estudio de procesos para la solubilización y precipitación...

“ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIÓN Y

PRECIPITACIÓN DE IONES METÁLICOS CONTAMINANTES

MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATO-

REDUCTORAS”

UNIVERSIDAD DE CÁDIZ

FACULTAD DE CIENCIAS

Departamento de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos y

Tecnologías del Medio Ambiente

Gema Cabrera Revuelta

Mayo, 2005

“ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIÓN Y

PRECIPITACIÓN DE IONES METÁLICOS CONTAMINANTES

MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATO-

REDUCTORAS”

Memoria presentada por la Licenciada Gema Cabrera Revuelta para optar al grado

de Doctor por la Universidad de Cádiz

Fdo: Gema Cabrera Revuelta

Puerto Real, Mayo de 2005

La presente Tesis Doctoral ha sido co-dirigida por los Doctores D. Domingo Cantero

Moreno, Catedrático de Ingeniería Química y D. Jose Manuel Gómez Montes de Oca,

Profesor Titular de Ingeniería Química de la Universidad de Cádiz, y cumple los

requisitos exigidos por la legislación vigente.

Fdo: Dr. D. Domingo Cantero Moreno

Fdo: Dr. D. José Manuel Gómez Montes de Oca

Fdo.: Dr. D. José María Quiroga Alonso Director del Dpto. de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos y Tecnologías del

Medio Ambiente Universidad de Cádiz

Después de este largo camino siento la necesidad de dar las gracias a

todas las personas que de alguna manera han contribuido para que esto

sea posible:

- Al Prof. Domingo Cantero Moreno, por brindarme la oportunidad de

pertenecer a su grupo de investigación y permitirme estrenar la línea

de Biorremediación. Su experiencia y su capacidad de crítica me

han ayudado a creer en mi trabajo.

- Al Prof. José Manuel Gómez Montes de Oca, por su entrega, su

confianza, su disponibilidad y su eficacia, en realidad es difícil

destacar sólo algunas de sus cualidades. Gracias Tete, por tu calidad

humana y por saberme hacer poner los pies en la tierra. Tengo suerte

de trabajar contigo.

- Al Prof. Edgardo Donati, le agradezco su acogida, su disponibilidad y

todo lo que he aprendido durante las estancias que realicé en su

país, vos sabés que es mucho. Gracias por haberme dado la

oportunidad de conocer y trabajar con tus chicas, a ellas gracias

también.

- A mis compañeros del departamento, cada acontecimiento que

ocurre es, sin duda, fruto del trabajo de todos. Gracias por lo que me

aportáis día a día.

A mis padres,

a mis hermanos

y a Elsa

A Jose,

por todo lo que me quieres,

por todo lo que te quiero.

Querer es poder

INDICE

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A.-INTRODUCCIÓN………….……………………………..………………. 1

B.-ANTECEDENTES………..………………...……………………………….. 7

1 CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS………...…..………………… 9

1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TÉCNICAS DE

REMEDIACIÓN………………………………………………………… 9

1.1.1 TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN……………………….………………….. 12

1.1.1.1 Técnicas de contención………………..…………………….. 13

1.1.1.2 Técnicas ex-situ……………………………………………….…. 14

1.1.1.3 Técnicas in-situ…………………………….…………………….. 15

1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS……………………… 16

1.2.1 TÉCNICAS DE BIORREMEDIACIÓN…………………………………….. 18

1.2.1.1 Técnicas de movilización………………………….………….. 18

1.2.1.2 Técnicas de inmovilización……………….…………………... 20

1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO……….………… 21

1.4 CARACTERÍSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES

ESTUDIADOS…………………………………………………………… 26

1.4.1 CROMO……………………………………………………………………. 27

1.4.1.1 Características………………………………………………….. 27

1.4.1.2 Toxicidad…….…………………………………………………… 29

1.1.2. NÍQUEL……………………………………………….……………………. 30

1.1.2.1. Características………….……………………………………….. 30

1.1.2.2. Toxicidad……………………….………………………………… 32

1.4.2 ZINC………………………………………………………………………… 34

1.1.3.1. Características……….…….…………………………………… 34

1.4.2.1 Toxicidad……………….………………………………………… 35

1.5 LEGISLACIÓN SOBRE METALES PESADOS…………………….…… 36

2 BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES…………..… 43

2.1. BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES……………………………………. 44

INDICE

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2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES…………………..………………… 45

2.1.1 CARACTERÍSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y

Acidithiobacillus thiooxidans……………………………………….….. 46

2.2 MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA BIOLIXIVIACIÓN DE

MINERALES SULFURO…………………………..………………………. 49

2.2.1 MECANISMO DIRECTO………………………………….……………….. 49

2.2.2 MECANISMO INDIRECTO…………………………….………………….. 50

2.2.3 DISCUSIÓN DE LOS MECANISMOS…………………….………………. 52

2.3…FUNCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN LA

LIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO………………..…………… 55

2.4 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL……………………….…………….. 56

2.5…FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIÓN………….…… 59

2.6…TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS BACTERIAS

AZUFRE-OXIDANTES……………………….………………………….. 61

2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS

AZUFRE-OXIDANTES…………..…………………………………….... 66

2.7.1 BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES………………………..………………. 66

2.7.2 BIOLIXIVIACIÓN DE LODOS………..…………………..…….…………. 70

2.7.3 BIOLIXIVIACIÓN DE SUELOS…………………………………………….. 75

2.7.4 BIOLIXIVIACIÓN DE OTROS RESIDUOS…………………………...…… 77

2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES………………………………………….. 78

2.8 REDUCCIÓN DEL Cr(VI) POR LA ACCIÓN DE LAS BACTERIAS

AZUFRE-OXIDANTES…………………………………….…………….. 81

3 BIOPRECIPITACIÓN CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…….. 84

3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS………..…………………. 84

3.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…………….………………….. 85

3.2.1 CARACTERÍSTICAS………...……………………………………………… 88

3.2.2 GÉNERO Desulfovibrio………..…………………………………………. 89

3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS………. 90

INDICE

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3.2.4 METABOLISMO DEL GÉNERO Desulfovibrio……..…………………… 91

3.3 FUNCION DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LA

BIOPRECIPITACIÓN DE METALES……….………………………….. 93

3.3.1 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL………………...………………………. 94

3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE SULFATO….… 94

3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS….………………………... 98

3.6 APLICACIÓN DE LA BIOPRECIPITACIÓN DE METALES POR

BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS……….………………………… 102

3.7 INTEGRACIÓN DE PROCESOS DE BACTERIAS AZUFRE-

OXIDANTES Y BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…..…………… 106

4 INMOVILIZACIÓN DE CELULAS…………………………….……………. 109

4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIÓN…………….…………..………… 109

4.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN…………….………………..…….. 109

4.2.1 ADHESIÓN………………..…………………………..……………………. 110

4.2.2 ATRAPAMIENTO……………………….……………..…………………… 111

4.3 INMOVILIZACION DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES….………. 112

4.4 INMOVILIZACION SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO….……….. 113

C.-MATERIAL Y MÉTODOS…………….…………………………………... 117

1 MATERIAL Y MÉTODOS……………………….…………………………… 119

1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS…………………………………... 119

1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES……………………….………... 119


1.1.1.2 Mantenimiento de las cepas………………………………… 119

1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…………………………………… 122


1.1.2.2 Mantenimiento de las cepas………………………………… 123

1.2 MÉTODOS DE ANÁLISIS………………………………………………. 127

1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX………………………………………………... 127

INDICE

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1.2.2 CONCENTRACIÓN CELULAR…………………………………………... 127

1.2.2.1 Bacterias en suspensión………………………………………. 127

1.2.2.2 Bacterias inmovilizadas……………………………………….. 128

1.2.3 CONCENTRACIÓN DE PROTONES……………………………………. 129

1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO………………………………………. 129

1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METÁLICOS…………………………… 130

1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE…………………….. 131

1.2.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA

ELECTRÓNICA…………………………………………………………….. 131

1.2.8 DIGESTIÓN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL………........… 132

2 PROTOCOLOS EXPERIMENTALES……………………………………….. 133

2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO……… 134

2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO…………... 136

2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans…………………………………………... 137

2.2.2 SOLUBILIZACIÓN DE METALES PRESENTES EN ARENA……………… 137

2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) CON

BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO………..…….. 138

2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y

SOLUBILIZACIÓN DEL Cr(III) CON BACTERIAS AZUFRE-

OXIDANTES EN CONTINUO…………………………………………… 139

2.4.1 REACTOR DE At. thiooxidans…………………………………………... 139

2.4.2 COLUMNA CON RESIDUO DE CROMO……………………………… 140

2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN DISCONTINUO… 141

2.6…PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO… 142

2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp…………………………………………. 143

INDICE

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2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIÓN………………………………………….. 144

2.7…PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIÓN DE At. ferrooxidans

Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO…..………. 145

2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE

SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN

CONTINUO……………………….……………………………………. 147

D.-RESULTADOS…………………………………………………..…............ 149

1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)……………………..… 151

1.1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS

AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO………………………..….. 151

1.2 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At. thiooxidans

EN CONTINUO………………………………...………………………. 168

2 REDUCCION DEL Cr(VI)…………………………………………….. 174

2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIÓN DEL Cr(VI) EN DISCONTINUO.... 174

2.2 REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III) CON

BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO……….………... 181

3 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)………………………… 187

3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y

Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN

DISCONTINUO…………………………………………………………. 187

3.1.1 ESTUDIO CON Cr(III)………………….………………………………….. 187

3.1.2 ESTUDIO CON Cr(VI)…………………………………………….………. 191

3.1.3 ESTUDIO CON Cr(III) y Cr(VI)……………………………….………….. 193

3.1.4 ESTUDIO CON Ni(II)………………………………….…………………… 195

3.1.5 ESTUDIO CON Zn (II)………………………………….………………….. 199

3.1.6 ESTUDIO CON Cr(III), Ni(II) y Zn(II)………………………….………….. 203

3.2 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS

SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO…………………………… 210

INDICE

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4 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS……………………..………… 214

4.1 INMOVILIZACIÓN DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES SOBRE

ESPUMA DE POLIURETANO……….…………………………………. 214

4.2 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y

PRECIPITACIÓN EN CONTINUO…………….……………………… 219

4.3 COMPARACIÓN CON OTRO PROCESO…………….……………. 226

E.-CONCLUSIONES…………………..………………………………….….. 231

F.-BIBLIOGRAFÍA…………………………..………………………….…….. 235

A.-INTRODUCCIÓN

INTRODUCCION

3

En el último siglo, se ha generado un aumento considerable del

contenido de metales pesados en el medio ambiente provocado,

principalmente, por el gran número de procesos industriales que emplean

como materias primas los metales, así como por las explotaciones mineras y

sus industrias derivadas. Por este motivo, el estudio de técnicas que traten

de reducir la contaminación causada por éstos constituye un tema de gran

actualidad. Normalmente estos metales se encuentran presentes en aguas

y suelos y, en ocasiones, en forma de pequeñas partículas dispersas en el

aire. Hoy en día, el tratamiento de medios contaminados con iones

metálicos, como efluentes industriales, lodos, sedimentos y suelos, puede

llevarse a cabo mediante distintas técnicas tales como precipitación,

intercambio iónico, filtración por membrana o métodos electroquímicos. Sin

embargo, estos tratamientos están restringidos por problemas técnicos y

económicos; provocando la aparición de otras técnicas alternativas que

involucran bioprocesos.

En ocasiones, los iones metálicos se encuentran en los medios

contaminados en formas insolubles. La acción de determinados

microorganismos permite la transformación de compuestos insolubles a otros

solubles, de modo que los iones pasan a solución acuosa. A esta operación

de solubilización de iones mediante microorganismos se le conoce con el

nombre de biolixiviación. Las bacterias azufre-oxidantes del género

Acidithiobacillus (en concreto Acidithiobacillus ferrooxidans y

Acidithiobacillus thiooxidans) son conocidas por su capacidad para

solubilizar iones metálicos a partir de sulfuros y óxidos complejos dando lugar

a otras formas solubles como los sulfatos.

Por otra parte, cuando los metales se presentan en formas solubles en

los medios contaminados de forma natural, o como consecuencia de

procesos químicos o biológicos, podría ocurrir que debido a su movilidad las

INTRODUCCION

4

especies metálicas pasen de capas superficiales a capas más internas y, en

consecuencia a los posibles acuíferos. Una de las vías para evitar la

movilización de los metales presentes en un medio es la bioprecipitación de

dichos iones. Algunas especies microbianas tienen la capacidad de oxidar

o reducir ciertos iones, de manera que modifican la solubilidad de las

especies metálicas provocando su precipitación y, por tanto, su separación

y posterior eliminación del medio. Las bacterias sulfato-reductoras, entre las

que se encuentra el género Desulfovibrio, tienen la habilidad de precipitar

iones metálicos a partir de formas metálicas solubles.

Habitualmente el contacto directo entre la biomasa y la solución que

contiene los iones metálicos no es sencillo y presenta algunos problemas

técnicos. La inmovilización previa de la biomasa en estructuras sólidas

proporciona el tamaño, la rigidez y la porosidad necesarios para realizar

este tipo de procesos. Esta técnica, además, facilita la recuperación de los

iones metálicos y la reactivación de la biomasa para su reutilización.

El presente trabajo se realizó con el objeto de estudiar los procesos

que permiten la solubilización y precipitación de metales pesados presentes

en medios contaminados empleando la capacidad de las bacterias azufre-

oxidantes y sulfato-reductoras para tolerar la presencia de iones metálicos y

llevar a cabo estos procesos.

Para ello, en primer lugar, se seleccionaron los metales a estudiar:

cromo, níquel y zinc. Estos metales se encuentran presentes de forma

común en los residuos de las plantas de tratamiento de superficies y en los

efluentes o lodos de industrias relacionadas con la minería. Debido a su

toxicidad y a su presencia en variedad de medios contaminados parece de

interés tomarlos como referencia en el estudio de bioprocesos que permitan

la disminución o eliminación de estas especies metálicas en dichos medios.

INTRODUCCION

5

El estudio de la solubilización de estos metales por la acción de las

bacterias azufre-oxidantes se realizó en discontinuo para determinar de esta

forma la viabilidad del proceso y la tolerancia de At. ferrooxidans y At.

thiooxidans a los distintos metales. El estudio se llevó a cabo en distintas

condiciones y los resultados obtenidos permitieron desarrollar un proceso de

solubilización de dichos metales en forma continua, donde compuestos

insolubles de éstos metales se encontraban soportados en arena.

Las bacterias azufre-oxidantes tienen además la capacidad de

generar compuestos reductores a partir de la oxidación de azufre

elemental, esta propiedad les permite reducir el cromo hexavalente a

cromo trivalente, menos tóxico. Por tanto, debido a la evidente presencia

del Cr(VI) en distintos tipos de residuos, se consideró de interés el estudio de

la reducción de éste ion por parte de las bacterias azufre-oxidantes en

régimen discontinuo y continuo.

El estudio de la bioprecipitación de metales en solución con las

bacterias sulfato-reductoras (Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp.) se

realizó de forma discontinua empleando varias concentraciones de los

iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II). El estudio se realizó determinando la precipitación

de cada metal individualmente y, posteriormente, se estudió dicho proceso

con una combinación de todos los metales. El desarrollo del proceso de

precipitación en continuo persiguió una mayor disminución de la movilidad

de cada uno de los metales en solución en un medio acuoso.

Con el fin de integrar ambos procesos de una forma efectiva se

decidió inmovilizar previamente las bacterias azufre-oxidantes sobre espuma

de poliuretano. Para ello, se estudió previamente la dinámica de

inmovilización de cada una de las bacterias para determinar cual de ellas

podría resultar más ventajosa.

INTRODUCCION

6

Finalmente la integración de los procesos de solubilización y

precipitación en continuo estudiados permitió evaluar la transformación y la

disminución del contenido metálico de un residuo contaminado con cromo,

níquel y zinc.

En definitiva, el objetivo general del presente trabajo fue el

estudio de los procesos de solubilización con bacterias azufre-

oxidantes y de precipitación con bacterias sulfato-reductoras para el

tratamiento de residuos contaminados por metales pesados. Este

objetivo general se concretó en los siguientes objetivos específicos

desarrollados en el trabajo realizado:

- Estudio de la solubilización de compuestos insolubles de cromo,

níquel y zinc mediante la acción de las bacterias azufre-oxidantes,

At. ferrooxidans y At. thiooxidans, en régimen discontinuo y

continuo.

- Estudio de la reducción de Cr(VI) a Cr(III) por parte de las bacterias

azufre-oxidantes en régimen discontinuo y continuo.

- Estudio de la precipitación de iones metálicos (Cr(III), Ni(II) y Zn(II))

mediante el empleo de las bacterias sulfato-reductoras,

Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp., en régimen discontinuo y

continuo.

- Estudio de la integración de los procesos de solubilización y

precipitación de metales pesados en régimen continuo.

B.-ANTECEDENTES

ANTECEDENTES

9

1 CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS

1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN

Los metales se encuentran de forma habitual formando parte de

depósitos minerales los cuales son procesados física y químicamente para la

obtención de metales puros. Esta actividad ha sido desarrollada a lo largo

de los siglos debido al elevado interés que representan estos elementos o

sus compuestos por su extensa aplicación en un gran número de industrias

(construcción, aeronáutica, automovilística…). En la tabla 1 se recogen las

aplicaciones más importantes de algunos de los metales más comunes.

Metal Aplicaciones más comunes Referencia

Ag Fotografía, joyería Gordon(2001)

Au Joyería, electrónica, láminas Gordon(2001)

Cd Galvanizado, baterías, pigmentos de plásticos y

pinturas Beveridge y Doyle(1989)

Co Imanes, superaleaciones Gordon(2001)

Cr Acero inoxidable, materiales refractarios, curtido de

pieles Gordon(2001)

Cu Sistemas eléctricos, tuberías, equipos de calefacción,

aleaciones Beveridge y Doyle(1989)

Ni Aceros, aleaciones para monedas, utensilios de

cocina Beveridge y Doyle(1989)

Pb Baterías, cables, pigmentos y aleaciones. Beveridge y Doyle(1989)

Pt Joyería, catalizadores, electrónica Gordon(2001)

Zn Aleaciones, galvanizado, gomas, papel, productos

cosméticos y farmacéuticos, pinturas. Mulligan y col.(2001)

Tabla 1: Principales aplicaciones de algunos metales pesados

Estos elementos han sido extraídos y utilizados ampliamente por el

hombre desde la antigüedad pero en las últimas décadas la rápida

ANTECEDENTES

10

expansión de la industria, el incremento de las actividades domésticas y el

carácter consumista de la sociedad actual han dado lugar a un aumento

desorbitado de la cantidad de metal emitida al medio ambiente. Los

metales se introducen en el medio ambiente como residuos procedentes de

la actividad minera o de otras fuentes como son la combustión del petróleo,

procesos industriales, restos de pesticidas y residuos domésticos, entre otros.

Los metales pesados se acumulan mayoritariamente en suelos y

sedimentos cercanos a zonas industriales y mineras. Los efluentes

procedentes de estas zonas son habitualmente sometidos a tratamientos de

depuración de aguas pero una vez que vuelven al medio natural persisten

en él, no pueden ser biodegradados y pueden además participar de un

gran número de reacciones que lo pueden hacer más o menos tóxico. En

general, pueden quedar adsorbidos en el suelo, incorporarse a ríos y lagos,

lixiviar hasta acceder a aguas subterráneas o expandirse en la atmósfera. La

movilidad de estos metales de un medio a otro ocurre mediante procesos

físicos, químicos o biológicos (Figura 1). La exposición a los metales pesados

a través del agua y los alimentos da lugar a la acumulación de éstos en

microorganismos, plantas, animales y seres humanos lo que puede

desembocar en la alteración o extinción de estos seres vivos (Mulligan y col.,

2001).

ANTECEDENTES

11

Reacciones químicas y biológicas

Sedim

entación

sedimento

rocas

suelo

biosfera

Des

inte

grac

ión

hidrosfera

atmósferaInhalación

Absorción

Ingestión

Desintegracióncondensación

evaporación

Desintegración

Evap

orac

ión

Prec

ipita

ción

Solución

Reacciones químicas y biológicas

SedimentaciónMeteorización

Figura 1: Procesos de movilización de los metales en el medio ambiente (Board, 1996).

Los metales pesados se pueden definir como aquellos metales con

una densidad por encima de 5 g/cm3, de forma que los elementos de

transición desde el vanadio hasta el semi-metal arsénico, del circonio al

bismuto y del lantano al polonio se consideran metales pesados junto con el

grupo de los lantánidos y los actínidos (Nies, 1999) que no son considerados

como tales por otros autores (Beveridge y Doyle, 1989). De cualquier modo,

la definición de metal pesado está asociada a aquellos metales que en

pequeña concentración resultan nocivos para los seres vivos.

De los 90 elementos que existen de forma natural en la Tierra, 21 son

no-metales, 16 son metales ligeros y los 53 restantes incluyendo el arsénico

son metales pesados. La mayoría de los metales pesados son elementos de

transición con orbitales d incompletos, que dan lugar a cationes con la

habilidad de formar compuestos complejos susceptibles de actuar en

reacciones redox y variar de este modo su movilidad en el medio en que se

ANTECEDENTES

12

encuentran o interaccionar con otros compuestos que se encuentren en él.

Habitualmente estos cationes juegan un importante papel como elementos

traza en complejas reacciones bioquímicas.

Sin embargo, a elevadas concentraciones los metales pesados

forman compuestos complejos no específicos en las células que pueden

producir efectos tóxicos. Algunos cationes de metales pesados como Hg(II),

Cd(II) y Ag(I) forman fuertes complejos que lo hacen demasiado tóxicos

para cualquier función fisiológica. Incluso algunos elementos traza básicos

en la alimentación, como el zinc, el níquel o el cobre, se convierten en

tóxicos a mayores concentraciones.

Entre los mecanismos moleculares que determinan la toxicidad de los

metales pesados se encuentran (Cañizares-Villanueva, 2000):

• desplazamiento de iones metálicos esenciales de moléculas y

bloqueo de sus grupos funcionales.

• modificación de la conformación activa de biomoléculas

(enzimas, polinucleótidos).

• ruptura de la integridad de biomoléculas.

• modificación de otros agentes biológicamente activos.

1.1.1 TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN En vista de la extensión de los metales pesados en el medio

ambiente, en los últimos tiempos se han venido desarrollando una serie de

técnicas que tratan de reducir su contenido o, mejor dicho, transformarlos

en formas más estables que no accedan con tanta facilidad a ciclos

biológicos.

Entre ellos se distinguen las técnicas de contención que tratan de

retener físicamente los contaminantes de modo que queden depositados

ANTECEDENTES

13

de forma controlada; las técnicas ex-situ que emplean transformaciones

físicas, químicas o biológicas para modificar la toxicidad o disponibilidad de

los contaminantes, pero tratándolos fuera de su ubicación original; y las

técnicas in-situ que se basan en la transformación de los contaminantes

presentes en el medio sin modificar su ubicación, habitualmente se

aprovechan propiedades de los microorganismos o las plantas para tratar

de reducir la contaminación propia del medio

1.1.1.1 Técnicas de contención

- Aislamiento y contención: Los medios contaminados se aíslan y se

confinan para prevenir posteriores movimientos, reducir la permeabilidad

del residuo e incrementar la capacidad de resistencia al residuo. Las

barreras físicas se realizan de acero, cemento, bentonita o ladrillo en capas

horizontales y/o verticales dispuestas de forma que eviten las infiltraciones.

- Solidificación/estabilización: Estas técnicas no implican barreras

físicas. La solidificación consiste en la encapsulación de los contaminantes

en una matriz sólida y la estabilización incluye la adición de un compuesto

(polímeros orgánicos y silicatos) que reacciona con el contaminante

reduciendo su movilidad. Estos tratamientos se hacen complejos in-situ

debido a la dificultad de mezcla de los componentes adicionados.

- Vitrificación: Es un proceso de solidificación/estabilización que

requiere el aporte de energía térmica. Esto implica la inserción de

electrodos en el medio contaminado transmitiéndose una corriente que

desplaza los iones metálicos y la posterior solidificación cuando el medio se

enfría.

1.1.1.2 Técnicas ex-situ

- Separación mecánica: El objetivo de estos procesos de selección

del tamaño de partícula es eliminar contaminantes que por su tamaño se

ANTECEDENTES

14

puedan distinguir de otras menos contaminantes. Para determinar si estos

procesos son adecuados resulta esencial caracterizar los tamaños de

partícula y el nivel de contaminación de cada fracción. Para la separación

física se emplean hidrociclones, tanques de sedimentación, columnas de

lecho fluidizado, flotación o separación magnética.

- Separación pirometalúrgica: Este tipo de procesos emplea hornos a

alta temperatura (200-700ºC) para volatilizar los metales presentes en suelos

contaminados y, posteriormente, los metales se recuperan o inmovilizan. Se

aplica actualmente al mercurio ya que éste es fácil de convertir a su forma

metálica a altas temperaturas. Otros metales como el arsénico, cromo,

cadmio y plomo requieren de un pretratamiento.

- Tratamientos químicos: Los tratamientos químicos por mecanismos

reductores u oxidantes se emplean para reducir la toxicidad o la movilidad

de los metales contaminantes. Se emplean habitualmente en el tratamiento

de aguas residuales. Las reacciones de oxidación, que pueden disminuir la

toxicidad, precipitando o solubilizando metales, implican la adición de

permanganato potásico, peróxido de hidrógeno, hipoclorito o cloro

gaseoso. Las reacciones de neutralización se emplean para ajustar el pH de

suelos ácidos o básicos. Las reacciones de reducción se inducen por la

adición de compuestos alcalinos como sodio, dióxido de azufre, sales de

sulfito y sulfato ferroso. Esta técnica se emplea a veces como

pretratamiento de otras como la solidificación/estabilización. Por otra parte,

al tratarse de reacciones no específicas se corre el riesgo de que otros

metales se transformen en formas más tóxicas o más móviles.

1.1.1.3 Técnicas in-situ

- Barreras permeables: Son barreras que contienen una sustancia

reactiva (física, química o biológica o una combinación de ellas) que está

dispuesta para reducir la movilidad de metales presentes en aguas

ANTECEDENTES

15

subterráneas cercanas a lugares contaminados. Hasta el momento se han

empleado como material zeolita, hidroxiapatita, hierro elemental y piedra

caliza

- Técnicas de electrocinética: Estos procesos implican el paso de una

corriente eléctrica de baja intensidad entre un cátodo y un ánodo

introducidos en el medio contaminado, los iones y pequeñas partículas

cargadas se transportan entre los electrodos. Un gradiente eléctrico inicia el

movimiento por electromigración (movimiento de las especies químicas

cargados), electroósmosis (movimiento del fluido), electroforésis

(movimiento de partículas cargadas) o electrolisis (reacción química

producida por un campo eléctrico).

- Técnicas de biorremediación: Estos procesos bioquímicos

aprovechan la capacidad de los microorganismos de tolerar elevadas

concentraciones de metales pesados y de transformar las especies

metálicas en función del estado de oxidación en que se encuentran y de

las condiciones que existan en el medio. Los procesos más conocidos son la

biolixiviación, solubilización de un metal en estado insoluble en forma de

óxidos o sulfuros, permitiendo su extracción; la bioprecipitación,

precipitación de un metal que se encuentra soluble y móvil en el medio

favoreciendo su deposición y separación, y la biosorción, retención de

metales por interacción fisicoquímica del metal con componentes de la

superficie celular.

- Fitoremediación: Estos procesos aprovechan la habilidad de

algunas plantas de acumular metales pesados en sus raíces, ramas y hojas

mediante mecanismos de adsorción o por la excreción de componentes

que pueden variar las condiciones del suelo dando lugar a la formación de

complejos metálicos. La elección del método más adecuado depende de

las condiciones climáticas y de la biodisponilidad del metal en el suelo. Estas

ANTECEDENTES

16

técnicas tienen el inconveniente de requerir un tiempo elevado para la

obtención de resultados, habitualmente se emplean plantas que se

caracterizan por un rápido crecimiento. (Mulligan y col., 2001)

1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS

Algunos metales son esenciales para los microorganismos mientras

que otros son tóxicos incluso en pequeña cantidad. La habilidad para

crecer a altas concentraciones de metal se ha encontrado en muchos

microorganismos (Nies, 1999) y puede ser el resultado de mecanismos

intrínsecos o inducidos (Ledin, 2000). Gadd (1992) definió tolerancia como la

habilidad para soportar la presencia de metales tóxicos por medio de

propiedades intrínsecas y resistencia como la habilidad para sobrevivir en

presencia de metales tóxicos por medio de mecanismos de disminución de

toxicidad producidos como respuesta directa a la presencia de metal. Así,

muchos microorganismos se han adaptado adecuadamente a la presencia

de metales mediante sistemas de resistencia cromosómicos. Las mejoras en

las técnicas de manipulación genética pueden aumentar la resistencia a los

metales de gran número de microorganismos haciéndolos susceptibles de

ser aplicados para la remediación a mayor escala de medios

contaminados (Bruins y col., 2000).

Existe una gran diversidad de formas por las que los microorganismos

pueden interaccionar con los metales y variar su toxicidad (figura 2),

principalmente:

ANTECEDENTES

17

Intracelular

MetalotioninasPéptidos de metal gamma-glutamilcisteína

Enlazamiento no específico/QuelaciónCompartimentalización en organelosReacciones redox/Transformaciones

Membrana celular/espacio periplasmático

Adsorción/Intercambio iónicoReacciones redox/TransformacionesPrecipitaciónDifusión y transporte

Pared celular

Adsorción/Intercambio iónicoUnión covalenteAtrapamiento de partículasReacciones redoxPrecipitación

Materiales asociados a células

(Polisacáridos, cápsulas)Intercambio iónicoAtrapamiento de particulasEnlazamientono específicoPrecipitación

Reacciones extracelulares

Precipitación por productos excretadosFormación de complejos y quelaciónSideróforos

Figura 2: Procesos que contribuyen a la captación microbiana y disminución de la toxicidad de metales. (Gadd y White, 1993).

• Transformación mediante procesos redox, alquilación, etc.

modificando la movilidad y toxicidad de los metales.

• Acumulación de metales, que puede ser por un metabolismo

independiente (acumulación pasiva), sorción o por un

metabolismo dependiente que implica transporte intracelular

(acumulación activa), consumo. Pueden ocurrir ambos

mecanismos en el mismo organismo.

• Producción o eliminación de sustancias, como compuestos

orgánicos que varían la movilidad de los metales, o sulfuros

que reducen la movilidad de éstos.

• Participación en el ciclo del carbón, influyendo en la cantidad

y características de la materia orgánica, lo cual puede variar

en la movilidad de ciertos metales, ya que los compuestos

ANTECEDENTES

18

orgánicos podrían formar enlace con los metales. La

formación de complejos organo-metálicos modifica la

especiación de los metales.

• Modificación de la movilidad de los metales de forma

indirecta por cambios en el pH, potencial redox, etc.

consecuencia de su propio metabolismo.

1.2.1 TÉCNICAS DE BIORREMEDIACIÓN Los avances tecnológicos desarrollados actualmente para la

remediación de medios contaminados por metales pesados consisten en el

uso selectivo y la mejora de procesos naturales para el tratamiento de

residuos particulares. Las distintas interacciones entre microorganismo y

metal han dado lugar al desarrollo de distintos bioprocesos, algunos de los

cuales, se describen a continuación. La descripción de estos bioprocesos

(Figura 3) se puede realizar atendiendo a si movilizan o inmovilizan las

especies metálicas presentes en el medio contaminado (Cañizares-

Villanueva, 2000).

1.2.1.1 Técnicas de movilización

Biolixiviación

Los procesos de biolixiviación están basados en la habilidad de

ciertos microorganismos (bacterias, hongos) para transformar compuestos

sólidos dando lugar a elementos solubles y extraíbles, los cuales pueden ser

recuperados (Krebs y col., 1997). Esta capacidad implica principalmente:

• reacciones redox.

• formación de ácidos orgánicos e inorgánicos.

• excreción de agentes complejantes.

ANTECEDENTES

19

Biodegradación de compuestos organo-metálicos

Reducción de metal

Eliminación/producción de sustancias movilizadoras de metal

Acumulación de metales

Oxidación de azufreoxidación de metal

Reducción de metal

Reducción de azufre

MOVILIZACIÓN INMOVILIZACIÓNM-org

Fe(II)

M

org

Fe(III)

descenso de pH

Movilización de metal

M-orgM

M pasiva

M activa

sulfuro

aumento de pH

Inmovilización de metal

Fe(II)

Fe(III)

U (red)

U (ox)

Figura 3: Interacciones entre metales y microorganismos (Ledin, 2000)

Existe una gran diversidad de microorganismos de los que se conoce

su capacidad de lixiviar metales, entre ellos hay autótrofos, de cómo los

microorganismos del género Thiobacillus, y heterótrofos, como especies del

género Aspergillus y Penicillium, entre otros. La lixiviación de minerales con

sulfuro se basa en la actividad de bacterias quimiolitotrófas, principalmente

Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans, las cuales

convierten los sulfuros metálicos insolubles en sulfatos metálicos solubles

mediante una reacción de oxidación. La lixiviación de minerales sulfurados

por la acción de este tipo de bacterias con el objetivo de la extracción de

metales valiosos es una bioindustria ya establecida, sin embargo, hasta

hace unos años no se han comenzado a dar aplicaciones de la lixiviación

dirigidas a la reducción de la contaminación de suelos y otras matrices

contaminadas con metales pesados. La lixiviación de minerales no sulfurosos

(óxidos, carbonatos o silicatos) se lleva a cabo por bacterias y hongos

ANTECEDENTES

20

heterótrofos que excretan ácidos orgánicos o agentes quelantes o

complejantes que disuelven el metal presente en el medio. La biolixiviación

representa una tecnología limpia con bajo coste económico y bajo

requerimiento energético (Bosecker, 1997, Krebs y col., 1997)

1.2.1.2 Técnicas de inmovilización

Bioacumulación

Este tipo de técnicas se basan en la capacidad de algunos

microorganismos para interaccionar con especies metálicas por medio de

su superficie celular. Los microorganismos más adecuados para este tipo de

procesos son aquellos que tienen una relación área superficial/volumen

elevada para garantizar una superficie de contacto suficiente y poder así

interaccionar con el metal que se encuentra en sus alrededores.

La bioacumulación puede ser pasiva, llamada entonces biosorción, y

depende principalmente de las propiedades de superficie como la carga,

la orientación de los grupos funcionales sobre la superficie celular y de la

especiación del metal y su estado químico en la fase acuosa. La

bioacumulación consta básicamente de dos etapas, primero ocurre la

interacción electrostática entre los iones metálicos y los grupos reactivos

dispuestos sobre la superficie celular y, segundo, estos lugares se comportan

como núcleos de deposición de más metales. Actualmente se han

desarrollado procesos de biosorción con biomasa viva y muerta (Cañizares-

Villanueva, 2000).

Pero, además, los microorganismos tienen mecanismos de consumo o

acumulación de metales esenciales para su metabolismo y, en ocasiones,

pueden desarrollar esta capacidad para acumular metales no esenciales

en su interior. La bioacumulación activa o bioacumulación intracelular

requiere que se produzcan reacciones o componentes metabólicos por

ANTECEDENTES

21

parte de la célula, para ello necesitan de una fuente de energía. El

mecanismo intracelular se realiza mediante un sistema de transporte

específico que permite inmovilizar el metal en el interior de la célula. La

bioacumulación pasiva y activa puede darse de forma simultánea en un

mismo microorganismo (Ledin, 2000).

Bioprecipitación

Los microorganismos pueden inmovilizar de forma efectiva ciertos

metales pesados a través de su capacidad para reducir esos elementos a

estados de oxidación menores que los transforman en especies metálicas

menos activas, es decir, de menor movilidad. A veces este fenómeno está

muy ligado al de biosorción (Valls y Lorenzo, 2002). Uno de los mejores

ejemplos de este tipo de procesos lo representa la producción de sulfuro de

hidrógeno por parte de bacterias sulfato-reductoras, el cual reacciona con

metales pesados en forma soluble para transformarlos en compuestos

sulfuro, insolubles. Las bacterias del género Citrobacter tiene la capacidad

de precipitar metales pesados en forma de fosfatos (Beveridge y Doyle,

1989).

1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO

Una de las mayores fuentes de contaminación por metales pesados

la constituyen los residuos (emisiones, efluentes, lodos, etc.) procedentes de

las industrias. Como ejemplo de los residuos a tratar por los procesos

propuestos en esta memoria podemos considerar los residuos de

galvanizado. Las industrias dedicadas al galvanizado de piezas metálicas

destacan por su elevado contenido en este tipo de elementos. La

legislación actual establece los límites de vertido de los residuos

procedentes de este tipo de industrias por la toxicidad que suponen para el

medio ambiente. Como métodos prioritarios para la disminución del

ANTECEDENTES

22

contenido metálico en estos residuos se han comenzado a tomar medidas

en el proceso de fabricación tales como la separación de efluentes o la

sustitución de compuestos por otros menos nocivos.

Los métodos galvánicos o de recubrimiento electrolítico consisten en

depositar por vía electroquímica finas capas de metal sobre la superficie

sumergida en una solución hídrica con iones metálicos, electrolitos, al hacer

pasar una corriente (Figura 4). El objetivo es aportarle propiedades de

resistencia mecánica, conductoras o decorativas. El balance general de

este tipo de procesos se recoge en la figura 4. No obstante, es evidente que

en función del recubrimiento electrolítico que se utilice se van a generar

distintos de residuos. Así se pueden distinguir:

Cátodo

MM+n

Recubrimiento de M

Ánodo

Electrolito

e-e-

RECUBRIMIENTO ELECTROLÍTICO

Figura 4: Esquema de un baño de recubrimiento electrolítico.

ANTECEDENTES

23

Recubrimiento electrolítico

Agua

Sales metálicas

Aditivos

Ánodos

Material auxiliar (filtros, carbón activo).

Electricidad

Pieza metálica

Pieza recubierta

Agua residual de enjuague

Electrodos contaminados o usados

Lodos anódicos o de limpieza

Material auxiliar usado

Emisiones

Figura 5: Diagrama de balance de materiales para las operaciones de recubrimiento electrolítico

Cobrizado: Los baños de cobre pueden ser ácidos (sulfato de cobre)

o alcalinos (cianuro de cobre). Los ácidos requieren un mayor control pero

se prefieren a los cianurados por su toxicidad para el medio ambiente y la

salud.

Niquelado: En el galvanizado con níquel se pueden utilizar baños de

sulfamatos o baños “Watts” con sulfatos de níquel. La mezcla con otros

componentes del proceso puede generar complejos de níquel muy estables

y difíciles de tratar.

Cromado: los baños de cromado emplean cromo trivalente y

hexavelente. Debido a la elevada toxicidad del cromo (VI) sobre los seres

vivos, se realiza un control más exhaustivo de los residuos emitidos en esta

etapa y, generalmente, se someten sus aguas residuales a procesos con

bisulfito de sodio para reducir el Cr(VI) a Cr(III), menos tóxico.

Zincado: Los baños de zinc pueden ser cianurados (alcalinos) y

existen otros (ácidos) basados en potasio y amonio. Los baños cianurados,

ANTECEDENTES

24

por la toxicidad que representan, están comenzando a ser sustituidos por

otros compuestos como sales de sodio.

Actualmente, los residuos de galvanizado se suelen derivar a:

• confinamiento controlado

• reciclaje/reutilización

• almacenamiento temporal en la planta

• relleno sanitario

• tratamiento fisicoquímico

• drenaje municipal

Durante los últimos años, se han tomado las siguientes medidas para

reducir la contaminación por metales pesados en este tipo de plantas:

Enjuagues de recuperación y prolongación del escurrido: la pieza

recubierta se enjuaga y se trata de recuperar, aumentando la eficacia del

escurrido, el metal implicado en esa etapa para volver a emplearlo en el

baño electrolítico.

Sustitución de los compuestos metálicos más dañinos: los baños

cianurados de zinc se sustituyen por baños neutros de cloruro de zinc o

baños ácidos de sulfato, cloruro o fluoroboratos de zinc. Los baños

cianurados de cobre se sustituyen por baños ácidos de sulfato o

fluoroborato de cobre. Además se comienza a sustituir el cromo

hexavalente por cromo trivalente en el proceso de cromado, aunque esto

supone mayor coste y mantenimiento.

Eliminación de compuestos quelantes: en algunos baños de

recubrimiento electrolítico se emplean este tipo de compuestos para

controlar la concentración de iones libres en la solución pero pueden inhibir

ANTECEDENTES

25

la precipitación de los metales, por ello la tendencia es no emplearlos para

favorecer el tratamiento posterior de los lodos con metales.

Recuperación de metales y sales metálicas de los baños mediante

procesos de:

• Ósmosis inversa

• Electrodiálisis

• Precipitación y separación.

• Separación electrolítica.

• Evaporación

• Intercambio iónico

Entre los factores que determinan si la recuperación del metal es

económicamente justificable se incluyen el volumen de residuo que

contiene el metal, su concentración, el potencial para reutilizar el metal una

vez recuperado y los costos de tratamiento y deposición. Algunas de las

características más relevantes de estos procesos se recogen en la tabla 2.

Habitualmente, los métodos convencionales para eliminar los metales

pesados de los efluentes industriales resultan muy costosos. La necesidad de

encontrar procesos más económicos hace atractivos a los procesos

biológicos que pueden reducir el contenido de estos contaminantes de

forma eficaz y sin implicar elevados costes (Atkinson y col, 1996). En este

sentido, se vienen desarrollando algunos trabajos que van desde la

utilización de corteza de árbol cuyos componentes actúan como agentes

quelantes sobre los metales pesados (Gaballah y Kilbertus, 1998), el uso de

subproductos de algunas industrias (barros, cenizas, etc.) u otros soportes

(arena, silica, etc.) para actuar como base para procesos de adsorción

(Santos y Oliveira, 2003, Ciccu y col., 2003), el empleo de bacterias, hongos

ANTECEDENTES

26

o algas como biosorbentes (Atkinson y col., 1996, Malik, 2004) o el desarrollo

de procesos con otros microorganismos para la solubilización de los metales

presentes en un residuo industrial (Bosecker, 2001).

Técnica Intercambio iónico

Ósmosis inversa o electrodiálisis

Separación electrolítica Evaporación

Objetivo Recuperación del electrolito

Recuperación del electrolito y el agua desionizada

Recuperación interna de metales en enjuagues o soluciones concentradas

Concentración de los enjuagues para retornarlos al baño

Requisitos

equipo de intercambio iónico, agua desionizada, energía electrica

Energía eléctrica, membranas

Equipo de electrolisis, energía eléctrica

Equipo de evaporación atmosférica, energía

Costos Alto Alto Bajo-medio alto Relación costo/ beneficio

Regular-/mala Buena Buena Regular -mala

Aplicación

Recuperación de metales presentes como electrolitos

Recuperación de metales en el primer enjuague de cascada

Recuperación de metales en enjuagues de recuperación o de cascada

Recuperación d metales en baños calientes

Limitantes

Exige alto control de proceso. No se puede usar para algunos electrolitos

Uso de agua desionizada. Resistencia de las membranas a cambios en el pH y la temperatura. No aplicable al cromo

Solo para soluciones concentradas. No aplicable al cromo

Baños calientes sin tensioactivos Es recomendable el agua desionizada

Tabla 2: Principales características de algunos de los tratamientos empleados para recuperar metales en las plantas de galvanizado (GTZ, 1998)

1.4 CARACTERÍSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES ESTUDIADOS

Existe un gran número de metales que se encuentran de forma

habitual en los medios contaminados por la actividad industrial,

principalmente. De todos ellos, se han seleccionado para el estudio de su

posible eliminación o reducción por medio de la actividad bacteriana, los

ANTECEDENTES

27

iones cromo (III), niquel (II) y zinc(II). Estos iones se encuentran a distintas

concentraciones en los efluentes industriales y existe una legislación que

detalla los niveles máximos permitidos en el medio ambiente.

1.4.1 CROMO

1.4.1.1 Características

El cromo es un metal de color blanco plateado, duro y quebradizo,

relativamente suave y dúctil cuando se encuentra en estado puro y no está

tensionado. No se encuentra en estado elemental en la naturaleza. Su

mineral más importante por abundancia es la cromita (FeCr2O4 o FeO·

Cr2O3). El cromo puro se obtiene por reducción del óxido de cromo(III) con

aluminio (procedimiento aluminotérmico), mediante electrolísis o a partir de

ioduro crómico. Sus características más relevantes y las de sus compuestos

más comunes se recogen en la tabla 3. (Página web 1)

Existen cuatro isótopos naturales del cromo: 50Cr, 52Cr, 53Cr y 54Cr. Se

han producido otros mediante reacciones radioquímicas de los cuales el

más importante es el 51Cr.

El cromo galvanizado y pulido es de color blanco azulado brillante y

su poder reflejante es el 77% del de la plata.

El cromo forma fundamentalmente compuestos con el oxígeno: óxido

de cromo (II) (CrO), óxido de cromo(III) (Cr2O3) y óxido de cromo (VI) (CrO3).

Se conocen también los peróxidos, ácido percrómico y percromatos y son

muy comunes los halogenuros.

ANTECEDENTES

28

Nombre Cromo

Símbolo Cr

Nº atómico 24

Masa atómica (g/mol) 51,996

Valencia 2, 3, 4, 5, 6

Aspecto metal blanco-azul plateado

Nº CAS 7440-47-3

Punto de ebullición (ºC) 2665

Punto de fusión (ºC) 1857

Densidad (g/ml) a 20ºC 7,19

Solvólisis en H2SO4 y HCl diluidos

Presión vapor (Pa, 844ºC) 10-6

Configuración electrónica [Ar] 3d54s1

Electronegatividad 1,66

1er Pot. de ionización (eV) 6,80

Radio atómico (Å) 1,27

Radio covalente (Å) 1,27

Radio iónico (Å) (e.o +3) 0,69

Tabla 3a: Datos generales y características fisico-químicas del cromo.

Nombre Dicromato de sodio (dihid) Óxido de cromo(VI)

Fórmula Na2Cr2O7·2H2O CrO3

Masa molecular (g/mol) 298 (anhidro 261,98) 99,99

Aspecto agujas anaranjadas-rojas Cristales rojo oscuro

Nº CAS 7789-12-0 1333-82-0

Punto de ebullición (ºC) > 400 ºC descomposición No destilable

Punto de fusión (ºC) 357ºC (>86º sal anhidra) 198ºC

Densidad (g/ml) 2,35-2,52 2,7

Solvólisis 73,18% en H2O a 20ºC 1660 g/l a 20ºC

Tabla 3b: Características de algunos compuestos comunes de cromo (VI)

Sus propiedades mecánicas, dureza y resistencia a la tensión, le

proporcionan una gran variedad de aplicaciones. El cromo tiene una

capacidad relativamente baja de forjado, enrrollamiento y propiedades de

ANTECEDENTES

29

manejo, pero cuando se encuentra libre de oxígeno, hidrógeno, carbono y

nitrógeno es muy dúctil y se puede forjar y manejar.

Las principales aplicaciones del cromo son: su uso como catalizador

en la síntesis del amoniaco, en la fabricación de aceros de cromo y aceros

inoxidables, en aleaciones con cromo y en el cromado galvánico. Los

compuestos orgánicos del cromo se emplean como pigmentos para

pinturas y las sales de cromo(VI) se emplean para la preservación de la

madera y el curtido de cueros (Pais y Benton, 2000).

1.4.1.2 Toxicidad

El cromo es un elemento natural que se encuentra en rocas,

animales, plantas, suelos y en polvos y gases volcánicos. Las formas más

comunes en el medio ambiente son Cr elemental, Cr(III) y Cr(VI). No se

asocia un olor o sabor característico a este tipo de compuestos.

El cromo (III) aparece de forma natural en el ambiente y es un

elemento nutritivo esencial ya que interviene en algunos procesos

metabólicos. El cromo elemental y el cromo (VI) se producen generalmente

por procesos industriales.

Resultado de las actividades industriales, el cromo en sus distintas

formas entra en contacto con el medio natural, es decir, con el aire, agua,

suelo y, consecuentemente, en la cadena alimenticia.

Agua: En los sistemas acuáticos, la toxicidad de los compuestos

solubles de cromo varía según la temperatura, pH, dureza del agua y

organismos que la pueblan. Los compuestos de cromo (VI) se disuelven con

facilidad, pero en condiciones naturales y en presencia de materia

orgánica oxidable, se reducen rápidamente a compuestos de cromo (III)

más estables y menos hidrosolubles.

ANTECEDENTES

30

Suelo: La movilidad del cromo se evalúa considerando la capacidad

de adsorción y reducción de los suelos y sedimentos. Los hidróxidos de

cromo (III), una vez sedimentados, difícilmente vuelven a movilizarse, ya que

la oxidación a cromo (VI) no ocurre de forma natural. El cromo (VI) resulta

tóxico aun en concentraciones muy bajas, siendo el pH del suelo un factor

muy influyente. El uso de fosfatos incrementa la entrada de cromo en el

suelo.

Cadena alimentaria: Los compuestos de cromo (III) asimilados junto

con los alimentos resultan relativamente inocuos, sin embargo, los de cromo

(VI) son altamente tóxicos. Los animales y seres humanos incorporan al

organismo cantidades relativamente bajas de cromo por inhalación. La

mayor entrada de cromo se produce por el agua o los alimentos que se

ingieren, la resorción en el intestino depende de la forma en que se

encuentre este metal. Se asimilan el 20-25% del cromo de complejos

orgánicos y un 0,5% del cromo inorgánico. La gran parte del cromo que se

encuentra en el medio ambiente se atribuye a emisiones industriales. Las

emisiones naturales hacia la atmósfera son de unas 58000 t/a y las de origen

industrial cerca de las 100000 t/a.

Riesgos sobre la salud humana: Respirar niveles altos de cromo (VI)

provoca irritación y hemorragias nasales y úlceras y perforaciones en el

tabique nasal. Los efectos agudos que puede provocar el contacto con

derivados del cromo hexavalente son fuerte irritación de la piel e incluso

quemaduras, así como alteraciones hepáticas y renales. Como efectos

crónicos se conocen la dermatitis alérgica de contacto y el cáncer de

pulmón (OIT, 2001).

ANTECEDENTES

31

1.1.2.NIQUEL

1.1.2.1.Características

El níquel es un metal blanco plateado. Es duro, maleable, dúctil, algo

ferromagnético y buen conductor del calor y de la electricidad. Este metal

es estable al aire y al agua y no se suele encontrar de forma libre en la

naturaleza pero es muy común encontrarlo de forma elemental en los

meteoritos (5-20%) y se cree que hay gran cantidad de este elemento en el

núcleo terrestre. Los minerales más comunes de este metal son la pirrotina

(pirita de cobre [CuFeS2], pentlandita [NiS]), garnierita [(Ni,Mg)3H4Si2O11],

millerita [NiS], niquelina [NiAs] y algunos más.

Existen cinco isótopos naturales del níquel: 58Ni, 60Ni, 61Ni, 62Ni y 64Ni.

Además se han identificado siete isótopos radiactivos. En la tabla 4 se

resumen las principales características del níquel y algunos de sus

compuestos.

Los compuestos más comunes del níquel son: el tetracarbonilo de

níquel [Ni(CO4)], líquido incoloro sumamente venenoso, el óxido de níquel

[NiO] , el cloruro de níquel [NiCl2] y el sulfato de níquel [NiSO4].

Entre las aplicaciones principales del níquel destacan su uso

formando parte de aleaciones, forma aleaciones con casi todos los

metales, en técnicas de niquelado para recubrimiento de metales como

protección a la corrosión, fabricación de monedas y blindajes,

catalizadores, baterías de níquel-cadmio y pigmentos para pinturas entre

otras (Pais y Benton, 2000).

ANTECEDENTES

32

Nombre Níquel

Símbolo Ni

Nº atómico 28


Valencia 2, 3

Aspecto Blanco plateado

Nº CAS 7440-02-0


Punto de fusión (ºC) 1455


Solvólisis en H2SO4 y HCl diluidos

Presión vapor (Pa, 20ºC) 0







Tabla 4a: Datos generales y características fisico-químicas del níquel.

Nombre Tetracarbonilo de níquel cloruro de níquel

Fórmula Ni(CO4) NiCl2(·6H2O)

Masa molecular (g/mol) 170,75 129,6

Aspecto Líquido incoloro Cristales amarillo pálido

Nº CAS 13463-39-3 7718-54-9

Punto de ebullición (ºC) 42,2

Punto de fusión (ºC) -19,3 987

Densidad (g/ml) 1,31 3,55

Solvólisis Disolventes orgánicos En agua: 1170 g/l

Tabla 4b: Características de algunos compuestos comunes de níquel.

1.1.2.2.Toxicidad

El níquel es liberado al aire por las plantas de producción de energía

y las incineradoras de basuras y es, posteriormente, depositado en el suelo.

También puede llegar al medio ambiente en las aguas residuales. La mayor

ANTECEDENTES

33

parte de los compuestos de níquel liberados al ambiente se absorben por

los sedimentos o partículas del suelo donde el níquel es finalmente

inmovilizado.

Agua: En los sistemas acuáticos el níquel, habitualmente, se

encuentra en estado de oxidación (II), la forma en que se encuentra en el

agua depende del pH. Los compuestos de níquel ingresan en el agua

generalmente de modo antropogénico y se pueden encontrar sales

solubles, óxidos insolubles o polvo de níquel metálico.

Aire: El níquel en el aire se encuentra en forma de aerosol. En el aire la

forma metálica es estable. Con respecto a las emisiones, las mayores

corresponden a sulfatos, óxidos simples y óxidos complejos de níquel y, en

menor medida, el polvo de níquel metálico.

Suelo: Se suele encontrar como mineral cristalino inorgánico, en

complejos quelados o como ión libre. El comportamiento de estos

compuestos en el suelo depende de su naturaleza y, principalmente, del

tipo de suelo. Generalmente la disminución del pH incrementa la desorción

y, por tanto, aumenta el contenido de níquel en solución en el suelo.

Cadena alimentaria: Numerosas plantas acumulan níquel que toman,

principalmente, del suelo a través de su sistema radicular, lo cual hace que

la ingestión de níquel por el ser humano se pueda deber al consumo de

vegetales. Para muchas plantas el níquel constituye un nutriente importante

para el crecimiento vegetal.

Riesgos sobre la salud humana: El metal y sus compuestos inorgánicos

se pueden considerar inocuos pero el contacto permanente con la piel

puede provocar la “sarna del níquel”. Los compuestos orgánicos, como el

tetracarbonilo de níquel son extremadamente tóxicos. Los riesgos principales

derivados de la exposición continuada a compuestos de níquel son:

ANTECEDENTES

34

alergias, rinitis, sinusitis, enfermedades respiratorias y cáncer (cavidades

nasales, pulmón) (OIT, 2001).

1.4.2 ZINC

1.1.3.1.Características

El zinc puro y recientemente pulido es de color blanco azulado y

brillante, es dúctil y maleable pudiéndose enrollar y tensar pero cantidades

pequeñas de otros metales pueden volverlo quebradizo. Es buen conductor

del calor y de la electricidad. El zinc puro no es ferromagnético. Los

minerales de zinc son muy comunes y se suelen encontrar acompañados de

otros metales (plomo, cadmio, hierro, cobre…), entre ellos destacan: la

blenda (esfarelita) [ZnS], la wurzita [ZnS], la smithsonita o calamina [ZnCO3],

la hemimorfita y willemita (silicatos de zinc) y la cincita [ZnO] (Tabla 5).

Se conocen un gran número de isótopos del zinc de los cuales los

cinco más estables son: 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn y 70Zn.

El zinc normalmente forma los compuestos en estado divalente, los

más importantes son: el óxido de zinc [ZnO] que se emplea como pigmento

blanco, relleno de materiales de caucho, farmacia, cosmética, tintas y

equipos eléctricos; el sulfuro de zinc [ZnS] que se emplea como fluorescente

en señales, televisiones, radioscopia y pinturas, y el sulfato de zinc [ZnSO4] útil

en la fabricación de pinturas, tratamiento de maderas y obtención de zinc

hidrolítico.

Las aplicaciones del zinc más importantes son su uso en aleaciones,

sobretodo con aluminio y cobre que aumentan su solidez, su empleo como

protección superficial de otros metales en chapas y alambres de hierro,

cubos y techados y el agregado de magnesio es muy empleado en la

industria del automóvil (Pais y Benton, 2000).

ANTECEDENTES

35

Nombre Zinc, cinc

Símbolo Zn

Nº atómico 30


Valencia +2

Aspecto Blanco-azulado brillante

Nº CAS 7440-66-6


Punto de fusión (ºC) 419,5


Solvólisis En ácidos y bases

Presión vapor (Pa, 103,3ºC) 1,3 x 10-7







Tabla 5a: Datos generales y características fisico-químicas del zinc.

Nombre Óxido de zinc Sulfato de zinc

Fórmula ZnO ZnSO4

Masa molecular (g/mol) 81,37 161,43

Aspecto Cristales o polvo blanco Cristales incloros

Nº CAS 1314-13-2 7733-02-0

Punto de fusión (ºC) 1975 >600

Densidad (g/ml) 5,6 3,54

Solvólisis En agua: 1,6 x 103

Tabla 5b: Características de algunos compuestos comunes de zinc

1.4.2.1 Toxicidad

El zinc se encuentra de forma natural en el aire, el agua y el suelo

pero actualmente las concentraciones están aumentando por las

ANTECEDENTES

36

actividades industriales como la minería, la combustión del carbón y los

residuos y el procesado del acero.

Agua: La presencia de zinc en el agua se debe principalmente a los

vertidos de aguas residuales que no son depuradas de forma satisfactoria, lo

cual puede provocar el aumento de la acidez del suelo. Este metal

permanece estable en agua dulce y salada debido a la capa de óxido que

lo recubre. En polvo, debido a la gran superficie de contacto, es muy

reactivo, creando peligro de explosión.

Suelo: Se puede detectar acumulación de zinc en suelos hasta un

radio de varios kilómetros de distancia de las plantas metalúrgicas y en las

cercanías inmediatas no es posible la explotación agrícola. La presencia de

zinc afecta a las plantas y puede interrumpir la actividad biológica en los

suelos, dificultando la descomposición orgánica.

Cadena alimentaria: En suelos ricos en zinc sólo un número limitado

de plantas tiene la capacidad de sobrevivir ya que la presencia de este

metal produce necrosis, clorosis e inhibe el crecimiento. Algunos peces

pueden acumular zinc cuando viven en cursos contaminados de agua. La

acumulación de zinc en seres vivos y plantas afecta claramente a la

cadena alimentaria.

Riesgos sobre la salud humana: El zinc es nutriente esencial para los

humanos y los animales (cofactor enzimático) su deficiencia provoca

problemas en el crecimiento y la madurez y anemia. En contraposición un

exceso de zinc produce úlceras de estomago, irritación de la piel, vómitos,

daños en el páncreas, disturbios en el metabolismo de las proteínas y

arteriosclerosis. La exposición continuada en el ambiente de trabajo

produce la fiebre o los escalofríos del zinc (OIT, 2001).

ANTECEDENTES

37

1.5 LEGISLACIÓN SOBRE METALES PESADOS

Los metales pesados son considerados como residuos tóxicos y

peligrosos por la ley 20/1986, de 14 de Mayo, Básica de Residuos Tóxicos y

Peligrosos. Dicha ley fue modificada por el Real Decreto 952/1997, de 20 de

junio, y en ella se exponen la clasificación de residuos, los modos de gestión

y las obligaciones del productor de residuos.

La generación de residuos con presencia de metales pesados

proviene de muchas y diversas fuentes. La orden del Ministerio de Medio

Ambiente MAM/304/2002, de 8 de Febrero, publica las operaciones de

valorización y eliminación de residuos y la lista europea de residuos.

En la tabla 6 se recopilan los principales residuos que contienen

metales pesados obtenidos a partir de la clasificación europea de residuos

procedente de la decisión 2000/532/CE de 3 de Mayo de 2000. Por otra

parte esta orden presenta un listado de las operaciones de eliminación y

valorización de residuos, entre ellas se consideran algunas de las

actividades relacionadas con el tipo de residuos que se tratan en este

estudio (tabla 7).

Resulta complicado establecer unos valores límite de metales

pesados en suelos, lodos, aguas y sedimentos, ya que estas

concentraciones dependen del tipo de residuo en que se encuentren y de

la legislación propia de cada estado o comunidad autónoma.

Ya que el residuo a tratar bajo el proceso estudiado en el presente

trabajo se constituye de una matriz sólida en la que se encuentran

inmovilizados los metales pesados, podemos hacer referencia a la

legislación existente respecto a la aplicación de lodos a suelos.

ANTECEDENTES

38

01 Residuos de la prospección, extracción de minas y canteras y tratamientos físicos y químicos de minerales

010101 Residuos de la extracción de minerales metálicos

010304 Estériles que generan ácido procedentes de la transformación de sulfuros

010307 Otros residuos que contienen sustancias peligrosas procedentes de la transformación física y química de minerales metálicos.

04 Residuos de las industrias del cuero, de la piel y textil

040104 Residuos líquidos de curtición que contienen cromo

040106 Lodos, en particular los procedentes del tratamiento in situ de efluentes, que contienen cromo.

040108 Residuos de piel curtida (serrajes, rebajaduras, recortes, polvo de esmerilado) que contienen cromo.

06 Residuos de procesos químicos inorgánicos

060313 Sales sólidas y soluciones que contienen metales pesados

060315 Óxidos metálicos que contienen metales pesados

060405 Residuos que contienen otros metales pesados

060502 Lodos de tratamiento in situ de efluentes que contienen sustancias peligrosas

10 Residuos de procesos térmicos

1005 Residuos de la termometalurgia del zinc

1006 Residuos de la termometalurgia del cobre

1008 Residuos de la termometalurgia de otros metales no férreos

11 Residuos del tratamiento químico de superficie y del recubrimiento de metales y otros materiales; residuos de la hidrometalurgia no férrea

110109 Lodos y tortas de filtración que contienen sustancias peligrosas

110111 Líquidos acuosos de enjuague que contiene sustancias peligrosas

110202 Lodos de la hidrometalurgia del zinc

110502 Cenizas de zinc

12 Residuos del moldeado y tratamiento físico y mecánico de superficies de metales y plásticos

120103 Limaduras y virutas de metales no férreos.

ANTECEDENTES

39

120118 Lodos metálicos que contienen aceites

16 Residuos no especificados en otros capitulos

160118 Metales no férreos

160601 Baterías de plomo

160602 Acumuladores de Ni-Cd

160802 Catalizadores usados que contienen metales de transición peligrosos o compuestos de metales de transición peligrosos

17 Residuos de la construcción y demolición

19 Residuos de las instalaciones para el tratamiento de residuos de las plantas externas de tratamiento de aguas residuales y de la preparación de agua para consumo humano y de agua para uso industrial

1903 Residuos estabilizados/solidificados

1904 Residuos vitrificados y residuos de la vitrificación

1905 Residuos del tratamiento aeróbico de residuos sólidos

190702 Lixiviados de vertedero que contienen sustancias peligrosas

190805 Lodos del tratamiento de aguas residuales urbanas

190808 Residuos procedentes de sistemas de membranas que contienen metales pesados

190811 Lodos procedentes del tratamiento biológico de aguas residuales industriales, que contienen sustancias peligrosas

190813 Lodos procedentes de otros tratamientos de aguas residuales industriales, que contienen sustancias peligrosas

1910 Residuos procedentes del fragmentado de residuos que contienen metales

191202 Metales férreos

191301 Residuos sólidos, de la recuperación de suelos, que contienen sustancias peligrosas

20 Residuos municipales incluidas las fracciones recogidas selectivamente

200133 Baterías y acumuladores especificados en los códigos 160601, 160602 ó 160603 y baterías y acumuladores sin clasificar que contienen esas baterías

200140 Metales

Tabla 6: Clasificación de residuos que contienen metales pesados

ANTECEDENTES

40

código Operacion

D2 Tratamiento en medio terrestre (biodegradación de residuos líquidos o lodos en el suelo)

Operaciones de eliminación

D8 Tratamiento biológico que da como resultado compuestos o mezclas que puedan eliminarse por un procedimiento autorizado

Operaciones de valorización R4

Reciclado o recuperación de metales y de compuestos metálicos

Tabla 7: Operaciones relacionadas con el trabajo desarrollado.

La directiva 86/278/CEE, de 12 de junio, se refiere a la protección del

medio ambiente y, en particular, de los suelos, en la utilización de los lodos

de depuradora en agricultura.

Esta ley tiene por objeto regular el uso de lodos para evitar efectos

nocivos sobre suelos, plantas, animales y seres humanos y fomentar su

correcto uso. En ella se considera:

• que los lodos pueden tener propiedades agronómicas útiles, lo

que conlleva a su valorización en la agricultura.

• que ciertos metales pesados pueden ser tóxicos para las

plantas y para el ser humano por su presencia en las cosechas.

• que es necesario fijar valores límite para dichos elementos en

el suelo.

• que es necesario prohibir la utilización de lodos con metales

pesados cuando la concentración de éstos supera los valores

límite.

Para ello, se establecen los niveles permitidos de ciertos metales para

tres condiciones diferentes:

• valores límite de concentraciones de metales pesados en los

suelos que reciben lodos.

ANTECEDENTES

41

• valores límite de concentraciones de metales pesados en los

lodos.

• valores de las cantidades máximas anuales de metales

pesados que pueden ser introducidos en los suelos destinados

a la agricultura.

Dichos valores se recogen en la tabla 8. En esta directiva queda

pendiente el establecimiento de los valores límite para el cromo.

Valores límite de metales pesados en suelos tratados con lodos (mg/kg mat. seca)

Valores límite de metales pesados en

lodos (mg/kg mat. seca)

Cantidades máximas anuales

(g/ha/año)

Cd 1-3 20-40 150

Cu 50-140 1000-1750 12000

Hg 1-1,5 16-25 100

Ni 30-75 300-400 3000

Pb 50-300 750-1200 15000

Zn 150-300 2500-4000 30000

Tabla 8: Valores límite de concentraciones de metales pesados recogidos en la directiva 86/278/CEE

En el borrador para una nueva Directiva relativa a la aplicación de

lodos en el suelo (Bruselas 12/01/2000) se definen los tipos de lodos y se

presentan valores límite de concentración de metales pesados algo más

restrictivos y en función del pH del suelo.

En dicho trabajo además:

• se exige comprobar mediante un test si es posible que el Cr(III)

se oxide a Cr(VI) y si es así, se prohíbe el uso de lodos que

produzcan mas de 1 �M de Cr(VI).

ANTECEDENTES

42

• se establecen los valores límite para concentraciones de

compuestos orgánicos y dioxinas

La legislación española, en el Real Decreto 1310/1990 regula la

utilización de lodos de depuración en el sector agrario y traspone al

derecho español la Directiva de la UE 86/278/CEE. En ella se presentan los

valores límite de concentración de metales pesados, incluyendo el cromo,

en suelos tratados con lodos, en lodos para ser utilizados con fines agrícolas

y las cantidades máximas anuales aplicables de lodos en suelos (tabla 9)

Valores límite de metales

pesados en suelos tratados con lodos (mg/kg mat. seca)

Valores límite de metales pesados en lodos (mg/kg mat. seca)

Cantidades máximas anuales (g/ha/año)

Suelo pH<7 Suelo pH>7 Suelo pH<7 Suelo pH>7

Cd 1 3 20 40 150

Cu 50 210 1000 1750 12000

Ni 30 112 300 400 100

Pb 50 300 750 1200 3000

Zn 150 450 2500 4000 15000

Hg 1 1,5 16 2,5

Cr 100 150 1000 1500 30000

Tabla 9: Valores límite de concentraciones de metales pesados recogidos en el Real Decreto 1310/1990

El tratamiento de residuos sólidos que contienen metales pesados

puede dar lugar a la movilidad de estos elementos y su paso a medios

líquidos. Por tanto, resulta de interés conocer los valores límite de vertido de

los metales pesados.

ANTECEDENTES

43

La ley 29/1985, de 2 de Agosto, ley de Aguas, modificada

principalmente por la Ley 46/1999, de 13 de Diciembre, recoge los valores

límite de diversos parámetros en los vertidos de agua residuales. Los

principales metales pesados se recogen en la tabla 10.

Elemento Valores límite (mg/l)

Cadmio 0,1-0,5

Cobre 0,2-10

Cromo (III) 2-4

Cromo (IV) 0,2-0,5

Niquel 2-10

Mercurio 0,05-0,1

Plomo 0,2-0,5

Zinc 3-20

Tabla 10: Valores límite de concentración de metales pesados (mg/l) permitidos en vertidos de aguas residuales para efluentes con pH 5,5-9,5.

ANTECEDENTES

44

2 BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS AZUFRE-

OXIDANTES

2.1.BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES

Los metales valiosos han sido obtenidos a partir de minerales por

lixiviación desde hace cientos de años. Este proceso se creyó que era una

reacción química mediada por la presencia de oxígeno y agua hasta 1947,

cuando fue demostrada la catálisis bacteriana de la oxidación del hierro y

la formación de ácido sulfúrico en las aguas de mina (Colmer y Hinkle, 1947)

En la actualidad, el uso de microorganismos para extraer metales a

partir de minerales, denominado como biominería, es bien conocido. Los

microorganismos participan en la deposición y solubilización de metales

pesados de la corteza terrestre desde siempre y esta actividad

mayoritariamente ha estado ligada al ciclo del hierro y del azufre. El uso de

microorganismos en el procesado de minerales tiene algunas ventajas sobre

los métodos fisicoquímicos tradicionales: son compatibles con el medio

ambiente, no requieren un elevado costo energético y son útiles en la

recuperación de minerales de baja ley (Rawlings, 2002).

La biominería incluye términos como biolixiviación y biooxidación. La

biolixiviación consiste en la conversión de un metal formando parte de un

compuesto insoluble mediante un proceso de oxidación que lo transforma

en una forma soluble, permitiendo así la extracción del metal en el medio

acuoso. La biooxidación se refiere a los procesos en los cuales la

recuperación de un metal es facilitada por la descomposición microbiana

del mineral, pero el metal extraído no es solubilizado. Un ejemplo es la

recuperación de oro a partir de la arsenopirita, la oxidación se produce

ANTECEDENTES

45

sobre otros compuestos del mineral que acompañan al oro, permitiendo la

liberación de éste que es posteriormente extraído por cianurización.

La aplicación de procesos basados en la biolixiviación permite la

obtención de metales a partir de minerales de forma natural pero también

a partir de residuos industriales que no pueden ser manejados por técnicas

convencionales. No obstante, los procesos de biolixiviación sólo han

tomado importancia recientemente en algunas industrias minerales,

mientras que la lixiviación hidrometalúrgica química en condiciones ácidas

ha sido muy desarrollada (Krebs y col., 1997).

Una variedad de microorganismos catalizan la lixiviación de minerales

a partir de depósitos minerales y pilas en las minas. Entre ellos, las especies

autótrofas Thiobacillus y las especies heterótrofas Aspergillus y Penicillium son

las más estudiadas. Krebs y col. (1997), recoge una selección de los

microorganismos conocidos por su capacidad potencial para la lixiviación.

2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES

Los microorganismos más activos en la biolixiviación de minerales

sulfurados son las bacterias que pertenecen al género Thiobacillus, aunque

también se conocen especies de otros géneros (Acidianus, Sulfolobus,

Leptospirillum) que actúan sobre este tipo de minerales.

La lixiviación bacteriana es llevada a cabo en los ambientes ácidos,

a valores de pH entre 1,5-3, a los cuales la mayoría de los iones metálicos se

mantienen en solución. En estas condiciones las especies acidófilas

Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans son las de mayor

importancia. Otros miembros de este género son también capaces de

oxidar azufre y sulfuros pero sólo crecen a valores de pH mayores a los

cuales no todos los iones metálicos se mantienen disueltos.

ANTECEDENTES

46

Como resultado del análisis de la secuencia 16S rARN (ARN

ribosomial) se incluyen desde el año 2000 dentro del género Thiobacillus las

bacterias azufre-oxidantes pertenecientes a las divisiones �, � y � de las

Proteobacterias. Con lo cual, el género Thiobacillus fue subdividido en un

nuevo género, Acidithiobacillus (At.), para acomodar a los miembros

altamente acidófilos que componían el género. Éste incluye At.

ferrooxidans, At. thiooxidans y At. caldus (anteriormente conocidos como

Thiobacillus ferrooxidans, thiooxidans y caldus, respectivamente)(Nelly y

Wood, 2000).

2.1.1 CARACTERÍSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y Acidithiobacillus thiooxidans. Son bacterias gram-negativas, de forma cilíndrica no esporulada y

que habitualmente se encuentran de forma natural en las aguas ácidas de

minas (Johnson y Hallberg, 2003; Dopson y col., 2003). Sus características

más destacables son (Nemati y col., 1998; Bosecker, 1997; Norris, 1990):

• Quimiolitotrófas: obtienen la energía necesaria para su

metabolismo a partir de compuestos reducidos o parcialmente

reducidos de azufre siendo el producto final de la oxidación el

sulfato.

• Autótrofas: la fuente de carbono para la síntesis de nuevo

material celular la obtienen mediante la fijación de dióxido de

carbono atmosférico. Requieren de otros nutrientes como N y P

junto con algunos elementos traza.

• Aerobias: el oxígeno es el principal aceptor de electrones.

• Mesófilas: su óptimo de temperatura se encuentra en torno a

30ºC aunque el rango de temperaturas es muy amplio debido

a la gran diversidad de las distintas cepas de estas especies.

ANTECEDENTES

47

• Acidófilas: viven en ambientes ácidos (pH<6).

A pesar de su similitud estas bacterias difieren en otras características

muy relevantes que se describen a continuación y algunas de las cuales se

recogen en la Tabla 11.

Característica Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans

Tamaño 0,5 x 1-1,5 �m 0,3 x 1-1,2 �m

Rango de temperatura 15-37 ºC 10-37 ºC

Temperatura óptima 30 ºC 30 ºC

Rango de pH 1,4-6 0,5-6

pH óptimo 2,0 2,0-3,5

Fuente de energía Fe2+,S0, S2-, S2O32-, UO22+ S0, S2O32-, S4O62-

Fuente de carbono CO2 CO2

Fuente de nitrógeno NH4+ NH4+

Aceptores electrónicos O2, Fe3+ O2

Tabla 11: Principales características de Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans.

Acidithiobacillus ferrooxidans: es el protagonista en los procesos de

biolixiviación (Norris, 1990; Bosecker, 1997). Esta bacteria fue aislada por

primera vez en 1947 por Colmer y Hinkle de un drenaje ácido de minas.

Morfológicamente es muy similar a At. thiooxidans pero la principal

característica que las diferencia es su capacidad para derivar la energía

también de compuestos del ión ferroso, por lo que es una bacteria hierro-

oxidante y esta capacidad la hace partícipe en los distintos mecanismos

implicados en la lixiviación de minerales ya que regenera el férrico, que es

un importante agente lixiviante. At. ferrooxidans además no es aerobio

estricto, y es capaz de crecer anaerobiamente en sustratos de azufre bajo

ciertas condiciones empleando Fe(III) como aceptor de electrones (Das y

col., 1992; Pronk y col.; 1992, Leduc y Ferroni, 1994)

Acidithiobacillus thiooxidans: fue aislado por primera vez en 1922 por

Walksman y Joffe, tienen forma de varilla corta, su longitud no supera el

ANTECEDENTES

48

micrón y eventualmente poseen un flagelo polar que les confiere una

movilidad superior a la observada en At. ferrooxidans. Obtienen la energía

necesaria para su metabolismo únicamente a partir de azufre elemental o

de compuestos reducidos de azufre (sulfuros, tiosulfatos). La principal

diferencia con At. ferrooxidans es su menor contenido en GC (guanina-

citosina) en su ADN y su imposibilidad para oxidar hierro, lo cual no le

permite la lixiviación por el mecanismo indirecto, ya que ésta involucra la

presencia de Fe(III) y, como consecuencia, no solubiliza algunos minerales

como la pirita y la calcopirita (Norris, 1990).

En la oxidación de los compuestos de azufre, donde el oxígeno

molecular es el último aceptor de electrones, se forman una serie de

especies intermedias (sulfito, tiosulfato) que tienen diversidad de

aplicaciones por sus características reductoras (Donati y Curutchet, 1995).

En presencia de la bacteria, la oxidación se completa hasta la formación

de ácido sulfúrico, lo que provoca una disminución del pH en el medio que

puede alcanzar valores incluso menores de 1 (Imai, 1978).

La elevada producción de ácido a partir de una fuente

relativamente barata, el azufre elemental, permite su uso como agente

lixiviante en variedad de situaciones (Imai, 1978; Schröter y Sand, 1992):

descomposición de rocas, solubilización de fósforo procedente de rocas

fosfáticas (Donati y Curutchet, 1995) y lixiviación de metales a partir de

sulfuros minerales (Suzuki, 2001; Gómez y col., 1999).

En cultivo mixto con otras bacterias acidófilas hierro-oxidantes (At.

ferrooxidans o Leptospirillum ferrooxidans) pueden contribuir en la disolución

de concentrados minerales a través de la oxidación del azufre depositado

sobre la superficie mineral que impide el ataque del Fe(III) regenerado por

las bacterias hierro-oxidantes (Sasaki y col., 1998, Giaveno y Donati, 2000,

Falco y col., 2003)

ANTECEDENTES

49

2.2 MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO.

En los últimos años se ha profundizado en el estudio de los

mecanismos involucrados en la biolixiviación de sulfuros minerales llevada a

cabo por las bacterias azufre-oxidantes

Actualmente existen aplicaciones de estos procesos implantados

comercialmente, como son la recuperación de cobre, uranio y oro

(Bosecker, 1997; Rohwerder y col., 2003; Suzuki, 2001). Por ello, es importante

conocer los mecanismos que rigen la relación bacteria-mineral.

La biolixiviación de minerales sulfuro con bacterias del género

Acidithiobacillus ocurre a través de dos mecanismos: directo e indirecto.

Existe gran diversidad de trabajos que discuten la existencia o no de éstos o

que tratan de describir las reacciones o compuestos involucrados en cada

uno de ellos (Suzuki, 2001; Sand y col., 2001; Crundwell, 2003)

2.2.1 MECANISMO DIRECTO Para que ocurra lixiviación bacteriana por mecanismo directo debe

existir un contacto directo entre la bacteria y la superficie del sulfuro mineral.

La oxidación a sulfato tiene lugar mediante una serie de etapas catalizadas

enzimaticamente, que se puede resumir en la siguiente reacción.

42 MeSOOMeS bacteria →+ [1]

Donde MeS representa un sulfuro mineral.

En el caso de la pirita, el mecanismo es distinto y se necesita la

intervención de bacterias hierro-oxidantes, la pirita es oxidada a sulfato

férrico de acuerdo con las reacciones:

424222 444144 SOHFeSOOHOFeS bacteria+ →++ [2]

ANTECEDENTES

50

OHSOFeSOHOFeSO bacteria23424224 2224 + →++ )( [3]

que se pueden resumir en la reacción:

42342222 222154 SOHSOFeOHOFeS bacteria+ →++ )( [4]

Existen trabajos de Torma (1971 y 1977) que describen la oxidación de

algunos minerales sulfuro no ferrosos por parte de At. ferrooxidans: covelita

(CuS), calcocita (Cu2S), esfalerita (ZnS), galena (PbS), antimonita (Sb2S3),

cobaltita (CoS) y millerita (NiS). Las cuales seguirian una reacción similar a la

descrita en la reacción [1].

Existen evidencias de que la bacteria tiene que estar en íntimo

contacto con la superficie mineral. El mecanismo de adhesión y el inicio de

la solubilización del metal no están aún completamente comprendidos. Si

resulta obvio que la bacteria no se adhiere en cualquier lugar de la

superficie mineral sino que lo hace en lugares específicos de imperfecciones

del cristal y que la solubilización del metal es debida a interacciones

electroquímicas.

2.2.2 MECANISMO INDIRECTO En este mecanismo la bacteria genera un agente lixiviante que oxida

químicamente al sulfuro mineral. En soluciones ácidas este lixiviante es el ión

férrico y la solubilización del metal se puede describir por la reacción:

oSFeSOMeSOSOFeMeS ++→+ 44342 2)( [5]

Para mantener suficiente hierro en solución la oxidación química del

sulfuro metálico debe ocurrir en ambientes ácidos, pH inferior a 5. La

cantidad de ferroso formada por la reacción [5] puede ser regenerada por

la acción de las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans o Leptospirillum

ferrooxidans) que oxidan el ferroso dando lugar a férrico, el cual puede

ANTECEDENTES

51

actuar de nuevo como lixiviante. En este mecanismo la bacteria no

necesita estar en contacto con la superficie mineral. Las bacterias sólo

tienen una función catalítica ya que aceleran la reoxidación de ferroso, que

sería mucho más lenta en ausencia de bacteria. Lacey y Lawson(1970)

muestran que en el rango de pH 2-3, la oxidación bacteriana de ferroso es

aproximadamente 105-106 veces más rápida que la oxidación química.

El azufre formado de forma simultánea en la reacción [5] puede ser

oxidado a ácido sulfúrico por acción de las bacterias azufre-oxidantes,

reacción [6], en este caso la reacción es mucho más rápida para At.

thiooxidans que para At. ferrooxidans.

42220 2232 SOHOHOS bacteria

→++ [6]

Un ejemplo bien conocido del proceso de biolixiviación indirecta es

la extracción de uranio de minerales; el uranio tetravalente, insoluble, es

oxidado a uranio hexavalente, soluble en agua.

4423422 2FeSOSOOUSOFeOU IVIV+→+ )( [7]

El lixiviante puede ser generado por At. ferrooxidans por oxidación de

la pirita [4] que está frecuentemente asociada a los minerales de uranio.

Además del mecanismo indirecto hay evidencias de que esta bacteria

puede oxidar UIV a UVI enzimáticamente y empleando parte de la energía

de esta reacción para la asimilación del CO2.

Aunque, de forma clásica, la biolixiviación está basada en la

interacción de procesos de oxidación químicos y biológicos, se le debe

atribuir una importancia particular al ciclo de ferroso a férrico. En la

naturaleza y en las aplicaciones técnicas ambos mecanismos, directo e

indirecto, ocurren simultáneamente.

ANTECEDENTES

52

2.2.3 DISCUSIÓN DE LOS MECANISMOS Como ya se ha referido, existe un debate acerca de la interacción

de las bacterias hierro-oxidantes y azufre-oxidantes y los minerales sulfuro.

Los defensores del mecanismo directo argumentan que la bacteria posee

un mecanismo biológico específico para degradar el mineral y obtener así

energía directamente del mineral. Por otra parte, los autores que se

decantan por el mecanismo indirecto sostienen que son los iones férricos en

solución los que disuelven el mineral y que la bacteria gana la energía

necesaria para su metabolismo de la regeneración de los iones férricos

(Crundwell, 2003). El mecanismo directo indudablemente ocurre pero

algunos creen que no es la ruta predominante. Existen argumentos en la

bibliografía que tratan de demostrar la existencia de este mecanismo,

basados en la estequiometría, la adhesión bacteriana o mediciones sobre

la superficie mineral (Hansford y Drossou, 1988) que no pueden resolver el

debate. Crundwell (2003) deduce que la cinética de cada uno de las vías

propuestas parece ser el factor crítico y plantea su demostración a partir de

un estudio cinético

Sin embargo, recientes publicaciones realizadas por Sand y

colaboradores (Sand y col., 1995: Schippers y col., 1996; Sand y col., 1996 y

2001; Rohwerder y col., 2003; Kinzler y col., 2003) dudan sobre la existencia

del mecanismo directo. Estos investigadores defienden que las bacterias

pueden realizar la disolución del sulfuro por mecanismos de contacto o no-

contacto. El mecanismo de no-contacto asume que la bacteria sólo oxida

los iones Fe(II) a Fe(III) el cual, posteriormente, ataca al sulfuro mineral y es

reducido de nuevo a Fe(II). El mecanismo de contacto requiere la adhesión

de la bacteria a la superficie del sulfuro y el mecanismo primario para la

adhesión a la pirita es de tipo electrostático. En el caso de At. ferrooxidans,

exopolímeros de la pared celular contienen iones Fe(III) formando complejos

ANTECEDENTES

53

con dos tipos de residuos de ácido urónico, la carga positiva resultante se

adhiere a la carga negativa de la pirita. Así, la primera función del férrico es

la adhesión, seguida de su función como lixiviante del sulfuro al igual que en

el mecanismo de no-contacto.

La principal característica del modelo que describen es que los iones

Fe(III) y/o los protones son los únicos agentes (químicos) que disuelven un

mineral sulfuro. El mecanismo es estrictamente indirecto y la bacteria tiene

la función de regenerar los iones Fe(III) y/o H+ y concentrarlos en la interfase

mineral/agua o mineral/bacteria para aumentar el ataque del lixiviante y

así la degradación. El factor determinante es la capa de exopolímeros ya

que en ella tienen lugar los procesos químicos que disuelven el mineral.

Basándose en esto, diferencian dos mecanismos de lixiviación: vía

tiosulfato y vía polisulfuros. En general, la disolución es alcanzada por

combinación de procesos de ataque de protones y oxidación. La vía de

lixiviación depende de la especie mineral, el criterio relevante es la

reactividad del sulfuro con los protones, es decir, su solubilidad en ácido.

Esta propiedad está directamente relacionada con la configuración

electrónica. Los sulfuros metálicos cuya banda de valencia es derivada sólo

de orbitales del átomo metálico del sulfuro no pueden ser atacados por

protones (sulfuros no solubles en ácido). Estos sulfuros se disuelven vía

tiosulfato, pertenecen a este grupo la pirita (FeS2), molibdenita (MoS2) y

tungstenita (WS2). Aquellos sulfuros cuya banda de valencia está

conformada por orbitales del átomo metálico y del sulfuro pueden ser

atacados por protones (son más o menos solubles en ácido) y lixivian via

polisulfuro. En este grupo están la esfalerita (ZnS), galena (PbS), arsenopirita

(FeAsS), calcopirita (CuFeS2) y hauerita (MnS2).

La descripción de estos mecanismos se esquematiza en la figura 6 y

se puede describir como:

ANTECEDENTES

54

MS

Fe3+

Af, Lf

M2+ + S2O32-

Fe2+

Fe3+, O2

O2

(Af, At )

(Af, At)

SnO62- , S6

SO42- + H+

Fe3+, O2

MS

Fe3+

Af, Lf

M2+ + H2S+ (H2S2)

Fe2+

Fe3+, O2

O2

(Af, At )

Af, At

H2Sn2- ,

SO42- + H+

Fe3+, O2

S6

H+

A. Vía tiosulfato B. Vía polisulfuro

Figura 6: Esquema comparativo de los mecanismos de ataque indirecto propuestos por Sand. (A) Via tiosulfato y (B) Vía polisulfuro. (Rohwerder y col., 2003) Los reactivos recuadrados indican que son los productos mayoritarios del proceso. El nombre de las bacterias aparece entre paréntesis cuando la reacción no es sólo llevada a cabo por las bacterias sino también de forma abiótica.

Via tiosulfato: El ión férrico ataca al mineral sulfuro mediante la

extracción de un electrón reduciéndose a ferroso y obteniéndose del

mineral el catión metálico y compuestos de azufre intermedios solubles en

agua. Las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans (Af) y Leptospirillum

ferrooxidans (Lf)) catalizan el reciclado del ión férrico en condiciones

ácidas. El primer compuesto de azufre liberado es el tiosulfato que es

oxidado por las bacterias azufre-oxidantes vía tetrationato y otros

politionatos para dar finalmente sulfato. También puede darse la

acumulación de azufre sino existen bacterias azufre-oxidantes. Para la

extracción del electrón se concluye que solo las bacterias oxidantes de

ferroso pueden lixiviar sulfuros no solubles en ácido en condiciones ácidas.

ANTECEDENTES

55

Vía polisulfuros: En el caso de los sulfuros solubles en ácido la

disolución se realiza por la acción combinada de la extracción de

electrones por iones férricos y el ataque del protón, es decir, el enlace del

protón a la parte sulfuro del mineral mediante los electrones de la banda de

valencia. La unión metal-sulfuro en el mineral puede ser rota por el ataque

del protón, después de que dos protones se hayan unido se libera sulfuro de

hidrógeno. A su vez, el férrico puede oxidar el azufre del mineral liberando

catión sulfuro que dimeriza espontáneamente a disulfuro(H2S2) y se oxida,

posteriormente, vía polisulfuro y radicales polisulfuro a azufre elemental. La

acción oxidante del ión férrico no es prerrequisito para la vía polisulfuro, ya

que, en este caso, la unión metal-sulfuro puede ser rota por el ataque de

protones, así que los sulfuros metálicos solubles en ácido pueden ser

disueltos por la actividad de las bacterias azufre-oxidantes. En ausencia de

Fe(III), estas bacterias oxidan el sulfuro de hidrógeno liberado del ataque del

protón al mineral a azufre elemental y luego a ácido sulfúrico, regenerando

así los protones previamente consumidos por la disolución del mineral.

2.3 FUNCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN LA LIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO.

En las dos rutas descritas, las bacterias hierro-oxidantes tienen un

papel primordial en la regeneración de Fe(III), que es el principal agente

lixiviante en este tipo de ambientes ácidos. Los microorganismos oxidantes

de ferroso controlan el potencial redox de éstos ambientes, el cual se

determina principalmente por la relación Fe(III)/Fe(II) en solución.

Por su parte, las bacterias oxidantes de azufre contribuyen a la

transformación de los compuestos intermedios de azufre a ácido sulfúrico,

fuente de protones (Schippers y Sand, 1999; Schippers y col., 1999). En el

caso del azufre elemental esta transformación es llevada a cabo

ANTECEDENTES

56

exclusivamente por las bacterias ya que esta especie es inerte a la

oxidación abiótica en medios ácidos. Esto hace que en ausencia o estado

de inhibición de estas bacterias el azufre elemental se acumule en el curso

del proceso de disolución del mineral sulfuro. El azufre elemental puede

estar suspendido, en forma de agregados o cristales libres, o formando una

capa sobre la superficie del mineral (Fowler y col., 1999; Mustin y col., 1993).

En este último caso, las propiedades electroquímicas de la superficie mineral

podrían cambiar y/o formarse una barrera que reduciría la velocidad de

difusión de los iones lixiviantes y el oxígeno para interaccionar con el

mineral, lo cual influye negativamente en la velocidad de lixiviación.

Las bacterias azufre-oxidantes tienen entonces una doble función en

la lixiviación de minerales sulfuro:

• la producción de ácido sulfúrico a partir de compuestos de

azufre reducido para la regeneración de los protones

consumidos en la etapa inicial de la lixiviación (vía polisulfuros).

• la eliminación del azufre acumulado sobre la superficie

mineral.

2.4 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL

La mayoría de las bacterias lixiviantes crecen adheridas a la

superficie de los minerales sulfuro. Se conoce que el proceso de adhesión es

predominantemente mediado por la presencia de sustancias poliméricas

extracelulares, conocidas como EPS (del inglés “extracellular polymeric

substances”) (Sand y col., 2001, Gehrke y col., 1995). Hay suficientes

evidencias que demuestran la función de una capa orgánica en la

interacción bacteria-sustrato. Estas películas han sido observadas en células

de At. ferrooxidans crecidas en pirita y para comprender su función en los

procesos de biolixiviación se ha estudiado su composición en este sistema

ANTECEDENTES

57

(Gehrke y col., 1995). Para llevar a cabo la lixiviación de la pirita, las células

de At. ferrooxidans atacan la superficie mineral por medio de sustancias

exopoliméricas excretadas (lipopolisacáridos) y oxidan el mineral a ácido

sulfúrico e iones férrico. El ataque primario a la pirita (pH 2) es mediado por

un complejo exopolímero-Fe(III). Se cree que la especie de hierro se une a

subunidades de ácido glucurónico, este complejo tiene una carga neta

positiva que interacciona electrostáticamente con la carga negativa de la

superficie del sustrato, pirita. La figura 7 representa un modelo de

mecanismo de lixiviación de la pirita por adhesión de células de At.

ferrooxidans.

Fe3+ Fe2+

S2O32-

bacteria

EPS

Medio de lixiviación

(O2, Fe3+, Fe2+, SO42-)

glóbulos de azufre

membrana citoplasmática

espacio periplasmático

membrana externa

pirita

Figura 7: Representación de lixiviación por mecanismo de contacto catalizada por una célula de At. ferrooxidans. La célula queda embebida en la capa de EPS adhiriéndose a la pirita por interacción electrostática. Durante la oxidación de tiosulfato y tetrationatos puede formar agregados de azufre elemental y politionatos en el espacio periplasmático (glóbulos de azufre) (Rohwerder y col., 2003)

ANTECEDENTES

58

La capa de exopolímeros formando complejos con Fe(III) constituye

un lugar de reacción en el cual el proceso de disolución tiene lugar (Fowler

y col., 1999; Tributsch, 1999). Este puede ser interpretado como un

compartimento donde algunas condiciones especiales, aunque todavía no

bien conocidas, prevalecen (pH, potencial redox, concentración de iones,

etc.) (Sand y col., 1999). Existen estudios dirigidos a determinar la correlación

entre la cantidad de iones férrico que se encuentran dentro de la capa

formada por los EPS y la actividad oxidativa de At. ferrooxidans (Kinzler y

col., 2003). Otros estudios tratan de demostrar la importancia de este tipo de

compuestos realizando estudios con bacterias At. ferrooxidans a las cuales

se les ha desprendido la capa de sustancias exopoliméricas. Se observa una

disminución de la capacidad oxidativa pero en pocas horas la capa de EPS

es producida de nuevo. La adición de compuestos exocelulares a las

células previamente desprendidas de ellos también regenera la capacidad

oxidativa en poco tiempo, alcanzando niveles de lixiviación similares a los

obtenidos con las células sin tratar (sin modificar sus EPS) (Sand y col., 2001).

Las células que crecen sobre azufre, sin hierro, exhiben una

composición diferente de sus exopolímeros, constituyen una superficie

fuertemente hidrofóbica y no atacan la pirita. En el estudio de sus EPS no se

ha detectado la presencia de acido glucurónico ni férrico pero si un

aumento del fosfato. Por tanto, es evidente que el sustrato influye en la

estructura química de los exopolímeros, aunque no todos los mecanismos

de regulación están aún clarificados.

Considerando las propiedades de superficie de la bacteria, la

adhesión al azufre se piensa que está regida por fuerzas de atracción de

carácter hidrófobo (Van de Waals), mientras que la adhesión a la pirita es

debida a fuerzas electrostáticas.

ANTECEDENTES

59

En ausencia de iones Fe(III) At. ferrooxidans actúa del mismo modo

que At. thiooxidans, por oxidación del azufre. El conocido como mecanismo

directo de lixiviación de sulfuros metálicos puede no ser más que la

oxidación biológica del azufre elemental formado químicamente para dar

sulfato.

2.5 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIÓN

La efectividad de la biolixiviación depende en gran medida de la

eficiencia de los microorganismos y de la composición química y

mineralógica del mineral a ser lixiviado. La extracción máxima de metal

puede ser alcanzada sólo cuando las condiciones de lixiviación

corresponden a las condiciones óptimas de crecimiento de la bacteria.

Entre los factores que intervienen en este proceso destacan:

Nutrientes: Los microorganismos que se emplean para la extracción

de metales de minerales sulfuro son bacterias quimiolitotrófas, con lo cual,

sólo requieren compuestos inorgánicos para su crecimiento. En general, los

nutrientes minerales son obtenidos del medio ambiente y a partir del mineral

lixiviado. Para un crecimiento óptimo es necesaria la presencia de la

cantidad adecuada de hierro, azufre y sales de amonio, fosfato y

magnesio.

O2 y CO2: Para el adecuado crecimiento y actividad oxidativa se

requiere suplemento de oxígeno. En el laboratorio puede ser obtenido por

aireación o agitación. A mayor escala, como en las acumulaciones al aire

libre de mineral (dump o heap leaching) el suministro del oxígeno requerido

puede tener ciertas dificultades. El dióxido de carbono es la única fuente de

carbono requerida pero normalmente no es necesaria una adición externa

de CO2.

ANTECEDENTES

60

pH: es importante el correcto ajuste del pH al valor óptimo para el

crecimiento de la bacteria y su capacidad de solubilización. El pH óptimo,

así como el rango de pH, en el que la bacteria trabaja con efectividad

varía de una cepa a otra, por tanto, es importante conocerlos por medio de

la literatura o mediante trabajos experimentales.

Temperatura: El óptimo de temperatura para el crecimiento y la

lixiviación de las bacterias azufre-oxidantes se encuentra en torno a 30ºC,

aunque al igual que para el pH existe una gran variabilidad en función de la

cepa empleada y del pH al que se encuentre el medio.

Sustrato mineral: La composición mineralógica del sustrato a lixiviar es

de gran importancia. Un alto contenido en carbonato del mineral puede

aumentar el pH del líquido lixiviado inhibiendo o suprimiendo la actividad

bacteriana. Los bajos valores de pH necesarios para la lixiviación pueden ser

alcanzados por un aporte externo pero esto puede provocar la formación o

precipitación de algunos compuestos (yeso) y afectar al coste del proceso.

La velocidad de lixiviación depende también de la superficie total del

sustrato. Una disminución del tamaño de partícula se traduce en un

aumento del área superficial dando lugar a una mayor cantidad de metal

producido para una masa igual de mineral.

Metales pesados: La lixiviación de sulfuros metálicos da lugar al

incremento de la concentración de metales disueltos en el lixiviado. En

general, las bacterias lixiviantes, y entre ellas las azufre-oxidantes, tienen la

capacidad de tolerar concentraciones relativamente elevadas de metales

pesados (De y col., 1997). Diferentes cepas de una misma especie

presentan sensibilidades muy diferentes a un mismo metal. Por ello, es

importante conocer la tolerancia de las bacterias que se van a emplear en

un proceso de lixiviación a los metales concretos que se encuentran en el

mineral. Con bastante frecuencia, estos microorganismos también

ANTECEDENTES

61

presentan la capacidad de adaptarse a niveles mayores de un metal por

continuos subcultivos a concentraciones incrementadas gradualmente del

metal a estudiar (Novo y col., 2000; Boyer y col., 1998; Baillet y col., 1997 y

1998).

Agentes surfactantes y “extractantes” orgánicos: estos compuestos

empleados como disolventes en la extracción generalmente tiene efectos

inhibitorios sobre la lixiviación bacteriana, principalmente porque disminuye

la tensión superficial y la transferencia de oxígeno.

2.6 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES

La extensa aplicación de las bacterias azufre-oxidantes a la

biolixiviación se debe a su capacidad de oxidación mediante los

mecanismos ya descritos y a su elevada tolerancia a los metales pesados en

solución. Esto hecho provoca que una vez lixiviado el mineral, si el metal que

pasa a la solución está a una concentración no tóxica para la bacteria, no

afectaría de forma significativa al metabolismo celular, de lo contrario

produciría su inhibición o muerte. Para la aplicación de estas bacterias a

procesos concretos de lixiviación es necesario conocer los límites de

tolerancia de la bacteria frente a los metales presentes en el mineral y a las

condiciones en que se va a trabajar posteriormente, esto permite diseñar un

proceso que trabaje con concentraciones de metal adecuadas para el

crecimiento y capacidad oxidativa de la bacteria.

Existen muchos estudios dedicados a conocer la tolerancia de estas

bacterias a distintos metales pesados. En su mayoría se refieren a

Acidithiobacillus ferrooxidans debido a su tradicional uso en la biolixiviación

y los numerosos trabajos desarrollados para estudiar el efecto de diversos

ANTECEDENTES

62

parámetros sobre la capacidad de oxidación del ión ferroso de esta

bacteria.

En las tablas 12 y 13 se recogen datos de tolerancia de distintas

cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans a varios metales pesados. Se

pueden observar que no existen niveles absolutos de tolerancia para los

iones metálicos, ya que dependen de la cepa utilizada y su estado

fisiológico, su historial previo de exposición al tóxico en cuestión y las

condiciones ambientales durante la exposición, así como el método

utilizado para la determinación de la toxicidad o la tolerancia. Además, los

niveles de tolerancia pueden incrementarse por reinoculación del

microorganismo a concentraciones más altas del ión tóxico de manera

progresiva. Así, la resistencia ligada a la adaptación de una especie a un

metal en concreto puede incrementar o disminuir la tolerancia del

organismo a otros metales (Tuovinen y col., 1971). Los mecanismos de

toxicidad de los metales y la resistencia bacteriana son complejos y no

están completamente comprendidos, no obstante, se han propuesto

algunos mecanismos para ciertos metales (Hutchins y col., 1986).

En los estudios acerca de la resistencia de Acidithiobacillus

ferrooxidans a determinados metales pesados se encuentra una gran

disparidad de datos debidos, principalmente, a que las cepas que se

estudian en cada caso son distintas y a que las condiciones experimentales

de los estudios no son siempre las mismas. Los primeros trabajos acerca de la

tolerancia de At. ferrooxidans a los metales pesados fueron realizados por

Tuovinen y col.(1971) e Imai y col.(1979).

En los últimos años, un gran número de trabajos se han enfocado al

estudio de la tolerancia natural de esta especie y al aumento de su

capacidad para tolerar un metal por continuos subcultivos en cantidades

iguales o crecientes del metal.

ANTECEDENTES

63

Ion metálico Limite tolerancia

(g/l) Referencia

4,5 Tuovinen y col. (1971)

0,63 Imai y col. (1975)

5 Brahmaprakash y col. (1988)

10 Hubber y nStetter (1990)

63,5 Rossi (1990)

10 Leduc (1997)

25 Das y col. (1997)

19 Boyer y col. (1998)

12,7 Novo y col. (2000)

Cobre

10 Cabrera y col. (2005)

1,12 Imai y col. (1975)

0,112 Rossi (1990)

56,2 Baillet y col. (1997)

10 De y col. (1997)

0,5 Cerruti y col. (1998)

67,2 Novo y col. (2000)

Cadmio


10 Trevors y col. (1985)

70 Kondratyeva y col. (1995)

6,5 Rossi (1990)

40 Das y col. (1997)

Zinc


0,006 Tuovinen y col. (1971)

0,06 Imai y col.(1975)

10 Hubber y Stetter (1990)

9,4 Leduc (1997)

19 Chisholm y col. (1998)

58,7 Dew y col. (1999)

35,2 Novo y col. (2000)

Níquel


0,02 Sisti y col. (1998)

3,9 Baillet y col. (1998) Cromo

0,4 Cabrera y col. (2005)

Tabla 12: Límites de tolerancia de At. ferrooxidans a distintos iones metálicos

ANTECEDENTES

64

Ion metálico Limite tolerancia

(g/l) Referencia

Zinc 39 Sakamoto y col. (1989)

Cadmio 45 Sakamoto y col. (1989)

As(III) 5 Collinet y Morin (1990)

As(IV) 40 Collinet y Morin (1990)

Fe(II)/Fe(III) 30/10 Sluszny (1995)

Al(III) 10 Sluszny (1995)

Cu(II) 6,5 Matlakosvka y Sklodowska (2001)

Tabla 13: Límites de tolerancia de At. thiooxidans a distintos iones metálicos

Baillet y col. (1997) estudiaron la tolerancia de una cepa de At.

ferrooxidans exponiéndolo a un amplio rango de concentraciones de ion

cadmio(II). Una vez encontrado el límite de tolerancia (56,25 g Cd(II)/l)

expusieron al cultivo a dicha concentración hasta observar que el tiempo

de oxidación de ferroso y la producción bacteriana toman valores similares

a los encontrados para el cultivo sin presencia de metal. A esto lo llaman

cultivo adaptado y, posteriormente, lo suplementan con cantidades

superiores de metal. Se observa que en presencia del ión cadmio se

produce una adaptación genética, tras varios subcultivos sin añadir metal,

la adición de cadmio al cultivo provoca una respuesta mejor a la obtenida

cuando se añade metal por primera vez, lo que indica que la exposición

previa al tóxico ha generando un cambio permanente en la bacteria. De lo

contrario, si el cultivo, tras varios subcultivos sin presencia del tóxico, hubiera

respondido de forma similar a cuando se añade por primera vez metal, la

exposición al tóxico produce un cambio no permanente o reversible, la

bacteria vuelve a su estado normal cuando el estímulo (metal) cesa,

adaptación fisiológica.

En otro trabajo, Baillet y col. (1998) estudiaron la tolerancia al cromo,

en este caso el límite de tolerancia fue encontrado para 3,9 g Cr(III)/l,

encontrándose que para posteriores subcultivos no mejora de forma

ANTECEDENTES

65

significativa el tiempo necesario para la oxidación del sustrato ni aumenta la

producción bacteriana.

Sisti y col. (1998) estudiaron la tolerancia de At. ferrooxidans y At.

thiooxidans al ion cromo (III), observando efecto inhibitorio a partir de los 20

mg Cr(III)/l pero tras varios subcultivos, se alcanza una tolerancia de 0,5 g

Cr(III)/l. Das y col. (1997) presentaron valores de tolerancia para distintas

cepas de esta bacteria al cobre y al zinc. Por distintos subcultivos

consiguieron obtener cultivos adaptados a estas concentraciones con un

tiempo de oxidación de ferroso similar al de un cultivo control (sin metal).

Existen otros estudios de adaptación al cobre, Boyer y col. (1998) que

encontraron el límite de tolerancia a este metal para At. ferrooxidans en 19

g Cu(II)/l, la adaptación del cultivo les permitió doblar este valor,

alcanzando los 38 g Cu(II)/l. Por otra parte, Novo y col. (2000) presentaron la

inhibición de una cepa At. ferrooxidans LR para 12,7 g Cu(II)/l. El cultivo una

vez crecido en presencia de este metal se puso en presencia de cobre,

cadmio, níquel o zinc a concentraciones conocidas como toleradas. Sólo se

observó una mejora en el crecimiento bacteriano en el cultivo con cobre, lo

cual sugiere la implicación de un mecanismo de especiación de la bacteria

en la resistencia a metales. Posiblemente, debido al estrés al que se somete

la célula por la exposición al metal, se produce un cambio en la ruta de

síntesis de proteínas que impide o disminuye la capacidad para resistir otras

especies metálicas.

En algunos de estos trabajos el estudio del límite de tolerancia se

realiza como paso previo a la utilización de esta bacteria como biosorbente

(Boyer y col., 1998, Baillet y col., 1997 y 1998).

ANTECEDENTES

66

2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES.

La aplicación de las bacterias azufre-oxidantes en la obtención de

metales a partir de minerales ha permitido conocer las condiciones

favorables y los mecanismos involucrados en la disolución de metales. El

desarrollo de investigaciones con minerales simples ha provocado, en

primer lugar, la aplicación y el estudio de esta capacidad bacteriana a

residuos contaminados habitualmente por metales (lodos, sedimentos,

suelos…) y, en segundo lugar, la aplicación a escala industrial de los

procesos con resultados más ventajosos. En este capítulo se realiza un

recorrido general por las tendencias observadas en los trabajos

desarrollados por distintos autores dirigidos al estudio de los procesos de

biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes en distintos sustratos.

2.7.1 BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES La capacidad de las bacterias azufre-oxidantes para la extracción

de metales a partir de minerales de baja ley ha sido muy estudiada. (Tipre,

2004; Gómez y col., 1999; Donati y col., 1996).

Existen trabajos dedicados al estudio de la lixiviación de la pirita con

Acidithiobacillus ferrooxidans. Estos procesos se basan en la oxidación del

Fe(II) a Fe(III) por parte de esta bacteria y el ataque del ion férrico al mineral

(Fowler y col., 1999).

La tendencia en los últimos años es la selección de una cepa o

consorcio de ellas más adecuadas para la solubilización del mineral,

determinar la cantidad de sustrato necesaria para llevar a cabo este

proceso, así como estudiar el mecanismo responsable del proceso de

lixiviación.

ANTECEDENTES

67

La biolixiviación de covelita (CuS) ha sido estudiada en numerosos

trabajos. Así, Donati y col. (1996) estudiaron la influencia del sustrato sobre la

biolixiviación de la covelita empleando cultivos puros y mixtos de At.

ferrooxidans y At. thiooxidans.

En presencia de Fe(II) At. ferrooxidans lo oxida generando Fe(III) que

ataca el mineral hasta que el proceso se ralentiza por la presencia de

jarositas, lo cual no permite una lixiviación elevada. La lixiviación en estas

condiciones con At. thiooxidans comienza por la oxidación química del

ferroso y el ataque del férrico a la covelita, que da lugar a cobre soluble y

azufre, que es oxidado por la bacteria. El ácido obtenido ataca al mineral y

proporciona un ambiente de bajo pH donde se evita la formación jarositas.

En presencia de azufre elemental la biolixiviación se debe al ataque ácido,

siendo mayor para At. thiooxidans por su tendencia a crecer hasta un pH

más bajo, esta bacteria produjo el mayor porcentaje de biolixiviación.

En un trabajo posterior (Pogliani y Donati, 2000) se intentó comprobar

que la biolixiviación de covelita por la acción de At. ferrooxidans y At.

thiooxidans se podía extrapolar a un sistema más complejo que un sulfuro

puro (mineral de covelita, magnetita y pirita). El estudio se realizó con

adición de ferroso o de férrico o ninguno de ellos. Cuando no se adiciona

hierro la mayor lixiviación es obtenida por At. ferrooxidans, esencialmente

debido a un mecanismo directo, y At. thiooxidans una vez que el hierro

presente en el propio mineral es oxidado por el aire, la bacteria oxida el

azufre formado. Los cultivos inoculados con férrico y el cultivo At.

ferrooxidans con ferroso (oxidación casi instantánea a férrico) muestran una

disolución del cobre similar en el tiempo. La extracción de cobre no fue

máxima, dado que la presencia de férrico produce la precipitación de

jarositas, impidiendo en cierto grado la solubilización. La mayor solubilización

se obtuvo para At. thiooxidans suplementado con ferroso, lo cual corrobora

ANTECEDENTES

68

el mecanismo propuesto en el estudio de la biolixiviación de la covelita

pura.

En un trabajo más reciente (Falco y col., 2003) se consideró la

posibilidad de obtener una mayor lixiviación de la covelita mediante un

cultivo mixto de At. thiooxidans y la bacteria hierro-oxidante Leptospirillum

ferrooxidans. El estudio también se realizó con y sin adición de ferroso. En

esta ocasión también se comprobó la mayor lixiviación para At. thiooxidans

en presencia de ferroso.

Está comprobado que la biolixiviación de metales procedentes de

minerales está regida en gran parte por la adhesión previa de la bacteria al

mineral (Pogliani y Donati, 1999; Sand y col., 2001; Porro y col., 1997). Por ello

algunos trabajos han sido desarrollados para intentar relacionar ambas

propiedades. Porro y col. (1997) desarrollaron un trabajo para tratar de

establecer la relación existente entre las propiedades superficiales

(hidrofobicidad) de At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en diferentes

fuentes de energía, no sólo con la capacidad de adhesión sino también

con la eficacia de biolixiviación de diferentes sustratos (azufre (Sº),

molibdenita (MoS2) y covelita (CuS)). Las bacterias crecidas en azufre,

sustrato hidrófobo, se adhieren en gran medida a sustratos de carácter

hidrófobo como la molibdenita y el azufre. At. ferrooxidans crecido en

medios con ferroso presentó una elevada adhesión a la covelita, un sustrato

más hidrofílico, que cuando es crecido sobre azufre. Se demostró una clara

relación entre la adhesión sobre diferentes sustratos y la fuente de energía

empleada. Sin embargo, no se observó una relación tan directa entre las

células adheridas y la eficacia de biolixiviación, el ataque de At. thiooxidans

a la covelita fue elevado a pesar de que no se dio una elevada adhesión

celular.

ANTECEDENTES

69

El estudio de biolixiviación de minerales no sólo se ha realizado sobre

los sulfuros minerales más comunes. Existen, entre otros, trabajos acerca de

la biolixiviación de molibdeno a partir de un mineral de cobre (Nasernejad y

col., 1999) o de la lixiviación de níquel de un sulfuro de níquel poco común,

Ni3S2 (Giaveno y Donati, 2001).

Los resultados positivos obtenidos en los estudios básicos de

biolixiviación de ciertos minerales hace pensar en la aplicabilidad real de

éstos y se han desarrollado estudios con el objetivo de conocer las

condiciones óptimas para la biolixiviación de minerales complejos.

En su trabajo, Gómez y col. (1999) estudiaron las condiciones óptimas

para la biolixiviación de un mineral complejo mediante un cultivo mixto de

At. ferrooxidans, At. thiooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Se estudio la

influencia del medio nutriente, la agitación, la densidad de pulpa del

mineral, la adición o no de dióxido de carbono y la temperatura. Los

mejores resultados se obtienen con medio 9K sin hierro, densidad de pulpa

del 5% y agitación mecánica. La mayor lixiviación para cobre ocurrió a 30ªC

y fue por ataque directo, para el zinc aumenta con la temperatura y la

disolución fue mayoritariamente química.

Tipre y col. (2004) estudiaron la biolixiviación de otro concentrado

mineral de cobre, plomo y zinc con un consorcio bacteriano formado por

At. ferrooxidans, At. thiooxidans, Leptospirillum ferrooxidans y organismos

heterótrofos. El experimento en discontinuo mostró para 20% p/v de mineral

la mayor solubilización (73% de Cu y 84% de Zn). La extracción mediante un

sistema en semi-continuo y densidad de pulpa del 25% p/v solubilizó 79% de

Cu y 82% de Zn y la operación en continuo en un reactor de tanque

agitado obtuvo extracciones del 85,3% y 80% de Cu y Zn, respectivamente.

La biolixiviación en continuo con la adición controlada del mineral se prevé

ANTECEDENTES

70

como una tecnología viable económicamente para la extracción de

metales de un concentrado mineral.

La capacidad oxidativa de las bacterias azufre-oxidantes también se

aplica en procesos de biooxidación, como en los minerales refractarios de

oro, donde la tarea de estas bacterias es lixiviar los metales constituyentes

del concentrado de minerales que acompaña al metal valioso para

favorecer su extracción, este proceso está aplicado tecnológicamente en

algunos lugares (Nestor y col., 2001).

2.7.2 BIOLIXIVIACIÓN DE LODOS En las plantas de tratamiento biológico de aguas se procesan

elevados volúmenes de aguas residuales urbanas y de aguas residuales

industriales, lo cual genera una cantidad desmesurada de lodos, que la

mayoría de las veces son depositados en el medio ambiente sin tratamiento

previo (incineración, landfilling, descargas en el mar, aplicación a suelos

agrícolas… (Xiang y col., 2000)). Se ha demostrado que la aplicación

agrícola de los lodos es un medio factible y efectivo por la aportación de

constituyentes beneficiosos para el crecimiento de las plantas y, a su vez, la

mejora de las propiedades físicas del suelo (Chang y col., 1984). Aunque los

lodos de aguas residuales poseen buenas características fertilizantes, la

presencia de metales pesados restringe su uso. La reducción de metales

pesados por medio del control de la fuente que los genera es un proceso

caro y complicado ya que, con frecuencia, es difícil identificar las fuentes

de origen de los metales presentes en el lodo por la diversidad de

contribuciones que puede tener una planta de aguas residuales. La

eliminación de metales antes de la aplicación a la tierra de los lodos puede

ser una mejor opción.

Existen varios métodos químicos, como la extracción con AEDT o el

tratamiento con ácidos, que han sido aplicados con este objetivo. La

ANTECEDENTES

71

extracción con AEDT muestra una elevada eficacia de eliminación para el

Cu, Pb y Cd pero, sin embargo, baja para Fe, Ni y Cr (Jenkins y col., 1981).

En los tratamientos ácidos se emplean ácidos orgánicos y minerales para

solubilizar metales a bajos pH, se obtienen elevadas eficacias pero las

dificultades de operación y el elevado consumo de agentes químicos hace

poco atractivos estos métodos (Hayes y col., 1980).

Se ha desarrollado y demostrado que los procesos de biolixiviación

aplicados a este tipo de residuos constituyen una tecnología prometedora.

En las últimas décadas, muchos trabajos han sido dirigidos a investigar la

eficacia de la eliminación de metales pesados procedentes de lodos

residuales por medio de métodos de biolixiviación, empleando bacterias

acidófilas hierro-oxidantes y/o azufre-oxidantes como At. ferrooxidans y At.

thiooxidans (Tyagi y col., 1988 y 1991; Jenkins, 1988; Chartier y Couillard,

1997). Estos procesos pueden disminuir en un 80% los costes si lo

comparamos con un método químico tradicional. Los distintos estudios

realizados hasta el momento han sido, en su mayoría, enfocados a

determinar la influencia de los diversos parámetros que intervienen en la

biolixiviación.

Algunos estudios previos (Tyagi y col., 1988; Blais y col., 1993) indican

la necesidad de la preacidificación del lodo a pH menores de 4,5, lo cual

limita su aplicación industrial por el consumo de ácido que esto implica.

Además, esto puede provocar otros efectos como la acidificación del suelo

enmendado con lodo. Por otra parte, la biolixiviación genera un ambiente

fuertemente oxidante y una disminución del pH que, además de solubilizar

los metales, digiere gran parte la materia orgánica presente en el lodo, lo

cual puede provocar la pérdida de algunos nutrientes que le restan valor

nutritivo al lodo resultante.

ANTECEDENTES

72

Entre los estudios acerca de la biolixiviación de lodos existen muchos

enfocados a determinar la influencia de algunos parámetros sobre este tipo

de procesos.

Así, Wong y col. (2001) estudiaron el efecto del pH inicial en la

biolixiviación de lodos anaerobios mediante un cultivo indígena de At.

ferrooxidans. Se observó una disminución del pH de 3-7 a 2,1-2,4 en tan sólo

6 días. En cuanto a la biolixiviación, después de 16 días de incubación se

obtuvieron porcentajes de eliminación bastante elevados: 50,2-78,4 % de Cr,

63,7-74,1% de Cu, 74,9-88,2% de Zn y 15,5-38,6% de Ni.

Xiang y col. (2000) estudiaron la influencia del sulfato ferroso presente

en el medio sobre la biolixiviación de lodos anaerobios realizada por un

cultivo indígena de bacterias azufre-oxidantes. La biolixiviación de los

distintos metales fue dispar. La solubilización de cromo se mostró

dependiente del crecimiento del cultivo, sin embargo, la solubilización del

zinc ocurrió en función del pH del medio. Cobre, níquel y plomo tras llegar a

un máximo de lixiviación presentaron fluctuaciones por efectos de

readsorción o formación de complejos. Se consiguió solubilizar: 70,6 % de

Cr(III), 87% de Zn(II), 91,5% de Cu(II), 54% de Ni(II) y 16% de Pb. Los niveles de

los metales que quedaron en el lodo estaban dentro de los límites permitidos

por la legislación.

La solubilización en el rango de temperaturas de 20-40ºC mostró

valores entre 37-41% de Cr, 53-56% de Cu, 63-68% de Ni, 50-59% de Pb y 77-

85% de Zn. Tras una mayor fase de latencia, los cultivos a 20ºC alcanzan

valores de solubilización similares en torno a los 10 días.

Otros trabajos tratan de estudiar como influye la presencia de sólidos

y de una fuente de energía en la biolixiviación de metales presentes en

lodos por parte de las bacterias azufre-oxidantes.

ANTECEDENTES

73

Lombardi y col. (2001) estudiaron la biolixiviación del zinc presente en

un lodo con cultivos At. ferrooxidans con y sin presencia de Fe(II), At.

thiooxidans con y sin presencia de Sº y un control. El porcentaje de

solubilización del Zn fue aproximadamente del 85-90% para At. thiooxidans

con azufre y el 80% para At. ferrooxidans con hierro, At. thiooxidans produce

una mayor solubilización pero At. ferrooxidans lo realiza en un menor tiempo,

ya que At. thiooxidans requiere una primera etapa de oxidación de azufre

para producir ácido sulfúrico para la lixiviación del metal, mientras At.

ferrooxidans puede solubilizar el metal por ataque del férrico generado por

la oxidación del ferroso presente en el medio.

Por otra parte, es importante verificar, tras el proceso de biolixiviación,

como afecta la especiación química a los metales que quedan en el lodo.

Con este objetivo en varios trabajos (Villar y col., 2001; Lombardi y Garcia Jr,

2001) se realizan procedimientos de extracción secuencial para determinar

el reparto de los metales en cada una de las fracciones del lodo y

determinar la biodisponibilidad del metal residual que permanece tras la

biolixiviación ya que, en ocasiones, los metales pueden mostrar una mayor

movilidad y afectar en mayor medida al suelo y las plantas, una vez que el

lodo sea aplicado con fines agrícolas, con lo cual, el proceso de

biolixiviación podría producir un efecto global negativo.

El estudio realizado por Matlakowska y Sklodowska (2001) se dirigió a

evaluar la efectividad de biolixiviación de cobre y cadmio por un cultivo

puro de At. ferrooxidans o mixto con At. thiooxidans, con distintos sustratos

(azufre, covelita y calcocita) en distintos tipos de lodos (lodos primarios,

lodos anaerobios, lodos deshidratados y lodos deshidratados

preacidificados). Los lodos anaerobios y deshidratados parecen ser los más

indicados para ser lixiviados, tras 21 días se alcanzó una extracción del 40-

ANTECEDENTES

74

50% de Cd y Cu. La biolixiviación en todos los casos fue más efectiva en el

caso del cultivo mixto suplementado con azufre.

Habitualmente los lodos son sometidos a procesos de incineración,

esto hace que la idea de biolixiviación de metales también sea trasportada

a este tipo de residuos. Existen diversos trabajos enfocados al estudio de

procesos de biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes sobre las cenizas

resultantes de la incineración de residuos. Ting y col. (2001) realizaron un

estudio comparativo entre la lixiviación química y la biolixiviación por At.

ferrooxidans de algunos metales para diferentes densidades de pulpa de

estas cenizas. La lixiviación química para 1% p/v de cenizas con ácido

sulfúrico 1M (77,5% Al, 42,3% Zn, 15,9% Pb, 7,0% Cu y 26,9% Mn) fue más

eficiente en el tiempo y la solubilización del plomo pero la biolixiviación con

At. ferrooxidans (75,3% Al, 44,7% Zn, 4,4% Pb, 11,6% Cu y 84,5% Mn) mostró

mayor solubilización de cobre y manganeso, los resultados para aluminio y

zinc fueron similares.

Krebs y col. (2001) estudiaron también la biolixiviación de metales

presentes en cenizas con cultivos Acidithiobacillus en función de la cantidad

de ceniza presente y de la adición o no de lodos anaerobios (fuente de

nutrientes, energía y flora indígena). La incorporación de lodos produce un

aumento de la población bacteriana y un mayor descenso del pH, dando

lugar a un menor tiempo necesario para la solubilización. Para densidades

entre 0,5-4%, pH 1-1,5, se obtuvo la solubilización del 80% de Cd, Cu y Zn, el

60% de Al, 30% de Ni, 10% de Cr y 5% de Pb, lo que supone el 50% del total

de metales presente en la ceniza.

Otros trabajos se han dirigido a la aplicación de la biolixiviación a

residuos concretos, como pueden ser los lodos procedentes de la actividad

industrial. Solisio y col. (2002) aplicaron At. ferrooxidans a la remediación de

lodos procedentes de dos tipos de industrias, lodos de la producción de

ANTECEDENTES

75

aleaciones de hierro-manganeso (alto contenido en Zn) y lodos

procedentes de una planta de oxidación anódica de aluminio (alto

contenido en aluminio). En el lodo rico en zinc se presentó una solubilización

del 73% de zinc para un 10% de contenido en lodo, sin embargo, el lodo rico

en aluminio sólo presentó una solubilización importante (78-77%) para un

contenido en lodo menor del 3%.

Al igual que los lodos, los sedimentos también presentan elevado

contenido en metales pesados. En su trabajo Chartier y Couillard (1997)

presentaron el estudio de los parámetros que influyen en la biolixiviación de

sedimentos por At. ferrooxidans (pH inicial, % de inóculo, incorporación de

nutrientes). Se observó que la biolixiviación del cobre dependía de la

presencia de bacteria y la lixiviación el zinc y el plomo se debió a la

presencia de ácido en el medio. En general, se obtuvo una lixiviación

aceptable del contenido en cobre (60-80%) y zinc (80-90%) pero no para el

plomo (< 30%), el pH afecta la solubilidad de este metal, el nivel de plomo

queda en valores superiores a los permitidos por la legislación. Otro trabajo

realizado por estos autores (Mercier y col., 1996) se dirige a la mejora de las

condiciones para la solubilización del plomo en sedimentos acuáticos. Para

evitar una elevada concentración de sulfato se sustituyó el sulfato ferroso

por cloruro ferroso, como fuente de energía para At. ferrooxidans,

obteniendo la solubilización de 5 mg Pb/l. Cuando la acidificación previa

del lodo se realizó con ácido clorhídrico en lugar de ácido sulfúrico se

biolixiviaron 11 mg Pb/l. En contraposición el bajo contenido en sulfato no

permite el desarrollo adecuado de la bacteria y, por consiguiente, la

eficacia en la solubilización de otros metales es menor.

2.7.3 BIOLIXIVIACIÓN DE SUELOS La actividad industrial ha provocado una elevada deposición de

metales pesados y compuestos orgánicos en sus alrededores, siendo uno de

ANTECEDENTES

76

los mayores acumuladores de esta contaminación el suelo. La complejidad

de la aplicación de la biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes reside en

que éstas son sensibles a bajas concentraciones de una gran variedad de

compuestos orgánicos frecuentemente presentes en el suelo (Tuttle y

Dugan, 1976). Algunos investigadores han tratado de demostrar que

algunas cepas Acidithiobacillus son tolerantes a ciertas sustancias orgánicas

(Zagury y col., 1994) y este hecho ha dado la posibilidad de aumentar la

aplicación de este proceso a los suelos y sedimentos contaminados.

Gómez y Bosecker (1999) estudiaron la biolixiviación de metales

pesados de varios suelos con cultivos aislados del propio suelo. El medio

empleado para el crecimiento de los cultivos, el tipo y la cantidad de suelo

fueron los parámetros de estudio. La biolixiviación fue mayor del 50% de los

metales presentes. At. ferrooxidans logró la solubilización total de Cd, Co, Cu

y Ni y At. thiooxidans solubilizó mas del 80% de Cd, Co, Cu y Zn. No se

detectó plomo ni bario en el lixiviado, dada la insolubilidad de sus sulfatos

correspondientes.

Gourdon y Funtowicz (1995) aplicaron la capacidad de producir

ácido sulfúrico de las bacterias azufre-oxidantes para eliminar los metales

pesados presentes en suelos contaminados de un área industrial. El 80-90%

de los metales (Zn, Pb, Cu y As) esta fuertemente unido a la matriz del suelo,

en la fracción residual. El proceso de biolixiviación, que se llevó a cabo con

cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans con y sin suplemento de azufre.

Se eliminó 45-50% de zinc y 35-40% de cobre en 90 días, mientras que el

plomo y el arsénico no fueron apenas solubilizados. Los mejores resultados se

obtuvieron para At. thiooxidans con azufre en el medio.

White y col. (1998) también realizaron un proceso similar. El estudio de

biolixiviación se llevó a cabo con un suelo contaminado de forma artificial y

un suelo contaminado por la actividad industrial. En el suelo artificial (Cd,

ANTECEDENTES

77

Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn) se consiguió la solubilización de mayor cantidad

de metal que la añadida, es decir, se solubilizó parte del metal mineralizado

en el suelo anteriormente. El porcentaje de biolixiviación de estos metales

fue del 90-99%, excepto para el plomo (66%) cuya solubilización se

mantenía incompleta tras 180 días. En el suelo industrial, con alto contenido

en Cu y Ni, se obtuvo una solubilización algo menor y la lixiviación fue más

lenta debido a que todo el metal está formando parte de la matriz del

suelo, de forma más arraigada, y a un mayor tamaño de partícula de este

soporte.

2.7.4 BIOLIXIVIACIÓN DE OTROS RESIDUOS El estudio las bacterias azufre-oxidantes y su aplicación en residuos

comunes (minerales, suelos, sedimentos, lodos, etc), ha dado lugar a que

algunos investigadores traten de aplicar esta capacidad a residuos más

concretos o de otro tipo. A continuación se citan algunos ejemplos.

Idachaba y col. (2004) evalúan la lixiviación del cromo presente en

un residuo procedente de un proceso de estabilización/solidificación

mediante la acción de At. thiooxidans formando una película. El tiempo de

formación de ésta influye de forma positiva en la extracción. A modo

general, se observó que el 50% del cromo se lixivia en las primeras 24 horas.

Uno de los residuos más tóxicos y numerosos que contienen metales

pesados son las pilas. Cerruti y col. (1998) tratan de aplicar la producción de

ácido sulfúrico de las bacterias azufre-oxidantes para disminuir el contenido

en metales de las baterías de níquel/cadmio. El trabajo se realizó en

biorreactores con At. ferrooxidans. Tras 93 días, se solubilizó el 100% del

cadmio, 96,5 % de níquel y 95% de hierro.

ANTECEDENTES

78

2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES Durante los últimos 25 años la biolixiviación ha abierto nuevas

oportunidades para la extracción metalúrgica y la biohidrometalurgia ha

sido implantada en la industria del cobre y el uranio, especialmente en el

tratamiento de minerales de baja ley (Bosecker, 1997).

Actualmente existen 11 plantas a gran escala que operan procesos

de biolixiviación en tanque agitado que emplean tres tecnologías diferentes

para procesar concentrados minerales refractarios de metales preciosos y

concentrados de pirita, cobalto y calcopirita (Brierley y Briggs, 2002).

La biolixiviación en pilas para recuperar cobre se ha convertido en

una práctica común en la industria. Desde 1980 hasta ahora 13 plantas han

trabajado realizando operaciones de biolixiviación (tabla 14), pero no todas

están en la actualidad en producción, debido al agotamiento de reservas

minerales o, en otros casos, por problemas operativos. Estas plantas

recuperan cobre a partir de la calcocita (Cu2S). El cobre es lixiviado de dos

formas: mediante ácido sulfúrico pasando a covelita (CuS) o por la acción

del férrico, formado a partir de la oxidación bacteriana de ferroso. El cobre

en la forma de calcopirita (CuFeS2) lixivia pobremente. Actualmente, se

están desarrollando nuevas tecnologías empleando microorganismos

termófilos para la biolixiviación de calcopirita, utilizando pilas o sistemas de

reactor de tanque agitado. La lixiviación en pilas de la calcocita es llevado

a cabo en aglomerados minerales de tamaño de partícula entre 1-4 cm,

que se acumulan en pilas de 6-10 metros de altura y cientos de metros de

ancho y de largo. La lixiviación es aplicada mediante regado por goteo. La

solución lixiviada que drena de las pilas es rica en sulfato de cobre y se

envía a un circuito de extracción para la recuperación del cobre. La

producción de cobre está en el rango de 10000-100000 t Cu/año según el

tamaño de las plantas de operación.

ANTECEDENTES

79

Planta y localización Tamaño (t mineral/día) Años en operación

Lo Aguirre, Chile 16000 1980-1996

Gunpowder’s Mammoth Mine, Australia In situ 1991-presente

Mt. Leyson, Australia 1370 1992-1997

Cerro Colorado, Chile 16000 1993-presente

Girilambone, Australia 2000 1993-clausurada

Ivan-Zar, Chile 1500 1994-presente

Quebrada Blanca, Chile 17300 1994-presente

Andacollo, Chile 10000 1996-presente

Dos Amigos, Chile 3000 1996-presente

Cerro Verde, Perú 32000 1996-presente

Zaldívar, Chile 20000 1998-presente

S&K Copper, Myanmar 18000 1998-presente

Ecuatorial Tonopah, USA 24500 2000-2001

Tabla 14. Plantas industriales de lixiviación de cobre. Olson y col. (2003)

En el campo de la biooxidación, como pretratamiento para la

obtención de metales preciosos, la primera planta comercial de

biolixiviación en tanque agitado fue abierta en 1986 para el tratamiento de

un concentrado de oro sulfídico. En la Tabla 15 se muestra un listado de las

plantas de pretratamiento de concentrados de oro refractario.

Normalmente, las plantas de este tipo operan con un 15-20% de densidad

de concentrado. Las plantas emplean mezclas de microorganismos

mesófilos y termófilos, de este modo, la oxidación de la pirita aumenta en

áreas internas de las pilas donde la temperatura puede ser de hasta 81ºC.

Brierley y Briggs (2002) han publicado una descripción de los equipos y

procesos empleados en la biooxidación comercial.

La aplicación comercial de la biolixiviación para la obtención del

uranio a partir de minerales de baja ley se practica desde los años 60. Las

más conocidas son las lixiviaciones in situ en las minas subterráneas de

Canadá. En ese tiempo la producción anual era entre 50-60 t de U3O8 (Olson

y col., 2003).

ANTECEDENTES

80

Planta y localización Tamaño

(t concentrado/día) Tecnología Años de operación

Fairview, South Africa

Inicialmente 10

Expandido a 35

Expandido a 40

BIOX 1986-presente

Sao Bento, Brazil Inicialmente 150

Expandido

BIOX

Eldorado 1990-presente

Harbour Lights, Australia 40 BIOX 1992-1994

Wiluna, Australia Inicialmente 115

Expandido a 158 BIOX 1993-presente

Sansu, Ghana Inicialmente 720

Expandida a 960 BIOX 1994-presente

Youanmi, Australia 120 Bac Tech 1994-1998

Tamboraque, Perú 60 BIOX 1990-presente

Beaconsfield, Australia 70 Bac Tech 2000-presente

Laizhou, China 100 Bac Tech 2001-presente

Tabla 15. Plantas comerciales de biolixiviación en tanque agitado para el pretratamiento de concentrados de oro. Olson y col. (2003)

La biolixiviación está siendo utilizada comercialmente sólo para la

recuperación de cobre, uranio y oro, sin embargo, en el futuro estos

procesos se podrían convertir en importantes para la recuperación de zinc,

níquel, cobalto y molibdeno. La infraestructura y los costes de operación son

mucho más bajos que los métodos convencionales pirometalúrgicos e

hidrometalúrgicos. Las plantas de proceso pueden ser construidas en las

proximidades de los depósitos minerales, salvando así los costes de

transporte. Los procesos no son complejos y son fáciles de controlar.

ANTECEDENTES

81

2.8 REDUCCIÓN DEL Cr(VI) POR LA ACCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES

Los compuestos de cromo tienen varias aplicaciones industriales

como la obtención de cromita, el galvanizado o el curtido de pieles entre

otras (Lawson, 1997). El cromo es acumulado en el medio ambiente por su

almacenamiento inapropiado o por la disposición de residuos de forma

inadecuada. El cromo hexavalente es clasificado como un contaminante

primario dada su movilidad en suelos y aguas subterráneas y sus efectos

dañinos sobre los seres vivos.

La reducción de Cr(VI) conduce a la formación de Cr(III), más estable

y menos tóxico, por tanto, este proceso se considera adecuado para ser

implementado como una tecnología limpia. La reducción o inmovilización

del Cr(VI) puede ser llevada a cabo de forma abiótica por distintas

sustancias (Palmer y Wittbrodt, 1991; Namasivayam y Raganathan, 1993,

James, 1996), pero estudios recientes han demostrado la idoneidad del uso

de la reducción biológica para el tratamiento de residuos que contienen

cromo (Quintana y col., 2001).

Generalmente, la biorreducción se realiza en presencia de fuentes de

carbono complejas y, de forma general, los microorganismos realizan la

reducción en condiciones anaerobias, empleando el Cr(VI) como aceptor

de electrones (Turick y col., 1996). La reducción del cromo hexavalente con

bacterias aerobias y que no requieren una fuente de carbono supone una

alternativa más atractiva.

Las bacterias azufre-oxidantes, At. ferrooxidans y At. thiooxidans

obtienen la energía de la oxidación de una variedad de compuestos de

azufre. La oxidación de dichos compuestos inorgánicos, en concreto del

azufre elemental, genera una serie de compuestos intermedios de azufre

ANTECEDENTES

82

(sulfitos, tiosulfatos y politionatos) con un alto poder reductor (Steudel y col.,

1987).

La capacidad de los cultivos Acidithiobacillus para reducir el Cr(VI)

en condiciones aerobias ha sido estudiada en algunos trabajos (Baillet y

col., 1998; Sisti y col., 1998; Quintana y col., 2001; Viera y col., 2003).

Aunque los mecanismos de oxidación de azufre no están

completamente elucidados, se sabe que At. thiooxidans requiere

glutationato reducido (GSH) como intermedio para la oxidación de azufre

elemental (Schlegel y Bowien, 1989) y, por tanto, se piensa que At.

ferrooxidans puede actuar de igual modo (Rossi, 1990):

HGSSGSHS nn →+ [8]

El polisulfuro formado es oxidado sucesivamente a diferentes

compuestos como sulfito (ecuación [9]), tiosulfato, otros politionatos y,

finalmente, sulfato (ecuación [10]).

+−

−++→++ HSOHGSSOHOHGSS nn 2

2

3122 [9]

−−

→+2

42

23

2

1SOOSO [10]

Si este mecanismo es correcto, la reacción [9] genera compuestos

reductores y es responsable de la aparición de protones en solución, hecho

que está de acuerdo con algunos trabajos realizados (Quintana y col., 2001;

Viera y col., 2003) donde la reducción del Cr(VI) viene acompañada de un

aumento de la concentración de protones en el medio.

Se ha demostrado recientemente que la capacidad de reducción

del Cr(VI) por las bacterias azufre-oxidantes se puede relacionar con los

compuestos reductores asociados a las partículas de azufre y las células

(Quintana y col., 2001). De esta forma, el estudio realizado por Steudel

ANTECEDENTES

83

(1989) indicó que el azufre coloidal de los cultivos de Acidithiobacillus se

presenta como una larga cadena de politionatos formando micelas o

glóbulos de unas pocas micras.

Con el objeto de estudiar la capacidad de estas bacterias para

reducir el Cr(VI) en distintas condiciones se han llevado a cabo diversos

trabajos. Así, Sisti y col.(1998) estudiaron la reducción del Cr(VI) con At.

ferrooxidans y At. thiooxidans en cultivo discontinuo y formando biopelículas

con las cepas previamente adaptadas al Cr(III). En cultivo discontinuo se

registró inhibición completa de At. ferrooxidans para concentraciones

mayores de 2 mM, y de At. thiooxidans para concentraciones superiores a 1

mM. La inmovilización de las células sobre azufre produjo una mayor

reducción del Cr(VI), llegando At. ferrooxidans hasta 7mM.

En un estudio posterior, Quintana y col. (2001) evaluaron la

capacidad de reducción del Cr(VI) por At. ferrooxidans a diferentes valores

de pH y en condiciones aerobias y anaerobias. El estudio se realizó

separando el azufre coloidal obtenido del cultivo bacteriano por filtración,

con el objeto de poner en contacto éste con la solución de cromo. Se

observó que la habilidad de reducción del azufre coloidal tiene lugar a un

amplio rango de pH, aunque la reducción aumenta al disminuir el pH.

Además se observó que la reducción fue mayor cuando la fase de

crecimiento del cultivo fue más avanzada y se demostró la habilidad de At.

ferrooxidans para emplear el Cr(VI) como aceptor de electrones.

Viera y col (2003) presentaron la reducción de Cr(VI) mediante At.

thiooxidans para diferentes valores de pH y la integración de este proceso

con la inmovilización de Cr(III) por la acción de dos cultivos del género

Desulfovibrio. Ambos procesos operaron secuencialmente en condiciones

de flujo continuo permitiendo la transformación de una solución de 5 mg/l

de Cr(VI).

ANTECEDENTES

84

3 BIOPRECIPITACIÓN CON BACTERIAS SULFATO-

REDUCTORAS

3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS

Las aguas residuales generadas como producto de actividades

mineras, el procesado de metales y las industrias petroquímicas se

caracterizan por tener un elevado nivel de metales, sulfato, otras sales y un

bajo pH. Si no son tratadas de forma apropiada estas aguas pueden causar

un serio impacto en el medio ambiente. Además de los metales y la acidez,

el sulfuro de hidrógeno producido a partir del sulfato en condiciones

anaerobias puede también causar efectos nocivos. Por ello, se hace

necesario el desarrollo de métodos de tratamiento con el objeto de eliminar

los metales, el sulfato y la acidez de estas aguas. Convencionalmente se

han empleado métodos químicos, como la neutralización con cal, para el

tratamiento de aguas de estas características. Sin embargo, estos métodos

se consideran costosos y producen una elevada cantidad de lodos

químicos que requieren de un posterior tratamiento. Los métodos biológicos

de tipo pasivo o llevados a cabo en reactores han venido siendo estudiados

y desarrollados para el tratamiento de estos medios, aunque las

aplicaciones a gran escala son aun limitadas (Tuppurainen y col., 2002).

Entre estos tratamientos se encuentra la bioprecipitación, una

técnica que aprovecha la capacidad de los microorganismos para reducir

los metales pesados presentes en un medio pasándolos a un estado de

oxidación menor dando lugar a compuestos más estables por su menor

solubilidad y, por tanto, también menor movilidad o biodisponibidad. Los

metales pueden ser eliminados biológicamente por diferentes mecanismos

de precipitación, ya sea como sulfuros, carbonatos e hidróxidos o por

ANTECEDENTES

85

sorción sobre la biomasa ocurriendo a veces ambos fenómenos de forma

simultánea.

El proceso biológico anaerobio de reducción de sulfato es

potencialmente superior a otros procesos de precipitación ya que puede

eliminar tanto los metales como el sulfato presentes, siendo uno de los

procesos más baratos para la eliminación de metales de aguas residuales

(Bowell, 2000). En el proceso de reducción de sulfato los metales son

precipitados con el sulfuro producido por microorganismos sulfato-

reductores formándose sulfuros metálicos insolubles (Drury, 1999; Groudev y

col., 1999).

Aunque muchos microorganismos generan metabolicamente sulfuro

de hidrógeno, siendo el sulfato un sustrato primario, este proceso sucede a

pequeña escala e implica la incorporación de azufre dentro de la célula y

su consiguiente degradación catabólica. Esta vía de producción de sulfuro

de hidrógeno se conoce como reducción de sulfato asimilatoria. En

contraste, la reducción no asimilatoria de sulfato es un proceso directo que

produce 10-100 veces más sulfuro de hidrógeno y es de gran interés

fisiológico debido a su similitud con la respiración de oxígeno y nitrógeno

(Postgate, 1984). La habilidad de las bacterias sulfato-reductoras para

realizar la reducción no asimilatoria de sulfato ha dado lugar al desarrollo de

gran número de investigaciones dirigidas a su estudio general y a su

aplicación a distintos niveles.

3.2 BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS

Las bacterias sulfato-reductoras (BSR) constituyen un único grupo

fisiológico de procariotas ya que tienen la capacidad de utilizar sulfato

como aceptor final de electrones en la respiración. En un principio se

tomaron como una curiosidad pero luego el interés creció por su relación

ANTECEDENTES

86

con otras formas de vida. En las últimas décadas el estudio de los procesos

metabólicos de las bacterias sulfato-reductoras ha recibido una atención

considerable y, a partir de los estudios, realizados se puede decir que éstas

son muy similares a otras bacterias y que la característica que más las

distingue es la forma en que metabolizan el sulfato (Barton, 1995). Las

bacterias sulfato-reductoras están ampliamente distribuidas en la Tierra, se

sabe que estos microorganismos juegan un papel significativo en la

naturaleza por medio de numerosas interacciones (Figura 8)

Bacterias sulfato-

reductoras

Tratamiento de aguas residuales y

pantanosAsociación con

animalesBiocorrosión

BioremediaciónProducción de combustibles

Transformaciones geoquímicas

Descomposición de alimentos

Ciclos de nutrientes medioambientales

Figura 8: Interacciones de las bacterias sulfato-reductoras. (Barton, 1995)

Durante un tiempo se pensó que sólo existían unas pocas especies

sulfato-reductoras y que exclusivamente empleaban lactato o piruvato

para su crecimiento. Sin embargo, en la actualidad se conoce que estas

bacterias tienen capacidad y diversidad para utilizar varios compuestos

como donador de electrones (Hansen, 1993). En un principio también se

pensó que la única reacción inorgánica asociada a estas bacterias era la

ANTECEDENTES

87

reducción de sulfato, pero actualmente se conoce que interaccionan con

gran variedad de compuestos en su medio ambiente. La figura 9 muestra

algunas de las reacciones de oxidación-reducción asociadas a varios

miembros de la familia de las sulfato-reductoras.

O2H2

e- + H+

S2-

SO42- S0

Compuestos orgánicos-S

N2

NO3-

NO2-

NH3

Compuestos orgánicos-S

CO2

CO

Compuestos orgánicos-C

HO· H2O2

H2O

Bacterias sulfato-reductoras

SeO32-

Se0 Selenio-metionina

U6+

U4+

Cr6+

Cr3+

Hg0

Hg(metil)2

Fe3+

Fe2+

Figura 9: Transformaciones químicas atribuidas a las bacterias sulfato-reductoras. (Barton, 1995)

Existen tres grupos celulares básicos de bacterias sulfato-reductoras:

eubacterias gram-negativas, eubacterias gram-positivas y arqueobacterias.

Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas y gram-negativas son las más

ampliamente distribuidas en la naturaleza. Este grupo incluye cinco géneros

que oxidan compuestos orgánicos de forma incompleta a acetato (Tabla

16) (Desulfovibrio, Desulfobotulus, Desulfobulbus, Desulfohalobium,

Desulfomicrobium) y siete géneros que oxidan compuestos orgánicos de

forma completa a dióxido de carbono (Desulfoarculus, Desulfobacer,

ANTECEDENTES

88

Desulfobacerium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema,

Desulfoarcina) (Barton, 1995).

Especie Cepa Habitat Sustrato Fijación N2

D. africanus NCIB 8401 Agua Lactato +

D. desulfuricans DSM 642 Suelo Lactato +

D. frutosovorans DSM 3604 Sedimentos de estuarios Fructosa NR

D. furfuralis DSM 2590 Residuos de papel Furfural NR

D. giganteus DSM 4123 Sedimentos Glicerol +

D. gigas NICB 9332 Agua de laguna Lactato +

D. longus DSM 6739 Productos del petróleo Lactato NR

D. pager ATCC 29098 Heces humanas Lactato NR

D. sulfodismutans DSM 3696 Barro de agua dulce Tiosulfato NR

D. vulgaris NCIB 8303 Suelo Lactato +

Dbu. marinus DSM 2058 Barros marinos Propionato +

Dbu. propionicus DSM 2032 Barro de agua dulce Propionato +

Dsm. apsheronum AUCCM 1105 Depósitos de petróleo Lactato NR

Dsm. Baculatum AUCCM 1378 Mineral de manganeso Lactato +

Dbo. Sapovorans DSM 2055 Barro de agua dulce Butarato NR

Dh. Retbaense DSM 5692 Sedimentos de lago hipersalino Lactato NR

Tabla 16: Algunas características de bacterias sulfato-reductoras mesófilas gram-negativas. NR: no recogida en bibliografía. (Barton, 1995)

3.2.1 CARACTERÍSTICAS Las bacterias sulfato-reductoras son bacterias heterótrofas que

requieren condiciones anaerobias estrictas con un poder de oxido-

reducción menor de -200mV. El principal sustrato orgánico empleado como

fuente de carbono y energía para los organismos que tienen mayor

velocidad de crecimiento, como Desulfovibrio sp., es un ácido orgánico de

bajo peso molecular como el ácido acético y láctico o alcoholes como el

etanol (Postgate, 1984; White y col., 1997). El metabolismo del carbono es

esencialmente similar en todos los casos, el sustrato orgánico es oxidado

completamente a CO2 o de forma incompleta a algún compuesto

ANTECEDENTES

89

intermedio. Se genera un ATP vía una cadena de transporte electrónico con

el sulfato como aceptor terminal de electrones que se reduce a sulfuro.

Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas tienen su máximo de

crecimiento a pH 6-8, aunque, algunos aislados pueden crecer en

condiciones moderadamente ácidas, pH 3-4. En esas condiciones las

bacterias son encontradas en sedimentos y su aparente tolerancia al ácido

se deriva de la existencia de un microambiente más neutral dentro del

hábitat, el cual es mantenido mediante la actividad de las propias

bacterias. Tanto la reducción de sulfato como la reducción de metales

utilizan protones contribuyendo a la alcalinidad en el ambiente de la

bacteria (Postgate, 1984).

3.2.2 GÉNERO Desulfovibrio Beyerinck (1895) presentó un aislado de Spirillum desulfuricans y

apuntó la importancia de la producción microbiana de sulfuro de

hidrógeno para su estudio y su aplicación. La descripción morfológica de

esta bacteria deja pocas dudas acerca de que se aisló y caracterizó la

primera especie Desulfovibrio. Muchos investigadores han ampliado el

conocimiento sobre las eubacterias sulfato-reductoras gram-negativas, la

clase a la cual pertenece el género Desulfovibrio (Voordouw, 1995).

Postgate (1984) realizó un amplio estudio en el que se incluye el

descubrimiento del citocromo c3. Otros investigadores (LeGall y Fauque,

1988; Peck Jr, 1994) han documentado una amplia variedad de enzimas y

proteínas que han sido encontradas en especies Desulfovibrio y han

sugerido su participación en el metabolismo de estas bacterias.

Widdel (1991 y 1992) amplió el conocimiento actual de las bacterias

sulfato-reductoras gram-negativas mediante el descubrimiento de otros

géneros en los que se incluyen entre otras: Desulfobulbus, Desulfobacter,

Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema,

ANTECEDENTES

90

Desulfobotulus y Desulfoarculus. Los avances en biología molecular han

permitido descubrir la composición, metabolismo y diversidad de las

bacterias Desulfovibrio en el medio ambiente.

3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS El metabolismo del carbono por las bacterias sulfato-reductoras

ocurre vía mecanismo respiratorio (Hansen, 1993; Postgate, 1984). Los

sustratos empleados incluyen alcoholes, ácidos orgánicos, e hidrocarburos,

aunque los alcanos no son metabolizados y los azucares no se utilizan. Sin

embargo, cada cepa sólo es capaz de metabolizar un rango limitado de

estos sustratos. La preferencia por los sustratos ha sido empleada para

clasificar las bacterias sulfato-reductoras en tres grupos que pueden diferir

también en la velocidad de crecimiento (White y Gadd, 1998).

El grupo hidrogeno-lactato lo constituyen principalmente especies

Desulfovibrio y Desulfomaculum. Utilizan los ácidos orgánicos, lactato,

piruvato, succinato, fumarato y malato y pueden emplear también etanol

siendo el producto final acetato y/o CO2. Ciertos miembros de este grupo

pueden utilizar hidrogeno como donador de electrones en presencia de

CO2, acetato y otras fuentes de carbono. Es el grupo con crecimiento más

rápido (t1/2= 3-4 h en lactato).

Un segundo grupo incluye la especie Desulfobacter, bacterias que

son capaces de oxidar completamente acetato a CO2, aunque algunas

pueden emplear lactato o etanol. El rango de sustratos es muy limitado y no

son capaces de emplear hidrogeno como donador de electrones. El

crecimiento es más lento (t1/2= 20 h).

El último grupo se caracteriza por emplear ácidos grasos de mayor

peso molecular que el acetato. Son algunas especies Desulfobulbus y

ANTECEDENTES

91

Desulfovibrio, algunas oxidan sólo un número limitado de estos sustratos a

acetato y otras oxidan un gran rango de estos ácidos grasos hasta CO2. Este

grupo incluye algunos organismos extremadamente versátiles que

degradan compuestos fenólicos como ácidos aromáticos (Postgate, 1984).

3.2.4 METABOLISMO DEL GÉNERO Desulfovibrio El sulfato es el aceptor de electrones preferente de las especies

Desulfovibrio (Voordouw, 1995). Éste es reducido a sulfuro mediante una

serie de reacciones en las que intervienen varias enzimas:

iPAMPHSHATPSO 282

4 ++→+++−

int [11]

Hidrógeno, formato, lactato o piruvato y muchos otros compuestos

orgánicos, incluidos hierro metálico y algunos compuestos del petróleo,

pueden servir como donadores de electrones para la reducción del sulfato.

El crecimiento quimiolitotrófo de Desulfovibrio con el hidrógeno como

donador de electrones requiere de acetato o CO2 como fuente de

carbono e implica un gradiente de protones del interior al exterior celular. El

primero en describir este proceso fue Badziong y col. (1979). La habilidad

para utilizar hidrógeno como donador de electrones para la producción de

energía es general en el género Desulfovibrio (White y Gadd, 1998).

Cuando lactato o piruvato son empleados como donadores de

electrones, se oxidan de forma incompleta a acetato y CO2, como se

muestra en la reacciones [12] y [13]

−+

++→ eHpiruvatoLactato 22 int [12]

Y el piruvato es oxidado a acetato y dióxido de carbono

−+

++++→++ eHATPCOacetatoPADPPiruvato i 222 int [13]

ANTECEDENTES

92

De este modo, considerando la reacción de conversión energética

[14]

ADPATPAMP 2→+ [14]

y las ecuaciones [11], [12] y [13] se llega a una reacción que

relaciona dos moles de lactato por mol de sulfato

HSCOacetatoSOlactato ++→+−

22

4 2 2 2 [15]

y combinando [11], [13] y [14] se obtiene para el piruvato:

−−

+++→+++ HSATPCOacetatoSOPADPpiruvato i 24 422 4 22

4 [16]

Una gran variedad de alcoholes y aldehídos de cadena corta

pueden servir como donadores de electrones, se ha purificado y

caracterizado la enzima alcohol-deshidrogenasa de la especie Desulfovibrio

gigas (Hensgens y col., 1993) y el gen de la aldehido-oxidasa ha sido

clonado y secuenciado. También se conoce la habilidad de algunas cepas

sulfato-reductoras en zonas industriales para utilizar el hierro elemental como

donador de electrones (Little y col., 1991), este hierro es producido

industrialmente mediante el calentamiento de óxidos de hierro en un

ambiente reductor y revierte a su forma oxidada mediante procesos de

corrosión.

Además de la diversidad de donadores de electrones, las especies

Desulfovibrio pueden utilizar otros aceptores de electrones distintos del

sulfato. Algunas cepas Desulfovibrio desulfuricans pueden reducir nitrato a

nitrito o amonio (Dalsgaard y Bak, 1994). A pesar de considerarse a las

bacterias sulfato-reductoras estrictamente anaerobias, existen especies

Desulfovibrio que pueden emplear oxígeno como aceptor de electrones

(Dilling y Cypionka, 1990). Otros organismos son capaces de reducir

arsenato a arsenito (Ahman y col., 1994) y el Fe(III) ha sido sugerido como un

ANTECEDENTES

93

importante aceptor de electrones para Desulfovibrio sp. en sedimentos

anaerobicos (Coleman y col., 1993).

Las bacterias sulfato-reductoras contribuyen a la reducción e

inmovilización de metales pesados. Las condiciones reductoras creadas por

las sulfato-reductoras generan la reducción de algunos iones metálicos. En

particular, pueden contribuir a la eliminación de Cr(VI), convirtiendo

oxianiones como CrO42- a especies catiónicas menos tóxicas como el Cr(III)

que son precipitadas o bioadsorbidas (Fude y col., 1994; Lovley y Philips,

1994), y a la transformación de U(VI) soluble reduciéndolo a U(IV) insoluble

(Lovley y col., 1993; Lovley, 1995), se piensa que el citocromo c3

periplasmático sirve como metal reductasa en todos los casos.

3.3 FUNCION DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LA BIOPRECIPITACIÓN DE METALES

La generación de sulfuros por parte de las bacterias sulfato-

reductoras tiene una serie de consecuencias de especial relevancia en la

eliminación de metales: creación de un ambiente reductor, eliminación de

la acidez y precipitación de metales en forma de sulfuros. Los sulfatos

metálicos se encuentran con frecuencia en aguas contaminadas, como las

aguas ácidas de mina, normalmente por la acción de bacterias azufre-

oxidantes en los ambientes relacionados con la actividad minera. La

presencia de metales en forma de sulfatos también es resultado de

procesos metalúrgicos como la fundición de minerales sulfuro (Barnes y col.,

1991; White y col., 1997).

Los productos de solubilidad de la mayoría de los sulfuros metálicos

son muy bajos, de modo que la producción de una cantidad moderada de

sulfuro puede eliminar los metales de forma efectiva, reduciéndolos a

ANTECEDENTES

94

concentraciones por debajo de los niveles permitidos en el medio ambiente

(Cathorne y Dobbs, 1990). Además, estos microorganismos son

necesariamente anaerobios y en estas condiciones los sulfuros son más

estables (White y Gadd, 1998). Adicionalmente, el aumento de pH puede

resultar en la precipitación de metales como el hierro y el aluminio su forma

hidróxidos (Weast, 1978).

3.3.1 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL Las bacterias sulfato-reductoras generan sustancias poliméricas

extracelulares (EPS) que les permiten desarrollarse fácilmente en forma de

película. Las EPS comprenden una mezcla de polisacáridos,

mucopolisacáridos y proteínas que varían en función de la especie y el

cultivo y pueden unirse a metales solubles o partículas finas. Algunos

estudios indican la adhesión de los sulfuros precipitados sobre la biopelícula

formado por las bacterias sulfato-reductoras (White y Gadd, 2000a y b)

Pero las EPS pueden afectar a las características de superficies

metálicas cuando forman complejos con iones metálicos. La interacción

bacteria-metal, en este caso, tiene un efecto negativo, por el cual las

bacterias sulfato-reductoras son objeto de estudio en numerosos trabajos

(Beech y Sunner, 2004; Fang y col, 2002). La formación de estas biopelículas

con frecuencia se da sobre superficies como canalizaciones industriales,

tuberías de aguas residuales o intercambiadores de calor, originando lo que

se conoce como biocorrosión. El sulfuro producido por estas bacterias

causa lo que se conoce como la despolarización catódica de hidrógeno y

daña el pasivado de aceros y otros tratamientos de superficies metálicas

acelerando la interacción anódica.

ANTECEDENTES

95

3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE SULFATO

Para llevar a cabo de forma efectiva la reducción de sulfato por

parte de las bacterias sulfato-reductoras, es necesario controlar una serie de

factores principales, aunque el valor de estos parámetros depende

ampliamente de las características del medio que se pretende remediar.

Estos factores son:

• Nutrientes: Las bacterias sulfato reductoras por tratarse de

organismos heterótrofos, requieren de una fuente de carbono.

Suelen ser ácidos orgánicos de cadena corta, alcoholes y

otros compuestos menos comunes. Algunas cepas

metabolizan diferentes fuentes, con lo cual es importante

conocer cual aporta un mayor crecimiento bacteriano o una

mayor actividad bacteriana (White y Gadd, 1996).

Habitualmente estas bacterias se encuentran en hábitats

donde cuentan con una fuente de carbono cercana (lodos,

sedimentos). Además requieren de la presencia de otros

nutrientes esenciales como nitrógeno, fósforo, sales de amonio

y magnesio. Cuando el hidrógeno es empleado como aceptor

de electrones se requiere de dióxido de carbono y otros

sustratos como fuente de carbono para la bacteria.

• Fuente de energía: habitualmente, la fuente de carbono

también actúa como donador de electrones.

• Aceptor de electrones: para llevar a cabo su actividad es

necesario que exista una proporción de sulfato suficiente en el

medio. Existen estudios que tratan de relacionar la cantidad

óptima de sulfato o la velocidad de reducción de sulfato

ANTECEDENTES

96

necesarias para un mayor crecimiento bacteriano (Moosa y

col., 2002). Mantener la cantidad de sulfato adecuada es

importante también para evitar la proliferación de bacterias

metanógenicas que habitualmente coexisten con las

bacterias sulfato-reductoras compitiendo por el acetato o el

hidrógeno.

• Condiciones anaerobias: Las bacterias sulfato-reductoras son

anaerobias estrictas, es indispensable crear un ambiente

anóxico que se obtiene por el desplazamiento del oxígeno

presente en el medio mediante una corriente de gas libre de

éste, normalmente nitrógeno, o por el aporte de compuestos

reductores (acido tioglicólico, ácido ascórbico) que

consumen el oxígeno que pueda quedar en un sistema

cerrado.

• pH: las bacterias sulfato-reductoras crecen mejor bajo

condiciones ligeramente alcalinas en un rango de 7,0-7,8 y

toleran valores entre 5,5 y 9,0. El valor óptimo de pH difiere

mucho según la cepa y del habitat en el que se encuentre

previamente la bacteria ya que habitualmente se pueden

encontrar en efluentes industriales o aguas ácidas de mina

(Barton, 1995).

• Potencial redox: es un factor clave para el inicio de la

reducción de sulfato y depende del sustrato orgánico

seleccionado, debe estar por debajo de -200 mV.

• Temperatura: Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas crecen

mejor entre 28-38 ºC y su temperatura límite está entorno a 45

ºC, aunque también existen algunas cepas termófilas. La

temperatura es un factor muy influyente, hay autores que

ANTECEDENTES

97

hablan de cambios estacionales en la reducción de sulfato en

estudios llevados a cabo en sedimentos (Jorgensen, 1977). El

rango de temperatura óptimo para las bacterias sulfato-

reductoras se encuentra en torno a los 30 ºC.

• Composición del medio: El medio a tratar puede contener

compuestos como carbonatos o fosfatos que pueden influir en

el pH del medio o favorecer el crecimiento de bacterias que

coexistan con este grupo de bacterias.

• Ion sulfuro: producto de la reducción de sulfato, es tóxico para

las bacterias sulfato-reductoras y otras bacterias anaerobias.

La distribución del sulfuro en ambientes acuosos en sus diversas

formas (S2-, HS-, H2S) es dependiente del pH. La forma disociada

o libre de hidrógeno (S2-) es la responsable de la toxicidad e

inhibición de la bacteria. Las bacterias metanogénicas son

afectadas a una concentración de sulfuro de 150 mg/l

aproximadamente (Kalyuzhnyi y col., 1998), mientras que las

sulfato-reductoras tienen relativamente una alta tolerancia al

sulfuro, en torno a 1000 mg/l de sulfuro (libre de hidrógeno)

inhiben a éstas bacterias pero solo un 50% (Isa y col., 1986). No

obstante, el sulfuro producido a partir de la reducción de

sulfato puede aislar a las SRB de los efectos tóxicos de metales

pesados mediante la precipitación de éstos, un efecto

llamado “protección sulfuro” (Utgikar y col., 2002).

• Metales pesados: Los metales pesados presentes en forma

soluble pueden afectar de forma negativa a la bacteria, con

lo cual es importante conocer los máximos niveles permitidos

por la bacteria antes de aplicarlas para la remediación de un

medio contaminado. Por otra parte, a medida que transcurre

ANTECEDENTES

98

el proceso la cantidad de metal disminuye en el medio por la

propia actividad bacteriana, retirándose a la vez, sulfuro.

3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS

Muchos metales son tóxicos a los microorganismos, incluidas las

bacterias sulfato-reductoras, ya que pueden desactivar enzimas

reaccionando con sus grupos funcionales, desnaturalizar proteínas y

competir con cationes esenciales (Mazidji y col., 1992). Las concentraciones

de metales pesados tóxicas para las bacterias sulfato-reductoras están en

un rango que va desde unas ppm hasta más de 100 ppm según la cepa y el

ion metálico. La Tabla 17 recoge las concentraciones tóxicas de diversos

metales por distintos autores. Por otra parte, en la literatura también se

recoge el efecto estimulatorio que producen los metales pesados en

cantidades traza sobre la producción de sulfuro de hidrógeno.

En los últimos años Utgikar y col. (2002 y 2003) han llevado a cabo

varios estudios acerca de la inhibición y toxicidad que producen los metales

pesados sobre las bacterias sulfato-reductoras. Su estudio se dirigió a

conocer la toxicidad de los metales pesados para la posible aplicación de

estas bacterias para la reducción de la contaminación de las aguas ácidas

de mina, disminuyendo la elevada concentración de sulfato y metales

pesados así como la acidez características de este tipo de ambientes,

mediante la precipitación de las especies metálicas en forma de sulfuros.

El objetivo de la investigación fue determinar el efecto tóxico y/o

inhibitorio de los metales disueltos sobre un cultivo mixto de bacterias

sulfato-reductoras. La exposición a un agente externo puede resultar en la

muerte celular (efecto tóxico) o en la disminución de la actividad

metabólica (efecto inhibitorio).

ANTECEDENTES

99

Metal Cepa SRB Concentración

tóxica (mg/l) Referencia

Cepas Desulfovibrio 20-50 Booth y Mercer (1963)

Cepas Desulfovibrio 3 Temple y Le Roux (1964)

Cepas Desulfovibrio 2-20 Saleh y col. (1964)

Cultivo mixto 4-20 Hao y col.(1994)

Cu

Cultivo mixto 12 Utgikar y col. (2003)


Cultivo mixto 20 Utgikar y col. (2003) Zn

Desulfovibrio

desulfuricans 13 Poulson y col.(1997)

Cultivo mixto 75-80 Hao y col.(1994) Pb

Cepa L60 125 Loka Bharath y col.(1990)

Cultivo mixto >4-20 Hao y col.(1994) Cd

Cepa L60 54 Loka Bharath y col.(1990)


Ni Desulfovibrio

desulfuricans 10 Poulson y col.(1997)

Cr Cultivo mixto 60 Hao y col.(1994)

Hg Cepa L60 74 Loka Bharath y col.(1990)

Mezcla (Cr, Ni,Cu,

Cd, Zn, Pb) Cultivo mixto 20 Hao y col.(1994)

Tabla 17: Toxicidad de varios metales pesados sobre bacterias sulfato-reductoras

El estudio se realizó en botes sellados suplementados con cobre (6-

18,5 mg Cu(II)/l) y zinc (6,5-20 mg Zn(II)/l) y en un reactor en discontinuo (1l)

suplementado con 25 mg Cu(II)/l. El estudio en menor escala mostró un

descenso de todas las concentraciones probadas para los dos metales pero

solo llega hasta cero para los niveles menores de metal, encontraron que

los cultivos suplementados con cantidades mayores no precipitaron

totalmente. Para la mayor concentración estudiada de cobre se insolubilizó

aproximadamente un 16% y para la mayor de zinc un 37%.

ANTECEDENTES

100

Es destacable que la precipitación ocurre mayoritariamente en las

primeras 50 horas y luego se produce una disminución de la velocidad de

producción de sulfuro metálico. Los autores sugieren que esta ralentización

se debe a la no disponibilidad de ion bisulfuro, ya que los metales están

presentes en solución y, por tanto, se deduce que la velocidad de la

reacción de reducción de sulfato también disminuye. La inhibición no

puede deberse a los metales disueltos ya que la concentración es menor a

la inicial, por ello la hipótesis es que el sulfuro metálico formado inhibe a la

bacteria a través de un obstáculo físico. El metal precipitado actúa como

barrera y dificulta el acceso del par donador-aceptor de electrones al lugar

activo de la bacteria o la enzima. Esta adhesión fue comprobada por

microscopía electrónica. Una ilustración de este proceso de inhibición se

representa en la figura 10. Debido a este efecto los bioreactores para el

tratamiento de efluentes, tipo agua ácida de mina, debe contar en su

diseño con un dispositivo que permita la sedimentación y separación del

sulfuro metálico precipitado.

En un trabajo posterior se desarrolló matemáticamente una expresión

de velocidad que incorpora los efectos adversos que influyen en la

biocinética de la reducción de sulfato. La reducción de sulfato por las

bacterias sulfato-reductoras puede ser representada por una expresión tipo

Monod:

SKkSX

dtdS

s +

=−

ANTECEDENTES

101

bacteriaion bisulfuro

sustrato orgánico

ion sulfato

bacteriaion bisulfuro

sulfuro de metal precipitadoion metálico

bacteria

sustrato orgánico

ion sulfato

capa de sulfuro de metal precipitado

(a) Célula activa (b) Precipitación en torno a la célula (c) Inhibición celular

Figura 10: Mecanismo de inhibición de sulfuros metálicos. (Utgikar y col., 2002)

La reducción del número viable de células (efecto tóxico) se traduce

en una disminución de X, y una disminución en la velocidad metabólica se

traduce en una disminución de la constante de velocidad k, estos términos,

dependientes de la cantidad de metal presente en el medio, se expresan:

Efecto tóxico: X(M)=Xo exp(-KTM)

Efecto inhibitorio: k(M)=ko exp(-KIM)

Incorporando ambos términos a la expresión se obtiene una

disminución de la velocidad cuando la concentración de metal aumenta.

Esta expresión fue aplicada al estudio de la toxicidad del cobre y el

zinc sobre un cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras. Los resultados

mostraron una mayor toxicidad del cobre que del zinc (KT=10,6 y 2,9 mM-1

respectivamente). Las constantes de inhibición fueron aproximadamente 18

ANTECEDENTES

102

y 25 mM-1 para cobre y zinc, lo que indica que el zinc resulta algo más

inhibitorio.

3.6 APLICACIÓN DE LA BIOPRECIPITACIÓN DE METALES POR BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

La posibilidad de eliminación de metales disueltos en medios ácidos

con alto contenido en sulfato mediante el empleo de bacterias sulfato-

reductoras ha dado lugar al desarrollo de numerosos trabajos dirigidos a

evaluar los distintos factores que influyen en el proceso, así como estimular

la actividad de estas bacterias. La mayoría de los trabajos han sido

desarrollados a escala de laboratorio y planta piloto, algunos enfocados al

desarrollo de este proceso in situ, aunque también existen tratamiento ex

situ y algunas aplicaciones industriales (White y col., 1997).

En Hammack y Edenborg (1992) se presenta un estudio llevado a

cabo en un reactor de lecho empaquetado de 900 ml con compost como

soporte de un cultivo de bacterias sulfato-reductoras. Se eliminó el 75% del

níquel presente cuando no se contó con una fuente de carbono adicional y

un 95% cuando se añadió lactato al medio.

Con este mismo soporte, Dvorak y col. (1992) llevaron a cabo un

estudio a escala piloto de dos tipos de sistemas para el tratamiento de

aguas contaminadas por metales. El sistema Pittsburg (tres reactores de 200 l

en serie), en el que se eliminó la totalidad del hierro y el aluminio, y el

sistema Palmerton (reactor de 4500 l), que eliminó la mayoría del Zn, Mn, Ni y

Cd del medio.

La aplicación más extensa de un proceso empleando las bacterias

sulfato-reductoras es el tratamiento de aguas subterráneas procedentes de

una planta de fundición de zinc en Holanda. La planta piloto comprende un

reactor de acero inoxidable de 9 m3 con un lecho de lodo. Esta planta

ANTECEDENTES

103

eliminó los metales tóxicos (principalmente zinc) y el sulfato procedentes de

las aguas contaminadas. El reactor empleó un consorcio indefinido, pero

seleccionado, de bacterias sulfato-reductoras con etanol como sustrato

orgánico. El proceso fue expandido en 1992 a escala comercial (reactor de

cemento de 1800 m3) con capacidad para tratar 7000 m3/día de agua

contaminada (Barnes y col., 1991).

En su trabajo, Christensen y col. (1996) estudian la posibilidad de un

tratamiento in-situ de las aguas ácidas de minas empleando como base

para el proceso material de mina. El objetivo del estudio se centra en

estimular la actividad de las bacterias sulfato-reductoras presentes

añadiendo una solución sustrato (lactato, proteínas, cenizas, ácidos grasos)

y la incorporación adicional de estiércol o un inóculo crecido de bacterias

sulfato-reductoras. La experiencia suplementada con sustrato e inóculo

adicional resultó la más positiva, ya que acorta la fase de latencia y mejora

la actividad bacteriana dando lugar a la eliminación de metales en menor

tiempo.

Elliot y col. (1998) trataron la remediación de drenajes ácidos de mina

con bacterias sulfato-reductoras. Para ello operaron con una columna de

flujo ascendente y su objetivo fue estudiar la influencia de la disminución del

pH del medio para así alcanzar valores similares a los que se encuentran en

este tipo de medio. Las bacterias toleraron un pH de aproximadamente 3.

El trabajo de Kim y col. (1999) se dirigió también a la aplicación in-situ

de las bacterias sulfato-reductoras. El estudio evalúa la habilidad de las

bacterias sulfato-reductoras para prevenir la generación de aguas ácidas

de mina procedentes de las pilas de residuos piríticos. En la experiencia,

llevada a cabo en columnas con residuos de mina, se evaluó el efecto del

pH del medio. En 30 días se redujo el 80-100% del carbono orgánico total y la

concentración de metales (Cu, Cd, Ni, Zn). En concreto, para un lixiviado de

ANTECEDENTES

104

pH 2-3 se consiguió la alcalinización hasta pH 7 en 4 días y se obtuvo un 99%

de eliminación para cadmio, cobre y zinc y un 87% para el níquel. La

formación de los sulfuros sucedió en el orden esperado CuS, CdS, NiS y ZnS

de menor a mayor producto de solubilidad.

Por su parte, Foucher y col. (2001) propusieron el tratamiento de

drenajes ácidos de minas mediante un proceso en dos etapas. El estudio

lleva a cabo el tratamiento a escala piloto de un agua ácida artificial y,

posteriormente, un efluente real de una zona minera. En la primera etapa se

empleó un biorreactor de lecho fijo donde se produjo el crecimiento de las

bacterias sulfato-reductoras en condiciones anaerobias. El sulfuro de

hidrógeno generado se dirige a una columna y de allí la mezcla gaseosa se

introduce en un reactor de mezcla completa donde se encuentra el medio

contaminado y en el cual se produce la etapa de precipitación de metales

en forma de sulfuros. En el efluente real la precipitación de metales se

produjo de forma selectiva: Cu y Zn a pH 2,8 y 3,5, respectivamente, y otros

metales (Ni, Fe) a pH 6.

Un estudio similar para el tratamiento de aguas ácidas de mina con

cadmio y cobre fue llevado a cabo por Luptakova y Kusnierova (2002). El

método incluye tres etapas: la producción biológica de H2S en discontinuo

en un reactor anaerobio inoculado con Desulfovibrio desulfuricans, la

precipitación de metales con el H2S generado de forma selectiva (Cu pH 2,8

y Cd pH 3,5) y la separación de los sulfuros metálicos formados mediante

filtración por membrana.

La aplicación de las bacterias sulfato-reductoras también se realiza

en procesos combinados cuando el medio contaminado posee otros tipos

de compuestos o tóxicos además de sulfato y metales pesados. Groudeva y

col. (2001) presentan el tratamiento de aguas contaminadas con petróleo y

metales pesados. El estudio se realiza en pantanos donde se almacenan

ANTECEDENTES

105

este tipo de residuos. Los pantanos contienen una flora autóctona que

incluye distintos hongos y bacterias capaces de degradar los compuestos

de petróleo y a su vez bacterias sulfato-reductoras. Éstas se encuentran en

la base de los pantanos donde se dan condiciones anóxicas y llevan a

cabo la reducción del contenido en sulfato de las aguas y la eliminación de

metales pesados (Cd, Cu, Pb, Mn y Fe).

El uso de este tipo de técnicas in situ, como el tratamiento en

pantanos, va tomando mayor importancia frente a las técnicas ex situ en

biorreactores. En Gibert y col. (2002) se describe la aplicación de las

bacterias sulfato-reductoras en barreras permeables reactivas. Las barreras

permeables se instalan en acuíferos con un material reactivo adecuado

que induce la realización de procesos biológicos y físico-químicos para la

biorremediación de las aguas subterráneas que fluyen a través de él. En el

trabajo se desarrollan los distintos aspectos necesarios para el diseño de

esta técnica.

Tuppurainen y col. (2002) investigaron la eliminación de zinc y sulfato

de un agua residual sintética de forma paralela en cuatro reactores de flujo

ascendente a escala de laboratorio. Estudiaron la influencia del soporte, la

adaptación o no previa al residuo y el contenido en zinc (50 o 200 mg/l).

Durante el proceso el 30-40% del sulfato y sobre el 98% del zinc fue eliminado

y más de 150-200 mg de H2S fueron producidos en cada reactor. Las

columnas que operaban durante 48 días en presencia del residuo antes de

introducir el metal eliminaron una mayor cantidad en los primeros días pero

al final de la experiencia (150 días) la eliminación fue similar para adaptadas

y no adaptadas.

Jong y Perry (2003) estudiaron la recuperación de unas aguas

contaminadas por sulfato, arsénico y varios metales pesados (Cu, Zn, Ni, Fe,

Al, As, Mg) en un reactor anaerobio de lecho empaquetado de flujo

ANTECEDENTES

106

ascendente. El cultivo empleado fue un aislado mixto de bacterias sulfato-

reductoras procedente de una zona minera. Realizaron una primera etapa

de adaptación de 14 días, etapa discontinua, en la que el cultivo se puso

en contacto con el medio contaminado y se estudió el nivel de

precipitación de los metales para distintas concentraciones (5, 10, 20 y 50

mg/l de cada metal). Esta investigación demostró la reducción de sulfato y

eliminación consecutiva de Cu, Zn, Ni, Fe y As. La eficacia de eliminación

fue de un 97,5% para Cu, Zn y Ni, >82% para Fe y >77,5% para As, sin

embargo no fue nada efectivo para Mg y Al.

Hulshof y col. (2003) realizaron un estudio con el objeto de evaluar la

efectividad de la adición directa de virutas de madera o residuos de pulpa

de papel a residuos de mina y la inhibición potencial de los constituyentes

de los residuos sobre el crecimiento bacteriano. En la columna con residuos

de pulpa de papel se obtuvo una mayor reducción de sulfato y se requirió

menor tiempo de residencia, posiblemente sea debido al mayor contenido

en nutrientes (N, P, C) de este material. En ambas columnas se obtuvo la

remoción total del zinc (80 mg/l), el presente en mayor cantidad, y de otros

metales.

3.7 INTEGRACIÓN DE PROCESOS DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

Existen trabajos que tratan de integrar la biolixiviación de los metales

existentes en un medio y la bioprecipitación de estos mismos metales

presentes en el lixiviado obtenido.

Con esta integración se logra extraer los metales presentes en un

medio aumentando su movilidad por la acción de las bacterias acidófilas y,

posteriormente, inmovilizar las especies metálicas para su deposición de

ANTECEDENTES

107

forma controlada o para su reutilización, de esta acción se encargan las

bacterias sulfato-reductoras.

Con este fin, White y col. (1998) presentaron un proceso biológico

integrado de este tipo, compuesto por una etapa de lixiviación realizada

por bacterias azufre-oxidantes seguida de la reducción de sulfato y la

precipitación de metales presentes en el lixiviado. En el estudio a escala de

laboratorio, emplearon un suelo contaminado artificialmente con metal. A

medida que decrecía el pH los metales fueron lixiviados en el orden: Mn, Cr,

Ni, Co, Cd, Zn, Cu, Pb, aunque se dieron periodos donde hubo lixiviación

simultánea de varios. En la etapa de bioprecipitación se empleo un reactor

de sedimentación interna con recirculación, capaz de retener una elevada

concentración de biomasa, con un cultivo indefinido de bacterias sulfato-

reductoras resistentes a los metales por su exposición previa a éstos en los

ambientes en que habitan. Los metales precipitaron principalmente como

sulfuros aunque también se formaron carbonatos e hidróxidos. La

eliminación de los metales alcanzó una eficacia global de más del 98%.

Groudev y col. (2001) realizaron el tratamiento de tierras agrícolas

contaminadas por elementos radiactivos (uranio, radio, torio) y metales

pesados (cobre, zinc, cadmio) mediante dos métodos biotecnológicos

diferentes, el estudio fue llevado a cabo en dos porciones de suelo de unos

200 m2. En ambos métodos se realizó una solubilización inicial de los

contaminantes mediante la acción de la microflora indígena del suelo,

principalmente bacterias autótrofas mesófilas acidófilas y algunas basófilas y

ciertos organismos heterótrofos. En condiciones naturales la oxidación de los

sulfuros minerales se produce a velocidades relativamente bajas, debido a

algunos factores como son el elevado pH, la limitación de oxígeno en el

suelo, la insuficiente humedad durante relativamente largos periodos de

tiempo y la ausencia de nutrientes como nitrógeno y fósforo. Para tratar de

ANTECEDENTES

108

mejorar las condiciones de aireación y humedad se realizó el arado y la

irrigación del suelo y el aporte de nutrientes necesarios. Tras la solubilización,

una de las porciones de tierra se trató mediante un sistema de “enjuague” y

el efluente procedente del suelo cargado de metales disueltos fue tratado

por un sistema pasivo, como los pantanos, y las soluciones agotadas se

reciclaron al suelo. En la otra porción, no se lavó el suelo y una gran

cantidad de metales quedó retenida en las capas más profundas de suelo,

donde los contaminantes son inmovilizados como resultado de la actividad

de las bacterias sulfato-reductoras que habitan esta zona del suelo. La

actividad de estas bacterias fue estimulada por la inyección al suelo de una

solución de compuestos orgánicos.

Viera y col. (2003) presentaron un proceso combinado dirigido a la

reducción de Cr(VI) y precipitación del Cr(III) obtenido. Para ello,

aprovechan la capacidad Acidithiobacillus thiooxidans para reducir de

forma indirecta el Cr(VI). Esta primera etapa fue llevada a cabo en un

reactor de tanque agitado y en ella se obtuvo la reducción casi total del

Cr(VI) a Cr(III). La solución de Cr(III) generada pasó al reactor de

bioprecipitación (reactor de tanque agitado), donde las bacterias sulfato-

reductoras han sido previamente crecidas en condiciones anaerobias

durante seis días, a partir de los cuales la solución metálica suplementada

con lactato (4,5 g/l) ingresa en el reactor (75 ml/día). En esta etapa, del

Cr(III) introducido durante 8 días (6 mg) sólo 0,3 mg Cr(III) no precipitaron.

El elevado contenido en metales de lodos, sedimentos y aguas

procedentes de la actividad minera e industrial hace pensar en la

necesidad de técnicas que traten de solventar este problema. El uso de

este tipo de procesos combinados permite, no solo extraer de forma natural

el metal, sino volver a obtenerlo en forma de sulfuro pero fuera del medio

contaminado. La diversidad de medios posibles hace necesario el estudio

ANTECEDENTES

109

en profundidad de cada caso pero, no obstante, una vez sentadas las

bases en las cuales se generan las condiciones adecuadas para la

obtención del metal, estos procesos muestran una alta aplicabilidad y

versatilidad.

4 INMOVILIZACIÓN DE CELULAS

4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIÓN

Algunos microorganismos y otros materiales celulares tienen una

tendencia natural a adherirse a superficies y, de esta forma, ser

inmovilizados. Muchos biorreactores avanzados requieren que los

biocatalizadores que intervienen en el proceso (microorganismos,

enzimas,…) estén inmovilizados en un soporte sólido con el fin de reducir el

lavado celular e incrementar la concentración de biocatalizador en el

proceso. Desde que se propuso la primera aplicación de los

microorganismos inmovilizados, se han desarrollado un gran número de

procesos de este tipo en diferentes campos: biomédica (producción de

fármacos y reactivos), biosensores (medida de concentración de solutos

mediante reacciones catalizadas por enzimas), química (producción de

etanol, combustibles gaseosos,…), macromoléculas, producción de

alimentos y bebidas, tratamientos de aguas residuales (Scott, 1987).

4.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN

La inmovilización de microorganismos se puede definir como una

técnica que limita la libertad de movimiento de las células. Esta movilidad

puede ser restringida por una agregación celular, por adhesión a un soporte

o por atrapamiento. Las técnicas de inmovilización se suelen clasificar en

dos tipos:

ANTECEDENTES

110

Adhesión: los microorganismos se adhieren a la superficie de otros

microorganismos o de un soporte por autoadhesión o por un enlace

químico.

Atrapamiento: los microorganismos quedan retenidos en los

intersticios de un material poroso o son físicamente envueltos por una matriz

porosa como un gel o una membrana.

4.2.1 Adhesión Los métodos de adhesión aprovechan la capacidad de los

microorganismos de adherirse a otros microorganismos, formando

agregados, o a superficies sólidas. Esta habilidad puede ser natural o

inducida, y constituye la base de una técnica de inmovilización celular de

bajo coste pero efectiva.

La formación de agregados o flóculos ocurre principalmente cuando

se tiene un cultivo con alta concentración celular en suspensión. Este hecho

ocurre tanto con levaduras (Saccharomyces cerevisiae) como bacterias

(Zymomonas mobilis). La agregación microbiana puede ser inducida o

mejorada variando las condiciones ambientales, como puede ser la adición

de polielectrólitos o la aireación.

En la adhesión a superficies sólidas, dependiendo de la naturaleza

del soporte, el enlace entre microorganismo y superficie puede ser el

resultado de interacciones iónicas, físicas, hidrofóbicas o de Van der Waals.

El mecanismo de adhesión, aunque no está totalmente elucidado para

todos los microorganismos, en general se debe a la secreción por parte de

la célula de ciertas macromoléculas, como mucopolisacáridos, que actúan

como adhesivos para iniciar la interacción microorganismo-superficie.

ANTECEDENTES

111

La principal ventaja de estas técnicas es su simplicidad y su mayor

inconveniente la posible desorción de los microorganismos después de su

utilización.

4.2.2 ATRAPAMIENTO Los métodos de atrapamiento consisten en el confinamiento de

microorganismos dentro de la red de un polímero, o bien en membranas

semipermeables que presentan poros de un tamaño tal que evitan la salida

del microorganismo pero permiten la difusión del sustrato y productos. Estas

técnicas no dependen de una forma significativa de la naturaleza de las

células. Normalmente la encapsulación o atrapamiento implica la

ubicación de las células en los huecos intersticiales de la red de un polímero,

éstas se obtienen a partir de sus precursores (monómeros, olígomeros o

poliméricos), mediante cambios en las variables de solubilidad (disolvente,

temperatura, fuerza iónica y pH).

Desde el punto de vista físico, la interacción de microorganismos con

superficies se da en tres etapas sucesivas:

• Adhesión reversible debida a energías débiles.

• Adhesión firme, denominada adhesión irreversible, que

contempla la formación de uniones por puentes de hidrógeno

y enlaces iónicos.

• Secreción de material extracelular, adhesión más lenta.

Desde el punto de vista de los microorganismos y una vez producida

la interacción, el desarrollo y formación de la película bacteriana se da en

tres pasos.

• Adsorción o inmovilización de los microorganismos sobre la

superficie soporte.

ANTECEDENTES

112

• Adherencia o consolidación de la interfase entre

microorganismos y soporte.

• Colonización por crecimiento y división de los microorganismos

sobre la superficie.

4.3 INMOVILIZACION DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES

La tendencia natural de las bacterias azufre oxidantes,

Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para crecer

sobre superficies los convierte en organismos ideales para la inmovilización

celular. Un gran número de investigadores han tratado de desarrollar esta

capacidad para la mejora de los procesos en los que se ven involucrados

este tipo de microorganismos (Armentia y Webb, 1992).

Con el propósito de mejorar la capacidad de Acidithiobacillus

ferrooxidans para oxidar ferroso se han desarrollado gran número de

trabajos dirigidos a la inmovilización de este microorganismo sobre

diferentes soportes y condiciones de operación. De este modo, se han

usado muchos tipos de reactores, operando tanto en régimen discontinuo

como en continuo, con el fin de obtener los mejores resultados.

Para la inmovilización de At. ferrooxidans se han empleado varias

matrices, existiendo trabajos de adhesión sobre esferas de vidrio (Grishin y

Tuovinen, 1988), resinas de intercambio iónico (Karamanev y Nikolov, 1988) o

carbón activo (Grishin y Tuovinen, 1988, Carranza y García, 1990, Halfmeier y

col., 1993) y de atrapamiento en alginato, carragenato y perlita (Wakao y

col., 1994, Lancy y Tuovinen, 1984). Otros soportes, como la espuma de

poliuretano (Armentia y Webb, 1992) o la fibra de aleación de níquel

(Gómez y col., 2000) combinan las ventajas de la adhesión y el

atrapamiento. Este tipo de trabajos se dirigen a la mejora de las condiciones

ANTECEDENTES

113

experimentales para la obtención de una mayor oxidación del ferroso, sin

embargo, existen pocos estudios acerca de la inmovilización de At.

ferrooxidans con azufre como sustrato, en ausencia de ferroso.

El estudio de Acidithiobacillus thiooxidans no está tan avanzado

como el de At. ferrooxidans, de modo que el número de trabajos

desarrollados en cuanto a la inmovilización de esta bacteria es mucho

menor. No obstante, la estructura celular y la capacidad para adherirse a

las superficies hacen pensar en la posibilidad de inmovilización de esta

bacteria en los mismos soportes que se han estudiado para la otra bacteria.

De este modo, se conocen algunos trabajos sobre At. thiooxidans

inmovilizado sobre azufre para distintos tamaños de partícula (Pogliani,

1999).

4.4 INMOVILIZACION SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO

La espuma de poliuretano ha tomado últimamente una gran

relevancia como soporte para las técnicas de inmovilización, debido al

elevado número de aplicaciones de éste que se recoge en la literatura:

eliminación de compuestos orgánicos (Manohar y col., 2001, Moe e Irvine,

2001a y b, Hori y col., 2001, Yang y col., 2003), control de olores de residuos

(Burguess y col., 2001), fermentación de ácido acético (de Ory y col., 2004),

eliminación de hidrocarburos (Holubar y col., 1994), oxidación de sulfato

ferroso (Armentia y Webb, 1992), etc. En dichos trabajos, se inmovilizaron (o

coinmovilizaron) varios microorganismos dentro de los soportes empleando

diferentes tipos de reactores: tanque agitado, columnas empaquetadas o

biofiltros (de Ory y col., 2005).

La espuma de poliuretano es un material inerte con unas buenas

propiedades mecánicas (alta resistencia y elasticidad) y un bajo coste

ANTECEDENTES

114

comercial. Presenta una alta porosidad (cercana al 97%) y, por tanto, una

alta superficie de adsorción. Además, este material no sufre los

inconvenientes de escalamiento que se experimentan con otras matrices

de encapsulación ya que pueden ser preparados fácilmente grandes

volúmenes de este soporte. Otra ventaja importante de este soporte es que

los problemas de difusión de oxígeno se pueden reducir debido al elevado

tamaño de poro, hecho que es muy importante para el metabolismo de los

microorganismos aerobios. En la Figura 11 se muestran algunas unidades

cúbicas de espuma de poliuretano comercial y una fotografía de

microscopía electrónica de su estructura interna.

Un aspecto a tener en cuenta para la correcta comprensión del

fenómeno involucrado en el proceso de inmovilización sobre espuma de

poliuretano es el equilibrio de adsorción-desorción en la biopelícula.

Figura 11: fotografía de algunas unidades de espuma de poliuretano y estructura interna (x50) de la espuma de poliuretano.

Cuando la biopelícula de microorganismos inmovilizados está en

formación (adsorción) ocurre simultáneamente una pérdida continua de

células (desorción), especialmente si el reactor es agitado enérgicamente.

De modo que, debe ser establecida una velocidad de agitación adecuada

para encontrar un balance satisfactorio entre los dos efectos. Por un lado,

una agitación vigorosa mejora las condiciones generales de transferencia

ANTECEDENTES

115

de masa a la biomasa sumergida y, como consecuencia, aumenta la

población microbiana total así como el número de células adsorbidas

dentro del soporte. Por otro lado, los efectos de erosión y las colisiones

pueden aumentar por una agitación turbulenta frenando seriamente los

procesos de adsorción de la superficie celular. Al mismo tiempo, la

concentración de biomasa intersticial (células sumergidas en el líquido

retenido dentro de la estructura interna del soporte) constituye una fuente

potencial importante de biomasa para ser inmovilizada por el continuo

equilibrio de adsorción-desorción y tiene, además, una gran importancia en

las sucesivas fermentaciones posteriores.

C.-MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL Y MÉTODOS

119

1 MATERIAL Y MÉTODOS

1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS

1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES


Las bacterias azufre oxidantes empleadas en este estudio son cepas

de la colección alemana de microorganismos DSMZ, en concreto,

Acidithiobacillus ferrooxidans DSM 11477 y Acidithiobacillus thiooxidans DSM

11478.

1.1.1.2 Mantenimiento de las cepas

El medio de sales empleado para el mantenimiento de ambas

bacterias es de idénticas características y contiene nutrientes esenciales

tales como magnesio, fósforo, potasio y nitrógeno. La composición del

medio se describe en la Tabla 18 y es similar al propuesto para el

crecimiento de Acidithiobacillus ferrooxidans en presencia de ión ferroso por

Silverman y Lundgren (1959). Este medio sin la adición de Fe(II) se denomina

medio 0K. El medio ha de ser suplementado con la fuente de energía propia

de cada bacteria, así

• Acidithiobacillus ferrooxidans: es una bacteria hierro y azufre

oxidante, es decir, toma energía de la oxidación de hierro (II) o

de compuestos de azufre reducido. Por tanto, el medio puede

ser suplementado con Fe (II), en forma de sulfato ferroso, o con

azufre elemental.

• Acidithiobacillus thiooxidans: al ser exclusivamente azufre

oxidante el mantenimiento consiste en el aporte de las sales

nutrientes y el azufre elemental necesarios.

MATERIAL Y MÉTODOS

120

Compuesto g/l

(NH4)2SO4 3,0

MgSO4 0,5

K2HPO4 0,5

KCl 0,1

Ca(NO3)2 0,01

Tabla 18: Composición del medio de nutrientes para las bacterias azufre-oxidantes.

Mantenimiento con ión ferroso

Para el crecimiento de las bacterias azufre-oxidantes con ión ferroso

se utiliza el medio denominado como 9K, ya que contiene 9 g/l de Fe (II).

Para la preparación de un litro de este medio se disuelven las sales del

medio 0K en 1000 ml de agua destilada, se ajusta el pH a 1,8 con H2SO4 5M y

se esteriliza en autoclave (121ºC, 20 min). Posteriormente, se disuelve el ión

ferroso (44,8 g FeSO4·7H2O) en 300 ml del medio preparado, se ajusta a pH

1,8 y se esteriliza mediante un sistema de filtración a vacío. Por último, se

incorpora la disolución estéril de ferroso al medio 0K reservado y se conserva

a 4ºC.

El mantenimiento de la cepa en volumen final de 100 ml consiste en

la adición de 90 ml de medio 9K en un matraz estéril de 250 ml. Este volumen

se inocula con 10 ml de cultivo en fase exponencial de crecimiento y se

incuba en un agitador a 30ºC y 150 rpm.

Mantenimiento con azufre elemental

La preparación del medio de crecimiento requiere preparar el

volumen necesario de medio 0K, ajustado a pH 1,8 para At. ferrooxidans ó

pH 2,5 para At. thiooxidans. A continuación, se procede a la esterilización en

MATERIAL Y MÉTODOS

121

autoclave (121ºC, 20 min). Por último se esteriliza el azufre elemental en

microondas (3 pulsos de 30 s).

Para el mantenimiento de la cepa en un volumen final de 100 ml se

depositan 90 ml de medio 0K en un matraz estéril de 250 ml y se le añade 1

g de azufre elemental. Posteriormente, se inocula con 10 ml de cultivo en

fase exponencial de crecimiento y se incuba en un agitador a 30ºC y 150

rpm.

Debido a que los experimentos se han realizado tomando como

fuente de energía el azufre, el mantenimiento se realizó siempre en

presencia de éste. Los cultivos de At. ferrooxidans crecidos en hierro que se

emplean en una experiencia con azufre como única fuente de energía,

necesitaron de subcultivos continuados en azufre para eliminar por

completo la presencia de hierro.

Seguimiento de las cepas

El azufre elemental, por su carácter hidrofobo, se mantiene en la

superficie del cultivo cuando lo incorporamos al medio. A medida que se va

consumiendo por la acción de las bacterias pasa a formar una suspensión

coloidal (Figura 12).

Los cultivos de bacterias azufre-oxidantes han de ser refrescados, es

decir, se ha de renovar su medio de crecimiento cuando se han alcanzado

valores constantes de pH y población celular. Dicha renovación no se ha de

realizar cuando hay agotamiento de sustrato, ya que esto suele ocurrir a un

pH muy bajo y provoca situaciones de estrés a las células dando lugar a

cultivos posteriores con una larga fase de latencia y de baja población

bacteriana.

MATERIAL Y MÉTODOS

122

Figura 12: Medio 0K suplementado con azufre y At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en dicho medio (5 días)

Los cultivos se encuentran en la fase exponencial de crecimiento

cuando alcanzan un valor de pH igual a 1,0, aproximadamente, y la

población bacteriana se encuentra en torno a 1· 108 células/ml. En este

momento se encuentran en condiciones idóneas para ser utilizadas como

inóculo de las distintas experiencias que se deseen realizar.

Para cultivos crecidos con ión ferroso como fuente de energía, se

renueva el medio cuando la concentración de Fe(II) en el medio es de

aproximadamente 20 mg/l. La determinación de la concentración de este

ión se realiza por el método de la 1,10-fenantrolina propuesto por Vogel

(1989).

1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS


Las bacterias sulfato-reductoras empleadas fueron Desulfovibrio

vulgaris ATCC 29579 y Desulfovibrio sp. ATCC 49975, siendo esta última un

cultivo mixto de varias cepas de éste género.

MATERIAL Y MÉTODOS

123

1.1.2.2 Mantenimiento de las cepas

Los medios para la conservación y el crecimiento de estas bacterias

fueron propuestos por Postgate en 1979. Debido al carácter anaerobio de

estas bacterias, su mantenimiento es más complejo y se pueden distinguir

dos medios diferentes en función de la finalidad que se le vaya a dar al

cultivo: el medio Postgate B para el mantenimiento y el medio Postgate C

para el crecimiento y la realización de experimentos que requieran una

elevada reducción de sulfato.

Medio de mantenimiento

El medio Postgate B se caracteriza porque no facilita la producción

de biomasa en elevadas cantidades pero contiene compuestos reductores

que producen la anaerobiosis de este. La composición del medio Postgate

B se presenta en la Tabla 19

Compuesto g/l

KH2PO4

NH4Cl

CaSO4

Mg SO4

Lactato de sodio

Extracto de levadura

FeSO4·7H2O

Ácido ascórbico

Ácido tioglicólico

0,50

1

1

2

3,5

1

0,5

0,1

0,1

Tabla 19: Composición del medio Postgate B

Para su preparación se realiza el siguiente procedimiento

experimental, se incorporan los compuestos en el orden descrito en la Tabla

MATERIAL Y MÉTODOS

124

19 excepción de los ácidos, se preajusta el pH a 7 con NaOH o KOH 2N y se

añaden los compuestos reductores (ácido tioglicólico y ácido ascórbico). A

continuación, se vuelve a ajustar el pH a 7,0-7,5 y se preparan botes de

vidrio de 10 ml, con tapón de goma y virola metálica (tipo penicilina) para

asegurar el sellado hermético. Posteriormente, se fracciona el medio

depositando 9 ml en cada bote y cerrándolo inmediatamente. Durante este

tiempo es necesario mantener el medio en agitación para evitar que se

forme un precipitado coloidal y para favorecer la acción de los compuestos

reductores. Se debe proceder al sellado de los botes con la mayor urgencia

posible. Finalmente, se esterilizan a 121ºC durante 20 minutos y se mantiene

a 4ºC hasta su uso.

Para realizar los subcultivos, se utilizan frascos ya esterilizados con

medio Postgate B y se desinfectan con alcohol en la zona donde se va a

introducir el inóculo, así como aquellos que se utilizan como inóculo. Se

toma 1 ml de cultivo crecido en Postgate B y se inyecta en un frasco con

medio fresco teniendo especial cuidado de no introducir aire. Esta

operación se realiza por triplicado y se incuban de forma estática a 30ºC.

Seguimiento de las cepas

La presencia de sulfato ferroso en el medio provoca que las bacterias

reduzcan éste, dando lugar a sulfuro ferroso, que se caracteriza por ser un

precipitado negro (Figura 13). La presencia de este precipitado suele ocurrir

a las 24-48 horas y nos indica el óptimo crecimiento de estas bacterias. En

este momento se puede realizar un recuento de la biomasa para

comprobar el crecimiento y se mantienen los cultivos a 4ºC.

La actividad de la cepa se mantiene durante 20 días, tras los cuales

es necesario realizar un nuevo cultivo.

MATERIAL Y MÉTODOS

125

Figura 13: Medio Postgate B y Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp. crecidos en medio Postgate B (48 horas).

Medio de crecimiento

El medio Postgate C se caracteriza por no contener compuestos

reductores y se emplea cuando se persigue un crecimiento bacteriano

elevado. Este medio permite una mayor reducción de sulfato y es una

modificación del propuesto por Postgate (1984) ya que omite la adición de

sulfato ferroso y ácido cítrico, con el objetivo de facilitar la precipitación de

los iones metálicos de interés. Su composición se detalla en la Tabla 20

Compuestos g/l

KH2PO4

NH4Cl

Na2SO4

CaCl· 6 H2O

MgSO4· 7 H2O

Lactato de sodio

Extracto de levadura

0,50

1

4,5

0,06

0.06

6

1

Tabla 20: Composición del medio Postgate C modificado.

MATERIAL Y MÉTODOS

126

Para la preparación del medio Postgate C, se añaden los

compuestos en el orden descrito en la tabla 20, se ajusta el pH a 7,5 con

NaOH ó KOH 2N y se esteriliza en autoclave (121ºC y 20 minutos). Una vez

enfriado se conserva a 4ºC durante un tiempo limitado ya que es un medio

rico y pueden aparecer contaminaciones.

La inoculación de bacterias sulfato-reductoras en medio Postgate C

se realiza utilizando un bote estéril de 100 ml con un volumen de 90 ml de

medio. A continuación, se hace pasar una corriente de gas inerte

(normalmente nitrógeno), que pasa previamente por un filtro, durante 5-10

minutos.

Al mismo tiempo, se utiliza un cultivo crecido en Postgate B y se filtra

con papel Whatman nº4 para eliminar los precipitados de sulfuro ferroso y se

realiza una nueva filtración a vacío con membrana de 0,22 �m. Las células

retenidas se resuspenden en 10 ml de medio Postgate C y se añade al

medio contenido en el bote, sin dejar de pasar la corriente gaseosa.

Después de 5 minutos, se retira el aporte gaseoso, se procede a cerrar y

sellar el bote, para cultivar en estufa a 30ºC.

Seguimiento del cultivo

El crecimiento del cultivo se puede comprobar de forma visual,

observando el espesamiento del medio y la concentración celular en forma

de mucosidad (Figura 14). El seguimiento cuantitativo del crecimiento se

realiza con el control de varios parámetros como son la concentración

celular, el pH y la concentración del sulfato residual en el medio. Se suele

observar crecimiento favorable hasta unos 14 días.

MATERIAL Y MÉTODOS

127

Figura 14: Medio Posgate C y Desulfovibrio sp. crecido en este medio (14 días)

1.2 MÉTODOS DE ANÁLISIS

1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX La medida de estos parámetros se realizó mediante un electrodo de

plata (CRISON 52-02) empleando un pHmetro CRISON micropH 2002.

1.2.2 CONCENTRACIÓN CELULAR

1.2.2.1 Bacterias en suspensión

Para la determinación de la población bacteriana se utilizó el

método directo de recuento en microscopio óptico mediante una cámara

Neubauer (Gómez, 1997).

La cámara Neubauer es un dispositivo similar a un portamuestras, con

la diferencia de que cuenta con una cuadrícula en su zona central. La

cuadrícula aloja un volumen de 1 �l de la muestra. Utilizando los objetivos

adecuados es posible contar las unidades celulares situadas sobre la zona

cuadriculada.

En este caso se empleó un microscopio óptico Olympus BH-2 que

dispone de oculares con 15 aumentos y objetivos de 4, 10, 20, 40 y 100

MATERIAL Y MÉTODOS

128

aumentos. Previo a la medida se requiere realizar la dilución

correspondiente para tener una concentración a la que puedan distinguirse

y contarse las células. Las diluciones se realizaron con el medio de cultivo

característico de cada cepa para no someter a unas condiciones

desfavorables a las células que puedan provocar la muerte celular y, por

tanto, un recuento erróneo. El recuento se llevó a cabo considerando ocho

casillas, no siempre contiguas, tomadas de la diagonal de la cuadrícula. La

concentración celular se obtiene aplicando la siguiente expresión:

[ ]ml

Mcelasconsiderad casillas de nº

104 dilución· de factor contadas· células de nºCelular

6

=⋅

=

Los recuentos celulares se realizaron por duplicado para disminuir los

posibles errores en la determinación experimental.

1.2.2.2 Bacterias inmovilizadas

Los procesos de inmovilización de bacterias acumulan una elevada

concentración de éstas en los intersticios del soporte y adheridas en él. Para

realizar una estimación de la concentración de células que existe se ha de

realizar el recuento de la biomasa ocluida y la biomasa adherida.

Biomasa ocluida

Se toman varias unidades de soporte y se elimina el líquido intersticial

de cada una de ellas realizando presión con pinzas Millipore. En las

suspensiones obtenidas se realiza el recuento celular por cámara Neubauer

y se toma un valor medio.

Biomasa adherida

Cada una de las unidades de soporte se depositó en un recipiente

de 25 ml y se le añade un volumen exacto del medio de cultivo utilizado

para el crecimiento de la bacteria a un pH similar al que se encuentra en la

muestra (10 ml). Se introducen en un baño de ultrasonido (vetrasons-H

MATERIAL Y MÉTODOS

129

selecta) durante 15 minutos. Las bacterias adheridas se desprenden de la

superficie del soporte y pasan al medio líquido. Se realiza el recuento celular

de cada una de las muestras. Los soportes se secan en estufa (80 ºC, 24

horas) y se pesan en balanza analítica. La biomasa adherida se expresa

como Mcélulas/miligramos de soporte.

soporte de mgMcelulas

soporte de mgml 10

mlMcelulas

=⋅

1.2.3 CONCENTRACIÓN DE PROTONES La medida de la concentración de protones en el medio se realizó

mediante una valoración con hidróxido sódico 0,02 N factorizada con

biftalato potásico.

1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO La concentración de sulfato en el medio se realizó mediante el

método turbidimétrico clásico (Clesceri y col., 1989) con algunas

adaptaciones. Este método consiste en la reacción del ion sulfato con

cloruro de bario para dar sulfato de bario, que se caracteriza por formar

una suspensión blanca que enturbia el medio acuoso. La medida de esta

turbidez se relaciona con la concentración de sulfato.

El protocolo a seguir para la realización de esta medida requiere

preparar patrones entre 20 y 100 ppm de sulfato. Para ello se utiliza una

disolución de 1000 ppm de sulfato de sodio.

Las muestras se centrifugan durante 2 minutos o se filtran por

membrana de 0,22 micras para evitar la interferencia de otros componentes

en la medida.

Tanto los patrones como las muestras se llevan a un volumen final de

25 ml en matraces aforados, el contenido de éstos se deposita en tubos de

MATERIAL Y MÉTODOS

130

vidrio de 40-50 ml, para facilitar la agitación. A continuación se añade 1 ml

de una solución tampón (45 ml de H2O destilada, 4,5 ml de HCl

concentrado, 15 ml de etanol absoluto, 7,5 ml de glicerina y 11,25 g de

NaCl), se agita y se añade una punta de espátula de BaCl2. La mezcla se

agita un minuto en vortex (Heildolph REAX2000) y se deja reposar otro

minuto. La medida se realizó en un espectrofotómetro Hewlett-Packard 8453

a una longitud de onda de 450 nm.

1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METÁLICOS La concentración de iones metálicos se determina por

espectroscopia de emisión atómica por plasma de acoplamiento inducido.

El espectrómetro empleado fue un Iris Intrepid de Thermo Elemental. Antes

de realizar la medida se requiere realizar un procedimiento para la

adecuación de la muestra. Para ello, se toma la muestra con jeringa de 10

ml y se filtra por un filtro de jeringa de nylon de 0,22 micras (ALBET-JNY-020-

25-100) para separar el metal no soluble y las bacterias que pueden influir en

el deterioro de la muestra antes de su medida.

A continuación se diluye la muestra filtrada en agua destilada o en el

medio en que se encuentra hasta un volumen total de 3 ml, de modo que la

medida quede dentro de la recta de calibrado preparada y supere el límite

mínimo de detección.

Posteriormente, se acidifica con ácido nítrico (60%) para conservar la

muestra a un pH menor a 2, en el caso de que sea necesario.

Esta mezcla se conserva a 4ºC hasta el momento de la medida.

El procedimiento de medida realiza la media de tres lecturas de

cada muestra.

MATERIAL Y MÉTODOS

131

1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE La determinación del Cr(VI) se realiza por el método de la

difenilcarbazida (Clesceri y col, 1989).

Para ello, en matraces aforados de 5 ml se preparan patrones entre

0,5 y 1 ppm de Cr(VI) a partir de una disolución de 1000 ppm de dicromato

potásico. Se prepara un blanco con agua destilada de igual volumen.

Las muestras se llevan a un volumen de 5 ml en matraces aforados de

modo que su medida entre en el rango de determinación y a continuación

se vierten estas muestras en tubos de 10 ml y se acidifica con una gota de

ácido sulfúrico concentrado.

Se añaden 0,25 ml de difenilcarbazida (0,1 g en 20 ml de acetona) y

se agita en vortex para favorecer la reacción. Tras diez minutos en reposo, la

medida se realiza en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540

nm.

1.2.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA La visualización de las bacterias empleadas así como de las

experiencias realizadas sobre distintos soportes (espuma, precipitados

metálicos) se realizó en un microscopio electrónico Quanta 200 previo

pretratamiento de las muestras.

La toma de la muestra se realiza de distinta forma en función de su

estado:

• Muestras sólidas: se centrifugan y se deposita el pellet en un

tubo de 5 ml (si es muy grande se separa en varias porciones)

• Muestras líquidas: las bacterias en suspensión, se concentran y

se depositan sobre un cubreobjetos tratado con polilisina

MATERIAL Y MÉTODOS

132

durante 10 min. La polilisina se deposita previamente y se retira

el exceso antes de poner la muestra con papel absorbente.

Los cubreobjetos (20 mm) se colocan en un recipiente

diseñado para ello donde quedan almacenados en vertical.

A continuación se procede a la fijación con glutaraldehido al 2,5 %

en tampón de cacodilato de sodio 3-hidrato (0,1M, pH 7,2) y se deja actuar

durante 1 hora.

Para retirar el glutaraldehido, se añade cacodilato (0,1M, pH 7,2) por

las paredes sin tocar la muestra. Se realizan 2 lavados de 10 minutos cada

uno.

Seguidamente, se realiza una nueva fijación con OsO4 al 1%

(disolución tampón cacodilato 0,2M-OsO4 al 2%) durante 1 hora. Este paso

no siempre es necesario, se realiza siempre y cuando no se haya

conseguido una fijación con los pasos anteriores.

Por último, se realiza el secado por punto crítico y el metalizado (100-

150 s). Las muestras se conservan en campana de secado hasta que se

observan al microscopio.

1.2.8 DIGESTIÓN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL Esta técnica se empleó para determinar la cantidad de metal que

permanece insoluble en una solución o matriz sólida, antes o después de

aplicar un proceso de solubilización.

Para un medio de, aproximadamente 100 ml, se añadieron 10 ml de

HNO3 y 10 ml de HCl , ambos concentrados. Se calentó y agitó durante 1

hora. Tras dejar enfriar se filtró y se llevó a un volumen conocido para

determinar su contenido en metales por espectroscopía de emisión

atómica.

MATERIAL Y MÉTODOS

133

2 PROTOCOLOS EXPERIMENTALES

El estudio de los procesos de solubilización y precipitación de los iones

Cr(III), Ni(II) y Zn(II), así como, la reducción del Cr(VI), por la acción de

bacterias azufre-oxidantes y sulfato-reductoras se llevó a cabo mediante la

sucesión de las etapas experimentales descritas a continuación:

• Solubilización de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufre-

oxidantes en discontinuo.

• Solubilización de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufre-

oxidantes en continuo.

• Reducción de Cr(VI) con bacterias azufre-oxidantes en

discontinuo.

• Reducción de Cr(VI) y solubilización de Cr(III) con bacterias

azufre-oxidantes en continuo.

• Precipitación de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfato-

reductoras en discontinuo.

• Precipitación de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfato-

reductoras en continuo.

• Inmovilización de At. ferrooxidans y At. thiooxidans sobre

espuma de poliuretano.

• Integración de los procesos de solubilización y precipitación de

Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en continuo.

MATERIAL Y MÉTODOS

134

2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO

El estudio de la solubilización de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por la

acción de las bacterias azufre-oxidantes se llevó a cabo primeramente en

régimen discontinuo.

Se tomaron como referencia las concentraciones máximas de estos

metales en lodos para ser aplicadas al suelo: 1500 mg Cr/kg materia seca,

400 mg Ni/kg materia seca y 4000 mg Zn/kg materia seca. Estas mismas

cantidades en disolución dan lugar a concentraciones mayores a los que se

pueden encontrar habitualmente en efluentes contaminados. Por otra

parte, los estudios previos indicaron que algunas de estas concentraciones

no son toleradas por este tipo de bacterias.

Por tanto, se decidió trabajar con el 20% y el 50% de estas cantidades

en el medio de cultivo. La cantidad necesaria de cada metal se

suplementó empleando, óxido de cromo (III) (Cr2O3), sulfuro de níquel (NiS) y

sulfuro de zinc (ZnS), respectivamente.

Se prepararon ensayos con cada metal sólo y combinando todos

ellos. En la Tabla 21 se recogen las concentraciones de metal empleadas en

cada uno de ellos.

En matraces erlenmeyers de 250 ml se añadieron 90 ml de medio 0K

(ajustado a pH 4), 1 g de azufre elemental y la cantidad necesaria de

metal. A continuación se inoculó al 10% con un cultivo de At. ferrooxidans o

At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento. Se realizó un control

estéril (C50) al que se suplementaron todos los metales a la máxima

concentración de cada uno de ellos.

MATERIAL Y MÉTODOS

135

Ensayo [Cr(III)] ppm

[Ni(II)] ppm

[Zn(II)] ppm

Cr20 300

Cr50 750

Ni20 80

Ni50 200

Zn20 800

Zn50 2000

M20 300 80 8000

M50 750 200 2000

C50 750 200 2000

Tabla 21 Concentraciones de los metales empleados en cada uno de los ensayos

El seguimiento de la experiencia se realizó tomando muestras cada 3-

4 días, reponiendo previamente el volumen de agua evaporado. A cada

muestra se le determinó el pH, la población celular y la concentración de

metales en solución. Al final de la experiencia se determinó la cantidad de

metal residual de cada ensayo mediante digestión ácida.

Dado que los metales habitualmente se encuentran integrados en

matrices sólidas como lodos, sedimentos o suelos, se estudió también la

solubilización de estos metales en las mismas condiciones en presencia de

una matriz sólida como la arena. Para ello, se prepararon arenas

contaminadas artificialmente con cromo, níquel y zinc individualmente y los

tres al mismo tiempo. La cantidad de arena agregada en cada ensayo dio

lugar a las mismas concentraciones iniciales que en el estudio de

solubilización anterior y el seguimiento de la experiencia se realizó siguiendo

el mismo procedimiento descrito anteriormente.

MATERIAL Y MÉTODOS

136

2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO

La solubilización en continuo de los iones metálicos Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

se llevó a cabo preparando un cultivo de At. thiooxidans en un reactor de

tanque agitado de modo que el medio ácido que sale de forma continúa

se hizo pasar por una columna de lecho fijo en la que se encontraba una

arena contaminada artificialmente con los metales citados.

La descripción del equipo se detalla a continuación y se encuentra

representado en la figura 15.

30ºC 300 rpm

Aireación

Lixiviado

sensor pH

Sensor de temperatura

Medio 0K pH4

At. t.

Arena con Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

Figura 15: Equipo para la solubilización continua de cromo, níquel y zinc mediante un cultivo de At. thiooxidans.

MATERIAL Y MÉTODOS

137

2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans Para el crecimiento de esta bacteria azufre-oxidante se empleó un

reactor de tanque agitado con un volumen de trabajo de 800 ml sobre un

volumen total de 1 litro.

El reactor estaba provisto de un sensor de temperatura y un sensor de

pH para el control del proceso. La agitación (300 rpm) se obtuvo por

agitación magnética y el oxígeno necesario se proporcionó mediante un

compresor que suministraba un caudal de aire de 1,04 vvm.

El cultivo se realizó añadiendo al reactor 720 ml de medio 0K (a pH 4),

8 g de azufre elemental y 72 ml de un cultivo de At. thiooxidans en fase

exponencial de crecimiento (1020 Mcel/ml y pH 0,96) y se mantuvo a 30ºC y

300 rpm. Tras una primera fase en régimen discontinuo, cuando el pH se

encontró en un valor de 1, se conectó la alimentación en continuo

mediante una bomba peristáltica.

Diariamente se realizó la medida de pH, concentración de protones,

concentración de sulfato, población bacteriana y volumen alimentado.

2.2.2 SOLUBILIZACIÓN DE METALES PRESENTES EN ARENA Para llevar a cabo el estudio de la solubilización de los metales

presentes en una arena contaminada artificialmente, se colocaron 50 g de

ésta en una columna de vidrio de 60 ml de volumen total.

La arena se preparó con aquellas concentraciones de cada uno de

los metales estudiados que según la legislación vigente marcan el mínimo

para que sea considerado como un lodo contaminado. De este forma, los

50 g de arena contenían: 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II)

aportados en forma de Cr2O3, NiS y ZnS, respectivamente.

MATERIAL Y MÉTODOS

138

A través de la columna se hizo pasar un caudal de medio ácido

procedente del reactor de crecimiento exactamente igual al de entrada

de alimentación del reactor de At. thiooxidans.

Diariamente se le determinó al lixiviado obtenido el pH, la

concentración de protones, la concentración de sulfato, la concentración

de cada uno de los metales y el volumen obtenido.

2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO

Para la determinación de la capacidad de reducción del cromo

hexavalente por At. ferrooxidans y At. thiooxidans en discontinuo se siguió el

protocolo descrito a continuación.

Se preparó una disolución de dicromato potásico (K2Cr2O7) de 1000

ppm y se esterilizó por filtración a vacío por membrana de 0,22 �m.

Una serie de erlenmeyers de 250 ml fueron suplementados con 90 ml

de medio 0K (pH 4,0) y 1 g de azufre elemental. A este medio se le añadió el

volumen necesario para obtener una concentración final de 1, 2,5, 5 y 10

mg/l; y finalmente, se inoculó al 10% con cultivos en la fase exponencial de

crecimiento.

Se realizó un control sin inóculo a la mayor concentración de Cr(VI)

considerada (10 ppm) y dos controles inoculados (uno de cada bacteria)

sin metal.

El seguimiento de esta experiencia se realizó mediante la medida del

pH, la población celular, la concentración de Cr(VI), empleando el método

de la difenilcarbazida, y la concentración de cromo total, por

espectroscopia de emisión atómica.

MATERIAL Y MÉTODOS

139

2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DEL Cr(III) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO

Para el estudio de la reducción del Cr(VI) y la solubilización del Cr(III)

presentes en un residuo por la acción de las bacterias azufre-oxidantes, se

empleó un reactor para el crecimiento de un cultivo At. thiooxidans y una

columna de lecho empaquetado, que soportaba el residuo, donde se

produjo la reducción/solubilización del cromo por la acción del medio

procedente del reactor de At. thiooxidans. La descripción del proceso se

detalla a continuación y se encuentra representado en la figura 16.

Figura 16: Esquema del sistema empleado para la reducción del Cr(VI) y la solubilización del Cr(III) presentes en un residuo mediante la acción de At. thiooxidans

2.4.1 Reactor de At. thiooxidans El reactor empleado fue una columna de lecho empaquetado

constituida por 170 g de azufre elemental (tamaño de partícula 2-4 mm). El

Aireación

Lixiviado Medio 0K pH5

Residuo de cromo

At. thiooxidans + azufre

pH1

MATERIAL Y MÉTODOS

140

azufre tiene una doble finalidad: actuar como soporte para la inmovilización

de las bacterias y como sustrato. La columna disponía de 150 ml de

volumen útil sobre un total de 300 ml.

Inicialmente se añadió a la columna medio 0K a pH 2,5 y se inoculó al

10% con un cultivo At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento.

La alimentación del reactor constaba de medio 0K ajustado a pH 5.

El oxígeno necesario para el metabolismo celular se proporcionó mediante

un sistema de aireación conectado a un difusor (1,10 vvm). Para la entrada

de alimentación y salida de medio se empleó una bomba peristáltica de

doble cabezal.

El seguimiento del reactor se realizó diariamente mediante la medida

del pH, la concentración de protones y la población celular.

El sistema operó inicialmente en discontinuo hasta alcanzar un pH

igual a 1, es entonces cuando se dispuso en régimen continuo para obtener

la renovación de todo el medio presente en la columna y se mantuvo de

nuevo en discontinuo. Este proceso se repitió hasta asegurar la formación

de la biopelícula, momento en que se mantiene en régimen continuo.

2.4.2 Columna con residuo de cromo En una columna de características similares a la empleada para la

inmovilización de At. thiooxidans, se añadieron 157 g del residuo de cromo a

tratar.

El residuo empleado procedía de un filtro prensa de una planta de

galvanizado. Dicho filtro, constituido principalmente de compuestos

arcillosos, retiene el cromo procedente de los baños de cromado y cuando

se colmata se desecha y es renovado por otro; este hecho supone una

acumulación elevada de cromo en el medio donde se almacenan.

MATERIAL Y MÉTODOS

141

El contenido del residuo es 30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI).

La columna estaba conectada a una bomba peristáltica que

permitía la salida de lixiviado a un caudal similar al de entrada de medio a

pH 1. El seguimiento de la columna se realizó midiendo el volumen

recolectado de lixiviado y determinando a éste el pH, la concentración de

protones, la concentración de sulfato y la concentración de cromo

hexavalente y total.

2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN DISCONTINUO

Las experiencias realizadas tenían el objetivo de estudiar la tolerancia

de las bacterias sulfato-reductoras a los iones metálicos, así como

cuantificar la capacidad de precipitación de dichos iones por estas

bacterias.

Durante la experimentación fueron necesarios cultivos crecidos en

medio Postgate C, y para ello, con la antelación suficiente, se sembraron en

medio Postgate C las cepas de bacterias sulfato-reductoras necesarias

mantenidas en medio Postgate B, de acuerdo al protocolo descrito

anteriormente en el apartado 1.1.2.2 de esta misma sección.

Una vez crecido el cultivo y, antes de utilizarlo en la experiencia, es

necesario retirar el sulfuro que existe en el medio, con el fin de que no se

produzca una precipitación inicial de los metales solubles que se vayan a

suplementar al medio. Para ello se centrifuga (5000 G, 30 min, 20 ºC) o se

filtra a vacío por membrana de 0,22 micras y se resuspende en el volumen

necesario de medio Postgate C fresco

MATERIAL Y MÉTODOS

142

Las disoluciones de los metales objeto del estudio se prepararon a

partir de una disolución stock de 1000 ppm para cada ión metálico con

Cr2(SO4)3, NiSO4 ·6H2O y ZnSO4 ·7H2O, respectivamente, filtrados a vacío por

membranas de 0,22 micras para asegurar su esterilización.

Se prepararon recipientes de vidrio con medio Postgate C estéril a los

que se añadió el volumen de disolución metálica necesario para disponer

de la concentración metálica deseada en cada ensayo. Cada prueba se

realiza por duplicado.

A continuación se burbujeó una corriente de N2 gaseoso durante

unos minutos, y se añadió 5 ml de inóculo a cada prueba manteniendo la

corriente de nitrógeno unos minutos más. Se cerraron herméticamente con

tapón de goma y virola metálica. Los cultivos se incubaron a 30ºC en estufa.

El muestreo se realizó cada 3-4 días extrayendo con aguja y jeringa

1,5-2 ml de cada experimento cuidando de no introducir aire en el bote,

hecho que se evita haciendo pasar la corriente de nitrógeno durante unos

minutos después del muestreo.

De cada muestra se tomó una fracción para la determinación de la

concentración celular, que se diluye si es necesario, y el resto se filtró por

filtro de membrana de 0,22 micras. Al sobrenadante obtenido se le

determinó la concentración de sulfato y se acondicionó para la medida del

ión o iones metálicos que existan en la muestra.

2.6 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO

Para el estudio de la precipitación de iones metálicos en solución

mediante bacterias sulfato-reductoras se procedió a realizar un cultivo

MATERIAL Y MÉTODOS

143

continuo de estas bacterias en un reactor de tanque agitado. El sulfuro de

hidrógeno obtenido se puso en contacto con una disolución metálica de

cromo, níquel y zinc.

El proceso se detalla a continuación y se encuentra representado en

la figura 17.

30ºC 500 rpm

Nitrógeno

Precipitado

sensor pH


Medio Postgate C

D. sp

Figura 17 Sistema empleado para la precipitación de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en solución con un cultivo Desulfovibrio sp. en continuo.

2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp.

Para el crecimiento de este cultivo mixto de Desulfovibrio sp. se utilizó

un reactor de tanque agitado de 800 ml cerrado herméticamente. El

reactor disponía de una entrada para el paso de una corriente de N2

gaseoso que permitió asegurar las condiciones anaerobias necesarias tanto

MATERIAL Y MÉTODOS

144

al inicio como a lo largo de la experiencia cuando se producía algún

cambio que implicase entrada de aire al sistema.

El reactor cuenta además con un sensor de temperatura y un sensor

de pH. La toma de muestra se realizó mediante una jeringa en la

conducción de salida del reactor para evitar la manipulación en el interior

del reactor y la entrada no deseada de aire al sistema.

El cultivo se preparó con 720 ml de medio Postgate C y 72 ml de un

cultivo de Desulfovibrio sp. en fase exponencial de crecimiento. El cultivo se

mantuvo en régimen discontinuo durante dos días y, transcurrido este

tiempo, necesario para el crecimiento de la biomasa hasta la fase

exponencial, se comenzó a operar en régimen continuo con la entrada de

medio Postgate C.

El seguimiento del cultivo continuo se realizó con la medida diaria del

pH, la población bacteriana y la concentración de sulfato.

2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIÓN Para determinar la capacidad para precipitar iones metálicos del

medio generado por las bacterias sulfato-reductoras se preparó una

disolución con los sulfatos comunes de cromo, níquel y zinc hasta obtener

una concentración de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000 ppm de

Zn(II).

Se realizó un seguimiento diario del volumen que se fue descargando

en el reactor de precipitación. En dicho reactor se dispone de un medio

líquido procedente del reactor de crecimiento de las bacterias sulfato-

reductoras, la disolución metálica bajo estudio y una cantidad de

precipitado generado. A una muestra de dicha mezcla se le determinó el

pH, la concentración de sulfato y la concentración de metales en solución.

En aquellos casos en los que se detectó una escasa precipitación, el

MATERIAL Y MÉTODOS

145

volumen recogido en el reactor de precipitación se volvió a reutilizar para

continuar con la precipitación de los metales en solución, a fin de

completar la precipitación total.

2.7 PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIÓN DE At.

ferrooxidans Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO

Para el seguimiento de la dinámica de inmovilización de las bacterias

azufre-oxidantes sobre espuma de poliuretano se realizó un cultivo en

discontinuo, la metodología empleada se representa en la figura 18.

Se emplearon matraces erlenmeyers de 500 ml a los que se le añadió

180 ml de medio 0K ajustado a pH 1,8 para el cultivo At. ferrooxidans o a pH

2,5 para At. thiooxidans. El medio se suplementó con 2 g de azufre

elemental, 1 g de espuma de poliuretano (cubos de 0,5 cm de lado) y 20 ml

de inóculo del cultivo correspondiente en fase exponencial. Los cultivos se

incubaron a 30ºC y 150 rpm. Y cuando alcanzaron un pH de 1, se retiró el

medio filtrando el cultivo por un embudo Buchner y un filtro de papel

Whatman nº4. La espuma retenida se llevó a un nuevo matraz erlenmeyer

estéril y se añadieron 200 ml de medio 0K al mismo pH que en la etapa

inicial y se incubó en las mismas condiciones. Cuando el pH fue 1, se volvió

a repetir el procedimiento pero empleando medio 0K ajustado a pH 4, ya

que este medio será el que se emplee en los procesos de solubilización de

metales con las bacterias inmovilizadas sobre espuma.

MATERIAL Y MÉTODOS

146

30ºC 150 rpm

pH�1

2 g Sº

180 ml medio 0K pH óptimo

20 mlinóculo

30ºC 150 rpm

2 g Sº

200 ml medio 0K pH óptimo

30ºC 150 rpm

pH�1

2 g Sº

200 ml medio 0K pH 4

NUEVO CICLOpH�1

Figura 18: Procedimiento de inmovilización de bacterias azufre-oxidantes sobre espuma de

poliuretano

Los ciclos se continuaron realizando en estas últimas condiciones

hasta observar que la cantidad de biomasa inmovilizada se mantiene

constante al final de cada etapa y que los ciclos tienen una duración

similar. El seguimiento de la experiencia se realizó midiendo diariamente el

pH, la concentración de protones y la concentración de sulfato. Al final de

cada ciclo se determinó la biomasa ocluida y la biomasa retenida en el

soporte.

MATERIAL Y MÉTODOS

147

2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN CONTINUO.

La integración de los procesos de solubilización y precipitación se

llevó a cabo en el sistema experimental descrito en la figura 19. La etapa de

solubilización se desarrolló con un cultivo de At. thiooxidans inmovilizado

sobre espuma de poliuretano. Para ello, se inocularon al 10% dos

erlenmeyers de un litro los cuales contenían 650 ml de medio 0K, 4 g de

cubos de espuma de poliuretano y 6,5 g de azufre elemental. Se realizaron

cuatro ciclos de inmovilización en discontinuo y, a continuación, se

depositaron en una columna de vidrio donde se llevó a cabo el crecimiento

de este cultivo en continuo. Inicialmente la columna se preparó con 7,5 g

de espuma de poliuretano con una densidad celular de 12 Mcel/mg de

espuma sumergidas en 650 ml de medio 0K a pH 4 y con 6,5 g de azufre

elemental.

Figura 19. Esquema del sistema empleado para la integración de los procesos de solubilización y precipitación de cromo, níquel y zinc en continuo.

Una vez que se alcanzó un valor de pH 1 el sistema comenzó a

operar en régimen continuo mediante el uso de una bomba peristáltica de

Aireación

Lixiviado

Medio 0K

Arena contaminada

At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de poliuretano

pH1

30ºC 500 rpm

Nitrógeno

Precipitado

sensor pH


Medio Postgate C

MATERIAL Y MÉTODOS

148

doble cabezal. La alimentación continua consistió en medio 0K a pH 4 y el

aporte de azufre elemental se realizó de forma puntual cuando se detectó

un descenso en la producción de ácido sulfúrico. El efluente procedente de

la columna se hizo pasar a través de una columna de lecho empaquetado

con la arena contaminada. En concreto, la columna se preparó con 50

gramos de una arena que contenía 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg

de Ni(II) y 200 mg de Zn(II). El lixiviado procedente de la columna se recogió

en un erlenmeyer de un litro y, tras tomar muestra, se filtró para eliminar los

posibles sólidos arrastrados del lecho antes de someter esta solución al

proceso de bioprecipitación. Diariamente se siguió el estado del proceso

midiendo el pH, la concentración de protones y la concentración de sulfato

tanto a la salida del reactor como al lixiviado, y a éste también se le

determinó el volumen obtenido y la concentración de los iones metálicos.

La etapa de precipitación se realizó en condiciones similares a las

empleadas en el proceso de precipitación en continuo descrito con

anterioridad en el que se empleaba un lixiviado artificial. Se empleó un

reactor de tanque agitado para el crecimiento del cultivo mixto de

bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio sp., en medio Postgate C. Una vez

obtenido el estado estacionario, el medio procedente del reactor se goteó

sobre un embudo de decantación donde se encontraba la fracción de

lixiviado diaria obtenida de la etapa de solubilización.

Se siguió la concentración celular, el pH y la concentración de sulfato

en el reactor de crecimiento de Desulfovibrio sp. y al volumen de

precipitado obtenido se le determinó el pH, la concentración de sulfato y la

concentración de metales en solución.

D.-RESULTADOS

RESULTADOS

151

1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

1.1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO

Se estudió la solubilización de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II), aislados o

combinados entre sí a dos concentraciones distintas de cada uno de ellos

en presencia de At. ferrooxidans y At. thiooxidans. Se tomaron como

referencia concentraciones de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000

ppm de Zn(II), siendo estos valores los máximos permitidos por la legislación

vigente para lodos que pueden ser aplicables a suelos. Sin embargo, estas

concentraciones pueden resultar tóxicas para los microorganismos, por lo

que se decidió trabajar con el 20% y el 50% de éstas en solución, esto da

lugar a concentraciones que se pueden encontrar de forma habitual en

lodos (Matlakoska y Sklodowska, 2001; Villlar y col. 2001), sedimentos (Chen

y Lin, 2000; Seidel y col. 1998) y suelos (Gómez y Bosecker, 1999)

contaminados. De esta forma, se denominó a estas experiencias como 20 o

50 según el porcentaje de estas cantidades que se encuentran en solución.

Durante la experimentación se siguió la evolución del pH, la

concentración del metal en solución y la concentración de biomasa, la

evolución de las concentraciones de cada uno de ellos se representa en un

mismo gráfico para cada bacteria en presencia de las dos concentraciones

de metal estudiada en cada caso.

Para ambas bacterias se observó que, en presencia de la

concentración menor de cromo y de níquel se produjo un descenso

acusado del pH parejo al cultivo control.

RESULTADOS

152

Figura 20: Fotografía de microscopía electrónica (x 20000) de las bacterias azufre-oxidantes empleadas en el estudio, At. ferrooxidans (izqda.) y At. thiooxidans (dcha.)

En el experimento de At. ferrooxidans en presencia de cromo (III)

(figura 21) se observa una solubilización inicial significativa y luego se

mantiene prácticamente constante durante todo el estudio para las dos

concentraciones estudiadas.

En el caso del experimento AfCr20 se observa un aumento de la

biomasa pasado el tercer día, a partir de este momento se estabiliza la

cantidad de metal solubilizado independientemente de la disminución

progresiva del pH (1,8-0,7) y del crecimiento de la población bacteriana.

Este comportamiento es distinto cuando se trabaja con la concentración

más alta de metal (AfCr50), de tal forma que la biomasa se mantiene en los

valores iniciales, lo que hace pensar que la cantidad de metal solubilizado

al principio, puede inhibir la actividad metabólica de At. ferrooxidans. A

pesar de ello, la cantidad de cromo solubilizado es muy pequeña en ambos

casos (< 2%) y sólo es posible su justificación en base a la baja solubilidad

del óxido de este metal.

RESULTADOS

153

At. ferrooxidans + Cr(III)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0

2

4

6

8

10

12

14

[Cr(

III)]

(ppm

) Mcel/ml AfCr20 Mcel/ml AfCr50[Cr] AfCr20 [Cr] AfCr50

Figura 21: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. ferrooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III)

En la figura 22 se representa la evolución de la concentración

bacteriana y la concentración de Cr(III) en solución para los cultivos de At.

thiooxidans. Al igual que para el experimento con At. ferrooxidans, tan sólo

el cultivo de menor concentración registra un crecimiento apreciable de la

biomasa, llegando a niveles similares de población que éste otro

microorganismo. Este aumento de la biomasa tiene relación directa con el

descenso registrado en el valor del pH (2,0-0,5). En este experimento,

también se observa una solubilización inicial del metal que se mantiene

prácticamente constante a lo largo del tiempo.

RESULTADOS

154

At. thiooxidans + Cr(III)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0

2

4

6

8

10

12

14

16

[Cr(

III)]

(ppm

)

Mcel/ml AtCr20 Mcel/ml AtCr50[Cr] AtCr20 [Cr] AtCr50

Figura 22: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. thioooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III)

Por tanto, se puede decir que, a las concentraciones ensayadas, At.

thiooxidans no es capaz de solubilizar el óxido de cromo presente en el

medio.

Las figuras 23 y 24 representan la evolución del proceso de

solubilización de Ni(II) por At. ferrooxidans y At. thiooxidans,

respectivamente. Así, en el caso de At. ferrooxidans se puede observar que

la presencia de la menor concentración de níquel no afecta al crecimiento

de esta especie bacteriana ya que, tras una fase de latencia de 3 días, se

observa un crecimiento exponencial del cultivo. Este aumento se

corresponde con un descenso en el pH (1,8-0,6) y un aumento gradual en la

solubilización del sulfuro metálico.

RESULTADOS

155

At. ferrooxidans + Ni(II)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0

5

10

15

20

25

30

35

40

[Ni(I

I)] (p

pm)

Mcel/ml AfNi20 Mcel/ml AfNi50[Ni] AfNi20 [Ni] AfNi50

Figura 23: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. ferrooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II)

La cantidad final solubilizada fue mayor de 17,5 ppm, lo que supone

un 22,1% del metal agregado. Por el contrario, la concentración mayor de

níquel estudiada afecta claramente al crecimiento celular, de tal forma que

ni el pH ni la biomasa varían con respecto a los valores iniciales y la

cantidad de metal solubilizada inicialmente se mantiene constante.

RESULTADOS

156

At. thiooxidans + Ni(II)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0

10

20

30

40

50

60

[Ni(I

I)] (p

pm)

Mcel/ml AtNi20 Mcel/ml AtNi50[Ni] AtNi20 [Ni] AtNi50

Figura 24 Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. thiooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II)

En los experimentos realizados con At. thiooxidans se puede observar

un comportamiento similar, de modo que con la menor concentración de

sulfuro, se registra un crecimiento microbiano importante, mientras que la

concentración de biomasa permanece prácticamente invariable cuando

se encuentra presente una mayor concentración del sulfuro (AtNi50). De

esta forma, se puede llegar a registrar una solubilización del 21,7% de Ni(II)

para el caso de AtNi20, mientras que en el experimento de mayor

concentración, la solubilización que se consigue es la inicial del sulfuro

(16,7%) permaneciendo invariable con el tiempo.

En las figuras 25 y 26, se muestra la evolución de los distintos

parámetros seguidos para las experiencias en presencia de sulfuro de zinc.

RESULTADOS

157

En general, se puede decir que la presencia del zinc inhibe la actividad

bacteriana, ya que se registran fases de latencia un poco más acusadas

que para el resto de los compuestos metálicos ensayados. Este

comportamiento puede tener su explicación en una mayor solubilidad

inicial del sulfuro de zinc, de tal forma, que en las primeras horas de cultivo

se pueden alcanzar valores de 600 - 900 ppm de Zn(II) en solución para los

experimentos con At. ferrooxidans y 600 – 700 ppm de Zn(II) para los cultivos

de At. thiooxidans, de tal forma que nos encontramos ante elevadas

concentraciones del metal en solución que provocan la inhibición parcial o

total de la actividad bacteriana. Este hecho no ocurre en los ensayos con

compuestos de cromo o níquel ya que la solubilización propia de éstos no

llega a superar tales niveles de solubilización inicial, principalmente porque

la cantidad aportada de estos metales es mucho menor.

At. ferrooxidans + Zn(II)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0

200

400

600

800

1000

1200

[Zn(

II)] (

ppm

)

Mcel/ml AfZn20 Mcel/ml AfZn50[Zn] AfZn20 [Zn] AfZn50

Figura 25 Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. ferrooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II)

RESULTADOS

158

De las dos cepas ensayadas, At. ferrooxidans es más sensible a la

presencia de Zn en solución, ya que no se registra crecimiento para el caso

del 50%, mientras que si es posible encontrar un aumento de la población

bacteriana para At. thiooxidans. Esta evidencia tiene una relación directa

con el grado de solubilización, de tal forma, que se registran valores de

78,4% y 43% para las dos concentraciones estudiadas en los cultivos de At.

thiooxidans.

Una vez que se estudiaron los comportamientos de las dos cepas

frente a cada uno de los compuestos metálicos de forma individual, el

siguiente paso en la experimentación fue determinar la influencia que tiene

la presencia de los compuestos de cromo (III), níquel (II) y zinc (II) de forma

conjunta para acercarnos a lo que puede ocurrir de forma natural en un

residuo contaminado

At. thiooxidans + Zn(II)

0

100

200

300

400

500

600

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

[Zn(

II)] (

ppm

)

Mcel/ml AtZn20 Mcel/ml AtZn50[Zn] AtZn20 [Zn] AtZn50

Figura 26: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. thiooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II)

RESULTADOS

159

En cuanto al comportamiento de At. ferrooxidans en presencia de la

mezcla de metales, la tendencia está claramente condicionada por la

presencia de zinc. De tal forma que, para el caso de las experiencias con el

20% de cada cantidad referencia de metal (figura 27), se obtuvo un

crecimiento celular importante a partir del décimo día de incubación y,

para el caso de las experiencias con 50% no se detectó crecimiento

microbiano relevante (figura 28).

At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%)

0

100

200

300

400

500

600

700

0 5 10 15

Tiempo (días)

Mce

l/ml -

[Zn(

II)] (

ppm

)

0

5

10

15

20

25

[Cr(

III)]

, [N

i(II)]

(ppm

) - p

H

Mcel/ml [Zn] [Cr] [Ni] pH

Figura 27: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones máximas, 300ppm de Cr(III), 80 ppm de Ni(II) y 800 ppm de Zn(II)).

RESULTADOS

160

At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15

Tiempo(días)

Mce

l(ml)

- [Zn

(II)]

(ppm

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[Cr(

III)]

, [N

i(II)]

(ppm

) - p

H

Mcel/ml [Zn] pH [Cr] [Ni]

Figura 28: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones máximas, 750ppm de Cr(III), 200 ppm de Ni(II) y 2000 ppm de Zn(II))

Si se comparan los porcentajes de solubilización de estas

experiencias, se puede comprobar que se encuentran en el mismo nivel a

los obtenidos de forma individual. Es decir, que la presencia de varios tipos

de compuestos metálicos en el medio no afecta de forma significativa al

comportamiento de estas cepas.

At. thiooxidans se comporta de manera similar, la combinación de

metales parece que no afecta al porcentaje de solubilización final y la

evolución del crecimiento celular (figuras 29 y 30) fue pareja a la vista para

At. thiooxidans en presencia de zinc.

RESULTADOS

161

At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%)

0

100

200

300

400

500

600

700

0 5 10 15

Tiempo (días)

Mce

l/ml -

[Zn(

II)] (

ppm

)

0

5

10

15

20

25

[Cr(

III)]

, [N

i(II)]

(ppm

) - p

HMcel/ml [Zn] [Cr] [Ni] pH

Figura 29: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones máximas, 300ppm de Cr(III), 80 ppm de Ni(II) y 800 ppm de Zn(II))

Con el objetivo de comparar los resultados obtenidos mediante

solubilización biológica con aquellos que pueden obtenerse por métodos

químicos, se llevo a cabo la digestión ácida de cantidades iguales de los

compuestos metálicos empleados en 100 ml de medio 0K a pH 4. Tras la

adición de ácido nítrico y ácido clorhídrico, se llevó la mezcla a ebullición,

tal como se describe en el apartado de Material y Métodos de la presente

memoria Los resultados también se compararan con la solubilización

obtenida por un control estéril realizado con medio 0K ajustado a pH 1,8

para una composición de metales igual a la estudiada con las bacterias. En

la tabla 22 se puede muestran los porcentajes de solubilización obtenidos

con el cultivo At. ferrooxidans, el cultivo At. thiooxidans, la debida al ataque

RESULTADOS

162

con ácidos fuertes y la obtenida con el control estéril para una mezcla

metálica de cromo, níquel y zinc.

At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%)

0

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15

Tiempo(días)

Mce

l(ml)

- [Zn

(II)]

(ppm

)

0

10

20

30

40

50

60

[Cr(

III)]

, [N

i(II)]

(ppm

) - p

H

Mcel/ml [Zn] pH [Cr] [Ni]

Figura 30: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones máximas, 750ppm de Cr(III), 200 ppm de Ni(II) y 2000 ppm de Zn(II))

Modo de Solubilización Cr2O3 NiS ZnS

At. ferrooxidans 1,13 (1,5%) 4,52 (22,6%) 106,5 (53,25%)

At. thiooxidans 1,01 (1,35%) 4,85 (24,25%) 110 (55%)

Digestión ácida 1,12 (1,49%) 18,51 (92,5%) 168,9 (84,45%)

Control pH 1,8 1,14 (1,51%) 2,21 (11,05%) 42,22 (21,11%)

Tabla 22:. Cantidad en mg y porcentaje (%) de cada metal solubilizado de una combinación de compuestos metálicos (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II) en 100 ml de medio 0K) por At. ferrooxidans, At. thiooxidans, digestión ácida y control ésteril a pH 1,8 l.

RESULTADOS

163

Como se puede observar la solubilización del cromo(III) es

prácticamente igual independientemente del método empleado. Este

hecho se debe, fundamentalmente, a la insolubilidad característica del

óxido de cromo empleado, ya que éste presenta una elevada resistencia a

su disolución en presencia de una gran variedad de agentes químicos.

Por el contrario, el ataque químico con ácidos fuertes permite una

elevada solubilización del sulfuro de níquel (92,5%) y del sulfuro de zinc

(84,45%) frente a la obtenida por un método biológico. No obstante, el

porcentaje de solubilización biológica obtenidos para las dos bacterias

empleadas permite reducir en gran medida el contenido metálico de

ciertos residuos hasta alcanzar niveles aceptables para ser depositados o

reutilizados según la legislación. Al mismo tiempo, la solubilización de níquel

y zinc con medio a pH 1,8 es mucho menor a la obtenida en los demás

casos, pero permite asegurar que una proporción del metal solubilizado se

debe a la acción de los compuestos del medio ácido generado por las

bacterias azufre-oxidantes.

Por tanto, cuando se desea llevar a cabo la solubilización de los

metales presentes en un medio contaminado, existe la necesidad de

realizar una evaluación de las ventajas e inconvenientes que presenta cada

una de ellas en función de la cantidad de metal que se desea solubilizar y

del uso posterior que se le quiera dar al residuo. De esta forma, si mediante

una técnica de tipo químico nos podemos asegurar un elevado grado de

solubilización, su aplicación resulta mucho más costosa y genera un ataque

más agresivo al medio ambiente que mediante la aplicación de una

técnica de tipo biológico. En ese sentido, para concentraciones bajas de

los metales ensayados, la solubilización biológica se presenta como una

alternativa viable y de menor coste económico y ambiental que la digestión

RESULTADOS

164

ácida, ya que no requiere del uso de compuestos químicos ni de un aporte

energético.

Los resultados de solubilización en este estudio son menores a los

obtenidos por Villar y col. (2001). Estos autores estudiaron la lixiviación de los

metales presentes en lodos anaerobios mediante un cultivo indígena de

bacterias azufre-oxidantes en cultivo discontinuo. El lodo empleado

contenía concentraciones de cromo, níquel y zinc dentro del rango de las

concentraciones consideradas en el presente trabajo (685 mg Cr(III)/kg, 38

mg Ni(II)/kg y 888 mg Zn(II)/kg). En dicho trabajo se calcula la eficacia de

solubilización (r) como la razón entre la cantidad de metal disuelto y la

cantidad de metal total en el lodo.

total metal mgdisuelto metal mg

=r

El cálculo de este término permite hallar la constante de velocidad

de solubilización del metal (k (d-1)) asumiendo una cinética de solubilización

de primer orden.

ktrktdt

rd−=−→−=

−)ln(

)(1

1

La pendiente de la representación de ln(1-r) en función del tiempo

proporciona el valor de la constante k. En la tabla 23 se presentan los

valores de la constante de velocidad y el porcentaje de solubilización para

cada metal para la experiencia a 30ºC llevada a cabo por Villar y

colaboradores, a las concentraciones que más se asemejan a las

empleadas en el presente trabajo.

RESULTADOS

165

metal k (d-1) % solubilización

Cromo 0,125 40

Níquel 0,377 64

Zinc 1,000 80

Tabla 23: Constante y porcentaje de solubilización de los metales presentes en un lodo presentados por Villar y col. (2001)

De igual manera se realizó el cálculo de estas constantes para cada

una de las experiencias realizadas en este trabajo, tanto para At.

ferrooxidans como para At. thiooxidans, dichos valores se presentan en la

tabla 24 junto a los porcentajes de solubilización. Dado que la mayor

solubilización ocurre en los primeros 3 días se calculó la velocidad en este

periodo y, por ello, se presenta el porcentaje de solubilización a los 3 días y

al final del proceso (día 14).

Si se realiza la comparación entre los resultados obtenidos se observa

que las constantes de velocidad obtenidas en este estudio son siempre

menores a las obtenidas en el experimento con lodos. Este hecho se debe

principalmente a que en ocasiones la cantidad de metal dispuesta para

solubilizar es mayor, el compuesto de cromo empleado para el estudio de

solubilización en el presente trabajo destaca por su baja solubilidad incluso

en condiciones ácidas extremas y, por otra parte, el cultivo empleado por

Villar y colaboradores se constituye de un consorcio de bacterias azufre-

oxidantes aislado del propio lodo y, por tanto, habituadas a la presencia de

los metales existentes en el lodo. En cuanto al porcentaje de solubilización,

sólo en el caso del zinc, se obtienen valores similares a los encontrados por

Villar y col. (2001), la insolubilidad del óxido de cromo y una mayor cantidad

de níquel suplementada en el presente trabajo dan lugar a unos

porcentajes mucho más bajos. El grado de solubilización obtenido coincide

con los resultados presentados por otros autores (Chen y Lin, 2000; Xiang y

RESULTADOS

166

col. 2000; Krebs y col. 2001), de tal forma que la solubilización es mayor para

el ion zinc, en menor extensión para níquel y luego para cromo, el cual

muestra mucha resistencia a la biolixiviación.

At.

ferrooxidans % solubilización

At.

thiooxidans % solubilización

Experiencia Metal k(d-1 ) día 3 día 14 k(d-1 ) día 3 día 14

Cr20 0,002 1,2 1,25 0,0015 1,06 1,38

Cr50 Cr

0,0023 1,68 1,73 0,0016 1,62 1,86

Ni20 0,051 16,5 22,07 0,051 15,96 21,74

Ni50 Ni

0,055 16,65 18,42 0,077 21,98 24,48

Zn20 0,472 76,56 80,81 0,391 70,25 78,38

Zn50 Zn

0,182 43,16 48,63 0,127 32,95 43,05

Cr 0,027 0,93 0,98 0,0018 1,29 1,31

Ni 0,0504 16,36 25,71 0,046 16,55 25,54 M20

Zn 0,432 74 76,94 0,426 73,43 78,81

Cr 0,003 1,53 1,51 0,0027 1,31 1,36

Ni 0,583 18,98 22,62 0,069 21,62 24,28 M50

Zn 0,187 44,38 53,25 0,138 35,1 55

Tabla 24: Constante y porcentaje de solubilización de cada uno de los metales para las distintas experiencias de solubilización con At. ferrooxidans y At. thiooxidans.

Hasta el momento se ha estudiado el comportamiento de las

bacterias con los metales presentes en forma de compuestos insolubles en

el medio de crecimiento, sin embargo, para acercarnos un paso más a la

configuración de un suelo o lodo contaminado real, es necesario que estos

sulfuros se encuentren confinados en una matriz sólida. En este sentido, se

realizó un estudio en el que se preparó una arena contaminada con los

mismos compuestos metálicos en la misma proporción que los experimentos

anteriores y, ésta se agregó al medio de cultivo de ambas cepas para el

seguimiento de la solubilización.

La primera consecuencia de la adición de arena es el aumento del

pH inicial en torno a 2,5 - 3, sensiblemente superior a las experiencias

RESULTADOS

167

realizadas sin la presencia de arena. Además, transcurridos 3 días de

incubación, se produce la solubilización de algunos componentes de la

arena ya que se registra una alcalinización del medio y el pH se sitúa en un

rango de entre 7 y 8,5. En estas condiciones, nos encontramos añadiendo

una variable adicional y las bacterias no pueden crecer ni realizar su

actividad oxidativa debido a su carácter acidófilo. Por tanto, no se observó

ningún tipo de solubilización de los iones metálicos presentes. Los resultados

indicaron la imposibilidad de poder solubilizar los compuestos metálicos

tomados empleando arena como soporte. Se puede pensar que un mayor

tiempo de contacto entre bacteria y metal podría llevar a la acidificación

del medio para bajas concentraciones de metal.

Por tanto, se puede concluir que la solubilización de metales en

forma de compuestos insolubles, tanto libres como alojados en una matriz

de un soporte (como la arena) que puedan interferir en la actividad

metabólica de estas bacterias, sería más conveniente realizarlo de forma

indirecta, es decir, creciendo el cultivo de las bacterias en su medio de

crecimiento óptimo con azufre como fuente de energía. A continuación, se

utiliza el medio ácido generado en el metabolismo microbiano para ponerlo

en contacto con el residuo sólido donde se encuentre el metal objeto de

lixiviación.

RESULTADOS

168

1.2 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At.

thiooxidans EN CONTINUO

Para el estudio de solubilización de cromo, níquel y zinc por la acción

de At. thiooxidans en continuo se empleó un cultivo de este microorganismo

crecido en un reactor de tanque agitado y cuyo medio, una vez alcanzado

un pH igual a 1, se hacía pasar a través de una columna de lecho fijo con

una arena contaminada por estos metales. El sistema empleado se muestra

en la figura 31.

Figura 31: Sistema empleado para la solubilización continua de una arena contaminada de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) mediante el medio ácido generado por At. thiooxidans crecido en cultivo sumergido.

Inicialmente, el crecimiento de At. thiooxidans (figuras 32 y 33) en

cultivo sumergido se mantuvo 3 días en régimen discontinuo hasta alcanzar

un pH de 0,99 (800 Mcel/ml, 0,23 g H+/l, 15,5 g SO4=/l) y, a partir de ese

RESULTADOS

169

momento, se comenzó a trabajar con alimentación continua. Inicialmente

se estableció un caudal de 12 ml/h, que resultó muy bajo, y provocó gran

inestabilidad en el cultivo, de forma que se llegaron a alcanzar valores de

pH por debajo de 1 y grandes fluctuaciones en la población celular. Sin

embargo, a partir de los 12 días, el pH del cultivo se estabilizó en un valor

próximo a 1 y una población de 300 Mcel/ml, para un caudal de 15 ml/h

(THR 2,2 días). Esta situación se mantuvo, hasta que la población subió en el

día 30 de operación hasta un valor de 700 Mcel/ml, sin que hubiese ningún

otro cambio aparente, posiblemente por una adaptación del cultivo a las

condiciones de operación. De cualquier forma, esta nueva situación

termina en un nuevo estado estacionario que resulta adecuado para el

objetivo que se persigue en esta experiencia. En ambos casos, se puede

observar que se trabaja en régimen de estado estacionario, ya que el resto

de parámetros (concentración de sulfato y protones) también permanecen

en valores casi constantes durante los períodos anteriormente reseñados.

0200400600800

10001200

14001600

0 10 20 30 40

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0

0.5

1

1.5

2

2.5

pH

Mcel/ml pH

Figura 32: Seguimiento de la población bacteriana y el pH en el reactor de At. thiooxidans.

RESULTADOS

170

0

5

10

15

20

0 10 20 30 40

Tiempo (días)

[SO

4=] g

/l

00.050.10.150.20.250.30.350.4

[H+]

g/l

[SO4] [H+] g/l

Figura 33: Seguimiento de la concentración de sulfato y de protones en el reactor de At. thiooxidans.

El medio ácido generado en este reactor se empezó a circular a

través de la columna una vez alcanzado el estado estacionario en el

reactor de At. thiooxidans. Inicialmente, el lixiviado obtenido presentó un pH

básico debido a la alcalinidad de la arena, y a medida que fue pasando el

medio ácido por el lecho se produjo la neutralización de los compuestos del

residuo hasta alcanzar un pH menor a 1, cuando se había obtenido un

volumen de lixiviado de 600 ml.

De esta forma, mientras el lixiviado obtenido fue básico, no se

observó solubilización alguna de zinc, sin embargo fue más significativa para

el níquel, alcanzando su concentración máxima, y también se observó

solubilización del cromo (figura 34). Una vez que el pH fue menor a 2, se

incrementó considerablemente la lixiviación del zinc, alcanzándose una

concentración máxima de 186,8 ppm. Pasados 5 litros de medio ácido, la

cantidad lixiviada de este metal fue insignificante.

RESULTADOS

171

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12

Volumen de liviviado (l)

[Cr(

III)]

, [N

i(II)

] y

pH

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

[Zn

(II)

]

[Cr(III)] [Ni(II)] pH [Zn(II)]

Figura 34: Concentración de los iones metálicos en el volumen de total de lixiviado.

En este período de solubilización de zinc, se solubilizó una pequeña

fracción de cromo y níquel que permanecieron prácticamente constantes

en un rango entre 1-3 ppm. Cuando el volumen de lixiviado obtenido

alcanzó los 4,5 litros se registró un incremento notable de la lixiviación de los

tres metales estudiados. Este hecho no se observó en otros experimentos

posteriores de solubilización continua llevados a cabo en este trabajo, con

el mismo tipo de residuo aunque en distintas condiciones de producción de

ácido y cantidad de metal. Por tanto, esta anomalía pudo deberse a que la

compactación de la arena hizo que se formaran caminos preferenciales del

medio ácido a través del lecho, de modo que, a partir de un momento, al

producirse la solubilización de algunos compuestos se redujo la

compactación del lecho facilitándose así el contacto del medio ácido con

otra porción aún muy rica en metal y, por tanto, la lixiviación de una gran

proporción del metal presente. Este comportamiento viene a resaltar la

necesidad de una adecuada homogeneización previa del residuo a tratar

para evitar cambios indeseables en el proceso de solubilización.

RESULTADOS

172

En la última fase del proceso se registró la lixiviación del cromo,

principalmente, ya que es el metal que aun quedaba en mayor cantidad,

la concentración máxima de este metal en el lixiviado se mostró una vez

obtenidos 4,5 litros de lixiviado.

Finalmente, y tras hacer pasar 11,4 litros de medio ácido se obtuvo

una elevada solubilización de todos los metales: 55,4% de Cr(III), 100% de

Ni(II) y 100% de Zn(II).

Como se puede observar, el procedimiento seguido es adecuado

para llevar a cabo la solubilización de los metales estudiados cuando éstos

se encuentran presentes en medios contaminados, pero esto implica el

consumo de un elevado volumen de ácido y, para ello, el mantenimiento

de un cultivo de bacterias azufre-oxidantes en continuo durante unos 40

días. Cabe resaltar que, en la etapa final del proceso la cantidad de metal

solubilizado fue bastante baja a pesar del volumen de ácido invertido en el

proceso. Por tanto, habría que llegar a una situación de compromiso entre

la cantidad de metal solubilizado y el consumo de medio ácido de modo

que el proceso resulte viable, siempre que se consiga un residuo con

concentraciones permitidas por la legislación con el menor consumo de

medio ácido posible.

En este punto, sería necesario realizar una valoración técnica y

económica del proceso de solubilización continua de los metales presentes.

Por un lado, estimar económicamente el medio ácido necesario para llegar

a los niveles de solubilización deseados y establecer una comparación

respecto a la utilización de ácido obtenido por vía química, para

determinar la viabilidad económica del proceso. Por otro lado, habría que

estudiar la componente ambiental del proceso, de tal forma que se pueda

valorar la incidencia sobre el medio ambiente de un medio ácido generado

por un proceso biológico frente a un medio ácido mineral. De cualquier

RESULTADOS

173

forma, este aspecto se escapa de los objetivos planteados en este trabajo y

sería necesario realizar un estudio más detallado que permitiera llegar a

conclusiones adecuadas.

En general, la obtención biológica de ácido sulfúrico a partir de una

fuente relativamente barata, el azufre elemental, resulta económicamente

favorable frente al tratamiento con soluciones concentradas de ácido

sulfúrico, ya que se reducen los costes de obtención y transporte del ácido

y, a su vez, su impacto ambiental. Además, el pH en el medio de

crecimiento de la bacteria desciende gradualmente, de modo que, los

metales presentes en el medio pasan a solución a diferentes velocidades en

función de sus solubilidades, permitiendo así ser separados de la solución de

forma selectiva.

Al mismo tiempo, en este proceso se ha utilizado un reactor continuo

con la biomasa en suspensión y sería más adecuado, para favorecer la

generación de medio ácido por parte de las bacterias azufre-oxidantes, la

inmovilización de las bacterias en un soporte inerte, ya que esta operación

permite una mayor concentración de la población celular, un menor riesgo

de lavado celular, por lo que se puede trabajar a mayores velocidades de

dilución, y una menor influencia de los cambios de las condiciones externas

sobre el crecimiento del cultivo.

RESULTADOS

174

2 REDUCCION DEL Cr(VI)

2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIÓN DEL Cr(VI) EN DISCONTINUO

Como ya se ha reseñado en los antecedentes de la presente

memoria, en aquellos residuos que se encuentra contaminación por cromo

éste suele estar presente tanto en forma hexavalente como trivalente. Por

tanto, dada la alta toxicidad que presenta la primera de las formas

mencionadas se hace necesario disponer de algún tratamiento que

permita la reducción del Cr(VI) a Cr(III) para su posterior eliminación del

residuo contaminado. En este sentido, y aprovechando la habilidad que

tienen las bacterias acidófilas del género Acidithiobacillus para tolerar y

reducir el cromo hexavalente, se programaron una serie de experiencias

con Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para

determinar los niveles de tolerancia a este iónde estas bacterias en régimen

discontinuo y, posteriormente, se aplicó esta propiedad para el tratamiento

de un residuo de cromo en régimen continuo.

Para estudiar la tolerancia al cromo (VI) y la capacidad de reducción

de este ión por parte de las bacterias azufre-oxidantes, se cultivó a At.

ferrooxidans y At. thiooxidans en presencia de varias concentraciones de

cromo hexavalente (1, 2,5, 5 y 10 ppm), mediante la adición de una

disolución de dicromato potásico. Al mismo tiempo, se preparó un control

estéril con una concentración de 10 ppm de este ión metálico para su

comparación con los cultivos bacterianos y poder discernir la posible

influencia de un mecanismo químico de reducción. Durante toda la

experimentación se siguió la evolución del pH, la concentración de

biomasa total y la concentración de cromo (VI) en solución.

RESULTADOS

175

Analizando el comportamiento de At. ferrooxidans frente a las

distintas concentraciones de cromo (VI) (figura 35), se puede observar que

la presencia de concentraciones menores de 5 ppm de Cr (VI) no afectan

significativamente al crecimiento microbiano, de tal forma que se pueden

alcanzar concentraciones microbianas similares al cultivo control sin

presencia de metal. Así, para una concentración mayor de 5 ppm se

observa un cierto grado de inhibición (se alcanza un 70% menos de

concentración bacteriana), aunque sí es posible registrar un alto grado de

reducción del Cr(VI) con un desfase de 48 horas respecto a las

concentraciones menores ensayadas. En presencia de 10 ppm de cromo

(VI), no se observa crecimiento celular y el pH permanece constante, lo cual

indica inhibición total de la actividad bacteriana, ya que no se observó

aumento de la concentración de protones en el medio y, por tanto,

oxidación del azufre suplementado.

Para las menores concentraciones ensayadas (1 y 2,5 ppm) se

registró una reducción completa del Cr(VI) en 24 horas, y hasta que no se

reduce todo el cromo no se observa descenso del pH, debido a la

oxidación de azufre y, por tanto, un aumento del crecimiento bacteriano.

Este hecho coincide con el observado por Sisti y col. (1998), quienes

recogen este hecho experimental, de tal forma que el crecimiento

bacteriano se empieza a detectar de forma considerable cuando

desaparece la presencia del cromo (VI) y comienza el mecanismo de

oxidación del azufre coloidal presente en el medio de cultivo.

Todos los experimentos realizados se detuvieron tras 11 días de cultivo,

bien porque se registró un descenso acusado del pH para aquellos que

habían conseguido la reducción del cromo (VI), o bien porque no se registró

actividad microbiana tras este tiempo de cultivo.

RESULTADOS

176

Figura 35:Evolución del pH (a), población bacteriana (b) y concentración de Cr(VI) (c) pra At. ferrooxidans

(a) pH

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 8 10 12

pH

Af

Af1

Af2,5

Af5

Af10

C10

(b) Población bacteriana

0

200

400

600

800

1000

1200

0 2 4 6 8 10 12

Mce

l/ml

(c) Concentración de Cr(VI)

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

[Cr(

VI)

] (p

pm

)

RESULTADOS

177

Cabe resaltar que no se produce reducción del cromo (VI) de tipo

químico ya que el cultivo estéril a 10 ppm de este metal, se mantuvo en los

niveles iniciales y además no registró descenso del pH.

Esta misma experiencia se realizó con At. thiooxidans y la

representación de cada uno de los parámetros medidos se recoge en la

figura 36. A diferencia de los cultivos con At. ferrooxidans, se puede observar

que At. thiooxidans es un poco más sensible a la presencia de cromo (VI),

ya que aunque para el cultivo con la menor concentración se puede

registrar un comportamiento similar al observado para At. ferrooxidans, con

una reducción total y crecimiento similar, para las concentraciones

superiores se observa un comportamiento distinto. De esta forma, para una

concentración de 2,5 ppm de Cr(VI) se observa una fase de latencia de 96

horas, a pesar de que se puede conseguir la reducción completa del cromo

(VI) a las 24 horas de cultivo.

At. thiooxidans es inhibido notablemente por 5 ppm de Cr(VI), ya que

se puede observar una reducción inicial del 50% de la concentración a las

48 horas del cultivo, manteniéndose prácticamente constante en este nivel

hasta los 11 días de cultivo. Al mismo tiempo, no se observó un crecimiento

celular significativo, ni tampoco un descenso en el valor del pH. Por tanto, se

puede decir que, aunque la población bacteriana inicial del cultivo tiene

capacidad de reducción del cromo (VI) presente, no es capaz de continuar

dicha reducción hasta el 100% porque se encuentra inhibido el crecimiento

microbiano por la presencia del metal. Este misma discusión sería aplicable

al cultivo con 10 ppm de cromo (VI), ya que se registra un leve descenso de

la cantidad de cromo (VI) a las 24 horas de cultivo, pero no se detectó

crecimiento microbiano alguno debido a la inhibición completa de la

actividad bacteriana que se mantiene constante durante todo el tiempo de

cultivo.

RESULTADOS

178

Figura 36: Evolución del pH. (a), población bacteriana (b) y concentración de Cr(VI) (c) para At. thiooxidans

(a) pH

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12

pH

AtAt1At2,5At5At10C10

(b) Población bacteriana

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 6 8 10 12

Mce

l/ml

(c) Concentración de Cr(VI)

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

[Cr(

VI)

] (p

pm

)

RESULTADOS

179

Por tanto, a la vista de los resultados obtenidos en estos experimentos,

se puede concluir que ambas especies bacterianas tienen una respuesta

similar a la presencia de este ión aunque no presentaron igual nivel de

tolerancia. Los datos obtenidos se resumen en la tabla siguiente:

Tabla 25: Porcentaje de reducción del Cr(VI) para At. ferrooxidans y At. thiooxidans y tiempo empleado para obtener el nivel de reducción indicado

En el trabajo llevado a cabo por Quintana y col. (2001) se estudió la

reducción de una solución de 10 ppm de Cr(VI) a partir del medio

generado por un cultivo discontinuo de At. ferrooxidans. El proceso se realizó

de forma indirecta, sin poner en contacto la bacteria con el cromo

hexavalente, los compuestos reductores generados y adheridos al azufre

coloidal se hicieron pasar sobre la solución de cromo(VI). Este modo de

trabajo permitió una mayor reducción, obteniéndose para pH 2 una

reducción del 45%.

En un estudio realizado por Viera y col. (2003) de forma similar pero en

este caso con At. thiooxidans, se obtuvo la reducción de aproximadamente

el 60% del cromo(VI) para una solución de 10 ppm. No obstante, el volumen

de disolución tratada en cada caso fue de 5 y 20 ml respectivamente, con

lo que la cantidad total de cromo reducido es menor que en el presente

Experiencia % Cr(VI)

reducido

Tiempo

(días)

Af1 100 1

Af2,5 100 1

Af5 100 2

Af10 32,69 11

At1 100 1

At2,5 100 1

At5 64,7 11

At10 16,53 11

C10 1,53 11

RESULTADOS

180

trabajo, pero, por otra parte, estos estudios presentan como ventaja el poco

tiempo de contacto necesario para llevar a cabo estos niveles de

reducción, que fue tan sólo de unos minutos.

Los resultados encontrados en la bibliografía acerca de la reducción

de forma indirecta del cromo (VI) con el medio generado por la bacterias

del género Acidithiobacillus, así como la baja tolerancia de estas bacterias

al cromo hexavalente hace pensar en la conveniencia de diseñar procesos

de reducción de este ión de forma indirecta, donde se puedan aprovechar

la capacidad para generar compuestos reductores y para reducir este ión

de dichas bacterias sin dañar su metabolismo celular. Con dicho objetivo, se

procedió al desarrollo de un sistema en régimen continuo y de contacto

indirecto entre el medio generado por las bacterias y el concentrado de

cromo.

RESULTADOS

181

2.2 REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO

El objetivo de esta experiencia fue aplicar la capacidad de las

bacterias azufre-oxidantes para reducir el Cr(VI) a Cr(III), y, a su vez,

solubilizar el Cr(III), presente en forma insoluble, de un residuo operando en

régimen continuo. El sistema empleado se muestra en la figura 37.

Figura 37: Sistema empleado para la reducción de Cr(VI) y solubilización de Cr(III) de un residuo por la acción de At. thiooxidans inmovilizado sobre azufre elemental.

Para llevar a cabo este proceso se inmovilizó At. thiooxidans sobre

azufre elemental siguiendo el proceso descrito en la sección de Material y

Métodos de esta memoria. El uso de esta bacteria permite la producción de

RESULTADOS

182

un medio con mayor concentración de protones y en menor tiempo que At.

ferrooxidans, lo cual resulta ventajoso para la solubilización del Cr(III).

Se inoculó al 10% el medio 0K presente en la columna con un cultivo

At. thiooxidans en la fase exponencial de crecimiento y se realizaron varios

ciclos de inmovilización para asegurar una elevada concentración celular.

La finalización de cada ciclo se estableció cuando el pH en el reactor

alcanzó un valor próximo a 1, momento en el que se renovó el medio.

Después de varios ciclos de inmovilización, se consideró que la formación

de la biopelícula era estable cuando la concentración de protones y la

población celular en suspensión permanecieron constantes tras cada ciclo.

Los intervalos de tiempo en los que no se estuvo incorporando

alimentación a la columna, se trabajó en régimen discontinuo con

recirculación del medio para proporcionar homogeneidad y favorecer el

acceso del medio a todas las partículas de azufre contenidas en ésta.

En la figura 38 se presentan los valores de pH y población celular

durante toda la etapa de inmovilización. Como se puede observar, se

necesitaron 250 horas de operación para alcanzar una población celular

estable cercana a los 300 Mcél/ml en la columna. Alcanzado el estado

estacionario, se continuó operando por cargas, de tal forma que cuando el

pH era menor o igual a 1, se procedía a la descarga del medio y la carga

posterior con medio 0K hasta conseguir nuevamente un pH de 1

RESULTADOS

183

0

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300

Tiempo (horas)

Mce

l/ml

0

0,5

1

1,5

2

2,5

pH

Mcel/ml pH

Figura 38: Evolución del crecimiento bacteriano de At. thiooidans inmovilizado sobre partículas de azufre

El medio descargado de la columna de inmovilización se hizo pasar

por otra columna donde se encontraba un residuo que contenía cromo

trivalente y hexavalente. Los resultados obtenidos en la etapa de

reducción/solubilización del cromo se representan en la figura 39.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Volumen de lixiviado (ml)

[Cr(

III)]

(g/l)

pH

0

2

4

6

8

10

12

14

16

[Cr(

VI)]

(mg/

l)

pH [Cr(III)] g/l [Cr(VI)] mg/l

Figura 39 Evolución del pH y concentración de Cr(III) y Cr(VI) en el lixiviado obtenido en función del volumen de medio ácido pasado a través de la columna de residuo

RESULTADOS

184

Inicialmente el medio ácido provocó dos efectos:

• Se produjo la disminución de la alcalinidad propia del residuo.

El medio ácido puede solubilizar los compuestos arcillosos que

forman parte del residuo, pero el pH se mantiene en valores

elevados y en estas condiciones no se aprecia solubilización

del Cr(III).

• La salida presenta una concentración significativa de Cr(VI), y

por tanto, este hecho indica un tiempo insuficiente de

contacto entre el medio y el residuo para que se lleve a cabo

la reducción o bien que la concentración de azufre coloidal y,

por tanto, de compuestos reductores, no fue suficiente para

producir la reducción del Cr(VI).

De esta forma, se puede observar que hasta que el volumen del

medio ácido pasado no superó los 2 litros, se siguieron observando

fluctuaciones en el pH del lixiviado y la concentración de Cr(III) estuvo

siempre por debajo de 10 ppm. Tan sólo en un caso (Vlixiviado = 1030 ml) en el

que se produjo una disminución notable del pH, se observó una lixiviación

importante de Cr(III) (69 mg). Esta disminución es de carácter puntual y

pudo deberse a la acidificación de una zona determinada por el

establecimiento de un camino preferencial del medio.

Por tanto, después de un tiempo de operación bajo estas

condiciones, se concluyó que el régimen por cargas no era el más

adecuado para llevar a cabo la reducción, ya que en aquellos períodos de

tiempo sin entrada de alimentación, el sistema se mantenía en

recirculación, y pudo ocurrir que la poca cantidad de metal que se hubiera

lixiviado por la acción del medio ácido, volviera a precipitar en el residuo.

Este hecho está perfectamente justificado por el equilibrio ácido-base que

RESULTADOS

185

se establece entre el medio ácido y el residuo arcilloso, provocando que el

pH global aumente y no se registre lixiviación apreciable.

Por ello, a partir de los primeros 1900 ml se decidió interrumpir la

recirculación del medio ácido y se comenzó a operar de forma continua

con el medio obtenido directamente de la columna de inmovilización,

siendo el caudal de salida del lixiviado de la columna sensiblemente menor

que el de alimentación para facilitar un tiempo de contacto suficiente para

la solubilización. Una vez detenida la alimentación se mantenía la salida de

efluente hasta vaciar la columna de todo el medio líquido, quedando así

preparado para la siguiente carga.

Con este cambio en el régimen de operación de la columna se

registró una inmediata solubilización de cromo (III) y un descenso

considerable del pH que se mantuvo en un rango entre 1,8-3.

Durante las primeras horas de funcionamiento, las características del

lixiviado estuvieron fluctuando hasta alcanzar unos valores constantes una

vez que el volumen acumulado de medio ácido superó los 3300 ml. En este

momento, la concentración de Cr(III) se mantuvo en torno a los 4000 ppm y

el valor de pH estuvo siempre por debajo de 2,5. Después de hacer pasar 4

litros de medio ácido, se obtuvo un 12% de la solubilización del Cr(III) (5,68

gramos de los 47,1 presentes en el residuo), aunque habría que destacar

que un 8% se obtuvo en los últimos 900 ml recogidos, una vez alcanzada la

composición constante en el lixiviado.

Siguiendo la tendencia obtenida en esta última fase, se puede

realizar una estimación teórica del volumen necesario para lixiviar todo el

cromo presente. En estas condiciones se obtuvo una solubilización media de

421,14 mg Cr(III) / 100 ml de medio ácido, es decir, 4,21 g Cr(III) / L.

RESULTADOS

186

La cantidad de Cr(III) que permanece en la columna sería de:

47,1 g Cr(III) totales – 5,68 g Cr(III) lixiviados = 41,42 g Cr(III) sin lixiviar

que necesitarían:

41,42 g Cr(III) / 4,21 g Cr(III) / L = 9,83 l de medio ácido.

Aproximadamente 10 litros de medio serían necesarios para la

lixiviación del 100% del cromo contenido en el residuo. Se observa que un

volumen similar de medio ácido fue necesario para la solubilización de tan

sólo el 54,6% del cromo presente en la arena en la experiencia de

solubilización continua descrita con anterioridad, a pesar de que la

cantidad de cromo fue menor (se solubilizaron 41mg de 75mg totales). Este

hecho se debe, fundamentalmente, a la distinta solubilidad de los

compuestos de cromo tratados en cada caso. Además se corrobora que

para una mayor concentración de metal se da una mayor solubilización,

como se observó en la etapa de solubilización en discontinuo.

Con respecto a la reducción de Cr(VI), no se detectó la presencia de

este ión a partir de los 2900 ml de lixiviado obtenido, si bien la cantidad de

Cr(VI) acumulada en el lixiviado alcanzó los 11,5 mg de los 157 mg totales, lo

que indica que el 7,34% de Cr(VI) no fue reducido y que, por tanto, se

obtuvo una reducción del 92,66%. Se comprobó que el proceso de

reducción de forma indirecta y continua resulta viable ya que permite una

elevada reducción del cromo hexavalente sin interferir en el metabolismo

celular, y en mayor medida que en las experiencias de contacto indirecta

pero en régimen discontinuo presentadas por Quintana y col. (2001) y Viera

y col. (2003).

RESULTADOS

187

3 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN DISCONTINUO

3.1.1 Estudio con Cr(III) Para el estudio de la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al

ion cromo(III) se emplearon las cepas Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio

sp. y se suplementó el medio de crecimiento Postgate C con Cr2(SO4)3 para

obtener las siguientes concentraciones iniciales: 1, 4,5, 9, 12 y 15 ppm de

Cr(III).

El crecimiento bacteriano se vio inhibido para las dos cepas por la

presencia de este metal (figura 40), incluso para la menor concentración

estudiada (1 ppm) la población no alcanzó el máximo de crecimiento

obtenido por la bacteria sin metal (control Dv y Dsp). Además se observó

que, a partir de los siete días, se produce una estabilización de la población.

El descenso de la concentración de sulfato (figura 41) fue paralelo al

crecimiento celular. Los cultivos con mayor crecimiento presentaron un

mayor consumo de este sustrato hasta los siete días, momento a partir del

cual la concentración de sulfato se mantiene prácticamente constante.

La medida de la concentración de cromo(III) soluble en el medio

permitió calcular el porcentaje de cromo precipitado con respecto al

suplementado inicialmente. Estos valores están representados en la figura

42.

A simple vista se puede observar que el porcentaje de

bioprecipitación aumenta a lo largo del tiempo y que la cantidad de metal

precipitado es mayor cuanto mayor es la cantidad inicial, lo cual da lugar a

RESULTADOS

188

mayores porcentajes de precipitación. De este modo, la mayor

precipitación ocurre para los cultivos suplementados con 15 ppm de Cr(III) a

los once días, obteniéndose un 24,7 % de precipitación para la cepa pura y

un 24,13% para el cultivo mixto.

(a) Desulfovibrio vulgaris

0

100

200

300

400

500

600

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Mce

l/ml

1 ppm4,5 ppm9 ppm12 ppm15 ppmcontrol Dv

(b) Desulfovibrio sp.

0

100

200

300

400

500

600

700

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Mce

l/ml

1 ppm4,5 ppm9 ppm12 ppm15 ppmcontrol Dsp

Figura 40:Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de cromo(III)

RESULTADOS

189


1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)

1 ppm4,5 ppm9 ppm12 ppm15 ppmC 15 ppmcontrol Dv


1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)

1 ppm4,5 ppm9 ppm12 ppm15 ppmC 15 ppmcontrol Dsp

Figura 41 Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de cromo(III).

A los once días, los valores de precipitación son muy similares para

ambos casos, sin embargo, a los tres días, se observa una mayor

RESULTADOS

190

precipitación para el cultivo mixto, lo cual aporta una ventaja en el sentido

del tiempo, ya que en cuatro días se obtiene el 10-15% de precipitación.


0

5

10

15

20

25

4 7 11Tiempo (dias)

% b

iopr

ecip

itaci

ón

1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm C 15 ppm


0

5

10

15

20

25

4 7 11

Tiempo (dias)

% b

iopr

ecip

itaci

ón

1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm C 15 ppm

Figura 42: Precipitación de cromo(III) con Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp.(b)

Para los ensayos estériles preparados con 15 ppm de Cr(III) se detectó

una precipitación menor del 1%, este hecho permite justificar que no hay

RESULTADOS

191

precipitación en ausencia de microorganismos, y que el compuesto

responsable de la precipitación sólo se produce por un mecanismo

biológico.

Además de la capacidad de precipitación, se puede determinar a

partir de este estudio la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al ion

Cr(III). El límite de tolerancia está en torno a 15 ppm, ya que a dicha

concentración se observó una importante inhibición del crecimiento y un

descenso de la actividad metabólica con menor consumo de sulfato. A

pesar de ello, se obtuvo una precipitación de Cr(III) que puede justificarse

con la producción de sulfuro. En los estudios con concentraciones mayores

(20 ppm, datos no mostrados) se encontró una alta toxicidad para ambas

cepas, registrándose la muerte celular y la ausencia de actividad

metabólica.

Los valores de tolerancia (15 ppm) son mucho menores que los

obtenidos por Hao y col.(1994), que presentaron un cultivo mixto de

bacterias sulfato-reductoras que tolera 60 ppm de Cr(III). Sin embargo, Viera

y col. (2003) encontraron el mismo nivel de tolerancia para ambos cultivos a

20 ppm de Cr(III).

3.1.2 Estudio con Cr(VI) Habitualmente, los medios contaminados por cromo presentan

cromo hexavalente junto con el cromo trivalente. Aunque un objetivo de

nuestro estudio es la reducción del Cr (VI) a Cr (III) mediante el trabajo de

las bacterias azufre-oxidantes, puede ocurrir que el lixiviado arrastre cromo

hexavalente si no se ha producido una reducción total. Por ello, parece

interesante estudiar la tolerancia de estas bacterias al ion Cr (VI).

Dado que la cepa mixta en el estudio de precipitación del Cr(III), y

de otros iones, mostró mayor actividad se decidió realizar la experiencia con

RESULTADOS

192

este cultivo. Para ello, se procedió de forma similar a los experimentos

anteriores. Se prepararon 50 ml de medio Postgate C con concentraciones

de 1, 5 y 10 ppm de Cr(VI) y se inóculo al 10% con Desulfovibrio sp. En este

caso, tan sólo se llevó a cabo el estudio de la tolerancia del cultivo mixto a

este ión metálico, por tanto, no se realizó el seguimiento de la

concentración de metal en el sobrenadante. A partir de los resultados

obtenidos de la población celular (figura 43) y el consumo de sulfato (figura

44), se deduce claramente la tolerancia de Desulfovibrio sp. a

concentraciones de 1 y 5 ppm de Cr(VI) aunque se observa una ligera

inhibición si comparamos la evolución de estos dos parámetros para cultivos

suplementados con metal y el cultivo control. Sin embargo, una

concentración de 10 ppm de Cr(VI) resultó tóxica para la célula. Los datos

de tolerancia obtenidos permitieron realizar un estudio posterior con

Desulfovibrio sp. en presencia Cr(VI) y Cr(III) en solución.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Mce

l/ml

control Dsp

1 ppm

5 ppm

10 ppm

C 10ppm

Figura 43: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI).

RESULTADOS

193

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)

control Dsp1 ppm5 ppm10 ppmC 10ppm

Figura 44: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI.)

3.1.3 Estudio con Cr(III) y Cr(VI) Estudiada la tolerancia al Cr(III) y Cr(VI) de forma independiente, se

procedió a realizar el estudio de ambos iones en combinación. A partir de

los datos obtenidos, se seleccionaron las concentraciones adecuadas para

llevar a cabo este estudio.

En esta experiencia, al igual que en las anteriores, se dispusieron

botes de vidrio de 50 ml, medio Postgate C suplementado con 15 ppm de

Cr(III) y 1, 2,5 y 5 ppm de Cr(VI). Para ello, se emplearon disoluciones de

Cr2(SO4)3 y K2Cr2O7. Se inoculó al 10% con Desulfovibrio sp. crecido en

Postgate C. Se preparó también un control estéril de 15 ppm de Cr(III) y 5

ppm de Cr(VI) (C15/5) para determinar si se produce precipitación debido

a factores no biológicos. Los ensayos se realizaron por duplicado y el

seguimiento del crecimiento fue muy similar al caso anterior (Figura 45).

RESULTADOS

194

0

100

200

300

400

500

600

0 2 4 6 8 10 12 14

Tiempo (días)

Mce

l/ml

control Dsp

15/1

15/2,515/5

Figura 45: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III) y Cr(VI).

La presencia de ambos iones afecta al crecimiento de la bacteria y

al séptimo día se produce el máximo crecimiento celular. El consumo de

sulfato se corresponde de forma directa con el crecimiento de la población

y la precipitación del metal.

En la figura 46 se muestran los porcentajes de precipitación de cada

uno de los ensayos realizados. En esta experiencia, el cultivo mixto se mostró

tolerante a las mayores concentraciones probadas. La respuesta tuvo una

tendencia similar al caso anterior, de tal forma que a mayor concentración

de metal presente en el medio mayor porcentaje de él precipita, este

hecho puede deberse a la posible reducción del Cr(VI) a Cr(III) por parte de

las bacterias sulfato-reductoras, lo cual hace que la cantidad de Cr(III) en

solución aumente y, por ello, se observe una mayor precipitación. De

cualquier modo el porcentaje de precipitación se situa en un valor cercano

al obtenido para 15 ppm de Cr(III).

RESULTADOS

195

0

5

10

15

20

25

30

15 15/1 15/2,5 15/5 C15/5

% b

iopr

ecip

itaci

ón

Figura 46. Porcentaje de bioprecipitación para Desulfovibrio sp. En presencia de Cr(III) y Cr(VI).

3.1.4 Estudio con Ni(II) El estudio del efecto del ion Ni(II) sobre las bacterias sulfato-

reductoras se realizó añadiendo al medio de crecimiento 1, 4, 8,5, 17 y 30

ppm de Ni(II) a partir de una disolución de sulfato de niquel (NiSO4 · H2O).

La evolución del crecimiento bacteriano se muestra en la figura 47.

La población aumentó de forma significativa hasta los siete días de cultivo y,

a partir de ahí, se produjo una ligera estabilización. Resulta evidente que la

concentración de metal afecta al metabolismo celular de tal modo que,

para ensayos con 17 ppm, el crecimiento fue muy bajo y para 25 ppm no se

observó crecimiento significativo. Se puede decir que la concentración de

25 ppm de Ni(II) resulta tóxica para el cultivo puro (Dv) y el mixto (Dsp) ya

que, además del descenso celular, no se observó consumo alguno de

sulfato.

RESULTADOS

196


0

200

400

600

800

1000

1200

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Mce

l/ml

1 ppm

4 ppm

8,5 ppm

17 ppm

25 ppm

Control Dv

(b) Desulfovibrio sp .

0

200

400

600

800

1000

1200

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Mce

l/ml

1 ppm4 ppm8,5 ppm17 ppm25 ppmControl Dsp

Figura 47. Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de níquel(II)

Al igual que ocurre en ausencia de metal, el cultivo mixto en

presencia de las concentraciones más bajas de metal (1, 4 y 8,5 ppm)

alcanzó una mayor concentración celular que Desulfovibrio vulgaris a las

mismas concentraciones de metal.

RESULTADOS

197

Solo se produjo un consumo de sulfato significativo (Figura 48) en los

casos donde se observó crecimiento celular notable, siendo claramente

mayor el descenso de la concentración de sulfato para el cultivo mixto.


1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)

1 ppm4 ppm8,5 ppm17 ppm25 ppmC 25 ppmControl Dv


1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)

1 ppm4 ppm8,5 ppm17 ppm25 ppmC 25 ppmControl Dsp

Figura 48. Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de níquel(II)

RESULTADOS

198

En cuanto a la precipitación de Ni(II) (Figura 49), se observó para

ambos cultivos una precipitación en torno al 65% para los ensayos de 1

ppm, de un 92% para los ensayos de 4 ppm y un 96% para los de 8,5 ppm.

Para el experimento con 17 ppm de Ni(II), se registró una leve precipitación

con el cultivo mixto(<20%), siendo nula para el cultivo puro.


0

20

40

60

80

100

120

4 7 11

Tiempo (dias)

% b

iopr

ecip

itaci

ón

1 ppm 4 ppm 8,5 ppm 17 ppm C 25 ppm


0

20

40

60

80

100

120

4 7 11Tiempo (dias)

% b

iopr

ecip

itaci

ón

1 ppm 4 ppm 8,5 ppm 17 ppm C 25 ppm

Figura 49: Precipitación de níquel(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de níquel(II)

RESULTADOS

199

En el cultivo puro se puede observar que la precipitación máxima

que se alcanza para el caso con 1 ppm ocurre en tan sólo cuatro días, pero

los ensayos de 4 y 8,5 ppm mejoraron su precipitación al cabo de los siete

días y este valor se mantiene constante en el siguiente muestreo.

Para el cultivo mixto los resultados de precipitación obtenidos a los

cuatro días alcanzaron un máximo, ya que un mayor tiempo de cultivo no

conlleva un aumento de esta cantidad. Se puede decir que en tan solo

cuatro días, con este cultivo se pueden precipitar 8,5 ppm de Ni(II) casi en

su totalidad.

Ambos cultivos toleran hasta 8,5 ppm, y concentraciones mayores

ralentizan el crecimiento y reducen la capacidad reductora del sulfato de

estas bacterias. El cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras empleado

por Hao y col. (1994) resultó más tolerante a la presencia de ion níquel (10-

20 ppm)

3.1.5 Estudio con Zn (II) La experiencia fue realizada suplementando el medio de cultivo

Postgate C con sulfato de zinc (ZnSO4· 7H2O) para obtener unas

concentraciones iniciales de Zn(II) de 5, 7, 10, 15 y 20 ppm.

El crecimiento bacteriano (Figura 50) se ve afectado de una forma

gradual en función de la concentración de metal en el medio, siendo la

fase de latencia mayor a medida que aumenta la cantidad de zinc en

solución. Se puede observar que el cultivo puro (Dv) presenta un

crecimiento similar a los 14 días de incubación para los experimentos con

concentraciones menores de 10 ppm. De igual modo, el cultivo mixto (Dsp)

puede llegar a valores considerables de biomasa para concentraciones por

debajo de 15 ppm, encontrándose una importante inhibición para el caso

de 20 ppm. Este comportamiento vuelve a poner de manifiesto que el

RESULTADOS

200

cultivo mixto tolera mayores concentraciones del metal en solución, como

bien se ha observado con los metales ensayados anteriormente.


0

200

400

600

800

1000

0 2 4 6 8 10 12 14

Tiempo (días)

Mce

l/ml

5 ppm7 ppm10 ppm15 ppm20 ppmcontrol Dv


0

200

400

600

800

1000

1200

0 2 4 6 8 10 12 14

Tiempo (días)

Mce

l/ml

5 ppm7 ppm10 ppm15 ppm20 ppmcontrol Dsp

Figura 50: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de zinc(II)

RESULTADOS

201

Como se observa en la figura 51, el consumo de sulfato se muestra

parejo al aumento de la población. Cabe resaltar que en presencia de

Zn(II) se obtiene mayor población celular y, por tanto, mayor consumo de

sulfato que en presencia de otros iones.


0

1000

2000

3000

4000

5000

0 2 4 6 8 10 12 14

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)

5 ppm7 ppm10 ppm15 ppm20 ppmC 20 ppmcontrol Dv


0

1000

2000

3000

4000

5000

0 2 4 6 8 10 12 14

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)

5 ppm7 ppm10 ppm15 ppm20 ppmC 20 ppmcontrol Dsp

Figura 51: Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de zinc(II)

RESULTADOS

202

Si observamos los porcentajes de bioprecipitación, se puede ver que

el comportamiento de los dos cultivos de bacterias sulfato-reductoras fue

bastante distinto en este caso (Figura 52).


0

20

40

60

80

100

120

4 7 11 14

Tiempo (dias)

% b

iopr

ecip

itaci

ón

5 ppm 7 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm C 20 ppm


0

20

40

60

80

100

120

4 7 11 14

Tiempo (dias)

% b

iopr

ecip

itaci

ón

5 ppm 7 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm C 20 ppm

Figura 52:. Precipitación de zinc(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b)

RESULTADOS

203

Para el cultivo Desulfovibrio vulgaris con 5 ppm de Zn(II) se alcanzó

una precipitación cercana al 100% tras siete días de incubación y fueron

necesarios 11 días para alcanzar niveles similares en el experimento con 7 y

10 ppm. Para el resto de las concentraciones, tras 14 días de incubación,

sólo el caso de 15 ppm alcanzó una precipitación notable (20%), siendo tan

sólo de un 9% para el cultivo de 20 ppm.

Estos resultados indican que existe una correspondencia entre el

crecimiento del cultivo y la concentración de metal precipitado. De tal

modo que, la cantidad de metal precipitado aumenta en el tiempo hasta

alcanzar un máximo que coincide con el momento en que se supera la fase

exponencial de crecimiento en cada cultivo. Este hecho se corrobora

también para el cultivo mixto, donde a los 7 días se observa el máximo de

precipitación para el cultivo con 5 ppm, a los 11 días, coincidiendo con el

aumento de la población celular, se precipitó el 99-95% del metal de los

cultivos con 7-15 ppm y a los 14 días se obtuvo una precipitación del 93%

para el caso de 20 ppm. La concentración máxima tolerada de zinc (20

ppm) coincide con la obtenida por Utgikar y col. (2001) aunque algo menor

que la presentada por Hao y col. (1994) cuyo cultivo mixto toleró entre 25 y

40 ppm de este ion.

3.1.6 Estudio con Cr(III), Ni(II) y Zn(II) Una vez estudiada la tolerancia de Desulfovibrio vulgaris y

Desulfovibrio sp. a los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) se llevó a cabo un estudio

similar combinando estos metales, por pares y todos juntos. El objetivo de

este estudio es determinar el comportamiento de las bacterias sulfato-

reductoras en presencia de una mezcla de iones metálicos, de forma similar

a como ocurriría en un medio natural.

RESULTADOS

204

Las concentraciones seleccionadas de cada metal fueron aquellas

toleradas por ambos cultivos y que presentaron una precipitación

significativa. Con el fin de poder establecer comparaciones, dado que el

estudio con Cr(III) y Ni(II) se realizó hasta los 11 días de incubación se

consideraron los valores correspondientes a este mismo tiempo para los

cultivos con Zn(II) y se establecieron iguales tiempos de muestreo en la

experiencia con combinación de metales.

Se expuso a ambos cultivos a 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10

ppm de Zn(II). Las combinaciones se denominaron: CrNi, CrZn, NiZn y CrNiZn.

Figura 53: Experiencia de precipitación de los iones cromo, níquel y zinc combinados en un cultivo de Desulfovibrio vulgaris (11 días).

La evolución de la concentración celular de Desulfovibrio vulgaris

(Figura 54) en presencia de los metales fue similar, el crecimiento fue mayor

cuando los metales se encuentran combinados en parejas que para el

cultivo con cada uno de ellos por separado. La prolongada fase de

latencia del cultivo puro con 10 ppm de Zn(II) no se detecta cuando el

metal se encuentra combinado con alguno más. Los datos de sulfato

(Figura 55) se muestran coherentes con el aumento de la población celular.

RESULTADOS

205

Desulfovibrio vulgaris

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Mce

l/ml

Cr Ni Zn CrNiCrZnNiZnCrNiZn

Figura 54: Crecimiento bacteriano para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II).

Desulfovibrio vulgaris

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)


Figura 55: Consumo de sulfato para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

En el caso del cultivo mixto (figura 56), el comportamiento es similar,

el crecimiento es mayor cuando se combinan dos metales, que cuando se

RESULTADOS

206

suplementan cada uno de ellos por separado. Se puede observar también

correspondencia entre crecimiento y consumo de sulfato (figura 57).

Desulfovibrio sp.

0100200300400500600700800

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

Mce

l/ml


Figura 56: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II).

Desulfovibrio sp.

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (días)

sulfa

to (p

pm)


Figura 57: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II).

RESULTADOS

207

Podría pensarse en un efecto de co-precipitación de los metales

cuando se dan condiciones reductoras en el medio, ya que en ausencia de

bacterias, el propio medio no produce precipitación alguna, de tal forma

que los controles realizados con cada una de las combinaciones de metal

posibles no presentaron porcentaje de precipitación mayor del 5%.

En la tabla 26 se muestran los porcentajes de bioprecipitación de

cada metal individual y en combinación para los dos cultivos de bacterias

sulfato-reductoras.

Cepa Metales sólo CrNi CrZn NiZn CrNiZn

Cr(III) 24,7 28,0 29,2 33,3

Ni(II) 96,0 94,7 100,0 95,1 Desulfovibrio

vulgaris

Zn(II) 92,9 100,0 100,0 100,0

Cr(III) 25,5 28,8 32,0 33,0

Ni(II) 96,1 95,4 100,0 91,4 Desulfovibrio

sp.

Zn(II) 94,7 100,0 100,0 100,0

Tabla 26: Porcentajes de precipitación de los iones metálicos solos y en combinación para Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp.

La cantidad de cromo precipitado aumenta en los ensayos en que se

encuentra combinado, aunque no se alcanzan los valores de precipitación

tan elevados obtenidos para otros metales. Esta mejora puede atribuirse a

una co-precipitación formando compuestos más complejos, aunque esta

presunción tendría que confirmarse mediante la determinación analítica del

precipitado obtenido.

RESULTADOS

208

Las cantidades de níquel y zinc precipitados son bastante similares

cuando se encuentran solos o en combinación, aproximadamente, se

alcanza el 100% de eliminación del metal en solución.

Para llegar a determinar las causas reales de este tipo de

comportamiento, sería necesario programar una nueva batería de

experimentos y profundizar en las técnicas analíticas para llegar a

determinar la naturaleza química de los precipitados obtenidos. Sin

embargo, estos experimentos no se han fijado como objetivos básicos del

trabajo realizado y pueden constituir nuevos trabajos de investigación

dentro de la línea iniciada con este estudio.

Otro de los factores que puede influir significativamente en la

precipitación de los metales en combinación es la respuesta de las

bacterias ante los distintos metales. En este sentido, Utgikar y col. (2001)

presentaron un mecanismo de inhibición de la reducción de sulfato de las

bacterias sulfato-reductoras por la deposición de las partículas del sulfuro

metálico formado sobre la membrana celular, lo que cual impide el acceso

de la materia orgánica y del ion sulfato a las inmediaciones de la célula,

reduciendo así la posibilidad de generar sulfuro y precipitar los iones

metálicos presentes en el medio. En la figura 17 se muestran fotografías

realizadas por microscopía electrónica donde se presenta un cultivo

Desulfovibrio sp. en presencia de una combinación de cromo, níquel y zinc

al inicio de la experiencia y a los 14 días. Se observa claramente la

deposición de precipitados sobre la superficie celular de las bacterias

cuando el proceso está por finalizar.

RESULTADOS

209

Figura 58: Fotografía de microscopía electrónica (x20000) de un cultivo Desulfovibrio sp. en presencia de cromo, níquel y zinc para tiempo cero(izqda.) y a los 14 días (dcha)

Por tanto, la deposición del sulfuro metálico sobre la superficie celular

puede explicar claramente el descenso de la actividad metabólica de las

bacterias y de la bioprecipitación de los metales estudiados.

RESULTADOS

210

3.2 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO

Para el estudio de la precipitación en continuo de los iones Cr(III),

Ni(II) y Zn(II) por la acción de las bacterias sulfato-reductoras se empleó un

reactor de tanque agitado donde se creció un cultivo de Desulfovibrio sp..

Se utilizó el cultivo mixto por presentar una mayor velocidad de crecimiento

y de reducción de sulfato que el cultivo puro, como ya se observó en el

estudio de precipitación discontinua.

Figura 59: Sistema empleado para la precipitación de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes en un lixiviado artificial por el medio generado por un cultivo Desulfovibrio sp.

El medio obtenido del reactor, rico en sulfuro de hidrógeno, se goteó

sobre un depósito donde se encontraba la solución metálica que había de

RESULTADOS

211

ser precipitada y a la disolución resultante se la denominó como

precipitado. El equipo empleado se muestra en la figura 59.

El reactor de bacterias sulfato-reductoras se mantuvo en régimen

discontinuo durante 2 días (figura 60), a partir de ese momento se trabajó a

caudales crecientes partiendo de 6 ml/h hasta 14 ml/h, caudal que se

establece a los 9 días. El cultivo se mantuvo con una población celular entre

300-500 Mcel/ml y una concentración de sulfato entre 2-2,5 g/l de sulfato a

lo largo de todo el período de experimentación.

0

100

200

300

400

500

600

700

0 10 20 30 40

Tiempo (días)

Mce

l/ml

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

[SO

4=] (

ppm

)

Mcel/ml [SO4=]

Figura 60: Evolución de la población celular y la concentración de sulfato en el reactor de Desulfovibrio sp.

Una vez conseguido el estado estacionario, el efluente del reactor se

introdujo en el reactor de precipitación.

Inicialmente, para evaluar la capacidad de estas bacterias para

precipitar iones metálicos se empleó una disolución a la que denominamos

lixiviado artificial. La solución, de 100 ml, se preparó con sulfato de cromo,

de níquel y de zinc, para obtener una composición final de: 766 ppm de

Cr(III), 376 ppm de Ni(II) y 3521 ppm de Zn(II), cantidades similares a las

RESULTADOS

212

tomadas como referencia en apartados anteriores del estudio. La figura 61

presenta un cuadro resumen de la cantidad de cada uno de los metales

durante el proceso de bioprecipitación.

Figura 61. Cuadro resumen del proceso de precipitación de iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por Desulfovibrio sp.

La adición de 900 ml de medio con sulfuro de hidrógeno, procedente

del reactor de crecimiento de las bacterias sulfato-reductoras, alcanzó una

reducción del 13,1% de Cr(III), 13,6% de Ni(II) y 46,5% de Zn(II). Dado que el

precipitado obtenido contenía una gran cantidad de metales en solución,

se tomaron distintas fracciones de esta disolución con el fin de poder llegar

a establecer el límite de precipitación que se puede conseguir bajo esta

metodología. De esta forma, del lixiviado residual que quedó de esta

primera etapa se trataron 23,1 mg de Cr(III), 14,7 mg de Ni(II) y 51,1 mg de

Zn(II) en total, y esta cantidad en solución fue procesada mediante cinco

etapas de precipitación que permitieron llegar a precipitar el 0,87% de

mg Cr(III)

mg Ni(II)

mg Zn(II)

Formato:

Lixiviado artificial Precipitación % de precipitación

76,6 37,6 352,1 10 5,1 163,8 13,1 13,6 46,5 0,9 l medio D. sp.

33,1 19,8 214,9 10,2 11,2 208,8 30,8 56,6 97,2 4,51 l medio D. sp.

0,2 6,1 45 0,87 41,5 88,1 5 etapas 4,51 l medio D. sp.

23,1 14,7 51,1

66,6 32,5 188,3 43,5 17,8 137,2

Lixiviado residual Fracción sin tratar

Fracción Precipitación % de precipitación

Precipitación % de precipitación Cantidad de lixiviado tratada

Datos globales

RESULTADOS

213

Cr(III), el 41,5% de Ni(II) y el 88,1% de Zn(II). Si consideramos que una fracción

de la disolución inicial no fue tratada, se puede calcular el porcentaje total

de precipitación respecto a la cantidad de metal procesada, y de esta

forma, se obtuvo un 30,8% de Cr(III), 55,8% de Ni(II) y 97,16% de Zn(II).

Se observa que la mayor precipitación ocurre para el ion Zn(II), como

ocurre en el caso de las experiencias en discontinuo. Este hecho puede

deberse a que la de solubilidad del sulfuro de zinc es menor a la solubilidad

de los demás compuestos en las condiciones en que se encuentra el medio,

con lo cual incluso para concentraciones muy bajas de sulfuro de

hidrógeno se obtiene precipitación de zinc, preferentemente.

De los resultados obtenidos se puede destacar que la mayor

precipitación ocurre cuando las concentraciones de los iones metálicos a

tratar son más elevadas, de modo que la mayor precipitación ocurre en la

etapa inicial. Las últimas fracciones del lixiviado residual tratadas

presentaron una precipitación nula o muy baja de cromo y níquel y la

precipitación de zinc se fue haciendo menor a medida que el contenido de

éste en las distintas fracciones iba disminuyendo. En general, se puede

deducir que este proceso no resulta viable para concentraciones

demasiado bajas, ya que implica un elevado consumo del medio generado

por las bacterias sulfato-reductoras. Este hecho se observa claramente en la

segunda parte del proceso, en la cual fueron necesarios más de 4,5 litros

para precipitar tan sólo 0,2 mg de Cr(III), 6,1 mg de Ni(II) y 45 mg de Zn(II).

Por tanto, resulta conveniente favorecer la precipitación

manteniendo unas concentraciones lo suficientemente elevadas en los

lixiviados a tratar como para que la precipitación sea notable con el menor

consumo de medio reductor posible.

RESULTADOS

214

4 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS

4.1 INMOVILIZACIÓN DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO

Con el fin de obtener una producción de medio ácido suficiente

para realizar el proceso de solubilización de iones metálicos en continuo, se

estudió la conveniencia de inmovilizar las bacterias azufre-oxidantes sobre

un soporte inerte. En este sentido, dada la experiencia de la que se dispone

con la espuma de poliuretano, se procedió al estudio del proceso de

inmovilización de ambas especies bacterianas sobre este soporte.

El procedimiento constó de una primera etapa de inmovilización al

pH óptimo de crecimiento de cada bacteria de forma discontinua en

matraces erlenmeyers con las bacterias en suspensión y un gramo de

unidades cúbicas de espuma de poliuretano. Tras dos ciclos, se empleó

medio 0K ajustado a pH 4, por ser este valor más adecuado para el

incremento de la producción de ácido.

Inicialmente, se observó que las partículas de azufre elemental

suplementadas permanecieron en la superficie del líquido, debido a su

carácter hidrófobo, de modo que se pensó en la incompatibilidad de este

sustrato con el soporte elegido, ya que las bacterias retenidas en el interior

de la espuma difícilmente podrían acceder a la fuente de energía. Sin

embargo, la acción de las bacterias en suspensión hace que la oxidación

del azufre produzca partículas de menor tamaño que difunden fácilmente

en la matriz porosa o se adhieren a su superficie, teniendo lugar este

proceso en las primeras 24 horas (figura 62).

RESULTADOS

215

Figura 62: Cultivo discontinuo a de At. thiooxidans crecido sobre espuma de poliuretano.

El seguimiento de la experiencia se realizó midiendo diariamente el

pH, la concentración de sulfato y la concentración de protones que se

produce. Se fijó como criterio para finalizar un ciclo de inmovilización que el

pH estuviera próximo a un valor de 1; en este momento, se determinó la

concentración de biomasa inmovilizada de acuerdo a la metodología

descrita en el apartado de Material y Métodos de la presente memoria. En

estas condiciones la concentración de protones se encuentra en torno a los

0,25 g/l y la concentración de sulfato en 15 g/l.

En la figura 63 se muestra la evolución del pH a lo largo de los distintos

ciclos de inmovilización para At. ferrooxidans. La etapa de inicial se

compone de dos ciclos de menor extensión ya que al partir de un medio

más ácido (pH 1,8) el valor de pH 1 se alcanza en menor tiempo. Una vez

suplementado con medio 0K a pH 4, se pudo observar una tendencia muy

similar a partir del cuarto ciclo, tanto en la medida de pH como en la

RESULTADOS

216

concentración de los productos de reacción (figura 64), siendo la duración

media de un ciclo de inmovilización de 165 horas. La constancia en los

ciclos respecto del tiempo coincide con el estacionamiento de la cantidad

de bacterias inmovilizadas en un valor de 15 Mcél/mg de soporte (figura 65).

0.5

0.7

0.9

1.1

1.3

1.5

1.7

1.9

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Tiempo (horas)

pH

Figura 63:.Evolución del pH en el proceso de inmovilización de At. ferrooxidans sobre espuma de poliuretano.

02468

1012141618

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Tiempo (horas)

[SO

4=] g

/l

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

[H+]

g/l

[SO4] g/l [H+] g/l

Figura 64: Evolución de la concentración de protones y de sulfato en el proceso de inmovilización de At. ferrooxidans sobre espuma de poliuretano

RESULTADOS

217

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6

Ciclo

Mce

l/mg

de s

opor

te

At. thiooxidans

At. ferrooxidans

Figura 65: Evolución de la población celular inmovilizada por mg de espuma de poliuretano en función de los ciclos realizados para At. ferrooxidans y At. thiooxidans.

La tendencia seguida en el proceso de inmovilización de At.

thiooxidans se muestra en las figuras 66 y 67, y cabe destacar que en este

caso, se necesita un menor tiempo para la inmovilización de esta especie

bacteriana. Los dos primeros ciclos fueron similares en extensión a los

observados para At. ferrooxidans, a pesar de que At. thiooxidans parte de

un pH inicial mayor (medio 0K pH 2,5). Una vez que el cultivo es

suplementado con medio a pH 4, la biomasa inmovilizada se establece en

torno a los 24 Mcél/mg de soporte (figura 65) en el cuarto ciclo y la

extensión de los ciclos no supera las 140 horas.

Por tanto, a la vista de los resultados se puede concluir que, tanto At.

ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en espuma de

poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como fuente de energía,

siendo dicha inmovilización más efectiva para el segundo de ellos.

Teniendo en cuenta estos resultados y, persiguiendo el objetivo de su

aplicación para la producción de medio ácido, parece más conveniente

RESULTADOS

218

utilizar columnas de At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de

poliuretano.

0.5

0.7

0.9

1.1

1.3

1.5

1.7

1.9

2.1

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Tiempo (horas)

pH

Figura 66: Evolución del pH en el proceso de inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano

02468

1012141618

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Tiempo (horas)

[SO

4=] g

/l

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

[H+

] g/l

[SO4] g/l [H+] g/l

Figura 67: Evolución de la concentración de protones y de sulfato en el proceso de inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano.

RESULTADOS

219

4.2 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN EN CONTINUO

La integración de los procesos de solubilización y precipitación en

régimen continuo estudiados se llevó a cabo en el sistema descrito en la

figura 68.

Figura 68: Sistema empleado para la integración de los procesos de solubilización y precipitación de iones metálicos en continuo.

Para realizar el proceso de solubilización se llevó a cabo la

inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano en matraces

erlenmeyers. Tras cuatro ciclos de inmovilización, la espuma colonizada se

incorporó a una columna de lecho fijo a la que se suplementó medio 0K (pH

4) y azufre elemental. Inicialmente, el sistema operó en discontinuo (figura

69) hasta alcanzar un pH igual a 1, comenzando a trabajar en ese momento

en régimen continuo con un caudal de alimentación de 14,5 ml/h. Bajo

estas condiciones de operación, el estado estacionario se estableció para

una población celular inmovilizada de 33 Mcél/mg de espuma.

RESULTADOS

220

0

2

4

6

8

10

12

14

0 4 8 12 16 20

Tiempo (días)

[sul

fato

] (pp

m)

0.5

1

1.5

2

pH

[sulfato] pH

Figura 69: Evolución de la concentración de sulfato y pH en la columna de At. thiooxidans

El medio ácido generado en la columna de At. thiooxidans se utilizó

como alimentación de otra columna que contenía 50 gramos de una arena

contaminada artificialmente con 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg de

Ni(II) y 200 mg de Zn(II).

El aporte de cromo hexavalente a la arena se realizó con el objetivo

de determinar la reducción del cromo(VI) a cromo(III) mediante los

compuestos reductores obtenidos por la oxidación de azufre elemental por

parte de las bacterias azufre-oxidantes. El primer volumen de lixiviado

obtenido presentó una elevada concentración de cromo (VI). Este hecho

se debe a la elevada solubilidad del dicromato potásico que hace que este

ión se disuelva rápidamente en el medio ácido circulante y abandone con

facilidad la matriz sólida en la que se encuentra y, por otra parte, el tiempo

de residencia del medio fue insuficiente para que se produjese el contacto

adecuado entre los compuestos reductores y el cromo hexavalente. No

obstante, se observó una reducción parcial del Cr(VI), ya que sólo se

detectó la presencia de este ión en el primer lixiviado obtenido el cual

contenía 39,7 mg de Cr(VI) de los 50 mg totales, lo que supone que en los

primeros 210 ml de medio ácido se redujo el 20,6% de este ión. Un aumento

RESULTADOS

221

del tiempo de residencia permitiría el incremento de este porcentaje; de

cualquier modo la proporción de este ion en la arena es mucho mayor a la

que se suele encontrar en los medios contaminados de forma natural.

Después de esta primera etapa de solubilización, el contenido total

de Cr(III) en la arena se vió aumentado por la reducción de Cr (VI) en un

total de 10,3 mg de Cr (III) para pasar a un total de 85,3 mg de Cr(III) totales.

Al igual que en el estudio independiente de solubilización en

continuo, se produce una lixiviación inicial de cromo y níquel (figura 70)

cuando el pH del lixiviado no es muy ácido debido a la alcalinidad del

soporte sólido empleado. Alcanzadas las condiciones ácidas, se muestra

una elevada solubilización del zinc contenido en la arena que se

acompaña por una leve y lenta lixiviación de los otros metales. La figura 71

permite comprobar la evolución de la cantidad de metal lixiviada en

función del volumen de ácido empleado para este proceso.

020406080

100120140160180

0 1 2 3 4 5Volumen (litros)

[Zn(

II)]

0246810121416

[Cr(

III)]

, [N

i(II)]

y p

H

[Zn(II)] [Cr(III)] [Ni(II)] pH

Figura 70: Evolución de la concentración de metales en el lixiviado en función del volumen de ácido pasado a través de la columna.

RESULTADOS

222

0

50

100

150

200

0 1 2 3 4 5 6

Volumen (litros)

mg

Zn(II

) lix

ivia

dos

0

5

10

15

20

mg

Cr(

III) y

mg

Ni(I

I) lix

ivia

dos

mg Zn(II) mg Cr(III) mg Ni(II)

Figura 71: Evolución de la cantidad de cada metal solubilizado en función del volumen de ácido pasado a través de la columna.

En la tabla 27 se presentan algunos valores representativos del

proceso de solubilización y precipitación completo. En la etapa de

solubilización se puede observar que, después de hacer circular por la

columna de residuo 2,4 litros de medio ácido, las concentraciones de los

distintos metales toman valores muy bajos y se ha completado un alto

porcentaje de la solubilización total. En concreto, se solubilizó el 14,62% de

Cr(III), el 26,65% de Ni(II) y el 90,53% de Zn(II). De esta forma, después de

pasar 3 litros más de medio ácido tan sólo se consiguió un aumento del

2,07% del Cr(III), un 6,25% del Ni(II) y un 7,89% del Zn(II). Como se puede

observar, el proceso es más efectivo cuando los metales se encuentran a

mayores concentraciones, por lo que parece adecuado utilizar este

proceso para tratar cantidades similares a las iniciales e ir incorporando

posteriormente más fracciones de residuo con el fin de mantener

concentraciones que permitan unos porcentajes de solubilización elevados.

La baja solubilización del cromo se debe principalmente a dos

motivos, la extrema insolubilidad del compuesto de cromo (III) empleado

RESULTADOS

223

(Cr2O3), lo que hace pensar que la mayor parte del cromo (III) lixiviado

proceda de la reducción del cromo (VI), y la baja densidad del óxido de

cromo que provoca que gran parte de la cantidad aportada a la arena

sea arrastrada por el lixiviado, retirándolo de la arena y eliminando, por

tanto, la posibilidad de ser solubilizado.

Cromo Níquel Zinc

mg totales en la arena 85,30 20,00 200,00

mg lixiviados en 2,4 l de medio ácido 12,47 5,33 181,10

% lixiviado del total 14,62 26,65 90,53

mg precipitados de 2,4 l de lixiviado con 2,2 l de

medio reductor 0,27 2,88 50,73

% precipitado de 2,4 l de lixiviado 2,17 54,03 28,02

mg lixiviados en 5,5 l de medio ácido 14,24 6,58 196,84

% lixiviado del total 16,69 32,90 98,42

mg precipitados de 5,5 l de lixiviado con 4,8 l de

medio reductor 0,29 2,90 54,53

% precipitado de 5,5 l de lixiviado 2,05 44,12 27,70

Tabla I1. Datos generales obtenidos en el proceso de solubilización-precipitación.

Los porcentajes de solubilización finales obtenidos por este proceso

son menores a los mostrados para la solubilización con un cultivo At.

thiooxidans en suspensión. No obstante, el volumen de ácido empleado

mediante esa metodología fue mayor (11,4 litros). Para el mismo volumen

consumido en este proceso (5,5 litros), en el caso del cultivo de At.

thiooxidans en suspensión, se obtuvo una solubilización del 39,4% de Cr(III),

88,1% de Ni(II) y 97,7 % de Zn(II) frente al 17% de Cr(III), 34,3% de Ni(II) y 99,3%

de Zn(II) para At. thiooxidans inmovilizado. Como se puede observar estas

RESULTADOS

224

concentraciones fueron más altas para el caso del cromo y níquel pero el

tiempo necesario para alcanzar estos niveles fue de 26 días frente a los 19

días empleados con At. thiooxidans inmovilizado en espuma de poliuretano.

Por tanto, en función del parámetro que deseemos optimizar habría

que decidir de que modo resulta más conveniente operar. De cualquier

modo, si comparamos la cantidad de metal lixiviado en la primera etapa

(2,4 litros), que fue la que resultó más efectiva, con los porcentajes de

solubilización obtenidos para el proceso con At. thiooxidans en cultivo

sumergido, dichos valores fueron menores para el cromo y el zinc y muy

similares para el níquel (5,5% de Cr(III), 27,7% de Ni(II) y 69,9% de Zn(II)). Estos

resultados justifican la inmovilización de las bacterias azufre-oxidantes de

cara a obtener una mayor solubilización de los metales en un menor

tiempo, siempre y cuando trabajemos dentro de un rango de

concentraciones de metales que permita una solubilización significativa.

La siguiente etapa, de precipitación, se realizó de forma similar al

proceso descrito anteriormente en la presente memoria para la

precipitación de un lixiviado artificial de cromo, níquel y zinc. Para ello, se

creció un cultivo de Desulfovibrio sp., en un reactor de tanque agitado, en

el cual, tras una primera etapa en cultivo discontinuo se comenzó a trabajar

en régimen continuo con un caudal de alimentación de medio de 12,5

ml/h. Alcanzado el estado estacionario, se operó de forma que el volumen

de medio lixiviado obtenido diariamente de la etapa de solubilización se

empleó como medio para la precipitación, el tiempo de contacto entre el

lixiviado y el efluente rico en sulfuro de hidrógeno procedentes del reactor

de Desulfovibrio sp. fue de 24 horas.

Durante toda la experimentación, el lixiviado obtenido se filtró a

través de una membrana de 0,22 �m para retener el óxido de cromo

arrastrado en el proceso de solubilización, con el fin de no interferir en la

RESULTADOS

225

medida de la concentración de metales presentes en el sobrenadante del

precipitado.

De acuerdo con los resultados obtenidos (tabla 27), se puede decir

que el proceso de precipitación es posible para los distintos metales

presentes en el lixiviado, pero al igual que en el proceso de solubilización, la

eficacia del proceso fue mayor para aquellos lixiviados con

concentraciones mayores de los metales. De este modo, las distintas

fracciones de lixiviado tratadas en los primeros 2,4 litros obtenidos en el

proceso de solubilización presentaron un porcentaje de precipitación más

alto. En esta primera etapa se registra la mayor parte de la precipitación

total, de tal forma que se puede llegar a precipitar el 2,2% de Cr(III), el 54%

de Ni(II) y 28% de Zn(II) de la cantidad de lixiviado tratada, empleando para

ello 2,2 l de medio reductor. Se observa que, tal como ocurrió en el estudio

anterior, la precipitación de cromo es bastante baja mostrándose una

cierta preferencia por la precipitación de los otros metales.

El elevado porcentaje de precipitación del níquel frente al del zinc, se

debe a que las primeras fracciones presentan una concentración

significativa de níquel y, sin embargo, no se detectó aún la solubilización del

zinc, lo cual hace que el sulfuro de hidrógeno se consuma en la

precipitación del níquel en solución. La baja concentración de metales en

las fracciones de lixiviado tratadas posteriormente, dieron lugar a una baja

precipitación de cromo y níquel, observándose sólo precipitación del ion

zinc.

La etapa final no resulta tan efectiva como era de esperar, ya que, el

tratamiento total del lixiviado obtenido en la etapa de solubilización dio

lugar a la precipitación del 2,1% de Cr(III), 44,1% de Ni(II) y 27,7% de Zn(II)

empleando un total de 4,8 litros de medio procedente del reactor de

bacterias sulfato-reductoras.

RESULTADOS

226

4.3 COMPARACIÓN CON OTRO PROCESO

Finalizado el proceso integrado resulta interesante la comparación

de los resultados obtenidos con un proceso similar. Para ello, se recurrió al

trabajo realizado por White y Gadd (1998), en el cual se propone un

proceso de solubilización y precipitación de un suelo contaminado

artificialmente, y se calcularon una serie de parámetros para hacer posible

dicha comparación. Las tablas 12 y 13 presentan los datos referentes a la

etapa de solubilización y precipitación del proceso integrado llevado a

cabo por estos autores y el realizado en el presente trabajo

Parámetros Unid. White y Gadd (1998) Proceso Integrado

Volumen de trabajo l 9 0,85

Caudal volumétrico ml/h 100 15

Velocidad de dilución d-1 0,267 0,43

Tiempo empleado d 190 19

Cantidad de residuo tratada g 8000 50

Volumen de medio ácido l 456 5,5

Metales estudiados Cr(III) Ni(II) Zn(II) Cr(III) Ni(II) Zn(II)

Concentración del residuo mg/l 132,0 108,8 141,8 1500 400 4000

Cantidad tratada de metales mg 1056 870,1 1134 85,3 20 200

Cantidad lixiviada mg 950,4 817,9 1032,0 14,24 6,58 196,84

% lixiviado - 90 94 91 16,7 32,9 98,4

Cant. lixiviada/vol. ácido mg/l 2,08 1,79 2,26 2,59 1,20 35,78

Tabla 12 : Parámetros pertenecientes al proceso de solubilización continua llevado a cabo por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo.

El proceso de solubilización de White y Gadd (1998) empleaba un

reactor (9 l) suplementado con 8 kg de suelo e inoculado con un cultivo de

bacterias azufre-oxidantes acidófilas y neutrófilas. Dicho proceso se

mantuvo 190 días operando y, para ello, se emplearon 456 litros de medio.

RESULTADOS

227

Como puede observarse, la concentración del residuo tratado fue

mucho menor que en el proceso estudiado en este trabajo, aunque la

cantidad de cada metal tratada fue mayor. Estos autores obtuvieron

porcentajes de solubilización mayores del 90% para todos los metales,

mientras que en el estudio detallado en la memoria, la mayor

concentración de metales en el residuo y la utilización de una velocidad de

dilución mayor condujeron a unos porcentajes muchos menores en el caso

del cromo y el níquel. No obstante, cabe indicar que el proceso se detuvo

cuando se observó una baja solubilización con respecto al volumen de

ácido empleado pero la experiencia previa de solubilización continua con

At. thiooxidans en cultivo sumergido, permitió asegurarnos que un mayor

volumen de ácido empleado da lugar a la solubilización completa del

níquel y el zinc y una solubilización notable, mayor del 55%, del cromo.

Por otra parte, si comparamos la cantidad de metal solubilizado por

volumen de ácido empleado, en el presente trabajo se obtienen mayores

niveles de solubilización para el cromo y el zinc, destacando este último.

Este hecho viene a coincidir con el efecto observado de mayores

concentraciones en los lixiviados para aquellos casos en los que se parte de

una concentración de metal mayor en el residuo. De cualquier modo, la

menor capacidad de lixiviación en el sistema de White y Gadd (1998) se

puede deber a la forma en que se encuentran integrados los iones

metálicos en el suelo.

La etapa de precipitación llevada a cabo por White y Gadd (1998)

se realizó en un reactor de sedimentación interna con recirculación,

alimentado con lixiviado a 100 ml/h e inoculado con un cultivo mixto

formado por distintas cepas resistentes a los metales y procedentes de

distintos ambientes. La selección del cultivo bacteriano y el diseño del

RESULTADOS

228

reactor para favorecer la precipitación, dieron lugar a una elevada

precipitación de todos los iones.

Los bajos rendimientos obtenidos en el proceso de precipitación

llevado a cabo en el trabajo aquí presentado se corroboran si lo

comparamos con otros procesos como el de White y Gadd (1998), ya que

sólo en el caso del zinc se obtuvo una precipitación significativa con

respecto al volumen de medio procedente del reactor de bacterias sulfato-

reductoras, debido a la alta concentración de este metal en el lixiviado.

Este hecho experimental puede deberse a que en este trabajo no se ha

realizado ningún tipo de selección de las bacterias y se ha trabajado con

cepas de colección.

Parámetros Unid. White y Gadd (1998) Proceso Integrado

Volumen de trabajo l 1 0,8

Caudal volumétrico ml/h 100 12,5

Velocidad de dilución d-1 2,4 0,375

Tiempo empleado d 190 19

Cantidad de residuo tratada g 8000 50

Volumen de medio D.sp. l 456 4,8

Metales estudiados Cr(III) Ni(II) Zn(II) Cr(III) Ni(II) Zn(II)

Concentración del lixiviado mg/l 1,31 1,81 2,49 2,59 1,20 35,78

Cantidad tratada de metales mg 597,0 828,4 1134 14,24 6,58 196,84

Cantidad precipitada mg 581,9 664,0 1092,7 0,29 2,90 54,53

% precipitado - 97,5 80,2 96,4 2,1 44,1 27,7

Cant. precipitada/vol. D. sp. mg/l 1,28 1,46 2,40 0,06 0,60 11,36

Tabla 13: Parámetros pertenecientes al proceso de precipitación continua llevado a cabo por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo.

E.-CONCLUSIONES

CONCLUSIONES

231

• Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de solubilizar los

iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes en compuestos de carácter

insoluble cuando éstos se encuentran solos y en combinación. En

concreto, operando en régimen discontinuo At. ferrooxidans es

capaz de solubilizar 1,5 % de Cr(III), 22,6 % de Ni(II) y 53,25% de Zn(II) y

At. thiooxidans 1,35% de Cr(III), 24,25% de Ni(II) y 55% de Zn(II) de una

disolución metálica compuesta por 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y

200 mg de Zn(II) en 100 ml de medio.

• La presencia de una matriz sólida como la arena en el cultivo

discontinuo de las bacterias azufre-oxidantes provoca alteraciones

en el medio que inhiben la actividad celular y, por tanto, impiden el

proceso de solubilización de compuestos metálicos.

• El proceso de solubilización en continuo propuesto permite lixiviar los

compuestos metálicos presentes en una arena contaminada

artificialmente. El crecimiento en continuo de At. thiooxidans en

cultivo sumergido produce un medio de elevada acidez que puede

ser empleado de forma continua como agente lixiviante sobre el

lecho de arena contenido en una columna. Los porcentajes de

solubilización obtenidos haciendo pasar 11,4 l de medio ácido por 50

g de arena (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II)) fueron

de un 55,4% de Cr(III), 100% de Ni(II) y 100% de Zn(II) del total añadido.

• Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de reducir el

cromo hexavalente a cromo trivalente mediante la producción de

compuestos reductores obtenidos a partir de la oxidación de azufre

elemental. En cultivo discontinuo, At. ferrooxidans es capaz de reducir

totalmente un cultivo con 5 ppm de Cr(VI) en dos días y el 32,7% de

10 ppm, tras 11 días de incubación. Sin embargo, At. thiooxidans se

muestra más sensible a la presencia de este ion, y sólo es capaz de

CONCLUSIONES

232

alcanzar un reducción del 64,7% de 5 ppm de Cr(VI), tras 11 días de

incubación, y el 16,5% de 10 ppm, encontrándose una elevada

inhibición para esta concentración.

• La capacidad de reducción del Cr(VI) y de solubilización del Cr(III) de

las bacterias azufre-oxidantes se puede aplicar de forma simultánea

en un proceso continuo con el fin de reducir la toxicidad de un

residuo de cromo (30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI)). El proceso

diseñado permite la reducción de un 92,66% del Cr(VI) y la

solubilización de un 12% del Cr(III) de un total de 157 g de este residuo

cuando se hacen pasar 4 litros de medio ácido.

• Las bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio

sp., pueden tolerar la presencia de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) y

precipitarlos a partir de compuestos solubles, como sulfatos, cuando

se encuentran solos y en combinación. El cultivo puro (Desulfovibrio

vulgaris) tolera la presencia de 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10

ppm de Zn(II) alcanzando para dichas concentraciones una

precipitación del 24,7% del Cr(III), 96% del Ni(II) y 92,7% del Zn(II). El

cultivo mixto (Desulfovibrio sp.) tolera la presencia de 15 ppm de

Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 20 ppm de Zn(II) obteniéndose la

precipitación en estos casos del 25,5% del Cr(III), 96,1% del Ni(II) y 93%

del Zn(II). Los porcentajes de precipitación de dichos iones son

bastante similares cuando éstos se encuentran en combinación para

los dos cultivos estudiados.

• El proceso propuesto para la precipitación continua de cromo, níquel

y zinc en solución permite evitar el problema de inhibición y toxicidad

de estos metales sobre la actividad celular de las bacterias sulfato-

reductoras. El tratamiento de un total de 33,08 mg de Cr(III), 19,74 mg

de Ni(II) y 214,84 mg de Zn(II) mediante este sistema permite la

CONCLUSIONES

233

precipitación del 30,8% de Cr(III), 56,6% de Ni(II) y 97,2% de Zn(II). Este

hecho hace que sea susceptible de ser empleado para la

precipitación de los metales presentes en las disoluciones obtenidas

en el proceso de solubilización en continuo llevado a cabo por las

bacterias azufre-oxidantes

• Tanto At. ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en

espuma de poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como

fuente de energía, siendo dicha inmovilización más efectiva para el

segundo de ellos. Por ello la producción de medio ácido puede ser

favorecida por la aplicación de esta operación empleando

columnas de At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de

poliuretano.

• El proceso de solubilización en régimen continuo resulta más efectivo

cuando el crecimiento de At. thiooxidans se realiza inmovilizando las

bacterias sobre espuma de poliuretano. Este hecho proporciona una

mayor producción de ácido y, por tanto, una mayor solubilización de

los metales si lo comparamos con la solubilización obtenida para un

volumen igual obtenido por At. thiooxidans en cultivo sumergido. Con

5,5 litros de medio ácido se obtuvo la solubilización del 17% de Cr(III),

34,3% de Ni(II) y 99,3% de Zn(II).

• La adaptación de una etapa de precipitación con las bacterias

sulfato-reductoras al proceso de solubilización en continuo, proceso

integrado, da lugar a la alcalinización de los lixiviados pero la

precipitación de lixiviados de baja concentración metálica fue

insignificante, por lo que esta etapa sólo resulta efectiva cuando se

tratan concentraciones relativamente elevadas permitiendo la

eliminación de los metales en la solución y la acidez típica de este

tipo de medios.

CONCLUSIONES

234

• El proceso propuesto resulta ventajoso para residuos contaminados

por metales y de características ácidas que puedan ser retirados de

su origen (lodos, aguas residuales) ya que permitiría la posterior

deposición o la reutilización del residuo, pero no sería favorable para

medios naturales contaminados que se deseen recuperar o devolver

a su forma habitual, como suelos o sedimentos, dado que la

transformación de estos medios mediante el proceso desarrollado

daría lugar a características diferentes (pH, conductividad, materia

orgánica, flora bacteriana…) a las originales de estos medios antes

de ser contaminados.

F.-BIBLIOGRAFÍA

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