo essa demanda e inserindo no mercado novos medicamentos
derivados de produtos naturais (NEWMANN; CRAGG, 2016; CRAGG;
NEWMANN, 2013).
Na busca por novos fitoterpicos, a pesquisa etnofarmacolgica uma
pea fundamental, que visa conhecer o uso tradicional das plantas para guiar a
anlise fitoqumica e biolgica inicial. Seguindo esta primeira etapa, a anlise
fitoqumica busca conhecer os constituintes qumicos da espcie e isolar as
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29
substncias presentes para o segundo passo, que a pesquisa farmacolgica.
Nesta etapa testam-se extratos, fraes e substncias puras em diferentes
modelos experimentais, com a utilizao de animais e/ou testes in vitro
(BRUSOTTI, 2014; MALHEIROS et al., 2010; CECHINEL FILHO, 2017).
Durante a pesquisa preciso tambm levar em considerao as
variaes temporais e espaciais do contedo total de metablitos secundrios
produzidos pelas plantas nas diferentes horas do dia, pocas do ano ou nveis de
maturao. Apesar de serem as mesmas geneticamente, a expresso gnica pode
sofrer modificaes resultantes da interao de processos bioqumicos,
fisiolgicos, ecolgicos e evolutivos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Alguns pases ao redor do mundo so classificados como
megabiodiversos, por apresentarem uma vasta diversidade de biomas e
consequentemente grandes possibilidades na busca por novos compostos
bioativos. O Brasil est na lista dos 15 pases com maior biodiversidade do
mundo, e esta lista tambm inclui: China, ndia, Costa Rica, Indonsia, Congo,
Equador, Madagascar, Panam, Peru, Colmbia, Equador, Malsia, Mxico e
Austrlia (ALVES; PONTES, 2017).
Vale ressaltar que das cerca de 250.000 espcies existentes no mundo,
apenas 5-15% j foram estudadas, e mesmo assim no em sua plenitude. Esse
nmero mostra a infinidade de metablitos secundrios e estruturas qumicas que
podem ajudar na descoberta de novos compostos com poucos ou nenhum efeito
colateral para o tratamento de muitas doenas que hoje em dia so denominadas
focos de estudo: cncer, doenas cardiovasculares, doenas do sistema nervoso
central, doenas anti-inflamatrias e infecciosas (WAGNER, 2016, JTTE et al.,
2017).
Dentre os biomas brasileiros a mata atlntica vem se destacando por ser
considerada um dos hotspots da biodiversidade mundial. Ela apresenta grande
riqueza de espcies vegetais, apesar de toda a devastao sofrida ao longo dos
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30
anos por parte da humanidade (BOLZANI; FLAUSINO-JUNIOR; VALLI,
2016). Dentro deste bioma, a famlia Myrtaceae uma importante representante
de espcies com caractersticas qumicas promissoras e potencial biolgico j
comprovados. Esta famlia abriga o gnero Eugenia, objeto de estudo da presente
pesquisa.
1.2 MERCADO DOS FITOTERPICOS
Os medicamentos fitoterpicos representam uma poro significativa do
mercado mundial de medicamentos, com crescimento nas vendas de 15% ao ano
contra 4% do setor de frmacos sintticos (RODRIGUES, 2016). No Brasil, esse
mercado comeou a se expandir recentemente e movimenta cerca de 500 milhes
de dlares por ano, segundo estimativas da Associao Brasileira da Indstria de
Fitoterpicos (ABIFISA) (ABIFISA, 2017).
O mercado mundial de medicamentos fitoterpicos movimenta mais
dinheiro em pases desenvolvidos, principalmente os da Europa (50% somente
na Alemanha), fato interessante, pois estes pases detm pouca biodiversidade.
Em contrapartida, a Amrica Latina, com sete pases considerados
megabiodiversos (Brasil, Colmbia, Costa Rica, Equador, Mxico, Panam e
Peru) representam apenas 5% desse mercado (ALVES, 2013).
Alm da questo financeira, os pases desenvolvidos tambm
pesquisam mais na rea de fitoterpicos. Um estudo recente demonstra a forte
ligao entre publicaes na rea de produtos naturais com o ndice de
Desenvlvimento Humano (IDH). Dentre os pases com maior ndice, se destacam
tambm queles que mais publicam nesta rea, e so justamente os pases menos
megabiodiversos (pases europeus e da amrica do norte), com mais de 50% das
publicaes. Dentre os que possuem megabiodiversidade, o Brasil o terceiro
que mais publica artigos relacionados produtos naturais, depois de China e
ndia (ALVES; PONTES, 2017).
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31
No Brasil, dos mais de 10.000 artigos sobre plantas medicinais
publicados por cientistas brasileiros entre 2011 e 2013 e da grande
biodiversidade brasileira (o pas detm 20-22% do total de espcies de plantas
medicinais existentes no mundo), apenas um medicamento fitoterpico
legitimamente brasileiro encontrado atualmente como um dos 20 fitoterpicos
mais vendidos nas farmcias brasileiras, o Acheflan, antiinflamatrio de uso
tpico (DUTRA et al., 2016).
Alm disto, o mercado brasileiro de fitoterpicos movimenta cerca de
261 milhes de dlares, o que representa 5% do mercado total de medicamentos.
Pode-se concluir que ainda h muito trabalho a ser desenvolvido entre academia
e as indstrias farmacuticas para que novos medicamentos fitoterpicos
cheguem ao mercado (DUTRA et al., 2016).
Segundo dados recentes, existem 332 medicamentos registrados a
base de produtos naturais e 27 combinados, totalizando 359 registros no Brasil.
Destes, 145 devem ser vendidos com prescrio mdica, um deles com reteno
da receita. Considerando a vasta biodiversidade brasileira e o potencial para
produo de fitoterpicos, poucos so os produtos disponveis no mercado
atualmente (CARVALHO et al, 2017).
No entanto, o sistema mdico no pas ainda prioriza o tratamento
convencional, apesar da grande fonte de recursos naturais disponveis na rica
biodiversidade brasileira. O governo brasileiro vem tentando ampliar as opes
teraputicas ofertadas pelo Sistema nico de sade (SUS), incluindo o tratamento
com plantas medicinais. Em 2006 foi ento criada a Poltica Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterpicos, em vigor at os dias de hoje (FIGUEIREDO;
GURGEL; GURGEL JR., 2014).
Entre 2013 e 2015, o Ministrio da Sade registrou um aumento de
161% na procura pelos medicamentos fitoterpicos no SUS. Talvez esta
expressiva mudana seja decorrente de outras aes governamentais que
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32
impulsionaram a prescrio por parte dos profissionais da sade, como
lanamento do Memento Fitoterpico em 2016, importante documento que guia
a prescrio de espcies vegetais (CECHINEL FILHO, 2017).
Alm desta ao, em 2016 ainda foi lanada a Poltica e Programa
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterpicos, que tem como objetivo garantir
o uso seguro, racional e sustentvel das plantas medicinais, alm de desenvolver
uma cadeia produtiva e a indstria nacional de fitoterpicos (CECHINEL
FILHO, 2017).
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33
2. ASPECTOS RELACIONADOS PLANTA EM ESTUDO
2.2 A FAMLIA Myrtaceae
A famlia Myrtaceae uma das mais importantes da biodiversidade
brasileira, compreendendo cerca de 100 gneros e 3.500 espcies de rvores e
arbustos. Ela est distribuda por todos os continentes, nas regies tropicais e
subtropicais e no Brasil ela pode encontrada predominantemente no sul.
(GRESSLER; PIZO; MORELLATO, 2006).
Wilson e colaboradores (2005) classificaram esta famlia em duas
subfamlias, Myrtoideae e Psiloxyloideae e 17 tribos. No Brasil so encontradas
somente espcies da subfamlia Myrtoideae, de apenas uma tribo, Myrteae, que
por sua vez se divide em trs subtribos Eugeniinae, Myrciinae e Myrtinae. Os
gneros mais importantes (que possuem mais de 100 espcies), so Eugenia,
Myrcia e Calyptranthes.
As mirtceas, como so chamadas no Brasil, abrigam numerosas
espcies medicinais e frutferas bastante conhecidas e comercializadas, como a
Psidium guajava L (goiabeira), a Myrciaria cauliflora Berg (jabuticabeira) e a
Eugenia uniflora L. (pitangueira), e por essa razo elas so economicamente
muito importantes. O gnero mais importante das mirtceas o gnero Eugenia,
com 1.200-1800 espcies (tambm conhecido como gnero Syzygium)
(BRIGGS; JOHNSON, 1979; MCVAUGH, 1968; GRESSLER; PIZO;
MORELLATO, 2006).
2.3 O GNERO Eugenia
O gnero Eugenia um dos mais importantes da sua famlia, possuindo
350 a 400 espcies nativas no Brasil, muito utilizadas na medicina tradicional
para tratar inmeras enfermidades. O seu potencial biolgico vem sendo muito
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estudado e as pesquisas tm mostrado um grande nmero de resultados positivos
(MAGINA et al., 2009; QUEIROZ et al, 2015).
As plantas do gnero Eugenia apresentam rvores ou arbustos verdes
durante o ano todo. Seu fruto esfrico e geralmente comestvel, constitudo de
uma baga de at 3 centmetros de dimetro, coroado pelo clice e achatado nas
extremidades (AURICCHIO; BACCHI, 2003).
As espcies deste gnero so amplamente estudadas por apresentarem
grande potencial farmacolgico e importantes metablitos secundrios. A
espcie E. uniflora, conhecida popularmente como pitangueira, a planta mais
estudada, e tem aplicao diurtica, antifngica, antimicrobiana, antidiabtica,
antirreumtica, gastroprotetora, entre outros (ALMEIDA; FARIA; SANTOS et
al., 2011).
Alm da pitanga, podem ser citadas muitas outras como a Eugenia
dysenterica (Cagaita), utilizada no tratamento de diarreia e lcera (DUARTE et
al., 2010; PRADO et al., 2014); Eugenia pyriformis (Uvaia), com propriedades
antimicrobianas (CHAVASCO et al., 2014; STIEVEN; MOREIRA; SILVA,
2009); Eugenia jambolana (Jamelo ou Joo-bolo), com potencial
gastroprotetor, antiproliferativo, antidiabtico e antimicrobiano
(CHATUVERDI et al., 2007; BAG et al., 2012; CHAREPALLI et al., 2016);
Eugenia brasiliensis (Grumixama), utilizada como agente antimicrobiano e
antiproliferativo, alm de ser usada tratamento de diarreia e reumatismo
(COLLA et al., 2012; MAGINA et al., 2009; MAGINA et al., 2012; TEIXEIRA
et al., 2017), a Eugenia umbelliflora (Baguau), com propriedade
gastroprotetora, antimicrobiana, antileishmanicida (CECHINEL et al., 2013;
FAQUETTI et al., 2015; MAGINA et al., 2009; MEYRE-SILVA et al., 2009) e
a Eugenia euosma, (conhecida como Guamirim ou Murta), com potencial de
inibio da adipognese, sendo um aliado para o tratamento da obesidade
(OIKAWA et al., 2016).
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35
2.3.1 Composio qumica
Dados sobre o perfil qumico das espcies de Eugenia demonstram uma
composio qumica bastante ampla, que varia de acordo com o estgio de
desenvolvimento e principalmente em funo das variaes climticas
(QUEIROZ et al., 2015).
Muitos compostos j foram isolados de espcies de Eugenia, dentre
eles: compostos fenlicos (olivetol), flavonoides (keampferol, quercetina,
isoquercetina, quercitrina, rutina, myricitrina, myricitina, catequina,
epicatequina) antocianinas, taninos (cido elgico, acido glico, metill gallato,
casuarinina), triterpenos (cido betulnico, betulina, -amirina, -amirina, cido
urslico, cido oleanlico, nilocitina, cido maslnico) e esterides (-sitosterol,
stigmasterol) (TENFEN et al., 2018).
As classes de compostos mais importantes do gnero Eugenia so os
terpenoides e os flavonoides. Os flavonoides so compostos facilmente
encontrados em diversas espcies de Eugenia, sendo os mais conhecidos a
quercetina, mirecetina, canferol e as catequinas (QUEIROZ et al., 2015).
Os metablitos fenlicos so vastos na natureza, sendo abundantes em
frutas, vegetais e algumas plantas medicinais. A ingesto de algumas classes
especficas destas substncias na dieta (flavonis, antocianinas,
proantocianidinas, flavonas, flavanonas e catequinas) est fortemente
relacionada preveno de doenas cardiovasculares, que atualmente so a
principal causa de morte nos pases desenvolvidos (WANG et al., 2014).
Os mecanismos pelos quais este compostos atuam como
cardioprotetores esto relacionados ao seu efeito antioxidante, vasodilatador e
atividade anti-inflamatria. Estas atividades relatadas tambm so relacionadas
preveno de doenas neurodegenerativas e cncer, pois ambas doenas tem
suas respectivas patogneses ligadas ao estresse oxidativo (MUSCHIETTI,
MARTINO, 2016; WANG et al., 2014).
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36
Os flavonoides so produtos de origem biossinttica mista, sintetizados
atravs da via do cido chiqumico (ou chiquimato) e tambm do acetato (acetil
coenzima A). A via do cido chiqumico origina o cido cinmico e seus
derivados (cidos cafeico, ferlico, sinpico, etc.). A via do acetato origina um
tricetdeo, que pode ser condensado com algum derivado de cido cinmico,
gerando uma chalcona com 15 tomos de carbono, que o precursor inicial de
toda a classe dos flavonoides (DEWIK, 2002).
Os terpenides so considerados a maior classe de metablitos
secundrios, com 30.000 compostos j descritos. A classe dos triterpenos a
mais importante deste grupo de substncias, e apresenta grande atividade
biolgica, principalmente anti-inflamatria, antitumoral e analgsica (NIERO,
MALHEIROS, 2016; SULTANA, 2017).
Os triterpenos do tipo pentacclico so os mais encontrados na literatura
para este gnero, em especial os com esqueleto do tipo lupano e oleanano, como
a betulina, -amirina e -amirina (MAGINA et al, 2012). Alguns exemplos de
triterpenos encontrados em espcies j estudadas so: cido barbinrvico, isolado
das folhas da E. punicifolia (LEITE et al., 2014), o taraxerol, -amirina, -
amirina, betulina e cido betulnico, isolados das folhas da E. umbelliflora
(MEYRE-SILVA et al., 2009) e os cidos triterpnicos isolados da E. moraviana,
o cido betulnico, -hidroxibetulnico e o cido platnico (LUNARDI et al.,
2001).
Em um trabalho de reviso sobre o gnero Eugenia, Tenfen e
colaboradores (2018) descrevem algumas estruturas qumicas j isoladas de
espcies deste gnero. As figuras a seguir demonstram exemplos de compostos
fenlicos (Figura 1) e terpenoides j descritos na literatura para este gnero
(Figura 2).
https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_xiqu%C3%ADmicohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Xiquimatohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Acetatohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Acetil_coenzima_Ahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Acetil_coenzima_Ahttps://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_cin%C3%A2mico
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Figura 1. Compostos fenlicos isolados de espcies de Eugenia.
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Figura 2. Terpenoides isolados de espcies de Eugenia
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Novos compostos isolados do gnero Eugenia tem sido descritos
constantemente na literatura, como os eugenial C, isolado da E. umbelliflora
(FAQUETTI et al., 2015) e o triterpeno indito 24,25-epoxi-28-
hidroxicicloartan-3-ona, isolado da E. involucrata (VECHI, 2015).
2.4 A ESPCIE Eugenia mattosii
A espcie E. mattosii D. Legrand (Figura 3) foi descoberta perto da
dcada de 1950 pelo engenheiro agrnomo Joo Rodrigues de Mattos, nos
arredores de Blumenau (SC), e por essa razo foi classificada pelo botnico
uruguaio Diego Legrand com este nome, em homenagem Mattos. conhecida
popularmente como Cambu ou Pitanguinha de mattos e encontra-se em risco de
extino (LEGRAND, 1969; SOBRAL et al., 2009)
Os frutos de E. mattosii, j foram estudados previamente por nosso
grupo de pesquisa, tendo sido demonstrado por CCD a presena de compostos
fenlicos, terpenos e esteroides. Avaliou-se tambm o potencial antinociceptivo
e gastroprotetor do extrato metanlico bruto do fruto inteiro. No teste de dor
induzida por cido actico em camundongos (dose de 10 mg/kg de peso), o
extrato apresentou um percentual mdio de 43% de inibio das contores
abdominais, demonstrando efeito antinociceptivo. Na avaliao do potencial
gastroprotetor, houve diminuio da rea lesada do estmago de camundongos
submetidos aos modelos de lcera por etanol e indometacina na dose de 250
mg/kg de peso (NESELLO, 2015; DOS SANTOS et al., 2018).
Quanto ao aspecto fitoquimico, Apel e colaboradores (2005),
verificaram por meio de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massas (CG/EM) a presena de 21 compostos no leo voltil das folhas de E.
mattosii, identificados atravs do espectro de massas como sesquiterpenos
oxigenados (17,6%) e hidrocarbonetos sesquiterpenos (78,8%), representando
96,4% da composio do leo.
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40
Figura 3. Foto ilustrativa das partes areas de E. mattosii (A) e no local de coleta
da planta (B).
Fonte: o autor
A
A
B
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41
3 POTENCIAL BIOLGICO DE PLANTAS MEDICINAIS
As plantas medicinais representam uma inesgotvel fonte de
substncias qumicas para a pesquisa e descoberta de novos compostos com
potencial farmacolgico para a preveno e tratamento de diversas doenas
(CECHINEL FILHO, 2017; CRAGG; NEWMANN, 2013).
De acordo com estas informaes, imprescindvel que se realize um
estudo qumico e farmacolgico abrangente quando se inicia um trabalho com
uma planta potencialmente medicinal que ainda no foi estudada em relao s
suas caractersticas qumicas. Desta forma, neste trabalho, objetivamos realizar
uma triagembiolgica amplo para conhecer melhor o potencial farmacolgico da
planta em questo.
Foram selecionadas algumas atividades biolgicas especficas in vitro
e in vivo para avaliar a planta escolhida, E. mattosii. Sobres estas respectivas
atividades, uma breve descrio foi preparada, conforme descrito abaixo:
3.1 Atividade antibacteriana
As mudanas que a globalizao trouxe para a sociedade atual tm
aumentado o nmero de casos de doenas infecciosas na populao. Entre essas
mudanas podemos citar as imigraes, alteraes do ambiente, aumento da
populao, sedentarismo e m-alimentao, alm do consumo indiscriminado de
agentes antimicrobianos. Estes fatores somados falta de novos antibiticos
disponveis no mercado vem gerando um grave problema de sade pblica: a
resistncia antimicrobiana (GOLDSTEIN et al., 2012; AGUIAR et al., 2012).
Este um problema bastante complexo e tem causas variadas, mas o
fato que ao longo dos anos, as bactrias desenvolveram mecanismos capazes
de diminuir ou mesmo inativar a ao dos frmacos. As cepas podem adquirir
resistncia por meio de mutaes genticas, produo de enzimas, alterao dos
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42
stios receptores impedindo a absoro do frmaco ou, ainda, podem sintetizar
protenas que inibem a ao dos antibiticos. Na maioria das vezes, esta
resistncia ocorre quando o tratamento no seguido de forma adequada como,
por exemplo, no uso de subdoses, durao prolongada ou insuficiente dos
medicamentos (TANWAR et al., 2017).
Os antimicrobianos utilizados na prtica clnica mdica e veterinria
tambm representam um grande risco ambiental, se no forem utilizados com
precauo ou descartados de maneira correta. Vrias substncias existentes nos
frmacos so resistentes ao processo de tratamento, permanecendo no meio
ambiente por longos perodos, acarretando srios riscos socioeconmicos e
ambientais. Muitos antibiticos acabam por selecionar os microorganismos mais
resistentes, ocasionando uma futura resistncia este medicamento quando
utilizado por pessoas que foram expostas alimentos ou gua contaminada por
antibiticos, por exemplo (BALBINO; BALBINO, 2012).
Algumas bactrias, chamadas molicutes ou micoplasmas, no possuem
parede celular e por esta razo so mais propensos a no responder ao tratamento
com antibiticos convencionais, pois a maioria deles atua justamente sobre a
parede celular. Estas bactrias, consideradas os menores microrganismos
capazes de autorreplicao, so responsveis por diversas doenas em seres
humanos (algumas doenas sexualmente transmissveis), mas tambm em
animais e plantas. Em humanos j foram descritas cerca de 17 espcies, sendo
que cinco delas so patognicas (ZANETTI, 2015; BENFATTI et al., 2010).
Somando-se todos estes fatores, se faz necessria a busca por novas
terapias que possam servir de tratamento contra os molicutes. Levando em
considerao que a maioria dos medicamentos utilizados no controle de
infeces derivada de produtos naturais, a pesquisa com plantas medicinais
representa uma estratgia para a obteno de novos compostos que possam ter
ao antimolicute (NEWMAN; CRAGG, 2012).
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43
Muitas plantas vem sendo estudadas nesse sentido, e compostos como
cumarinas, flavonoides, taninos, alcaloides e terpenides tem sido considerados
substncias chaves para resultados positivos na atividade antimicrobiana
(SILVA; FERNANDES JNIOR, 2010).
O gnero Eugenia foi recentemente estudado quanto sua atividade
antimolicute. As espcies E. beaurepaireana, E. brasiliensis, E. umbelliflora
foram avaliadas por Benfatti e colaboradores (2010), que observaram uma
atividade antimolicute interessante para a primeira espcie descrita. No caso da
E. platysema, cujas folhas so ricas em compostos fenlicos, o extrato
hidroalcolico e as fraes apresentaram resultados promissores, sendo o a
frao de diclorometano a mais ativa (125 g.mL-1) frente a algumas cepas
testadas (TENFEN et al., 2016). O leo essencial das folhas de E. hiemalis,
demonstrou bons resultados frente s cepas avaliadas por Zatelli e colaboradores
(2016).
3.2 Atividade gastroprotetora
A gastrite e a lcera pptica so ocasionadas por modificaes na funo
celular e estrutura tecidual, gerando um desequilbrio entre os fatores de proteo
da mucosa gstrica (muco, fluxo sanguneo, mecanismo antioxidante) e os
fatores agressores (cido clordrico, espcies reativas de oxignio), que podem
gerar leses na parede do estmago (PRABHU; SHIVANI, 2014; NAJIM, 2011).
Diversos fatores esto relacionados estas doenas, podendo ser
internos: gentica, patologias infecciosas e/ou patologias granulomatosas
associadas a doenas crnicas ou externos: qualidade de vida, estresse, consumo
de lcool, cafena, drogas e medicamentos comos anti-inflamatrios no
esteroidais e/ou a infeco pela bactria Helicobacter pylori
(MALFERTHEINER; CHAN; McCOLL, 2009; PRABHU; SHIVANI, 2014).
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44
O tecido gstrico possui mecanismos de defesa prprios: a
reconstituio do epitlio, produo de suco gstrico, barreira de muco e
bicarbonato, secreo de protenas de choque trmico, alm da perfuso
adequada de sangue no trato gastrintestinal (NAJIM, 2011; TULASSAY;
HERSZENYI, 2010).
Os sintomas dos pacientes com lcera e gastrite so dor epigstrica,
sintomas disppticos (plenitude), distenso abdominal, saciedade precoce,
nuseas e dispepsia (HIRUMA-LIMA et al., 2009).
Os frmacos mais utilizados no tratamento da lcera gstrica atuam
inibindo a secreo cida gstrica, como a cimetidina e a ranitidina (que so
frmacos antagonisstas do receptor H2 da histamina), ou inibindo a bomba de
prtons (como o omeprazol e esomeprazol). Apesar de efetivos, estes
medicamentos apresentam baixa qualidade na cicatrizao da leso ulcerativa e
recidivas constantes da doena, com necessidade do prolongamento do
tratamento (ARAKAWA et al., 2012; KANGWAN et al., 2014).
O uso prolongado dos medicamentos anti-secretores tambm provoca
uma srie de efeitos adversos, como ginecomastia, cefaleia, dor abdominal,
diarria, vmito, fraturas osteoporticas (devido baixa calcificao ssea) e no
osteoportica (originada de trauma), alm de hipergastrinemia, que em casos
mais acentuados pode contribuir para o desenvolvimento de neoplasia gstrica
(MOULI; AHUJA, 2011).
Neste sentido, imprescindvel investigar alternativas farmacolgicas
capazes de promover a preveno e a cicatrizao de lceras, com ausncia ou
reduo de efeitos colaterais, e as plantas medicinais so uma alternativa
interessante. Alguns metablitos secundrios produzidos pelas plantas, como
alguns flavonoides, terpenos e alcalides, so capazes de proteger o estmago e
at de tratar leses j instaladas (KLEIN-JNIOR et al., 2012).
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Muitas plantas medicinais estudadas por nosso grupo de pesquisa j
apresentaram potencial gastroprotetor: Achyrocline satureoides, Polygala
cyparissias, Rubus imperialis, Maytenus robusta, Brassica oleracea, Baccharis
dracunculifolia. No mercado farmacutico tambm existem fitoterpicos para o
tratamento da lcera gstrica, como o caso de cpsulas de Maytenus ilicifolia,
que comercializada por diversos laboratrios (SOMENSI, 2015).
Dentre os metablitos que mais se destacam por seu potencial
antioxidante, anti-inflamatrio e consequentemente gastroprotetor esto os
flavonoides, compostos bastante encontrados nas plantas do gnero Eugenia
(MAGINA et al., 2010). Algumas espcies j estudadas demostraram atividade
gastroprotetora: E. jambolana (DONATINI et al., 2009), E. umbelliflora
(MEYRE-SILVA et al., 2009), E. punicifolia (BASTING et al., 2014).
3.3 Atividade antinociceptiva
Nocicepo ou algesia o termo mdico para a recepo de estmulos
aversivos, transmisso, modulao e percepo de estmulos agressivos, que so
interpretados e transmitidos pelo sistema nervoso perifrico at o sistema
nervoso central onde interpretado como dor (KLAUMANN; WOUK; SILLAS,
2008; OMS, 2012).
A dor caracterizada por experincias sensoriais e emocionais, e pode
ser crnica, quando perdura por um longo tempo ou aguda, quando acaba em um
curto espao de tempo. O conjunto das percepes de dor que o ser humano
capaz de distinguir pode ser induzida em um receptor de trs formas especficas.
A primeira forma a mecnica (capaz de excitar um mecanorreceptor); a segunda
a do tipo trmica (capaz de excitar um termorreceptor) e a terceira a do tipo
qumica (que afeta quimioceptores) (KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008).
Sentir dor, apesar de representar uma sensao desagradvel, um
processo fisiolgico muito importante para o ser humano. Esta sensao permite
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46
que o indivduo tenha conscincia de que algo est ameaando o bom
funcionamento do seu organismo e muitas vezes ela o nico sintoma para o
diagnstico de vrias doenas. A IASP (International Association for the Study
of Pain) descreve a dor como uma experincia sensorial e emocional
desagradvel que est associada com leses reais ou potenciais (OMS, 2012).
Um estudo epidemiolgico realizado pela SBED (Sociedade Brasileira
para estudo da dor) com 919 pessoas das cinco regies do Brasil, demonstrou
que 42% relataram algum tipo de dor e 37% disseram conviver com dor h pelo
menos seis meses. A pesquisa revelou que a dor acomete mais mulheres que
homens e demonstrou algumas diferenas entre as regies. A maior incidncia
(42%) no Sul, seguido do Sudeste (38%) (SOUZA et al., 2016).
A dor crnica no um problema somente no Brasil, j que 20 a 40%
da populao mundial em algum momento da vida acometido por ela, que causa
sofrimento, inaptido ao trabalho, problemas psicossociais e prejuzos
econmicos (SBED, 2016).
A OMS recomenda que para o tratamento da dor, seja seguido um
protocolo chamado Escala Analgsica. O primeiro degrau recomenda o uso de
medicamentos analgsicos simples e anti-inflamatrios para dores fracas. O
segundo degrau sugere opioides fracos, que podem ser associados aos
analgsicos simples ou anti-inflamatrios do primeiro degrau, para dores
moderadas. O terceiro degrau consta de opioides fortes, associados ou no aos
analgsicos simples ou anti-inflamatrios, para dores fortes (OMS, 2012).
Todos os medicamentos descritos nesta escala, at mesmo os do
primeiro degrau podem causar efeitos adversos indesejveis aos pacientes com o
uso contnuo. Estes efeitos incluem nuseas, dor de cabea, vmitos, gastrites e
lceras. J os opioides podem tambm causar dependncia e crises de abstinncia
(POLSKI et al., 2014).
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Considerando que a dor um problema de sade pblica e que o
tratamento convencional provoca muitos efeitos colaterais, se faz necessria a
busca por novos medicamentos, menos agressivos. Nesse sentido, a busca por
compostos derivados de plantas medicinais se faz justificvel e imprescindvel
para a sade mundial (BAHMANI et al., 2014).
Ao longo da histria o homem tem buscado as plantas medicinais para
o tratamento da dor. Alguns exemplos comuns so: a morfina, isolada da Papaver
somniferum; a Cannabis sativa, conhecida popularmente no Brasil como
maconha; a capsaicina, substncia isolada de vrias espcies de Capsicum, as
populares pimentas vermelhas, amplamente utilizadas na culinria (ALMEIDA;
NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; CALIXTO et al., 2000).
A descoberta mais importante neste sentido foi a da salicina, isolada de
espcies de Salix alba por Rafaele Piria em 1832. Aps muitas modificaes
estruturais foi sintetizado o cido acetilsaliclico, com propriedades analgsicas
e antipirticas, dando origem famosa Aspirina, lanamento que foi
acompanhado pelo surgimento de uma gigante indstria farmacutica na
Alemanha, a Bayer (DUTRA et al., 2016).
O Ncleo de investigaes Qumico-Farmacuticas da UNIVALI
(NIQFAR), trabalha h 20 anos com plantas medicinais, e j demosntrou
atividade antinociceptiva para diversas plantas da flora catarinense, como a
Aleurites moluccana (nogueira-da-ndia), Chrysophyllum cainito (abiu-roxo),
Cipura paludosa (alho do mato), Garcinia achaicharu (bacupari), Ipomoea pes-
capae (p-de-cabra), Lichi chinensis (lichia), Marrubium vulgare (maromba),
Phyllanthus niruri (quebra-pedra), Plinia glomerata (cabeludinha), Polygala
cyparissias (avenca da praia), Rubus imperialis (amora-branca), Wedelia
paludosa (vedlia), Eugenia involucrata (cerejinha do mato), Campomanesia
reitziana (gabiroba) e Myrcianthes pungens (guabiju) (CECHINEL FILHO,
2017).
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Algumas espcies do gnero Eugenia que j foram estudadas quanto ao
seu potencial antinociceptivo como E. punicifolia (BASTING et al., 2014), E.
fruticosa (SHAMS-UD-DOHA et al., 2012) e E. involucrata (VECHI, 2015;
VECHI et al., 2017), apresentaram promissores resultados.
3.4 Atividade antiproliferativa
O cncer uma doena considerada multicausal e crnica, que afeta
milhares de pessoas ao redor do mundo, tanto em pases subdesenvolvidos
quanto em pases em desenvolvimento. uma doena na qual as clulas sofrem
alteraes genticas e crescem de forma anormal, invadindo outros tecidos e
perdendo sua funo original (MIRANDA et al., 2013; SAN FELICIANO;
CECHINEL FILHO, 2014).
A etiologia do cncer ainda no muito bem esclarecida, porm, as
neoplasias podem surgir devido s mutaes genticas espontneas ou induzidas
por agentes patognicos como metais, radiaes, radicais livres do oxignio,
inflamaes crnicas e exposio xenobiticos (tabaco, lcool, pesticidas, etc).
Este processo termina com a proliferao de clulas anormais (tumorais),
gerando os tumores (CAMPOS et al., 2014; FERNANDES; MAFRA, 2005).
O National Cancer Institute (NCI), afirma que os EUA gastam 125
bilhes por ano no tratamento de cncer e a projeo de novos casos de cncer
s tende a aumentar, com possibilidades de se tornar a doena que mais mata no
mundo, ultrapassando as doenas cardiovasculares. No Brasil, o INCA (Instituto
Nacional do Cncer) aponta a ocorrncia de aproximadamente 600 mil novos
casos de cncer entre 2016-2017 (INCA, 2017; MARIOTTO et al., 2011).
A utilizao de compostos bioativos para o tratamento do cncer
conhecida ao longo da histria da humanidade. Estudos populacionais sugerem
que um risco reduzido de cncer est associado ao alto consumo de vegetais e
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frutas devido presena de fitoqumicos naturais com poder quimiopreventivo
(GULLET et al., 2010; GREENWELL; RAHMAN, 2015).
Os compostos de origem vegetal possuem um grande potencial na
preveno do cncer devido sua segurana, baixo custo e biodisponibilidade
oral. Atualmente, a maioria dos medicamentos para o tratamento de cncer do
mercado farmacutico so derivados de produtos naturais, chegando um
percetual de aproximadamente 75% (NEWMAN; CRAGG, 2016; CAMPOS et
al., 2014).
Estudos tm demonstrado que as principais vias de sinalizao
desreguladas no cncer so afetadas por nutrientes: metabolismo carcinognico,
reparo de DNA, proliferao celular/apoptose, diferenciao, inflamao,
desequilbrio na proteo antioxidante e angiognese. Entre os nutrientes com
ao preventiva podem ser elencados o clcio, zinco, selncio, cido flico,
cidos graxos essenciais, vitaminas (C, D e E). Alm dos nutrientes, muitos
compostos bioativos encontrados em plantas tem demonstrado proteo em
vrias fases do desenvolvimento do cncer, dentro os quais pode-se citar os
flavonoides (apigenina, kaempferol, quercetina), carotenoides (licopeno,
betacaroteno), terpenoides (taxol), vitaminas (A, C, D e E), sulforafano, alguns
polifenis (resveratrol) (VALENTE et al., 2014).
Alm destas substncias isoladas, alguns extratos de plantas
demonstram atividade como Viscum album, Hypericum perforatum, Withania
somnifera (Ashwagandha), Melaleuca alterniflia (melaleuca ou tee tree),
Zingiber officinale (gengibre), Curcuma longa (crcuma), Calendula officinalis
(margarida), Rosmarinus officinalis (alecrim) tambm podem ter ao anticncer
por diferentes mecanismos, principalmente induzindo a apoptose, apresentando
atividade antiproliferativa e anti-metasttica (CHINEMBIRI et al., 2014).
Espcies de Eugenia so geralmente ricas em flavonoides e terpenoides
e por essa razo podem ser promissoras na busca por novos agentes anticncer.
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50
Recentemente algumas espcies vem demostrando potencial antiproliferativo,
como a E. jambolana e a E. brasiliensis (CHAREPALLI, 2016; TEIXEIRA et
al., 2017).
3.5 Atividade anticolinestersica
A atividade anticolinestersica est relacionada inibio da
acetilcolinesterase (AChE), uma enzima que degrada a acetilcolina em colina e
cido actico. A acetilcolina (ACh) por sua vez um neurotransmissor
importante nas fendas sinpticas e possui uma funo essencial para o organismo
e para o sistema nervoso central (SNC), pois decisivo no desempenho
cognitivo. Alguns elementos qumicos, classificados como neurotoxinas, podem
afetar a atividade desta enzima, provocando principalmente
espasmos musculares (FORTUNATO, 2016; OLAZARN; NAVARRO;
ROJO, 2013).
Apesar de ser uma enzima importante, inibir sua ao por meio de
agentes anticolinestersicos pode ser uma importante soluo para algumas
doenas como a miastenia gravis, glaucoma e a doena de Alzheimer (DA), alm
de serem utilizados como agentes analgsicos (FORTUNATO, 2016).
Atualmente, a maioria dos tratamentos teraputicos para a DA esto
relacionados inibio da enzima acetilcolinesterase para aumentar o nvel de
acetilcolina nas sinapses nervosas, melhorando os sinais de vrios distrbios
neurolgicos (SENOL et al., 2010; TAKIZAWA et al., 2015).
A DA umas das principais causas de demncia no mundo. Ela
uma das doenas neurodegenerativas relacionadas idade mais prevalente em
idosos, junto com as deficincias cognitivas. O aumento da prevalncia desta
doena em todo o mundo uma ameaa sade pblica, uma vez que cerca de 5
a 8% das pessoas com mais de 60 anos apresenta a DA (OMS, 2018; SAEEDI et
al., 2017).
https://pt.wikipedia.org/wiki/Neurotoxinahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Espasmohttps://pt.wikipedia.org/wiki/Miastenia_gravishttps://pt.wikipedia.org/wiki/Glaucomahttps://pt.wikipedia.org/wiki/Mal_de_Alzheimer
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51
Em todo o mundo, cerca de 47 milhes de pessoas tm demncia, e
se identifica quase 10 milhes de novos casos a cada ano. Sendo a DA a causa
mais comum de demncia (60-70% dos casos), possvel calcular que existam
cerca de 6 a 7 milhes de novos casos de DA anualmente. O nmero total de
pessoas com demncia projetado para cerca de 75 milhes em 2030 e em 2050
para 132 milhes (OMS, 2018).
Nos ltimos anos, investimentos considerveis foram dedicados ao
desenvolvimento de medicamentos para o tratamento desta enfermidade, que
est relacionada destruio e envelhecimento celular, responsveis pela
desordem neurolgica caracterstica da DA. Os sintomas incluem a perda de
memria, disfuno cognitiva, distrbios de comportamento e dificuldade na
realizao das atividades dirias (MAGINA et al., 2012; SIEBERT et al., 2015).
A DA considerada grave, incapacitante e at o momento sem cura.
Considerando o aumento da expectativa de vida da populao mundial e o
consequente aumento da incidncia de DA, a busca por novos agentes com
potencial anticolinestersico se faz imprescindvel (DIAS et al., 2015). Neste
sentido, as plantas medicinais podem ser aliadas, como o caso da galantamina,
isolada de plantas da famlia Amaryllidaceae (GIORDANI et al., 2008).
O gnero Eugenia apresenta algumas espcies j estudadas quanto ao
seu potencial anticolinesterasico, como a E. dysenterica e E. brasiliensis
(GASCA et al., 2017; SIEBERT et al., 2015). Muitas espcies tambm
apresentam potencial anti-inflamatrio, tendo relao desta forma com a
preveno e tratamento da DA (DZOYEM et al., 2017). Desta forma, se justifica
a busca por substncias bioativas com potencial anticolinestersico nas folhas e
caules de E. mattosii.
-
52
3.6 Atividade vasorrelaxante
A presso arterial (PA) elevada a condio mais prevalente na
ateno bsica sade e est relacionada a diversas patologias importantes como
as doenas relacionadas ao corao e a falncia renal (JAMES, 2013).
Segundo a OMS, a hipertenso e suas complicaes so responsveis
por 17,7 milhes de mortes a cada dia (cerca de 31% de toda mortalidade
mundial), tanto em pases em desenvolvimento quanto em pases de primeiro
mundo. Apesar dos esforos governamentais, a sua prevalncia continua a
aumentar (GALLARDOORTZ et al., 2015; OMS, 2017).
As doenas cardiovasculares (DCVs) so distrbios relacionados ao
funcionamento do corao e dos vasos sanguneos . Os indivduos com presso
arterial aumentada, alteraes de glicemia e lipdeos plasmticos e com
sobrepeso ou obesidade apresentam alto risco para o desenvolvimento destas
doenas, que so a causa nmero um de mortes em todo o mundo (OMS, 2017;
OMS, 2007, WANG et al., 2014).
Segundo as Diretrizes Brasleiras de Hipertenso Arterial, a PA a
fora que o sangue bombeado pelo corao exerce contra a parede distensvel
dos vasos sanguneos. O volume de sangue que sai do corao (dbito cardaco)
e a resistncia que ele encontra para circular na periferia (resistncia perifrica
vascular) que determinam essa presso. Em humanos, a presso arterial mdia
gira em torno de 120 mm Hg para a presso sistlica e 80 mm Hg para diastlica
(SBC, 2016).
A regulao da PA em curto prazo (reao em segundos)
desempenhada pelos barorreflexos, quimiorreflexos e SNC. O controle da PA em
longo prazo (horas ou dias) desempenhado pelos rins. Em mdio prazo
(minutos), a regulao ou modulao ocorre principalmente por ao dos
sistemas hormonais (GUYTON, 1991; SILVA, 2011).
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53
O endotlio vascular capaz liberar substncias que relaxam a
musculatura lisa, controlando a presso arterial, como por exemplo o xido
ntrico. O endotlio est localizado na parede interna dos vasos sanguneos, que
so constitudos de trs camadas histolgicas: a camada externa que formada
por tecido conjuntivo; a camada mdia, formada por clulas musculares lisas e a
camada ntima, constituda por uma nica camada de clulas que reveste
internamente os vasos sanguneos. Em condies normais existe um equilbrio
entre a liberao desses fatores, mas em condies patolgicas como a de
hipertenso arterial, acontece um desequilbrio que est associado ao
desenvolvimento de complicaes relacionadas s DCVs (SILVA, 2011).
Os riscos causados por essa enfermidade fazem com que seja cada
vez mais necessria a busca por tratamentos alternativos para o controle da
hipertenso. No Brasil e no mundo, muito comum o uso de plantas medicinais
como fonte alternativa no tratamento desta complicao. As propriedades
calmantes e anti-hipertensivas de determinadas plantas tm sido alvo de novas
descobertas farmacolgicas (SILVA et al., 2015).
O atratamento farmacolgico da hipertenso inclui uma variedade de
drogas que atuam em diferentes vias, com o objetivo teraputico de reduzir a PA
sistlica e diastlica para valores mais aceitveis fisiologicamente. No entanto,
muitos pacientes no apresentam reduo eficiente da PA com uso de drogas
anti-hipertensivas convencionais (SBC, 2016; MANCIA et al., 2013).
Neste sentido, o desenvolvimento de novas ferramentas
farmacolgicas pode ajudar a melhorar o manejo clnico da hipertenso arterial.
Plantas medicinais podem ser grandes aliadas no controle da presso arterial,
muitas delas j so utilizadas na medicina tradicional: Cymbopogon citratus
(DC.) Stapf (capim-limo), Cynara scolymus L. (alcachofra), Rosmarinus
officinalis L. (alecrim), Allium sativum L. (alho), Coleus barbatus Benth (falso
boldo) (FARIAIS et al., 2016).
-
54
As espcies de Eugenia so geralmente ricas em flavonoides,
compostos j conhecidos por seu potencial cardioprotetor, antioxidante e anti-
inflamatrio (WANG et al., 2014). Por esta razo, justifica-se a busca por novas
substncias biotivas provenientes de plantas medicinais como a Eugenia
mattosii, que possam reduzir a presso arterial, uma vez que esta espcie faz parte
de um gnero to promissor quando se trata de doenas cardiovasculares.
3.7 Atividade antiparasitria
As parasitoses so muito comuns em todo o mundo, gerando graves
consequncias para a sade pblica. Cerca de 50% da populao mundial e 36%
da populao brasileira sofrem com algum tipo de doena relacionada parasitas
(OMS, 2016). Apesar deste tipo de doenas estar relacionado precrias
condies de vida (falta de higiene e saneamento bsico, desnutrio, gua
poluda), sendo mais prevalente em pases em desenvolvimento, os pases
desenvolvidos tambm so afetados pelas parasitores (MUKBELl et al., 2017).
Estas doenas so normalmente negligenciadas pelo setor mdico e
farmacutico, pois no representam um mercado lucrativo, alm de tambm
serem esquecidas por pesquisadores. Faltam avanos tecnolgicos para o
desenvolvimento de novas ferramentas de diagnstico, drogas ou vacinas que
possam combater estas parasitoses to comuns. A giardase e a leishmaniose,
provocadas por parasitas, so doenas normalmente negligenciadas e bastante
prevalentes em pases em desenvolvimento. (ARVALO-LOPZ et al., 2018).
A giardase provocada por espcies de Giardia, sendo a principal
delas a G. lamblia (ou G. intestinalis/duodenalis). Animais domsticos e crianas
so os mais afetados por esse parasita intestinal (THOMPSON, 2011). A
giardase causa diversos problemas intestinais, entre eles a infeco intestinal, a
diarreia e a m absoro de nutrientes, sendo que pode ocasionar danos mais
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55
severos em casos graves. A principal via de transmisso a oral-fecal (BARRY
et al., 2013; MUKBELl et al., 2017).
Muitos medicamentos existem para o tratamento da giardase, no
entanto, eles provocam muitos efeitos colaterais. No mundo das plantas
medicinais, algumas alternativas j so descritas para combater a giardase. Uma
delas a curcumina, o principal metablito isolado da Curcuma longa, um
rizoma de cor alaranjada bastante utilizado na culinria indiana (GUTIERRZ-
GUTIRREZ et al., 2017).
No caso da leishmaniose, existem muitas espcies associadas
patologia, que costuma acometer humanos e animais. Costumava ser encontada
somente na rea rural, mas atualmente pode ser diagnosticada em ambientes
urbanos. A doena se manifesta de trs maneiras: leishmaniose cutnea (lceras
drmicas), mucocutnea (lceras na pele, boca, nariz) ou visceral (forma mais
grave, causa febre de longa durao, perda de peso, astenia, anemia e pode levar
bito (GOBBI et al., 2016; OMS, 2016).
Existem mais de 300.000 casos de leishmaniose visceral e mais de 1
milho de casos de leishmaniose cutnea. No Brasil, a maior parte das infeces
por Leishmania acontece em adultos e so do tipo cutnea (OMS; 2015).
Para o tratamento de leishmania se utiliza alguns medicamentos
especficos como o Antimoniato de Meglumina (desde 1946) e a anfotericina B
(desde 1957). Miltefosina a droga mais recente em utilizao, aprovada para
em 2008 nos Estados Unidos pela FDA (Food and Drug Administration). Todos
esses tratamentos so altamente txicos e mostram efeitos secundrios graves.
Portanto, importante desenvolver novas alternativas para o tratamento destas
doenas e os produtos naturais desempenham um papel crucial na descoberta de
novos medicamentos nesta linha (ARVALO-LOPZ et al., 2018).
A Bolvia o pas que mais apresenta casos de Leishmaniose no
mundo, e vem buscando alternativas dentro de sua prpria biodiversidade para o
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56
tratamento desta doena. Recentemente foi publicado um estudo com vrias
plantas de uma comunidade boliviana, levando em considerao o uso popular
das mesmas. Cinco plantas apresentaram potencial leishmanicida: Jacaranda
glabra, Scoparia dulcis, Tessaria integriflia, Thalia geniculata e Ejije Bidu.
As plantas medicinais so grandes aliadas na busca de novas
substncias capazes de combater estes parasitas. Muitos metablitos secundrios
vem sendo estudados em relao atividade antileishmanicida e antigirdia. O
Brasil, sendo um grande foco de zoonoses e ter uma grande biodiversidade, pode
ser local de descoberta de plantas com potecial antiparasitrio.
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CAPTULO III
Resultados e Diiscusso
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58
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1 AVALIAO FITOQUMICA
Neste item, ser exposto toda a parte fitoqumica que permeia a tese,
sendo a parte inicial da pesquisa e tambm servindo de auxlio durante as
avaliaes biolgicas que sero descritas nos artigos posteriores a este item. As
metodologias apresentadas foram a base do estudo com a planta.
1.1 Material vegetal
O material vegetal foi coletado entre agosto de 2015 a novembro de
2016, nos jardins da UNIVALI, na cidade de Itaja, SC, Brasil. Foram realizadas
quatro coletas, a cada trs meses, de acordo com as diferentes estaes do ano,
sempre no ltimo ms de cada estao. A planta foi identificada pelo Prof. Oscar
Benigno Iza (UNIVALI) e uma exsicata foi depositada no Herbrio Barbosa
Rodrigues (Itaja-SC) sob o nmero VCFilho 150.
1.2 Anlise fitoqumica
As folhas e os caules frescos de E. mattosii foram picados e extrados
separadamente por macerao com metanol durante 7 dias temperatura
ambiente. A relao planta-solvente variou entre 1:3 a 1:5 (para cada 100 g de
planta fresca foram utilizados de 300 a 500 ml de metanol), dependendo da parte
da planta. Os extratos foram filtrados e concentrados em um rotaevaporador sob
presso reduzida (50C) fornecendo os respectivos extratos metanlicos brutos
(EMB), que seguiram para o processo de isolamento de compostos atravs de
colunas cromatogrficas (CC), conforme demonstra a Figura 4.
A fim de comparar os rendimentos de cada estao do ano, todos os
extratos foram realizados seguindo o procedimento j descrito acima, sempre
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60
utilizando as partes da planta in natura. Os rendimentos de cada extrato esto
descritos na Tabela 1.
Figura 4. Fluxograma do procedimento de extrao e partio das folhas secas
de E. mattosii.
Tabela 1. Dados de coleta e rendimentos de extratos sazonais de E. mattosii.
Amostras E. mattosii Data
coleta
Rendimento (%)
EMB-Folhas Primavera Nov 2016 8,96
EMB-Caules Primavera Nov 2016 2,91
EMB-Folhas Vero Fev 2016 7,73
EMB-Caules Vero Fev 2016 2,09
EMB-Folhas Outono Maio 2016 6,73
EMB-Caules Outono Maio 2016 2,29
EMB-Folhas Inverno Ago 2015 10,94
EMB-Caules Inverno Ago 2015 2,4
* EMB= extrato metanlico bruto
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61
1.3 Isolamento e identificao de compostos
O processo de triagem inicial da planta foi realizado na primeira
coleta, em agosto de 2015 com o extrato das folhas frescas. Uma CC inicial foi
preparada com 15g de extrato metanlico bruto das folhas (EMB-inverno) em
coluna de vidro de 125ml com 62g de slica gel 60 da marca Macherey-Nagel
(0,04-0,063 mm / 230-400 mesh ASTM). Esta coluna de triagem foi
recromatografada algumas vezes e levou ao isolamento de pequenas quantidades
de fitol (1mg), lcool palmtico (32 mg) e cido urslico (11 mg), que foram
identificados por CG/EM. Nesta fase do trabalho pode-se observar o grande
potencial fitoqumico da planta atravs da cromatografia em camada delgada
(CCD), conforme demonstra a Figura 5.
Figura 5. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) das subfraes obtidas da
primeira Coluna Cromatogrfica (CC) com o extrato bruto de E. mattosii.
-
62
Para isolamento de compostos, foi utilizado um extrato obtido das
folhas secas da primeira coleta, que aconteceu em agosto de 2015 (coleta de
inverno), pois esta coleta demonstrou um maior rendimento. Os procedimentos
de extrao e partio foram idnticos aos j mencionados anteriormente.
Aps a partio, ambas fraes foram submetidas colunas
cromatogrficas a fim de isolar os principais constituintes ativos. 15 g da frao
clorofrmio (FCL) foram submetidas a CC aberta em coluna de vidro de 200 ml
com 130 g de slica gel 60 eluda com gradiente de hexano:acetona, resultando
na coleta de 183 subfraes (10 ml cada) nesta coluna inicial.
As subfraes similares da primeira coluna foram combinadas com
base em seus perfis em CCD, utilizando-se de placas pr-revestidas Merck
Kieselgel 60 F254 (0,25 mm) eludas com gradiente hexano:acetona. As manchas
foram visualizadas por UV e reveladas com reagente anisaldedo. Algumas
subfraes foram recromatografadas seguindo o mesmo procedimento, conforme
Figura 6. As subfraes 75-85 (664 mg) e 86-89 (373 mg) forneceram o
isolamento de um total de 362 mg de um slido branco puro, identificado como
pinostrobin, enquanto as subfraes 153-165 (231 mg) e 166-177 (810 mg)
levaram ao isolamento de um total de 84 mg de outro slido branco puro,
indentificado como cryptostrobin.
Ambas substncias foram identificados com base nos dados espectrais
(FIGURA 7 a 10) e comparadas com dados da literatura (SOLLADI et al.,
1999; MASSARO et al., 2014).
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63
Figura 6. Fluxograma do procedimento de isolamento de compostos da FCL-
folhas de E. mattosii.
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64
Figura 7. RMN de H1 do flavonoide isolado pinostrobin.
Figura 8. RMN de C13 do flavonoide isolado pinostrobin.
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65
Figura 9. RMN de H1 do flavonoide isolado cryptostrobin.
Figura 10. RMN de C13 do flavonoide isolado cryptostrobin
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66
Em relao frao de acetato de etila (FAE), 12g foram submetidos
a procedimentos cromatogrficos em coluna de vidro de 200ml com 80 g de slica
gel 60 utilizando-se gradiente de clorofrmio:metanol. Conforme descrito na
Figura 11, 138 subfraes foram coletadas na primeira coluna e combinadas de
acordo com a similaridade. A subfrao 50-79 (450 mg) foi recromatografada
duas vezes e permitiu o isolamento de avicularin (15 mg) e (-)- catequina (6 mg),
identificadas com base nos dados espectrais de RMN (FIGURAS 12 a 15) e
comparadas com dados da literatura (LEE et al., 2014; AYRES et al., 2009). As
estruturas dos compostos isolados podem ser observadas na Figura 16.
A CCD tambm foi usada para monitorar a combinao das
subfraes e a pureza dos compostos. Neste caso elas foram eludas com
gradiente clorofrmio:metanol e reveladas com cloreto frrico (FeCl3).
Figura 11. Fluxograma do procedimento de isolamento de compostos da FAE-
folhas de E. mattosii.
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67
Figura 12. RMN de H1 do flavonoide isolado (-)-catequina.
Figura 13. RMN de C13 do flavonoide isolado (-)-catequina.
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68
Figura 14. RMN de H1 do flavonoide isolado avicularin.
Figura 15. RMN de C13 do flavonoide isolado avicularin.
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69
Figura 16. Estruturas dos compostos isolados das folhas de E. mattosii. (A)
Pinostrobin, (B) Cryptostrobin, (C) (-)catequina e (D) Avicularin.
O
OH O
OCH3
O
CH3
OOH
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
(A) (B)
(C)
O
OH
OH
OH
OH
O
O
O
OH
OH
OH
(D)
2. Identificao e quantificao de substncias isoladas por UPLC-
PDA/ESI+ - QTOF
2.1 Equipamento
O equipamento utilizado foi um cromatgrafo lquido Acquity da
marca Waters, equipado com um detector de arranjo de fotodiodos (PDA)
acoplado a Quadrupole Time of Flight (Q-ToF) (Waters Synapt G1), (Waters
Corp., Milford, MA, USA). Os dados foram processados por software da Waters,
MassLynx V4.1.
2.2 Condio experimental
Todas as anlises foram realizadas em modo positivo e V ptico (ESI-
V +), e usando sistema de cromatografia de fase reversa. A coluna utilizada para
o mtodo UPLC foi um Acquity UPLC BEH C18 (1.7m 2.1 mm x 100 mm).
Os componentes da fase mvel foram A: gua com 0,1% de cido frmico e B:
acetonitrila. A coluna foi eluda no fluxo 0,2 ml.min-1. O gradiente comeou com
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70
15% de B em A e manteve-se durante 5 minutos, aumentando para 35% em 10
minutos, para 55% em 20 minutos, para 70% em 22 minutos, para 80 % em 24
minutos, retornando s condies iniciais gradualmente em 35 minutos e mantido
durante 2 minutos para o equilbrio da coluna. O volume injetado foi de 1 l.
Os dados de espectrometria de massas foram adquiridos utilizando uma
fonte de eletrospray, faixa de varredura de massa de 70-1000 m / z, temperatura
da fonte 120 C, temperatura de dessolvatao 250 C, fluxo de gs de cone 10
Lh-1, gs de desolvatao 450 Lh-1 e tenso capilar de 3.0 kV.
Todas as amostras foram preparadas em 1ml de metanol grau LC-MS,
utilizando 10mg de extratos e 1mg de compostos puros (padres). Como
marcador qumico foram utilizados os compostos catequina, pinostrobin e
cryptostrobin.
2.3 Quantificao de compostos
As amostras foram comparadas pelos cromatogramas MS XIC,
utilizando a massa dos compostos para identificao dos mesmos. Para
identificar e quantificar o pinostrobin e o cryptostrobin no cromatograma,
utilizou-se a massa destas substncias para sua extrao, 271. No caso da (-)-
catequina, a sua respectiva massa, de 291, foi utilizada para extrao.
Para calcular a concentrao destes compostos nos extratos e fraes, a
rea total do cromatograma foi relacionada rea composta isolada
(cromatograma padro). A porcentagem em m / m foi transformada em
concentrao mg.g-1, assumindo linearidade.
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71
CAPTULO IV
Composio qumica e atividade antimicoplasmatica de
extratos, fraes e substncias isoladas das folhas e caules de
Eugenia mattosii
Este artigo foi submetido ao peridico Qumica Nova, com fator de impacto
igual a 0.627. Submisso em 02-fevereiro-2018.
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72
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73
Composio qumica e atividade antimicoplasmtica de extratos, fraes e
substncias isoladas das folhas e caules de Eugenia mattosii
Giovana Vechi1, Adrielli Tenfen1, Ariela Mana Boeder2, Lorena Hernandez-
Gmez3, Caio Maurcio Mendes de Crdova2, Franco Delle Monache1, Valdir
Cechinel Filho1
1 Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, Universidade do
Vale do Itaja, CEP: 88302-901, Itaja, SC, Brasil 2 Departamento de Cincias Farmacuticas, Universidade Regional de
Blumenau, CEP: 89030-001 Blumenau, SC, Brasil 3 Centro de Investigacin em Productos Naturales - CIPRONA, Universidad de
Costa Rica, San Jos, Costa Rica
Resumo
A espcie Eugenia mattosii pertence a um gnero importante da famlia
Myrtaceae, conhecida pela diversidade de substncias bioativas, utilizadas na
medicina tradicional para curar diferentes tipos de doenas. Como no h muita
informao sobre esta espcie de Eugenia em literatura, o objetivo deste estudo
foi avaliar a composio qumica e a atividade antimicrobiana das folhas e caules
da E. mattosii. O extrato metanlico de folhas e caules e suas respectivas fraes
de clorofrmio (FCL) e acetato de etila (FAE), alm de trs substncias isoladas,
pinostrobin, cryptostrobin e (-)- catequina, foram avaliados em relao ao seu
potencial antimicrobiano, contra cepas de bactrias sem parede celular,
conhecidas como molicutes. Ambos extratos metanlicos demonstraram
atividade moderada (MIC = 250-500 g.mL-1). As fraes apresentaram
melhores resultados em comparao com o extrato metanlico bruto (MIC = 125-
1000 g.mL-1), especialmente as FAE das folhas, que mostraram atividade em
concentraes de 125-250 g.mL-1 para todas as cepas testadas. O pinostrobin e
o cryptostrobin apresentaram boa atividade antibacteriana contra M. pneumoniae
FH e M. Genitalium, sendo que o pinostrobin apresentou MIC de 12,5 g.mL-1
frente cepa de M. pneumoniae FH. A (-)-catequina no demonstrou atividade.
Em concluso, as fraes de E. mattosii e os compostos isolados (pinostrobin e
cryptostrobin) apresentaram uma promissora atividade antibacteriana.
Palavras-chave: Eugenia mattosii; atividade antimicoplasmatica; pinostrobin;
cryptostrobin, catequina.
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74
1 Introduo
Molicutes so bactrias sem parede celular, responsveis por vrias
doenas humanas e animais, incluindo pneumonia, vaginite e pielonefrite.
Devido resistncia relatada esses microrganismos, essencial buscar novas
terapias antimicrobianas que sejam efetivas contra os molicutes, e o gnero
Mycoplasma considerado de grande importncia para esta classe de bactrias
(LOWE et al., 2014; TAYLOR-ROBINSON, 2017).
Estudos anteriores realizados em nossos laboratrios demonstraram
que algumas espcies do gnero Eugenia, como E. beaurepaireana, E.
brasiliensis, E. umbelliflora, E. hiemalis e E. platysema, apresentaram promissor
potencial antimolicute (BENFATTI et al., 2010; TENFEN et al., 2017;
ZATELLI et al., 2015).
A Eugenia mattosii, foco deste estudo, popularmente conhecida
como Cambui e ocorre no sul do Brasil, entretanto, pouco se conhece sobre sua
composio qumica e atividade biolgica.
Considerando as importantes atividades j descritas para este gnero
e as diversas infeces problemticas causadas por molicutes, este estudo tem
como objetivo avaliar o potencial antimicoplasmtico de extratos, fraes e
substncias isoladas das folhas e caules de E. mattosii, alm de quantificar os
principais compostos por Cromatografia lquida de ultra performance (UPLC).
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75
2 Material e Mtodos
2.1 Anlise fitoqumica
A anlise fitoqumica est descrita no captulo II, item 4.
` Para avaliao do potencial antimicoplasmtico foram utilizados os
extratos e fraes das folhas e caules secos, provenientes da coleta de inverno,
alm das substncias isoladas destas amostras.
2.2 Ativid