estudi sobre compostos que poden ajudar a prevenir o ...³/treballs de recerca... · treball de...
TRANSCRIPT
Treball de recerca
Estudi sobre compostos que
poden ajudar a prevenir o
tractar la diabetis tipus II i la
obesitat
Jordi Del Pozo Rodríguez
2º Batxillerat Científic Tecnològic
Tutores: Lourdes Corcoy i Laia Miret
Abreviatures BSA: bovine serum albumin
Mfn2: Mitofusina 2
C1: Compost 1
C2: Compost 2
C3: Compost 3
DNA: Àcid desoxiribonucleic
DMEM: Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium
FBS: Fetal bovine serum (sèrum de fetus boví)
DMSO: Dimetilsulfóxid
PBS: Tampó salí fosfat
RLU: Unitats relatives de llum
RNA: Àcid ribonucleic
µL: Micro litres
rpm: Revolucions/minut
Sumari
El treball que he realitzat consisteix en comprovar si tres compostos poden tractar dues
malalties, la diabetis tipus II i la obesitat. Per fer-ho he necessitat d’un experiment que consistia en
comprovar si els compostos augmentaven la concentració d’una proteïna que es troba disminuïda
en aquestes malalties i que resulta necessària per les cèl·lules.
L’experiment consisteix en comparar la quantitat de proteïna que produeixen els tres
compostos (que anomenarem C1,C2 i C3) amb un compost (anomenat DMSO) que sabem que no
incrementarà la quantitat normal d’aquesta proteïna en les cèl·lules.
Per fer les pràctiques de l’experiment, he pogut disposar d’un laboratori del Parc Científic de
Barcelona on disposaven de material altament especialitzat per poder dur a terme
l’experimentació.
Agraïments
La realització d’aquest treball no hauria estat possible sense l’ajut fonamentalment de dues
persones: la meva tutora del treball de recerca a l’ institut, Lourdes Corcoy, i la meva tutora al Parc
Científic de Barcelona, Laia Miret. Sense elles dues no hagués pogut fer aquest treball, els estic molt
agraït per haver tingut confiança en mi, i per la paciència que han tingut a
l’hora de fer-me explicacions, el seu interès pel treball i l’ajut que m’han
donat a l’hora de buscar informació. Moltes gràcies per donar-me el
vostre suport sempre que l’he
necessitat.
També m’agradaria
mencionar dues entitats que són
el meu institut, L’IES Maria
Aurèlia Capmany, i el Parc
Científic de Barcelona, entitat a la qual estic també immensament agraït per haver-me deixat
utilitzar les seves instal·lacions. Em sento molt orgullós de que una entitat així, amb tecnologia
capdavantera a Europa, es trobi a Barcelona.
Moltes gràcies, a més, a la gent del meu voltant, els meus familiars i amics per ajudar-me en
tot el que heu pogut.
Índex 1)Introducció ............................................................................................................. 1
a. Què és la diabetis tipus II? ................................................................ 1
b. Què és l’obesitat? .................................................................................. 2
2)Antecedents............................................................................................................ 2
a. La Mitofusina 2 ...................................................................................... 3
3)L’experiment .......................................................................................................... 4
a. Hipòtesi de l’experiment ................................................................... 4
b. Cèl·lules HeLa ......................................................................................... 5
c. Cèl·lules HeLa M2P14 ........................................................................ 6
d. Plàsmid ...................................................................................................... 6
e. Formació d’un pl{smid ...................................................................... 7
f. Gen reporter luciferasa ....................................................................... 7
4)Procediment ........................................................................................................... 8
5)Material .................................................................................................................... 9
6)Inici de l’experimentació.................................................................................. 10
a. Preparació del medi ............................................................................ 10
b. Descongelació de les cèl·lules ....................................................... 11
c. Sembrem les cèl·lules en una placa.............................................. 13
d. Incubació de les cèl·lules amb els diferents compostos .... 17
e. Imatges de les cèl·lules ...................................................................... 19
f. Quantificació de luciferasa (luminòmetre) .............................. 21
7)Resultats finals: Luminescència ................................................................ 24
8)Anàlisi, conclusions i representació gràfica dels resultats .............. 25
9)Altre mètode per comprovar la producció de Mfn2 ........................... 26
10)Experimentacions futures per validar el compost ........................... 28
11)Annex ...................................................................................................................... 29
12)Vocabulari ............................................................................................................ 30
13)Bibliografia .......................................................................................................... 32
L’asterisc i el format en cursiva d’algunes paraules al llarg de tot el treball indiquen que estan presents al vocabulari.
1
Jo al Parc Científic de Barcelona
Esquema de la glucosa a la sang d’una
persona amb glucèmia i una altre amb
nivells normals de glucosa.
L’objectiu és aconseguir mantenir els nivells
normals de glucosa a la sang.
1. Introducció
La diabetis mellitus tipus II i l’obesitat
són malalties desafortunadament molt
esteses a la nostra societat i quan al
Parc Científic em van proposar
realitzar un treball d’investigació sobre
compostos que podrien ajudar a
tractar-les em va semblar haver trobat
el treball perfecte.
El fet de poder ajudar a persones a combatre aquestes malalties em fascinava, a més, treballar en
un laboratori em semblava un gran avanç de cara a la meva preparació per al futur, ja que
investigar el perquè de les coses o trobar solucions als problemes de la nostra societat, sempre ha
estat la branca en la qual jo volia treballar.
1.a Què és la diabetis tipus II?
La diabetis mellitus tipus 2 o diabetis tipus 2 (antigament anomenada diabetis de l’adult o diabetis
no insulinodependent, per diferenciar-la de la diabetis mellitus insulinodependent diabetis tipus 1),
és una malaltia caracteritzada pels alts nivells de glucosa en sang (és per tant una diabetis mellitus)
en un context de resistència a la insulina i deficiència relativa d’insulina. Tot i que inicialment sovint
es controla només incrementant l’exercici i amb una modificació de la dieta, quan la malaltia
progressa els medicaments són
necessaris.
2
Logotip del Parc científic de
Barcelona
Bàscula que mesura la
massa corporal
1.b Què és l’obesitat?
L'obesitat o adiposi és una malaltia crònica* causada per diversos
factors ( genètics, ambientals...) On la quantitat de greix acumulat
comporta risc per a la salut, reduint l'esperança de vida de l'individu. De
vegades es considerada com només un problema estètic, però
constitueix una veritable amenaça per a la nostra salut, ja que
incrementa les possibilitats de patir altres malalties com la diabetis, el
colesterol i la hipertensió.
2. Antecedents
El treball que realitzaré parteix d’una informació prèvia que m’ha
donat el Parc Científic de Barcelona.
El Parc va comprar una llibreria (conjunt) de 20000 compostos i va
decidir demanar col·laboració a la Universitat de Santiago de
Compostel·la. Per realitzar un “screening”, un procés mitjançant el
qual aconseguirien obtenir hits (compostos actius) que podrien
ajudar a tractar la diabetis de tipus II i/o obesitat. En aquest
screening es van obtenir 20 hits, els qual van tornar a ser validats en
el parc Científic mesurant l’activitat transcripcional dels compostos. L’experiment que he realitzat al
Parc Científic ha sigut analitzar 3 dels 20 hits incials, que anomenaré C1,C2 i C3 (el nom d’aquests
compostos és patrimoni del Parc Científic de Barcelona)
Gràcies a les investigacions realitzades en el laboratori del Parc Científic sé que quan una persona
pateix Diabetis Mellitus de tipus 2 i/o obesitat, per tant té resistència a la insulina, presenta
problemes funcionals als mitocondris, concretament en la proteïna Mitofusina 2.
3
Xarxa Mitocondrial: A la imatge es poden apreciar dos
mitocondris d’un mateix pacient, que ha de tenir
alguna malaltia com la diabetis tipus II o l’obesitat. Un
d’ells, el de l’esquerra, ha reduït molt els nivells de
Mfn2, mentre que el de la dreta encara no.
2.a La Mitofusina 2(que anomenarem Mfn2)
És una proteïna mitocondrial localitzada a la membrana, que és clau per a l’activitat correcte
dels mitocondris*, encara que es troba al mitocondri i que aquest orgànul consta de DNA propi la
seva activitat es regulada des del nucli. Al mitocondri és on es produeix la respiració cel·lular, és a
dir, on s’obté l’energia necessària per la cèl·lula per portar a terme diverses funcions. S’ha vist que
en pacients amb diabetis tipus 1 aquesta proteïna es troba més expressada dels valors normals i en
els de tipus 2 i obesitat es veu una menor expressió del gen* que codifica aquesta proteïna*.
Aquesta proteïna està implicada en la formació de xarxes mitocondrials o filaments
mitocondrials, de manera que quan disminueix la seva expressió, les xarxes poden arribar a
desaparèixer. També s'ha descobert que la Mfn2 potencia la funció oxidativa del mitocondri, de
manera que quan es reprimeix l'expressió de la proteïna disminueix la capacitat de la cèl·lula per
oxidar glucosa, el potencial de membrana mitocondrial i el consum d'oxigen per part de la cèl·lula.
La proteïna Mitofusina 2 s’expressa a partir del gen que la codifica, el gen Mfn2. Aquest gen conté
un element anomenat PROMOTOR,
que és una regió de DNA que controla
en quines condicions s’activa
l’expressió d’aquest gen* i es produeix
la proteïna. Per tant, si volem trobar
un compost que ajudi a tractar la
diabetis, haurà d’activar el promotor
de Mitofusina 2, és a dir, el nostre
objectiu es buscar un compost que
augmenti la producció de Mfn2, i així
aconseguirem que augmenti també la
capacitat d’oxidació del mitocondri.
4
3. L’experiment
Per poder realitzar aquest experiment he pogut disposar de les instal·lacions d’un laboratori del
Parc Científic de Barcelona (un espai de trobada entre universitat, empresa i societat que té com a
finalitat investigar, principalment en ciències de la vida) en què disposava de tot el material
necessari.
3.a Hipòtesi de l’experiment
Els compostos amb què experimentarem són capaços d’activar el promotor i augmentar la
producció de Mfn2 i per tant ajudar a tractar la diabetis i/o obesitat?
Per explicar l’experiment primer definiré quines seran les diferents variables:
La variable independent que és la que podem modificar serà el compost (C1,C2,C3), i la dependent
la variació en la producció de Mfn2. La resta de variables com la temperatura, la concentració de
diòxid de carboni ([CO2]), el pH... es mantindran constants durant tota l’experimentació. El nostre
control negatiu* a l’experiment serà un compost anomenat DMSO (dimetilsulfòxid). (Ja que sabem
que no augmentarà la quantitat de proteïna)
Per poder comprovar la nostra hipòtesi utilitzarem cèl·lules HeLa M2P14. Aquestes cèl·lules
provenen de les cèl·lules HeLa, però han estat modificades.
Esquema del promotor del gen
5
3.b Les cèl·lules HeLa Constitueixen un llinatge de cèl·lules epitelials
humanes procedents d'un carcinoma cervical. Al
1951 es practicà una intervenció quirúrgica a la
pacient Henrietta Lacks (HeLa), de la qui prové el
nom de la línia cel·lular, a la qui van extreure
cèl·lules tumorals d'un carcinoma de l'úter amb la
intenció d'avaluar-ne la malignitat.
Aquelles cèl·lules es deixaven cultivar tan bé, i
proliferaven tan fàcilment en cultius cel·lulars, que
des d'aleshores començaren a ser utilitzades a gran
escala en centres d’investigació. Ara es poden trobar
a quasi tots els laboratoris del món.
Henrietta Lacks
Imatges de les cèl·lules HeLa, a la
imatge del damunt es veuen
mitjançant un microscopi òptic i a
la de la dreta amb un microscopi
electrònic.
6
3.c Cèl·lules HeLa M2P14 ( les que utilitzarem) Per saber si els compostos activen el promotor de Mitofusina 2, necessitem un sistema que ens
permeti mesurar si els compostos són actius. En el laboratori on he fet les pràctiques es va construir
una línia cel·lular(cèl·lules HeLa M2P14) estable que conté un plàsmid que està format pel gen
reporter luciferasa unit al promotor de Mfn2.
3.d Plàsmid
Els plàsmids són unes seqüències de DNA extracromosòmic circular o linear que es repliquen o es
transcriuen de manera independent del DNA cromosòmic i que han estat introduïts a les cèl·lules.
Normalment contenen gens o conjunts de gens que li donen un avantatge selectiu, de manera que
s’utilitzen habitualment per multiplicar un gen que es vol expressar.
Plàsmid introduït en les
cèl·lules HeLa M2P14. Plàsmid
Esquema de la fusió del promotor amb el gen reporter que es troba al plàsmid
7
3.e Formació d’un plàsmid El gen o fragment de DNA que interessa ha de ser identificat, i aïllat. Aquesta acció la porten a
terme els anomenats enzims de restricció*. Aquests són capaços de reconèixer seqüències
concretes de DNA ( no més de 8 nucleòtids) i tallar la cadena de forma precisa ,actuen, per dir-ho
d’alguna forma, com una espècie de “tisores moleculars”. Després el fragment de DNA és introduït
a la cadena de DNA que ens interessa.
3.f Gen reporter (luciferasa)
Un gen reporter o indicador és un gen que està controlat pel promotor en estudi (en aquest cas pel
promotor de la Mfn2) i té una activitat fàcil de mesurar. En el nostre cas utilitzarem el gen
indicador LUCIFERASA.
No utilitzem el gen en estudi (Mfn2) perquè no podem
mesurar la seva activitat, en canvi sí que podem mesurar
l’activitat del gen de la luciferasa ja que aquesta proteïna
quan reacciona amb el seu substrat, la luciferina, emet
luminescència. Això fa que puguem quantificar si els
compostos que estem analitzant activen el promotor de la
proteïna Mitofusina2, ja que és el mateix que el de la
luciferasa, utilitzant un aparell anomenat luminòmetre*.
Reacció que mesurarem al luminòmetre.
Luminòmetre
Esquema de
la actuació
dels enzims
de restricció
Com podem veure en aquesta reacció
un dels productes és la llum (light en
anglés) per tant podem mesurar la
reacció utilitzant un luminòmetre.
8
A la natura podem trobar organismes que tenen
luciferasa, com les cuques de llum, que són capaces
de produir llum per elles mateixes.
4. Procediment
1. Preparar del medi
2. Descongelar les cèl·lules
3. Sembrar les cèl·lules en una placa de 12 pous
4. Incubar-les amb els compostos actius
5. Mesurar l’activitat de luminescència en el luminòmetre
6. Analitzar i treure conclusions sobre els resultats
7. En el cas que algun compost activés el promotor de Mfn2, el Parc Científic haurà de seguir
investigant per saber si en un futur podrà ser utilitzar com a fàrmac per tractar la diabetis
tipus II i la obesitat
Cuca de llum
9
5. Material
Pipetejador automàtic
Sistema d’aspiració de líquids
Càmera de Neubauer i
cobreobjectes
10
Campana amb el medi cel·lular
6. Inici de l’experimentació
6.a Preparem el medi
Per elaborar el nostre medi cel·lular necessitem:
DMEM 500 ml: El DMEM és una modificació de BME que conté una concentració 4 vegades
més alta d’aminoàcids i vitamines.
FBS 57,4 ml: El FBS és el sèrum més
extensament usat per al cultiu de cèl·lules
ja que és baix en anticossos i conté més
factors de creixement.
Penicil·lina/ Estreptomicina 5,74 ml: Les
penicil·lines són antibiòtics empleats
profusament en el tractament d'infeccions
provocades per bacteris sensibles.
L’estreptomicina és un inhibidor de la
síntesi de proteïnes. Actua fent que no es pugui sintetitzar la proteïna S12 a través de no
permetre que la subunitat del ribosoma bacterià S30 s’uneixi amb la part de RNA
transferència que li pertoca (formilmetionil-RNAt). Això evita la iniciació de la síntesi de
proteïna i condueix a la mort totes les cèl·lules microbianes.
Hepes 11,48 ml: HEPES és extensament
usat en cultius cel·lulars, en gran part
perquè és el millor mantenint el pH
fisiològic, tot i els canvis en la
concentració de diòxid de carboni
(produït per la respiració cel·lular).
Per aconseguir el medi agafem la
quantitat especificada de cada substància
i les introduïm en un recipient que podem
tancar i el barregem.
Medi cel·lular
11
6.b Descongelem les cèl·lules
Traiem les cèl·lules del congelador on es troben a una temperatura de – 80°C, i les escalfem
una mica introduint-les en un bany d’aigua a 40°C.
Hem de treure ràpidament les cèl·lules del bany perquè es podrien morir.
A continuació posem les cèl·lules amb 9 mL de medi en un falcon de 15 mL.
Després agafem el falcon (tub) amb les cèl·lules i el medi i el posem en una centrifugadora a
una velocitat de 1400 rpm (revolucions per minut) durant 3 minuts. D’aquesta manera
aconseguim mantenir separades les cèl·lules del medi.
Un cop ha acabat el procés de centrifugació absorbim el medi del falcon, d’aquesta manera
eliminem el DMSO* que és tòxic per a les cèl·lules. A continuació, afegim 10 mL de medi al
péllet (les cèl·lules) amb una pipeta i ho agitem, seguidament ho traslladem a una placa de
cultiu.
Bany d’aigua
Centrifugadora
12
Posem la placa a la incubadora perquè les cèl·lules creixin a 37 ºC i a un 5% de CO2
(condicions ideals perquè creixin les cèl·lules).
Incubador
Condicions en què es trobaran les
cèl·lules (37°C i 5% CO2)
13
6.c Sembrem les cèl·lules en una placa de 12 pous
Absorbim el medi.
Rentem les cèl·lules amb 5 mL de PBS* (una solució tampó* que ajuda a mantenir constant
el pH.).
Agitem la placa suaument per ajudar a desenganxar les cèl·lules de la paret de la placa.
Absorbim el PBS.
Afegim 1 ml de Tripsina* (trenquem els enllaços de les
proteïnes i així les cèl·lules es desenganxen de la
superfície de la placa).
Ho deixem 3 minuts a l’incubador a una temperatura
de 37°C i 5% de CO2.
14
Afegim 9 ml de medi per desactivar la tripsina (amb el pas del temps pot arribar a ser tòxica)
i passem les cèl·lules a un falcon de 15 ml.
Preparem la càmara de Neubauer posant el cobreobjectes a sobre.
La Càmera de Neubauer: és un instrument
utilitzat en medicina i biologia per realitzar el
recompte de cèl·lules en un medi líquid, que
pot ser un cultiu cel·lular, sang, orina....
Aquesta càmera de recompte està adaptada al
microscopi. Es tracta d'un portaobjectes que té
dues zones lleugerament deprimides i que en el fons de les quals s'ha marcat amb l'ajuda d'un
diamant una quadrícula de dimensions conegudes. Es cobreix la càmera amb un cobreobjectes
que s'adhereix per simple tensió superficial. Després s'introdueix el líquid, en el nostre cas el
medi, entre la càmera i el cobreobjectes. D’acord amb la quantitat de cèl·lules comptades,
coneixent el volum de líquid que admet el camp del reticle, es calcula la concentració de
cèl·lules per unitat de volum de la mostra líquida inicial.
La fórmula de valoració del nombre de cèl·lules
(vàlida universalment) és la següent:
Observem amb el microscopi i comptem
les cèl·lules.
Partícules per μl=partícules
comptades)/superfície(mm²)·profunditat
de la càmera(mm)· dilució
15
Amb la càmera de Neubauer el que farem és mesurar la concentració de cèl·lules que tenim
en 1 mL, amb això podem saber quants μL hem d’abocar de medi i de cèl·lules amb medi a
cada pou.
Agafem 15 μL de la solució cel·lular utilitzant la pipeta de 20 μL i els introduïm entre la
càmera de Neubauer i el cobreobjectes
Fem un recompte del número de cèl·lules amb la càmera de Neubauer, mitjançant el
microscopi. Es compten totes les cèl·lules des 4 quadrats més petits de color més fosc dels
costats del quadrat gran(el del centre no).
16
Càlculs
Dades: Volum1 Quadrat càmera de Neubauer=0.1µL, Cèl·lules Comptades= 89 cèl·lules
El nostre objectiu és aconseguir tenir per tant aplicarem els següents
factors de conversió per saber el volum en µL necessari:
A cada pou volem introduir un volum de 1mL (=1000µL) per tant:
1000µL-314µL =686µL de medi a cada pou
En resum el volum necessari a abocar a cada pou de la placa és:
686µL de medi
314µL de cèl·lules amb medi
Sembrem la placa de 12 pous (70.000
cèl·lules/pou):
Afegim a cada pou 686µL medi i 314µL
de cèl·lules amb medi utilitzant
micropipetes.
17
Distribució dels compostos a la placa de 12 pous
6.d Incubació de les cèl·lules amb els diferents compostos
A la placa de 12 pous sembrem les cèl·lules, ho
farem utilitzant els 12 pous. Distribuirem els
diferents compostos de 3 en 3 pous: és a dir que al
final hem de tenir 3 pous amb DMSO (que
utilitzarem com a valor basal en l’experiment,
sabem que no activarà el promotor, per tant és el
nostre control negatiu en l’experiment), 3 amb el
C1, 3 amb el C2 i 3 amb el C3. Tal com he dit abans
és molt important que la resta de variables com la
temperatura, pH , el material, el número de
cèl·lules es mantingui constant.
Ho fem mitjançant 4 eppendorfs en els quals es troben les diferents substàncies, i les ficarem
distribuint-les als pous com he explicat anteriorment.
Procediment:
Agafem 40µL de medi i els aboquem a 4 eppendorfs.
Posem el nom als eppendorfs DMSO, C1, C2, C3.
Afegim a cada eppendorf 10µL del compost que hem posat el nom, de manera que
finalment tenim 50µL.
Preparem 4 falcon, on fiquem a cada un 4 vegades 995µL és a dir 3980µL.
Posem el nom dels compostos a cada falcon, i afegim 20µL de la dissolució que conté el
medi i el compost que hem escrit.
18
Agafem les cèl·lules, absorbim el medi, i les rentem tirant 1mL de PBS a cada pou i
ràpidament l’absorbim també.
I a la placa on són les cèl·lules tirem 1000µL de cada compost als seus 3 pous corresponents,
quedant finalment 3 amb DMSO, 3 amb C1, 3 amb C2 i 3 més amb C3.
Placa cel·lular de 12 pous on estem rentant les cèl·lules amb PBS
19
6.e Imatges de les cèl·lules
Abans de quantificar la proteïna luciferasa observarem les cèl·lules al microscopi i farem algunes
fotos.
Hem de fer aquestes fotos per
comprovar que les cèl·lules estiguin en
bones condicions, també per observar
com estan constituïdes i veure la seva
estructura.
Augment del
microscopi:
100 augments
Augment del
microscopi:
100 augments
Augment del
microscopi:
200 augments
20
Després de comprovar que les cèl·lules
es troben en bones condicions,
quantificarem la proteïna luciferasa.
Augment del
microscopi:
200 augments
Augment del
microscopi:
400 augments
Augment del
microscopi:
400 augments
21
6.f Quantificació de la proteïna luciferasa amb el luminòmetre
Per determinar els compostos que activen el promotor de la Mitofusina2, Utilitzarem un
luminòmetre per mesurarem la producció de luciferasa, que serà equivalent a la producció de Mfn2
ja que el promotor de la luciferina està enganxat al de la Mfn2.
Una vegada ja hem incubat els compostos amb les cèl·lules durant 21 hores a 37°C, en una
placa de 12 pous mesurarem la luminescència.
Absorbim el medi de les cèl·lules i les rentem amb PBS.
Afegim a cada pou 100 µL de lysis buffer que trenca la membrana cel·lular per poder
quantificar la luciferasa i rasquem les cèl·lules amb la punta de la pipeta, amb això el que
pretenem aconseguir és que la proteïna que ens interessa(luciferasa) quedi fora de les
membranes cel·lulars i així la podem mesurar.
12 pous*100 µL lysis buffer a cada pou= 1200 µL lysis buffer, però en farem 1500 per tenir-
ne de més i no anar justos, hem de diluir el lysis buffer 5 vegades, per tant agafem 300µL de
lysis buffer i afegim 1200µL H2O.
Traspassem les cèl·lules de cada pou a un eppendorf.
L’agitem amb un vòrtex.
Imatge d’un vòrtex, aparell
on agitem les cèl·lules per
fer que quedin repartides
homogèniament per tot el
falcon.
22
I les centrifuguem a 50.000 rpm durant 30 segons
Agafem 10µL de cada extracte cel·lular i ho posem en tubs de plàstic.
Portem els tubs al luminòmetre, afegim 20 µL de luciferina (el substrat de la luciferasa) a
cada tub i els anem posant un per un al luminòmetre i mesurem(això ho hem de fer per els
12 tubs), d’aquesta manera sabrem si poden activar el promotor de Mfn2.
Imatges en què estic mesurant la
luminescència al luminòmetre
C2
C3
23
C1
C2
C3
Un cop obtinguts aquests resultats el
que farem és mesurar la quantitat de
proteïna present a cada pou.
Podem apreciar analitzant els
resultats que el C1 i el C2 podrien
activar el promotor de la Mfn2,
mentre que el C3 presenta uns valors
molt similars al nostre control negatiu
de l’experiment el DMSO.
RLU: Unitats relatives de llum
(unitats en què mesura el
luminòmetre)
DMSO
Resultats obtinguts al luminòmetre
24
7. Resultats finals: Luminescència
Compost
RLU
(Relative Light Unit)
Mitjana de cada comost ( Suma dels 3 valor quantificats pel luminòmetre de cada compost i divisió entre 3)
Increment respecte la quantitat de proteina que estaría present en el control negatiu (el DMSO) (Divisió entre la mitjana de el C1 el C2 o el C3 entre el la mitjana de les RLU del DMSO)
DMSO 154560
DMSO 209459 195735 1
DMSO 223186
C1.1 528110
C1.2 504091 510608 2,61
C1.3 499623
C2.1 507252
C2.2 664510 571040,7 2,92
C2.3 541360
C3.1 157556
C3.2 172176 194361 0,99
C3.3 253351
Analitzant la taula dels resultats obtinguts podem comprovar que els resultats de la columna
RLU de proteïna són molt similars entre el DMSO i el C3, i també hi ha similitud de valors entre els
dels compostos 1 i 2. Per tant, com que el compost 3 presenta uns resultats molt semblants al
nostre control negatiu el DMSO, descartem que pugui produir Mitofusina 2.
Per fer més visible els resultats, a la pàgina següent hi ha un gràfic que mostra el
increment de la quantitat de Mfn2 de cada compost (C1,C2 i C3) respecte el DMSO (control
negatiu).
25
Parc Científic de Barcelona
8. Anàlisi, conclusions i representació gràfica dels resultats
Finalment observant l’augment en la producció de Mfn2 dels compostos, podem afirmar que dos
d’aquests compostos (el C1 i el C2) podrien ajudar a tractar la diabetis tipus II i la obesitat, ja que
han incrementat la producció de la proteïna que hem comprovat mitjançant el luminòemtre,
quantificant la luciferasa. El C3 no ha produït cap
increment en la quantitat de Mfn2, d’altra banda el
Parc Científic continuarà realitzant experiments
sobre el C1 i el C2 per determinar si poden ajudar a
combatre aquestes malalties.
26
Kit (BCA PROTEIN ASSAY KIT 1
PIERCE)
Placa que es pot introduir a
l’espectrofotòmetre.
9. Altre mètode per comprovar la producció de Mfn2 Quantificació proteïna mitjançant: BSA PROTEIN ASSAY KIT 1 PIERCE
L’assaig BSA consisteix en un experiment per determinar la concentració de proteïna total
en una mostra. La concentració de la proteïna es mostra per un canvi de color en la solució, des del
verd fins al violeta, que és proporcional a la concentració de la proteïna i que pot ser mesurat
utilitzant tècniques colorimètriques. Per poder quantificar de forma estimada la proteïna es
necessita fer una recta patró que relacioni absorbància amb concentració de proteïna, per elaborar
aquesta recta s’ha d’utilitzar qualsevol solució que contingui proteïnes per utilitzar-la com a mostra,
normalment es fa servir BSA (bovine serum albumin). Coneixent la recta patró podem comparar
l’absorbància de les nostres mostres i obtenir la concentració de proteïna existent en elles.
27
Imatge d’un prisma, on es pot apreciar
clarament la descomposició d’un raig
de llum en els diferents colors. A partir
de la longitud d’ona del color de les
nostres mostres podrem saber la
quantitat que tenim de Mfn2.
Imatge d’un espectrofotòmetre:
instrument utilitzat per mesurar
la intensitat del color.
Durant l’assaig BSA tenen lloc dues reaccions fonamentals per mesurar la proteïna:
En la primera reacció els enllaços peptídics de la
proteïna redueixen el ió Cu2+ del sulfat de coure
a Cu1+ (la reacció depèn de la temperatura). La
quantitat de Cu1+ reduïda és proporcional a la
quantitat de proteïna present en la solució.
En la segona reacció dues molècules d’àcid bicinconinic
es quelaten (explicació a l’annex) amb un ió Cu1+, donant
lloc a un producte amb coloració violeta que absorbeix la
llum a una longitud d’ona de 562nm.
A partir de la intensitat del color violeta podrem
saber la quantitat de proteïna (Mitofusina 2),
present a les diferents mostres de cada compost
mitjançant un espectrofotòmetre*.
28
10. Experimentacions futures per validar el compost
Al Parc continuaran realitzant proves amb aquests compostos ( el C1 i el C2) com quantificar la quantitat de
RNA transcrita i comprovar la quantitat que pot ser ingerida pels humans, per determinar si podran ser
utilitzats en l’àmbit de la medicina.
Es continuarà investigant per determinar si aquests
compostos poden tractar aquestes malalties.
Amb el pas del temps, una vegada es comprovi definitivament que aquests compostos poden tractar
aquestes malalties seran distribuïts a la nostra societat (farmàcies...), per garantir una millor salut de la
població.
29
Annexos
Quelat
Complex metall-EDTA
Un quelat és un compost químic format per un ió metàl·lic lligat per
diversos lligams covalents a una estructura heterocíclica de
compostos orgànics com aminoàcids, pèptids o polisacàrids.
L'element lligat per un quelat queda impedit de seguir les reaccions
químiques que tindria en cas d'estar lliure.
Replicació, transcripció i traducció del
DNA
Replicació: Procés de duplicació (còpia) del DNA, que es dona al nucli.
Transcripció: És el pas de DNA a RNA missatger que es dona la nucli.
Traducció: Fabricació de proteïnes a partir del ARN missatger, procés que es dona al citoplasma
DNA
missa
tge
RNAmissatger
Proteïna
Expressió genètica
30
Vocabulari
PBS: Salino Protegit Fosfat (PBS abreujat) és una solució tampó d'ús general dins la bioquímica i altres
branques d'investigació biològica. Ajuda a mantenir constant el pH. Tripsina: La tripsina és una proteasa de serina trobada al sistema digestiu de molts vertebrats, actua com a
enzim i trenca les proteïnes que permeten les unions entre cèl·lules. Això és causat per la capacitat que té la
tripsina de trencar, com hem dit, els enllaços entre proteïnes. En el laboratori de cultiu de teixits, aquest
procés s’utilitza en la collita de les cèl·lules cultivades a plaques de petri.
DMSO: El dimetil sulfòxid (dimetilsulfòxid, DMSO, CH3SOCH3) és un líquid orgànic sense color que conté
sulfur, usat com a dissolvent orgànic industrial a partir de 1940, com criopreservant a partir de 1961 i com
un medicament (redueix el dolor i la inflamació).
Gen: és una unitat de DNA que codifica almenys una proteïna. L’expressió del gen està controlada pel seu
promotor, que és una altra seqüència de DNA situada abans del lloc d’inici de la transcripció de DNA del gen
d’interès.
Àcid bicinconinic: l’àcid més comunament empleat per bioquímics per determinar el nivell total de proteïna
en una solució. Procés en el què dues molècules de quelat d’àcid bicinconinic Cu1 més l’ ió, formant un
complex púrpura soluble en agua que absorbeix la llum en 562 nm.
Espectrofotòmetre: Instrument emprat per a mesurar la intensitat d'una determinada ratlla espectral d'un
espectre d'absorció o d'emissió.
Mitocondri: és un orgànul tancat per una membrana que es troba a la majoria de les cèl·lules eucariotes, els
mitocondris generen la major part dels subministraments de trifosfat d'adenosina (ATP) que necessita la
cèl·lula com a font d'energia química. A més a més de subministrar energia, els mitocondris estan implicats
en diferents processos, com ara la comunicació, la diferenciació, així com el cicle cel·lular i el seu
creixement.
Control negatiu: és alguna cosa que saps per endavant que no resultarà com l'estàs predient (que no
alterarà cap resultat en el que busques de l’experiment). Això serveix per demostrar que les variables que
obtens no són resultat de la metodologia que utilitzes. I a partir del resultats que doni aquest compararàs els
altres resultats.
pH: és un índex de la mesura de l'acidesa o alcalinitat d'una solució
31
Malaltia crònica: és una malaltia que no es cura en un temps curt
Enzims de restricció: són enzims que tallen fragments de DNA específicament per una seqüència concreta
Luminòmetre: Un fotòmetre sensible empleat per mesurar els nivells de llum molt baixos (com els produïts
en un processos luminescents)
Solucions tampó: són aquelles que no modifiquen gairebé el seu pH a l'afegir una petita quantitat d'àcid o
base o al diluir-les. Són molt importants per els processos químics i bioquímics ja que una modificació del pH
del medi on es realitza la reacció pot fer modificar el mecanisme de la reacció
Proteïna: són compostos orgànics fets d'aminoàcids arranjats en una cadena lineal i units per enllaços
peptídics entre els grups carboxil i amino de residus adjacents. La seqüència d'aminoàcids d'una proteïna és
definida per la seqüència d'un gen, que està codificada al codi genètic.
32
Bibliografia
Entitats
Parc Científic de Barcelona (IRB Barcelona)
Llibres
Colberg Sheri,PHD. Diabetes y ejercicio físico. Jesús Domingo. España.
Clínica Universitaria de Navarra. Obesidad. Raquel Lòpez Varela. León (España)
American Diabetes Association Inc. Diabetes de la A a la Z. Beatriz Magri. Alexandria,
Virginia, Nueva York.
Campillo Álvarez, José Enrique. El Mono Obeso. España
Salvador Rodríguez, Javier. La Diabetes. Manuales de Bolsillo Everest.
Premsa
Manuel S|nchez, Carlos. “Las células inmortales de Henrietta Lacks”. ABC (XL SEMANAL).
02/05/10. Página 60
Internet
Salino Protegit Fosfat. 19/08/10.
http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/Phosphate_buffered_saline
Sociedad Española de Medicina Estética. La Mitofusina 2 está implicada en la
fisiopatología de la diabetes.
http://www.seme.org/area_seme/actualidad_articulo.php?id=4
Vídeos online
“Contaje de células con cámara de Neubauer”
http://www.youtube.com/watch?v=TmPOmi2NHb0
“Tripsinización y pase de mantenimiento de células de mamífero”
http://www.youtube.com/watch?v=dfRNGHXyl3M&feature=related
“Plasmid Cloning” http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o
33
Enciclopèdies
Online: http://es.wikipedia.org/
Electròniques:Enciclopèdia Encarta 2009 (Microsoft)
Documents
Apartat 2.3 del document: Unió del gen amb un Plàsmid. http://www.xtec.es/iesrovira-
forns/documents/proteina.pdf
Tesis doctoral: Francesc X. Soriano Zaragoza. “REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DEL GEN DE MITOFUSINA 2 EN MÚSCULO ESQUELÉTICO” Barcelona, 2004.