UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

TAIANA DE ARAÚJO CONCEIÇÃO

ESTUDO DA PRODUÇAO DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS POR FUNGOS AGARICOMYCETES CULTIVADOS EM

RESÍDUOS AGRO-INDUSTRIAIS DO ESTADO DA BAHIA

Feira de Santana, BA

2010

ii

TAIANA DE ARAÚJO CONCEIÇÃO

ESTUDO DA PRODUÇAO DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS POR FUNGOS AGARICOMYCETES CULTIVADOS EM

RESÍDUOS AGRO-INDUSTRIAIS DO ESTADO DA BAHIA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como

requisito para obtenção do título de mestre

Orientador: Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto (UEFS)

Co-orientador: Prof. Dr. Hélio Mitoshi Kamida (UEFS)

Feira de Santana, BA 2010

iii

Ao meu pai Emanuel in memorian, dedico.

iv

AGRADECIMENTOS

A DEUS, TODA HONRA, TODA GLÓRIA E TODO LOUVOR!

À MINHA FAMÍLIA, MEU ALICERCE: VOVÓ MARLENE, DINDO WILÓ, TIA

GUEGA, TIO BINHO, TIA QUINHA, TIA SANDRA, TIA BETE, TIA LITA E TIA LILI.

AOS PRIMOS QUERIDOS.

À MINHA MÃE JÔ E IRMÃ VICTÓRYA POR TODO APOIO E AMOR

INCONDICIONAL.

AOS QUERIDOS ORIENTADORES ARI E HELIO PELA CONFIANÇA,

ORIENTAÇÃO, AMIZADE E ENSINAMENTOS.

AOS QUERIDOS AMIGOS DO LAPEM: GÓ, CISSA, SÚ, GI, RITA POR TODA

BOA VONTADE, TODA AJUDA! OBRIGADA!

A AMIGO PAULINHO PELA AJUDA NO SEQÜENCIAMENTO DAS AMOSTRAS.

A PROF. DRA. MARIA ALICE NEVES PELA CONCESSÃO DAS AMOSTRAS E

COLABORAÇÃO NO TRABALHO.

AOS AMIGOS DE TODAS AS HORAS PELAS ATIVIDADES EXTRA

LABORATÓRIO, SEM AS QUAIS NÃO TERIA CHEGADO ATÉ AQUI.

AO AMIGO JOÃO RONALDO PELAS DISCUSSÕES QUE MUITO

ENRIQUECERAM O TRABALHO.

A PROF. DRA. MARIA GABRIELA KOBLITZ PELA ORIENTAÇÃO VALIOSA NA

EXECUÇÃO DA METODOLOGIA DA PARTE ENZIMÁTICA.

A FUNDAÇAO DE AMPARO A PESQUISA (FAPESB) PELA CONCESSÃO DA

BOLSA

v

Ó profundidade das riquezas! Tanto da ciência como da sabedoria de Deus.

Quão insondáveis são os seus juízos e quão inescrutáveis os seus caminhos!

Porque quem compreendeu o intento do Senhor? Ou quem foi seu conselheiro?

Ou quem lhe deu primeiro a Ele, para que lhe seja recompensado? Porque Dele,

por Ele e para Ele são todas as coisas; glória pois a Ele eternamente. Amém!

Carta aos Romanos, Cap. 11, vers. 33-36

vi

RESUMO

A lignina é um dos compostos que fazem parte da parede celular dos vegetais

e, devido à sua complexidade estrutural, representa um dos compostos naturais

mais recalcitrantes na natureza. A capacidade dos fungos basidiomicetos de

degradar compostos ligninolíticos, como a madeira, torna este grupo alvo de

pesquisas biotecnológicas e as principais enzimas relacionadas à degradação de

compostos ligninolíticos são as lacases, lignina peroxidase e manganês peroxidase.

Os Agaricomicetos coletados no estado da Bahia mostraram ser potenciais

produtores de enzimas ligninolíticas pela capacidade em descolorir o corante

Remazol Briliant Blue R (RBBR). Os resíduos de cevada e casca de mandioca foram

bons substratos para produção de lignina peroxidase e manganês peroxidase. Os

resultados de otimização de uma linhagem Polyporus tricholoma (Mont.) indicou boa

produção de lignina peroxidase nas condições de substrato com 30% de cevada e

70% de mandioca, umidade de 90%, pH 3,0 e temperatura de 23° C por 7 dias. Já a

linhagem Lentinus tigrinus (Bull.) teve boa produção de manganês peroxidase em

substrato composto de 50% de cevada e 50% de mandioca, umidade de 90%, pH

7,0, e incubação a 28° C por 28 dias. No pH 5,0, a manganês peroxidase teve seu

ótimo de atividade.

Palavras-chave: lacases, manganês peroxidades, lignina peroxidase,

Agaricomycetes, degradação de lignina.

vii

ABSTRACT

Lignin is one of the compounds that constitutes in the cell wall of plants

and, due to their structural complexity, represents one of the most recalcitrant

natural compounds in nature. The capacity of Basidiomycetes to degrade

ligninolytic compounds such as wood, makes this group a target to

biotechnology research. The key enzymes related to degradation of the

ligninolytic compounds are: laccase, lignin peroxidase and manganese

peroxidase. The Agaricomycetes collected in Bahia State, proved to be

potential producers of ligninolytic enzymes by the ability to decolorize the dye

remazol brilliant blue R. The residues of barley and cassava shell shown to be

good substrates for production of lignin peroxidase and manganese

peroxidase. The optimization results of lineage Polyporus tricholoma (Mont.)

indicated good production of lignin peroxidase in conditions of substrate

composition of 30% barley and 70% cassava, 90% moisture, pH 3.0 and

temperature 23° C. The strain Lentinus tigrinus (Bull.) also show good

production of manganese peroxidase in substrate composed by 50% barley

and 50% cassava, 90% moisture, pH 7.0, and incubated at 28° C for 28 days.

At pH 5.0, the manganese peroxidase achieves maximum activity.

Key words: laccase, manganese peroxidadese, lignin peroxidase,

Agaricomycetes, lignin degradation.

viii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DA LITERATURA 3

2.1 DIVERSIDADE E IMPORTANCIA DOS FUNGOS 3

2.2 FUNGOS DEGRADADORES DE LIGNINA 5

2.2.1 Fungos de degradação macia 5

2.2.2 Fungos de degradação marrom 6

2.2.3 Fungos de degradação branca 7

2.3 LIGNINA 7

2.4 ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS 9

2.5 RESÍDUOS AGRO-INDUSTRIAIS 12

2.5.1 Coco 13

2.5.2 Cana-de-açúcar 13

2.5.3 Mandioca 14

2.5.4 Cevada 14

3 MATERIAIS E MÉTODOS 16

3.1 COLETA E PRESERVAÇAO DOS ESPÉCIMES 16

3.2 IDENTIFICAÇAO DOS ESPÉCIMES 17

3.2.1 Taxonomia clássica 17

3.2.2 Taxonomia molecular 17

3.2.2.1 Extração de DNA 17

3.2.2.2 PCR das amostras 17

3.2.2.3 Purificação e seqüenciamento do produto de PCR 18

3.2.2.4 Análise no banco de dados 18

3.3 ISOLAMENTO 18

3.4 SELEÇÃO DE FUNGOS QUANTO À CAPACIDADE DE

PRODUÇÃO DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

19

3.5 OBTENÇÃO E PROCESSAMENTO DOS SUBSTRATOS 19

3.6 OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO PARA PRODUÇÃO

DAS ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

20

ix

3.7 INCUBAÇÃO DOS FUNGOS E OBTENÇÃO DOS

EXTRATOS ENZIMÁTICOS

21

3.8 DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL HIDROGENIÔNICO 21

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ENZIMAS

LIGNINOLÍTICAS

21

3.9.1 Lacase 21

3.9.2 Manganês peroxidase 21

3.9.3 Lignina peroxidase 22

3.10 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA TOTAL 22

3.11 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ESPECÍFICA 23

3.12 EXPERIMENTO DO TIME COURSE 23

3.13 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS

LIGNINOLÍTICAS

23

3.13.1 Efeito do pH na atividade 23

4 RESULTADOS E DISCUSSAO 24

4.1 COLETA, ISOLAMENTO E PRESERVAÇÃO DOS

ESPÉCIMES

24

4.2 SELEÇÃO DE FUNGOS QUANTO À CAPACIDADE DE

PRODUÇÃO DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

27

4.3 IDENTIFICAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS 36

4.4 PRÉ TESTES PARA OS EXPERIMENTOS DE

OTIMIZAÇÃO

39

4.5 OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO PARA PRODUÇÃO

DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS E DETERMINAÇAO DE

SUA ATIVIDADE

41

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

PARA Polyporus tricholoma

43

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

PARA Lentinus tigrinus

48

4.8 EXPERIMENTO DO TIME COURSE 51

4.9 EFEITO DO pH NA ATIVIDADE DE MNP DE Lentinus

tigrinus

54

x

5 CONSIDERAÇOES FINAIS 57

6 REFERÊNCIAS 59

7 APÊNDICES 69

8 ANEXOS 79

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Cálculo do mix para o PCR 18

Tabela 2 Planejamento experimental gerado pelo software Statistica 6.0 20

Tabela 3 Coleta, isolamento e preservação dos espécimes 25

Tabela 4 Linhagens testadas quanto à sua capacidade de

descolorir o corante RBBR

28

Tabela 5 Análise de variância das taxas de crescimento e descoloração

das amostras em meio AEM+RBBR

33

Tabela 6 Atividades enzimáticas das linhagens P. tricholoma (16) e L

tigrinus (27) obtidas nos ensaios de otimização.

42

Tabela 7 Tabela ANOVA para atividade de Lac para P. tricholoma. 43

Tabela 8 Tabela ANOVA para atividade de MnP para P. tricholoma. 43

Tabela 9 Tabela ANOVA para atividade de LiP para P. tricholoma. 43

Tabela 10 Referencias bibliográficas pesquisadas 47

Tabela 11 Tabela ANOVA para atividade de LiP para L. tigrinus. 48

Tabela 12 Tabela ANOVA para atividade de Lac para L. tigrinus. 48

Tabela 13 Tabela ANOVA para atividade de MnP para L. tigrinus. 48

Tabela 14 Atividade específica no time course da MnP para L tigrinus. 52

Tabela 15 Atividade da MnP frente a diferentes valores de pH do meio

reacional.

55

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Molécula de lignina, simulação da estrutura e das possíveis

ligações (KLOCK et al., 2005).

08

Figura 2 Região de coleta: Feira de Santana (UEFS), Salvador (19° BC),

Ituberá, Itaitu e Miguel Calmon.

16

Figura 3 Basidioma das coletas. 26

Figura 4 Descoloração do meio AEM+RBBR dos isolados cedidos pela

Prof.ª Maria Alice Neves com 14 dias de crescimento.

29

Figura 5 Descoloração do meio AEM+RBBR dos isolados coletados no

campus da UEFS e região da Chapada, com 14 dias de

crescimento.

30

Figura 6 L. tigrinus, formação dos primórdios do corpo de frutificação em

placa após 3 semanas de incubação.

31

Figura 7 Gráfico do crescimento e descoloração de RBBR das linhagens

ao longo de 14 dias.

32

Figura 8 Eletroforese do gel com o produto de PCR das amostra TAC 16 e

TAC 27

36

Figura 9 Basidioma do P. tricholoma 37

Figura 10 Basidioma do L. tigrinus 38

Figura 11 Atividade enzimática de Lignina Peroxidase nos pré testes. 40

Figura 12 Atividade enzimática de Lacase nos pré testes. 40

Figura 13 Atividade enzimática de Manganês Peroxidase nos pré testes. 41

Figura 14 LiP: gráfico de Pareto – variáveis significativas. 44

Figura 15 Gráfico de tendência da Lignina Peroxidase: substrato X

temperatura

45

Figura 16 Gráfico de tendência da Lignina Peroxidase: substrato X pH 45

Figura 17 Gráfico de tendência da Lignina Peroxidase: pH X temperatura 46

Figura 18 MnP: gráfico de Pareto – variáveis significativas. 49

Figura 19 Gráfico de tendência da Manganês Peroxidase: pH X substrato 50

Figura 20 Gráfico de tendência da Manganês Peroxidase: temperatura X

substrato

50

Figura 21 Gráfico de tendência da Manganês Peroxidase: temperatura X pH 51

xiii

Figura 22 MnP: gráfico do time course de MnP de L tigrinus. 52

Figura 23 Atividade enzimática de MnP de L. tigrinus no time course. 53

Figura 24 Gráfico da variação de pH dos extratos brutos usados no time

course.

53

Figura 25 L tigrinus no 28º dia de incubação. 53

Figura 26 Gráfico da variação da atividade específica de MnP com pH do

meio reacional.

55

1

1 INTRODUÇÃO

A biodegradação dos materiais lignocelulósicos constitui um dos mais

importantes ciclos do carbono na natureza e o entendimento desse processo, por si,

representa contribuição significativa às ciências naturais (KIRK; CULLEN, 1998).

Os fungos juntamente com os insetos são um dos grupos mais diversos da

Terra. São conhecidos apenas cerca de 105.000 espécies de fungos,

aproximadamente 7% do estimado de 1,5 milhões de espécies. Devido à sua

diversidade e distribuição, ocupam virtualmente todos os biomas terrestres

desempenhando um importante papel ecológico. Estes organismos são

responsáveis pela ciclagem de diversas substâncias no meio, principalmente

madeira e seus compostos (ALEXOPOULOS et al., 1996).

Dentre os componentes da madeira, a lignina é o que apresenta maior

resistência à decomposição. A biodegradação de lignina é um dos mais importantes

fatores determinantes da degradação da madeira e, consequentemente, do ciclo de

carbono na biosfera (CAMARGO, 2003). Esta capacidade de degradar os

componentes da madeira foi quase que exclusivamente associada à produção de

enzimas ligninocelulolíticas extracelulares (BLANCHETTE et al., 1997; KULLMANN;

MATSUMURA, 1997; REDDY et al., 1998; MASON et al., 2001; GELPKE et al.,

2002), sendo que as enzimas melhor caracterizadas são as lacases (Lac), as lignina

peroxidases (LiPs) e as manganês peroxidases (MnP) (CONESA et al., 2002;

MARTÍNEZ, 2002; GUILLÉN et al., 2000).

Os fungos são capazes de utilizar uma grande diversidade de substratos para

sua nutrição, o que permite sua ubiqüidade. Na natureza, existe uma grande

abundância de polímeros que podem ser aproveitados por fungos como fonte

nutricional, principalmente os resíduos de origem vegetal. Os fungos possuem os

mecanismos enzimáticos apropriados para transformar moléculas complexas em

compostos simples pela sua habilidade de deslignificação seletiva. Nas últimas

décadas tem havido uma crescente busca da utilização de resíduos agroindustriais,

devido à incessante demanda das atividades agrícolas. O acúmulo destes resíduos

gera a deterioração do meio ambiente e perda de recursos, com contribuição

significante para o problema da reciclagem e conservação da biomassa. Diversos

processos são desenvolvidos para utilização desses materiais, transformando-os em

compostos químicos e produtos com alto valor agregado. Os resíduos

2

lignocelulósicos são também uma grande alternativa para geração de energia,

devido a sua grande disponibilidade na natureza. O uso de resíduos agrícolas como

substratos em bioprocessos, além de poder ser economicamente viável, ajuda a

resolver os problemas ambientais decorrentes de seu acúmulo na natureza

(MENEZES et al., 2009; ALEXANDRINO et al., 2007).

Este trabalho teve como objetivo geral estudar a secreção de enzimas

ligninolíticas (lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase) por fungos

agaricomicetos (cogumelos s.l.) coletados no estado da Bahia em fermentação semi-

sólida usando como substratos de crescimento resíduos agro-industriais gerados no

semi-árido. E como objetivos específicos (i) coletar isolados de fungos

agaricomicetos (cogumelos s.l.) em diversas regiões do Estado da Bahia (Mata

Atlântica, Semi-árido), realizar sua identificação e purificação dos isolados para

obtenção de culturas puras; (ii) realizar a prospecção de fungos basidiomicetos de

acordo com o potencial de produção de enzimas ligninolíticas utilizando o corante

Remazol Briliant Blue R (RBBR) como indicador e selecionar os isolados que

apresentassem maior potencial de produção de enzimas ligninolíticas; (iii) otimizar

as condições de cultivo, testando diversos substratos lignocelulósicos, visando

indicar as melhores condições de temperatura, pH, umidade, substrato e tempo de

crescimento; (iv) caracterizar bioquimicamente as enzimas produzidas visando

indicar o pH ótimo de atuação das enzimas.

A importância deste trabalho reside no fato de realizar a prospecção de

fungos basidiomicetos do grupo dos Agaricomycetes s.l. (cogumelos) coletados

principalmente na região do semi-árido do estado da Bahia de acordo com o

potencial de produção de enzimas ligninolíticas. Os fungos coletados nesta região

podem ser vantajosos, pois, como são encontrados em condições adversas como

altas temperaturas e baixa umidade, podem apresentar características desejáveis

em diversas aplicações industriais. As enzimas ligninolíticas são reconhecidamente

empregadas em diversas aplicações, como na produção de ração animal e na

degradação de poluentes recalcitrantes. Desta forma, a utilização de resíduos

agroindustriais é uma alternativa para as indústrias de biotecnologia obterem

enzimas hidrolíticas e oxidativas com um custo mais baixo em relação às enzimas

que estão no mercado. Além destas vantagens mencionadas, a produção destas

enzimas utilizando tais resíduos dispõe-se também como uma maneira viável de

agregar valor a estes resíduos, diminuindo assim o impacto ao meio ambiente.

3

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 DIVERSIDADE E IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS

Os fungos são organismos eucarióticos, quimioheterotróficos, de nutrição

absortiva com digestão extracorpórea parcial, predominantemente aeróbicos ou

fermentadores facultativos, que apresentam estrutura corpórea pluricelular micelial

(fungos filamentosos) ou unicelular leveduriforme (leveduras), com parede celular

constituída de quitina e glicanos e tendo o ergosterol como principal esteróide

constituinte da membrana plasmática. Os fungos são predominantemente sapróbios

e a decomposição, particularmente em ambientes terrestres, é a principal função

ecológica desempenhada por este grupo de organismos. Eles podem ainda viver

associados a outros organismos como parasitas ou mutualistas, como também

formarem associações que não compreendem nem relação de parasitismo estrito

nem mutualismo estrito, como no caso dos líquens e fungos endobióticos

(ALEXOPOULOS et al., 1996).

A importância econômica dos fungos para as sociedades compreendem tanto

aspectos negativos, ou danos que estes organismos podem causar à economia,

quanto aspectos positivos, podendo ser aproveitados economicamente. Os aspectos

positivos dos fungos na economia, entretanto, suplantam os negativos. No setor

agropecuário, os fungos já são utilizados para a micorrização de sementes de

algumas plantas cultivadas e no controle biológico de animais, plantas e fungos

parasitas de vegetais agricultáveis. O impacto positivo dos fungos na economia

decorre principalmente do setor industrial, já que diversos produtos são o resultado

direto da atividade biológica desses organismos. Toda a indústria de processos

fermentativos, quer de bebidas ou de alimentos fermentados, baseia-se na utilização

industrial do processo natural de fermentação realizado por fungos. Os fungos são

ainda utilizados para a produção tanto de metabólitos primários como alcoóis, ácidos

orgânicos, enzimas, vitaminas e esteróis, como de metabólitos secundários como

antibióticos, alcalóides e pigmentos. Recentemente, os fungos ainda têm sido

utilizados na biorremediação de compartimentos ambientais (ex. solo)

comprometidos por altos índices de poluentes, de forma que vêm sendo utilizados

para uma decomposição mais eficiente do lixo orgânico, de compostos naturais

recalcitrantes e de xenobióticos, assim como na biosorção de metais pesados e

compostos radioativos que podem ocorrer naturalmente (CARLILE; WATINKSON

4

2001). Além disso, os fungos compreendem uma importante fonte de novos

compostos bioativos. Como apresentam crescimento rápido e ciclo de vida curto,

podem ser cultivados em espaços menores, sob condições altamente controladas,

com grande produção de biomassa. O período de tempo e o custo de um programa

de bioprospecção de compostos de interesse comercial em fungos são

consideravelmente menores do que em plantas e animais.

Os fungos compreendem um dos principais clados de seres vivos do Planeta

Terra, com, aproximadamente, 105.000 espécies já descritas, no entanto,

informações sobre distribuição geográfica, hospedeiros e, principalmente potencial

biotecnológico, ainda é escassa (MUELLER; SCHMIT, 2007). Se a estimativa mais

aceita de existirem 1,5 milhão de espécies (HAWKSWORTH, 2004) estiver correta,

então o número total de espécies conhecidas abrange menos de 7% de todas as

prováveis espécies atualmente existentes. Portanto, os fungos compreendem um

dos grupos de organismos menos conhecido e supõe-se que a maior parte dos

táxons ainda por serem descobertos esteja predominantemente na região tropical.

Muitos destes fungos são basidiomicetos que participam diretamente da

degradação dos principais compostos vegetais como celulose e a lignina. Apesar

dos recorrentes estudos deste grupo, sua delimitação precisa ainda é difícil. O

conhecimento da diversidade de basidiomicetos em regiões tropicais e,

especialmente no Brasil, ainda é escasso, sendo geralmente restrito às áreas de

estudo dos especialistas. Esta situação não é diferente do que se conhece sobre a

região semi-árida brasileira, com o agravante de que, em geral, historicamente, a

região litorânea, domínio de Florestas Ombrófilas Úmidas, tem sido muito mais

inventariada quanto à diversidade de basidiomicetos do que a região semi-árida do

interior do Nordeste (GÓES-NETO; BASEIA, 2006)

Estima-se que existam aproximadamente 30.000 espécies já descritas de

basidiomicetos, o que corresponderia a algo em torno de 37% dos fungos

verdadeiros (KIRK et al., 2001). De uma maneira geral, os basidiomicetos são

fungos que produzem, em alguma etapa de seu ciclo de vida, microestruturas

reprodutivas especializadas, os basídios, que são células que funcionam como

esporângios de reprodução sexuada, produzindo meiósporos, denominados de

basidiósporos devido a sua origem.

A grande maioria das espécies de Basidiomycota e aproximadamente 98%

das espécies de Agaricomycotina conhecidas são Agaricomycetes. Os

5

Agaricomycetes compreendem todos os Basidiomycota que formam basidiomas,

com himênio definido. É exatamente neste grupo que estão os agaricomicetos mais

comumente conhecidos – os cogumelos (HIBBETT et al., 2007).

2.2 FUNGOS DEGRADADORES DE LIGNINA

Os fungos degradadores da madeira podem ser divididos e três grupos, de

acordo com a morfologia da degradação: fungos de degradação branca, marrom e

macia. Os fungos degradadores da madeira são taxonomicamente diversos e a

maioria deles pertence à subdivisão Basidiomycotina. Os basidiomicetos de

degradação branca são os mais eficientes organismos degradadores de lignina. São

capazes de mineralizar lignina e, eventualmente, até CO2 e H2O. Os fungos de

degradação marrom e macia são capazes de degradar lignina em alguma extensão,

embora preferencialmente ataquem a celulose na madeira. (KIRK; FARRELL, 1987;

RODRIGUES; DURÁN, 1988; ORTH et al., 1993; HATAKKA, 1994; TUOR et al.,

1995).

2.2.1 Fungos de degradação macia

Os fungos pertencentes ao Filo Ascomycota e os fungos assexuais podem

causar um tipo específico de degradação na madeira, caracterizada por ser suave,

de aparência úmida, que sob condições de secagem pode lembrar a degradação do

tipo marrom (BLANCHETTE, 1991). Os fungos de degradação macia

preferencialmente colonizam e degradam madeiras duras, especialmente as de alta

umidade (ESLYN et al., 1975). Em madeiras moles, a velocidade de degradação por

fungos de degradação macia é geralmente mais lenta que a dos fungos de

degradação branca e marrom. Embora normalmente metabolizem os

polissacarídeos da madeira, são capazes de ocasionar algumas transformações da

lignina. No caso dos fungos de degradação marrom, a lignina é usualmente

modificada por desmetilação (ESLYN et al., 1975). Entretanto, os fungos de

degradação macia são deficientes na despolimerização de ligninas sintéticas,

embora convertam rapidamente compostos fenólicos relacionados com lignina

(ANDER et al., 1988).

6

2.2.2 Fungos de degradação marrom

Produzem tipicamente uma quebra extensiva dos polissacarídeos da madeira

(ex: celulose e hemicelulose) e deixam a maioria da lignina intacta. Logo, a madeira

degradada por esses fungos tem um aspecto amarronzado e de aparência frágil

(BLANCHETTE, 1991). Os fungos de degradação marrom predominantemente

atacam madeiras moles, enquanto os de degradação branca são eficientes no

ataque a madeiras duras. Os fungos responsáveis pela degradação marrom também

pertencem ao Filo Basidiomycota e a maioria das espécies às famílias Polyporaceae

e Hymenochaetaceae, entretanto, correspondem a apenas 6% de todos os

basidiomicetos que degradam a madeira (RAYNER; BODDY, 1988).

Embora esses fungos não sejam capazes de efetivamente despolimerizar a

lignina, podem fazer modificações, resultando em decréscimo dos grupos metoxilas

da lignina da madeira. Logo, os grupos fenólicos aumentam significativamente (JIN

et al., 1990), alterando a lignina para subseqüentes biodegradações. Além disso, um

aumento dos grupos hidroxilas alifáticos, como os carboxílicos, também produzem

quebras parciais de interunidades de ligações com cadeias laterais (JIN et al., 1990).

Além disso, as propriedades da degradação mostram grande variedade entre as

espécies, não sendo possível dessa forma fazer generalizações (ERIKSSON et al.,

1990).

O mecanismo pelo qual os fungos de degradação marrom modificam a lignina

é ainda desconhecido, já que não produzem enzimas ligninolíticas. Acredita-se que

moléculas pequenas (glicoproteínas), que quelam ferro, poderiam participar das

transformações da lignina através da produção de radicais de hidroxila (ENOKI et

al., 1990; BACKA et al., 1992; DURÁN, 1996).

Os fungos de degradação marrom produzem porosidade e erosão nas células

da parede da madeira, devido a uma quebra rápida do suporte celulósico das

microfibrilas (ERIKSSON et al., 1990). Perda da lignina, em particular das células

dos cantos, e remoção dos grupos metoxilas são visualizadas por técnicas de

microscopia eletrônica (BLANCHETTE, 1991). Com base nessas observações, as

hifas de fungos de degradação marrom podem ser divididas em dois grupos

fisiológicos: a) hifas que degradam todos os componentes da parede celular da

madeira, incluindo a lignina; b) hifas que podem somente modificar a lignina, quando

estão degradando os polissacarídeos da madeira (HIGHLEY et al., 1985).

Microfibrilas específicas como extensões lineares e emaranhado de células das

7

paredes das hifas, foram detectadas nesses fungos (LARSEN et al., 1992), que

podem transportar enzimas hidrolíticas a um contato direto com seu substrato

(GREEN et al., 1992).

2.2.3 Fungos de degradação branca

Os basidiomicetos causadores de degradação branca na madeira produzem

degradação seletiva da lignina na parede celular, deixando a celulose praticamente

intacta (BLANCHETTE, 1991; BLANCHETTE et al., 1994). Entretanto, esses fungos

variam consideravelmente, de acordo com o tipo de ataque à lignina e aos

polissacarídeos da madeira. Além disso, demonstram velocidades diferentes na

remoção da lignina (KIRK; FARRELL, 1987). Com base nessas propriedades, os

fungos de degradação branca podem ser divididos em dois subgrupos: a) fungos

que degradam simultaneamente todos os componentes, aproximadamente à mesma

velocidade e, b) fungos que preferentemente degradam lignina. Os últimos, que

degradam seletivamente a lignina, criam tipicamente áreas localizadas de

degradação e assim são designados fungos de bolsos brancos ou manchados

(ERIKSSON, 1990).

A identificação dos fungos de degradação branca é baseada nas

características morfológicas e fisiológicas das hifas. A maioria dos basidiomicetos

tem hifas dicarióticas com conexões específicas entre os septos do micélio

(BLANCHETTE, 1991). Sua habilidade comum é oxidar compostos fenólicos,

relacionados à lignina, que na maioria das vezes está associada a enzimas

extracelulares ligninolíticas, especialmente lacases.

Estudos de microscopia eletrônica nos últimos anos têm revelado que esses

fungos colonizam a madeira, invadindo o lúmen de traqueídeos e fibras, segregando

enzimas que degradam a lignina e polissacarídeos (RUEL; JOSELEAU, 1991;

BARRASA et al., 1992; DANIEL et al., 1992).

2.3 LIGNINA

A lignina é composta basicamente de unidades de fenilpropano formando

uma macromolécula tridimensional e amorfa, representando de 20 a 30% do total

dos compostos lignocelulósicos. É encontrada nas lamelas médias das fibras e nas

paredes das fibrilas e constitui um polímero fenólico que confere à madeira sua

coloração marrom, densidade e massa característica. O acoplamento das unidades

8

de fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva, o que é atribuído ao

mecanismo de biossíntese da lignina que se processa por via radicalar a partir da

reação de três diferentes alcoóis cinamílicos precursores: o álcool cumaril, álcool

ciniferil e álcool sinapil. (FERRAZ, 2004).

Figura 1: Molécula de lignina, simulação da estrutura e das possíveis ligações (KLOCK et al., 2005).

9

2.4 ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

A atividade de fenoloxidases extracelulares, indicando a presença de enzimas

ligninolíticas, foi descoberta na década de 30 em fungos de degradação branca

(ERIKSSON et al., 1990) e posteriormente foi demonstrado que as reações eram

catalisadas por oxidoredutases do tipo lacases e peroxidases (KIRK, 1971; ANDER;

ERIKSSON, 1976). A habilidade para oxidar compostos fenólicos, especificamente,

tem sido utilizada como critério de identificação para fungos de degradação branca

verdadeiros (KÄÄRIK, 1965). Após o isolamento de lacases, duas peroxidases,

denominadas lignina peroxidase e manganês peroxidase, foram evidenciadas na

participação da quebra da lignina.

O Phanerochaete chrysosporium é um dos mais potentes organismos

ligninolíticos conhecidos, sendo o mais estudado. Este basidiomiceto tem

crescimento rápido, degrada extensivamente a lignina a altas temperaturas,

apresenta formação abundante de conídios na fase assexual e seu ciclo de vida é

rápido. Para o metabolismo da lignina, esse fungo produz um sistema ligninolítico,

que se expressa somente durante a fase de micélio secundário e é induzido pela

limitação de carbono, sulfato e nitrogênio, sendo altamente oxidativo (LEISOLA;

FLEITCHER, 1985; GHOSH; SINGH, 1993). As enzimas extracelulares associadas

com a degradação de lignina por Phanerochaete chrysosporium incluem as lignina

peroxidases (LiPs), as manganês peroxidases (MnPs) e a glioxal oxidase geradora

de peróxido de hidrogênio (RAJARATHANAM et al., 1992).

A MnP, ou peroxidase corante, tem máxima atividade a pH 4,5 e demonstrou

dependência absoluta de Mn2+ e lactato. A enzima é estimulada pelo aumento da

concentração protéica nas reações e inibida completamente por NaNO3, KCN e

EDTA 1mM. Demonstrou-se que Mn2+ tem função na mineralização da lignina

sintética por fungos da degradação branca, tanto como mediador ativo para MnP

como regulador da sua produção, bem como da produção da LiP e lacase (KEREM;

HADAR, 1993).

A LiP descoberta em 1982 por Glenn et al. (1983), citado por Haapala e Linko

(1993) em filtrados de cultura de P. chrysosporium, foi inicialmente designada por

diferentes nomes tais como oxigenase dependente de H2O2, ligninase e

diarilpropano oxigenase, até que se verificou tratar-se de peroxidases (LEISOLA;

WALDNER, 1988). Essa enzima possui um grande potencial de oxidação, podendo

oxidar substratos fenólicos e não-fenólicos (SANTOS et al., 2010). A LiP de P.

10

chrysosporium tem uma atividade ótima de pH de aproximadamente 2,0 à

temperatura ambiente e é facilmente superoxidada pelo excesso de H2O2 à forma

inativa. A inativação também pode ocorrer pela perda do grupo heme sob agitação

forte (LEISOLA; WALDNER, 1988).

As LiPs e as MnPs são glicoproteínas. Aproximadamente quinze peroxidases

diferentes de MnP foram isoladas e purificadas considerando seu ponto isoelétrico.

Todas as peroxidases contêm um grupo heme porfirina-ferro por molécula. O ferro é

oxidado por H2O2 a um estado de oxidação maior, o que torna a enzima capaz de

oxidar a lignina e outros compostos relacionados (LEISOLA; WALDNER, 1988). A

MnP relaciona-se à LiP, pois oxida Mn2+ e a Mn3+, este último cátion pode oxidar

unidades fenólicas da lignina e, pode estar envolvido na sua fragmentação

(RAJARATHANAM et al., 1992). Podem oxidar fenóis monoaromáticos e compostos

aromáticos (SANTOS et al., 2010).

Em meio líquido, a produção de enzimas ligninolíticas pode ser dividida em

duas fases. A primeira, de crescimento do fungo, quando a velocidade de agitação

não é crítica. Durante a segunda fase, de produção da enzima, a velocidade de

agitação tem um papel chave. Nesta fase, as culturas limitantes em nitrogênio

podem ser agitadas acima de 150 rpm e as limitantes em carbono até 30-40 rpm,

para manter a atividade ligninolítica (LEISOLA; WALDNER, 1988; MOYSON;

VERACHTERT, 1993).

Um outro fator crítico é a tensão de oxigênio, pois o crescimento procede

rapidamente quando as culturas em meio líquido são aeradas; entretanto, a

atividade ligninolítica ocorre mais rápido alcançando maiores teores quando a

atmosfera é de 100% de oxigênio (LEISOLA; WALDNER, 1988). No entanto, em

meio sólido, o oxigênio não é fator limitante para a taxa de degradação da lignina,

nem a taxa de respiração do fungo é afetada pelo enriquecimento com oxigênio

(KEREM et al., 1992).

A temperatura de crescimento para o P. chrysosporium têm um papel

importante na produção e na máxima atividade da MnP e LiP. Nas temperaturas de

39, 33 e 28ºC houve produção da MnP e LiP, mas a 23ºC houve maiores

quantidades de MnP e a 18ºC somente a atividade de MnP foi detectada (VYAS et

al., 1994). Esse fungo é termotolerante com uma temperatura ótima para

crescimento entre 39-40ºC. Sua taxa de crescimento diminui com a queda da

11

temperatura, determinando um atraso na produção de MnP e LiP e diminuindo a

atividade proteolítica.

O álcool veratril é conhecido como indutor de fenoloxidases, atuando também

como um mediador na transferência de um elétron. Desta forma compostos que não

são diretamente acessíveis à enzima podem ser oxidados pela via do álcool veratril.

Outra função é estabilizar a LiP pela remoção de excesso de peróxido de hidrogênio

(LEISOLA; WALDNER, 1988). Pode aparecer como metabólito secundário nas

culturas de P. chrysosporium e Pleurotus florida (DHALIWAL et al., 1992). O álcool

veratril é oxidado pelas LiPs sob condições aeróbias a veratrildeído e é o único

produto da oxidação. Entretanto, sob condições anaeróbicas, outros produtos são

formados, incluindo duas quinonas e um produto da clivagem do anel aromático.

Portanto, na presença de peróxido, as LiPs podem mediar a abertura do anel

aromático (LEISOLA; WALDNER, 1988).

Uma outra enzima, a lacase (Lac), tem recebido considerável atenção nesses

últimos dez anos devido ao seu papel na degradação da lignina e aplicações

potenciais na destoxificação de poluentes fenólicos (KUMARAN et al., 1997). A

lacase é uma polifenoloxidase de natureza glicoprotéica e é produzida por alguns

fungos da podridão branca tais como Lycoperdon sp., Coriolus versicolor, Phellinus

ignarius (GUZMÁN et al., 1993) com exceção do P. chrysosporium que exibe pouca

atividade (TUOR et al., 1995).

A lacase é uma enzima que possui íon cobre no seu sítio ativo e tem ampla

especificidade ao substrato. Essa enzima emprega o oxigênio molecular como

redutor e também oxida anéis fenólicos para radicais fenóxi. A lacase oxida

compostos fenólicos por abstração de um elétron, com formação de radicais que

podem repolimerizar ou serem levados à despolimerização. A especificidade da

enzima ao substrato depende da origem da lacase. Sua função fisiológica ainda não

é clara e seu papel na biodegradação da lignina é incerto (GOLD; ALIC, 1993;

SANTOS et al., 2010), contudo a lacase e a MnP devem agir complementarmente

ou sinergisticamente. Além disso lacases isoladas de fungos tem atraído atenção

considerável para ciência e indústria, até hoje cerca de 100 isoenzimas tem sido

isoladas de culturas de fungos e suas propriedades bioquímicas, assim como suas

características catalíticas tem sido caracterizadas (LIU et al., 2009).

A lacase de Pleurotus ostreatus é uma ο-difenil oxidase que utiliza guaiacol e

o pirocatecol, sendo inativada por hidroquinona, resorcinol e tirosina; seu ponto

12

isoelétrico é de 2,9 (SANNIA et al., 1986). O pH ótimo para sua atividade depende

do substrato; na presença de guaiacol e siringadalzina, variando de 5,0-6,0 e 6,0-

7,0, respectivamente; é uma enzima estável a várias temperaturas mas, a partir de

55ºC, sua atividade diminui (PALMIERI et al., 1993).

Dentre os fungos da degradação branca produtores de lacases e outras

ligninases, encontram-se as espécies de Pleurotus. Alguns estudos conduzidos com

P. ostreatus, compilados por Rajarathanam e Bano (1989), mostram que os

principais parâmetros culturais afetando a degradação da lignina por esses

basidiomicetos são o substrato de crescimento, a fonte de nitrogênio, bem como sua

concentração e condições de cultivo. De um modo geral, a carência de uma fonte

externa de nitrogênio, temperatura de 25-30ºC, disponibilidade de oxigênio e cultivo

estático de Pleurotus spp., favorecem a degradação de lignina.

Kerem e colaboradores (1992) assim como Akhmedova (1994), observaram

uma alta atividade de lacase no início do período de degradação da lignina. De

acordo com estes pesquisadores, a lacase pode atuar na destoxificação de

compostos do substrato como oxidar grupos fenólicos, agindo como uma enzima

inicial na clivagem de cadeias laterais e anéis aromáticos das porções fenólicas da

lignina. Outras enzimas de natureza oxidativa tal como a álcool veratril oxidase

podem ter um papel importante na degradação da lignina.

2.5 RESÍDUOS AGRO-INDUSTRIAIS

Nas últimas décadas há uma crescente busca da utilização de resíduos

agroindustriais, devido a incessante demanda das atividades agrícolas. O acúmulo

destes resíduos gera a deterioração do meio ambiente e perda de recursos, com

contribuição significante para o problema da reciclagem e conservação da biomassa.

Diversos processos têm sido desenvolvidos para utilização desses materiais,

transformando-os em compostos químicos e produtos com alto valor agregado. Os

resíduos lignocelulósicos são também uma grande alternativa para geração de

energia, devido a sua grande disponibilidade na natureza. O uso de resíduos

agrícolas como substratos em bioprocessos, além de poder ser economicamente

viável, ajuda a resolver os problemas ambientais decorrentes de seu acúmulo na

natureza (ALEXANDRINO et al., 2007; MENEZES et al., 2009).

13

2.5.1 Coco

O consumo de água de coco verde no Brasil é crescente e significativo e

atualmente o país possui cerca de 50 mil hectares cultivados em todo território. No

ano de 2000 já havia no país cerca de 80 indústrias de pequeno e 3 de grande porte

(CARRIJO et al., 2002). O nordeste se destaca sendo a região com a maior

produção de coco no país, com uma produção no ano de 2001 superior a 960 mil

frutos, ou seja, 68% de toda produção nacional. Em nível estadual a Bahia se

destaca, pois sua produção atingiu cerca de 30% do total nacional e 44% da

produção nordestina no ano de 2001 (PIRES et al., 2004). Observa-se nessa região

um subaproveitamento do resíduo do coco verde após consumo ou industrialização

da água, sendo muitas vezes depositado em lixões e às margens de estradas.

Além disso, este material é de difícil decomposição no solo levando cerca de

8 anos para se decompor devido a grande porcentagem de lignina e celulose e à

pequena quantidade de hemicelulose, que conferem a esse substrato uma grande

durabilidade, o que gera um problema ambiental (ROSA et al., 2001; CARRIJO,

2002; NOGUEIRA et al., 1998).

2.5.2 Cana-de-açúcar

O bagaço de cana é um dos resíduos lignocelulósicos obtidos na indústria

açucareira. É quase totalmente utilizado nas caldeiras como combustível. Porém,

estudos têm apontado para a viabilidade desse substrato no cultivo de espécies de

cogumelos (PANDEY et al., 2000a). Estudos indicam que até 2020 a melhor relação

custo benefício para produção de etanol será a partir de cana-de-açúcar até que a

tecnologia de produção a partir de outros resíduos lignocelulósicos esteja

comercialmente madura (CALLE; WALTER, 2006).

O bagaço de cana consiste aproximadamente de 50% de celulose, 25% de

hemicelulose e 25% de lignina. Em comparação com outros resíduos agrícolas,

pode ser considerado um rico reservatório da energia solar (PANDEY et al., 2000a).

O expressivo crescimento da produção de cana-de-açúcar, no Brasil, nas

últimas décadas, tem determinado importantes mudanças no que se refere ao

aspecto agroambiental. Os números do setor canavieiro impressionam pela grande

extensão de terra cultivada. A cana-de-açúcar ocupa hoje por volta de 6 a 6,5

milhões de hectares de terras, o equivalente a 1,5% dos solos cultivados do Brasil,

14

caracterizando um sistema de monocultivo que tem especial significado econômico e

social para o país (MACHADO; HABIB, 2009).

2.5.3 Mandioca

A mandioca (Manihot esculenta) é considerada um importante recurso

alimentício em um grande número de países tropicais. De origem amazônica, a

mandioca foi então disseminada na África durante o século 16 e Ásia durante o

século 18. Cerca de 60% da mandioca produzida no mundo é usada no consumo

humano, outra grande parte é usada na indústria de ração para animais

(aproximadamente 33%) e os 7% restantes é usado na indústria como as têxteis, de

papel, etc. Com o advento da abordagem biotecnológica, o foco tem sido

direcionado no intuito de aumentar a aplicação da mandioca e seus resíduos em

novos processos com objetivo de agregar valor a mandioca. Durante sua manufatura

dois tipos de resíduos são gerados, um líquido e um sólido, sendo este último

descartado no ambiente, tornando-se uma grande preocupação ambiental (PANDEY

et al., 2000b).

A produção mundial de raízes tuberosas de mandioca em 2004 foi de quase

204 milhões de toneladas (FAO, 2006). Em 2005, segundo o IBGE, a colheita

brasileira foi de 25,9 milhões de toneladas. O estado da Bahia, por vários anos, tem

se destacado na produção de mandioca no Brasil sendo considerado o segundo

maior produtor de mandioca nos últimos anos, com produção de 4,6 milhões de

toneladas em 2005, superado apenas pelo Pará (CARVALHO et al., 2007).

2.5.4 Cevada

A cevada (Hordeum vulgare sp. vulgare) é um cereal de inverno que ocupa a

quinta posição, em ordem de importância econômica, no mundo. O grão é utilizado

na industrialização de bebidas (cerveja e destilados), na composição de farinhas ou

flocos para panificação, na produção de medicamentos e na formulação de produtos

dietéticos e de subprodutos de café. A cevada é ainda empregada em alimentação

animal como forragem verde e na fabricação de ração. No Brasil, a malteação é o

principal uso econômico da cevada, já que o país produz apenas 30% da demanda

da indústria cervejeira. A produção brasileira de cevada está concentrada na Região

Sul, com registros de cultivo também nos estados de Goiás, de Minas Gerais e de

São Paulo. Atualmente, a cevada é mais cultivada em mais de 140 mil hectares, e a

15

produção é de aproximadamente 380 mil toneladas. Há três maltarias em atividade,

instaladas no Rio Grande do Sul, no Paraná e em São Paulo. O agronegócio de

cevada-malte no Brasil supera 200 milhões de dólares/ano, com possibilidades de

crescimento no curto prazo devido à expansão da capacidade das indústrias. Devido

ao aumento no consumo de cerveja no nordeste brasileiro, as grandes companhias

têm investido bastante nessa região, no intuito de aumentar a produção.

Recentemente uma grande marca anunciou o investimento de alguns milhões de

reais na produção de cerveja no estado da Bahia, o que acarretou no aumento de

geração de resíduos de cevada (EMBRAPA, 2009a, 2009b).

16

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 COLETA E PRESERVAÇÃO DOS ESPÉCIMES

No campo, os espécimes foram coletados manualmente com auxílio de faca e

acondicionados em sacos de papel. Todos os exemplares coletados (por número de

coleta) foram georreferenciados com sistema de posicionamento global (GPS) e

dados de campo, como substrato, cor, luminosidade incidente, data e local também

foram devidamente registrados no momento da coleta. Na preservação e

herborização foi seguido o protocolo de Fidalgo e Bononi (1989).

Figura 2: Região de coleta: Feira de Santana (UEFS), Salvador (19° BC), Ituberá, Itaitu e Miguel Calmon.

17

3.2 IDENTIFICAÇÃO DOS ESPÉCIMES

3.2.1 Taxonomia clássica

A identificação dos espécimes de basidiomicetos coletados foi baseada na

morfologia das estruturas macroscópicas e microscópicas dos basidiomas. Os

basidiomas foram analisados macroscopicamente quanto às características (tipo,

cor, dimensões, consistência, textura) do himenóforo, dos tubos, e do contexto e,

quando necessário, comparados com material já identificado depositado no Herbário

da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS).

Para a observação microscópica do material, foram feitos cortes à mão livre

de cada basidioma, com auxílio de lâminas de aço inoxidável. Os cortes foram

acondicionados em lâminas de vidro e corados com hidróxido de potássio 3% e

floxina 1%. Também foi utilizado o reagente de Melzer, segundo Singer (1951), de

modo a se observar a reação amilóide ou dextrinóide dos basidiósporos, hifas e

outras microestruturas.

3.2.2 Taxonomia molecular

3.2.2.1 Extração de DNA

O micélio das espécimes crescido por cerca de 20 dias foram macerados em

cadinhos de porcelana com nitrogênio líquido. O pó foi transferido para tubos

Eppendorf (2mL) contendo 1mL de Brometo de cetil-trimetil-amônio (CTAB) e 4 µL

de 2-mercaptenol e estes colocados em banho-maria (60˚C/30min). Acrescentou-se

800 µL de clorofórmio álcool isoamílico e colocou-se os tubos para agitar por pelo

menos 1 hora. Os tubos foram então centrifugados (10min/13.000rpm) e o

sobrenadante pipetado para novos tubos Eppendorf (1,5mL) e acrescentado 800 µL

de isopropanol. As amostras foram colocadas em freezer por 12 horas. Após esse

período os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 13.000 rpm e o sobrenadante

descartado. Foram feitas três lavagens sucessivas em 800 µL de etanol 70%. O

pellet foi deixado em bancada para secagem por pelo menos 12 horas e

ressuspendido em tampão TE.

3.2.2.2 PCR das amostras

Foram utilizados os primers ITS 1, ITS4, LR0R e LR5. A reação de PCR foi

feita em termociclador da marca Eppendorf em 28 ciclos (94°C – 4 min., 94°C – 1

min., 50°C – 1min., 72°C – 3min. e 72°C – 7 min.)

18

Tabela 1: Cálculo do mix para o PCR

Reagentes Quantidades Tampão 10X 5 µL MgCl2 50mM 1,5 µL DNTPs 10X 1 µL

Primer F 0,5 µL Primer R 0,5 µL

DNA 1,0 µL Taq 0,25 µL BSA 0,5 µL

Água miliQ 39,75 µL Total 50,0 µL

3.2.2.3 Purificação e seqüenciamento do produto de PCR

Os produtos de PCR foram purificados através da digestão com a fosfatase

alcalina e a exonuclease (kit ExoSap IT, GE). A reação de seqüenciamento foi

realizada com Big Dye terminator versão 3.1 (Applied Biosystems). As amostras

foram seqüenciadas em ambas as direções usando o seqüenciador automático SCE

2410 (Spectrumedix LLC) no Laboratório Molecular (LAMOL) da Universidade de

Feira de Santana (UEFS).

3.2.2.4 Análise no banco de dados

Os eletroferogramas resultantes foram editados através do programa GAP4

do Pacote Staden (Staden, 1998). As seqüências resultantes foram submetidas à

pesquisa no BLASTn do NCBI (National Center for Biotechnology Information –

www.ncbi.nlm.nih.gov), alinhadas utilizando o programa Clustral X (Thompson et al.

1997) e ajustadas manualmente.

3.3 ISOLAMENTO

O isolamento de culturas foi feito em câmara de fluxo laminar, seguindo

padrões de esterilização de laboratório. Uma fração de tecido do basidioma que não

estivesse em contato direto com o ar foi retirada para fazer o isolamento em placas

de Petri com meio de cultura. O meio de cultura utilizado foi o Agar batata dextrose

(BDA) suplementado com extrato de levedura (EL) (BDAL: BDA 3,9%, EL 2% e ágar

1,5%) e incubados em BOD, à 28ºC, no escuro. Observações diárias foram

19

realizadas para verificar o crescimento de culturas puras e repicagens foram

realizadas quando necessário. A preservação dos isolados purificados a

médio/longo prazo foi realizada em água destilada estéril. Os isolados purificados e

conservados em água destilada estéril serão depositados na Coleção de Culturas de

Microrganismos da Bahia (CCMB).

3.4 SELEÇÃO DE FUNGOS QUANTO À CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE

ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

Foi utilizado meio de cultura ágar extrato de malte (AEM, 1,2% de ágar e

1,5% extrato de malte) acrescido do corante RBBR na concentração de 0,02% (p/v)

para testar as espécies de basidiomicetos quanto à habilidade ligninolítica (GLENN;

GOLD, 1983; FREITAG; MORELL, 1992; MACHADO, 2005). O meio acrescido do

corante foi preparado e esterilizado a 121ºC / 20 min. e vertidos em placas de Petri

(9 cmØ) em triplicata. Posteriormente as placas foram inoculadas na região central

com discos (0,6 cm Ø) retirados das margens das culturas de fungos com micélio de

7 dias. Estas foram incubadas em BOD sob condições de 28±2°C no escuro por 14

dias. Foram utilizadas placas sem a presença dos fungos como controle. Avaliações

diárias foram realizadas com auxílio de uma régua milimetrada para medir a taxa de

crescimento vegetativo e o halo de descoloração. No final do experimento, as

imagens de pelo menos um dos exemplares de cada espécie foram registradas

através de câmara fotográfica digital.

3.5 OBTENÇÃO E PROCESSAMENTO DOS SUBSTRATOS

A casca de coco, a casca de mandioca e o bagaço da cana de açúcar foram

obtidos em feiras livres do município de Feira de Santana - BA e o resíduo da

cevada foi obtida já moída em uma cervejaria situada na cidade de Alagoinhas-BA.

Os substratos não receberam qualquer tratamento além de secagem e moagem. A

secagem foi realizada em estufa de ventilação forçada a 50ºC e, posteriormente,

triturados em partículas de 1mm através de moinho de faca.

20

3.6 OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO PARA PRODUÇÃO DAS ENZIMAS

LIGNINOLÍTICAS

Foi utilizado um planejamento experimental multivariável através da aplicação

do programa Statistica (6.0), no qual o programa gerou planilhas de ensaio e as

superfícies de resposta. As seguintes variáveis foram analisadas: tipo do substrato

lignocelulósico, temperatura de incubação e pH inicial do meio, conforme a tabela

abaixo:

Tabela 2: Planejamento experimental gerado pelo software Statistica 6.0

Otimização Variável - α -1 0 +1 +α

Substrato 0¹:100² 30¹:70² 50¹:50² 80¹:20² 100¹:0²

pH 3,0 4,6 7,0 9,4 11,0

Temperatura 20 23,2 28 32,8 36

Ensaio Subst.

(%) pH Temp. (ºC)

1 30¹:70² 4,6 23,2

2 30¹:70² 4,6 32,8

3 30¹:70² 9,4 23,2

4 30¹:70² 9,4 32,8

5 80¹:20² 4,6 23,2

6 80¹:20² 4,6 32,8

7 80¹:20² 9,4 23,2

8 80¹:20² 9,4 32,8

9 0¹:100² 7 28

10 100¹:0² 7 28

11 50¹:50² 3 28

12 50¹:50² 11 28

13 50¹:50² 7 20

14 50¹:50² 7 36

15 50¹:50² 7 28

16 50¹:50² 7 28

17 50¹:50² 7 28

18 50¹:50² 7 28

1- cevada;

2-mandioca

21

3.7 INCUBAÇÃO DOS FUNGOS E OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ENZIMÁTICOS

Foram colocados em frascos Erlenmeyers (250 mL) 5g dos substratos

separados (bagaço de cana, casca de mandioca, fibra de côco verde e cevada) ou

misturados em diversas proporções e ajustados à umidade de acordo com o

planejamento experimental anteriormente descrito. O material foi autoclavado a

121°C, 1 atm, durante 20 min. Posteriormente, foram adicionados quatro discos (0,5

cmØ) contendo micélio dos fungos selecionados. O controle consistiu em material

sem inoculação dos discos contendo micélio. Os frascos foram incubados no interior

de estufa BOD, sob condição de escuro e o tempo de incubação e temperatura

variaram de acordo com os parâmetros de otimização enzimática.

Foi adicionada água destilada aos frascos e o material homogeneizado com

auxílio de bastão de vidro e, em seguida, filtrado em filtro sintético de nylon. O

filtrado foi centrifugado a 13.000 rpm por 10 minutos a 4ºC e o sobrenadante obtido

utilizado para determinação de pH e atividade das enzimas ligninolíticas.

3.8 DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL HIDROGENIÔNICO

A determinação de pH das amostras obtidas foram realizadas com auxílio de

medidor de pH calibrado com tampão a pH 4,0; 7,0.

3.9 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

3.9.1 Lacase (SZKLARZ et al.,1984, modificado)

Foi realizada empregando-se siringaldazina como substrato enzimático. A

mistura da reação foi composta de 0,6 mL de sobrenadante (obtido através da

centrifugação do filtrado – 2687,3 g / 10min); 0,1 mL de tampão citrato-fosfato 0,05

M (pH 5,0); 0,1 mL de água destilada e 0,1 mL de siringaldazina (0,1% em etanol). A

oxidação da siringaldazina (∈525= 65.000/Mcm) até quinona foi acompanhada

durante 10 min a 525 nm, sendo a atividade expressa em UI/L (unidade

internacional/Litro - onde unidade internacional significa µmol.min).

3.9.2 Manganês peroxidase (KUWAHARA et al., 1984)

A atividade desta enzima foi determinada avaliando-se a oxidação do

vermelho de fenol (∈610 = 4460 mol/cm) na presença de manganês e H2O2. A reação

foi obtida mediante a mistura de 0,5 mL do extrato enzimático; 0,1 mL de lactato de

22

sódio 0,25 M; 0,05 mL de MnSO4; 0,2 mL de albumina bovina 0,5%; 0,1 mL de

vermelho de fenol 0,1%; 0,05 mL de H2O2 em tampão succinato de sódio 0,2 M pH

4,5. A mistura foi incubada a 30ºC por 5 min e a reação interrompida pela adição de

0,04 mL de NaOH 2,0 N. A absorbância foi lida a 610 nm e a atividade expressa em

UI/L.

3.9.3 Lignina peroxidase (TIEN; KIRK, 1984)

Esta atividade foi determinada mediante oxidação do álcool veratrílico (∈310 =

9300 mol/cm). O meio de reação de oxidação foi composto de 0,6 mL de

sobrenadante, 0,2 mL de H2O2 2,0 mM, 0,2 mL de álcool veratrílico 2,0 nM em

tampão tartarato de sódio a 0,4 M (pH 3,0). A reação foi iniciada pela adição de H2O2

e o aparecimento do aldeído veratrílico foi determinado fazendo-se a leitura de

absorbância a 310 nm. A atividade foi expressa em U/L.

O cálculo da atividade enzimática seguiu a fórmula:

Enzima UI/L = ∆ Abs x 106

∈ x R x T

onde:

∆ Abs = Absorbância final - Absorbância inicial.

∈ = coeficiente de extinção da enzima, dependente do comprimento de onda em que

é lida (310 nm = 9300 L/M.cm, 525 nm = 65000 L/M.cm, 610 nm = 4460 L/M.cm).

R = volume, em mL, do sobrenadante utilizado na reação.

T = tempo de reação.

3.10 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA TOTAL

A determinação de proteína total foi feita pelo método de Bradford (1976),

seguindo as instruções do kit de reagentes da BioAgency para o macroensaio. Foi

feita a curva padrão de albumina nas concentrações variando de 0,01 a 0,5 mg/mL.

As medições foram feitas em espectrofotômetro do tipo Nanodrop.

23

3.11 DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ESPECÍFICA

A atividade específica de cada enzima foi calculada como sendo o quociente entre a

atividade bruta e a quantidade de proteína total dada pelo método Bradford:

3.12 EXPERIMENTO DO TIME COURSE

Após a indicação do software Statistica 6.0 das melhores condições de cultivo

(proporção de substrato, pH e temperatura) para produção das enzimas, foi

realizada a determinação do time course para as enzimas nas condições

preconizadas. As leituras de atividade enzimática foram realizadas em seis tempos

diferentes de incubação: 4, 7, 14, 21, 28 e 35 dias.

3.13 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

3.13.1 Efeito do pH na atividade

O efeito de pH foi avaliado pela variação do pH do meio reacional entre 3,0 e

11,0 e determinação da atividade das enzimas no meio sob exposição ao valor de

pH preconizado.

Atividade específica (U/mg) Atividade bruta (U/L)

Proteína Bradford (mg/L)

24

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 COLETA, ISOLAMENTO E PRESERVAÇÃO DOS ESPÉCIMES

Foram realizadas coletas em cinco localidades diferentes no Estado da Bahia

(Figura 2): (i) no campus da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS); (ii)

na trilha da cachoeira Véu de Noiva localizado no distrito de Itaitu (município de

Jacobina); (iii) na trilha da Cachoeira do Jajai localizada no Parque Estadual das

Sete Passagens no município de Miguel Calmon, sendo as duas últimas na região

da Chapada Diamantina; (iv) na reserva da Michelin no município de Ituberá e (v) na

reserva do 19º Batalhão de Caçadores em Salvador (Figura 3). No campus da UEFS

foram coletadas 11 linhagens entre os dias 08 e 11 de novembro de 2008 e mais 4

linhagens entre os meses de janeiro a março de 2009. Dessas apenas 10 tiveram

isolamento bem sucedido. Na Chapada Diamantina foram coletadas 11 linhagens

onde apenas 4 conseguiram ser isoladas. Apenas uma linhagem foi isolada das

duas coletas oriundas da reserva da Michelin e não se conseguiu isolar a linhagem

coletada em Salvador. Foram realizadas também tentativas de isolamento de

amostras coletadas pela Prof. Dra. Maria Alice Neves (UFPB) no estado da Bahia

para o Programa de Pesquisa em Biodiversidade (PPBio). Das 16 amostras cedidas

11 isolamentos foram bem sucedidos (Tabela 3).

Todos os isolados foram preservados em água destilada estéril em triplicata e

serão depositados na Coleção de Cultura de Microrganismos do Estado da Bahia

(CCMB-UEFS).

25

Tabela 3: Coleta, isolamento e preservação dos espécimes

Coleta Local Isolamento Preservação

TAC 04 UEFS SIM SIM TAC 05 UEFS SIM SIM TAC 06 UEFS SIM SIM TAC 07 UEFS NÃO NÃO TAC 08 UEFS NÃO NÃO TAC 09 UEFS SIM SIM TAC 10 UEFS NÃO NÃO TAC 11 ITUBERÁ SIM SIM TAC 12 ITUBERÁ SIM NÃO TAC 13 UEFS SIM SIM TAC 14 UEFS SIM SIM TAC 15 UEFS SIM SIM TAC 16 UEFS SIM SIM TAC 17 ITAITU NÃO NÃO TAC 18 ITAITU NÃO NÃO TAC 19 ITAITU NÃO NÃO TAC 20 ITAITU SIM SIM TAC 21 ITAITU NÃO NÃO TAC 22 ITAITU NÃO NÃO TAC 23 ITAITU NÃO NÃO TAC 24 ITAITU SIM SIM TAC 25 M. CALMON NÃO NÃO TAC 26 M. CALMON NÃO NÃO TAC 27 M. CALMON SIM SIM TAC 28 UEFS NÃO NÃO TAC 29 UEFS NÃO NÃO TAC 30 ITAITU PERDIDO PERDIDO TAC 31 SALVADOR SIM NÃO TAC 32 UEFS SIM SIM TAC 33 UEFS SIM NÃO

MAN 197 Serra Ramalho SIM SIM MAN 198 Serra Ramalho SIM SIM MAN 201 Serra Ramalho SIM SIM MAN 202 NÃO NÃO MAN 206 NÃO NÃO MAN 208 NÃO NÃO MAN 264 Morro Chapéu SIM SIM MAN 269 Morro Chapéu SIM SIM MAN 270 Morro Chapéu SIM SIM MAN 277 NÃO NÃO MAN 304 UEFS SIM SIM MAN 306 Feira VI SIM SIM MAN 307 NÃO NÃO MAN 309 Entre Rios SIM SIM MAN 311 Entre Rios SIM SIM MAN 312 Entre Rios SIM SIM

26

TAC 20 TAC 21 TAC 22 TAC 31

TAC 28 TAC 32 TAC 27

TAC 04

TAC 06 TAC 08 TAC 10 TAC 09

TAC 11 TAC 12 TAC 18

TAC 25

Figura 3: Basidioma das coletas

27

4.2 SELEÇÃO DE FUNGOS QUANTO À CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE

ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS

Das 28 amostras que foram isoladas, 15 foram capazes de descolorir o

corante RBBR (Figuras 4 e 5); 10 não apresentaram descoloração e 3 amostras não

puderam ser avaliadas devido a problemas de contaminação (Tabela 4). Os testes

foram feitos em triplicata, e cada placa foi medida em dois eixos perpendiculares a

fim de minimizar o erro. Foi calculada então a média de crescimento e descoloração

ao longo de 14 dias. Das amostras avaliadas, 4 apresentaram halo de descoloração

maior que o halo de crescimento e 6 já tinham alcançado uma taxa de descoloração

de 100% do diâmetro da placa no 14º dia (Anexos 1e 2).

TAC 13 TAC 16 TAC 17 TAC 19

Figura 3: Basidioma das coletas (continuação)

28

• NA=não avaliado; S. Id. = sem identificação.

Amostra Local de

coleta Identificação Descoloração de

RBR Descoloração

MAN 197 Serra do Ramalho Marasmius sp. Sim 64,8%

MAN 198 Serra do Ramalho s/id. Não

MAN 201 Serra do Ramalho

Panaelous sp. Sim 58%

MAN 264 Morro do Chapéu Marasmius sp. Não

MAN 269 Morro do Chapéu

Galerina sp. Sim 47,7%

MAN 270 Morro do Chapéu Panaelous sp. Não

MAN 304 UEFS Coprinus sp. NA MAN 306 Feira VI s/id. Sim 58,3% MAN 309 Entre Rios s/id. Sim 75,5% MAN 311 Entre Rios Pleurotus sp. Não MAN 312 Entre Rios Lentinus sp. Sim 100% TAC 04 UEFS S. Id. NA TAC 05 UEFS S. Id. Sim 100% TAC 06 UEFS S. Id. Não TAC 09 UEFS S. Id. Sim 100% TAC 11 ITUBERÁ S. Id. Sim NA TAC 12 ITUBERÁ S. Id. Não TAC 13 UEFS S. Id. Não TAC 14 UEFS S. Id. Não TAC 15 UEFS S. Id. Não TAC 16 UEFS Polyporus tricholoma Sim 100% TAC 18 ITAITU S. Id. Sim NA TAC 20 ITAITU S. Id. Sim 100% TAC 25 ITAITU S. Id. Sim NA TAC 27 M. CALMON Lentinus tigrinus Sim 100% TAC 31 SALVADOR S. Id. NA TAC 32 UEFS S. Id. Sim 79% TAC 33 UEFS S. Id. Não

Tabela 4: Linhagens testadas quanto a sua capacidade de descolorir o corante RBBR.

29

Figura 4: Descoloração do meio AEM+RBBR dos isolados cedidos pela Prof.ª Maria Alice Neves com 14 dias de crescimento.

MAN 197 MAN 201.1 MAN 201.2

MAN 264.2 MAN 269 MAN 306

MAN 309 MAN 312

30

TAC 05.1 TAC 06.1 TAC 09

TAC 09.1 TAC 13 TAC 14

TAC 15 TAC 16 TAC 27

TAC 32

Figura 5: Descoloração do meio AEM+RBBR dos isolados coletados no campus da UEFS e região da Chapada, com 14 dias de crescimento.

31

Com a ajuda do programa SISVAR foi aplicado o teste de variância

juntamente com teste de Tukey (ANOVA - em nível de significância de 5%) para a

escolha das linhagens que seriam utilizadas para os ensaios de atividade

enzimática. Três se mostraram bem promissoras, pois foram capazes de

descolorirem toda a placa contendo RBBR na primeira semana de crescimento, são

elas: TAC 16, TAC 20 e TAC 27 (Tabela 5). Foram escolhidas as linhagens TAC 16

em virtude desta apresentar resultados de descoloração do meio contendo o corante

RBBR em apenas 48 horas de crescimento (8,25mm), e TAC 27 por esta apresentar

além de 100% de descoloração de RBBR, a característica de formar os primórdios

do corpo de frutificação no crescimento em placa de Petri em apenas 3 semanas de

cultivo (Figuras 6 e 7). Tal característica, única dentre todas as linhagens isoladas,

indica que o fungo TAC 27 possui um crescimento rápido em meios sintéticos e não

é exigente de grandes quantidades de C e N, além de ser esta uma característica

taxonômica.

Figura 6: L. tigrinus, formação dos primórdios do corpo de frutificação em placa após 3 semanas de incubação

32

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tempo (dias)

Cre

scim

en

to (m

m)

32

20

09.1

9

16

13

15

27

05.1

06.2

14

201.2

264.2

269

309

197

312

306

201.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tempo (dias)

De

sc

olo

raç

ão

(m

m)

32

20

09.1

9

16

13

15

27

05.1

06.2

14

201.2

264.2

269

309

197

312

306

201.1

Figura 7: Gráfico de crescimento e descoloração de RBBR das linhagens ao longo de 14 dias

33

Tratamentos Médias Resultados do teste

--------------------------------------------------------------------------------

309 11.183571 a1

2012 11.343571 a1

269 19.269286 a1 a2

2011 23.985000 a1 a2

306 26.330000 a1 a2

197 28.556429 a1 a2 a3

32 42.670714 a2 a3 a4

51 58.342143 a3 a4 a5

15 59.939286 a4 a5

9 62.962143 a4 a5

91 63.970000 a4 a5

62 66.283571 a4 a5

13 66.714286 a4 a5

312 66.945000 a4 a5

2642 68.521429 a4 a5

27 73.176429 a5

16 74.321429 a5

14 75.605714 a5

20 78.272143 a5

--------------------------------------------------------------------------------

TABELA DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA

--------------------------------------------------------------------------------

FV GL SQ QM Fc Pr>Fc

--------------------------------------------------------------------------------

TRAT 18 139208.737407 7733.818745 15.630 0.0000

erro 247 122218.128721 494.810238

--------------------------------------------------------------------------------

Total corrigido 265 261426.866128

--------------------------------------------------------------------------------

CV (%) = 43.20

Média geral: 51.4943233 Número de observações: 266

--------------------------------------------------------------------------------

Teste Tukey para a FV TRAT

DMS: 29,898094881542 NMS: 0,05

Média harmonica do núm. de repetições (r): 14

Erro padrão: 5,94504738500026

Crescimento

Tabela 5: Análise de variância das taxas de crescimento e descoloração das amostras em meio

AEM+RBBR

34

Tratamentos Médias Resultados do teste

--------------------------------------------------------------------------------

15 0.000000 a1

62 0.000000 a1

2642 0.000000 a1

13 0.000000 a1

14 0.000000 a1

2012 15.956429 a1 a2

2011 27.485000 a1 a2 a3

306 27.543571 a1 a2 a3

32 29.871429 a1 a2 a3

269 32.413571 a2 a3

197 36.647143 a2 a3 a4

309 43.805714 a2 a3 a4 a5

51 47.852143 a3 a4 a5

312 48.357143 a3 a4 a5

9 63.401429 a4 a5

91 64.327143 a4 a5

27 68.272143 a5

20 68.593571 a5

16 70.107143 a5

--------------------------------------------------------------------------------

TABELA DE ANÁLISE DE VARIÂNCIA

--------------------------------------------------------------------------------

FV GL SQ QM Fc Pr>Fc

--------------------------------------------------------------------------------

TRAT 18 170373.474386 9465.193021 18.938 0.0000

erro 247 123451.459136 499.803478

--------------------------------------------------------------------------------

Total corrigido 265 293824.933522

--------------------------------------------------------------------------------

CV (%) = 65.89

Média geral: 33.9280827 Número de observações: 266

--------------------------------------------------------------------------------

Teste Tukey para a FV TRAT

DMS: 30,0485703881094 NMS: 0,05

Média harmonica do núm. de repetições (r): 14

Erro padrão: 5,97496848935053

RBBR

O uso de corantes, como indicadores de atividade ligninolítica, foi sugerido a

partir de evidências que corantes poliméricos atuavam como substrato de enzimas

ligninolíticas. Os primeiros autores a proporem o uso de corantes poliméricos, para

seleção de microrganismos ligninolíticos foram Glenn e Gold (1983), com o objetivo

de aperfeiçoar os testes. Desde então esse método é utilizado para detectar a

habilidade ligninolítica de espécies de alguns fungos (BALLAMINUT, 2007).

Segundo Machado e colaboradores (2005), o uso de corantes para avaliação

preliminar do potencial degradativo de fungos oferece uma série de vantagens por

35

ser estável, solúvel e barato além de ter baixa toxidade para os esses organismos.

Há evidências que o sistema capaz de descolorir corantes faz parte do sistema de

despolimerização de lignina. A taxa de descoloração não pode ser relacionada à

atividade de uma enzima em particular, mas no resultado da ação de um mecanismo

ligninolítico. Estudos anteriores mostraram que os corantes são descoloridos em

cultura de Phanerochaete chrysosporium e que a inibição da degradação de lignina

também inibe a descoloração do corante. A absorção do corante nessas culturas

sem que haja degradação é mínima, chegando ao máximo de 11% (POINTING,

2001).

A capacidade da maioria dos fungos testados nesse trabalho em descolorir o

corante RBBR em meio sólido está consoante com os resultados encontrados por

Machado e colaboradores (2005) citados no parágrafo anterior. O trabalho de

Moreira-Neto e colaboradores (2009) traz a espécie L. crinitus como sendo capaz de

modificar o pH do meio contendo AEM+RBBR de modo a produzir enzimas e

apresentar altas taxas de descoloração. As dissertações de mestrado de Niebisch

(2009) e Ballaminut (2007) também mostram a habilidade de L. crinitus em descolorir

não só o corante RBBR, como outros tipos de corantes.

Eichlerová e colaboradores (2006) encontraram taxas de descoloração de

fungos em AEM+RBBR de no máximo 80% ao longo de 14 dias, enquanto as taxas

de descoloração obtidas no presente trabalho já chegavam a 100% com apenas 7

dias de incubação.

A degradação de corantes por espécies da família Polyporaceae são

observadas nos trabalhos de Machado e colaboradores (2005), Solarska e

colaboradores (2009) e Bajwa e Arora (2009).

36

4.3 IDENTIFICAÇÃO DAS LINHAGENS SELECIONADAS

4.3.1 Identificação molecular

A amplificação por PCR da região ITS das linhagens TAC 16 e TAC 27 com

os primers ITS 1 e ITS 4 originou fragmentos característicos de aproximadamente

600 pb (Figura 8 e Anexo 3), conforme demonstrado por muitos trabalhos na

literatura (SCHIMIDT; MORETH, 2003; KISS, 1997; ERLAND et al., 1994; GARDES;

BRUNS, 1993) para a região em questão. A análise molecular das amostras mostrou

que a linhagem TAC 16 tem 99% de identidade com Polyporus tricholoma, e a

linhagem TAC 27, 86% de identidade com Lentinus tigrinus.

M 416(1) 416(2) 416(3) 416(4) 16(1) 16(2) 16(3) 27(1) 27(2) 27 (3)

Figura 8: Eletroforese do gel com o produto de PCR das amostra TAC 16 e TAC 27

500 600

37

4.3.2 Identificação clássica

A comparação da descrição morfológica das espécies com os dados

indicados no Mycobank corroboraram a identificação das duas linhagens

Descrição de campo: Basidioma anual, estipitado. Píleo centralmente

estipitado, umbilicado, de creme a levemente castanho, margem com cílios filiformes

de aspecto coriáceo. Margem inteira, ondulada, aguda, ciliada. Contexto reduzido.

Superfície himenial poróide. Gregário, crescendo em tronco (Figura 9).

Polyporus tricholoma

Reino – Fungi

Filo - Basidiomycota

Classe - Agaricomycetes

Ordem - Polyporales

Família - Polyporaceae

Genero - Polyporus

Espécie – Polyporus tricholoma

Figura 9: Basidioma do P. tricholoma

38

Descrição de campo: Píleo coriáceo profundamente umbilicado creme a

castanho, com fibrilas marrons, contexto reduzido. Estipe central e cilíndrica.

Superfície himenial lamelar, com lamelas decurrentes. Gregário, crescendo em

tronco (Figura 10). Em laboratório formou primórdios do corpo de frutificação em

placa com meio BDAL, segundo o MycoBank (Acesso em 12/08/2010) essa

característica distingue essa espécie das demais espécies do genero.

Lentinus tigrinus

Reino – Fungi

Filo - Basidiomycota

Classe - Agaricomycetes

Ordem - Polyporales

Família - Polyporaceae

Genero - Lentinus

Espécie – Lentinus tigrinus

Figura 10: Basidioma do L. tigrinus

39

4.4 PRÉ TESTES PARA OS EXPERIMENTOS DE OTIMIZAÇÃO

Para os experimentos de otimização do meio de cultivo para secreção das

enzimas ligninolíticas foi realizado um pré-experimento para observar em quais dos

quatro substratos propostos ocorreria a maior produção de atividade enzimática:

bagaço de cana (CA), resíduo de cevada (CE), casca de coco (CO) e casca de

mandioca (MA); e quais valores de umidade (80%, 85% e 90%) as linhagens

apresentariam melhor produção após 7 dias de crescimento. De acordo com os

resultados foi observada atividade da enzima lignina peroxidase em todos os

substratos, exceto para L. tigrinus em cevada; da enzima lacase apenas para a

linhagem P. tricholoma em cevada e coco, e L tigrinus em mandioca e coco; e da

manganês peroxidase para P. tricholoma em cevada e L tigrinus em cana. Os

fungos só cresceram em umidade acima de 90%, sendo esta então fixada para os

testes posteriores. Os melhores resultados foram observados para os substratos de

cevada e mandioca sendo estes então selecionados para os experimentos de

otimização (Figuras 11, 12 e 13).

Atividade enzimática de agaricomicetos nos substratos resíduo de cevada,

casca de mandioca e bagaço de cana-de-açúcar já foi observada anteriormente em

diversos trabalhos: Regina e Broetto (2005), Silva e colaboradores (Acesso em

12/12/2009), Menezes e colaboradores (2009) para bagaço de cana-de-açúcar;

Gómez e colaboradores (2005), Gassara e colaboradores (2010), Hatvani e Mécs

(2001), Lorenzo e colaboradores (2002) para resíduo de cevada; Regina e Broetto

(2005), Pandey e colaboradores (2000) para casca de mandioca; Pedra e Marino

(2006) para casca de coco.

Outros substratos alternativos já foram utilizados em diversos trabalhos sobre

atividade lignocelulolítica de cogumelos sensu lato, como: casca de banana, maça,

kiwi, noz, uva, bagaço de laranja, sagu, castanha entre outros com bons resultados

de atividade enzimática de LiP, MnP e Lac (ELISASHVILI; KACHLISHVILI, 2009;

ELISASHVILI et al., 2008; ALEXANDRINO et al., 2007; REDDY et al., 2003;

VIKINESWARY et al., 2006; LORENZO et al., 2002; HATVANI; MÉCS, 2001;

GASSARA et al., 2010; GÓMEZ et al., 2005).

40

CA CO MA CE

L. tigrinus

P. tricholoma0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Susbtrato

Atividade Enzimática

(U/L)

Atividade enzimática de LiPAtividade enzimática de LiP

Substrato

Atividade enzimática

(U/L)

Figura 11: Atividade enzimática de Lignina Peroxidase nos pré testes

CA CO MA

CE

L. tigrinus

P. tricholoma0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Substrato

Atividade enzimática

(U/L)

Atividade enzimática de LacAtividade enzimática de Lac

Substrato

Atividade enzimática

(U/L)

Figura 12: Atividade enzimática de Lacase nos pré testes

41

CA CO MA CE

L. tigrinus

P. tricholoma0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Substrato

AtividadeEnzimática

(U/L)

Atividade enzimática de MnP

4.5 OTIMIZAÇÃO DO MEIO DE CULTIVO PARA PRODUÇÃO DE ENZIMAS

LIGNINOLÍTICAS E DETERMINAÇAO DE SUA ATIVIDADE

Com a ajuda do software Statistica 6.0 foram geradas 18 planilhas de ensaio,

variando-se a concentração relativa dos substratos, pH e temperatura de incubação.

A umidade foi fixada em 90% como citada anteriormente. Os frascos foram

incubados por 7 dias e após esse período foi realizado a extração das enzimas. Para

lacase o maior resultado encontrado para P. tricholoma foi de 6,93 U/L na condição

de cultivo com 100% mandioca, pH 7,0 e 28ºC; para L tigrinus, 8,71U/L no ensaio

com 50% mandioca + 50 % cevada, pH 7,0 e 28ºC. Para lignina peroxidase foi

encontrado o valor de 3,58 U/L para P. tricholoma nas condições de 30% mandioca

+ 70% cevada, pH 4,6 e 23,2ºC e 6,95 U/L para o fungo L tigrinus em 50% mandioca

+ 50% cevada, pH 3,0 e 28ºC. Para manganês peroxidase, 4,66U/L para P.

tricholoma na condição de 50% mandioca + 50% cevada, pH 7,0 e 28 ºC e para L

tigrinus 23,58 U/L em 50% mandioca + 50% cevada, pH 7,0 e 28 ºC (Tabela 6).

Atividade enzimática de MnP

Substrato

Atividade enzimática

(U/L)

Figura 13: Atividade enzimática de Manganês peroxidase nos pré testes

42

Lac (U/L) LiP (U/L) MnP (U/L) pH E.B. Ensaio Subst. pH Temp.

16 27 16 27 16 27 16 27

1 30¹:70² 4,62 23,2 0,277 0,092 3,585 0,000 0,000 0,000 5,1 5,3

2 30¹:70² 4,62 32,8 0,000 0,000 0,000 0,824 0,000 0,000 5,5 5,8

3 30¹:70² 9,38 23,2 0,000 5,841 2,867 0,000 0,000 0,000 5,2 5,6

4 30¹:70² 9,38 32,8 0,082 4,938 0,000 0,932 0,000 1,076 5,3 5,8

5 80¹:20² 4,62 23,2 0,621 0,595 0,000 0,000 0,000 0,000 5,8 5,8

6 80¹:20² 4,62 32,8 0,369 0,949 0,000 0,000 0,000 0,000 5,1 5,8

7 80¹:20² 9,38 23,2 0,000 6,933 0,000 0,000 0,000 0,000 5,6 5,6

8 80¹:20² 9,38 32,8 0,282 8,282 2,437 0,179 0,000 0,000 5,2 5,7

9 0¹:100² 7 28 0,949 4,467 2,258 0,287 0,000 0,000 5,6 6,0

10 100¹:0² 7 28 6,933 4,036 0,036 1,541 0,000 0,000 5,9 5,5

11 50¹:50² 3 28 0,549 7,508 0,000 6,953 0,000 0,000 5,9 5,6

12 50¹:50² 11 28 0,000 5,026 0,000 2,258 4,395 0,000 5,7 5,4

13 50¹:50² 7 20 0,333 0,000 0,000 1,075 0,000 0,000 5,3 5,3

14 50¹:50² 7 36 1,236 7,585 0,000 4,982 3,408 0,000 6,0 5,5

15 50¹:50² 7 28 0,569 8,697 0,000 1,004 4,664 14,709 5,3 5,5

16 50¹:50² 7 28 0,169 8,713 0,000 3,620 0,807 23,587 6,0 5,4

17 50¹:50² 7 28 0,338 8,344 0,000 5,305 1,256 15,247 5,4 5,3

18 50¹:50² 7 28 0,200 0,000 0,000 5,950 0,000 17,220 5,9 5,1

Tabela 6: Atividades enzimáticas das linhagens P. tricholoma (16) e L tigrinus (27) obtidas nos ensaios de otimização (E.B.=extrato bruto; 1-CEVADA; 2-MANDIOCA).

43

4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA PARA P. tricholoma

Tabela 7: Tabela ANOVA para atividade de Lac (P. tricholoma).

SQ= soma quadrática; GL= graus de liberdade; MQ= média quadrática

Tabela 8: Tabela ANOVA para atividade de MnP (P. tricholoma).

R² = 0,66642 SQ GL MQ Fcalc Regressão 19,6061 9 2,1784 0,6664

Resíduo 22,8821 7 3,2688 Ftab

Falta de ajuste 13,9859 5 10% - 2,72

Erro puro 18,8962 2 5% - 3,68

Total 42,4882 16 1% - 6,72

SQ= soma quadrática; GL= graus de liberdade; MQ= média quadrática

Os valores de R² e Fcalc observados nas tabelas 7 e 8 não foram

significativos, portanto esses dados não puderam ser aproveitados para avaliação.

Tabela 9: Tabela ANOVA para atividade de LiP (P. tricholoma).

SQ= soma quadrática; GL= graus de liberdade; MQ= média quadrática

A análise de variância apresentada na tabela 9 demonstrou que os resultados

foram estatisticamente significativos em nível de 5%. A secreção de lignina

peroxidase é dependente do fator substrato, como observado no diagrama de Pareto

onde apenas a barra correspondente a essa variável está posicionada a direita de p

(Figura 14). A análise das interações entre as variáveis mostrou que as melhores

condições de secreção da enzima lignina peroxidase do P. tricholoma tendeu a ficar

R ² = 0,59744 SQ GL MQ Fcalc Regressão 25,4080 9 2,8310 1,15

Resíduo 17,1205 7 2,4458 Ftab

Falta de ajuste 17,0509 5 10% - 2,72

Erro puro 0,0696 2 5% - 3,68

Total 42,5285 16 1% - 6,72

R² = 0,87768 SQ GL MQ Fcalc Regressão 21,7302 9 2,4145 5,5814 Resíduo 3,0285 7 0,4326

Falta de ajuste 3,0285 5 Ftab

Erro puro 0,0 2 5% - 3,68 Total 24,7587 16 1% - 6,72

44

entre as condições de substrato com porcentagem maior de mandioca, temperatura

mais baixa e pH mais ácido (Figuras 15, 16 e 17).

Como as indicações dadas acima têm validade estatística, tentou-se fazer o

experimento de análise de secreção da enzima ao longo do tempo de incubação

(time course) usando como parâmetros temperatura de 23ºC, pH 3,0 e substrato

com 30% de cevada e 70% de mandioca, porém não houve crescimento nas

condições preconizadas e o experimento não pôde ser levado adiante.

Figura 14: LiP: gráfico de Pareto – variáveis significativas

Substrato

pH

Temperatura

Figura 14: LiP: gráfico de Pareto – variáveis significativas

45

2,0 1,5

1,0 0,5

0,0 -0,5

-1,0 -1,5

-2,0 substrato

2,0 1,5

1,0

0,5 0,0

-0,5

-1,0

-1,5

-2,0

temperatura

4

5

6

7

8

9

10

Figura 15: Gráfico de tendência da Lignina Peroxidase: substrato X temperatura

0

1

2

3

4

5

6

2,0 1,5

1,0 0,5

0,0 -0,5

-1,0 -1,5

-2,0 2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5

-1,0

-1,5

-2,0

substrato

pH

Figura 16: Gráfico de tendência da Lignina Peroxidase: substrato X pH

46

O gênero Polyporus caracteriza-se principalmente, por apresentar basidioma

estipitado e sistema hifálico dimítico. A análise do tamanho dos poros e também dos

esporos, é importante na identificação das espécies deste gênero. Todas as

espécies são heterotálicas e tetrapolares, lignícolas e crescem em troncos de

árvores ou madeira morta, possuem exoenzimas que degradam hemicelulose,

celulose e lignina. São causadores da podridão branca, contribuindo para a ciclagem

de nutrientes em ambientes terrestres, o que faz com que esses fungos sejam mais

utilizados que os outros decompositores na aplicação de certos processos

biotecnológicos baseados em materiais lignocelulósicos (VIEIRA, 2005; ISRAEL,

2005).

As condições de cultivo usadas nos ensaio de otimização dessa espécie não

foram favoráveis a produção de Lac e MnP, contudo Peláez e colaboradores (1995),

encontraram para Polyporus arcularius atividade de Lac de 30 U/L e MnP menor que

1 U/L em meio basal por 7 dias, assim como para LiP (< 1 U/L. Semelhantemente

Solarska e colaboradores (2009) detectaram para algumas espécies causadoras de

podridão branca atividade de MnP (60 µmol/L) e Lac (40 µmol/L) em menos de 3

pH

temperatura

-2

-1

1

2

3

4

0

2,0

1,5 1,0

0,5 0,0

-0,5 -1,0

-1,5 -2,0 2,0

1,5 1,0

0,5 0,0

-0,5 -1,0

-1,5 -2,0

Figura 17: Gráfico de tendência da Lignina Peroxidase: pH X temperatura

47

dias de incubação em matéria orgânica. O máximo de atividade de LiP encontrada

por esses autores foi de 20 µmol/L em 24 horas de incubação. A atividade de LiP

detectada, 3,58 U/L, foi maior que a atividade detectada por Zhao e colaboradores

(1996) e Arora e colaboradores (2002), que detectaram apenas 0,173 U/g e 1 U/mL

respectivamente de outros fungos de podridão branca (Tabela 10).

Atividade observada Autor e ano Espécie

Meio/Substrato/ condições LiP Lac MnP

PELÁEZ et al. (1995)

Polyporus arcularius

Meio basal / 7d <1U/L 30U/L <1U/L

Polyporaceae

0,173U/g ZHAO et al.

(1996) Lentinus tigrinus

Meio sólido: ágar + corante

1,463U/g

ARORA et al. (2002)

Polyporaceae

Farelo de trigo 0,1U/mL 8,5U/mL 29,8U/mL

SOLARSKA et al. (2009)

Polyporus sp.

Matéria orgânica: 5d/30°C/125rpm

144U/L 23U/L

FENICE et al. (2003)

Lentinus tigrinus

Água de lavagem de moinho de

azeitona

Não detectada

400U/L

JAOUANI et al. (2003)

Lentinus tigrinus

Água de lavagem de moinho de

azeitona

Não detectada

49U/L 32U/L

D’ANNIBALE et al. (2004)

Lentinus tigrinus

Água de lavagem de moinho de

azeitona

Não detectada

150U/L

LECHNER e PAPINUTTI

(2006)

Lentinus tigrinus

Farelo de trigo Não

detectada 2U/g 19U/g

Tabela 10: Referencias bibliográficas pesquisadas

48

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA PARA L tigrinus

Tabela 11: Tabela ANOVA para atividade de LiP (L. tigrinus).

SQ= soma quadrática; GL= graus de liberdade; MQ= média quadrática

Tabela 12: Tabela ANOVA para atividade de Lac (L. tigrinus).

SQ= soma quadrática; GL= graus de liberdade; MQ= média quadrática

Os valores de R² e Fcalc observados nas tabelas 11 e 12 não foram

significativos, portanto esses dados não puderam ser aproveitados para avaliação.

Tabela 13: Tabela ANOVA para atividade de MnP (L. tigrinus).

SQ= soma quadrática; GL= graus de liberdade; MQ= média quadrática

A análise de variância apresentada na tabela 13 demonstrou que os

resultados são estatisticamente significativos em nível de 5% e de 1%. A secreção

de manganês peroxidase é dependente dos fatores substrato, pH e temperatura

como observado no diagrama de Pareto onde as barras correspondentes a essas

variáveis estão posicionadas a direita de p (Figura 18). A análise das interações

entre as variáveis mostrou que as melhores condições de secreção da enzima

R² = 0,64139 SQ GL MQ Fcalc Regressão 59,3159 9 6,5906 1,39

Resíduo 33,1648 7 4,7378 Ftab

Falta de ajuste 30,2709 5 10% - 2,72

Erro puro 2,8939 2 5% - 3,68

Total 92,4807 16 1% - 6,72

R² = 0,60719 SQ GL MQ Fcalc Regressão 107,7256 9 11,9695 1,20

Resíduo 69,69 7 9,9557 Ftab

Falta de ajuste 69,6027 5 10% - 2,72

Erro puro 0,0873 2 5% - 3,68

Total 177,4156 16 1% - 6,72

R² = 0,95142 SQ GL MQ Fcalc Regressão 851,0618 9 94,562 15,2337 Resíduo 43,4524 7 6,2074

Falta de ajuste 5,4491 5 Ftab

Erro puro 38,0033 2 5% - 3,68 Total 894,5142 16 1% - 6,72

49

manganês peroxidase de L. tigrinus tendeu a ficar entre as condições de substrato

com porcentagens iguais, temperatura média e pH neutro (Figuras 19, 20 e 21).

Esse resultado corrobora a hipótese levantada por Silva e colaboradores

(Acesso em 12/12/2009) de que a maioria dos fungos basidiomicetos cresce melhor

na faixa de temperatura de 20-30ºC e que o controle da temperatura do

desenvolvimento fúngico é um fator chave na regulação da fermentação semi-sólida

para otimização dos processos de deslignificação.

Figura 18: MnP: gráfico de Pareto – variáveis significativas

Substrato

pH

Temperatura

50

-20

0

10

20

30

-10

temperatura

2,0

1,5 1,0

0,5 0,0

-0,5

-1,0 -1,5

-2,0

substrato

2,0

1,5 1,0 0,5

0,0 -0,5

-1,0 -1,5

-2,0

1,5

-20

0

10

20

30

-10

pH

2,0

1,5 1,0

0,5 0,0 -0,5

-1,0

-1,5

-2,0

substrato

2,0 1,5

1,0 0,5

0,0 -0,5

-1,0 -1,5

-2,0

Figura 19: Gráfico de tendência da Manganês Peroxidase: pH X substrato

Figura 20: Gráfico de tendência da Manganês Peroxidase: temperatura X substrato

51

4.8 EXPERIMENTO DO TIME COURSE

Como as indicações dadas acima têm validade estatística, foi realizado o

experimento de análise de secreção da enzima ao longo do tempo de incubação

(time course) usando como parâmetros: temperatura de 28ºC, pH 7,0 e substrato

com 50% de cevada e 50% de mandioca. A análise de secreção da enzima foi feita

no 4º, 7º, 14º, 21º, 28º e 35º dia.

De acordo com o gráfico da Figura 22 observou-se um aumento da atividade

específica até o 28º dia, após o qual foi decrescente até cair pela metade no 35º dia.

A análise de variância com teste de Tukey para comparação das médias foi aplicada

para todos os tempos, havendo diferença estatística significativa entre eles em nível

de significância de 5% (tabela 14), portanto 28 dias de incubação (Figura 25) foi

considerado o melhor tempo para secreção de MnP nas condições de cultivo

otimizadas para L tigrinus (Figura 23). Nesse experimento, de uma forma geral o pH

-20

0

10

20

30

-10

temperatura

2,0

1,5

1,0

0,5 0,0

-0,5 -1,0

-1,5

-2,0

pH

2,0 1,5

1,0 0,5

0,0 -0,5

-1,0 -1,5

-2,0

Figura 21: Gráfico de tendência da Manganês Peroxidase: temperatura X pH

52

dos extratos brutos obtidos variou entre 5,5 e 6,0 mostrando uma tendência de

aumento de pH desses extratos ao longo dos tempos de incubação (Figura 24).

Tabela 14: Atividade específica no time course da MnP (L tigrinus)

Ensaio Tempo (dias)

Ativ. Esp.* (U/mg) (média±desvio)

1 4 0,001 ± 0,000 a

2 7 0,037 ± 0,002 b

3 14 0,083 ± 0,009 c

4 21 0,088 ± 0,004 d

5 28 0,125 ± 0,051 e

6 35 0,052 ± 0,006 f

* Ativ. Esp.: atividade específica Obs.: Os valores de atividade são as médias das replicatas. Médias com letras iguais não diferem entre si, segundo o teste de Tukey

Figura 22: Gráfico do time course de MnP de L tigrinus

Time Course da MnP de L. tigrinus

0,0000,0100,0200,0300,0400,0500,0600,0700,0800,0900,1000,1100,1200,1300,140

0 7 14 21 28 35 42

Tempo (dias)

Atividade específica(U/mg)

Time course da MnP de L. tigrinus

53

Figura 25: L tigrinus no 28º dia de incubação

Figura 24: Gráfico da variação de pH dos extratos brutos usados no time course

pH dos extratos brutos usados no time course

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

4 7 14 21 28 35

Tempos de incubaçao (dias)

pH

pH dos extratos brutos usados no time course

Figura 23: Atividade enzimática de MnP de L. tigrinus no time course

Atividade Enzimática de MnP de L. tigrinus no time course

048

121620242832

4 7 14 21 28 35

Tempo (dias)

Atividadeenzimática (U/L)

Atividade enzimática de MnP de L. tigrinus no time course

54

Como observado na tabela 10, Jaouani e colaboradores (2003) encontraram

para uma linhagem de L. tigrinus em 4 dias de crescimento valor semelhante de

MnP (32 U/L) que o observado no presente trabalho (30 U/L). Por outro lado Lechner

e Papinutti (2006) encontraram para outra linhagem, valor menor de atividade para

MnP (19 um/g) com 7 dias de incubação, o experimento de time course mostrou que

o pico de atividade da enzima MnP foi em torno de 90 dias de incubação (750 um/g),

diferentemente do encontrado no presente trabalho que foi de 28 dias.

D’Annibale e colaboradores (2004) também não detectaram em uma linhagem

de L. tigrinus atividade de MnP com 4 dias de incubação, porém seu pico de

produção foi no 7° dia chegando a detectar o valor de 150 U/L. Semelhantemente

Fenice e colaboradores (2003) não detectaram para outra linhagem da mesma

espécie, atividade de MnP antes do 5° dia de incubação e obtiveram pico de

atividade no 7° dia (400 U/L). A composição do substrato influencia o padrão de

produção da enzima. O substrato em particular usado nos diferentes trabalhos em

fermentação semi-sólida tem a capacidade de induzir ou aumentar a produção de

lignocelulases (LECHNER; PAPINUTTI, 2006). As características genéticas das

espécies, assim como os parâmetros físico-químicos como pH, nitrogênio,

temperatura, oxigenação e presença de minerais também interferem na produção e

ação das enzimas (KAMIDA et al., 2005).

As condições de cultivo desse fungo não foram favoráveis à produção de Lac

e LiP e as melhores condição para produção de MnP foram: Composição de

substrato com 50% de cevada e 50% de mandioca, pH 7,0, umidade de 90%,

incubação de 28° C por 28 dias. Corroborando os dados obtidos em literatura

(Tabela 10), não foi detectada atividade de LiP. Essa enzima é tida como catalizador

primário na deslignificação fúngica, sendo que sua atividade extremamente difícil de

detectar nos processos de degradação. Tem sido relatado que geralmente fungos de

degradação branca somente expressam LiP durante seu metabolismo secundário

(idiofase) e a produção dessa enzima está atrelada a diminuição de certos nutrientes

(nitrogênio, carbono ou enxofre) (ZHAO et al., 1996).

4.9 EFEITO DO pH NA ATIVIDADE DE MNP DE L. tigrinus

Determinado o melhor tempo de incubação para secreção dessa enzima foi

realizado o experimento de determinação de pH ótimo de atividade da enzima,

variando o pH do meio reacional. A MnP de L. tigrinus obtida nas condições

55

otimizadas de substrato 50% cevada e 50% de mandioca com 90% de umidade em

pH 7,0 e incubado por 28 dias a 28° C atuou bem em uma faixa grande de pH, que

variou de 4,0 a 8,0 (Tabela 15). A melhor atividade verificada foi em pH 5,0 com

18,65 U/L (Figura 26).

Tabela 15: Atividade da MnP frente a diferentes valores de pH do meio reacional

Os valores de atividade são as médias das replicatas. Médias com letras iguais não diferem entre si, segundo o teste de Tukey

pH Ativ. Enzimática (U/L)

(média±desvio)

3,0 11,18 ± 4,208 a

4,0 17,61 ± 3,123 b

4,5 16,32 ± 5,748 c

5,0 18,65 ± 2,199 d

6,0 18,48 ± 4,215 e

7,0 18,42 ± 4,454 f

8,0 17,79 ± 5,108 g

9,0 14,89 ± 3,963 h

10,0 10,55 ± 0,903 i

11,0 13,3 ± 3,670 j

Figura 26: Gráfico da variação da atividade específica de MnP com pH do meio reacional

Determinação do pH ótimo de atividade da MnP de L. tigrinus

89

1011121314151617181920

3,0 4,0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

pH

Atividade Enzimática (U/L)

56

O amplo espectro de atuação de pH verificado nessa enzima discorda de

outros trabalhos como o de Niebisch (2009). Neste trabalho os fungos de

degradação branca geralmente apresentam uma faixa de atividade de MnP mais

ácida variando de 2,6 a 4,5. A vasta faixa de atuação indica que essa enzima poderá

vir a ser uma vantagem para a utilização em processos industriais.

57

5 CONSIDERACOES FINAIS

• Os agaricomicetos s.l. é um grupo presente em várias regiões do estado da

Bahia, porém ainda é pouco inventariado, sendo de extrema importância

estudos nessa área.

• De uma forma geral os agaricomicetos coletados no estado da Bahia têm

grande potencial de produção de enzimas ligninolíticas, devido à capacidade

da grande maioria das espécies em descolorir o RBBR.

• As condições de cultivo testadas para P. tricholoma não foram favoráveis a

produção de Lac e MnP. Contudo não se pode afirmar que essa espécie não

produza tais enzimas, sendo necessários estudos posteriores para determinar

os parâmetros de produção

• As condições ótimas de produção de LiP de P. tricholoma foram em

concentração de substrato com 30% de cevada e 70% mandioca com 90% de

umidade, pH 3,0 e incubação a 23ºC. Estudos posteriores são necessários

para determinar o melhor tempo de incubação.

• As condições de cultivo testadas para L. tigrinus não foram favoráveis a

produção de Lac e LiP. Contudo não se pode afirmar que essa espécie não

produza tais enzimas, sendo necessários estudos posteriores para determinar

os parâmetros de produção.

• Para L. tigrinus o melhor resultado de secreção de enzima foi da MnP em

condições ótimas de composição de substrato 50% de cevada e 50% de

mandioca, pH 7,0 a uma temperatura de 28°C e por um período de incubação

de 28 dias.

• A enzima MnP de L. tigrinus secretada nestas condições tem seus melhores

resultados de atividade em pH 5,0.

• Estudos posteriores para determinação de temperatura ótima de atividade

devem ser feitos para MnP de L. tigrinus.

• A MnP de L. tigrinus é ativa numa ampla faixa de pH, o que pode indicar uma

aplicabilidade industrial.

• As duas linhagens testadas de P. tricholoma e L. tigrinus mostraram ser

dependentes dos fatores: substrato, umidade, pH, temperatura e tempo de

incubação para produção de enzimas.

58

• Os resíduos agroindustriais de cevada e mandioca usados são bons

substratos para produção de enzimas ligninolíticas como observados nos

resultados obtidos

• São necessários estudos posteriores no sentido de testar a eficiência na

bioconversão de lignina pelas enzimas produzidas no presente trabalho

59

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MnP (U/L)CA – 27 CE – 16

Abs εxRxT Abs εxRxT0,006 1000000 11150 0,009 1000000 11150

TOTAL 0,538117 TOTAL 0,807175

106 106

Lac (U/L)CE – 16 CO – 16

Abs εxRxT Abs εxRxT0,005 1000000 195000 0,010 1000000 195000

TOTAL 0,025641 TOTAL 0,051282MA – 27 CO – 27

Abs εxRxT Abs εxRxT0,193 1000000 195000 0,021 1000000 195000

TOTAL 0,989744 TOTAL 0,107692

106 106

106 106

LiP (U/L)CA – 27 CE – 16

Abs εxRxT Abs εxRxT0,069 1000000 27900 0,048 1000000 27900

TOTAL 2,473118 TOTAL 1,720430CA – 16 MA – 16

Abs εxRxT Abs εxRxT0,050 1000000 27900 0,055 1000000 27900

TOTAL 1,792115 TOTAL 1,971326CO – 16 MA – 27

Abs εxRxT Abs εxRxT0,009 1000000 27900 0,085 1000000 27900

TOTAL 0,322581 TOTAL 3,046595CO – 27

Abs εxRxT0,042 1000000 27900

TOTAL 1,505376

106 106

106 106

106 106

106

7 APÊNDICES

Apêndice 1: Cálculo da atividade enzimática das enzimas lacase, lignina peroxidase e manganês peroxidase nos pré-testes.

70

Apêndice 2: Cálculo da absorbância da MnP de L. tigrinus no time course.

Time Course - MnP (27)

R1 R2 R3 F1 NF1 F1 NF1 F1 NF1 Média

0,159 0,100 0,094 0,107 0,125 0,223 0,017 F2 NF2 F2 NF2 F2 NF2 Média

0,133 0,079 0,086 0,096 0,080 0,107 -0,006 F3 NF3 F3 NF3 F3 NF3 Média

Tempo 1 4dias

0,119 0,125 0,144 0,120 0,095 0,107 -0,002 Total 0,003

R1 R2 R3 F1 NF1 F1 NF1 F1 NF1 Média

0,113 0,211 0,124 0,192 0,103 0,164 0,076 F2 NF2 F2 NF2 F2 NF2 Média

0,118 0,209 0,117 0,219 0,102 0,164 0,085 F3 NF3 F3 NF3 F3 NF3 Média

Tempo 2 7dias

0,140 0,211 0,108 0,223 0,108 0,291 0,123 Total 0,095

R1 R2 R3 F1 NF1 F1 NF1 F1 NF1 Média

0,285 0,488 0,146 0,479 0,271 0,492 0,252 F2 NF2 F2 NF2 F2 NF2 Média

0,313 0,509 0,161 0,613 0,179 0,349 0,273 F3 NF3 F3 NF3 F3 NF3 Média

Tempo 3 14dias

0,162 0,426 0,133 0,475 0,158 0,406 0,285 Total 0,270

R1 R2 R3 F1 NF1 F1 NF1 F1 NF1 Média

0,127 0,428 0,206 0,461 0,133 0,385 0,269 F2 NF2 F2 NF2 F2 NF2 Média

0,167 0,390 0,219 0,499 0,129 0,437 0,270 F3 NF3 F3 NF3 F3 NF3 Média

Tempo 4 21dias

0,128 0,427 0,184 0,468 0,174 0,478 0,296 Total 0,278

R1 R2 R3 F1 NF1 F1 NF1 F1 NF1 Média

0,097 0,247 0,054 0,406 0,060 0,205 0,216 F2 NF2 F2 NF2 F2 NF2 Média

0,116 0,759 0,054 0,379 0,142 0,330 0,385 F3 NF3 F3 NF3 F3 NF3 Média

Tempo 5 28dias

0,063 0,480 0,057 0,657 0,096 0,293 0,405 Total 0,335

R1 R2 R3

F1 NF1 F1 NF1 F1 NF1 Média

0,066 0,093 0,101 0,201 0,090 0,251 0,096

F2 NF2 F2 NF2 F2 NF2 Média

0,096 0,254 0,085 0,302 0,081 0,240 0,178

F3 NF3 F3 NF3 F3 NF3 Média

Tempo 6 35dias

0,068 0,208 0,076 0,396 0,082 0,239 0,206

71

MnP T1 MnP T4Abs 106 εxRxT Abs 106 εxRxT

0,003 1000000 11150 0,278 1000000 11150TOTAL 0,269058 TOTAL 24,932735

MnP T2 MnP T5Abs 106 εxRxT Abs 106 εxRxT

0,095 1000000 11150 0,335 1000000 11150TOTAL 8,520179 TOTAL 30,044843

MnP T3 MnP T6Abs 106 εxRxT Abs 106 εxRxT

0,270 1000000 11150 0,206 1000000 11150TOTAL 24,215247 TOTAL 18,475336

Apêndice 3: Cálculo da atividade enzimática da MnP de L. tigrinus no time course (U/L).

72

Apêndice 4: Determinação do teor de proteína total (método de Bradford) de L. tigrinus no time course.

Tempos [ ] Proteína (mg/mL) Média T1-1-1 0,173 0,196667 T1-1-2 0,151 T1-1-3 0,266 T1-2-1 0,223 0,219333 T1-2-2 0,237 T1-2-3 0,198 T1-3-1 0,184 0,201667 T1-3-2 0,213 T1-3-3 0,208 T2-1-1 0,345 0,266333 T2-1-2 0,312 T2-1-3 0,142 T1-2-1 0,223 0,234333 T2-2-2 0,206 T2-2-3 0,274 T2-3-1 0,197 0,244 T2-3-2 0,284 T2-3-3 0,251 T3-1-1 0,249 0,259 T3-1-2 0,251 T3-1-3 0,277 T3-2-1 0,227 0,313 T3-2-2 0,364 T3-2-3 0,348 T3-3-1 0,271 0,326333 T3-3-2 0,354 T3-3-3 0,354 T4-1-1 0,288 0,281333 T4-1-2 0,207 T4-1-3 0,349 T4-2-1 0,348 0,3 T4-2-2 0,254 T4-2-3 0,298 T4-3-1 0,347 0,292667 T4-3-2 0,286 T4-3-3 0,245 T5-1-1 0,104 0,187333 T5-1-2 0,237 T5-1-3 0,221 T5-2-1 0,279 0,305667 T5-2-2 0,307 T5-2-3 0,331 T5-3-1 0,354 0,328667 T5-3-2 0,34 T5-3-3 0,292 T6-1-1 0,438 0,361333 T6-1-2 0,304 T6-1-3 0,342 T6-2-1 0,364 0,405 T6-2-2 0,464 T6-2-3 0,387 T6-3-1 0,384 0,345 T6-3-2 0,42 T6-3-3 0,231

73

Apêndice 5: Cálculo da absorbância e atividade enzimática nos ensaios de determinação do pH ótimo

pH ótimo - MnP (27) R1 R2 R3

AP P AP P AP P Média

0,326 0,425 0,369 0,578 0,386 0,564 0,162 AP P AP P AP P Média

0,335 0,480 0,341 0,490 0,346 0,472 0,140 AP P AP P AP P Média

pH 3,0

0,351 0,421 0,357 0,400 0,399 0,503 0,072 Total 0,125

R1 R2 R3 AP P AP P AP P Média

0,312 0,542 0,350 0,579 0,356 0,574 0,226

AP P AP P AP P Média 0,312 0,497 0,248 0,483 0,313 0,508 0,205

AP P AP P AP P Média

pH 4,0

0,321 0,550 0,313 0,472 0,318 0,404 0,158 Total 0,196

R1 R2 R3 AP P AP P AP P Média

0,297 0,396 0,296 0,391 0,311 0,466 0,116 AP P AP P AP P Média

0,304 0,581 0,307 0,533 0,300 0,529 0,244 AP P AP P AP P Média

pH 4,5

0,293 0,418 0,302 0,456 0,311 0,590 0,186 Total 0,182

R1 R2 R3 AP P AP P AP P Média

0,291 0,370 0,345 0,604 0,314 0,524 0,183 AP P AP P AP P Média

0,295 0,485 0,295 0,561 0,290 0,530 0,232 AP P AP P AP P Média

ph 5,0

0,323 0,588 0,303 0,439 0,313 0,539 0,209 Total 0,208

R1 R2 R3 AP P AP P AP P Média

0,318 0,575 0,311 0,380 0,324 0,476 0,159 AP P AP P AP P Média

0,317 0,516 0,316 0,661 0,320 0,536 0,253 AP P AP P AP P Média

pH 6,0

0,321 0,500 0,322 0,591 0,314 0,483 0,206 Total 0,206

R1 R2 R3

AP P AP P AP P Média

0,334 0,546 0,317 0,456 0,313 0,444 0,161

AP P AP P AP P Média

0,339 0,456 0,360 0,634 0,349 0,545 0,196

AP P AP P AP P Média

pH 7,0

0,348 0,583 0,346 0,576 0,378 0,689 0,259

Total 0,205

74

R1 R2 R3

AP P AP P AP P Média

0,321 0,419 0,321 0,515 0,322 0,468 0,146

AP P AP P AP P Média

0,337 0,594 0,341 0,487 0,351 0,517 0,190

AP P AP P AP P Média

pH 8,0

0,350 0,486 0,338 0,430 0,355 0,707 0,259 Total 0,198

R1 R2 R3

AP P AP P AP P Média

0,319 0,517 0,309 0,398 0,302 0,360 0,115

AP P AP P AP P Média

0,377 0,553 0,364 0,601 0,347 0,504 0,190

AP P AP P AP P Média

pH 9,0

0,388 0,650 0,354 0,450 0,330 0,429 0,193

Total 0,166

R1 R2 R3

AP P AP P AP P Média

0,299 0,405 0,319 0,477 0,300 0,394 0,119

AP P AP P AP P Média

0,345 0,491 0,335 0,421 0,354 0,442 0,107

AP P AP P AP P Média

pH 10,0

0,370 0,475 0,330 0,475 0,320 0,452 0,127

Total 0,118

R1 R2 R3

AP P AP P AP P Média

0,308 0,449 0,311 0,440 0,322 0,460 0,136

AP P AP P AP P Média

0,305 0,407 0,385 0,540 0,352 0,440 0,115

AP P AP P AP P Média

pH 11,0

0,340 0,496 0,372 0,667 0,365 0,495 0,194

Total 0,148

75

Apêndice 6: Cálculo da atividade enzimática da MnP de L. tigrinus nos ensaios de determinação do pH ótimo

pH 3,0

Abs. 106 εxRxT 0,125 1000000 11150

TOTAL 11,210762 pH 4,0

Abs. 106 εxRxT 0,196 1000000 11150

TOTAL 17,578475 pH 4,5

Abs. 106 εxRxT 0,182 1000000 11150

TOTAL 16,322870 pH 5,0

Abs. 106 εxRxT 0,208 1000000 11150

TOTAL 18,654709 pH 6,0

Abs. 106 εxRxT 0,206 1000000 11150

TOTAL 18,475336 pH 7,0

Abs. 106 εxRxT 0,205 1000000 11150

TOTAL 18,385650 pH 8,0

Abs. 106 εxRxT 0,198 1000000 11150

TOTAL 17,757848 pH 9,0

Abs. 106 εxRxT 0,166 1000000 11150

TOTAL 14,887892

pH 10,0

Abs. 106 εxRxT 0,118 1000000 11150

TOTAL 10,582960 pH 11,0

Abs. 106 εxRxT 0,148 1000000 11150

TOTAL 13,273543

76

Apêndice 7: Teor de proteína total, atividade enzimática e atividade específica de P. tricholoma (16) e L. tigrinus (27), nos ensaios de otimização.

Amostra

27

[ ]

mg/mL

[ ]

mg/L

Lac

(UI/L)

LiP

(UI/L)

MnP

(UI/L)

Lac

(U/mg)

LiP

(U/mg)

MnP

(U/mg)

27-1-2 0,085 85 0,092308 0 0 0,001086 0 0 27-2-2 0,154 154 0 0,824373 0 0 0,005353 0 27-3-2 0,094 94 5,84103 0 0 0,062139 0 0 27-4-3 0,16 160 4,938462 0,9319 1,076233 0,030865 0,005824 0,006726 27-5-3 0,218 218 0,594872 0 0 0,002729 0 0 27-6-3 0,077 77 0,948718 0 0 0,012321 0 0 27-7-1 0,078 78 6,933333 0 0 0,088889 0 0 27-8-1 0,087 87 8,282051 0,179211 0 0,095196 0,002060 0 27-9-3 0,055 55 4,466667 0,286738 0 0,081212 0,005213 0

27-10-1 0,072 72 4,035897 1,541219 0 0,056054 0,021406 0 27-11-3 0,121 121 7,507692 6,953405 0 0,062047 0,057466 0 27-12-2 0,111 111 5,025641 2,258065 0 0,045276 0,020343 0 27-13-2 0,033 33 0 1,075269 0 0 0,032584 0 27-14-3 0,058 58 7,584615 4,982079 0 0,130769 0,085898 0 27-15-1 0,11 110 8,697436 1,003584 14,70852 0,079068 0,009123 0,133714 27-16-3 0,129 129 8,712821 3,620072 23,58744 0,067541 0,028063 0,182848 27-17-3 0,106 106 8,34359 5,304659 15,24664 0,078713 0,050044 0,143836 27-18-3 0,041 41 0 5,949821 17,21973 0 0,145118 0,419993

Amostra

16

[ ]

mg/mL

[ ]

mg/L

Lac

(U/L)

LiP

(U/L)

MnP

(U/L)

Lac

(U/mg)

LiP

(U/mg)

MnP

(U/mg)

16-1-2 0,005000 5 0,276923 3,585229 0 0,055385 0,717046 0 16-2-2 0,016000 16 0 0 0 0 0 0 16-3-2 0,001809 1,8 0 2,867384 0 0 1,592991 0 16-4-1 0,010000 10 0,082051 0 0 0,008205 0 0 16-5-2 0,044000 44 0,620513 0 0 0,014103 0 0 16-6-1 0,025000 25 0,369231 0 0 0,014769 0 0 16-7-3 0,021000 21 0 0 0 0 0 0 16-8-1 0,017000 17 0,282051 2,437276 0 0,016591 0,143369 0 16-9-1 0,001704 1,7 0,948718 2,258065 0 0,558069 1,328274 0 16-10-2 0,027000 27 6,933333 0,035842 0 0,256790 0,001327 0 16-11-3 0,009000 9 0,548718 0 0 0,060969 0 0 16-12-1 0,100000 100 0 0 4,394619 0 0 0,043946 16-13-2 0,031000 31 0,333333 0 0 0,010753 0 0 16-14-2 0,038000 38 1,235897 0 3,408072 0,032524 0 0,089686 16-15-1 0,009000 9 0,569231 0 4,663677 0,063248 0 0,518186 16-16-2 0,027000 27 0,169231 0 0,807175 0,006268 0 0,029895 16-17-1 0,003422 3 0,338462 0 1,255605 0,112821 0 0,418535 16-18-3 0,069000 69 0,2 0 0 0,002899 0 0

77

Curva padrao BSA

y = 0,0021x + 0,0051

R2 = 0,9871

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,01 0,02 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5

[ ] mg/mL

Ab

sorb

anci

a

Apêndice 8: Curva padrão de albumina usada na determinação de proteína total pelo método de Bradford.

78

8 ANEXOS

Anexo 1: Média das triplicatas dos halos de crescimento dos fungos.

Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

32 8 11.16 14.83 20.66 28 32.33 38.33 45.66 51.5 57.83 64.33 69.83 75.33 79.66

20 18 28.66 41.66 58.33 74.5 82.66 90 90 90 90 90 90 90 90

09.1 12.33 21 29.75 41 53 61 69 77.25 84.25 87 90 90 90 90

9 11.83 16 29 40.5 51.83 59.33 65.83 75.83 82.16 89.16 90 90 90 90

16 19.5 29.75 45.5 64.25 77 84.5 90 90 90 90 90 90 90 90

13 18.5 29.5 38 49 60 67 72 80.5 82 83.5 84 90 90 90

15 15.16 21.5 28 36 44.83 52 59.16 67.5 74.5 80.5 90 90 90 90

27 16 25.16 36.5 48.16 61.5 71.83 83.66 88.16 90 90 90 90 90 90

05.1 12.83 18.66 26.66 35.83 43.5 50.83 58.66 65.33 72.5 78.5 83.83 89.66 90 90

06.2 14.16 22.5 34.16 45 56 64.83 73.16 81 87.16 90 90 90 90 90

14 22.83 34.5 48.33 63.66 81.66 87.5 90 90 90 90 90 90 90 90

201.2 6.16 6.5 7.5 8.33 9 10 10 11.33 12.5 13.83 15.5 17.33 20 20.83

264.2 20 28.66 39.66 49.66 59.33 68.16 73.5 80.33 90 90 90 90 90 90

269 6.66 7.83 9.5 11.16 12.66 14.83 16.83 20.16 22.66 25.5 27.66 30.16 31.16 33

309 6.16 7.16 8.33 8.5 8.83 10 10.33 11.83 12.5 12.83 13.5 14.5 15.5 16.5

197 9.5 12.16 15 17.16 19.66 22.5 25 28.5 31.83 36.33 39.83 44.16 47.33 50.83

312 13.33 23.33 32.33 44.66 59.83 64.5 76.25 85 88 90 90 90 90 90

306 7.5 8.5 11.33 14.5 18.16 22.5 24 27.16 31 34.16 37.33 40.66 44.66 47.16

201.1 0 0 6.66 11.16 16 19.83 23.16 27.16 30.16 34.33 36.5 40 43.5 47.33

79

Anexo 2: Média das triplicatas dos halos de descoloração do RBBR dos fungos.

Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

32 0 0 0 0 0 22.33 25.5 33 42.4 44.66 53.33 59.66 66.16 71.16

20 10.5 11.66 29.66 48.33 64.5 75.66 90 90 90 90 90 90 90 90

09.1 16.33 23 29.75 41 52.5 61 68.5 77.25 84.25 87 90 90 90 90

9 13.66 22.16 29 40.5 51.66 59.33 65.83 74.16 82.16 89.16 90 90 90 90

16 8.25 14.75 39.5 56.75 57.75 84.5 90 90 90 90 90 90 90 90

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

27 0 25.16 36.5 48.16 61.5 71.83 83.66 89 90 90 90 90 90 90

05.1 0 0 0 0 0 41.25 58.25 64 72.5 79.5 83.83 90 90 90

06.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

201.2 8 8.66 10.83 13.16 13.83 13.83 14.33 14.33 16.6 17.5 19.16 20.83 25 27.33

264.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

269 15.5 16.33 19.83 21.83 25.83 29.5 30.83 36.33 40.83 41.16 41.16 44.66 45 43

309 21.83 26.16 28.66 32.33 35.83 39.5 42.33 43.66 48 51.66 57.16 57.66 60.5 68

197 14 17.16 21.5 25.5 30.16 32 34.16 38.33 43.66 43.83 47 51.66 55.33 58.33

312 0 0 0 0 0 0 65 74 88 90 90 90 90 90

306 0 9.66 12.83 14.5 18.16 21.83 24 27.16 34.16 37.33 40.66 44.66 48.16 52.5

201.1 0 6.5 9.5 12.33 18.33 24.5 27 30.16 34.16 36.16 41 44.66 48.16 52.33

80

Anexo 3: Seqüências originadas pelo primer direto das linhagens selecionadas para os testes de otimização.

Fungo16(1) – P. tricholoma

GCCTTACGAGGCATGTGCTCGCCCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACA

ATACTGTAGGCTTCAGGAGCTTCTCGGGCTTTCATTAGCTCGGGTTGTAACT

GAGCTTACGTTTACTACAAACATCATACAGTATCAGAATGTGTATTGCGATA

AACGCATCTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT

GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA

ATCATCGAATCTTTGAACGCACCCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCAT

GCCTGTTTGAGTGTCGTGAAATTCTCAACCTAACAAGTTTGGTACGAGCTTG

CTTTAGGCTTGGACTTGAAGGTCTTGCTGGCTGCTCGTCCAGTCCGGCTC

Fungo27 (1) – L. tigrinus

TTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCCCTGCTCATCCACTCTACACC

TGTGCACTAACTGTAGGCTTTCGGGAGCTTCGAAAGCAGAGGGGACTGGCC

TTCACAAGCCGGTCTCTAATGCCTGTAGTTGTGACCGGGGCTTACGTCTTAC

CACAAACTCTTACAAGTATCAGAATGTGTATTGCGATGTAACGCATCTATAT

ACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGC

GAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT

TGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTAAGTGG

TCATTGAAATTCCTCAACCTACCGGTTTCTTAAACCGGACTTGGCTTAGGGC

TGGAACTTGGAGAGGCTTGTGTCGCGTTTTGCTTCCGGGCATAAGTCGCCCT

CCCCCTCAAATCGCATTAAGCTTGGGTTCCTTTGGGGATCGGCTC