Estudo de promotores: a técnica de DNA footprinting

RNA

A B C

Filme raio X ou Phosphoimager?

In Situ Hybridization

In situ hybridization of a Drosophila embryo with probes for even-skipped (red) and hunchback (green).

Nuclear Run on “fotografia”

Núcleo dehepatócito

Núcleo decel de rim

Transcrição constitutivaTranscrição específica em hepatócitos

F E D C B AK J I H G LR S T V X Z

DNA imobilizado em filtros

RT-PCR

- R

T+

RT

Quantificação de RNA

por Real-Time PCR

Detecção de fluorescência gerada em cada ciclo de amplificação:

- SYBR green- Primers fluorescentes

Determinação do limiar de detecção Ct

O valor de Ct é correlacionado com a quantidade inicial de DNA amplificado

Estudos de expressão de mRNA em escala genômica:

High throughput analysis

– Microarrays• cDNAs• Oligos• Gene chips (Affymetrix)

– ESTs

– SAGE

Spotter – podem ser oligos ou cDNA

Estudos de expressão de mRNA em escala genômica: DNA Microarray

Cada cDNA de uma cor (vermelho ou verde)Igualmente ligados = amarelo

O chip

Sintese na lamina (chip)

Affymetrix

Estudos de expressão gênica: análise e quantificação de RNA

Northern blotRT-PCR e Real Time RT-PCR

Técnicas de estudo da regulação da expressão gênica DNA footprintingBand shiftTransfecção com gene reporterDuplo-híbridoCHIP (chromatin immunoprecipitation

Técnicas de estudo de expressão gênica em escala genômica

DNA MicroarrayAnálise de EST (expressed sequence tags) SAGE (serial analysis of gene expression)

Quantificação da expressão de um mRNA

- Northern blot e RUN ON

- Proteção à RNAse H (RNA radioativo pareia)

- RT-PCR (reverse transcribed)

- Real Time PCR

Estudo de promotores: transfecção c/ gene repórter

Luciferase assay

Genes repórteres- CAT- Luciferase- -gal (controle de transfecção)

Estudo de promotores: a técnica de band-shiftEletrophoretic Mobility Shift Assay EMSAEletrophoretic Mobility Shift Assay EMSA

CHIP: Imunoprecipitação da cromatina

Análises de EST

SAGE: Serial Analysis of Gene Expression

Duplo-híbrido em levedura

Estudos de expressão de mRNA em escala genômica: DNA Microarray

Yeast genome/proteome database: 12Mb ~6000 genes (50% with assigned function)

10% involved in transcription141 with their activity tested:

myc-tagging

Anti-Myc Hybridize to DNA chip with6361 spots, representing allthe known intergenic regions in the yeast genome. Average size of the spotted PCR = 480 bp

CHIP e Microarraypodem identificar todos os genes regulados por um mesmo fator de transcrição

6361 spots, representing all of the known intergenic regions in the yeast genome. (average size = 480 bp)

Identificação de sequencias regulatórias

reconhecidas por uma RBP

Estudo da regulação

da tradução

Monossomose subunidadesribossomais

Polissomos

Frações contendo mRNA associadoa polissomos cada vez maiores

Marcação de cDNA e hibridização

Uso de Microarray para identificação de genes associadosa polissomos