ESTUDO IN SILICO DO ACETATO DE 1'S-1'-ACETOXIEUGENOL E DE SEUS INTERMEDIÁRIOS SINTÉTICOS

Karla Karine Beltrame (IC), (Fundação Araucária), UTFPR,

karlabeltrame@hotmail.com Rafaelle Bonzanini Romero (CO-OR), UTFPR,

rbromero@utfpr.edu.br Adriano Lopes Romero (OR), UTFPR,

adrianoromero@utfpr.edu.br INTRODUÇÃO

A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é hoje um dos maiores problemas

de Saúde Pública a nível mundial, constituindo um desafio constante para toda a comunidade

científica. Apesar do esforço efetuado para prevenir, tratar e compreender os mecanismos patológicos

continua a ser uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo (REN-RONG

et al., 2006). A terapia antirretroviral altamente ativa (HAART, Highly Active Anti-Retroviral

Therapy) é o tratamento utilizado atualmente contra a infecção causada pelo vírus HIV, e se dá pela

associação de vários fármacos que apresentam mecanismos de ação diferentes. Estes fármacos

geralmente são pertencentes a duas classes principais os inibidores de transcriptase reversa, como é o

caso do AZT, e os inibidores de protease, como é o caso do raltegravir e do efavirenz. Esta terapêutica,

cujos alvos são proteínas virais, mostrou-se efetiva na redução da carga viral e atrasou a progressão da

doença na maioria dos casos, porém esses fármacos não previnem nem conseguem curar a infecção

pelo HIV (PROVENCHER et al., 2004).

Esta terapêutica, cujos alvos são proteínas virais, mostrou-se efetiva na redução da carga viral,

bem como no atraso da progressão da doença. Contudo, estes fármacos não previnem nem conseguem

curar a infecção pelo HIV (PROVENCHER et al., 2004). Em geral, a baixa permeabilidade celular e a

elevada toxicidade dos fármacos até hoje utilizados, bem como a fraca adesão à terapêutica por parte

dos doentes verificada em muitos regimes terapêuticos, geram grandes dificuldades no tratamento

(TEMESGEN et al., 2006; AGRAWAL et al., 2006). Por outro lado, a elevada taxa de mutação

associada à emergência de estirpes resistentes a estes fármacos e a latência característica do vírus,

constituem os principais obstáculos que a terapêutica antirretroviral enfrenta, e que conduziram a um

maior investimento no sentido de encontrar novos alvos terapêuticos promissores, com menor

probabilidade de desenvolverem resistências (PROVENCHER et al., 2004), ou novas formas de

terapia (como por exemplo, a terapia gênica) (TEMESGEN et al., 2006; AGRAWAL et al., 2006).

Recentemente, alguns grupos de pesquisa vêm realizando trabalhos com produtos naturais,

especialmente os derivados de plantas, mostrando que muitos apresentam atividade inibitória da

replicação do HIV. Um exemplo é o acetato de 1'S-1'-acetoxichavicol (1, acetato de galangal), isolado

de Alpinia galanga, que mostrou ser um eficaz inibidor da proteína Rev (YE & Li, 2006).

Posteriormente, outro grupo de pesquisa isolou o 1'S-1'-acetoxidiidrochavicol (2, acetato de

diidrogalangal) de Alpinia galanga, mas não avaliaram nenhuma atividade biológica com este

composto (YANG et al., 2009). A proteína Rev é responsável pela regulação da expressão de proteínas

virais, mediante o controle da taxa de exportação dos mRNAs. Esta proteína é essencial para a

replicação do HIV, atuando como um interruptor crucial entre a latência viral e a replicação viral.

De Alpinia galanga, foram isolados outros fenilpropanóides {acetato de 1’S-1’-

hidroxichavicol (3) e acetato de 1’S-1’-acetoxieugenol (4)} que apresentam atividades semelhantes ao

acetato de galangal. Outras atividades biológicas e/ou farmacológicas são atribuídas a estes

compostos, tal como para o acetato de acetoxieugenol que mostrou ser um potencial agente

quimioterapêutico contra células de câncer de mama possuindo também uma citoxicidade mais

elevada do que do seu análogo acetato de galangal (HASIMA et al., 2010).

AcO

OAc

AcO

OAc

1 2

AcO

OAc

CH3O

4

AcO

OH

3

Sendo assim, a presente comunicação tem como objetivo relatar o estudo in silico das

entidades químicas envolvidas na rota sintética do acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol.

MATERIAIS E MÉTODOS

A obtenção do (E)-2-metóxi-4-(prop-1-enil) fenol (isoeugenol, 6) foi realizada segundo

metodologia reportada por Carrasco et al. (2008) a partir do eugenol (5).

A obtenção do 2-metóxi-4-(3-metiloxiran-2-il)fenol (7) foi realizada via epoxidação do

isoeugenol (6) utilizando ácido meta-cloroperbenzóico. A obtenção do 4-[(1’S)-1’-hidróxiprop-2-en-1-

il]-2-metoxifenol (8) foi realizada segundo Yadav et al. 2002.

A obtenção do acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4) foi realizada utilizando metodologia

adaptada de Heravi et al. (2006).

As propriedades moleculares do acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4) e de seus intermediários

sintéticos (5-8) foram calculadas, com base em descritores moleculares utilizando a regra dos cinco de

Lipinski, no software Molinspiration Online Property Calculation Toolkit

(http://www.molinspiration.com/). A regra dos cinco de Lipinski estabelece alguns parâmetros

estruturais relevantes para a predição teórica do perfil de biodisponibilidade oral, que está agregada à

absorção e a permeabilidade de possíveis fármacos e depende de cinco parâmetros: (a) número de

grupos aceptores de ligação hidrogênio (nALH) menor ou igual a 10; (b) número de grupos doadores

de ligação hidrogênio (nDLH) menor ou igual a 5; (c) massa molecular (MM) menor ou igual a 500

g/mol; (d) coeficiente de partição octanol-água (milog P) menor ou igual a 5; (e) área de superfície

polar (PSA) menor ou igual a 140 Å. Moléculas que violam mais do que uma destas regras podem ter

problemas com a biodisponibilidade.

O estudo de drug likeness e drug score foi realizado utilizando o programa Osiris Property

Explorer (http://www.organicchemistry.org/prog/peo/). Os valores de drugscore entre 0,1 e 1,0 e um

valor positivo para drug likeness indicam que a molécula avaliada contém grupos frequentes em

medicamentos comerciais. Os efeitos tóxicos teóricos avaliados foram mutagenicidade,

tumorogenicidade, efeitos irritantes e na reprodução humana por meio de cores (vermelho = alto risco,

amarelo = risco moderado e verde = sem risco).

O docking molecular visando estudar a orientação e a afinidade dos compostos 4-8 com quatro

alvos enzimáticos foi realizado na ferramenta online http://Mcule.com (KISS et al., 2012). Cada

composto foi estudado com duas proteases, PDB 1A30 e 1AAQ, e duas transcriptases reversa, PDB

1C0T e 2VG7, utilizadas pelo Vírus da Imunodeficiência Humana - tipo 1. Como comparação,

realizaram-se os mesmos estudos para o composto raltegravir.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4) foi sintetizado a partir do eugenol comercial quatro

etapas com rendimento global de 65% (Imagem 1). A etapa chave da rota sintética foi a redução

enantiosseletiva da cetona 7 utilizando Daucus carota. As demais reações envolveram metodologias

reacionais clássicas e bem estabelecidas na literatura. A pureza dos compostos foi avaliada por

cromatografia em camada delgada e a identificação esta sendo realizada por Ressonância Magnética

Nuclear de 1H e de 13C.

HO

CH3O

O

65

HO

CH3O

HO

CH3O

HO

OH

CH3O

AcO

OAc

CH3OSS

4

7

8

Imagem 1 - Rota sintética utilizada para a síntese do acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4).

FONTE: Beltrame et al. (2013).

As propriedades moleculares e dados de Drug Likeness foram calculadas, com base em

descritores moleculares, utilizando a regra dos cinco de Lipinski, no software Molinspiration Online

Property Calculation (Tabelas 1 e 2).

Tabela 1 - Propriedades moleculares calculadas no software Molinspiration.

Composto MilogP TPSA Natoms MW nON nOHNH Nviolation Nrotb Volume

5 2,100 29,462 12,0 164,204 2 1 0 3 162,140

6 2,379 29,462 12,0 164,204 2 1 0 2 161,585

7 1,444 46,533 13,0 178,187 3 1 0 3 164,322

8 1,109 49.690 13,0 180,203 3 2 0 3 170,184

4 1,753 61,844 19,0 264,277 5 0 0 7 243,207

FONTE: Beltrame et al. (2013).

Tabela 2 - Dados de Drug Likeness calculados no software Molinspiration.

Composto ligante

GPCR

Modulador

de canal de

íon

Inibidor

de quinase

Ligante de

receptor

nuclear

Inibidor

de

protease

Inibidor

de enzima

5 -0,86 -0,36 -1,14 -0,78 -1,29 -0,41

6 -1,02 -0, 53 -1,06 -0,70 -1,35 -0,51

7 -0,88 -0,45 -1,12 -0,84 -1,13 -0,43

8 -0,45 -0,26 -0,83 -0,46 -0,99 -0,25

4 -0,29 -0,19 -0,52 -0,08 -0,41 -0,03

FONTE: Beltrame et al. (2013).

Os dados de Drug Likeness e de propriedades moleculares calculados (Tabelas 1 e 2) estão de

acordo com a regra dos cinco de Lipinski e sugerindo então, que as substâncias estudadas possuem

potencialidade de inibição de enzimas. Dentre todas as substâncias estudadas, o acetato de 1’S-1’-

acetóxieugenol (4) é a substância que possui maior potencialidade, ou seja, o estudo nos sugere

potencial de biodisponibilidade oral, que é um requisito essencial para substâncias antitumorais

utilizadas no tratamento do câncer.

Os dados de toxicidade e de Drug Likeness foram calculados no software Osiris (Imagem 2).

Segundo dados do programa Osiris, para o acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4), é observado apenas

efeito irritante de alto risco, cujo efeito pode estar associado ao grupo indicado em vermelho (Figura

2), indicando talvez que este grupo deve ser modificado. Já os outros compostos, 5-7 possuem efeitos

mutagênico e tumorogênico de alto e/ou moderado risco. Efeito irritante de alto risco é observado para

os compostos 5, 6, 8 e 4.

Imagem 2 - Dados de toxicidade e de Drug Likeness calculados, na ferramente online Osiris, para os

compostos 4-8. FONTE: Beltrame et al. (2013).

Entre os compostos avaliados, o acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4) é o que apresenta valores

de drug likeness, drug score e de toxicidade ideais, indicando que este produto natural possui

potencial farmacológico.

O estudo de docking molecular dos compostos 4-8 com duas proteases, PDB 1A30 e 1AAQ, e

duas transcriptases reversa, PDB 1C0T e 2VG7, utilizadas pelo Vírus da Imunodeficiência Humana é

apresentado na tabela 3. Nesta ferramenta, valores negativos indicam interações favoráveis com o alvo

enzimático. Pode-se observar, então, que todos os compostos estudados apresentam interações

favoráveis com as enzimas estudadas. No entanto, todas as interações são mais fracas do que as que

ocorrem com o composto raltegravir - utilizado atualmente no tratamento contra o vírus HIV.

As visualizações do acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4) no sítio ativo da enzima transcriptase

reversa (PDB 1C0T), com e sem representação da superfície da enzima, são apresentadas na Imagem

3. Entre as interações enzima-substrato destacam-se as interações intermoleculares do tipo ligação de

hidrogênio estabelecidas entre: (i) o grupo amina livre do resíduo glicina 142 com o oxigênio do grupo

carboxila (éster fenólico); (ii) o grupo fenol presente no resíduo tirosina 270 com o oxigênio da

metoxila.

4 5 6 7 8

Tabela 3 - Valores de docking score obtidos na ferramenta Mcule.

Protease Transcriptase reversa Composto

PDB 1A30 PDB 1AAQ PDB 1C0T PDB 2VG7

5 - 5,7 - 5,7 - 7,2 - 6,8

6 - 5,8 - 6,0 - 7,5 - 6,7

7 - 5,9 - 5,8 - 6,8 - 6,7

8 - 5,7 - 5,5 - 7,2 - 6,8

4 - 6,6 - 6,5 - 8,2 - 7,8

Raltegravir - 9,5 - 9,5 - 7,3 - 9,9

FONTE: Beltrame et al. (2013).

Imagem 3 - Visualizações do acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4) no sítio ativo da enzima transcriptase reversa

(PDB 1C0T), com e sem representação da superfície da enzima. FONTE: Beltrame et al. (2013).

CONCLUSÃO

A partir dos estudos realizados permitiu-se estabelecer uma rota sintética simples e eficiente

para a síntese do acetato de 1’S-1’-acetóxieugenol (4), um produto natural isolado da planta Alpinia

galanga, e este possui potencial atividade contra o câncer de mama.

O estudo in silico feito com os programas Osíris e Molinspiration é de grande auxílio para a

pesquisa com novos fármacos, pois pode direcionar novos estudos com possíveis fármacos. Esses

estudos corroboram com os dados da literatura que reportam as atividade biológicas do acetato de 1’S-

1’-acetóxieugenol (4).

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à fundação Araucária pela bolsa de Inovação e pelo apoio financeiro recebido.

REFERÊNCIAS

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galangal (L.) Swartz] Extracts. J. Agric. Food Chem., v.57, p. 3286-90, 2009. YE, Y.; LI, B. 1'S-1'-Acetoxychavicol acetate isolated from Alpinia galanga inhibits human immunodeficiency virus type 1 replication by blocking Rev transport. J. Gen. Virol., v. 87, p. 2047-53, 2006.