estudio de perfiles de expresiÓn gÉnica en pacientes …
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TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
PRESENTA:
Q. C. Judith Villa Morales
DIRECTORES :
DR. DIEGO JULIO ARENAS ARANDA
DR. ABSALOM ZAMORANO CARRILLO
MEXICO,D.F. JUNIO 2009
ESTUDIO DE PERFILES DE EXPRESIÓN GÉNICA EN
PACIENTES CON NEUROFIBROMATOSIS TIPO 1: EXPRESIVIDAD CLÍNICA MODERADA Y SEVERA
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA
Y HOMEOPATIA POSGRADO EN BIOMEDICINA MOLECULAR
Agradecimientos:
A dios, por todo.
A mis padres, por el amor y el apoyo que siempre me han
dado.
A mis hermanos, por que la vida no seria tan bella, si faltara
alguno ellos.
Al resto de mi familia, por los momentos inolvidables que
nos mantienen unidos.
A todas las personas que me apoyaron para lograr una meta
más en la vida: Amigos, profesores y compañeros de trabajo.
A mis tutores y miembros del comité, gracias por el apoyo y
la enseñanza para realizar este trabajo.
INDICE
Lista de abreviaturas i
Lista de gráficas iv
Lista de figuras vi
Lista de tablas vii
RESUMEN viii
ABSTRACT ix
INTRODUCCION
Generalidades de Neurofibromatosis tipo 1(NF1) 10
Características clínicas de la Neurofibromatosis tipo 1 11
Otras Manifestaciones Clínicas 14
Características del Gen nf1 y la Neurofibromina 14
Neurofibromina y su interacción con la familia de RAS 15
Vía de señalización de RAS 15
Mutaciones en la NF1 18
ANTECEDENTES 19
Perfiles Moleculares entre Neurofibromas Plexiformes y Tumores
malignos obtenidos de pacientes con NF1.
19
Perfil transcripcional de líneas celulares obtenidas de MPNSTs y
células de Schwann normales
21
HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS 22
MEME 22
BD JASPAR 24
Planteamiento del problema 25
JUSTIFICACIÓN 26
OBJETIVO GENERAL 27
OBJETIVOS PARTICULARES 28
MATERIAL Y MÉTODOS 29
Diseño de estudio experimental 29
Criterios de selección, inclusión y exclusión 30
Criterios de selección del estudio computacional 31
Estrategia experimental 32
Obtención de ARN total 33
Procesos de Microarreglos de expresión 33
Hibridación 34
Escaneo 34
Validación de genes mediante RT-PCR 36
Metodología Bioinformática 37
Búsqueda en MEME 38
Búsqueda en JASPAR 39
RESULTADOS 40
Pacientes seleccionados 40
ARNm Obtenido de pacientes 41
Resultados de Microarreglos 42
Resultados Bioinformáticos 50
DISCUSIÓN 56
PERSPECTIVAS 60
CONCLUSIONES 61
BIBLIOGRAFIA 62
LISTA DE ABREVIATURAS
NF1 Neurofibromatosis tipo 1
NF2 Neurofibromatosis tipo 2
CALS Manchas café con leche
MPNSTs Tumores Malignos de Vaina de nervios periféricos
nf1 Gen asociado a Neurofibromatosis 1
LOH Pérdida de heterocigocidad
ARN Ácido ribonucleíco
ARNm Ácido ribonucleíco mensajero
GTPasa Enzima de activación relacionado a guanidil -trifosfatasa
GRD Dominio de activación relacionada a GTPasa
GEF Factores Intercambiadores
TFBs Sitios de unión asociados a factores de transcripción
TF Factores de transcripción
5’ UTR Región 5´ no traducida
RT-PCR Retro transcripción mediante reacción en cadena de
polimerasa
ARNc Ácido ribonucleíco complementario
CY3 Cyanina 3
CY5 Cyanina 5
ADNc Ácido desoxirribonucleíco complementario
ARG1 Arginasa1
ANXA3 Anexina3
MgCl2 Cloruro de magnesio
i
RT- MMLV Retrotranscriptasa de Leucemia de Virus Murino Maloney
BD Base de datos
MA Expresividad clínica Moderada Adulto
MN Expresividad clínica Moderada Niño
LEV Expresividad clínica leve
SEV Expresividad clínica severa
RATIO Radio o Nivel de expresión de señal de fluoroforo
nt Nucleótidos
GC Regiones de guaninas y citosinas
AT Regiones de adeninas y timinas
i
LISTA DE GRAFICAS
Gráfica 1. Niveles de expresión de 9 genes analizados en microarreglos 44
Gráfica 2. Niveles de expresión de ARG1 y ANXA3 45
Gráfica 3. Comparación de los niveles de expresión entre Neurofibromas y
sangre periférica
46
Gráfica 4. Comparación de Niveles de expresión en factores de
transcripción
49
Gráfica 5. Contenido nucleotídico de motivos encontrados en regiones
promotoras
51
Gráfica 6. Resultados de BD JASPAR de regiones promotoras de genes
sobre expresados
52
Gráfica 7. Resultados de BD JASPAR de regiones promotoras de genes
sobre expresados
53
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mecanismo Molecular de Neurofibromas 13
Figura 2. Vías se señalización donde participa la Neurofibromina
(NF1)
17
Figura 3. Página Web del buscador MEME. 23
Figura 4. Metodología General. 32
Figura 5. Metodología General de Microarreglos. 35
Figura 6. Diseño de tamaños de UTRs 5’ para MEME. 37
Figura 7. Presentación de motivo en MEME. 38
Figura 8. Página principal de la base de datos de JASPAR. 39
Figura 9. ARN total en biochip Agilent. 41
Figura 10. Expresión de ARNm de Arginasa1. 47
Figura 11. Expresión de ARNm de Anexina3. 48
vi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Resultados de genes alterados en neurofibromas 20
Tabla 2. Resultados clínicos 40
Tabla 3. Cuantificación de ARN total 41
Tabla 4. Resultados de microarreglos. 43
Tabla 5. Motivos encontrados en las regiones UTR de genes sobre y
sub expresados.
50
Tabla 6. Factores de Transcripción Putativos en regiones promotoras
de genes sobre expresados
54
Tabla 7. Factores de Transcripción Putativos en regiones promotoras
de genes sub expresados
55
vii
RESUMEN
La neurofibromina, es una proteína codificada por el gen nf1, que
regula de forma negativa la activación de la vía de señalización del
oncogen Ras, la cual se encuentra alterada en los pacientes con
neurofibromatosis tipo 1. Para estudiar los perfiles moleculares de
esta enfermedad, se identificaron los niveles de expresión
correspondientes a 44,000 secuencias génicas en muestras de
pacientes con expresividad clínica Moderada y Severa. Siete genes
se detectaron como sobre expresados (ARG1, ANXA3, CEACAM8,
CEACAM6, CAMP, MMP1, CASP8) en los pacientes con expresividad
clínica moderada en adulto y niño (MN, MA) y como sub expresados
en el paciente severo. Asimismo, mediante ensayos de RT-PCR se
confirmó la sobre expresión del ARNm de los genes ARG1 Y
ANXA3 los cuales ya han sido asociados a malignizaciones
hepáticas. Por otro lado, los sitios de unión asociados a factores de
transcripción (FTBs) putativos, encontrados en los promotores de
genes sobre y sub expresados en los tumores benignos de NF1, se
compararon con los niveles de expresión que dichos FTBs
presentaron en el análisis de microarreglos de Sangre periférica.
viii
ABSTRACT
The neurofibromin, a protein encoded by the gene nf1, functions as a negative
regulator of the signaling pathway of the Ras oncogene, and is altered in
patients with neurofibromatosis type 1. Here, identified the expression levels of
44,000 genes sequences in samples from patients with variable clinical
expression (moderate and severe), over and down expressed genes were
compared between different clinical expressions, seven genes were over
expressed (ARG1, ANXA3, CEACAM8, CEACAM6, CAMP, MMP1, CASP8) in
patients with moderate clinical expression in adult and child (MN, MA). So
interesting, the same 7 genes are down expressed in the patient severe. RT-
PCR test confirmed mRNA expression of genes ARG1 and ANXA3 which have
been associated with malignant liver. Furthermore, we compared the binding
sites associated with putative transcription factors (FTBs), found at the over and
down expressed genes in benign tumors in NF1 and the possible correlation of
FT expression levels than those presented in the analysis of microarray of
peripheral blood.
ix
INTRODUCCION
Las facomatosis son un grupo de enfermedades caracterizadas por
malformaciones tisulares de tipo tumoral, lesiones múltiples del ectodermo y
neuroectodermo. También se les ha denominado displasias blastomatosas. El
término facomatosis deriva de la presencia de hamartomas lentiformes en el
iris, en la retina o en el disco óptico (lenteja y cristalino), dentro de las
facomatosis más frecuentes se encuentra la esclerosis tuberosa (OMIM #191100) o
enfermedad de Bourneville cuya frecuencia la sitúa como la segunda
facomatosis más frecuente con una tasa de incidencia de 1 en 10 000 recién
nacidos y la neurofibromatosis tipo 1 (OMIM # 162200) o enfermedad de Von
Recklinghausen cuya frecuencia la sitúa en el tercer lugar por su incidencia de
1 en 3000 recién nacidos.
Generalidades de Neurofibromatosis tipo 1(NF1) El término neurofibromatosis se utilizó de forma general, hasta la década de los
80’s para describir dos enfermedades (NF1 y NF2) genéticas diferentes. La
Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) fue descrita por primera vez en 1793 por Von
Tilesius; posteriormente, en 1882 Von Recklinhausen describe esta
enfermedad en varios miembros de una misma familia determinando su
descripción clínica. La diferencia entre neurofibromatosis tipo 1 (OMIM 162200)
y Neurofibromatosis tipo 2 (OMIM 101000), se estableció en 1987 cuando
Barker, Seizinger y Rouleau, identificaron los genes relacionados con cada
enfermedad (Theos et al; 2006). La NF1 es una enfermedad de herencia
autosómica dominante, presenta una frecuencia de 1 en 3000 individuos, se
produce por una mutación en el gen nf1 que se encuentra en el brazo largo del
cromosoma 17 (q11.2). Es una enfermedad genética que presenta una
penetrancia del 100% y expresividad variable de acuerdo a la edad. Sus
manifestaciones clínicas más importantes son el glioma del nervio óptico,
manchas cutáneas de color café con leche, nódulos de Lisch, hamartomas del
iris, neurofibromas dérmicos o plexiformes y en menor frecuencia se observan
alteraciones óseas como displasia del esfenoíde, adelgazamiento de la cortical
de huesos largos (Theos et al; 2006). La Neurofibromatosis tipo 2 (NF2), es una
enfermedad autosómica dominante, con una incidencia de 1 en 30,000
individuos, está enfermedad se produce por mutaciones en el gen nf2, que esta
en el cromosoma 22, codifica para la proteína merlina o schwanomina, los
signos clínicos de esta patología son tumores en sistema nervioso y
anormalidades oculares (Base et al; 2005).
Características clínicas de NF1
El Instituto Nacional de Salud (NIH por sus siglas en inglés) de E.U.A. definió
en 1987, los criterios diagnósticos para la neurofibromatosis y propuso el
nombre de NF1, en el cual se establece que debe cumplir con dos de los
siguientes seis criterios clínicos para determinar una NF1.
1. Seis o más manchas café con leche (CALS), deben de ser mayor de 5
mm en niños y de 15 mm de diámetro en pacientes adultos.
2. Dos o más neurofibromas cutáneos o subcutáneos, o un neurofibroma
plexiforme.
3. Pecas inguinales o axilares.
4. Glioma del nervio óptico.
5. Dos o más nódulos de Lisch.
6. Lesiones óseas distintivas, como displasia del esfenoides,
adelgazamiento de huesos largos y seudoartrosis.
Los datos clínicos han sido bien estudiados, se sabe que las manchas café con
leche, también llamadas CALS pueden presentarse en individuos normales, sin
embargo, las pecas inguinales o axilares son hiperpigmentaciones poco
comunes. El glioma óptico se presenta en el 15% de estos pacientes durante la
primera década de la vida, lo que puede llevar a un deterioro visual rápido ya
que compromete la vista, debido a esto los pacientes deben ser vigilados
frecuentemente. Por otro lado, las anormalidades óseas ocurren en el 20% de
los pacientes, se presentan displasias al nacimiento, osteoporosis, fibromas no
osificantes y escoliosis. También en el 10 % de los pacientes se producen
fracturas y deformaciones óseas en etapas tempranas. Existen complicaciones
vasculares como la estenosis vascular, aneurismas y fístulas arteriovenosas
que involucran a la aorta abdominal y sus bifurcaciones estas complicaciones
sólo ocurren en el 1% de estos pacientes (Theos et al; 2006).
Los neurofibromas en la piel se presentan durante la infancia, son tumores
benignos que derivan de la vaina del nervio y varían según el tamaño y
número, pueden ser dérmicos o plexiformes. Los neurofibromas dérmicos se
reconocen por su tamaño pequeño y un crecimiento discreto de forma cutánea
o subcutánea. Los neurofibromas plexiformes se forman internamente a lo
largo del plexo de un nervio periférico mayor; se caracterizan por tener un
tamaño mayor, tienen incremento en la matriz extracelular y en la
vascularización; sin embargo, ambos neurofibromas están compuestos por
células de Schwann (60-80%), neuronas, fibroblastos, células perineurales,
mastocitos y otras células (Ferner .et al; 2007).
Del 10% al 15% de los pacientes con neurofibromas pueden desarrollar otros
tumores de tipo maligno que se forman en la vaina de nervios periféricos
(MPNSTs por sus siglas en inglés), los cuales cubren áreas más extensas
(Trovo- Marqui et al; 2006). Los mecanismos moleculares responsables de la
transformación de tumor benigno a maligno no se conocen claramente, pero ya
se han identificado algunas alteraciones relevantes como la mutación de los
dos alelos en el gen nf1 que produce pérdida de la función en la
neurofibromina, esto asociado a otros mecanismos epigenéticos puede llevar a
la mutación de otros genes importantes en la regulación como son p53 y Ink4A,
lo que provoca el proceso de malignización (fig 1).
Figura 1. Mecanismo Molecular de Neurofibromas. El proceso molecular
que debe ocurrir para que se desarrolle la malignización, a partir de un
neurofibroma benigno a uno maligno, propuesto por Amy Theos, en el 2006.
nnff11 ++//--
HHaappllooiinnssuuffiicciieenncciiaa
MMuuttaacciióónn
nnff11 --//-- PPEERRDDIIDDAA DDEE HHEETTEE--
RROOCCIIGGOOCCIIDDAADD PPeerrddiiddaa ddee llaa ffuunncciióónn
NNEEUURROOFFIIBBRROOMMAASS
pp5533 IInnkk44AA pp1166
oottrrooss
MMaalliiggnniizzaacciióónn MMPPNNSSTTss
1100%%
Mutación de otros Genes Mecanismos Epigenéticos
Otras Manifestaciones Clínicas
Existen otras alteraciones clínicas que se han presentado en esta patología,
como son las de tipo psiquiátrico (33 %), la distimia se ha presentado en mayor
porcentaje, en otros casos se observa depresión, ansiedad y desórdenes de la
personalidad. El déficit de atención y alteraciones del lenguaje se presenta en
el 60% de los pacientes. Estas manifestaciones se observan de acuerdo al
grado de expresividad de cada uno de los pacientes, ya que produce un
impacto por la apariencia física y la calidad de vida que llegan a presentar.
Características del Gen nf1 y la Neurofibromina En 1990 el gen nf1 fue localizado mediante una clonación en el cromosoma 17
en el brazo largo en la región q11.2, está formado por 60 exones y tiene una
longitud aproximada de 350 kb. Este gen produce un ARNm con tamaño de 11
a 13 kb dependiendo de la isoforma, el gen nf1 realiza splicing alternativo en
sus exones 9, 23 y 48, codifica para la proteína Neurofibromina que está
formada por 2818 aminoácidos y tiene un peso aproximado de 280 kDa, se
expresa durante el desarrollo embrionario, mayoritariamente en el sistema
nervioso, también en otros tejidos como cerebro, cordón espinal y linfocitos.
(De Luca et al; 2004).
La Neurofibromina tiene una región funcional muy importante, conocida como
dominio de activación relacionado a GTPasa (GRD) de aproximadamente 21
aa; el dominio GRD está formado por los exones del 21 al 27. La función del
dominio GRD es interaccionar con la GTPasa intrínseca del complejo p21-Ras-
GTP para hidrolizar el GTP a GDP, esto hace que se inactive a p21-Ras, en su
funcionamiento normal. Por lo que la Neurofibromina es un regulador negativo
de proliferación y diferenciación celular (Jentarra et al; 2006).
Neurofibromina y su interacción con la familia de RAS Cabe señalar que la Neurofibromina participa en diversas vías de señalización,
como en la vía de Ras, el oncogen Ras es miembro de una gran familia de
proteínas de aproximadamente 21 kDa, son GTPasas monoméricas asociadas
a membranas, las cuales se presentan en dos formas, unida a GTP es su
forma activa y unida a GDP es su forma inactiva. La familia de Ras es una
subfamilia que pertenece a la superfamilia de proteínas G y está formada por
HRas, KRas, NRas, R-Ras, TC21, MRas, Rap 1A, Rap 1B, Rap 2A, Rap 2B,
Ra1A y Ra1B.
Ras GTPasa es un mediador esencial en vías de señalización que llevan a un
estimulo extracelular para los receptores de superficie celular. Las proteínas
RAS actúan como interruptores moleculares en el proceso de proliferación,
diferenciación, sobrevivencia y muerte. Estas pueden ser activadas mediante
receptores tirosina cinasas, acoplada a receptores de proteínas G Hetero
trimérica, receptores de citosinas, canales de calcio e Integrinas (Auki et al;
2008).
Vía de señalización de Ras El dominio GRD, mediante el cual interacciona la neurofibromina y Ras,
funciona como regulador celular, que traduce señales de la membrana
plasmática hacia el núcleo mediante efectores río abajo, a través de su dominio
estimula la hidrólisis de GTP a GDP que es su forma inactiva, suprimiendo la
función de proliferación celular.
Ras en su forma natural se encuentra inactivo ya que es un gen supresor de
tumor, para que Ras sea activado debe existir un factor de crecimiento el cual
hace contacto con los receptores de superficie membranal tirosina cinasa,
éstos activan factores intercambiadores (GEF), que se unen a proteínas
adaptadoras como Grb2, Shc, Shc2 y Gab, las cuales activan a SOS1 que es
una cinasa que fosforila a GDP-Ras (Inactivo) y es trifosfatada en su forma
GTP-Ras (activo), enviando señales a las cinasas BRAF, ARAF Y RAF1, que
van a fosforilar a MEK y este a su vez a ERK, el cual actúa directamente sobre
los factores de transcripción JUN/MYC que inician el proceso de proliferación
celular. Otra vía de señalización que se activa mediante GTP-Ras es a través
de la vía de fosfoinositol 3’ cinasa (PI3) que envía señal a AKT y da como
resultado la inhibición de la apoptosis (Ming-Jen et al; 2007).
Figura 2. Vías se señalización donde participa la Neurofibromina (NF1). La
vía de Ras es la que esta afectada en los pacientes con NF1. La
Neurofibromina participa en otras vías importantes que están reguladas por
genes asociados en procesos de cáncer como son: p53, RB y INK4A (Ming-Jen
et al; 2007).
Mutaciones en nf1
Como ya mencionamos el gen nf1 es muy grande, esto ha impedido que se
pueda estudiar de forma completa, estudios recientes indican que este gen
puede presentar mutaciones a lo largo de los 60 exones que lo forman. Se han
reportado mutaciones variables, el 50% son de novo, el 5% son pérdida del gen
completo, mutaciones puntuales, rearreglos cromosómicos, inserciones,
deleciones, etc. La pérdida de la heterocigosidad (LOH por sus siglas en inglés)
es cuando hay una primera mutación germinal y por mecanismo epigenéticos
ocurre una segunda mutación y se pierden los dos alelos en nf1, lo que lleva a
la producción de tumores benignos como los neurofibromas, los cuales pueden
desencadenar a tumores malignos como son los MPNSTs.
ANTECEDENTES
La Neurofibromatosis tipo 1 ha sido estudiado ampliamente, lo que ha permitido
conocer el gen nf1 y sus características peculiares en tamaño, número de
exones y tipo de mutaciones que dicho gen ha presentado. El gen nf1 codifica
la Neurofibromina, que es una proteína que participa en vías de señalización
como Ras, mTOR y Akt. Las funciones de estos genes han sido estudiadas a
través de los tumores benignos y malignos que se presentan en los pacientes
con NF1.
A partir del 2002 se publicaron diferentes trabajos basados en el análisis de
tumores de NF1, donde se emplearon nuevas metodologías que daban un
panorama global en el comportamiento de las enfermedades, muchos grupos
de investigación hicieron el abordaje metodológico mediante perfiles
transcripcionales o estudios de microarreglos de expresión, lo que permitió
conocer el comportamiento de miles de genes que participan o están asociados
a las patologías estudiadas. Como sucedió con diversos estudios de expresión
que se realizaron en el 2004 en neurofibromatosis tipo 1 (Bieché et al; 2004).
Perfiles Moleculares entre Neurofibromas Plexiformes y Tumores malignos obtenidos de pacientes con NF1
En el 2004, Bieché realizó un estudio de perfiles moleculares, entre los
neurofibromas plexiformes (tumores benignos), que pueden dar origen a la
formación de MPNSTs. Ambos tumores se analizaron mediante RT-PCR en
tiempo real. En este trabajo analizaron la expresión de 489 genes que
participan en diversos procesos celulares y moleculares, que están asociados a
la tumorigénesis y aquellos genes que participan en la diferenciación de células
de Schwann. Analizaron 14 neurofibromas plexiformes, 9 MPNSTs y 10
neurofibromas dérmicos que son los más comunes en pacientes con esta
patología. Las muestras fueron procesadas en las mismas condiciones y con la
misma cantidad, se midieron los niveles de expresión del ARNm mediante RT-
PCR en tiempo real, basada en la metodología de fluorescencia verde SYBR
GREEN (Hiatt et al; 2004).
Los resultados mostraron la sobre expresión de 27 genes, de los cuales 16
genes pertenecían a las 9 muestras de MPNSTs y 14 genes en los plexiformes.
16 genes participan en funciones de proliferación celular (MK167, TOP2A,
CCNE2), en senescencia (TERT, TERC/Htr), apoptosis (BIRC5/survivin, TP73)
y remodelamiento de matriz extracelular (MMP13, MMP9). 13 genes estaban
sub expresados en los 9 MPNSTs, 12 genes son específicos de tipos celulares
como células de Schwann (L1CAM, MPZ, S100B, SOX10) y mastocitos (CMA1,
TPSB) como se observa en la tabla 1.Otros genes están involucrados en el
remodelamiento de matriz extracelular (ITGBA4, TIMP4) y en la vía de
señalización de Hedgehog-Gli (DHH, PTCH2). Esta investigación encontró dos
genes que están involucrados en apoptosis, como son BIRC5/survivin y TP73
que están sobre regulados en los tumores malignos, se sabe que estos genes
codifican una proteína anti apoptótica, la cual está sobre expresada en algunos
cánceres humanos. Los resultados sugieren que la activación inapropiada de
vías de señalización ocurre específicamente en NF1 asociada a tumores
malignos o en aquellos de tipo cerebral o de piel ( Bieché et al; 2004).
Genes alterados Neurofibroma
Plexiforme
MPNSTs
(maligno)
Funciones
27 sobre-
expresados
14 9 Proliferacion
Senescencia
Remodelamiento
Apoptosis
13 sub-
expresados
0 13 Remodelamiento
Via hedgehog-gli
Tabla 1. Resultados de genes alterados en neurofibromas. Funciones de
los genes sobre y sub expresados en el estudio de tumores benignos y
malignos, realizado en el 2004 por Ivan Bieché.
Perfil Transcripcional de líneas celulares obtenidas de MPNSTs y células de Schwann normales.
En el 2004, R. Douglas Fields, del Instituto Nacional de Salud en Bethesda,
USA, realizó un perfil transcripcional en líneas celulares T265 derivadas de
MPNSTs, los cuales se compararon con una línea celular derivada de células
de Schwann normales. Fields analizó 4608 secuencias de ADNc utilizando la
metodología de Microarreglos, las secuencias alteradas fueron validadas
mediante RT-PCR semi cuantitativa y Western blot. La obtención de los dos
ARNm en ambas líneas celulares (tumoral y normal) se realizó en las mismas
condiciones, el diseño de los microarreglos fue por duplicado. Las células de
Schwann normales se extrajeron de dos donadores sanos. Se encontraron 955
genes alterados en su mayoría los provenientes de tumores malignos, de los
cuales 100 genes resultaron más alterados en los niveles de expresión, 88
genes no estaban reportados con funciones en las células de Schwann y se
han asociado a moléculas de adhesión celular, apoptosis, ciclo celular,
receptores de factor de crecimiento, factores de crecimiento,
neurotransmisores, traductores de señal y factores de transcripción (Fields, et
al; 2004).
La tecnología de microarreglos inició una etapa donde se introdujeron
herramientas bioinformáticas o computacionales, las cuales se han empleado
de forma integral. Estas dos metodologías han permitido estudiar
enfermedades como el cáncer y ayudan a predecir redes génicas que
participen en dicho proceso, lo cual ha reducido los costos de investigación y
los tiempos para determinar blancos específicos los cuales deben ser validados
de forma experimental.
HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS
Actualmente se han desarrollado predicciones computacionales lo que ha
ayudado a reducir costos en investigaciones masivas, como en el uso de
microarreglos. Recientemente, se han publicado análisis integrales (Chao et al;
2007; Lea et al; 2007) en los cuales se han estudiado factores de transcripción
en búsqueda de genes blanco con programas computacionales. Hasta el
momento no existe algún trabajo de este tipo que integre la bioinformática con
Neurofibromatosis tipo 1.
MEME (Multiple EM for Motifs Elucidation)
MEME es una herramienta computacional que identifica patrones en
secuencias biológicas, que permite descubrir nuevos sitios de unión a factores
de transcripción y dominios de proteínas. Este programa trabaja buscando
repetidos o patrones de secuencias de ADN o proteínas.
MEME emplea técnicas de modelamiento estadístico para seleccionar
automáticamente la mejor longitud, número de ocurrencias y descripción del
motivo, considerando la probabilidad de mutación dependiente de la posición
por matrices que representan cadenas de Markov (Liang et al; 2008).
Posteriormente, permite comparar las secuencias encontradas con otras
secuencias o motivos que ya han sido reportados y asociados ha algún factor
de transcripción en alguna especie en particular. Estos patrones de secuencias
(Motivos) pueden ser promotores génicos o sitios que estén co-regulando
algún gene (fig. 3). Los cuales se deben de comprobar de forma experimental,
demostrando la función o la importancia biológica de dicho motivo (Bailey et al;
2006).
Figura 3. Página Web del buscador MEME. Se pueden consultar otras bases
de datos computacionales que ayudan a descubrir nuevos patrones de
secuencias biológicas.
Base de Datos JASPAR La BD JASPAR, es la colección más completa de Sitios de Unión Asociados a
Factores de Transcripción (TFBS) de acceso libre, la cual frecuentemente está
incorporando nueva información, lo que ha permitido que sea una colección
META, por lo que se ha dividido en: JASPAR CORE que es una versión más
amplia de la original, no es redundante y es una matriz de alta calidad basada
en perfiles de unión a Factores de Transcripción; JASPAR FAM es una
colección de modelos de familias de TFBS; JASPAR PHYLO FACTS está
formada por un grupo de matrices computacionales de representaciones
estadísticas y regiones de motivos reguladores conservados evolutivamente de
genomas de mamíferos (Vlieghe et al; 2006).
La BD JASPAR, se ha extendido y equipado con funciones adicionales, el
acceso se logra mediante la página http://jaspar.genereg.net. (Bryne et al;
2008).
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Se sabe que la neurofibromatosis tipo 1 tiene una incidencia de 1:2500
individuos. En la población mexicana no existen datos de incidencia sobre ésta
enfermedad; en el servicio de Genética Clínica y Dermatología del Instituto
Mexicano del Seguro Social, hemos observado que existe una gran demanda
por parte de estos pacientes, lo que ha despertado nuestro interés para
estudiar molecularmente esta patología. Reportes recientes han planteado que
el gen nf1 puede presentar mutaciones a lo largo de sus 60 exones y no tiene
sitios blancos, debido a esto no hay una correlación entre los mecanismos
moleculares de la patología y la expresividad clínica en cada uno de los
individuos (Upadhyaya et al; 2008, Upadhyaya et al; 2009).
Hasta el momento sólo se han realizado estudios de expresión génica entre
MPNSTs y tumores benignos provenientes de pacientes con NF1, los cuales
han demostrado que existen cambios en la expresión de genes reguladores de
ciclo celular, apoptosis, remodelamiento de matriz extracelular y otros genes
que aun se desconoce si participan en alguna vía de señalización (Bieché et al;
2004).
JUSTIFICACIÓN Hasta donde sabemos no existe un estudio de microarreglos, donde se
comparé la expresión génica de cada paciente y la expresividad clínica variable
entre cada uno de ellos. Realizar esta investigación nos ayudará a proponer
una asociación entre los diferentes grados de expresividad clínica de NF1
(moderada y severa) y aquellos genes que presenten una expresión alterada
(sobre y sub expresión).
Por otro lado, realizar la búsqueda de motivos en las regiones promotoras de
genes sobre y sub expresados en neurofibromas (Bieché et al; 2004), nos
ayudará a predecir sitios de unión asociados a FT (FTBs) que puedan
interaccionar con otros genes que participen en la vía de RAS o que estén
asociados a genes formadores de tumores. Posteriormente, realizaremos una
comparación entre los FTBs encontrados computacionalmente y el nivel de
expresión de estos FT en cada uno de los microarreglos. Lo anterior, nos
permitirá proponer si existe asociación entre la función de FTBs y la
expresividad clínica variable de cada uno de los pacientes con NF1.
Esta investigación piloto, contribuirá para proponer una asociación entre la
expresividad clínica de NF1 y genes que resulten sobre o sub expresados y
que puedan estar involucrados en el grado de expresividad de esta patología.
Así también, establecer nuevas comparaciones en el uso de microarreglos y el
análisis bioinformático.
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Existen diferencias entre los perfiles de expresión génica de pacientes
afectados con neurofibromatosis tipo 1 con respecto a la expresividad clínica
variable que cada uno presenta? ¿Existen FTBs putativos con funciones que
puedan asociarse a NF1?
OBJETIVO GENERAL Identificar genes que puedan estar asociados a la expresividad variable de la
Neurofibromatosis tipo 1 mediante microarreglos de expresión y comparar con
los FTBs putativos.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Identificar aquellos genes que están sobre y sub expresados en cada
paciente para establecer una posible asociación entre la expresión
génica y la expresividad variable de NF1.
2. Validación de los genes seleccionados
3. Identificar secuencias motivo que están asociados a sitios de unión de
factores de transcripción, en la 5’ UTR de genes sobre y sub expresados
en tumores de NF1.
4. Correlacionar los sitios de unión asociados a factores de transcripción
putativos encontrados computacionalmente en tumores, con el nivel de
expresión encontrado en el estudio de microarreglos.
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL Este estudio se realizó en el CMNSXXI Hospital de pediatría en la Unidad de
Investigación Médica en Genética Humana, en el Laboratorio de Biología
Molecular y en el Laboratorio de Bioquímica de la Escuela Nacional de
Medicina y Homeopatía del IPN.
Figura 4. Metodología General. Estrategias realizadas para correlacionar la
búsqueda de motivos asociados a FT en Neurofibromas y la parte
experimental en el estudio de microarreglos, donde también se hizo el análisis
computacional.
METODOLOGIA GENERAL
SSEELLEECCCCIIÓÓNN DDEE PPAACCIIEENNTTEESS
CCOONN NNFF11 EEXXTTRRAACCCCIIOONN DDEE AARRNN
ccAARRNN yy MMAARRCCAAJJEE
MMIICCRROOAARRRREEGGLLOOSS ANALISIS DE
RESULTADOS
BUSQUEDA DE MOTIVOS EN 5’ UTR EN GENES SUB Y SOBRE
CORRELACIONAR CON SITIOS DE UNION AL DNA
BBIIOOIINNFFOORRMMAATTIICCOO YY EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALL
Bieché et al; 2004
MATERIAL Y MÉTODOS
Diseño de estudio de microarreglos Tipo de estudio
• Observacional
• Transversal
• Analítico
• Comparativo
Definición de variables Variable Definición
conceptual Definición operacional
Escala de medición
Unidad de medición
Expresividad variable
El número de signos clínicos y el de neurofibromas definirá la Unidad de medición
Ordinal Leve (0-8) Moderada (9-16) Severa (más de 17)
Perfil de expresión de genes
Grado de expresión del microarreglo (ℓ10 ח)
Unidades de fluorescencia por escala logarítmica
Ordinal Sub-expresado(>1.0) Sobre-expresado(<1.0)Normo-expresado (=1.0)
CRITERIOS DE SELECCIÓN
Los pacientes fueron referidos de la consulta externa del servicio de Genética
Médica y del servicio de dermatología del Hospital de Pediatría y del hospital
de especialidades CMN La Raza y CMN SXXI. IMSS.
Criterios de inclusión
• Con diagnóstico clínico de NF1 con expresividad leve, moderada y
severa, padre e hijo(a).
• Aceptaron participar mediante el consentimiento informado
Criterios de eliminación
• Muestras sanguíneas inadecuadas
• Muestras con ARN insuficiente
Criterios de selección del Estudio Computacional
Fueron seleccionados cuatro genes que están sobre expresados y participan
en procesos de apóptosis, proliferación celular y cinco genes sub expresados
que se consideran marcadores específicos de células de Schwann y
Mastocitos, debido a que estas células son las formadoras de los
Neurofibromas. Estos resultados fueron reportados en perfiles transcripcionales
de neurofibromas (Bieché et al; 2004).
Tipo de estudio
• Descriptivo
• Comparativo
Definición de variable Variable Definición Conceptual Escala de medición
Factores de transcripción putativos (FTBs) en genes asociados a NF1
FTBs con funciones relacionadas a Apoptosis, Proliferación celular y que se encuentran como marcadores en células formadoras de neurofibromas
Sub-expresado Sobre-expresado
Criterios de inclusión
• Genes sobre y sub expresados relacionados en procesos asociados a
NF1.
METODOLOGÍA DE MICROARREGLOS La parte experimental de este proyecto incluyó la extracción de ARN total, el
estudio de Microarreglos de expresión (Agilent) y pruebas estadísticas ya
implementadas en un software que facilita el análisis de cada una de las
secuencias.
Obtención de ARN total:
Para la extracción de ARN total se uso el kit comercial RNeasy Mini Kit
(Qiagen) y la Técnica de TRIZOL (Invitrogen) para obtener el mejor rendimiento
y calidad en cada una de las muestras. Se verificaron las concentraciones e
integridad de las muestras de ARN, mediante espectrometría (nanodrop) y
electroforesis en geles de agarosa al 2%.
De las muestras de ARN total obtenidas para el estudio de microarreglos se
guardo una alícuota que se empleó para la RT- PCR, fue almacenada a –70°C.
Procesos del Microarreglo
(Two Colos Microarray-Based Gene Expresión Análisis, Agilent)
La técnica de Microarreglos es altamente sensible y presenta un panorama
global del comportamiento génico, es por eso que es una metodología formada
por varios procesos (fig. 5), que fueron realizados bajo condiciones estrictas de
esterilidad para obtener resultados confiables.
Obtención de ARNc Marcado:
Una vez que se obtuvo ARN total, se realizó el marcaje de cada una de las
muestras, con el método que indica el kit RNA Spike Two Colours, (agilent). Se
preparó cada sonda para marcaje (Cy3 y Cy5) en diluciones especiales (1:40 y
1:20), considerando la concentración de ARN total (200ng). Primero se
prepararon reacciones para sintetizar el ADNc (RT-PCR), posteriormente se
realizó el marcaje donde se empleó una mezcla de Transcripción, con la cual
se obtuvo el ARNc, se purificó mediante el kit RNeasy mini spin columns
(Qiagen), finalmente fue cuantificado (> 825 ug y una actividad especifica de
Cy3 y Cy5 >8.0 pmol) usando el espectrofotómetro NanoDrop 2100 (Agilent)
que permite medir estas variables.
Hibridación
Se emplearon los reactivos de hibridación para genes de expresión (Agilent). Al
ARNc se le agregó un agente bloqueante y posteriormente se adicionó una
mezcla de fragmentación de ARNc, de acuerdo a las características del
microarreglo donde se realizo la hibridación (chip de 4 X 44K, Agilent) el cual
permite que se hagan secuencias de menor tamaño, las cuales se pegan de
forma específica a cada una de las secuencias del gen, se preparó la mezcla
con ambas sondas y se procedió a hibridar sobre la laminilla a 65 °C por 17
horas.
Escaneo
Transcurrido el tiempo de hibridación, se lavó la laminilla con soluciones de
lavado (SSC) y de acetonitrilo que sirven para eliminar los residuos de las
sondas no hibridadas, ayudan a estabilizar y a secar cada uno de los
microarreglos.
Posteriormente, cada laminilla fue ensamblada en los adaptadores, colocando
el código de barras hacia el interior del carrusel para introducirla al escáner
dual laser (Agilent), Mediante el cual se verifican todos los parámetros
necesarios como son: la región de escaneo, resolución de escaneo (5 µm)
selección del Rango Dinámico, canal de fluorescencia para Cy5 (532nm) láser
SH-YAG y Cy3 (633 nm) láser HeNe.
Una vez que el equipo verificó todos estos datos, se procedió a iniciar el
escaneo mediante el programa de Genespring GX 5.0, que permitió extraer de
forma confiable los datos para realizar el análisis de Microarreglos.
Figura 5. Metodología General de estudio Microarreglos. Se marcan las
muestras, la de referencia (Cy3) (Rojo) y la Muestra experimental (Cy5)
(verde), se realiza la hibridación, los lavados y por ultimo se hace el escaneo
de laminilla, para obtener los datos que son analizados por programas
computacionales.
Muestra de Referencia
Muestra Experimental
cDNA
cDNA
ARNc ARNc
22 ccoolloorreess 11 ccoolloorr
Marcaje de muestras
Hibridación en chips 44 mil secuencias
Lavados
Escaneo y análisis en Genespring
Validación de ARG1 y ANXA3 mediante RT-PCR
La metodología de microarreglos debe ser validada técnicamente, mediante
otras pruebas que pueden ser cualitativas, semi-cuantitativas (RT-PCR) y/o
cuantitativas(PCR tiempo real). Una vez que se analizaron los datos de cada
uno de los microarreglos, seleccionamos dos genes que se expresaron de
forma diferencial de acuerdo a la expresividad clínica de la enfermedad. Para
realizar la RT-PCR primero se diseñó un par de oligonucleótidos para cada gen
(sentido y antisentido) con los programas Primer3 y Oligo 3.0 los oligos fueron:
para Arg1, sentido ‘aaggaaagattcccgatgtg’ y antisentido
‘ccgaaacaagccaaggttat’; Anxa3, sentido ‘catggcatctatctgggttg’, y antisentido
‘tcatctcttctgccatctgc’.
Se sintetizaron los ADN complementarios (ADNc) de cada muestra, partiendo
de 200 ng ARN total aislado de las mismas muestras que se utilizaron para los
microarreglos. Se utilizó la metodología de transcriptasa reversa MMLT-V
(Invitrogen). Para cada par de oligonucleótidos se estandarizaron las
condiciones mediante gradientes de temperaturas, concentraciones de MgCl2 y
concentración de oligos. Posteriormente, los productos amplificados por PCR
fueron revelados con bromuro de etidio () y sometidos a una electroforesis en
geles de agarosa al 2%, con intensidad de 60 volts durante 60 minutos. Las
bandas se observaron mediante la exposición de luz UV, donde se corroboró la
expresión de cada gen, de acuerdo a las muestras analizadas en los
microarreglos (Fig.10 y 11).
METODOLOGÍA BIOINFORMÁTICA Para realizar la búsqueda de motivos en MEME, fue necesario seleccionar
cada gen (Bieché et al;2004), mediante el numero de Gene Id y posteriormente
se buscó la secuencia en Ensembl, en el extremo 5’ seleccionando tres
tamaños de UTR (3000,600,300 nt) (Fig. 6)
Figura 6. Diseño de tamaños de UTRs 5’ para MEME. Selecciónamos
cuatro genes sobre expresados y cinco sub expresados que fueron
reportados por Bieché I., en el 2004, en el estudio de expresión que realizó en
tumores benignos y malignos obtenidos de pacientes con NF1,
computacionalmente se obtuvo cada una se las secuencias génicas,
seleccionando tres tamaños de UTRs 5’ de -3000, -600 y -300 nt., las cuales
se introdujeron en MEME para buscar secuencias motivos.
ORF
5’ 5’
M. MASTOCITOS
M. SCHWANN
M. SCHWANN
M. SCHWANN
M. SCHWANN
RREELLAACCIIOONNAADDOO
SUB-EXPRESA
DOS
CMA1
S100B
L1CAM
MPZ
SOX10
GGEENNEE
APOPTOSIS
PROLIF-CELULAR
PROLIF-CELULAR
APOPTOSIS
RREELLAACCIIOONNAADDOO
SOBRE-
EXPRESA DOS
TP73
CCNE2
MKI67 BIRC5
GGEENNEE
-3000-600
-300
5’ 3’
Búsqueda en MEME Las secuencias se guardaron en formato Fasta y se introdujeron los archivos
en el buscador de patrones implementados en www.meme.sdsc.edu, el cual
genera tres secuencias motivo que son seleccionadas de acuerdo al número de
coincidencias en cada una de las secuencias, a la amplitud y contenido de
información de cada nucleótido. Esto quiere decir que el primer motivo
reportado es el que tiene mejor valor estadístico y produce una secuencia
consenso considerando a cada uno de los genes que fueron analizados y que
comparten dicha secuencia (Fig. 7).
Figura 7 Presentación de motivo en MEME. Ejemplo del motivo que se
encontró en el buscador MEME en los genes sobre expresados, donde se
informan los valores estadísticos como son el valor de p, la cadena en la
que se encuentra el motivo (- y +), y el numero de nt donde inicia el
motivo.
Búsqueda en JASPAR Una vez que se obtienen los tres motivos, cada uno se compara con la BD
JASPAR, que cuenta con Sitios de Unión al DNA que están asociados a
Factores de Transcripción que ya han sido reportados, la cual nos proporciona
información adicional, como es el porcentaje de homología que existe entre el
motivo encontrado con el motivo de la BD, nos dice en que especie ha sido
encontrado, el contenido de información que tienen estos nucleótidos y el tipo
de estructura o función que tiene dicho motivo (Fig 8).
Figura 8 Página principal de la base de datos de JASPAR.
Resultados Pacientes seleccionados Seleccionamos a cuatro pacientes con expresividad clínica variable y edad
diferente (padre e hijo), la expresividad se determinó de acuerdo al número de
neurofibromas (Leve 1-8, Moderado 9-16 y Severo más de 17) y los datos
clínicos que cada uno presentó también se consideró un control adulto sin NF1
(tabla 1).
DATOS MODERADO
ADULTO (MA) LEVE (LEV)
SEVERO (SEV)
MODERADO NIÑO (MN)
EDAD 28 AÑOS 3 AÑOS 44 AÑOS 13 AÑOS
NEUROFIBROMAS 9 2 <30 15
GLIOMAS X X
N LISCH X X
PECAS AX /ING X X
CALS X X X X
DISPLASIAS X
Tabla 2. Resultados clínicos. Los datos Clínicos y número de neurofibromas
en cada uno de los pacientes que seleccionamos, donde MA es Moderado
Adulto, LEVE es Hija leve, SEVERO es Adulto Severo y MN es Moderado Niño.
Obtención de ARN total Las muestras de los pacientes fueron sometidas a las extracción de ARN total,
mediante la técnica de Trizol (Invitrogen), se verificaron en gel de agarosa al
2% y mediante Biochip de agilent (Fig. 9) y se cuantificaron en equipo
nanodrop (Tabla 3).
Figura 9. ARN total en biochip Agilent, nano 2100, MP es marcador de peso
especifico para el biochip, las 4 muestras procesadas para microarreglos.
Tabla 3. Cuantificación de ARN total. Muestras utilizadas para microarreglos
y CT es un control sin NF1.
Muestra Concentración ug/µl
Pureza A260/A280
MA 46.66 2.06
LN 63.95 2.02
SA 50.71 1.97
MN 88.18 2.07
CT 80.00 1.90
28s
18s
PB 7500
5500 2500 1500
500 200
MA LN SA MN MP
18s
28s
Resultados de Microarreglos Los resultados del estudio de microarreglos fueron procesados mediante
algoritmos estandarizados por el software Genespring, donde se realizó la
normalización y corrección del fondo, se analizó de forma individual la
hibridación de cada muestra, para validar la calidad de cada microarreglo, se
logró observar cientos de genes con el nivel de expresión alterado, los cuales
fueron comparados con el control sin NF1. El porcentaje de variación entre las
muestras, se obtuvo al calcular el total de genes aproximados en el genoma
humano (23 000), con esto podemos observar que la comparación entre la
expresividad moderada, leve y el normal se encuentran en los rangos
permitidos que consideran una buena hibridación, según los especifican los
parámetros en la tecnología de Agilent. (>9 %)(tabla 4).
.
Cabe señalar que el diseño experimental que se empleo en los microarreglos,
consideró las muestras del paciente Leve Niña (LN) y control sin NF1 (CT)
como referencia, donde las dos muestras tuvieron niveles de expresión
similares al ser evaluadas en cada uno de los canales del escáner, el leve fue
utilizado en el microarreglo con las muestras de MA y MN y el CT fue utilizado
en el microarreglo de el paciente severo. Debido a lo anterior la expresividad
Leve no fue considerada de forma experimental. El diseño comparativo en los microarreglos fue de la siguiente forma: MA vs LN
(Moderado adulto vs Leve Niña), SA vs MN (Severo Adulto vs Moderado niño),
MN vs LN (Moderado niño vs Leve Niña) y SA vs CT (Severo Adulto vs Control
sin NF1). Seleccionamos los 25 genes que presentaron los ratios o radios de
intensidad de señal más altos, lo que se interpretaron como sobre expresados
y los 25 más bajos que se interpretaron como sub expresados, además
obtuvimos el porcentaje global de genes alterados en cada uno de los
microarreglos (tabla 4).
MUESTRAS GENES SOBRE EXPRESADOS
GENES SUB EXPRESADOS
Porcentaje de genes alterados
MA vs LN
( Moderado vs Leve)
25 25 5.2 %
SA vs MN (Severo vs Moderado)
26 24 7.9%
MN vs LN ( Moderado vs Leve)
25 25 6.9%
SA vs CT
(Severo vs Control sin NF1)
25 25 4.6%
Tabla 4. Resultados de Microarreglos. En la columna izquierda esta
subrayada la muestra que fue medible con respecto a la referencia. Se
determinarón 25 genes que se encontraban con los mayores radios de
expresión lo que determina si los genes están sobre y sub expresados. El
porcentaje de genes alterados en la expresión, fue calculado de acuerdo al
numero de genes totales aproximados en el humano( 23 000).
Seleccionamos nueve genes de acuerdo a la función que cada uno realiza, al
comparar cada uno de ellos entre los diferentes grados de expresividad clínica,
observamos que los niveles de expresión en las muestras Moderadas están
sobre expresados en siete genes (ARG1, ANXA3, CEACAM8, CEACAM6,
CAMP, MMP1, CASP8) y en el severo están sub expresados, sin embargo, los
genes AREG y FOS están sobre expresados en todas las muestras (Gráfica 1).
Grafica 1. Niveles de expresión de 9 genes analizados en microarreglos. Expresión diferencial de genes alterados que seleccionamos de acuerdo a la
diferente expresividad clínica (MA, SA, MN) siete genes están sobre
expresados en la expresividad Moderada y sub expresados en el severo y dos
genes están sobre expresados en las tres muestras.
-1,5-1
-0,50
0,51
1,52
2,5
ARG1
ANXA3
CEACAM8
CEACAM6CAMP
MMP1
CASP8AREG
FOS
MA SA MN
RATIO
SOBRE EXPRESADOS
SUB EXPRESADOS
De los nueve genes que analizamos, seleccionados dos, que fueron Arginasa1
(ARG1) y Anexina3 (ANXA3) de acuerdo a la expresión diferencial que
observamos con respecto a la expresividad clínica variable. Dichos genes
están sobre expresados en las muestras Moderadas y sub expresados en el
severo (Gráfica 2).
Grafica 2. Niveles de expresión de ARG1 y ANXA3. La expresión génica
diferencial se observó de acuerdo a la expresividad clínica analizada en cada
muestra. Donde MN y MA estas sobre expresados y el SA esta sub expresado
como se puede observar en las barras azules (ARG1) y las de color rosa
(ANXA3).
1,7
-0,4
8
1,11,
409
-1,2
1
1,66
1-3
-2
-1
0
1
2
3
MA SA MN
ARG1 ANXA3
RATIO
SOBRE EXPRESADOS
SUB EXPRESADOS
Además, realizamos una comparación entre los niveles de expresión de genes
sobre expresados (BIRC5) y sub expresados (L1CAM y S100B) reportados en
neurofibromas (Bieché I., 2004) con respecto al nivel de expresión que dichos
genes presentan en sangre periférica, considerando la expresividad clínica de
NF1, el único gen que coincide es BIRC5 que está sobre expresado en MA al
igual que en los neurofibromas; sin embargo, se encuentra sub expresado en el
SA y MN. Por otro lado, los genes L1CAM y S100B están sub expresados en
MN y en neurofibromas están sobre expresados (Gráfica 3).
Grafica 3. Comparación de los niveles de expresión de tres genes en Neurofibromas y sangre periférica. Observamos la expresión de los genes
BIRC5, L1CAM y S100B estudiados en Neurofibromas (Bieché I.,2004), con
respecto a la expresión en sangre periférica de pacientes con NF1.
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
MA SA MN
BIRC5L1CAMS100B
RATIO
Se validó la expresión de ARG1 y ANXA3 mediante productos de RT-PCR. A
través de una electroforesis en gel de agarosa al 2 %, observamos la expresión
del gen ARG1, donde la expresividad clínica LN y SA presentan una banda con
menor intensidad que la observada en la expresividad MA y MN. En el último
carril se colocó la muestra de un paciente Moderado (MX) de 16 años, que no
fue considerado para el estudio de microarreglos por no tener antecedentes
familiares de NF1 de alguno de sus padres. Sin embargo, se puede observar
una banda intensa al igual que la muestra del paciente MA (Fig. 10).
Figura 10. . Expresión del ARNm de Arginasa1. El tamaño esperado para
ARG1 es de 457 pb. El primer carril es el marcador de peso y las 4 muestras
analizadas en microarreglos, donde hay sobre expresión para MN y MA y sub
expresión en la muestra de SA y LN, en el carril 6 se observa la Muestra (MX)
de otro paciente Moderado que no se incluyo para microarreglos, sin embargo,
podemos observar que si presentó una banda intensa comparada con MA.
LN SA MX
Al validar la expresión de el gen ANXA3, se observó que no hay bandas en las
muestras con expresividad clínica LN y SA como era esperado, ya que en los
microarreglos estas muestras están sub expresadas; sin embargo, en las
muestras de expresividad MA y MN, si hay bandas que coinciden con
marcador de peso, de acuerdo al tamaño esperado para este gen (Fig. 11).
Figura 11. Expresión de ARNm de Anexina3. El tamaño esperado para
ANXA3 es de 498 pb. En el último carril se observa el Marcador de Peso, CN
es un control negativo donde no se observó ninguna banda. Sin embargo en
MA y MN si se observa una banda que puede corroborar lo encontrado en los
microarreglos, donde estas muestras están sobre expresadas.
LN SA
Finalmente, buscamos el nivel de expresión de los factores de transcripción
que ya han sido asociados en procesos de malignización o desarrollo de algún
cáncer como JUN, Fos y MYC; Sin embargo, no encontramos datos en la
expresión que puedan asociarse a la expresividad clínica de NF1, debido a que
el comportamiento en los niveles de expresión es indistinto en las tres
condiciones clínicas evaluadas, los tres se observan sobre expresados,
debemos resaltar que en el MN se expresó en menor grado que los demás
(Gráfica 4).
Grafica 4. Comparación de Niveles de expresión en factores de transcripción. Los factores de transcripción JUN, Fos y MYC en sangre periférica de pacientes con
NF1 presentan sobre expresión en las tres condiciones clínicas analizadas.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
MA MN SEV
JUNFOSMYC
R
A
T
I
O
RESULTADOS BIOINFORMÁTICOS
Buscador MEME
Después de introducir al sistema MEME las secuencias de genes sobre y sub
expresados en tumores benignos de NF1 (Bieché et al; 2004), se obtuvieron
tres motivos en cada uno de los diferentes tamaños de secuencias 5’ UTR. Los
dos grupos de genes se analizarón por separado (sobre y sub expresados) en
dos tamaños de motivos unos de >20 nt y otros >10 nt. La codificación del
identificador del motivo se basa en el número secuencial del motivo (1,2,3) y el
tamaño de motivo, en el nucleótido (20 o 10)( tabla 5).
Motivo 3000 600 300 >M120 TCTAAAAAAAAAAAAAAAAA TGTTTTTATTTTTTA AAAAAAACGAAAA
>M220 TTTTTTTTTTTTTAGACTGAG TTTTTGAAGAGATGG TTTGAA+
>M320 AAAAATATATAAATAAATAA+ GGAATTACAGGCGTGA+ AAAGTGTTGCGATT+
>M110 AAAAAAAAAA TTTTTA+ TTTGAATTT+
>M210 TTTTTTTTTT AATTTTTGTA TTAAAA+
SOB
RE EXPR
ESAD
OS
>M310 AAAAATTA TTTTTA+ AGCTAATT
>M120 ATTCTCCTGCCTCAGCCTC + TCCCTCTCCTCCCC GGGGAGGAGAGGGA
>M220 CCCAGGCTGTAGTGCAATG AGCCAGTACTTGGCAGCTG
A+
TGTCCTCAGCCAGTCA
TCAA+
>M320 AGGTTGAGGCTGCAGTGAGC AGCCCTGTGTGTATG AGCACTTGGGAGCT
>M110 CCTCAGCCTC AGGAGAGGGA TCCCTCTCCT
>M210 TTGCCCAGGC CTGTGAAA AAGAAAAA
SUB
EXPRESA
DO
S
>M310 CCCCAGGTTG ACTGCACATG CTGCCCCA
Tabla 5. Motivos encontrados en las regiones UTR de genes sobre y sub expresados. En la fila superior se observan tres tamaños de UTR (3000,600 y
300), en la columna izquierda se denominaron los motivos con M1 = motivo 1,
10 o 20 se refiere al tamaño (nt) de motivo solicitado en MEME, (+) son los
motivos que tuvieron mayor porcentaje de homología al compararlos con los FT
de la DB JASPAR.
Se cuantificó el porcentaje de nucleótidos en cada uno de los motivos
obtenidos por MEME. Como podemos observar en la gráfica 5, el mayor
contenido de GC está en el grupo de motivos obtenidos de las regiones
promotoras de los genes sub expresados y el mayor porcentaje de AT está en
las regiones promotoras de los genes sobre expresados.
0
10
20
30
40
50
60
3000 600 300 3000 600 300
A T G C
Gráfica 5. Contenido nucleotídico de motivos encontrados en regiones promotoras . El porcentaje de nucleótidos presentes en cada uno de los
motivos encontrados por MEME, demuestra que el mayor porcentaje de GC
está en los genes sub expresados y el mayor contenido de AT está en
SOBRE SUB
%
C O N T E N I D O
D E
N T
BD JASPAR
Cada uno de estos motivos se comparó con la BD JASPAR, que tiene patrones
asociados a Factores de Transcripción en varias especies. Esta BD
proporciona un porcentaje de homología con respecto al motivo que
encontramos, donde se considera que un valor mayor al 80% de homología es
estadísticamente significativo; sin embargo, nosotros consideramos
significativos aquellos FTBs con un porcentaje del 85% de homología en cada
uno de los grupos analizados (FOXL1, FOXD1, GATA 2 Y HMGI) (gráfica 6).
Gráfica 6. Resultados de BD JASPAR de regiones promotoras de genes sobre expresados. FT con porcentaje de homología mayor al 85%, asociados
a los FTBs en los genes sobre expresados en neurofibromas. Las barras están
descritas de acuerdo al número de motivo (1,2 y 3), en el tamaño 10 y 20.
% DE HOMOLOG I A 75
80
85
90
95
FOXL1 FOXI1 FOXD1 IRF1 GATA2 HMGI
M110 M210 M310 M120 M220 M320
Los resultados analizados en la BD JASPAR para los FTBs encontrados en las
regiones promotoras de genes sub expresados también se consideraron con el
mismo porcentaje de homología mayor al 85%, dentro de los cuales se
encontraron a FT como SPI1, SPIB y FOXC1 (Gráfica 7).
75
80
85
90
SPI1 SPIB ZNF42_1_4 TP53 USF1 YY1 PPARG FOXC1
M110 M210 M310 M120 M220 M320
% D E H O M O L O G I A
Grafica 7. Resultados de BD JASPAR de regiones promotoras de genes sub expresados. Factores de transcripción con porcentaje de
homología mayor al 85%, asociados a los FTBs en los genes sub
expresados en neurofibromas. Las barras están descritas de acuerdo al
número de motivo (1,2 y 3), en el tamaño 10 y 20.
Los factores de transcripción putativos (FOXL1, FOXD1, MEF2A, GATA2,
NR2F1, HMGI (Y), SPI1, SPIB) con mayor homología (85%) que se observan
en las gráficas 7 y 8, ya han sido asociados a funciones en el humano, como se
describe a continuación (tablas 6 y 7).
FT FUNCIONES
FOXL1 Se expresa en células de hígado.
FOXD1 Está asociado a la formación de tumores.
MEF2A Regula la expresión de genes de músculo específico.
GATA2 Se expresa en progenitores hematopoyéticos y mastocitos.
NR2F1 Regulador selectivo de genes de expresión endógena (E2) y
ER alfa.
HMGI(Y) Grupo de proteínas de unión nuclear, que interaccionan en
secuencias ricas en AT, observados principalmente en genes
de regulación en receptores de insulina humana.
Tabla 6. Factores de transcripción Putativos en regiones promotoras de genes sobre expresados. Funciones de los FTBs, contienen una secuencia
homologa mayor al 85%, en Neurofibromas y ya han sido asociados a FT con
funciones determinadas.
FT FUNCIONES
SPI1 Subfamilia de EST, codifica FT activadores durante el desarrollo
celular Mieloide y Linfoide.
SPIB Subfamilia de EST, participa en el desarrollo de células
dendríticas
FOXC1 Familia de FT asociados en la formación de tumores.
Tabla 7. Factores de transcripción Putativos en regiones promotoras de genes sub expresados. Funciones de los FTBs, contienen una secuencia
homologa mayor al 85%, en Neurofibromas.
Considerando los resultados presentados en las tablas anteriores, cabe señalar
que los FT FOXD1 y FOXC1 han sido asociados en funciones como la
formación de tumores, lo que podría asociarse a la neurofibromatosis tipo 1 en
la formación de neurofibromas que son tumores benignos. Asimismo, MEF2A
regula la expresión de genes de músculo específico y podría asociarse a NF1,
ya que se caracteriza en formar tumores específicos en el sistema de Nervios
periféricos. GATA2 y la familia SPI1 y SPIB están relacionados en el desarrollo
de linaje celular mieloide y linfoide. Por otra parte el factor de ranscripción
HMGI (Y) es considerado rico en AT, estas secuencias están asociadas a
regiones reguladoras de expresión de genes que actúan como receptores de
insulina humana, durante la diferenciación de miocitos y adipocitos.
Discusión La neurofibromatosis tipo 1, es una patología difícil de estudiar
molecularmente, debido a que el gen nf1, que se relaciona con esta
enfermedad, es de los más grandes que se han identificado. Se sabe que
puede presentar mutaciones a lo largo de sus 60 exones. Sin embargo, se ha
intentado correlacionar la expresividad clínica de la NF1 con alguna mutación
en el gen, pero hasta el momento se han reportado cerca de 880 mutaciones,
por lo que esta correlación no se ha podido establecer debido a las
características variables de la patología. (De Luca, 2006)
Los neurofibromas son tumores benignos, presentan el mayor impacto de la
patología, debido a que involucran al sistema de nervios periféricos, esta
característica y los mecanismos epigenéticos del microambiente de los tumores
pueden desencadenar la formación de tumores malignos (Yoko Auki et Al,
2008). Para el estudio de tumores se han utilizado las metodologías masivas
recientes como los microarreglos y qRT-PCR en tiempo real; sin embargo, sólo
se han encontrado algunos genes que se encuentran involucrados en diversas
vías de señalización como Ras, AKT y otros genes que participan en procesos
de apoptosis y proliferación celular (Shubbert S et Al; 2007).
En el estudio de microarreglos que realizamos encontramos siete genes sub
expresados de forma diferencial (CAMP, MMP1, CEACAM8, CEACAM6,
CASP8, ARG1, ANXA3), entre la expresividad clínica moderada y severa, los
cuales tienen funciones importantes que discutiremos en los párrafos
siguientes.
CAMP, puede funcionar como efector de respuesta inmune inespecífica contra
tumores, además se ha reportado como promotor del crecimiento celular de
tumor en cáncer de mama. MMP1, metaloproteasa 1 que participa en procesos
de reproducción y remodelamiento, se ha encontrado alterada en patologías
como artritis y procesos de metástasis.
CEACAM8, participa en procesos de migración, regulador de la expresión
génica y funciona como marcador de células tumorales, existen reportes que
se sobre expresa en leucemia linfocítica aguda y tumores sólidos malignos.
CEACAM6, se ha encontrado sobre expresado en neoplasmas y tumores
ováricos malignos, también se ha encontrado sobre expresado en líneas
celulares en cáncer de mama, páncreas, colon y en leucemias linfoblásticas.
CASP8, participa en el proceso de apoptosis, pero se ha determinado su
participación en enfermedades neurodegenerativas.
Otros genes sobre expresados en el estudio de microarreglos fue ARG1, es
una hidrolasa citosolíca que predominantemente se encuentra en el hígado y
en menor medida en riñón, cerebro, pulmón y vasos sanguíneos. Esta enzima
participa de forma central en el ciclo de la urea y se asocia en el
funcionamiento vascular lo que promueve la proliferación celular y
angiogénesis, recientemente se ha observado que la ARG1 en células de
músculo liso induce la activación de las vías JakStat y de AMPc. Así también,
se ha involucrado en la regulación de Oxido Nítrico y se ha propuesto como
un nuevo blanco terapéutico para prevenir enfermedades vasculares y
disfunciones reversibles de células de músculo liso y endotelial como lo refiere
Durante W et al, 2007. Asimismo, existen otros estudios donde se analizan los
niveles de arginasa1 en tejidos de tumor y en suero sanguíneo de pacientes
con hepatocarcinomas, donde se observó que hay un incremento en la
expresión de la proteína que fue medida por técnicas de inmunohistoquímica y
actividad enzimática sérica (Alicja Chrzanowska et al, 2008). Lo anterior,
fundamenta la importancia de nuestro estudio, ya que la ARG1 en los
microarreglos de pacientes con NF1 presentó sobre expresión en los que
tienen expresividad clínica moderada (Niño y Adulto). Por lo anterior, inferimos
que los pacientes que analizamos podrían presentar actividad sérica de
Arginasa1 elevada y podría ser indicador de factor de riesgo en nuestros
pacientes con NF1 para el desarrollo de algún proceso de carcinogenesis en el
futuro; sin embargo, es necesario ampliar el numero de pacientes con NF1 de
expresividad clínica moderada. Hasta el momento no existen reportes que
asocien a NF1 con la actividad elevada de ARG1.
El segundo gen validado fue ANXA3 o Anexina 3 que es un regulador de
crecimiento hepatocelular, se sabe que participa en vías de señalización, y que
es un potente mediador de angiogénesis o regulador de la vascularización en la
formación de tumores, se ha identificado como marcador de adenocarcinoma
de hígado según los estudios realizados por Liu YT en el 2009; la anexina 3 fué
medida en tejido de tumor hepático comparado con adenocarcinomas,
mediante inmunohistoquímica y hay diferencias en la expresión de está
proteína. Interesantemente, estos datos podrían coincidir con los pacientes de
NF1 que analizamos, debido a que mediante RT-PCR observamos diferencias
en la intensidad entre las muestras con expresividad clínica, leve, moderada y
severa; por lo que podríamos cuantificar mediante técnicas más específicas la
presencia de dicha proteína y proponer si existe alguna asociación de
anexina3 y el desarrollo de tumores en esta patología que confiera algún riesgo
en el desarrollo de malignización.
Por otro lado, al analizar los sitios de unión asociados a factores de
transcripción putativos (FTBs) encontrados en genes sobre y sub expresados
en neurofibromas obtenidos de pacientes con Neurofibromatosis tipo 1 que
previamente reportó Pascale Levy en el 2004, encontramos que la expresión
de estos genes es diferente en el análisis de microarreglos de sangre
periférica, lo que era esperado por los diferentes linajes celulares que existen
en dichos tejidos. Sin embargo, al realizar el análisis computacional
encontramos FTBs que han sido asociados a la familia de factores de
transcripción como HMGI(Y) (Webster K. et al; 1997), el cual ha sido estudiado
ampliamente porque se considera promotor de genes que participan como
receptores de insulina humana y se piensa que están involucrados en el
desarrollo de obesidad. Este factor de transcripción tiene una secuencia rica en
AT (Brunetti M et al, 2004), lo cual se relaciona con el porcentaje de contenidos
de nucleótidos, donde observamos que los FTBs encontrados en los genes
sobre expresados en neurofibromas, presentan un mayor porcentaje de
adeninas y timinas en sus secuencias. Interesantemente, al analizar los
resultados bioinformáticos, observamos que nuestros datos se podrían asociar
a lo reportado por Harder A. et al. en el 2004, en el cual realizó una búsqueda
de patrones de metilación en el promotor del gen NF1, analizando tumores de
vaina de nervios periféricos benignos, malignos y leucocitos. Los resultados
reportados fueron que existía alto contenido de residuos de citosina en la
región promotora de NF1 en leucocitos y neurofibromas benignos; sin embargo
en los tumores malignos analizados el contenido de regiones ricas en GC era
bajo; estos datos muestran que puede existir una relación entre el porcentaje
de contenido de nucleótidos en las regiones promotoras en nuestros FTBs que
se asocie algún mecanismo celular. Por lo anterior, podríamos proponer una
búsqueda de estas secuencias o FTBs, en linfocitos de pacientes con NF1 de
expresividad clínica leve, moderada y severa; con la finalidad de corroborar los
datos bioinformáticos y establecer si existe algún patrón de metilación de
acuerdo a la expresividad clínica de los pacientes, que nos permita realizar
una asociación en la expresividad de la patología.
Conclusiones
Se encontraron diferencias en los perfiles de expresión génica entre pacientes
con expresividad moderada y severa.
En los dos pacientes moderados existe un patrón de expresión similar en 9
genes, por lo que se considera que la diferencia de edad podría variar en el
nivel de expresión pero no en el patrón observado.
La expresión diferencial de los genes ARG1 y ANXA3 fueron validados por RT-
PCR, corroborando el hallazgo observado por microarreglos.
Los sitios de unión asociados a factores de transcripción (FTBs) putativos
identificados por el análisis in silico, demostró que participan en funciones
esenciales asociadas a la formación de tumores y expresión en linajes
celulares de mastocitos.
El porcentaje de contenido nucleotídico en cada uno de los motivos, podría
asociarse a secuencias reguladoras en las regiones promotoras de genes
involucrados en esta patología.
Perspectivas Es necesario realizar un estudio con un muestreo mayor, que nos permita
sustentar de forma estadística, una correlación entre la expresividad clínica de
NF1 y la expresión génica.
Por otro lado es necesario corroborar los datos computacionales de FTBs
putativos en su contenido nucleotidico o buscar si existen patrones de
metilación que puedan asociarse a la expresividad clínica de la NF1.
Cuantificar los FTBs con funciones especificas en la formación de tumores para
corroborar el análisis in silico en cada uno de los diferentes tipos de
expresividad clínica.
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