estudos da variabilidade genÉtica da mosca...
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ISSN Outubro,2003
0102 - 0110 109
ESTUDOS DA VARIABILIDADE GENÉTICA DA MOSCA BRANCA,
BEMISIA TABACI RAÇA B (HEMIPTERA, ALEYRODIDAE) NO BRASIL
RELATÓRIO FINAL
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia
Brasília 2003
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ISSN Outubro,2003
0102 - 0110 109
ESTUDOS DA VARIABILIDADE GENÉTICA DA MOSCA BRANCA,
BEMISIA TABACI RAÇA B (HEMIPTERA, ALEYRODIDAE) NO BRASIL
RELATÓRIO FINAL
3 República Federativa do Brasil Luiz Inácio Lula da Silva Presidente Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Roberto Rodrigues Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Conselho de Administração José Amauri Dimárzio Presidente Clayton Campanhola Vice-Presidente Alexandre Kalil Pires Dietrich Gerhard Quast Sérgio Fausto Urbano Campos Ribeiral Membros Diretoria-Executiva da Embrapa Clayton Campanhola Diretor-Presidente Gustavo Kauark Chianca Herbert Cavalcante de Lima Mariza Marilena T. Luz Barbosa Diretores-Executivos Embrapa Recursos Genéticos e Bioteconologia Luiz Antonio Barreto de Castro Chefe -Geral Clra de Oliveira Goedert Chefe-Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento José Manuel Cabral de Sousa Dias Chefe-adjunto de Comunicação e Negócios Arthur da Silva Mariante Chefe-Adjunto de Administração
4ISSN 0102 – 0110
Outubro 2003
DOCUMENTOS 109
ESTUDOS DA VARIABILIDADE GENÉTICA DA MOSCA BRANCA, BEMISIA TABACI RAÇA B (HEMIPTERA, ALEYRODIDAE) NO BRASIL
Luzia Helena Corrêa Lima
Paulo Roberto Queiroz
Márcio de Carvalho Moretzsohn
Wendel Neiva Martins Lago
Laura Campos Maria Regina Vilarinho de Oliveira
Brasília – DF 2003
5 Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na: Embrapa - Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W5 Norte (Final) - Brasília, DF CEP 70770-900 - Caixa Postal 02372 PABX: (61) 448-4600 Fax: (61) 340-3624 http://www.cenargen.embrapa.br e.mail:[email protected] Comitê de Publicações da Unidade Presidente: José Manuel Cabral de Sousa Dias Secretária-Executiva: Maria José de Oliveira Duarte Membros: Maurício Machaim Franco
Regina Maria Dechechi G. Carneiro Maria Alice Bianchi Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares Campos Carneiro
Suplentes: Arthur da Silva Mariante Maria Fátima Batista
Supervisor Editorial: Maria José de Oliveira Duarte Normalização Bibliográfica: Maria Alice Bianchi Tratamento de Ilustrações:Altevir de Carvalho Freitas Editoração Eletrônica: Altevir de Carvalho Freitas 1a edição 1a impressão (2003): tiragem Todos os direitos reservados. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei no 9.610).
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Autores
Luzia Helena Corrêa Lima Bióloga Pesquisador a Dra., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,
Cx. Postal 02372, CEP 70.849-970, Brasília, DF. E.mail:
Paulo Roberto Queiroz Estagiário Doutorando UnB, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Márcio de Carvalho Moretzsohn
Pesquisador Doutorando UnB, Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia. E.mail: [email protected]
Wendel Neiva Martins Lago Estagiário Iniciação Científica, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Laura Campos Biólogo MSc., Bolsista CNPq/ PADFIN.
Maria Regina Vilarinho de Oliveira
Bióloga, Pesquisadora Dra., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
E.mail: [email protected]
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AGRADECIMENTOS Os autores agradecem aos parceiros do Projeto “Estudos da variabilidade genética da mosca branca, Bemisia tabaci raça B (Hemiptera, Aleyrodidae) no Brasil”, cuja contribuição permitiu o cumprimento dos objetivos e das metas para o controle integrado da mosca-branca, Bemisia tabaci raça B, utilizando-se agentes naturais, na Região Nordeste do Brasil, liderado pela pesquisadora Maria Regina Vilarinho de Oliveira da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Parceiros do Projeto:
Embrapa Agroindústria Tropical Embrapa Cerrados Embrapa Mandioca e Fruticultura Universidade Federal de Pernambuco Universidade de Brasília Escola Superior de Agronomia de Mossoró PROFRUTAS.
SUPORTE FINANCEIRO: (PADFIN/ CNPq/ MA). CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) PADFIN (Programa de Apoio e Desenvolvimento da Fruticultura do Nordeste) MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento)
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Apresentação
A complexidade do gênero Bemisia, como praga e como vetor de fitoviroses, tem
ficado cada vez mais evidente à proporção que a praga se dispersa nas mais diversas
regiões geográficas do mundo. Os danos econômicos causados à cadeia produtiva de
diversas culturas têm levado a perdas significativas na agricultura mundial. No Brasil,
em aproximadamente dez anos, essa espécie se dispersou para 23 dos 26 estados da
Federação. Os danos econômicos causados pela praga e vetor de viroses, com perdas
na produção e redução na qualidade dos produtos são da ordem de US$ 20 bilhões.
Para o desenvolvimento de estratégias eficazes de controle se faz necessária a
identificação das populações dessa praga existente no Brasil, uma vez que estudos
recentes sugerem que a espécie Bemisia tabaci representa um complexo de
numerosos biótipos, cada qual com suas peculiaridades adaptativas e diruptivas,
exigindo manejos fitossanitários específicos e eficazes. Além disso, o monitoramento
das populações do inseto para detecção de biótipos exóticos deve ser uma constante.
Em linhas gerais, o projeto “Estudos da variabilidade genética da mosca branca,
Bemisia tabaci raça B (Hemiptera, Aleyrodidae) no Brasil” teve como objetivo identificar
e analisar as características genéticas das populações de mosca-branca coletadas no
país, com ênfase à região Nordeste, tendo como suporte procedimentos moleculares
como a técnica de RAPD. Os resultados demonstraram a variabilidade genética entre
as populações estudadas, confirmando o domínio do biótipo B no Brasil.
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Sumário Resumo ............................................................................................................... 10 Objetivos do Projeto .......................................................................................... 11 Descrição do Problema...................................................................................... 12 Materiais e Métodos ........................................................................................... 13 Resultados Finais............................................................................................... 17 Discussão............................................................................................................ 26 Conclusões ......................................................................................................... 28 Recomendação ................................................................................................... 28 Referências Bibliográficas................................................................................. 29
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Resumo
A incidência da mosca-branca em culturas de expressão econômica em 23 estados da
Federação e no Distrito Federal vem causando perdas significativas para a agricultura
brasileira. A correta identificação das espécies e raças e o conhecimento da
variabilidade genética das populações de mosca-branca são essenciais para um
controle e um manejo eficiente dessa praga. Identificar e caracterizar populações de
mosca-branca provenientes de diferentes regiões do Brasil foi o objetivo principal desse
trabalho. Do total coletado foram analisadas 276 amostras quanto à espécie ou raça. A
grande maioria das populações analisadas foi identificada como biótipo B de B. tabaci,
introduzido no início da década de 90 e estaria ocupando nichos ecológicos em áreas
anteriormente infestadas pelo biótipo nativo BR.
11 Objetivos do Projeto
A proposta do projeto “Estudos da variabilidade genética da mosca branca,
Bemisia tabaci raça B (Hemiptera, Aleyrodidae) no Brasil” foi avaliar a população de B.
tabaci no país, nos seguintes aspectos:
1. observar diferenças entre populações em diferentes plantas hospedeiras;
2. observar diferenças entre populações de diferentes localidades;
3. observar a variabilidade genética dentro das populações dependentes de
variações ambientais;
4. monitorar a entrada de novas raças ou biótipos na população presente na
região do semi-árido;
5. monitorar as possíveis variações genéticas entre as populações devido a
ocorrência e utilização de produtos químicos e biorracionais;
6. coletar e caracterizar populações de parasitóides presentes nas culturas da
região do semi-árido.
12 Descrição do Problema
A incidência e os danos causados pelas moscas brancas do complexo Bemisia
tabaci vem causando grandes perdas em culturas de expressão econômica, no Brasil e
no mundo. A dispersão da mosca branca no País e os inúmeros hospedeiros, tornaram
ainda maior e mais difícil o controle dessa praga. A correta identificação das raças e de outras espécies de moscas brancas,
assim como o conhecimento da variabilidade genética das populações é essencial para
um controle e um manejo eficiente dessa praga. Dessa forma, o ajuste de uma
metodologia molecular, para identificar e caracterizar populações de mosca-branca
provenientes de diferentes regiões do Brasil foram os objetivos principais desse projeto.
O uso de marcadores moleculares como RAPD (“Random Amplified Polymorphic
DNA”) Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso gera resultados de fácil detecção e
vêm sendo utilizados em associação a estudos de identificação de raças, bem como
para o estabelecimento de relações filogenéticas entre diferentes espécies ou
populações e a construção de mapas genéticos de interesse econômico. São técnicas
que apresentam muitas vantagens pois independem do estágio de desenvolvimento do
organismo e não são influenciadas pelas condições ambientais.
Essa técnica vem sendo utilizada para a identificação de espécies e raças de
diversos organismos, bem como para o esclarecimento de relações filogenéticas entre
espécies ou populações diferentes (Fungaro & Vieira, 1998).
Evidências recentes sugerem que a espécie Bemisia tabaci representa um
complexo de numerosos biótipos (Perring, 2001). O termo biótipo é utilizado para
designar populações que não apresentam distinções morfológicas, no entanto possuem
outros atributos úteis para a separação das mesmas de outras populações. Até o
momento, 41 populações distintas de B. tabaci foram estudadas em todo o mundo,
sendo que 24 destas populações receberam designação de biótipo e 17 populações
não foram identificadas, continuando sem designação taxonômica De Barro et al.,
2000. Múltiplas técnicas bioquímicas e moleculares suportam a inserção das
numerosas subunidades taxonômicas do complexo B. tabaci em populações,
agrupadas de acordo com a sua localidade (Costa & Brown, 1991; Gawel & Bartlett,
1993; Perring et al., 1993; Haymer, 1994; De Barro & Driver 1997; De Barro et al.,
2000; Moya et al, 2001; Brown et al., 2002; Simon et al., 2003). Assim, sete grupos
principais foram estabelecidos ao redor do mundo, de acordo com sua região
predominante de ocorrência (Perring, 2001).
13
Materiais e Métodos Identificação Morfológica
Adultos de Bemisia tabaci coletados em diferentes plantas hospedeiras nas
diversas regiões do país e foram armazenados em álcool 96% até serem analisados
pela técnica de RAPD. Adultos da raça A e B provenientes da Califórnia, Estados
Unidos, foram utilizados como padrões de referência. Da mesma forma, adultos da
raça A provenientes da colônia de criação da Embrapa-Arroz e Feijão e da raça B
provenientes da colônia de criação da Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia
foram utilizados também como padrões de comparação.
Folhas com ninfas de quarto instar e/ou “pupas” foram transferidas para sacos
de plástico contendo papel umedecido. Os sacos foram etiquetados, transferidos para o
laboratório e mantidos em temperatura de 8oC até o momento da identificação
morfológica. Indivíduos adultos foram coletados com o auxílio de um frasco aspirador e
acondicionados em recipientes de vidro, fixados em álcool 96% e armazenados a –
20oC, para posterior identificação morfológica e molecular. Os vidros foram etiquetados
com um número de acesso e transferidos para o banco de populações de mosca-
branca. O banco de populações de mosca-branca é mantido na Unidade Entomológica
do Laboratório de Quarentena Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia.
Utilizaram-se as chaves de Caballero (1994) e de Martin (1987) para
identificação dos indivíduos coletados.
Identificação Molecular
Extração de DNA - Um simples método de extração de DNA foi utilizado, de
acordo com a metodologia modificada por Lima et al. (2000). Uma única fêmea adulta
foi colocada em tubos plásticos de 1,5 mL, macerada em 60 µL de tampão de lise (Tris-
HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,30%, proteinase K 60 µg/mL) e
incubada a 65°C. Após 20 min, o homogenato foi incubado a 95°C por 7 min e
congelado imediatamente a -20°C.
14Análises RAPD - As reações de amplificação seguiram, também, a
metodologia adaptada por Lima et al. (2000). As amplificações foram feitas em volumes
de 30 µL, contendo tampão 1X (Tris-HCl 6 mM pH 8,8, KCl 50 mM, MgCl2 2 mM),
dNTPs 0,2 mM, primer 0,4 µM (OPA-02, OPA-04, OPA-10 ou OPA-13, Operon
Technologies), 2 U de Taq DNA polimerase (Pharmacia) e 4 µL de DNA. As
amplificações foram efetuadas em termociclador MJ Research, modelo PTC 100,
programado para uma etapa inicial de 3 min a 94oC, seguindo-se 45 ciclos (1 min a
93oC, 1 min a 35oC e 2 min a 72oC) e uma extensão final de 5 min a 72oC. Os produtos
de amplificação foram separados em géis de agarose a 1,5 % de concentração,
submersos em tampão TBE 1 X (Tris-borato 90 mM, EDTA 1 mM), corados em solução
de brometo de etídio (0,5 µg mL-1) e fotografados no sistema Eagle Eye (Stratagene).
Marcadores de massa molecular (Ladder 100 pares de bases - GIBCO) foram usados
para a determinação do tamanho dos fragmentos amplificados.
Análise dos dados - Os dados foram analisados de acordo com a presença (1)
ou ausência (0) da banda no gel, sendo estimada a similaridade genética entre os
indivíduos utilizando-se o índice de Jaccard. Em seguida, um dendrograma (Figura 4)
foi construído usando-se o método UPGMA (unweighted pair-group method analysis).
O programa utilizado no processamento total das análises foi NTSYS-pc 2.02 (Rohlf,
1993). A identificação das espécies e raças foi realizada por comparações com
padrões de RAPD conhecidos para os organismos em questão.
Análise Molecular de Parasitóides - Algumas espécies de parasitóides foram
analisadas utilizando-se a metodologia de RAPD-PCR. As reações de extração e
amplificação seguiram, a metodologia adaptada por Lima et al. (2000). O material
analisado foi Encarsia grupo lutea (Petrolina, PE e Teresina, PI) e Encarsia formosa
e E. lycopersici (Hymenoptera, Aphelinidae) (Piracicaba, SP).
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TABELA 1 Resultado da identificação de populações de mosca-branca, utilizando-se a técnica de
RAPD-PCR REGIÃO NORTE
Estado Cultura Mosca Branca
Roraima Cucumis melo Bemisia tabaci biótipo B Rondônia Cucumis sativus Bemisia tabaci biótipo B Tocantins Citrullus lanatus, Brassica
oleracea, Latuca sativa, Bemisia tabaci biótipo B
REGIÃO NORDESTE Ceará Cucumis sativus, Lycopersicon
esculentum, Capsicum annuum, Cucumis melo,
Citrullus lanatus, Brassica oleracea, Cucurbita moschata,
Cucurbita pepo, Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata,
Gossypium hirsutum, Glycine max, plantas daninhas.
Bemisia tabaci biótipo B
Rio Grande do Norte Citrullus lanatus, Brassica oleracea, Cucurbita moschata,
Lycopersicon esculentum, Capsicum annuum, Cucumis
melo, Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata, Plantas
invasoras, Manihot esculenta,
Bemisia tabaci biótipo B
Alagoas Citrullus lanatus, Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata,
Cucurbita moschata, Chrysanthemum sp.,
Dendranthema grandiflora,
Bemisia tabaci biótipo B
Paraíba Gossypium hirsutum Bemisia tabaci biótipo B Pernambuco Lycopersicon esculentum,
Cucumis melo, Citrullus lanatus, Arachis hypogaea,
Gossypium hirsutum, Brassica oleracea, Cucumis sativus,
plantas daninhas,
Bemisia tabaci biótipo B
Piauí Citrullus lanatus, , Lycopersicon esculentum,
Bemisia tabaci biótipo B
Maranhão Glycine max, Bemisia tabaci biótipo B Bahia Gossypium hirsutum,
Cucurbita moschata, Cucumis sativus, Solanum gilo, Solanum melongena,
Lycopersicon esculentum, Citrullus lanatus, Cucumis
melo, Durante repens, Manihot esculenta,
Bemisia tabaci biótipo B, Aleurothrixus aepim, Bemisia
tuberculata,
REGIÃO SUDESTE São Paulo Glycine max, Solanum
melongena, Vitis labrusca, Gossypium hirsutum, Chrysanthemum sp.,
Bemisia tabaci biótipo B
16Dendranthema grandiflora,
Phaseolus vulgaris, Minas Gerais Brassica campestris,
Abelmoschus esculentus, Cucumis anguria, Brassica oleracea, Daucus carotae,
Cucumis sativus, Capsicum annuum, Gossypium hirsutum,
Solanum gilo, Solanum tuberosum, Phaseolus vulgaris, Lycopersicon
esculentum, Glycine Max, Citrus reticulata, Vigna unguiculata, Euphorbia heterophylla, Manihot
esculenta,
Bemisia tabaci biótipo B e biótipo BR, Aleurothrixus
aepim,
Rio de Janeiro Cucumis sativus, Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata, Lycopersicon esculentum,
Hibiscus esculentus, Cucurbita moschata, Brassica oleracea,
Capsicum annuum,
Bemisia tabaci biótipo B e biótipo BR
Espírito Santo Carica papaya, Brassica campestris, Brassica oleracea,
Bemisia tabaci biótipo B
REGIÃO CENTRO-OESTE Mato Grosso Glycine max, Senna
obtusifolia, Hibiscus esculentus, Euphorbia heterophylla, Brassica
oleracea, Brassica campestris, Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata, Gossypium hirsutum, Lycopersicon
esculentum, plantas daninhas.
Bemisia tabaci biótipo B e biótipo BR
Goiás Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata, Cucurbita
moschata, Lactuca sativa, Brassica oleracea, Brassica campestris, Lycopersicon
esculentum, Hibiscus esculentus, Citrullus lanatus,
Cucumis sativus, Glycine max,
Bemisia tabaci biótipo B e biótipo BR
Mato Grosso do Sul Stylosanthes guianensis, Leguminosa Forrageira,
Bemisia tabaci biótipo B, Bemisia tuberculata,
Distrito Federal Cucurbita moschata, Glycine max, Brassica oleracea,
Brassica campestris, Lycopersicon esculentum, Phaseolus vulgaris, Vigna unguiculata, Gossypium
hirsutum, Solanum tuberosum, Cucumis sativus, Solanum
melongena, plantas daninhas,
Bemisia tabaci biótipo B e biótipo BR
REGIÃO SUL Rio Grande do Sul Lycopersicon esculentum, Bemisia tabaci biótipo B
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Resultados Finais ANO 1999/ 2000
MOSCA BRANCA
Durante os anos de 1999 e 2000, em todas as áreas de cultivo da região
Nordeste, um número populacional expressivo desse inseto foi detectado em culturas
como tomate, melão, melancia, uva, algodão e plantas invasoras. As perdas, na
maioria das pequenas propriedades chegaram a 100%: nos estados de Ceará e Rio
Grande do Norte, as perdas na cultura de melão e melancia variaram entre 30 e 100%.
Em Pernambuco, a situação se tornou caótica nas culturas de tomate, onde a praga
além da alimentação direta induzindo sérias desordens fitotóxicas, atuou como
transmissor do geminivírus disseminando-o, principalmente na região do Vale do São
Francisco, na Bahia e Paraíba.
Nas fazendas, durante as coletas, observou-se também a presença de plantas
daninhas, como hospedeiros secundários, em meio às plantações de melão e
melancia.
Na região de Mossoró (RN), a aplicação excessiva e desordenada de defensivos
químicos e o clima quente favoreceram, no inseto, a resistência aos agrotóxicos assim
como a adaptação, o aumento e a dispersão da mosca branca nas propriedades
agrícolas locais. Em algumas dessas propriedades, como foi o caso da Fazenda
Agricol, no município de Baraúna, foi observada grande densidade populacional de
mosca branca, em média 15 adultos/folha de melão.
Foram feitas coletas de adultos de Bemisia tabaci em várias plantações,
principalmente de melão e melancia, na região de Mossoró – RN e do semi-árido,
durante o período de janeiro a novembro de 1999. As amostras coletadas foram
armazenadas em álcool 96% até serem analisadas, utilizando-se marcadores
moleculares como RAPD.
Durante as análises realizadas nos anos de 1999/ 2000, as populações que
antecederam à entrada da raça B passaram a ser chamada de raça BR, para efeito de
estudos das populações brasileiras de B. tabaci.
Com base nas análises de identificação das raças constatou-se a presença de
apenas duas raças na região (B. tabaci raça BR e raça B) e viu-se a necessidade de
um estudo genético mais detalhado da raça recém introduzida e que apresentou
grande diversidade genética entre e dentre seus indivíduos.
18
As amostras de Bemisia tabaci sp. coletadas e identificadas de acordo com a
raça estão relacionadas na tabela 1, segundo as culturas hospedeiras e as respectivas
localidades de origem.
Perfil Molecular de Parasitóides - O uso de controle biológico é
extremamente importante, dentro da abordagem integrada para diminuir o impacto do
inseto nos agroecossistemas brasileiros. Algumas espécies de parasitóides foram
detectadas sobre populações de Bemisia tabaci, durante coletas e monitoramento
realizados por pesquisadores envolvidos com a mosca branca e enviados para
identificação e obtenção do perfil molecular, utilizando-se RAPD: Encarsia grupo
lutea e Encarsia formosa e E. lycopersici (Hymenoptera, Aphelinidae). O material
analisado foi Encarsia grupo lutea (Petrolina, PE e Teresina, PI) e Encarsia formosa
e E. lycopersici (Hymenoptera, Aphelinidae) (Piracicaba, SP). Encarsia formosa foi o
parasitóide mais freqüente e abundante entre populações de B. tabaci.
Para exemplificar a análise dos parasitóides, segue mostrado na figura 1 um dos
perfis moleculares obtidos com a utilização do primer OPA-13.
Figura 1 - Perfil do DNA em gel de agarose com a utilização do primer OPA-13. Parasitóides analisados: Encarsia formosa (poços 2-6), Encarsia lutea (poços 7-16),e E. lycopersici. (poços 17-25),
MM E. formosa E. lútea E. lycopersici
19
ANO 2001
Iniciou-se a coleta do ano 2001 observando-se uma baixa ocorrência de mosca
branca no campo e a presença constante do amarelecimento das folhas na plantação
de melão. A causa desse amarelecimento não é conhecida e continua trazendo a morte
precoce das plantas. Sabe-se apenas que esse fenômeno está associado a graves
infestações de mosca branca, umidade relativa elevada e temperaturas baixas.
Na avaliação de mosca-branca foram encontradas 20 ninfas/área de 1cm2 e
com o plantio de 35 dias foram encontrados 6 a 7 adultos por folha na cultura de melão.
Das amostras analisadas, 61 foram identificadas como biótipo B de Bemisia
tabaci, sendo 05 Bemisia tabaci biótipo BR e 08 não foram identificadas. Todas as
amostras coletadas foram registradas no banco de mosca-branca da Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia.
Os padrões de bandas produzidos por cada população analisada foram
comparados com os padrões de mosca branca identificadas previamente como sendo
biótipo B e BR. A partir dos resultados obtidos pode-se verificar que o biótipo B de B. tabaci é o
biótipo predominante em todo o território brasileiro. No Brasil, apenas o controle químico tem sido utilizado para controlar as
populações da mosca branca. Sabe-se que esta espécie adquire resistência rápida a
esses produtos, o que sugere a divergência genética encontrada na raça B no Brasil. A raça BR ainda é encontrada em baixas populações em praticamente todas as
regiões e plantas hospedeiras e que sua presença é notada, principalmente, após a
colheita da soja. Durante um período ocorre um aumento expressivo de seus indivíduos
e no período seguinte há um deslocamento dos mesmos para outras plantas
hospedeiras em diferentes áreas, predominando sempre, a raça B. Esse fato foi
observado pela equipe porém faltam dados mais concretos para a sua divulgação na
literatura.
20
ANO 2002
As populações de mosca-branca coletadas no período de 1999 a 2002 e
provenientes de diferentes plantas hospedeiras foram identificadas e caracterizadas
utilizando-se marcadores moleculares – RAPD. As populações estão relacionadas na
Tabela 1, sendo a grande maioria pertencente ao gênero Bemisia.
Com base nas 44 bandas polimórficas obtidas com as análises de RAPD foi
construída uma matriz de dados binários relativos à presença ou ausência de cada
banda em cada população. Esta matriz foi usada para calcular os coeficientes de
similaridade de Jaccard e, a partir desses dados, foi construído um dendrograma pelo
método UPGMA, dentro do programa NTSYS-pc, versão 2.0 (dado não apresentado).
Observou-se a existência de grande variabilidade entre as populações, considerando-
se o limite de 40% de similaridade genética, com 0,67 de similaridade média entre
todos os indivíduos analisados. A análise de variância molecular (AMOVA) mostrou que
da variabilidade genética total, 55,28% deve-se a diferenças entre indivíduos dentro de
populações enquanto 22,13% deve-se às diferenças entre populações dentro de cada
cultura amostrada e 22,59% deve-se à diferenças entre culturas.
Um resumo dos resultados das análises de agrupamento, fundamentado no
dendrograma construído com as 139 amostras analisadas está esquematizado na
figura 2. Quatro grupos principais tornaram-se evidentes. O primeiro grupo contendo
toda a população do biótipo B de B. tabaci de diferentes localidades do Brasil, tendo
como referência às populações de B. tabaci biótipo B coletadas em cultura de melão
nos EUA. Esse grupo está basicamente dividido em quatro subgrupos. O primeiro
subgrupo consiste de indivíduos coletados em soja no Ceará. O segundo inclui os
indivíduos coletados nas culturas de couve (Goiás), algodão (Bahia) e abóbora (Rio de
Janeiro), seguido de quatro agrupamentos derivados das análises de soja (SP), feijão
(CE), pepino (RJ) e tomate coletado no Rio Grande do Norte. A análise da população
de B. tabaci biótipo B encontrada em soja (SP) apresentou uma similaridade de 85 %
em relação às populações coletadas em feijão (CE), pepino (RJ), e tomate (RN). Por
sua vez, as populações encontradas em feijão e pepino apresentaram maior
similaridade (97 %) em relação à população de tomate (95 %) e soja (94%) coletada
em S.Paulo. O terceiro subgrupo consiste da cultura de melão coletado nos estados do
Ceará e Roraima apresentando uma similaridade de 80% em relação às populações
coletadas em algodão (MG), malva (PE) e mandioca (RN), e entre essas três, a relação
filogenética foi mais próxima, em torno de 90 %. O quarto subgrupo inclui as
21
populações coletadas em uva (SP) e tomate (CE), com uma relação filogenética entre
elas em torno de 90 %. O segundo grupo de importância inclui populações de B. tabaci
biótipo BR, coletadas em algodão nas proximidades de Brasília, DF. No terceiro e no
quarto grupo estão incluídas populações que foram utilizadas como padrão. São elas
as espécies de mosca-branca, Trialeurodes vaporariorum e Aleurodicus cocois e
também as populações de B. tabaci biótipo A, coletadas em algodão no Arizona, EUA.
Os resultados sugerem a existência de grupos e subgrupos de B. tabaci biótipo B
formados de acordo com a planta hospedeira e não com a região geográfica onde as
populações foram coletadas. Com isso, métodos de controle e manejo dessa praga
estabelecida para uma cultura em determinada região, provavelmente, funcionarão
para a mesma cultura em outras regiões. Por outro lado, esses métodos poderão não
funcionar para uma cultura diferente, localizada na mesma região.
As análises de agrupamento mostraram, ainda, a grande diferenciação entre o
biótipo B e os biótipos A e BR. Esse resultado mostrou a necessidade da utilização de
novos marcadores para uma definição mais precisa com relação à diversidade genética
entre as populações do biótipo B e a taxonomia entre as formas A, B e BR.
22
Figura 2 - DISTRIBUIÇÃO DAS POPULAÇÕES DE Bemisia tabaci NO BRASIL.
Subgrupo 1Soja (CE)
Soja (SP) Feijão (CE) Pepino (RJ) Tomate (RN)
Subgrupo 2Couve (GO), Algodão (BA)
Abóbora (RJ)
Mandioca (RN) Algodão (MG),Malva (PE)
Subgrupo 3Melão
(CE e RR)
Subgrupo 4Uva (SP), Tomate (CE)
Grupo 1Padrão Utilizado
B. tabaci biótipo BMelão (California-EUA)
Grupo 2B. tabaci biótipo BR
AlgodãoBrasília - D.F.
Grupo 3Padrões Utilizados
(Trialeurodes vaporariorum)(Aleurodicus cocois)
Grupo 4Padrão Utilizado
B. tabaci biótipo AAlgodão (Arizona-EUA)
Bemisia tabaciNo Brasil
Distribuição das Populações
23
POPULAÇÕES DE MOSCA BRANCA NO DISTRITO FEDERAL
Populações de mosca branca foram coletadas na região do Distrito Federal
em diferentes culturas (algodão, mandioca, berinjela, tomate, pepino, abóbora e
feijão) tanto a campo quanto em casa de vegetação (Tabela 2).
Os indivíduos coletados foram analisados quanto à variabilidade genética
por meio da técnica de RAPD-PCR (Figura 3).
As análises moleculares de DNA feitas nas populações de mosca branca
coletadas no Distrito Federal produziram 3 agrupamentos principais, sendo o
primeiro formado apenas pelas populações coletadas em abóbora, o segundo por
populações coletadas em pepino e feijão e o terceiro, pelas populações
encontradas em culturas de berinjela e tomate (Figura 4).
As populações de mosca-branca presentes em culturas de feijão e pepino
apresentaram uma similaridade genética de aproximadamente 40% enquanto que
para as populações presentes em culturas de berinjela e tomate foi de 30%. Não
houve uma diferença significativa nas análises moleculares relacionadas aos
insetos coletados tanto em casa de vegetação quanto a campo.
As análises de agrupamento e a diversidade genética encontrada nas
populações coletadas em cultura de abóbora mostraram uma diferenciação das
demais populações analisadas, formando um agrupamento à parte, constituído de
subgrupos intraespecíficos revelado pela construção de um dendrograma (dado
não apresentado).
Estes resultados sugerem que as populações de um mesmo biótipo possam
se agregar de acordo com a cultura hospedeira.
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Tabela 2 - Populações da mosca branca coletadas no Distrito Federal.
Código Origem Cultura Espécie
2261 Vitrine Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Algodão Bemisia tabaci raça BR
2492 Tibau/RN Mandioca Bemisia tabaci - raça B
2633 Chácara 110 – Planaltina/DF Berinjela B. tabaci - raça B
2643 Chácara 126 – Planaltina/DF Tomate B. tabaci - raça B
2653 Chácara 108 – Planaltina/DF Pepino B. tabaci - raça B
2663 Chácara 108 – Planaltina/DF Abóbora B. tabaci - raça B
2884 Casa de vegetação 9/ Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Tomate B. tabaci - raça B
2894 Casa de vegetação 9/ Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Abóbora B. tabaci - raça B
2904 Casa de vegetação 9/ Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Feijão B. tabaci - raça B
1 Biótipo BR de Bemisia tabaci usado como padrão; 2 Biótipo B de Bemisia tabaci usado como padrão; 3 Populações coletadas em campo; 4 Populações coletadas em casa de vegetação na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Figura 3 - Distribuição da população de B. tabaci no Distrito Federal.
M BR B Abóbora
casa vegetação casa vegetação
Tomate TomateAbóbora
campo campo
Análise dos fragmentos de DNA de mosca-branca obtidos de amplificação com o primer OPA-13 em gel de agarose. As letras BR e B correspondem aos biótipos de
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B. tabaci usados como padrão de identificação. A letra M indica o marcador de massa molecular de 100 pb.
BR
Tomate Berinjela B MM
Análise dos fragmentos de DNA de mosca-branca obtidos de amplificação com o primer OPA-15 em gel de agarose. As letras BR e B correspondem aos biótipos de B. tabaci usados como padrão de identificação. A letra M indica o marcador de massa molecular de 100 pb. Figura 4 – Distribuição da população de Bemisia tabaci no Distrito Federal.
Casade
Vegetação
Campo
Abóbora
Grupo 1
Pepino Feijão
Grupo 2
Casade
Vegetação
Campo
Tomate Beringela
Grupo 3
Bemisia tabaciNo Distrito Federal
Distribuição das Populações
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Discussão
A mosca-branca do complexo de raças Bemisia tabaci é uma das principais
pragas da agricultura brasileira podendo ser encontrada em quase todos os
estados brasileiros causando prejuízos cada vez maiores, principalmente em
culturas de leguminosas, frutas e hortaliças. Os danos são causados tanto
diretamente (pragas) pelos adultos e ninfas, quanto indiretamente (vetores), por
meio da transmissão de fitoviroses.
Em 1992, foi detectado um surto desta praga, em plantas de crisântemo, no
interior de São Paulo. Desde então a dispersão da mosca branca no Brasil ocorreu
de forma muito rápida e hoje, a sua presença em 23 Estados da Federação e no
Distrito Federal é um fato. A grande adaptabilidade dos indivíduos dessa espécie a
diferentes temperaturas e pesticidas favoreceu sua dispersão, principalmente na
região nordeste e no semi-árido (Oliveira et al., 1999). Nos estados do Ceará e do
Rio Grande do Norte, o prejuízo no campo chegou a 100 % em áreas de
pequenas propriedades, cultivadas com tomate, melão, melancia e algodão. A
situação tornou-se grave nas culturas de tomate, onde a praga tanto induziu sérias
desordens fitotóxicas, como disseminou o geminivírus na região do vale do São
Francisco, Bahia, Paraíba e Pernambuco. Em Mossoró, RN, em algumas
propriedades, foi observada grande densidade populacional da mosca-branca,
com uma média de 150 ninfas/cm2. Durante os últimos quatro anos, foram
coletados insetos adultos em 43 plantas hospedeiras de 337 localidades para
identificação e análise da variabilidade genética. Do total coletado, foram
identificadas e caracterizadas 276 amostras quanto à espécie e/ou raça. Para a
análise da variabilidade genética foram utilizadas 139 amostras dos biótipos A, B e
o biótipo nativo BR (Lima et al., 1999), além de duas outras espécies de mosca-
branca (Trialeurodes vaporariorum e Aleurodicus cocois). A grande maioria das
populações analisadas foi identificada como pertencente ao biótipo B de B. tabaci
e esse biótipo se encontra disperso por todo o território brasileiro, inclusive em
áreas anteriormente infestadas pelo biótipo BR (Lima et al., 2000). A dispersão
das populações do inseto tem sido acompanhada com freqüência, detectando-se
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a presença de B. tabaci por meio da identificação morfológica e da análise
molecular. Desta forma, a metodologia molecular estabelecida poderá ser
aplicada, rotineiramente, para atender a necessidade de se monitorar a presença
de outros biótipos do complexo B. tabaci e conseqüentemente evitando-se a
entrada de outros ainda inexistentes no país. Haverá também, uma contribuição
no estabelecimento de um manejo de controle das populações de mosca branca
no campo.
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Conclusões 1- Nas localidades onde foram feitas coletas e avaliações de aleirodídeos, a
presença do gênero Bemisia foi bastante ressaltada. No nordeste, a predominância de B. tabaci raça B foi uma constante. O controle populacional da praga foi possível, quando as orientações técnicas foram seguidas, utilizando os métodos de manejo de áreas e destruindo os restos de cultura, após a colheita.
2- Marcadores RAPD mostraram-se de grande utilidade para identificação e rápida análise da variabilidade genética de populações de B. tabaci e outras espécies de Aleirodídeos.
3- A estratégia molecular desenvolvida poderá ser aplicada, rotineiramente, para atender a necessidade de se monitorar a presença de populações específicas de mosca branca no campo.
4- Os resultados obtidos sobre a diversidade genética da população de mosca-
branca no Brasil sugerem a existência de outros ecótipos B de Bemisia tabaci. Ainda não há dados suficientes para uma nova classificação taxonômica de B. tabaci biótipo B e nem para se estabelecer novas raças ou espécies dentro deste “espécie complexo”.
5- O biótipo B de B. tabaci encontra-se disperso por todo o território brasileiro, inclusive em áreas anteriormente infestadas pelo biótipo BR. Portanto, medidas eficientes deverão ser tomadas, evitando-se de forma categórica, a entrada de novas raças e o surgimento de populações resistentes aos defensivos agrícolas.
6 Pode-se afirmar que as populações da raça B de B. tabaci ainda se encontram
em fase de adaptação no país.
Recomendação
Com base nestas informações e utilizando-se de metodologias moleculares complementares ao RAPD, outros parâmetros que possam inferir sobre a identificação de espécies diferentes associadas à diversidade genética poderão servir para auxiliar no controle de medidas fitossanitárias eficientes, não somente para o complexo de espécies B. tabaci como também para outras pragas exóticas que representariam motivos de alerta fitossanitário.
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Referências Bibliográficas
BROWN, S.; MCLAUGHLIN, W.; JEREZ, I. T.; BROWN J. K. Identification and distribuition of Bemisia tabaci (Gennadius)(Homoptera: Aleyrodidae) haplotypes in Jamaica. Tropical Agricultural, v.79, n.3, p.140-149, 2002.
CABALLERO, R. Clave de campo para immaduros de moscas blancas de Centroamérica (Homoptera: Aleyrodidae). Zamorano, Honduras: Escuela Agrícola Panamericana, 1994. p. 4
COSTA, H. S.; BROWN, J. K. Variation in biological characteristics and esterase patterns among populations of Bemisia tabaci, and the association of one population with silverleaf symptom induction. Entomologia Experimentalis et Applicata, v.61, p.211-219, 1991.
DE BARRO, P. J.; DRIVER F. Use of RAPD-PCR to distinguish the B biotype from other biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Australian Journal of Entomology, v.36, p.149-152, 1997.
DE BARRO, P. J.; DRIVER, F.; TRUEMAN, J. W. H.; CURRAN, J. Phylogenetic relationships of world populations of Bemisia tabaci (Gennadius) using ribosomal ITS1. Molecular Phylogenetics and Evolution, v.16, n.1, p.29-36, 2000.
FUNGARO, M. H. P.; VIEIRA, M. L. C. Aplicações da PCR em ecologia molecular. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. (Ed.). Ecologia microbiana. Jaguariúna: Embrapa – CNPMA, 1998. p. 225-227.
GAWELL, N. J.; BARTLETT, A. C. Characterization of differences between whiteflies using RAPD-PCR. Insect Molecular Biology, v.2, p.33-38, 1993.
HAYMER, D. S. Arbitrary (RAPD) primer sequences used in insect studies. Insect Molecular Biology, v.3, p.191-194, 1994.
LIMA, L. H. C.; CAMPOS, L.; MORETZSOHN, M. de C.; NÁVIA, D.; SILVA, O. R. L. e; OLIVEIRA, M. R. V. de. Populações de Bemisia tabaci (Gennadius) raça B no Brasil: análise da diversidade genética por RAPD. Brasília: Embrapa-CENARGEN, 1999. 6 p. (Embrapa-CENARGEN. Pesquisa em Andamento, 22).
LIMA, L. H. C.; NÁVIA, D.; INGLIS, P. W ; OLIVEIRA, M. R. V. Survey of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera:Aleyrodidae) biotypes in Brazil using RAPD markers. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 23, n. 4, p. 1-5, 2000.
LIMA, L. H. C.; CAMPOS, L.; MORETZSOHN, M. C.; NÁVIA D.; OLIVEIRA, M. R. V. Genetic Diversity of Bemisia tabaci (Genn.) Populations in Brazil Revealed by RAPD Markers. Genetics and Molecular Biology, Ribeirão Preto, v. 25, n. 2, p. 217-223, Dec. 2002.
30
MARTIN, J. H. An identification guide to common white pest species of the world (Homoptera: Aleyrodidae). Tropical Pest Management, v. 33, n. 4, p. 298-322, Oct./Dec. 1987.
MOYA, A.; GUIRAO, P.; CIFUENTES, D.; BEITIA, F.; CENIS, J. L. Genetic diversity of Iberian populations of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) based on random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction. Molecular Ecology, v.10, n.4, p.891-897, 2001.
OLIVEIRA, M. R. V.; LIMA, L. H. C. A influência do complexo Bemisia tabaci na agricultura brasileira. A Granja, v. 56, p. 48-49, maio, 2000.
OLIVEIRA, M. R. V.; FERNANDES, E. R.; ROCHA, H. G. C. 1. Alternativas ao controle da mosca branca, Bemisia tabaci raça B, em plantas de melão. Brasília, DF: Embrapa-CENARGEN, 1999. p.1-14. (Embrapa-CENARGEN. Pesquisa Em Andamento, 23)
PERRING, T. M. The Bemisia tabaci species complex. Crop Protection, v. 20, n. 9, p. 725-737, Nov. 2001.
PERRING, T. M.; COOPER, A. D.; RODRIGUEZ, R. J.; FARRAR, C. A.; BELLOWS JUNIOR, T. S. Identification of a whitefly species by genomic and behavioural studies. Science, v.259, p.74-77, 1993.
ROHLF, F. J. NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System,. New York: Applied Biostatistics, 1993. vers. 1.80
SIMON, B.; CENIS, J. L.; DEMICHELIS, S.; RAPISARDA, C.; CACIAGLI, P.; BOSCO, D. Survey of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) biotypes in Italy with the description of a new biotype (T) from Euphorbia characias. Bulletin of Entomological Research, v.93, n.3, p.259-264, 2003.
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