Estructura secundaria yDicroísmo Circular

Biofísca 2019

Estructura secundaria de proteínas• Pauling, 1950s, regularidades en estructuras

proteicas (cabellos, alfa keratina, seda de araña, beta keratina)

• Se confirmaron con la resolución de estructuras 3D

• Hay varios tipos de arreglos• Hélice alfa• Lámina beta (∥;∦)• “Coil”• Hélice 310• Polyproline II• …

Estructura secundaria de prots.

• Determinada por los ángulos diedros del backbone. De N- aC-• !à C’i-1;N;Ca;C’• "à N; Ca; C’; Ni+1

• La cadena polipeptídicapuede modelarse como una serie de planos peptídicos unidos en Ca con ángulos ! y "

Estructura secundaria de

proteínas• Las proteínas pueden tener diferente

contenido de cada tipo de estructura secundaria

• Es interesante saber con que tipo de proteína trabajamos

• O si la estructura secundaria de nuestra proteína se modifica• Ligandos• Temp/pH/sal• Interacciones• Producción/purificación• …

• Tengo un tubito con mi proteína: ¿Cómo puedo determinar su estructura secundaria?

Determinación de estructura secundaria: el cromóforo amida

n à p* ≈ 220 nm; prohibida por simetría (ε≈100)

p à p* ≈190 nm; permitida por simetría (ε≈7000)

p àp*

Espectros de absorción, hay info(¡acoplamiento entre cromóforos!) pero difícil de extraer

Las reglas de selección cambian cuando cambia la simetría de la luz incidente

• Luz polarizada en el plano, magnitud variable, dirección constante

Muestras orientadas + luz polarizada à información estructural• Dicroísmo lineal:

(A∥-A⟂)/(A∥+A⟂)• Poly-L-Glu, hélice

alfa, orientado (flujo)• Separación de

transiciones•Acoplamiento excitónico•Estructura regular•Dirección de la hélice

Pero orientar las moléculas es “difícil”• En proteínas los cromóforos están

orientados en forma heterogénea• El dicroísmo lineal no es práctico…• Otra forma de “ver” la orientación

relativa de cromóforos en arreglos regulares?• ….• Chan• ….

Luz “circularmente” polarizada

• Magnitud constante, dirección variable

• Luz linealmente polarizada à suma de luz polarizada circular a la derecha y a la izquierda

Luz circularmente polarizada

Luz circularmente polarizada, componentes

Interacción con luz circularmente polarizada: actividad óptica• Rotación óptica à

birrefringencia circular• Interacción diferencial

con R & L por diferencias de polarizabilidad

• Cambio en índice de refracción

• Giro en el plano de la luz polarizada lineal

• Empleada en la caracterización de la quiralidad de moléculas orgánicas

Interacción con luz circularmente polarizada: actividad óptica• Rotación óptica à

birrefringencia circular• Interacción diferencial

con R & L por diferencias de polarizabilidad

• Cambio en índice de refracción

• Giro en el plano de la luz polarizada lineal

• Empleada en la caracterización de la quiralidad de moléculas orgánicas (enantiómeros R o L)

Interacción con luz circularmente polarizada: actividad óptica• Dicroísmo circular à

Absorción diferencial (dicroísmo = dos colores)• Absorción diferencial de

R & L por cromóforo• Requiere banda de

absorción!• Cambia la intensidad

relativa de las dos componentes

• Da lugar a luz elípticamente polarizada

Interacción con luz circularmente polarizada: actividad óptica• Dicroísmo circular à

Absorción diferencial (dicroísmo = dos colores)• Absorción diferencial de

R & L por cromóforo• Requiere banda de

absorción!• Cambia la intensidad

relativa de las dos componentes

• Da lugar a luz elípticamente polarizada

Interacción con luz circularmente polarizada: actividad óptica• Resumiendo:

• Rotación, interacción diferencial, no hay absorción

• Dicroísmo, absorción diferencial

• En general, las dos cosas pasan juntas (si hay dicroísmo hay rotación…)

Dicroismo circular

• Diferencia de absorción entre la luz circularmente polarizada a la derecha y a la izquierda• ∆A(!) = AR(!)-AL(!) = [εR (!) - εL

(!)]lc• ∆A(!) = ∆ε(!)lc

• Es una diferencia muy chica entre dos señales muy grandes à baja s/n L

• Puede ser (+) o (-) J

También se puede medir la forma de la elipse• Histórico, se mantiene• Interconvertible con ∆Abs

Las reglas de selección cambian en CD

Por simetría para que µ•m≠0 se requiere quiralidad

Acoplamiento “crea” quiralidad

Desdoblamiento excitónico en CD: misma energía, distinta regla de selección

¿Y una proteína?: poly-L-Glu en TFE (hélice)

• Patrón CD UV lejano

• Acoplamientoexcitonico en !➝!* àcambio de signo

• Banda n➝!* negativa• Depende de estructuras

secundarias, no de residuos

-ve band (nm) +ve band (nm)

α-helix 222; 208 192

β-sheet 216 195

Random coil 200

Espectros de CD de proteínas, UV lejano (cromóforo amida)

Plegado Desplegado222 nm <0 ≈0

200 nm ≈0 <0

Proteínas alfa

Mioglobina

Proteínas beta

Concanavalina

Espectros variables!!

Proteínas alfa+beta

Lisozima

|θ210|> |θ222|

Proteínas alfa/beta

Carboxipeptidasa A

|θ210|< |θ222|

Proteínas desordenadas

Mínimo a 200 nm

Cualitativamente OK… se puede mejorar?• Si asumimos que:

• La estructura tridimensional de proteínas de referencia resueltas por cristalografía de rayos X se conserva en solución acuosa.

• Las contribuciones de los elementos de estructura secundaria individuales al espectro global de CD son aditivas, y el efecto de la estructura terciaria en el espectro es insignificante.

• Solo los cromóforos peptídicos son responsables del espectro de CD UV lejano, y las contribuciones de los cromóforos no peptídicos de las proteínas pueden despreciarse.

• Cada elemento (hélice, lámina, coil, …) puede describirse mediante un solo espectro de CD, y el efecto de la variabilidad geométrica de los elementos es insignificante.

• Entonces el espectro de CD de una proteína se puede calcular como:

Donde S es el espectro, N es el número de tipos de estructura secundaria, f es la fracción con la que contribuye cada estructura secundaria y B es el espectro base correspondiente

Ejemplo, mioglobina

• Tomando tres elementos!t = x"!" + x#!# + xc!c• Ajuste:x" = 80%, x#= 0%xc = 20% • De acuerdo con estructura!78% hélice, 22% coil• Es esencial expresar el espectro

como elipticidad molar por residuo• ¿Por qué?

wavelength in nm

190 200 210 220 230 240 250

Mea

n re

sidu

e el

lipic

ity in

deg

cm

2 dm

ol-1

-40000

-20000

0

20000

40000

60000

80000

a-helixb-sheetrandom coil

Distintos algoritmos, distintas bases• Los algoritmos de ajuste varían:

• Base de espectros (puros/proteínas con mezcla de SS)• Forma de ajustar (SVD, redes neuronales, …)

• Base de datos de espectros: PCDDB• http://pcddb.cryst.bbk.ac.uk/home.php

• Análisis online• Dichroweb à

http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml• CAPITO (CD Analysis and PlottIng TOol) à

http://capito.nmr.leibniz-fli.de/

Exactitud de algunos métodos (r coeff)

Método N prots

nm Hélice Lámina Otros

Singular value decomposition

17 178-240

0.98 0.68 0.22

Variable selection (VARSLC)

17 178-260

0.97 0.81 0.60

Variable selection-self-consistent method (SELCON)

33 178-260

0.93 0.91 0.53

Neural network analysis (CDNN2.1)

17 178-260

0.93 0.73 0.82

CAPITO 107 178-260

0.96 0.80 ND

Salida CAPITO

Limitaciones

• La deconvolución de un espectro de CD en 4 o 5 componentes que no varían de una proteína a otra es una simplificación excesiva• Los espectros de CD de referencia correspondientes al

100% de hélice, lámina, giro, etc. no son directamente aplicables a proteínas que contienen secciones cortas de las diversas estructuras (el CD de una hélice α aumenta al aumentar la longitud de la hélice, el CD de las hojas β es muy sensible al entorno y la geometría)• Los espectros UV lejano pueden contener

contribuciones de aminoácidos aromáticos.

Predicción de espectros de CD en el UV lejano basada en estructura

• PDB2CD Mavridis & Janes, Bioinformatics 33 56–63 (2017). http://pdb2cd.cryst.bbk.ac.uk/index.php

• Anda… ehhh…

¿Qué pasa en el UV cercano?

• Cromóforos à AA aromáticos (Phe; Tyr; Trp)

• CD depende de entorno de la cadena lateral

• Muy variable, no predecible

• “Fingerprint” de la estructura terciaria (empaque del corehidrofóbico de la proteína)

• Anhidrasa carbónica II humana

• - plegada

• -- desplegada

CD en el UV cercano• Contribución de los 7 Trp al

espectro• (¿cómo se puede haber obtenido?)

• El CD de cada Trp es particular y no tiene patrones predecibles en base a la estructura

Estructura secundaria, estructura terciaria

• Las distintas regiones reportan diferentes aspectos estructurales de las proteínas• UV lejano à amida à backbone

à estructura secundaria• UV cercano à aromáticos à core

hidrofóbico à estructura terciaria

• No siempre van de la mano … (!?!)

Resumiendo, aplicaciones de CD

• Determinación de la estructura secundaria de proteínas que no se pueden cristalizar (proteínas de membrana)• Procesos dinámicos, por ejemplo. plegamiento de

proteínas• Estudios de los efectos del ambiente sobre la estructura

proteica.• Estudio de cambios conformacionales inducidos por

ligandos (fármacos, sustratos, inhibidores …)• Investigaciones de interacciones proteína-proteína y

proteína-ácido nucleico.• Reconocimiento de tipo de plegamiento

Consideraciones prácticas

• Maximizar la relación señal/ruido:• Luz total à mayor si Abs baja• Señal total à mayor si Abs alta• Óptimo a Abs ≈ 0.8

• Problemas en UV lejano… todo absorbe• Baja sal• Evitar buffers con dobles enlaces, aminas, carbonilos …• Uso de celdas de paso 0.1 cm

• En estimación de estructura secundaria es críticauna medición precisa de concentración: elipticidaden deg/(cm2 dmol)

Trabajo práctico 2: espectros UV cercano de proteínas• Ionización de Tyr pH 7 vs. pH 13• Espectros de aminoácidos vs. Proteínas (BSA)

• Coeficiente de extinción à cuantificación• Comparación

Trabajo práctico 3. Análisis de estructura secundaria y terciaria por CD

• Adquisición de espectros UV-lejano• Muestras:

• BSA• EGFP• Zn(II) Beta Lactamasa

• Consideraciones:• Buffer (¿Transparente?)• Cubeta• Concentraciones (¿siempre la misma?)

• Cálculo de contenido de estructura secundaria• Conversión de unidades (!!!!)• Algoritmos

• Estructura terciaria• Zn(II) lactamasa vs. Apo lactamasa

MATERIAL DE ESTUDIO

CHAPTER E4 “Optical Activity” (pp 601-624)Fuente: Methods in Molecular Biophysics-Autores: Serdyuk, Zaccai & Zaccai

LIBRO DE REFERENCIA GENERAL: Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules, Edited by Gerald D. Fasman, Kluwer Academic Publishers

Electromagnetic waves and Circular Dichroism: a demonstration usinganimations (András Szilágyi)

http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm

http://cddemo.szialab.org/