Estudios de actividad de antifúngicos Estudios de actividad de antifúngicos “in vitro”“in vitro”

A.I. SuárezUGC Enfermedades Infecciosas y

Microbiología Clínica

Aumento nº pacientes disfunción sistema inmunitario:SIDATransplantesProcesos hematológicos/oncológicos/quimioterapia agresivaPacientes ICU

Aumento uso de antifúngicos de uso local y sistémicoAparición de resistencias antifúngicosNecesario disponer de pruebas de sensibilidad a antifúngicos

Aumento nº infecciones fúngicas/ Aumento mortalidad en pacientes de alto riesgo (40-90%)

Aumento nº especies hongos patógenos y cambio epidemiología

D. Bitar Emerging Infect Dis 2014; 20: 1149-1155

p < 0.001p < 0.001

Pruebas de sensibilidad a antifúngicosPruebas de sensibilidad a antifúngicos

Objetivo principal: detección mecanismos de resistencia en cepas productoras de la infección.Objetivo secundario: seleccionar el antifúngico activo para esa infección.Factores limitantes al estudio “in vitro”:

Características del antifúngicoRespuesta inmune pacienteEnfermedad de base del pacienteTratamiento de base del pacienteFactores asociados al tipo de hongo, incluyendo sensibilidad a antifúngicosLocalización de la infecciónInteracción paciente-hongo infectante-antifúngico

Métodos de detección de la resistencia a antifúngicosMétodos de detección de la resistencia a antifúngicos

Métodos de referencia:Método CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)en Estados Unidos.Método EUCAST (European Committee on AntimicrobialSusceptibility System) en Europa.Microdilución, resultados similares, identifican cepasresistentes entre cepas sensibles, cepas controles .

Métodos comerciales: diseñados para el laboratorio clínico

Difusión con discos o E-test, Sensititre Yeast One, Micronaut Microdilution, Vitek, ATB fungus 2. Facilidad uso, flexibilidad, estandarizados y rápidos (24 horas(24 horas).Discrepancias (errores muy mayores) < 5%.

M. Cuenca-Estrella. Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Supl 6): 54-59.

Métodos no estandarizados

Detección molecular de resistencia Detección molecular de resistencia antifúngicosantifúngicos

Otros métodos detección resistencia a antifúngicos:Otros métodos detección resistencia a antifúngicos:Citometría de flujoCitometría de flujo

Las alteraciones en la viabilidad del hongo se identifican como cambios en la emisión de fluorescencia. Se expresa en MFEC (mínima fluorescencia aumentada), la más baja concentración de antifúngico en el que el % de células con ↑ fluorescencia es > valor CO predeterminado

(50% C.glabrata y C.krusei y 40% C.parapsilosis).

Vale-Silva L.A. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31:941-946

Sin CAS 0.03 mg/L 0.06 mg/L 0.125 mg/l 0.25 mg/L

C.glabrata y Caspofungina4 h incubación

Otros métodos detección resistencia a antifúngicos:Otros métodos detección resistencia a antifúngicos:MALDI-TOF MS (Espectrometría de masas)MALDI-TOF MS (Espectrometría de masas)

Discrimina aislados sensibles, de resistentes después de 3 h de incubación con caspofungina

Vella A. J Clin Microbiol 2013; 51:2964-2969

C.albicans wildtype C.albicans mutante fks

Otros métodos detección resistencia a antifúngicosOtros métodos detección resistencia a antifúngicosMicrocalorimetría isotérmicaMicrocalorimetría isotérmica

MHIC (concentración calor mínima inhibitoria): La más baja concentración AF que inhibe 50 % del calor producido por el control sin AF o para CAS y AND, la menor concentración que reduce el pico de flujo de calor en 50%.

Furustrand Tafin U. Clin Microbiol. Infection 2012; 18: E241-E245.

¿Qué valor de CMI separa cepas sensibles y ¿Qué valor de CMI separa cepas sensibles y resistentes? resistentes?

R R

Puntos de corte especie-específicos (EUCAST) 2015

Los puntos de corte epidemiológicos y clínicos poseen una mayor sensibilidad para detectar resistencias emergentes y tienen utilidad

clínica.

+

Puntos de corte especie-específicos (EUCAST) 2015

Los puntos de corte epidemiológicos y clínicos poseen una mayor sensibilidad para detectar resistencias emergentes y tienen utilidad

clínica.

M.Cuenca-Estrella, J.L. Rodriguez-Tudela Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2010; 8: 267–

276.

Aplicación puntos de corte

Fothergill A.W. y cols. J Clin Microbiol 2014; 52: 994-997.

Impacto nuevos puntos de corte CLSI 2012

Incremento % cepas resistentes

Orash C. y cols. Clin Microbiol Infection 2014; 20:698-705.

Candidemias Suiza 2004-2009

↑ R azoles: C.tropicalis y C.parapsilosis↑ R Cas: C.glabrata y C.krusei

Resistencia a antifúngicosResistencia a antifúngicos

Resistencia microbiológica: el patógeno es inhibido por una concentración más alta de ese antifúngico, en comparación con la concentración que inhibe a las cepas sensibles (sin mecanismos de resistencia)Resistencia clínica/fallo tratamiento el patógeno se inhibe a una concentración del antifúngico que conlleva una alta probabilidad de fallo terapeútico (concentración superior a la dosis normal y segura del antifúngico)Resistencia microbiológica y clínica

M. A. Pfaller and D. J. DiekemaJ. Clin. Microbiol. 2012; 50:2846-2856.

ConsecuenciasResistencia

EpidemiologíaEpidemiología

Gran importancia de la distribución de especies y sensibilidad a antifúngicos en diferentes países y a nivel local en cada hospital.

Monitorización continua

Estudio Candipop05/2011-05/2012Candidemias en España5 ciudades, 29 hospitales

M.Puig-Asensio. Clin Microbiol Infect 2014; 20: O245-O254.

Mecanismos de resistencia en hongos Mecanismos de resistencia en hongos levaduriformeslevaduriformes

Azoles (Fluconazol, Voriconazol…): 10-25 %Sobreexpresión genes codificantes de bombas de expulsión:

* bombas ABC (ATP binding cassette): R cruzada todos azoles * bombas MFS (major facilitator superfamily): R FZ y VOR

* ambas.

Mutaciones puntuales gen (sustitución aa) codifica la enzima diana ERG11: alteraciones estructura tridimensional proteína, conlleva menor afinidad unión enzima-antifungico: ↑ valor CMI.

Sobreexpresión o regulación elevada enzima ERG11 alteradoMutaciones enzima ERG3: Bypass metabólico para sintetizar fecosterol (incapaz reemplazar al ergosterol). R cruzada azoles.

Pueden coexistir varios: adquisición secuencial bajo presión antifúngica.

Anfotericina B: 1-3 %Mecanismo no claro: mutaciones genes (ERG2, ERG3, ERG5, ERG6,ERG11)que regulan la biosíntesis del ergosterol :cambios composición membrana.

Equinocandinas (Caspofungina, Micafungina,…): raraMutaciones puntuales gen FKS1 que codifica la enzima 1-3 ß glucano sintetasa (síntesis glucanos pared). Mutaciones localizadas en regiones “hotspot” HS1 y HS2.R cruzada: modificación propiedades cinéticas/catalíticas enzima diana.Respuestas adaptativas al stress: ↑ contenido quitina pared y cambios aa que aumentan CMI.Mutaciones FKS intrínsecas de la diana glucanosintetasa, confieren elevadas CMI, en C.guilliermondii y C.parapsilosis. Sin relevancia clínica.

M. A. Pfaller. Am J Med 2012; 125, S1-S14

Sobreexpresión bombas de expulsión:MDR: FZ

CDR: azoles

Modificación enzima dianaSobreexpresión diana

Modificación otras enzimas

DISMINUCIÓN CONCENTRACIÓN INTRACELULAR ANTIFÚNGICO

M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Supl 6): 42-48.

M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014; 20 (Supl 6): 42-48.

Candida glabrata

Candida parapsilosis

Candidemias, Madrid, 2007-2013

L.J. Marcos-Zambrano. Antimicrob.Agents Chemother 2014;58:4565-4572.

M.A. Pfaller. J Clin Microbiol 2012: 50:1199-1203

20-30 % Candidemias : especies FluR intrinseca(Pre-azoles: 85 % C.albicans FluS)

M. Arendrup. Curr Opin Infect Dis 2014; 27: 484–49.

Resistencia Equinocandinas:Después de ≥ 3-4 semanas de tratamiento

Más frecuente en C.glabrata

En aumento

Mecanismos de resistencia en hongos Mecanismos de resistencia en hongos filamentososfilamentosos

Azoles (Fluconazol, Voriconazol…): < 5%Mutaciones gen Cyp51A: alteraciones estructurales enzima diana 14 -esterol-demetilasa: ↓ afinidadSobreexpresión bombas expulsión ABC y/o MFSMutación región promotora Cyp51A : sobreexpresión proteína resultante.

Equinocandinas (Caspofungina, Micafungina,…):Mutaciones puntuales gen FKS1 que codifica la enzima 1-3 ß glucano sintetasa (síntesis glucanos pared).

Polienos (Anfotericina B): rara. Excepción A.terreus y A.flavus : altas CMI.

Sobreexpresión bombas de expulsión:

Aumento nº copias diana

Modificación diana

INTERACCION ANTIFÚNGICO-DIANAINEFICIENTE

DISMINUCIÓN CONCENTRACIÓN INTRACELULAR ANTIFÚNGICO

M.C. Arendrup. Clin Microbiol Infect 2014 20 (Supl 6): 42-48.

Resistencia adquirida Resistencia adquirida AspergillusAspergillus spp spp

Sin Tratamiento previo:61% fungicídas agricultura: Europa Occidental, Asía, Pacífico.

Prevalencia mutación TR34/L98h cepas aisladas en estos países.

2 genotipos R en aislados R pesticidasPrevalencia aislados ambientales:?

Holanda 2007: 10%Dinamarca: suelos 8 % y pacientes: 4% (2009-2011)

Pacientes en Tratamiento azoles:Aspergilosis crónica o alérgica con Tto larga duración (3 semanas)Descrito en A.terreus y A.flavus

Pacientes en Tratamiento Candinas1 caso resistencia a Candinas . Infradiagnósticada por problemas técnicos antibiograma (inhibición parcial crecimiento)Pacientes en tratamiento > 3 semanas

Prevalencia resistencia a azoles en 19 países (incluido España):3.2 % (0-25%)

Van Der Linden J. ICAAC 2011. Abstr M-490

S.J.Howard. Mycopathologia 2014; 178: 427-433

Problemas: C.glabrata: Hemisferio Norte: 30 %. Población anciana.

↑R Fluconazol. 2º Candidemias C.parapsilosis: Hemisferio Sur. Población más joven. 2º Candidemias. ↑ candidemias (uso de Candinas). C.krusei: 5º Candidemia. R intrinseca Flu Aparición nuevas especies crípticas/prevalentes según zona geográfica

C.glabrata complex: C.bracarensis y C. nivariensis (0.2 % total). Poco sensible a azoles C.parapsilosis complex: C.parapsilosis sensu estricto, C.metapsilosis, C.orthopsilosis (2

y 4 % en España

SR Lockhart . J Clin Microbiol 2008;46:2659-64

Candidemias

Cambio epidemiólogico:Uso antifúngicos en Agricultura, Hospital y

consumo antifúngicos orales en Atención Primaria:(Onixis, vaginitis;..)

Flora comensal intestinal: reservorio infección sistémica

Resistencia cruzada azoles

Situación actual de resistencia a antifúngicosSituación actual de resistencia a antifúngicos

Infraestimada: estudios prevalencia incluyen aislamiento inicial Aislamientos de mucosas o infecciones profundas: % cepas R mayores.

Dinamarca: 15% C.albicans FluR y 20% C.dubliniensis FluR muestras mucosas R adquirida menos frecuente que R intrínseca (no plásmidos): en curso Tto.

Resistencia azoles en Resistencia azoles en A.fumigatus: A.fumigatus: en aumentoen aumento1.1. Tratamientos prolongados en Aspergilosis crónica: desarrollo de resistencia

2. Cepas de A.fumigatus R azoles en el ambiente/Uso fungicídas en Agricultura.No se puede excluir que el uso de azoles en Agricultura tengan un papel en la R antifúngicos.

Situación actual de resistencia a antifúngicosSituación actual de resistencia a antifúngicos

Aspergillus spp resistente azoles

Diseminación mundial/Problema salud pública:

TR34/L98H : India, China, Iran. R cruzada azoles

TR46/Y121F/T289A: Europa. VOR, IZV,PZV

Mecanismo origen/extensión: desconocido, fungicídas ????

TR34/L98H

E. Vermeulen. Curr Opin Infect Dis 2013; 26:493–500

Situación actual de resistencia a Situación actual de resistencia a antifúngicosantifúngicos

3.3. Aparición cepas de Aspergillus cripticas: no se diferencian morfológicamente pero son intrinsecamente resistentes/más resistentes:

A.lentulus, A.tubigensis, A.ustus complex,…

S.J. Howard. Mycopathologia 2014; 178:435-439

A.Alastruey-Izquierdo. Mycopathologia 2014; 178:427-433

Resistencia clínicaResistencia clínica

Diagnóstico incorrecto: Tto empírico o anticipadoSindrome de reconstitución inmune inflamatoria

Inmunosupresión pacienteTratamiento tardío infección: gran nº organismosFactores virulencia hongo: peor pronósticoInteracciones antifúngico con medicamentos pacienteFoco infecciónTratamiento incorrecto en duración o cumplimientoEnfermedad base paciente:

Prevención infección fúngica pacientes alto riesgoControl enfermedad de base

Consecuencias resistencia a antifúngicosConsecuencias resistencia a antifúngicos

Peor pronóstico y aumento mortalidad

Aparición infecciones de brecha durante la profilaxis antifúngica en pacientes con alto riesgo de infecciones fúngicas sistémicas

Indicaciones pruebas sensibilidadIndicaciones pruebas sensibilidad

Identificación a nivel de género y de forma óptima de especie.Infecciones Candida spp aisladas de líquidos estériles: fluconazol y otros según epidemiología local.Infecciones invasivas fallo tratamiento inicial, infecciones de brecha .Tratamiento prolongado azoles y/o cultivos repetidos con el mismo hongo.Si resistencia cruzada se ampliará estudio a antifúngicos de mayor espectro.Infección invasiva hongos filamentosos raros u otros hongos.Infección sistémica Aspergillus spp en pacientes inmunodeprimidos o Aspergilosis pulmonar crónica o alérgica.Hongos aislados durante profilaxis antifúngica.Infecciones por Aspergillus spp en tratamiento con azoles

( Recomendaciones ESCMID)Estudios epidemiólogicos

No es necesario: Hongos con alto nivel de resistencia intrínseca C.krusei y Fluconazol

A.terreus y Anfotericina B

Monitorización niveles antifúngicosMonitorización niveles antifúngicos

Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol, 5 FC

Niveles séricos impredeciblesAlteraciones en la absorción, metabolismo, eliminación o interacción

con otros medicamentos

Niveles adecuados

Eficacia Tratamiento Sin Toxicidad

Hongos filamentosos

Previene emergencia resistencias

Ashbee HR. J Antimicrob Chemother 2014; 69: 1162-1176.

↑ coste y tiempo Impacto clínico difícil estimar

Desescalada en el tratamiento empíricoDesescalada en el tratamiento empírico

Objetivo fundamental en programas de optimización de la política de antibióticos.Equipo multidisciplinar: microbiólogos, infectólogos y farmaceúticos:

Epidemiología localPatrones de sensibilidad Bibliografía actual

Desescalada basada en estudios de sensibilidadM.R. Ananda-Rajah. Curr Opin Infect Dis 2012; 25:107-115

Se desescaló (estudio sensibilidad) en:• Candidemia especies FluS en Tto Equinocandinas: < 40% • Pacientes menos graves o C.albicans: 50%

Shah DN. J Antimicrob Chemother 2011;66:2146-2151

Paso terapia parenteral a oral: Candidemias ESCMID: 10 días IV → oral ↓ coste Limita desarrollo R al reducir t exposición al antifúngico

Bal MA. Int J Clin Pract 2014; 68:20-27

R E. Lewis.Current Opinion in Infectious Diseases 2011, 24 (suppl 2):S14–S29

Éxito clínico: MultifactorialÉxito clínico: Multifactorial

ConclusionesConclusiones:

Las pruebas de sensibilidad a antifúngicos:

Detección mecanismos de resistencia en hongo responsable de la infección.Actualmente estandarizadas, en episodios de Candidemia se obtienen en 24 horas tras aislar el patógeno.Comienzan a ser fundamentales en el tratamiento del paciente y en los estudios de vigilancia.Resistencia microbiológica, clínica o ambas.Diferentes mecanismos de resistencia en Género Candida: inducción bombas de expulsión, alteraciones o sobreexpresión en la enzima diana.Indicaciones: infecciones sistémicas Candida spp, hongos aislados durante profilaxis, fallos tratamiento inicial, infecciones invasivas por hongos filamentosos raros,….