estudio citogenetico-analisis cromosomico

ESTUDIO CITOGENÉTICO : I. Cultivo Celular II. Análisis Cromosómico

Lic.TM. Héctor Herrera Reynoso Esp: Citogenética y Biología Molecular

CULTIVO CELULAR

Los cultivos celulares son un procedimiento tecnológico de mantenimiento y estudio de células vivas en un medio artificial que permite reproducir, de manera bastante fiable, las condiciones biológicas que las células tienen en su lugar de origen.

Potencialmente todas las células son cultivables, pero cada una de ellas presenta peculiaridades y requerimientos específicos.

Cultivo Celular: Estudio CitogenéticoMEDIOS DE CULTIVO CELULAR

Son compuestos que contienen : Todos los aminoóacidos, vitaminas,cofactores, coenzimas, enzimas, sales, iones, indicadores de pH.

Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionan dependiendo del tipo de muestra ó tipo de célula a cultivar y lograr que estos respondan adecuadamente con un crecimiento celular.

Los medios de cultivo celular se seleccionan dependiendo del tipo de estudio citogenético a realizar (Cultivo de alta resolución, Estudio de fragilidad cromosómica, etc) o del tipo de anomalía cromosómica a demostrar (Estudio de X frágil).

Cultivo Celular: Estudio Citogenético

ESTUDIO CITOGENETICO

MEDIO DE CULTIVO BASE

MEDIO DE CULTIVO ESPECIFICO

SANGRE PERIFERICA RPMI 1640, Mc Coy’S Modified, Tc 199

PB Max Karyotiping Medium, Createst Lynfocitos

MEDULA OSEA RPMI 1640, Mc Coy´S Modified

Marrou Max Karyotiping Medium

LIQUIDO AMNIOTICO HAM F-10, HAM F-12 AMNIOMAX, Chang B+C

RESTOS ENDOUTERINOS HAM F-12, HAM F-10 AMNIOMAX, Chang B+C

PIEL RPMI 1650 Chang B+C

Cultivo Celular: Estudio citogenéticoSUPLEMENTOS.- Además del medio de cultivo base, las células requieren para su crecimiento y división celular de suplementos, los cuales serán utilizados dependiendo del tipo de células que se desea cultivar y del tipo de estudio citogenético requerido.

1.- SUERO BOVINO FETAL (SBF) : se utiliza a diferentes concentraciones: 5% para el estudio de cromosoma X frágil

20% para el cultivo de SP y MO 30% para el cultivo de células fetales 30% para el cultivo de tumores2.- PENICILINA + ESTREPTOMICINA: utilizado como antibióticos para evitar la

contaminación bacteriana.3.- ANTIMICOTICOS: como la Fungizona para evitar el crecimiento de hongos, si

es que fuera necesario.

Cultivo Celular: Estudio CitogenéticoSUPLEMENTOS:4.- L- GLUTAMINA: Es un aas que en su forma levógira mejora el crecimiento

celular.5.- ESTIMULANTE MITOGENICO: Utilizado para estimular el proceso de mitosis en

el cultivo de linfocitos. Como: - Fitohemaglutinina (PHA) - Concavalina A (ConA) - Pockeweed Mitogen Además se utilizan suplementos o reactivos específicos cuando se requieren realizar estudios citogenéticos especiales como:.- Estudio Cromosoma X frágil: Se cultiva la SP (linfocitos) en medio TC 199 ó RPMI 1640 pero deficientes en ácido fólico, más L-glutamina ó bien utilizando la Fluorodeoxiuridina (FUdR) ó Metotrexate (MTX) que son inhibidores de las enzimas que participan en la síntesis de novo del ácido fólico.


Medios de Cultivo y Suplementos. Formas de presentación diferentes.. Medio Líquido y en polvo. Microcultivo


Preparacion de los Medios de Cultivo . Pesar el medio. Diluir en agua destilada. Agitar. Añadir Suplementos P+S L-Glutamina SBF. Ajustar el pH


Esterilización de los Medios de Cultivo. Sistema de filtración al vacio. Filtros millipore 0,22um. Bomba de vacío. Alicuotar en frascos estériles. Control de esterilidad en estufa a 37ºC por 48 hrs.

TECNICAS DE ESTUDIO

CITOGENETICO

Algo de historia

primer mapa de los patrones de bandas Gde cromosomas humanos publicado (1971)

grupos cromosómicos

(1956)

J.H.Tjio

(1966)Lejeune

Pateau(1961)

Técnica Convencional

Cariotipo humano: 46 XY

Bandeo Cromosómico: Bandas GTG

metaphase

DNA replication

chromosomes condense

nuclear envelope breaks down

chromosomes aligned on spindle fibers

Técnicas de Estudio Citogenètico

Estudio Citogenético: Estudio Cromosómico Células estén división celular (Mitosis) Análisis cromosómico (morfología y patrón de bandas) en Metafase. Algunas células normalmente en proceso de proliferación y diferenciación por lo que NO necesitan de un estimulante mitogénico para que entren división. Otras células ya diferenciadas requieren de un estimulante mitógeno para que entren en mitosis. Cultivos Indirectos y Cultivos Directos Cultivos a corto plazo y cultivos a largo plazo

Cultivo Celular

A.- Cultivo Celular Indirecto1.- Cultivo de Linfocitos .- Cultivo a corto plazo (72 horas) .- Muestra: Sangre Periférica .- Se realiza para detectar cualquier alteración

cromosómica constitucional. .- Se utiliza para detectar las autosomopatías

(Sindromes Down, Patau, Edwards, etc) y las Gonosomopatias (Síndromes de Turner,

Triple X, Klinefelter, etc)

Técnica de cultivo de linfocitos(sangre periférica)

Toma de muestra

Siembra

Cosecha

Preparación de laminas

Coloración y observación metafases

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)

Toma de Muestra. Condiciones de ascepcia. Anticoagulante heparina. Volumen de muestra


Eliminar el paquete de GR dejando la interfase y el plasma. La mezcla de la interfase (Linfocitos)

con el plasma.


Volumen del medio de cultivo (5-10 ml) Mayor esterilidad posible. Frascos de cultivo (Falcon flask, vidrio)

RPMI-1640 es un medio de cultivo que fue desarrollado por Moore et al. en el Roswell Park Memorial Institute, de ahí el acrónimo RPMI. Este medio contiene una gran cantidad de fosfato y está formulado para su uso en una atmósfera de dióxido de carbono 5%.


Volumen de muestra Mezcla de Interfase

plasma 1.0 – 1.5 ml Sangre total 0.5 ml ó 30 gotas. Microcultivo V gotas. Mezclar suavemente e incubar


Incubar a 37ºc por 70 a 72 horas


Después de las 72 horas sacar el frasco de cultivo la estufa.


COSECHA1. Colchicinización. Agregar Colchicina 0.1 ugr/ml : 50 –100 ul.. Mezclar suavemente. Incubar


Incubar a 37ºC por 50 a 60 minutos

El colcemid es un análogo de la colchicina que despolimeriza los microtúbulos del citoesqueléto, impidiendo la formación del huso mitótico, y por lo tanto bloqueando la mitosis en la etapa de metafase

• Por su unión reversible con la tubulina citoplasmática impide su polimerización dentro de los microtúbulos celulares, quedando inhibida la metafase de la división celular.

Sacar el frasco de la estufa, trasvasar a un tubo y centrifugar



. Centrifugar a 1000 rpm por l0 minutos.

. Con una pipeta pasteur eliminar el sobrenadante.. Trabajar siempre con el sedimento


2. Hipotonización. Adicionar solución hipotónica: Cloruro de Potasio 0.075 M


. Adicionar 6 ml de ClK 0.075M

. Agitar con pipeta pasteur


. Incubar a 37ºC por 10 a 15 minutos.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)3.- PREFIJACION: Sacar el tubo de la estufa y agregar 10 gotas de fijador. Solo para parar la acción de la solución hipotónica. Centrifugar a 1000 rpm por 10 minutos


4. FIJACIÓN: . Adicionar Fijador (5ml) . Fijador: Metanol (1Vol) + Acido Acético Glacial (1Vol)


. Adicionar 5 ml de fijador

. Mezclar con pipeta pasteur

. Dejar a TA por 20 minutos o dejar en refrigeración a + 4ªC por días a semanas.. Centrifugar


. Se realizan 2 ó 3 lavadosEl sedimento se resuspende con 1 a 2 ml de fijador.

5. Preparado Cromosómico. Adicionar 3 a 4 gotas sobre una lámina portaobjetos helada.. Secar al calor de un mechero.. Guardar en una gradilla



Cromosomas sin bandeo Cromosomas con Bandas G


Elaboración del Cariograma

ANALISIS CROMOSOMICO

Patrón de Bandas GTG de Cromosomas

Cultivo Celular

B. Cultivo Celular Directo: 1.- Cultivo de Líquido Orgánico: .- No se hace un cultivo celular propiamente dicho .- Se realiza directamente un choque hipotónico de las células y

posterior fijación. .- Permite demostrar alteraciones cromosómicas numéricas y/o

estructurales que indican la presencia de células neoplásicas. 2.- Cultivo de Médula Osea: .- Cultivo a corto plazo (24-48-72 horas) .- Muestra: Aspirado de Médula Osea .- Realizado para el estudio cromosoómico en pacientes con desordenes mieloproliferativos (Síndromes Mielodisplásicos, Leucemias)

Estudio Citogenético de Líquidos Orgánicos

Obtención de la Muestra Volúmen de Obtención Anticoagulante Heparina Conservación de la

MuestraCaracterísticas Físicas Color Aspecto

Criterios de Malignidad1. Alteraciones Numéricas (ploidía) Hipodiploidía : N° Cr < 46 Hiperdiploidía : 69 > N° Cr > 46 Poliploidía : N° Cr > 69

Estudio Citogenetico de Liquidos Orgànicos

2. Alteraciones Estructurales .- Ring,Translocaciones, deleciones, etc. .- Cromosomas marcadores (mar) .-Dobles minutes (Dm) .- Figuras Trirradiadas, Tetrarradiadas. .- Rupturas Cromosomicas (gap,cap)

CULTIVO DE MEDULA OSEA

CULTIVO MEDULA OSEA

Cultivo Celular3.- Cultivo de Piel .- Cultivo largo plazo (14-21 días) .- Muestra: Biopsia de piel (Cultivo de fibroblastos) .- Realizado generalmente cuando se sospecha de un mosaicismo

cromosómico no detectado en Cultivo de Linfocitos.

4.- Cultivo de Tumores: .- Cultivo largo plazo (14-30 días) .- Muestra: Biopsia del tumor ó la pieza quirúrgica del tumor .- Realizado para demostrar la presencia de una alteración numérica

y/o estructural de los cromosomas que estén asociados a la presencia de células tumorales ó células neoplásicas.

.- Brindan información sobre el diagnóstico, estadiaje, pronóstico y evaluación del tratamiento de los tumores.

Cultivo Celular5.- Cultivo de Células Fetales.- Cultivo a largo plazo (10-14 días).- Muestra: Liquido Amniótico obtenido por Amniocentesis alrededor de la 16ª semana de gestación..- Se efectúa para hacer el diagnóstico prenatal de una alteración cromosómica.6.- Cultivo de Vellosidades Coriales: .- Cultivo corto plazo (24 –48 horas) y Cultivo largo plazo (10-14 dias) .- Muestra: Biopsia aspiración de Vellosidades Coriónicas alrededor de la 10ª

semana de gestación..- Se efectúa para hacer el diagnóstico prenatal de una alteración cromosómica.7.- Cultivo de Restos Endouterinos: .- Cultivo largo plazo (10-14 días) .- Muestra: Legrado uterino y/o producto abortado .- Se realiza para detectar una anomalía cromosómica del producto.

Imagen en la pantalla del ultrasonido

Amniocentesis

Cultivo de Vellosidades Coriales

Cultivo de vellosidades corialesBiopsia transcervical Biopsia transabdominal

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M

BANDEO CROMOSOMICO

Existen varias técnicas de bandeo cromosómico, que nos permiten identificar individualmente los cromosomas, lo cual facilita la identificación de una alteración cromosómica numérica y especialmente demostrar la presencia de alteraciones cromosómicas estructurales.

• Permite precisar la localización de genes aportando información al llamado mapeo genético.

• Tener un mayor conocimiento acerca de la estructura cromosómica y de los reordenamientos que se producen en las distintas alteraciones tales como:

Fusiones y fisiones céntricas Translocaciones recíprocas y en tandem Inversiones peri y paracéntricas Deleciones Duplicaciones Constricciones secundarias Fracturas cromosómicas, etc.

BANDAS CROMOSÓMICAS Los bandeos cromosómicos pueden clasificarse en

morfológicos y dinámicos:

A.-LOS BANDEOS MORFOLÓGICOS: se obtienen basándose en técnicas inherentes a la

heterogeneidad de la cromatina. Existe una relación con proteínas (histónicas y no histónicas) e interacciones ADN. A su vez clasificados en:

Técnicas de tinción diferencial Métodos de tinción selectiva Coloraciónes con fluorocromos específicos aislados o

combinados con colorantes no fluorescentes y tinciones con Anticurpos fluorecentes.

B.-LOS BANDEOS DINÁMICOS: Basados en: técnicas que implican la incorporación de

una base análoga, bromo-deoxiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina también bandeo de replicación debido a la relación existente entre el tiempo de incorporación del BrdU y el patrón de replicación.

Al incorporar BrdU durante la fase de replicación temprana se obtiene un patrón de bandeo R destacándose las regiones ricas en G-C. Luego , los cromosomas pueden visualizarse utilizando distintos métodos de tinción que emplean colorante como el Giemsa o el naranja de Acridina o utilizando Anticuerpos específicos.

TIPOS DE BANDEO CROMOSOMICO

Técnicas de bandas QTécnicas de bandas G (GTG)Técnicas de bandas RTécnicas de bandas C

Técnica de bandas Q

• Fue la primera metodología de bandeo cromosómico ( llamado así por la sustancia fluorescente empleada la quinacrina)

• 1970, Casperson y colaboradores la desarrollaron.• 1971 - (Conferencia en Paris) fue denominada como

la técnica de banda Q.

UTILIDAD• Demostrar la porción distal del brazo largo del cromosoma Y

que se tiñe con mas intensidad que los demás cromosomas.• Las regiones pericentroméricas de los cromosomas 3 y 4 , y

las regiones satelitales y pericentroméricas de los cromosomas acrocéntricos muestran variaciones significativas conocidos como polimorfismo o heteromorfismos demostrados con estas técnicas.

• La fluorescencia mayor depende del ADN, si la región es mas rica en adenosina y timina (A-T) habrá mayor fluorescencia, pero si es el ADN rico en (G-C) la fluorescencia tiende a apagarse.

DESVENTAJA

• Es el uso de la fluorescencia , que después de que es usada desaparece progresivamente y es por ello que la observación, el análisis cromosómico así como la toma de microfotografía debe ser rápida para su observación en el microscopio.

SOLUCIONES:

1. Buffer Sorensen´s a pH 5.62. Colorante Dihidrocloruro de

Quinacrina al 1%

PROCEDIMIENTO :

1. Se tiñen las láminas con el colorante de Quinacrina por 15 a 20´ en oscuridad.2. Se lavan las láminas con Buffer Sorensen´s.3. Se monta con una laminilla con

el Buffer.4. Examinar al microscopio de

fluorescensia utilizando una luz de longitud de onda de 450 a 500nm

Bandeo Q (quinacrina)

Tinción con Mostaza de quinacrinaBandeo Q

Tecnica de bandas G

• La técnica de bandas G ( Giemsa ) obtenidas por digestión proteolítica con el uso de la enzima tripsina, es la mas usada y considerada como una técnica estándar.

• Es una técnica conocida como GTG (Bandas G por tripsina usando Giemsa), es un mecanismo aun no aclarado.

Clark y Coleg.

Histonas ricas en Arginina

En las bandas GTG

No tanto con la perdida de

ADN y proteina de cromosomas durante

el tx con tripsina

Dos tipos de bandas

Bandas G +(oscuras)

Bandas G -(claras))

Distribución de las prot. Cromosómicas y de ADN

Relativamente ricas en prot.

DisulfuroSulfihidrilos

Tecnica de Tecnica de bandas Gbandas G

• El patrón de bandas es similar entre (G-Q)• Es de uso rutinario• La banda G obtenida por GTG es muy

superior en la resolución,comparada con aquellas técnicas que utilizan Fluorocrómos.

PROCEDIMIENTO :

1. Se coloca en baño Maria a 37ºC el frasco Nº 1 de solución de tripsina 1%

2. Se coloca las láminas con la preparación cromosómica (menos de una semana) en el frasco Nº1 x 10´´.

3. Enjuagar las laminas en el frasco Nº2 de solución salina fisiológica.

4. Se colocan las laminas en el frasco Nº3 de colorante Giemsa 4% x 6 a 8´.

5. Lavar con agua corriente y dejar secar y observar en el microscopio.

SOLUCION :

1. Solución de trIpsina al 1%2. Solución salina fisiológica 3. Colorante Giemsa 4%

. Bandeo GTG: - Tripsina 1% (buffer) - Solución Salina Fisiolog. - Giemsa 4%

bandas G-pálidas bandas G-oscuras DNA rico en GC DNA rico en AT replicación temprana replicación tardía Muchos genes Pocos genes

Esta imagen muestra cada cromosoma humano normal comparado con su idiograma, o mapa, de bandas G, un esquema acordado internacionalmente para los patrones de bandas.

Técnica de bandas R• Se hace el tratamiento de las laminas a altas

temperaturas en varios buffer• Tinción con Acridina Oramge o Giemsa• Las bandas que producen estas técnica en los

cromosomas humanos son el reverso de bandas G o Q es decir que las bandas claras en Q o G son bandas oscuras en R.

VENTAJAS• Que la regiones teloméricas de los cromosomas

son mas teñidas, a diferencia de las técnicas de bandas Q y G en las que no son tan claras.

• El tratamiento con calor induce denaturación de las proteínas cromosómicas así como de las secuencias del ADN ricas en nucleótidos(A-T), mientras que el ADN rico en G-C de las bandas R en una configuración nativa.

PROCEDIMIENTO :

1. Preparar el buffer sorensen´s en un koplins y llevar a baño Maria 85ºC

2. Colocar las láminas preparadas(1-2 sem) en el buffer sorensen´s durante 10´.

3. Lavar las laminas de buffer S.4. Colocar en colorante de

Giemsa por 5´.5. Lavar, dejar secar y observar al

microscopio

SOLUCION:

1. Buffer sorensens(0.06,pH6.59)

2. Colorante de Giemsa.

CROMOSOMAS HUMANOS: BANDAS RGT

Bandas R-útil para teñir los extremos distáles de los cromosomas (deleciones o reorganizaciones distales)

Propiedades diferenciales entre las bandas G y R

G RComposición bajo contenido G+C Alto contenido G+CReplicación tardía tempranaSecuencias repetidas Line (L1) Sines (alu)Quiasmas Raros AbundantesNº de genes Escaso AbundantesClase de genes Específicos Domésticos

Tecnica de bandas C

• La técnica de bandas C produce una tinción selectiva de la heterocromatina constitutiva ,estas bandas están localizadas en la región pericentromérica de los cromosomas humanos.

• 1971- Fue un método descrito por Arrighi y Hsu.

APLICACION

Demuestra variación de tamaño de la región de heterocromatina constitutiva presente en las regiones pericentroméricas de los cromosomas.

Para los cromosomas 1,9,16 y brazos largos del cromosoma Y.

Polimorfismos. Inversiones pericentroméricas.

Desnaturalizar

Extraer el material cromosómico Alcali

Incubado en solución salina

GIEMSA

Tecnica de Tecnica de bandas Cbandas C

SOLUCION :

• HCL 0.2N• Ba (OH)2 5%• Solución saluria de

citrato de sodio(2xSSC)• Giemsa

PROCEDIMIENTO :

• Tratar la laminas con HCL 0.2N X 20´´ a Tº ambiente

• Lavar lamina con H2O destilada.• Tratar las laminas con sol.

Ba(OH)2 al x 5%x 1a2´.• Lavar con H2O destilada hasta

eliminar el exceso de bario.• Colocar las laminas en soluc. 2 x

SSC a 60ºC X 2 horas .• Lavar con H2O destilada• Teñir con Giemsa 5% en Buffer

sorensen’s a pH 7.0 x 15´• Lavar con H2O destilada y

observar al microscopio.

Bandeo C tiñe específicamenteregiones centroméricas

DETERMINACION DEN Nº DE BANDAS CROMOSOMICAS

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M

estudio citogenetico-analisis cromosomico

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