Estudio Preliminar de las Propiedades de la Semilla de Limón Mexicano (Citrus aurantifolia swingle) para su Posible Aprovechamiento

Preliminary Study of the Properties of Mexican Lime Seed (Citrus aurantifolia swingle) for its Possible Uses

Enrique Arriola-Guevara(1)*, Tania García-Herrera(1,2), Guadalupe M. Guatemala-Morales(1,2), Jorge A. García-Fajardo(2) (1) Centro Universitario de Ciencia Exactas e Ingenierías, Universidad de Guadalajara, Calzada Marcelino García Barragán y Olímpica, Sector Reforma, CP 44420 Guadalajara, Jalisco-México (e-mail: arriole@hotmail.com) (2) Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. Avenida Normalistas Nº 800, Colonia Colinas de la Normal, CP 44270, Guadalajara, Jalisco-México

* autor a quien debe ser dirigida la correspondencia

Resumen

Se obtuvieron propiedades clave de la semilla de limón mexicano (Citrus aurantifolia swingle) para su posible aprovechamiento en la industria de alimentos. Se consideraron propiedades físicas, composición, toxicidad en roedores (prueba de dosis letal media y toxicidad crónica) y actividad germicida (prueba de halos de inhibición y efectividad germicida). La semilla contiene 21% de proteínas, 39% de aceite vegetal y 29% de fibra, especialmente lignina en cantidad considerable, lo que hace viable su uso como materia prima para nutracéuticos o alimentos funcionales. La toxicidad de la semilla resultó nula por lo que es apta para el consumo humano. Se encontró cierta efectividad germicida para Candida albicans 85.77% (población Inicial = 0.304*108 UFC/ml) y para Escherichia coli 91.447% (población Inicial = 190*108 UFC/ml), por lo que puede ser usada como ingrediente en germicidas.

Palabras clave: limón mexicano, citrus aurantifolia swingle, propiedades de semillas, alimento

Abstract

Key properties of seed of Mexican lime (Citrus aurantifolia swingle) were studied for potential uses by the food industry. Characteristics considered included physical properties, composition, toxicity to rodents (average lethal dose and chronic toxicity), as well as germicidal activity (inhibition rings and germicidal effectiveness). The seed contained 21% protein, 39% vegetable oil and 29% fiber, particularly lignin. The seed could potentially be used as a basic component for nutritional supplements or functional food products. The toxicity was nil, and thus seed derivatives were safe for human consumption. Some germicidal effectiveness was found against Candida albicans, 85.77% (starting population = 0.304*108 UFC/ml), and against Escherichia coli, 91.447% (starting population = 190*108 UFC/ml), suggesting seed extracts could be used as an ingredient in germicidal products.

Keywords: mexican lime, citrus aurantifolia swingle, seed properties, food

INTRODUCCIÓN

En México existe un número considerable de industrias que producen aceite de limón y que llegan a procesar, como mínimo, 500 toneladas diarias del fruto fresco, de las cuales el 1% es semilla que se tira a rellenos sanitarios (García, 2004). De la semilla se puede aprovechar el aceite para su uso potencial como conservador, desinfectante y antibacterial, propiedades estas que se han encontrado en las semillas de otros cítricos como la toronja y la naranja (Braddock, 1999). Asimismo, es conocido que las oleaginosas contienen algunos componentes antioxidantes debido a las insaturaciones del aceite (Fereidoon, 1997). La semilla de limón -con una cubierta dura lignocelulósica- contiene una importante cantidad de fibra, grasas y proteínas, que son muy poco abundantes en el resto del fruto (Braddock, 1999).

Para que la lignocelulosa sea comestible es necesario sujetarla a una operación -común en panadería- que consiste en su degradación con enzimas celulasas y xilanasas para separar sus componentes: celulosa, hemicelulosa y lignina (Ponce y Pérez, 2002). De acuerdo al Comité de Toxicidad de Químicos en Alimentos y Ambiente del Reino Unido (Cassidy, 2003), la lignina es un fitoestrogeno que al ser metabolizado por la microflora intestinal humana, produce enterolactona y enterodiol, compuestos que tienen efectos hipocolesterolémicos que ayudan a prevenir las enfermedades cardiovasculares. Un fitoestrogeno es cualquier sustancia, o metabolito proveniente de una planta, que induce respuestas biológicas en vertebrados y puede imitar o modular las acciones de estrógenos endógenos. La lignina se encuentra en frutas, vegetales y cereales. Las concentraciones más altas de lignina se han encontrado en granos, semillas y otros alimentos ricos en fibra; en particular, la semilla de linaza (600-3700 mg/Kg) es la fuente más alta de lignina comestible conocida. Se recomienda un consumo de 0.48 a 0.72 mg diariamente (Cassidy, 2003). Lo recomendado por el Comité de Toxicidad de Químicos en Alimentos y Ambiente del Reino Unido ha sido también estudiado, validado y explicado -a detalle- por L. von Hertzen et al. (2004) y Jefferson (2005). Las características y composición de los ácidos grasos en su aceite, así como la presencia de lignina, le pueden conferir a la semilla de limón el atributo de producto nutracéutico.

La producción comercial del aceite esencial de limón mexicano (Citrus aurantifolia swingle), principal producto de exportación de la industria limonera e ingrediente de los refrescos de cola y lima-limón (Gobierno del Estado de Oaxaca, 2004), se lleva a cabo en los mismos estados productores de este cítrico. En México el principal productor de limón se encuentra en Tecomán en el estado de Colima, lugar tropical donde la temperatura promedio es de 26°C (Gobierno del Estado de Colima, 2004). Debido a que la semilla fresca tiene un alto contenido de humedad (68%) y una actividad acuosa de 0.98 (García et al, 2002), es propensa a una rápida descomposición por ataque de hongos y bacterias (Badui, 1993), por lo que es necesario deshidratarla para su conservación. El proceso de secado que se seleccione deberá tomar en cuenta las características geométricas y de densidad de la partícula.

Se obtuvo la composición nutricional de la semilla, se realizaron pruebas de límite de toxicidad en roedores y determinación de la actividad germicida según la norma NMX-BB-040-SCFI-1999 en el extracto obtenido por prensado.

Nuestro objetivo es encontrar propiedades clave de la semilla de limón para su posible aprovechamiento, evaluando características que deben tomarse en cuenta para el tratamiento de la semilla (que pudiera aprovecharse como producto nutracéutico) y el potencial de su extracto como posible bactericida y fungicida.

MATERIALES Y MÉTODOS

Siguiendo las normas mexicanas correspondientes, se determinaron algunas características de la composición de la semilla, como son: humedad utilizando la norma NOM-F-83-1986 (por destilación con desplazamiento por tolueno ó método de Dean-Stark), cenizas (por calcinación, NMX-F-66S-1978), grasas (por método Soxhlet con éter de petroleo, NMX-F-089-S-1978), proteínas (cuantificando nitrógeno por digestión con ácido nítrico y ácido sulfúrico, NMX-F-68S-1980), carbohidratos (por método de Lane y Eynon, NMX-F-312-S-1978), fibra (por tratamiento de la muestra desgrasada con ácido sulfurico al 1.25% y su posterior calcinación, NMX-F-90-S-1978) y presencia de almidón (prueba con reactivo de lugol, CETis No. 143, 1992). De acuerdo con lo publicado por la Biblioteca Digital de la Universidad de Chile (BDCh, 2001), el contenido calórico de la semilla deshidratada se estimó a partir de los valores de cada uno de los componentes nutricionales (1g proteínas = 4.1 Kcal, 1g carbohidratos = 4.1 Kcal, y 1g grasa = 9 Kcal).

Se experimentaron dos técnicas de extracción del aceite, prensado en caliente a 60º C y por el método Soxhlet (Egan et al., 1991), utilizando 3 solventes (hexano, éter y etanol). El análisis fue por triplicado y se reportan los valores promedio de rendimiento del extracto por cada técnica y solvente, así como la desviación estándar.

Se separó la cubierta de la semilla para determinar que cantidad de lignina contenía, de acuerdo con la técnica sugerida por Papinutti et al. (2003) por disolución en ácido sulfúrico. Todas las pruebas se realizaron por triplicado y se reportan los valores promedio y su desviación estándar.

La dosis letal media, DL50, se determinó aplicando las recomendaciones de la IACUC (2000) que indican que la dosis de prueba no debe ser mayor a 2000 mg/Kgindividuo. La toxicidad crónica se determinó tomando como base el método de las dosis repetidas (OECD TG 407-2001), suministrando a cada ratón la muestra en cantidad equivalente a 30g de fibra en un individuo de 70 Kg; esta dosis fue suministrada en su alimento a 3 ratones por 28 días. Cada prueba se hizo con semilla molida deshidratada y semilla molida deshidratada y semidesgrasada; esta última obtenida de la torta residual después del prensado, que contiene en promedio un 10% de aceite en base seca. La muestra, una pasta formada por 3 partes de semilla molida (H = 5%) y una parte de agua potable, se adhirió al alimento habitual del roedor.

Para detectar una posible actividad microbicida, se prepararon 4 extractos por maceración (agua destilada, agua-hexano 3:7, agua-etanol 3:7, agua-éter 3:7) de una mezcla semilla molida-solvente 1:2, y un extracto por prensado húmedo en caliente, mezclando semilla molida-agua 1:1 y prensándola a 60°C. Los extractos se usaron en el hongo Candida albicans y en bacterias gram negativa, Escherichia coli, para la prueba de halos de inhibición (De Paula y Martins, 2000). En los extractos que presentaron inhibición se determinó la actividad germicida siguiendo la norma NMX-BB-040-SCFI-1999.

También se hizo un estudio estadístico de dimensiones y densidad, el estudio se realizó tomando una muestra aleatoria de 50 semillas, midiendo largo, ancho y espesor de cada una de ellas con micrómetro con 0.1 mm de precisión; asimismo, también se midió su densidad por desplazamiento con tolueno. La esfericidad se estimó de acuerdo con la Ec. 1 (Levenspiel, 2004), tomando la semilla como un ovoide, y en la que las superficies corresponden a las de esfera y partícula del mismo volumen (subíndice V en la eqn. 1):

             (1)

Finalmente, se determinó la actividad de agua por medio del instrumento Aqualab 3T en semilla fresca y semilla deshidratada.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Tabla 1 se muestran algunas de las características de la composición de la semilla de limón.

Tabla 1. Parámetros físicos y composición de la semilla de limón

Parámetro Media Desv. Est.Humedad semilla fresca % 68.00 0.51Cenizas en base seca % 2.41 0.58Grasas en base seca % 39.10 1.62

Proteína en base seca % 21.27 2.16Carbohidratos en base seca

% 3.26 8.96

Fibra en base seca % 29.00 8.95Calorías (en 100g) 450.00 55.20

Almidón (+)Lignina % 0.60 0.011

La técnica de extracción del aceite con la que se obtiene el mejor rendimiento es utilizando éter etílico. En el caso del hexano y el éter como solventes, se observó que, para eliminar totalmente el solvente, es necesario mantener por tiempos largos la mezcla al vacío, lo que causa que el aceite se oxide, por lo que en este caso es recomendable la obtención del aceite por prensado en caliente a 60°C (Tabla 2).

Tabla 2. Rendimiento de la extracción de aceite por diferentes tratamientos.

Tratamiento Media % Desv. Est. %Hexano 29.00 3.47Etanol 25.00 6.17

Éter etílico 39.10 1.62Prensado 11.06 2.06

La toxicidad de la semilla resultó nula según las pruebas de dosis letal media y toxicidad crónica hechas en roedores alimentados con semilla molida deshidratada y semilla molida deshidratada y desgrasada; la descripción del experimento se muestra en la tabla 3. La actividad microbicida se evaluó por la técnica de discos de inhibición y por reto microbiano, según la norma NMX-BB-040-SCFI-1999, que indica que un producto etiquetado como germicida, debe tener 99.999% de efectividad en 30 segundos de contacto a la concentración de uso recomendada cuando la cuenta viable inicial se encuentre entre 75 y 125*108 UFC/ml. De acuerdo con los resultados que se muestran en la Tabla 4 –donde P.I. Población Inicial, y UFC, Unidades Formadoras de Colonias-, los extractos obtenidos por maceración de la materia prima, no tienen ninguna actividad microbicida; mientras que el extracto obtenido por prensado húmedo en caliente tiene una efectividad alta.

Tabla 3. Evaluación de la toxicidad en semilla de limón

Tipo de estudio Descripción Dosis Resultado

DL50 Dosis Máxima Semilla molida 2, 3, 5 g/kgraton Negativo

Toxicidad Crónca

Dosis fija (28 días) Semilla molida

Equivalente a 100 g en humano de 70 kg

Negativo. Sin daño aparente en órganos

DL50Dosis Máxima Semilla molida semidesgrasada

2, 3, 5 g/kgraton Negativo

Toxicidad Crónca

Dosis fija (28 días) Semilla molida semidesgrasada

Equivalente a 100 g en humano de 70 kg

Negativo. Sin daño aparente en órganos

En la Tabla 5 se muestran los valores de los parámetros físicos medidos. En base a esta información, la semilla de limón resulta ser un “sólido D” de la clasificación de Geldart. De acuerdo con Levenspiel (2004), un posible método –eficiente- de secado seria tratar la semilla en secadores del tipo de lecho fuente. Los valores obtenidos para la actividad del agua, antes y después del secado, indican la conveniencia de someter la semilla a este tratamiento antes de procesarla. Marcal y Márquez (1991) recomiendan que los granos sean secados hasta una humedad promedio de entre 10 y 13% para no sufrir daño estructural y conservarse de forma adecuada con los métodos de almacenamiento tradicionales. Por otra parte, Baduí (1999), recomienda una actividad de agua óptima de 0.1, para granos, harinas y cereales.

CONCLUSIONES

La semilla de limón no es tóxica; además de contener proteínas, aceite vegetal y fibra, especialmente lignina en cantidad considerable, su utilización como complemento alimenticio o ingrediente en nutracéuticos o alimentos funcionales para consumo humano se considera una alternativa viable.

El extracto obtenido por prensado tiene actividad bactericida importante, puede ser usado como ingrediente en desinfectantes y sanitizantes, no cumple con la norma NMX-BB-040-SCFI-1999, por lo que se recomienda hacer pruebas con un extracto purificado para tener un panorama más amplio de este aspecto y verificar si se tiene un bactericida de amplio espectro. La forma, dimensiones y densidad de la semilla de limón la sitúan como un “solido D” en la clasificación de Geldart, lo que la hace adecuada para su secado con lechos fuente.

Tabla 4. Evaluación de la actividad microbicida.

Tabla 5. Parámetros físicos de la semilla de limón

Parámetro Media Desv. Est.

Actividad de agua semilla fresca 0.98 0.01Actividad de agua semilla seca (al sol, 3 sesiones de 8 h) 0.22 0.28

Longitud característica promedio (cm) 0.99 0.24

Densidad semilla fresca (g/cm3) 1.10 0.04Densidad semilla seca (g/cm3) 0.81 0.04Esfericidad 0.78 0.12

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo de la Universidad de Guadalajara, del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Becario 127458) y del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (México).

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La resonancia magnética detecta semillas en mandarinasJosé BlascoSemillas en mandarinas son difíciles de detectar con rayos x radiografía y la tomografía computarizada, pero se distinguen fácilmente mediante imágenes por resonancia magnética.16 de enero 2012, SPIE Noticias. DOI: 10.1117/2.1201201.004049

Ausencia de semillas es una propiedad deseable en la producción de fruta, incluida la agricultura mandarina, y es explotado por los comerciantes como un factor en la toma de un producto competitivo. Cuando se producen las semillas, que afecta el precio de las mandarinas, causando pérdidas económicas para los productores y disminuir el prestigio de su fruto. Las primeras mandarinas cosechadas en cada temporada son cultivares de 'Clementinas' y 'Satsumas', que son excelentes en calidad y, en teoría, no producen semillas. Sin embargo, para prolongar la temporada de cosecha, los

productores en España y otros países han introducido variedades de mandarinas tardías, como 'Fortune', que se puede extender la temporada hasta abril. Por desgracia, estas plantas pueden polinización cruzada con otras variedades, como 'Clementinas', la producción de semillas de ambas variedades. Este resultado es un grave problema para los exportadores españoles que venden a mercados como el de EE.UU..

Actualmente, las semillas pueden ser detectados sólo por métodos destructivos, basado en el examen de las muestras de fruta representativas de cada lote. Sin embargo, estos métodos lento el proceso de selección y no garantizan la calidad de todos los frutos. Técnicas de visión por ordenador se utilizan para automatizar la inspección de la calidad externa de los productos agrícolas. 1, 2 De manera similar, las técnicas de imagen no invasivas utilizadas tradicionalmente en la medicina se puede utilizar para inspeccionar la calidad interna de los productos agrícolas. 3,

4 Somos perseguir este enfoque mediante el desarrollo de nuevas técnicas no destructivas para inspeccionar la calidad interna de la fruta. En particular, se ha evaluado recientemente de rayos x radiografía, tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (MRI) para las mandarinas inspección.

Figura 1. Imagen de tomografía computarizada de dos mandarinas. Una semilla es visible en el mandarín izquierda. Las semillas son difíciles de detectar mediante técnicas de rayos X porque las semillas y la pulpa tienen densidades similares.

La fruta utilizada en los experimentos eran 15 mandarinas, seleccionados por nuestros expertos internos. Un total de 10 mandarines eran de la variedad 'Fortune' y las semillas contenidas, mientras que los otros cinco eran de la variedad 'Reina' y supuestamente sin semillas.

En primer lugar, estudiamos las dos técnicas de rayos x, es decir, la radiografía y la TC. Adquirimos imágenes de la fruta utilizando equipos médicos pertenecientes al Hospital Quirón (Valencia, España). Los mandarines fueron colocados en grupos de cinco. Siguiendo las recomendaciones de la operadora, las imágenes de la TC fueron adquiridas mediante la configuración de 140kV y 20 mA (ver Figura 1 ). Para cada conjunto de frutas, adquirimos 50 rebanadas transversales: cada corte fue de 2 mm de espesor y no hubo diferencias entre cortes contiguos. Por lo tanto, fue tomar imágenes de todo el volumen de cada mandarina. Además, dos imágenes radiográficas que muestran una proyección coronal de las mandarinas se obtuvieron con el equipo sintonizado a 49kV y 42 mA, así como 49kV y 32mA.

Las densidades de las semillas y la pulpa son lo suficientemente cerca que están representados por niveles de gris similares en las imágenes. Por esta razón, el algoritmo que hemos desarrollado para detectar las semillas en las imágenes se basa en la extracción de bordes y la codificación. Sin embargo, el uso de esta técnica con las imágenes de TC y radiografía detecta sólo el 10% de las semillas (una semilla se consideró detecta si se encontró en ninguna de las imágenes). No hubo detecciones falsas.

Figura 2. detección de semillas utilizando formación de imágenes por resonancia magnética. (A) El mandarín. (B) Las semillas separadas del fondo por un algoritmo de segmentación de umbral. (C) Extraído contornos de las semillas. Áreas> 4 mm 2 se identifican como semillas. (D) Fotografía del mandarín después de ser cortado abierto.

Para la parte de resonancia magnética del estudio, se adquirió imágenes de mandarinas utilizando un escáner que tiene un imán permanente de 0.2T capaz de explorar objetos con un diámetro

máximo de 160 mm. Uno de nuestros principales esfuerzos fue estudiar qué secuencias de pulsos producen el mayor contraste en las imágenes entre las semillas y la pulpa.Al ajustar correctamente los parámetros tales como el tiempo de eco (T E ) y el tiempo (T repetición R ), se obtuvo una secuencia de adquisición de imágenes que este contraste mejorado (véase la figura 2 ). Otro factor limitante importante era el tiempo de adquisición, lo que podría llevar desde unos pocos segundos a varios minutos, dependiendo de la secuencia de pulsos empleada.

Como las imágenes tenían un buen contraste entre las semillas y la pulpa, se podría utilizar un método de segmentación de umbral para separar las semillas del fondo. A continuación, el contorno de cada objeto se analizó y se calculó su área. Hemos identificado un objeto como una semilla si tenía un área> 4 mm 2 . Este sistema ha detectado 100% de las semillas sin detecciones falsas. Las imágenes fueron obtenidas en 7s usando una secuencia spin-echo con T E = 18 ms y T R = 50 ms.

En resumen, la RM demostró ser superior a la TC y radiografía de rayos x para detectar semillas en mandarinas. El sistema de resonancia magnética detecta todas las semillas correctamente sin detecciones falsas. No fue posible discriminar entre semillas y la pulpa utilizando consistentemente CT o rayos X imágenes debido a sus densidades similares. Por lo tanto, la RM es una técnica adecuada para separar mandarinas sin semillas y sin semillas no invasiva y no destructiva. El método es seguro y potencialmente podría aplicarse en línea. El siguiente paso en este trabajo es el de reducir el coste de los equipos y el tiempo necesario para adquirir y procesar las imágenes. Los experimentos descritos aquí utilizan equipos médicos costosos configurado para obtener imágenes de alta calidad del cuerpo humano. Para convertir esta demostración de laboratorio en un sistema práctico y rentable, la tecnología MRI necesita ser desarrollado, optimizado para inspección en línea de frutas y verduras en las fábricas agrícolas.

José BlascoInstituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)Moncada, España

José Blasco era un analista de sistemas en IBM, España, antes de unirse IVIA en 1996 y recibió su doctorado en Informática por la Universidad Politécnica de Valencia en 2001. Él se centra en la visión por computador para aplicaciones agrícolas, publicando más de 20 artículos en revistas internacionales y contribuir a varias patentes.

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