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ESTRATTO DIGITALE DEL LIBROLABORATORIO

DIMICROBIOLOGIA

Le basi, le analisi ambientali e degli alimenti con espansione online

DiMichele Capurso

eFederica Coglitore

cartaceo di tipo A:ISBN 978-88-96708-53-8 PREZZO 20,00 EURO

Digitale di tipo CE-ISBN 978-88-96708-54-5 prezzo 13,99 euro

Il file di questo estratto contiene solo alcune pagine del libro e ci si rende conto che gli argomenti non sono completi osservando i numeri di pagina.

Qualora questo libro fosse ritenuto valido e sarà proposto per una adozione i docenti delle classi con adozione e i docenti che lo proporranno quest'anno (sappiamo che alcuni docenti poi cambiano classi) riceveranno la copia cattedra del libro nel mese di giugno dopo aver ricevuto i dati dall'A.I.E.

Quindi i docenti che proporranno il testo dovrebbero inviare i loro dati, quelli dell'istituto e le classi in cui è stato proposto e riceveranno la copia cattedra.

Michele Capurso e Federica Coglitore

LABORATORIODI

MICROBIOLOGIALe basi, le analisi ambientali e degli alimenti

con espansione online


Libro misto

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Copyright ©

Prima stampa aprile 2015

Ristampe: 2015 2016 2017 2018 2019 2020

1 2 3 4 5 6La prima edizione di Laboratorio di microbiologia. Le basi, le analisi ambientali e degli alimenticon espansione online

è

stata curata da: Michele Capurso e Federica Coglitore-

Icona logo editore di Fabio Coscarella (2001)-

Progetto grafico: Fabrizio Caruso- Rilettura del testo: Prof. Michele Capurso e Federica Coglitore- Illustrazioni ©

: Michele Capurso- Immagine di copertina: di Michele Capurso.- Videoimpaginazione: Fabrizio Caruso- Stampa e Legatura: tipografia Grafiche Calabria, Via Marciello

87032 Campora

S. Giovanni (CS)

Collaborazioni e ringraziamenti:

dott.ssa

Bianco, la prof..ssa

Gatti, il dott. Loperfido

(Direttore del

Laboratorio EuroQuality), e la dott.ssa Contento.

Ringraziamo vivamente l'Istituto Zooprofilattico

Sperimentale di Putignano

(BA), il Laboratorio di Analisi Merceologiche e ambientali "EuroQuality" di Gioia del Colle

e l'I.I.S.

"N. Chiarulli" di

Acquaviva

delle Fonti

per il materiale e le apparecchiature messe cortesemente a nostra disposizione.

Considerato che la realizzazione di un testo richiede particolare attenzione nei controlli ed è

molto difficile evitare completamente errori e imprecisioni, l’editore ringrazia sin da ora chi vorrà

segnalarli

Per la segnalazione o suggerimenti scrivere a:

[email protected]

L'editore è

a disposizione degli aventi diritto con i quali non è

stato possibile comunicare per eventuali omis-

sioni o inesattezze nella citazione della fonte dei brani o delle illustrazioni riprodotte nel presente volume.

Sito Web http://www.editoremannarinonew.it [email protected]

LEGISLAZIONE FOTOCOPIE

STOP

A norma di legge le pagine di questo volume non possono essere fotocopiate o ciclostilate o comunque riprodotte con qualsiasi mezzo meccanico.

In base all'art. 68 comma 6. È

vietato lo spaccio al pubblico delle copie di cui ai commi precedenti e, in genere, ogni utilizzazione in concorrenza con i diritti di utilizzazione economica spettanti all'autore.

Per uso personale bisogna attenersi all'art. 68 della legge 22 aprile 1941 e successive integrazioni.

Questo libro non può essere utilizzato in classe per la lezione se non è

regolarmente adottato.

Editore Mannarino FrancoContrada S. Chiara, 4 25122 Brescia http://www.editoremannarinonew.it [email protected]

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EDITORE MANNARINO

Michele Capurso e Federica Coglitore

LABORATORIODI

MICROBIOLOGIALe basi, le analisi ambientali e degli alimenti

Area numero di serie e numero copiaVietata la vendita senza numero di serie e numero copia

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Questo volume ampio e articolato, fornisce le nozioni generali sia teoriche che pratiche necessarie per affrontare con metodo e competenza il percorso di

programmazione del Laboratorio di Microbiologia. Il libro di 368 pagine, suddiviso in 13 capitoli, affronta le tematiche che vanno “

dalla sicurezza in laboratorio, all'analisi ambientale e degli alimenti “

ed è

rivolto:

- agli ITIS

Tecnologico -

Indirizzo Chimica, materiali e biotecnologie, articolazione Biotecnologie ambientali e Biotecnologie sanitarie;- agli IPSIA -

Indirizzo Chimico biologico;- ai Licei delle scienze applicate.

Il testo si caratterizza per la chiarezza e l’efficacia della trattazione, per l’impostazione didattica aperta a più

progetti curricolari, per l’alto livello di aggiornamento e per la ricchezza dell’apparato iconografico. Vengono percorse tutte le fasi che caratterizzano l’indagine microbiologica con un felice raccordo tra le tecniche tradizionali e quelle innovative

di biologia molecolare.Le metodiche di laboratorio proposte tengono sempre conto della valutazione dei

rischi, delle norme di sicurezza e delle modalità

di recupero delle sostanze utilizzate. Nella prima parte (I -

III capitolo), vengono analizzati gli aspetti di base per poter

operare nel laboratorio di microbiologia, vale a dire: la sicurezza, i materiali e gli strumenti utilizzati. Particolarmente dettagliato risulta il capitolo "disinfezione e sterilizzazione". Infatti, un buon analista di laboratorio in campo microbiologico deve conoscere i rischi deri-

vanti dalla possibile contaminazione di campioni e gli accorgimenti per ridurli al mi-

nimo.Nel IV capitolo si prendono in considerazione le fasi operative

per la preparazione di terreni di coltura che saranno poi utilizzati per le prime esperienze di laboratorio. Ogni punto è

curato di dettagli importanti registrati durante le innumerevoli prove in campo. Particolare attenzione è

dedicata alle sostanze da manipolare e ai reattivi da utilizzare così

da motivare gli studenti al problema inquinamento e al rispetto

delle norme vigenti nello smaltimento delle stesse. Le varie procedure riportano tutti i dettagli utili per la comprensione degli argomenti: ad esempio, quando si parla di colorazioni (V capitolo), nella sezione dedicata, sono riportate le immagini delle varie famiglie di microrganismi. Suggerimenti e accor-

gimenti mirati vengono riportati per poter utilizzare gli strumenti in modo corretto e per preparare le varie soluzioni da utilizzare.Questo per consentire a studenti e insegnanti di svolgere tutte

le attività

avendo sem-

pre riferimenti a disposizione per controllare ogni azione, funzione questa prope-

deutica per una visione unitaria e di collegamento alla comprensione dell'argomento.Dal IV

al IX capitolo si sviluppano tutte le procedure di basi del laboratorio di micro-

biologia e vengono proposte schede integrative

di analisi dedicate soprattutto ad aspetti di: osservazione dei microrganismi e morfologia batterica; indagine colturale;

PER L'INSEGNANTE

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tecniche di semina; verifica dei fattori influenzanti la crescita; valutazione della

crescita microbica “analisi quantitativa”; isolamento e identificazione “analisi quali-

tativa”.Dal I al (IX-X)

capitolo i contenuti sono propedeutici per svolgere tutta la program-

mazione didattica del laboratorio di microbiologia fino al terzo anno.Dal X capitolo inizia la parte di microbiologia ambientale. Si tratta di metodiche analitiche approfondite

che rispettano i protocolli proposti dalle norme vigenti, con i

riferimenti richiesti dalla nuova programmazione. Schemi, fotografie

e tabelle

sono gli elementi caratterizzanti queste schede ed elementi efficaci di supporto strettamente funzionali all’assimilazione dei contenuti concettuali.La parte che riguarda la microbiologia ambientale è

completa di tutte le analisi riferite ad: acqua, aria

e suolo. Il XIII capitolo tratta la microbiologia degli alimenti; si propongono una serie di analisi strutturate che aiuteranno a verificare le tecniche operative complesse da sviluppare nel V anno ma che sono motivo di trattazione anche al III anno.Adeguata rilevanza è

stata riservata nello studio dei microrganismi anche alle tecniche di analisi di biologia molecolare ed elettroforetiche.Dal X al XIII capitolo si può sviluppare tutta la programmazione

del IV

e V anno dei vari indirizzi.Il testo si completa con l'espansione online molto ricca di ulteriori approfondimenti ed esercizi.

Collegarsi al sito, entrare e chiedere la registrazione per l'accesso all'espansione online.Link:

http://www.editoremannarinonew.it/biologia-e-laboratorio-editore-mannarino.html

Per accedere all’espansione online

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Il presente lavoro si caratterizza per l’organizzazione di un percorso formativo strut-

turato in capitoli che tiene conto delle indicazioni ministeriali e delle reali necessità

didattiche sperimentate in campo, adeguate al monte ore a disposizione.

Il linguaggio

utilizzato risulta chiaro ed efficace e risponde all’esigenza di adeguarsi alle capacità

di apprendimento dei giovani, senza per questo rinunciare al rigore scien-

tifico e alla terminologia specifica.

La struttura del testo consente di avere sempre a disposizione ogni dettaglio necessario per la comprensione delle prove sperimentali proposte. Questo aspetto di utilità, non assolutamente trascurabile, compendia le difficoltà

spesso manifestate dagli studenti nel prendere rigorosamente appunti durante le fasi di descrizione delle esercitazioni, il problema di strutturare le informazioni per avere riferimenti chiari e adeguati per uno studio successivo, la necessità

di operare sempre in regime di sicurezza.

In particolare, tutte le proposte che riguardano le analisi ambientali sono sempre sup-

portate da informazioni dettagliate riguardanti le caratteristiche della specie ricercata e dei riferimenti normativi. Questa impostazione consente di avere

utili sussidi anche nella fase di rielaborazione del dato sperimentale ottenuto.

BibliografiaG. Chieffi, S. Dolfini, M. Malcovati, R. Pierantoni, M.L.

Tenchini

“Biologia e Genetica”

1996, EdiSES, s.r.l. –

NapoliM. Pusceddu

Nardella, G. Testoni “BIOLOGICA”, Trevisini

Editore –

MilanoCristina Maggi, Claudia Zeccara

“Biologia in laboratorio”, Casa Editrice G. Principato S.p.a

–

MilanoSergio Campari, “Guida al laboratorio di Microbiologia”, Zanichelli Editore S.p.a

–

BolognaM.J.

Pelczar, R.D. Reid, E.C.S.

Chan “Microbiologia”, Zanichelli S.p.A

–

BolognaFulvio Longo “Norme per la prevenzione degli infortuni e l’igiene del lavoro”

Azienda Unità

Sanitaria Locale BA/5 –

Putignano Gianfranco Tiecco

“Igiene e Tecnologia alimentare”

, Edagricole-Edizioni

Agricole della Calderini

s.r.l. –

BolognaJohannes Kramer, Carlo Cantoni “Alimenti microbiologia e igiene”

Organizzazione Editoriale Medico Farmaceutica S.p.a

-

Milano Appunti universitari di “Microbiologia degli alimenti”

Franco Ottaviani

“Tecniche per l’analisi microbiologica degli alimenti”

Corso teorico-pratico, Segreteria Simposi della International pbi – Milano

Roberto Ligugnana

“Le Buone Norme di Campionamento (BNC)”

pubblicato da International pbi

S.p.a

–

MilanoAntonietta Galli Volonterio

“Microbiologia degli alimenti”

G.B. Paravia S.p.a

–

TorinoAntonietta Galli, Alberto Bertoldi “Igiene degli alimenti e HACCP”

Modelli applicativi, EPC LIBRI s.r.l. –

RomaGiuseppe Cerutti

“Il rischio alimentare (tossici, contaminanti, residui, additivi)”, Tecniche nuove –

MilanoH. Beerens, F.M. Luquet

“Guida pratica d’analisi microbiologica del latte e dei suoi derivati”, Tecniche nuove –

MilanoF. Ottaviani

“L’analisi microbiologica dei prodotti lattiero-caseari”, Tecniche nuove –

MilanoCarlo Zambonelli

“Microbiologia Biotecnologia dei vini”, Edagricole

Edizioni Agricole –

BolognaFranco Ottaviani

“Microbiologia dei prodotti di origine vegetale”, Chiriotti

Editori –

PineroloRaccolta di scritti tecnici e scientifici coordinata da Franco Ottaviani

“Microbiologia ed igiene delle produzioni industriali e dei beni di consumo”, Edizioni CONSAL –

Sermide

(MN)Saverio Simeone “Laboratorio di Microbiologia Corso pratico di tecnica ed analisi

microbiologica”, Editrice San Marco S.r.l. –

Bergamo PonteranicaAlessandro Pavone, Roberta Paolucci

“Conoscenze e Applicazioni di Microbiologia Speciale”, Zanichelli Editore S.p.a

–

BolognaNorme UNI ISO4831, UNI ISO 4832, UNI ISO 4833, UNI EN ISO 7932, UNI ISO 8261, UNI ISO 8914, UNI 10592, UNI 10625,

UNI EN ISO 11290/1

PER LO STUDENTE

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INDICEARGOMENTO Pag

CAPITOLO I LA SICUREZZAIl laboratorio di microbiologia 9La valutazione del rischio biologico 10Le norme di comportamento 11Regolamento. Norme di sicurezza e di prevenzione degli infortuni per alunni minorenni

12

CAPITOLO II MATERIALE E STRUMENTI Organizzazione di un laboratorio di microbiologia 14Strumenti e attrezzature 15Strumenti per ingrandire-

Microscopio-

ContacolonieStrumenti per sterilizzare 16- Autoclave- Bunsen- Lampade germicide UV- Dispositivi per filtrazioneStrumenti per la preparazione dei campioni- Bilancia tecnica e analitica, - Miscelatore-omogeneizzatore- Centrifuga- pHmetro

Strumenti per incubare- Termostato a secco- Giara per anaerobiosi- Bagnomaria termoregolato riscaldante e bagno di sabbia Strumenti per l'allestimento delle colture- Ansa e ago da inoculo- Tamponi, pipette, provette, beute, bicchiericilindri graduati, bottiglie e flaconi, matracci e piastre Petri.Pipette di precisione

17

18

18

20Strumenti per la protezione-

Cappa di sicurezza a flusso laminare verticale- Cappa di sicurezza biologica (CBS)- Cappe biologiche di classe I, II e III

22

23

CAPITOLO III DISINFEZIONE E STERILIZZAZIONE

Microrganismi e contaminazione 25Alcune definizioni-

Decontaminazione, pulizia, antisepsi, asepsi, antisettico e lavorare asetticamente

26

La disinfezione - forme di disinfezione fisica - forme di disinfezione chimica- disinfezione di basso livello- disinfezione di livello intermedio- disinfezione di alto livello- approccio alla disinfezione- principi generali per l'utilizzo dei disinfettanti- effetti di alcuni disinfettanti- caratteristiche di un buon disinfettante- aspetti critici del processo di disinfezione- principali categorie chimiche- disinfettanti maggiormente in uso

27

28

29

30

31

La sterilizzazione- come agisce

32

ARGOMENTO Pag-

mezzi fisici e calore- le spore e la sterilizzazione mediante calore- calore secco stufa e Bunsen- calore umido autoclave- processo di sterilizzazione e valore F- funzionamento dell'autoclave- diagramma vapore-pressione- principio della sterilizzazione con il vapore- autoclave per utensili e ciclo di sterilizzazione- autoclave per carichi porosi- autoclave per liquidi in contenitori sigillati- pentola di koch - sterilizzazione frazionata (o tyndalizzazione)- Differenze tra diversi metodi di sterilizzazione mediante calore- pastorizzazione (non è una tecnica di sterilizzazione)Indicatori Di Sterilizzazione- indicatori chimici, fisici e biologici- differenza tra un indicatore biologico e un indicatore chimicoSterilizzazione mediante radiazioni- radiazioni UV- raggi gamma e microondemezzi meccanici di sterilizzazioni- filtri a spessore- membrane filtranti- filtri tipo nucleopore- fasi della sterilizzazione per filtrazione

333536

3738

39

40

41

42

43

44

45Sterilizzazione mediante mezzi chimici- azioni degli agenti antimicrobici- misura dell'attività antimicrobica- gas plasma

4647

IV CAPITOLO INDAGINE COLTURALE

I microrganismi a occhio nudo 49Coltivazione dei microrganismi 51Esame colturale- tipi di colture

52

Terreni di coltura- classificazione- liquidi, semisolidi e solidi- minimi, sintetici e complessi- selettivi e differenziali

5354

La preparazione dei terreni- pesata del liofilizzato- dissoluzione dei componenti- controllo e aggiustamento del pH- distribuzione del terreno- sterilizzazione- controllo di sterilità- scelta dei terreni di primo isolamento- utilizzo dei terreni preparati

5556

57

5859

Esperienza 1-

Preparazione dei terreni di coltura e il loro utilizzo

60

Esperienza 2-

La morfologia delle colonie 62

CAPITOLO V OSSERVAZIONE DEI MICRORGANISMI E LA MORFOLOGIA

BATTERICA

Il microscopio 63- ottici ed elettronici

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INDICEARGOMENTO Pag

-

componenti del microscopio- componenti meccaniche - componenti ottiche- utilizzo degli obiettivi- obiettivi: acromatici, apocromatici- caratteristiche tecniche degli obiettivi- oculare- altre caratteristiche degli obiettivi

63

646566

- Uso del microscopio 68

I coloranti - premessa, definizione caratteristiche chimiche, meccanismo della colorazione e classificazione

70

Generalità

sulle colorazioni- premessa e distinzione - altri reagenti usati nelle colorazioniLa preparazione delle soluzioni per le colorazioni- soluzione alcolica madre e soluzione idroalcolica

71

73

Esame microscopico a frescoEsame microscopico di preparati colorati- preparazione degli strisci e fissazione- fasi dell'allestimento di un preparato da colorare- osservazione dei preparati microscopiciMorfologia batterica- cocchi, bacilli, vibrioni, spirilli e spirocheteColorazioni preparazione delle soluzioni-

blu di metilene 1%, nigrosina al 2%, inchiostro di china al 10%, verde malachite al 5%, safranina 1%, cristalvioletto, liquido di Lugol, safranina in alcol al 2,5%, decolorante e la conservazione dei vetriniEsperienza 3-

Colorazione semplice al blu di metileneEsperienza 4-

Colorazione negativa con nigrosina Esperienza 5-

Colorazione strutturale della capsulaEsperienza 6-

Colorazione strutturale delle spore Esperienza 7-

Colorazione differenziale di Gram

7475

76

77

82

83

86

87

89

92

CAPITOLO VI

LE TECNICHE DI

SEMINA

Le tecniche di semina- semina in terreno solido per striscio e spatolamento- semina in terreno solido per inclusione, infissione e a becco di clarino- semina da slant a slant, inculo in brodo e semina in brodo per diluizioneEsperienza 8-

Le tecniche di semina in terreno solidoEsperienza 9-

Le tecniche di semina in terreno liquido

9497

98

99

100

103

ARGOMENTO PagCAPITOLO VII FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA

Coltivazione degli anaerobi 105-

Crescita vs Tolleranza 106-

Obbligato (stretto) vs facoltativo- Temperatura- pH-

Concentrazione salina (pressione osmotica) - Ossigeno (O2 )Esperienza 10-

Microrganismi anaerobi e aerobi e influenza dell'ossigeno sulla crescitaEsperienza 11-

Influenza del pH del terreno di coltura sulla crescitaEsperienza 12-

Influenza della temperatura sulla crescita Esperienza 13-

Valutazione dell’azione inibente di alcuni antibiotici

106

108

110

112

114

CAPITOLO VIII VALUTAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA "analisi

quantitativa"Metodi di conta diretti, indiretti e misurazione della biomassa

117

Metodi di conta indiretti 118Conta vitale in piastraconta per inclusione- conta per spatolamento- crescita a diverse diluizioni- preparazione delle diluizioni decimali seriali- quante diluizioni realizzare?- che cos’è una Unita Formante Colonia (UFC)? - metodo di conta tradizionale per la conta in piastra- metodo rapido per la conta in piastra - note generali per la procedura di calcolo

119

120

121

122Esperienza 14-

Conta microbica in piastraConta vitale in substrato liquido- Conta MPN (numero più probabile)Esperienza 15-

Conta microbica su terreno liquido

123126

128

Conta Vitale Su Membrana FiltranteEsperienza 16-

Conta su membrana per filtrazioneConta totale conta direttacamere di conta- Camera di Thoma- Camera di Petroff-HausserMetodi di conta diretti alternativi- DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)- FISH (Fluorescent In-Situ Hybridization)Metodi per la misurazione della biomassa

130132

134

135

136metodi gravimetrici, spettrofotometrici e chimici- separazione della biomassa- misurazione della biomassa 137

CAPITOLO VIII ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE"analisi qualitativa"

Isolamento e identificazione 139

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INDICEARGOMENTO Pag

-

l’isolamento diretto- isolamento per striscio su piastra- isolamento per spandimento e per inclusione- isolamento per diluizione all’estinzioneFasi dell’identificazione tradizionale- 1. isolamento in coltura pura- 2. Osservazione dei caratteri colturali- 3. test primari di identificazione - 4. Test secondari di identificazioneIl sistema BiologEnterotubeGalleria APIChiavi dicotomiche (o chiavi di identificazione)Tavole diagnostiche (o tabelle differenziali)Biologia molecolare. Identificazione basata sull'analisi del DNA microbico

140141

142143

144

145

146148

150- tecniche di amplificazione in vitroPCR fase per fase- DNA ed RNA polimerasi- Primer- Miscela di reazione- PCR Fase 1: Denaturazione termica- PCR Fase 2: Ibridazione del primer al bersaglio- PCR Fase 3: Estensione- Fine del primo ciclo di PCR- Metodiche PCREsperienza 17-

Isolamento in coltura pura dei fermenti lattici nello yogurtSaggio della catalisi e dell'ossidasiEsperienza 18-

Utilizzazione dell’amido Caratteristiche metaboliche

151152

153

153154

155

159161

162

Esperienza 19-

Utilizzazione dei carboidrati Caratteristiche metabolicheEsperienza 20-

Ossidazione e fermentazione Caratteristiche metabolicheEsperienza 21-

Utilizzazione di amminoacidi Caratteristiche metabolicheEsperienza 22-

Entrotube. Caratteristiche metaboliche Analisi 23-

Identificazione (con sistema API-

Test) di E. Coli in matrici alimentari Analisi 24-

Caratterizzazione di Pseudomonas: tecniche di biologia molecolare

164

166

168

170

173

176

CAPITOLO X MICROBIOLOGIA AMBIENTALE: LE ACQUE

Quadro normativo- acque destinate al consumo umano- acque superficiali e di irrigazione- acque di scarico- acque di piscinaMetodi di analisi- tecnica del numero più probabile (MPN)- conteggio delle colonie-

metodi rapidi- metodi molecolariAnalisi microbiologiche- modalità di campionamento- prelievo dei campioni- trasporto e conservazione dei campioniAnalisi 25-

Conteggio delle colonie a 22°C e a 37°CAnalisi 26-

Determinazione dei Batteri Coliformi a 37°C

180

182183184

185187189190191

194196

201

ARGOMENTO PagAnalisi 27-

Determinazione degli EnterococchiAnalisi 28-

Determinazione di Clostri-dium

perfringensAnalisi 29-

Determinazione di Pseudo-monas

aeruginosaMetodi integrati di controllo della qualità- uso di indicatori biologici- studio della matrice biota- relazione tra caratteristiche ambientali e comunità macrobentoniche- crenon (Eucrenal, Hypocrenal)- Rhithron (Epirhytral, Metarhytral, Hyporhytral)- Potamon (Epipotamal, Metapotamal, Hypopotamal)- Indice Biotico Esteso (IBE o EBI)- tabella per il calcolo del valore di I.B.E.- tabella di conversione dei valori I.B.E. in Classi di Qualità

210

213

219

224

225226

227228

229230

CAPITOLO XI MICROBIOLOGIA AMBIENTALE: L'ARIA

Qualità

dell’aria 232Sistemi di campionamento 233- campionatori gravitazionali- impattori inerziali- campionamento gravitazionale: i.m.a. (Indice microbico dell’aria)- impattatori rappresentazione schematica di un impattore a più stadi- impattatore aspirante monostadio tipo SAS (PBI) - fasi del campionamento dell'aria con impattatore monostatico SAS- SAS ISOLATOR Monitoraggio dell’aria in ambienti confinati-

indici microbiologici da ricercare- campionamento di cellule microbiche stressate. Metodo “TAL”- scelta dei punti di prelievo dei cicli produttivi e degli ambienti di lavoro- ambienti indoor- ambienti industriali e artigianalidefinizione dei parametri di campionamento- analisi quantitativa- lettura delle piastre- modalità di interpretazione e refertazione dei dati- calcolo delle ufc- scheda campionamento microbiologico- scheda campionamento microbiologico carica esterna

234235

236

237

238

239240

241

242243244

246247248

Analisi 30-

Protocollo per il controllo microbiologico dell’aria Determinazione FunginaAnalisi 31-

ricerca di legionella nell’aria e nel bio-aerosol

249

255

Licheni e qualità

dell'ariaI licheni- organizzazione interna- licheni e substrato- tipi di licheni

261

262

263

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INDICEARGOMENTO Pag

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riproduzione dei licheni- ecologia dei licheni- biomonitoraggioBioindicatori

e bioaccumulatori- qualità richieste a un Bioindicatore- bioaccumulatori- licheni come bioindicatori- livelli di inquinamento e tipo di reazione- metodo IBL (Indice Biodiversità Lichenica)Analisi 32-

stazione di rilevamento- tabella di riferimento per la qualità dell'aria; biodiversità lichenica; classi di natura- lità/alterazione- calcolo dell’ i.a.p. (indice di purezza atmosferica)

265266

267

268269270271273

274

CAPITOLO XII MICROBIOLOGIA AMBIENTALE: IL SUOLO

Campionamento, preparazione e conservazio-

ne- metodologie- campionamento sistematico- campionamento non sistematico a X- campionamento non sistematico a W- epoca di campionamento- profondità del prelievo- prelievo del campione elementare- formazione del campione globale- formazione del campione finale- preparazione del campione- uso del campione di terreno fresco- Conservazione dei campioni di terrenoValutazione cariche microbiche-

procedimento generale per le conte per via colturaleGruppi generici di microrganismi-

altri metodi di studio delle comunità microbiche-

tecniche del primo gruppo-

tecniche molecolari--estrazione acidi nucleici--elettroforesi del DNAAnalisi 33-

Determinazione di Batteri aerobi e anaerobi (Metodo di conteggio in piastra)Analisi 34-

Conteggio Attinomiceti(Metodo di conteggio in piastra)

276

277278

280

281

282

283284286

287288289290291292

293

297Gruppi fisiologici di microrganismi- il ciclo dell’Azoto- trasformazione dell’azoto nel terreno- ammonificazione. Prima fase della mineralizzazione- denitrificazione- fissazione dell’azoto atmosfericoIl ciclo dell'azotoAnalisi 35-

Batteri AmmonificantiAnalisi 36-

Batteri NitrosantiAnalisi 37-

Batteri NitrificantiAnalisi 38-

Batteri Denitrificanti

301302303304

305

308311314317

CAPITOLO XIII MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI

Caratteristiche degli alimentiRischio alimentare- Sicurezza alimentare- qualità degli alimenti

320321182183

ARGOMENTO PagMicrorganismi associati con gli alimenti- ecologia microbica degli alimenti- crescita dei microrganismi negli alimenti- limiti di contaminazione microbicaMetodi di analisi degli alimentiAnalisi 39- Numerazione della flora aerobica a 32°C nei gelatiAnalisi 40-

Determinazione della carica microbica a 21°C nel latte pastorizzatoAnalisi 41-

Ricerca dei lieviti nello yogurt Analisi 42-

Numerazione di Streptococcus

thermophilus

nello yogurtAnalisi 43-

Determinazione dei Coliformi totali e termoresistenti nel burroAnalisi 44-

Determinazione dei Coliformi totali nel latte -

Metodo MPN Analisi 45-

Numerazione di E. coli su terreno cromogenicoAnalisi 46-

Ricerca di E. coli in campione di mozzarellaAnalisi 47-

Numerazione di Stafilococchi coagulasi –

positivi Analisi 48-

Ricerca di Salmonella nelle uova frescheAnalisi 49-

Numerazione di Clostridium

perfringens

in alimentiAnalisi 50-

Numerazione di Bacillus

cereusAnalisi 51-

Ricerca di Listeria monocytogenesAnalisi 52-

Ricerca di Streptococchi fecali nell’acqua (metodo MF)Analisi 53-

Ricerca di Campylobacter

termotollerante)Analisi 54-

Ricerca di Yersinia

enterocolitica

323

324326328329

331

333335

337

339

342

344

346

348

352

355358360

362

365

ESPANSIONE ONLINEEsercizi interattivi relativi ai vari capitoli

Approfondimenti metodiche analitiche

Approfondimenti nuove norme e protocolli analitici

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Caratteristica fondamentale di un qualsiasi laboratorio microbiologico è

quella di ma-

nipolare materiale vivente

la cui tipologia può variare a seconda del tipo di presta-

zione fornita dal laboratorio (batteriologia, virologia, micologia, parassitologia).Nell’ambito di una struttura scolastica l’attività

del laboratorio microbiologico consen-

te allo studente di poter:• verificare e integrare le conoscenze teoriche;• acquisire abilità

e competenze specifiche relativamente alle principali tecniche di laboratorio;

• acquisire abilità

e competenze specifiche nell'applicare le metodiche dell'analisi microbiologiche.

Tali conoscenze, abilità

e competenze acquisite permettono allo studente di poter affrontare le varie procedure di laboratorio microbiologico con sicurezza, effettuare controlli microbiologici sul territorio e di interpretare i risultati secondo le attuali nor-

mative. Alcuni esempi sono: verificare la carica batterica (UFC)

dell'acqua minerale in commercio, di una piscina o di un corso d'acqua e stabilire se i

parametri rispettano la norma vigente (UFC/L); verificare la carica batterica dell'aria nella nostra classe, identificare la tipologia di batteri e stabilire se i risultati sperimentali rientrano nella norma; verificare e identificare la carica batterica presente nel terreno e stabilire se rispetta le norme.

IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

I cap. Sicurezza

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SICUREZZA E NORME DI COMPORTAMENTO

LA VALUTAZIONE DEL RISCHIO BIOLOGICOIl rischio per chi opera in ambito microbiologico è

legato alla possibilità

di venire a contatto con colture di microrganismi a volte di natura patogena1, o comunque alla possibile esposizione ad agenti cancerogeni o mutageni.Poiché

non sempre è

possibile sapere in anticipo con quale tipo di microrganismo si

ha a che fare, buona norma per l’operatore è

quella di trattare i campioni in esame come se fossero contaminati, in modo da prestare la massima attenzione e prendere tutte le precauzioni al fine di garantirsi condizioni di massima

sicurezza.

L’istituto nazionale per la sicurezza e la salute dei lavoratori ha raggruppato i vari microrganismi in 4 classi secondo la loro pericolosità:

I microrganismi di questa classe non sono molto pericolosi e possono essere manipolati senza precauzioni.

Classe I

Vi appartengono microrganismi abbastanza pericolosi (Clostri-dium, E. coli, Corynebacterium, Bacillus anthra-cis) che pos-sono essere trattati con sicurezza se si adottano le normali pro-cedure di prevenzione.

Classe II

Vi appartengono agenti altamente infettivi (Salmonella, Sta-filococco aureo, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia) che vanno trattati con moltissima attenzione.

Classe III

Ne fanno parte organismi estremamente pericolosi, quasi tutti virali che possono essere manipolati solo da specialisti in labo-ratori particolarmente attrezzati e autorizzati allo scopo.

Classe IV

Nell'ambito scolastico in genere si opera con microrganismi di classe I e II

e si utilizzano tutte le precauzioni di protezione per evitare

ogni possibile contaminazione. Tutte le espe-

rienze e le procedure analitiche proposte in questo libro terranno conto con nota speci-

fica della valutazione dei rischi e delle preca-

uzioni da utilizzare per evitarli. Il rischio biologico sarà

quindi trattato in modo specifico volta per volta in modo da avere rife-

rimenti certi e non generici.

Se vengono utilizzati

agenti biologici di tipo 2, 3 o 4

è

obbligatorio comunicare

all’organo di vigilanza territorialmente competente, almeno trenta giorni prima dell’inizio dei lavori, il nome e l’indirizzo

dell’azienda e del suo titolare, e il Documento della Valutazione dei

Rischi (DVR) contenente la valuta-

zione del rischio biologico. Se si utilizzano

agenti biologici del gruppo 4, inoltre, è

necessario ottenere l’autorizzazione del Ministero della Salute, la richiesta deve essere corredata delle informazioni citate per i gruppi 2 e 3 e dell’elenco degli agenti che si andranno a utilizzare. Tale autorizzazione ha una validità

di 5 anni, dopodiché

deve essere rinnovata.

1

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Micro. di natura patogena:

sono agenti biologici responsabili dell'insorgenza della condizione di malattia nell'organismo ospite.

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LE NORME DI

COMPORTAMENTO

“E’ bene considerare che è infinitamente più facile insegnare le norme del corretto comportamento a chi entra in un laboratorio, che correggere dei comportamenti diven- tati abituali”.La necessità

di condurre il lavoro in modo ottimale e, in particolare nel rispetto della propria ed altrui sicurezza, nonché

dell’ambiente in cui si opera, richiede che ogni operatore sia a conoscenza delle norme essenziali sul corretto comportamento. A tali norme occorre fare costante riferimento, tenendo sempre presente che le cause

principali degli incidenti sono dovute ad incuria e disattenzione.

La particolarità

del materiale trattato in un laboratorio microbiologico (cellule viventi) fa sì

che le norme di sicurezza prevedano rigorose norme di comportamento. Infatti, nel laboratorio microbiologico uno dei pericoli è

rappresentato dalla contaminazione.

La contaminazione può interessare:

•

la salute umana, in quanto cellule viventi possono insediarsi nel corpo dell’operatore con facilità attraverso le vie respiratorie, il contatto, l’ingestione;•

l’ambiente, nel senso che i campioni manipolati all’interno del laboratorio, eliminati come rifiuto se non trattati adeguatamente potrebbero diffondersi in maniera incontrol- lata all’esterno;•

i campioni analitici, in cui la presenza di specie microbiche estranee potrebbero alterare i risultati analitici con l’immediata conseguenza di ottenere dati falsati.

Le norme comportamentali generali da adottare durante le varie fasi dell’attività

nel laboratorio microbiologico, prevedono le seguenti prescrizioni:rispettare il regolamento di laboratorioindossare camici pulitiuso di guanti e maschere, quando prescritti

uso di cappe di sicurezza per trattare qualsiasi campioneastensione dall’assunzione di alimenti solidi e liquidiastensione dal fumolavaggi disinfettanti delle mani.

Le esperienze pratiche in laboratorio sono essenziali per comprendere gli argomenti trattati a lezione e per acquisire la metodica analitica necessaria per poter svolgere le analisi di controllo microbiologico. Per trarre da esse il massimo profitto ed eseguirle con serenità

e sicurezza è

importante rispettare alcune regole elencate nel regolamento di laboratorio.

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La struttura del laboratorio microbiologico deve prevedere come da norma, più

zone di lavoro distinte e separate tra loro, ma allo stesso tempo strettamente interconnesse, quali:

• una o più zone dotate di armadi per l’immagazzinamento di vetreria, reagenti chimici, terreni disidratati, attrezzature ed alcuni strumenti;

• una zona di contenitori a bassa temperatura (frigorifero, congelatore) per la conser- - vazione di materiali deteriorabili, dei ceppi e delle colture microbiche;

• una zona di sterilizzazione;

• una zona di incubazione delle colture;

• una zona di lavaggio;

• una zona di lavoro, banconi dotati di tutti gli allacci;

ORGANIZZAZIONE DI UN LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

incubatore

cappa a flusso laminare

II cap. materiale e strumenti

II c

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Gli strumenti e le attrezzature utilizzati in un laboratorio microbiologico, vengono classificati e raggruppati in base alla principale tipologia d’impiego in:- strumenti per ingrandire

(microscopio, contacolonie) - strumenti per sterilizzare

(stufa a secco, autoclave, Bunsen) - strumenti per preparazione campioni

(bilance, pHmetro, agitatore, omogeneizzatore) - strumenti per incubare

(giare per anaerobiosi, frigotermostato, bagnomaria) - strumenti per l’allestimento di colture

(ansa e ago da inoculo, micropipette, tamponi, flaconi con tappo a vite, piastre Petri, pipette monouso, agitatori)

- strumenti per la protezione(cappa a flusso laminare, dispositivi automatici di aspirazione, sacchetti di sterilizzazione, sacchetti per omogeneizzatore).

Microscopio ottico: è

uno strumento fondamentale in

quanto permette di osservare gran parte dei microrganismi.

La colorazione dei preparati microscopici facilita l'evi-

denziazione di forma e disposizione dei microrganismi

oltreché

particolari strutture cellulari utili

al fine dell'i-

dentificazione.

Contacolonie:

è

un apparecchio che permette l'osserva-

zione e la conta delle colonie che si sviluppano sul

terreno delle piastre; è

costituito da un piano illuminato e centime-

trato e da una lente d'ingrandimento (x 1.5).

Il conteggio delle colonie è

facilitato da un contatore digi-

tale che registra i dati ottenuti, segnando sul fondo della piastra ogni singola colonia con l'apposita penna.

STUMENTI E ATTREZZATURE

Strumenti per ingrandire

II cap. materiale e strumenti

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DISINFEZIONE E STERILIZZAZIONE

III cap. la sterilizzazione

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I microrganismi sono praticamente ubiquitari. In un laboratorio possono contaminare:-

aria-

superfici e strumenti-

operatoriSia che si lavori con colture pure, sia che si lavori con materiale contaminato da asso-

ciazioni più

o meno complesse di microrganismi è

necessario evitare che il materiale sperimentale sia contaminato dai microrganismi presenti nell’ambiente.Per evitare la contaminazione è

necessario:a)

prevenire per quanto possibile la contaminazione con microrganismi presenti nell’a-

ria, o sulle superfici del laboratorio o sul corpo dell’operatoreb) utilizzare substrati sterilic) utilizzare attrezzi sterili.

In microbiologia è

molto importante tenere sotto controllo la crescita microbica.Tale sorveglianza può avvenire attraverso un processo di inibizione, oppure attraverso un processo di distruzione dei microrganismi detto sterilizzazione.

Nelle pagine successive, gli argomenti relativi alla inibizione e alla sterilizzazione, (processi necessari per rispettare i punti citati precedentemente a, b e c), saranno trattati rispettando la seguente sequenza:

• Alcune definizioni • disinfezione (le varie forme, sostanze impiegate e tecniche)• sterilizzazione (le varie forme e la descrizione delle tecniche)

Microrganismi e contaminazione

DISINFEZIONE E STERILIZZAZIONE

III cap. disinfezione e sterilizzazione

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Supporto di filtrazione

LE FASI DELLA STERILIZZAZIONE PER FILTRAZIONE III cap. disinfezione e sterilizzazione

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STERILIZZAZIONE MEDIANTE MEZZI CHIMICI

La crescita dei microrganismi può essere controllata anche mediante l’uso di agenti chimici. Un agente antimicrobico è

un composto chimico che uccide i microrganismi o ne inibisce la crescita e può essere sia un composto naturale che un composto chimico di sintesi. Spesso, per designare sostanze dotate di questo tipo di

attività, si utilizzano pa-

role composte dal nome del tipo di microrganismo che ne subisce l'azione e dal suffisso cida

o statico, che indicano rispettivamente se il composto determini la morte

o sempli-

cemente inibisca la crescita del microrganismo. Quindi, un fungicida

sarà

un composto che provoca la morte di funghi, ma non neces-

sariamente di batteri o alghe, mentre un batteriostatico

sarà

un

composto che inibisce la crescita di batteri, ma non necessariamente di altri tipi di microrganismi.La distinzione tra la capacità

di un composto di determinare la morte o l'inibizione della crescita di microrganismi è

spesso arbitraria, in quanto lo stesso composto può essere letale ad alte concentrazioni, mentre, a basse concentrazioni, può limitarsi ad avere effetto inibente. Per essere efficace, un agente inibente la crescita deve essere costantemente presente, poiché, se viene rimosso o neutralizzato, il microrganismo che ne subisce l'azione potrebbe, se le condizioni sono favorevoli, ricominciare a crescere.Che effetti hanno?Quando un agente antimicrobico viene somministrato a una coltura

batterica in crescita esponenziale, è

possibile osservare uno di tre tipi distinti di effetti: - batteriostatico, - battericida, - batteriolitico.

L'effetto di un batteriostatico

è

quello di inibire la crescita senza causare la morte del batterio. Spesso gli agenti batteriostatici sono inibitori della sintesi proteica e agiscono legandosi ai ribosomi. Si tratta, comunque, di legami piuttosto lassi, di modo che, quando la concentrazione dell'agente batteriostatico diminuisce, i ribosomi si staccano dall'ini-

bitore e la crescita può riprendere.Gli agenti battericidi provocano la morte delle cellule pur senza causarne la lisi. Generalmente i battericidi si legano ai loro bersagli cellulari con legami irreversibili e non vengono rimossi per diluizione.

Gli agenti batteriolitici determinano la morte della cellula provocandone la lisi, effetto

che si riflette in una diminuzione del numero di cellule o della

torbidità

in seguito all'aggiunta del composto. Gli agenti batteriolitici comprendono alcuni antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare, come la

penicillina, come pure agenti che danneggiano la membrana citoplasmatica.

III cap. disinfezione e sterilizzazione

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INDAGINE COLTURALE

L'indagine colturale è

l'attività

che viene svolta nel laboratorio di microbiologia per identificare e stabilire la quantità

di eventuali microrganismi presenti nei campioni analizzati. Prima di poter raggiungere buoni livelli analitici bisogna apprendere le varie tecniche di base da applicare.

IV cap. indagine colturale e preparazioni dei terreni

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Anche se le cellule dei microrganismi sono in genere invisibili ad occhio nudo (<0,2 mm), le manifestazioni della loro crescita su substrato solido o

liquido possono con-

sentire di distinguerli in grandi gruppi o valutarne alcune proprietà

(produzione di pigmenti, produzione di polisaccaridi, rapporti con l’ossigeno) che ne consentono l'identificazione. Osserviamo alcuni esempi:

Crescita in substrati liquidi

1. Tubi di Brodo Bile verde brillante con cam-

panella di Durham non inoculati.2. Tubi di Brodo Bile verde brillante successiva-

mente alla semina e al periodo di incubazione (si evidenzia in tutti i tubi torbidità

e produzione di gas).

Lo studio di un *microrganismo, è

reso possibile quando è

dato di:

-

vederlo

INDAGINE MICROSCOPICA

-

coltivarlo

INDAGINE COLTURALE

-

riconoscere le sueattività

metaboliche

INDAGINE BIOCHIMICA

- utilizzarlo

INDAGINE DI

PROCESSO

* Microrganismo: insieme eterogeneo di organismi accomunati dalle piccole dimensioni, ma dotati di proprie caratteristiche strutturali, di precise attività fisiologiche e di particolari cicli vitali. Al mondo microbico vengono infatti assegnati 5 tipi di microrganismi:

ALGHE, FUNGHI, PROTOZOI, BATTERI, VIRUS

INDAGINE COLTURALE

I microrganismi a occhio nudo


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Crescita

in substrati

liquidi

Crescita

in substrati

solidi

(slant)

Crescita

in substrati

solidi

(piastre

Petri)

I microrganismi ad occhio nudo


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51

L’allestimento delle colture microbiche è

fondamentale per apprendere le varie proce-

dure analitiche e nel dettaglio è

finalizzato:

A.

Mantenere in laboratorio una collezione di ceppi batterici da utilizzare nelle inda-

gini analitiche e nel controllo delle caratteristiche di qualità.

B.

Studiare le caratteristiche biochimiche, fisiologiche e genetiche e le interazioni adat-

tative con l’ambiente delle varie specie.

C. Isolare, quantificare e identificare i microrganismi presenti in un campione naturale.

D. Coltivare i microrganismi per le produzioni industriali.

E. Determinare la sensibilità

dei microrganismi isolati agli agenti antimicrobici.

F. Controllare la sterilità

di materiali e attrezzature.

Indipendentemente dalle finalità

analitiche, gli aspetti fondamentali della coltivazione dei batteri riguardano:

le tecniche di preparazione e sterilizzazione dei terreni di coltura

le tecniche di semina in condizioni di sterilità

le tecniche di incubazione

i criteri di osservazione e di valutazione della crescita

le modalità di eliminazione o di conservazione delle colture

COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMIIV cap. indagine colturale e preparazioni dei terreni

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Verifichiamo l'apprendimento preparando alcuni terreni di coltura necessari per poter svolgere le prime analisi microbiologiche. Essendo la prima esperienza proposta, la spiegazione è

dettagliata, nelle prossime, la spiegazione sarà

ridotta alle fasi principali.Obiettivo:

preparare 250 mL

di agar nutrient

da utilizzare in piastre Petri per le prime analisi di laboratorio. Finalità: verificare la presenza di batteri sulle dita della mano e in alcuni ambienti dell'istituto.Materiale e strumenti:

una beuta da 500 mL, un tappo in cotone e garza, carta d'allu-

minio, spago, una bilancia tecnica, acqua distillata, bacchettine, pHmetro, Bunsen, autoclave

e

incubatore.Sostanze e reattivi:

terreno di coltura agar nutrient, acqua distillata, soluzione di HCl 0,5 M e NaOH 0,5 M e indicatore di sterilizzazione.Rischi e precauzioni:

non ci sono particolari rischi riguardo alle sostanze; possibili ustioni da oggetti caldi, utilizzare le protezioni necessarie per la manipolazione.

Esperienza 1

Procedimento operativoLeggiamo con attenzione l'etichetta del contenitore del

terreno agar nutrient, registriamo sul nostro quaderno i dati di sicurezza e i dati per effettuare i calcoli. Calco-

liamo la quantità

necessaria di terreno per preparare 250 mL

di terreno e la pesiamo in una beuta da 500 mL. (Evitare sempre l'inalazione e la dispersione delle polveri). Aggiungiamo 250 mL

di acqua distillata misurata con un cilindro da 250 mL

e mescoliamo continuamente uti-

lizzando una bacchettina.Per facilitare la solubilizzazione è

necessario riscaldare su piastra o su Bunsen e si deve continuare a mescolare sen-

za mai fermarsi.Appena sta per iniziare l'ebollizione è

necessario spostare velocemente la beuta dalla fonte di calore

in modo da evitare la fuoriuscita di terreno dal contenitore.Nell'attesa del raffreddamento si prepara il pHmetro e un tappo utilizzando del cotone e della garza come dimostra-

to in figura. Si procede a verificare il valore di pH e se non coincide con quello riportato nell'etichetta bisogna intervenire con: HCl per spostarsi a valori più

acidi e NaOH per spostarsi a valori più

basici, successivamente si chiude la beuta con il tappo preparato e della carta d'allu-

minio. Si sigla il proprio contenitore e si appone il nastri-

no per verificare la sterilizzazione che avverrà

nell'auto-

clave. Inserire, con l'aiuto dell'insegnante o del responsa-

bile il proprio terreno nell'autoclave (regolata alla temperatura adatta riportata sull'etichetta del terreno) e regi-

strare tutti i dettagli di funzionamento dello strumento sul proprio quaderno.

La Preparazione dei terrenidi coltura e il loro utilizzo


1-Es

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Il microscopio, è

uno strumento indispensabile nel laboratorio di microbiologia in quanto con-

sente di poter apprezzare particolari caratteristiche anatomiche

dei microrganismi. Si distinguono: microscopi ottici

utilizzano la luce (visibile) che è

emessa da un illuminatore, trasmessa o diffusa dall’oggetto, e rifratta da un sistema di lenti;

microscopi elettroniciutilizzano un fascio di elettroni (luce elettronica) e un sistema di lenti elettroniche.Componenti del microscopioIl moderno microscopio composto è

costituito da:parti meccanicheparti ottiche parti elettriche

Componenti meccanicheLe componenti meccaniche che caratterizzano la struttura dello strumento e consentono di

regolarne e controllarne l’esatto funzionamento sono:

stativotavolino portapreparatituborevolver portaobiettivicomandi di messa a fuoco (macro e micrometrica)

OSSERVAZIONE DEI MICRORGANISMI Il microscopio

Diaframma ad iride

Tavolino portapreparatiPiano mobile su cui si appog-

gia il vetrino da osservare; ad esso è

attaccato il traslatore, meccanismo che rende possi-

bile lo spostamento lungo gli assi (X e Y) del preparato, consentendo la ricerca dei

dettagli e l’osservazione di più

campi microscopiciStativo

Elemento centrale di sostegno e di assemblaggio di tutte le parti che costituiscono il mi-

croscopio.

Tubo. Struttura cilindrica entro cui si forma l’immagine intermedia; a una delle sue estremità

è

montato l’oculare.Revolver portaobiettivi. Supporto girevole destinato ad alloggiare più

obiettivi di diverso ingran-

dimento.Comandi di messa a fuoco

-Vite macrometricaÈ

la

manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco, permette di fare spostamenti verti-

cali sensibili del tavolino portapreparati, avvicinandolo o allontanandolo dall’obiettivo, fino a quando non si rende visibile il preparato.

-

Vite micrometricaPiù

piccola della precedente è

coassiale con essa, permette la regolazione fine della messa a fuoco.

Lampada

Tavolino portapreparatiVita micro e macrometrica

Regolatore intensità

di luce

Base

V cap. osservazione dei microrganismi e la morfologia batterica

V cap. osservazione dei microrganism

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Riportare il condensatore alla giusta altezza (1-2 mm al di sotto del tavolino traslatore) e regolare il

diametro del diaframma di apertura, in relazione

all’AN dell’obiettivo in uso. Alla fine gli obiettivi utilizzati devono essere puliti accuratamente con la soluzione specifica e bisogna

sempre evitare che la presenza di sostanza sulle lenti possa seccare per-

tanto l'intervento di pulizia si deve fare subito dopo aver finito la prova.

Selezionare l’obiettivo da usare e agire sul diafram-

ma fino a quando la sua apertura non occupi tutto il campo di osservazione. La selezione dell'obiettivo deve essere fatta in modo graduale da quello a meno ingrandimento per avere una panoramica dell'osser-

vazione a quello con ingrandimento maggiore fino a immersione per osservare il dettaglio.

Uso del microscopio

Le colorazioni


Esercitazione n° Titolo

premessa I coloranti. Esame a fresco, preparati per fissazione, criteri consi-

gliati per l'osservazione di preparati microscopici, morfologia

bat-

terica e reattivi necessari per le colorazioni proposte.3 Colorazione semplice con blu di metilene

4 Colorazione negativa con Nigrosina5 Colorazione strutturale delle spore6 Colorazione strutturale della capsula7 Colorazione differenziale di Gram


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PremessaI batteri e gli altri microrganismi hanno dimensioni molto ridotte ed il loro protoplasma ha un indice di rifrazione vicino a quello dell’acqua; per renderli visibili, o per osservarne in dettaglio le strutture interne, sono perciò quasi sempre necessarie colorazioni biologiche.

DefinizioneUn colorante è

una sostanza in grado di assorbire selettivamente la luce ed apparire quindi colorata, e di cedere tale proprietà

alla sostanza da colorare.

Secondo Cohn1, si definisce colorante un composto organico in possesso di un gruppo

cromoforo

(responsabile del colore) ed uno auxocromo, salificante (responsabile della cessione del colore), legati ad un anello benzenico.Tra i due gruppi si crea una interazione favorita dalla diversa elettronegatività. I coloranti sono dei Sali di cui uno degli ioni è

colorato (sale=

composto formato da ioni positivi e ioni negativi).

Caratteristiche chimicheQuasi tutti i coloranti usati in Biologia, sono ottenuti da diverse sostanze di partenza derivanti dal catrame: l’anello benzenico è

la struttura di base dalla quale viene sintetizzata per via chimica la maggior parte dei coloranti.Essi differiscono l’uno dall’altro per il numero e la posizione degli anelli benzenici, e per la sostituzione di atomi di idrogeno con altre molecole.Ad esempio, vi sono tre singole sostituzioni chiave di uno degli

atomi di idrogeno del benzene, che danno la struttura di base della maggior parte dei coloranti:1) sostituzione con un gruppo metilico per formare il toluene (metilbenzene);2) sostituzione con un gruppo idrossilico per formare il fenolo

(acido fenico);3) sostituzione con un gruppo aminico

per formare l’anilina (fenilamina).I coloranti sono generalmente formati da due o più

anelli benzenici, uniti da legami ben definiti

(cromofori), i quali sono associati alla produzione di colore; in altre parole sono raggruppamenti chimici in grado di fare apparire colorata la molecola del colorante.Alcuni dei gruppi cromofori più

comuni presenti nei coloranti sono:C = C, C = O, C = S, C = N, N = N, N = O, N = O2

.Una molecola di per se incolore ma in grado di legare questi gruppi cromofori e di apparire colorata è

detta cromogeno.I cromogeni per essere coloranti devono poter formare dei sali, devono cioè

contenere nella loro molecola altri radicali salificabili (-OH, -NH2, -COOH, -NR2, -OCH3, ecc.) detti auxocromi, in grado di cedere e fissare il colore sul substrato da colorare.

Caratteristiche chimicheTutti i coloranti hanno un alto grado di affinità

per l’idrogeno, quindi, se il gruppo cromoforo del colorante perde il doppio legame in seguito ad idrogenazione, il colorante risulta allo stato ridotto ed è

generalmente incolore. Nello stato incolore viene chiamato “composto leuco”.Di solito tale passaggio è

reversibile per ossidazione. Meccanismo della colorazione

I criteri secondo cui un colorante sia in grado di colorare sono

basati su due teorie:1) Teoria Fisica:stabilisce che la colorazione sarebbe dovuta ad una fissazione della sostanza colorante in seguito a fenomeni di adsorbimento.

I COLORANTI

1-

Ferdinand Julius Cohn

(Breslavia, 24 gennaio 1828 – Breslavia, 25 giugno 1898) è stato un botanico e biologo tedesco


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Esperienza3

Rischi e precauzioni.A.

Osservare tutte le informazioni riportate sulla scheda di sicurezza delle sostanze che vengo-

no utilizzate come coloranti.B.

Prestare attenzione nella fase di utilizzo della fiamma del Bunsen; mantenere la soluzione sgrassante lontano da fiamme libereC.

Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle colture microbiche e proteg-

gersi le mani con i guanti.

Colorazione semplice con blu di metilene

Materiale occorrente• Ansa • Bacchette di vetro• Carta assorbente• Pinza in legno• Pipette Pasteur monouso

________________________________________________________________Reattivi• Soluzione sgrassante di alcol-etere (attenzione infiammabile vapori nocivi)• Soluzione di blu di metilene (soluzione all'1% in acqua sterile)• Olio da immersione________________________________________________________________Strumentazione

Campione• Bunsen

Colture microbiche • Microscopio

(prodotte nella prec. esperienza)

Obiettivo. Osservare la forma di diversi microrganismi utilizzando una colorazione semplice.

Principio.I coloranti usati in microbiologia sono sostanze organiche nelle quali sono presenti

gruppi funzionali detti “cromofori”

associati alla produzione di colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi (nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il contrasto con l’ambiente rendendo più

visibili le cellule. Poiché

i batteri sono ricchi di acidi nucleici, si colorano molto bene

con coloranti basici come il blu di metilene.

•Portaprovette• Provette • Spruzzetta• Vaschetta per colorazione• Vetrini portaoggetti e coprioggetti

Le colorazioni



3-Esperienza di laboratorio. La colorazione sem

plice al blu di metilene

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Esperienza5 Colorazione strutturale della capsula

Pericoli:A.



Prestare attenzione nella fase di utilizzo della fiamma del Bunsen. Mantenere lontano da fiamme libere la soluzione sgrassante.C. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle colture microbiche.

Materiale occorrente• Ansa• Bacchette di vetro• Becher• Carta assorbente• Pinza di legno________________________________________________________________Reattivi• Soluzione sgrassante di alcol-etere (infammabile

vapori nocivi)• Inchiostro di china al 10%________________________________________________________________Strumentazione

Campione• Bunsen

Sospensione batterica• Microscopio

(inoculo di terra)

Obiettivo.Osservare la presenza di batteri capsulati. Principio.Per osservare la presenza di batteri capsulati (strutture che rivestono alcune cellule batteri-

che di natura saccaridica)

si utilizza una colorazione che, non richiede fissazione e permette una visione reale della morfologia batterica. La capsula batterica non avendo affinità

per i coloranti può essere messa in evidenza utilizzando colorazioni negative.

• Pipette Pasteur monouso• Portaprovette• Provette • Spruzzetta• Vaschetta per colorazione• Vetrini portaoggetti e coprioggetti

Le colorazioni



5-Esperienza di laboratorio. La colorazione

strutturale della capsula

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Esperienza

6 Colorazione strutturale delle spore

Pericoli:A.



Prestare attenzione nella fase di utilizzo della fiamma del Bunsen. Mantenere lontano da fiamme libere la soluzione sgrassanteC. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle colture microbiche.

Materiale occorrente• Ansa• Bacchette di vetro• Beuta• Carta assorbente• Piastre sterili• Pinza di legno• Pipette Pasteur monouso________________________________________________________________Reattivi e terreni• Agar al manganese (ricettario pag seguente)• Soluzione sgrassante di alcol-etere (infiammabile vapori nocivi)•

Verde malachite 5%, safranina (1 g di safranina in 10 cc di alcool e acqua fino a 100 mL), olio da immersione________________________________________________________________Strumentazione

Campione• Bunsen• Microscopio• Autoclave• Bilancia, termostato

Obiettivo: osservare la presenza di endospore e spore libere.Principio.In particolari condizioni i batteri del genere "bacillus" e "clostridium", danno luogo alla formazione di "spore". La grandezza della spora e la sua posizione sono caratteri-

stiche morfologice

e di classificazione.Le endospore, colorate a caldo con verde malachite, sono in grado di trattenere il colo-

rante anche dopo lavaggio, a differenza delle altre parti della cellula che assumono il colore del colorante di contrasto (safranina).

•Portaprovette• Provette • Spatola• Spruzzetta• Vaschetta per colorazione• Vetrini portaoggetti

Coltura micobica

di Bacillus

subtilis

(comunente

presente nel suolo) Gram

+

Le colorazioni



6-Esperienza di laboratorio. La colorazione

strutturale delle spore

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Esperienza7 Colorazione differenziale di Gram

Materiale occorrente• Ansa• Bacchette di vetro• Carta assorbente• Pinza di legno• Pipette Pasteur monouso________________________________________________________________Reattivi• Soluzione sgrassante di alcol-etere (infiammabile vapori nocivi)•

Cristalvioletto

(10 mL

madre + 2 g di acido fenico in 100 mL

di acqua),

liquido di Lugol, (1 g di I2

+ 2 g di KI in 200 mL

di acqua distillata)

safranina (al 2,5% in alcool al 95%),

decolorante (alcol 50%-acetone 50% o alcool al 95%), olio da immersione.________________________________________________________________Strumentazione

Campione• Bunsen

Colture microbiche di• Microscopio

(Streptococcus

thermophilusEscherichia

coli)


Osservare tutte le informazioni riportate sulla scheda di sicurezza delle sostanze che vengono utilizzate come coloranti.B. Prestare attenzione nella fase di utilizzo della fiamma del Bunsen.C. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle colture microbiche.

Obiettivo:

Questa colorazione consente la suddivisione di tutti i batteri in due categorie: i Gram+

e i Gram-.

Principio: La diversa colorazione che assumono i batteri con questa tecnica

dipende dalle differenze esistenti nella loro parete cellulare. La parete dei Gram+

è

costituita in gran parte da uno spesso strato di peptidoglicano

che non permette la decolorazione della cellula batterica (colorata precedentemente con il colorante basico cristalvioletto) da parte del decolorante. I Gram+

rimangono dunque colorati in violetto.I Gram-

hanno una parete multistratificata

che, per la sua composizione chimica, risulta permeabile all’agente decolorante. Questi batteri dunque si colorano con il colorante di

contrasto, la Safranina, assumendo una colorazione rosa.

• Portaprovette• Provette • Spruzzetta• Vaschetta per colorazione• Vetrini portaoggetti e coprioggetti

Le colorazioni



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TECNICHE DI

SEMINA

La semina dei microrganismi presenti in un dato campione nel terreno di coltura è

una parte dell'analisi che bisogna eseguire con attenzione e sfruttando la tecnica adatta. In questa sezione si illustrano le tecniche di semina e le esperienze proposte per acquisire il metodo.

Punto di inoculazione Punto di

inoculazione

VI cap. le tecniche di semina

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L’allestimento delle colture microbiche comporta il trasferimento dei microrganismi

presenti in un dato campione, in opportuni mezzi di crescita (terreni di coltura) liquidi o solidi.Essendo i microrganismi ubiquitari, gli ambienti naturali in cui

è

possibile riscontrarne la presenza sono diversissimi e numerosissimi:

In tali ambienti convivono, di norma, microrganismi appartenenti

a specie diverse, sia dello stesso gruppo biologico, sia di più

gruppi biologici (batteri e funghi; alghe, protozoi, batteri e virus, ecc.). Le fonti naturali dei microrganismi sono pertanto costituite da popolazioni miste.Il materiale da cui partire per allestire colture microbiche può

essere rappresentato da campioni naturali, ceppi standard di riferimento, colture pure isolate.La scelta della tecnica di prelievo dell’inoculo e di semina successiva è

determinata:

Qualsiasi sia il tipo di procedura adottata, questa deve essere condotta in condizioni di sterilità,

per evitare contaminazioni crociate dei microrganismi in esame da parte di contaminanti provenienti dall’ambiente, dai materiali utilizzati e dall’operatore.

ALIMENTI ACQUA LIQUIDI BIOLOGICI TERRENO

TECNICHE DI

SEMINA

dalle condizioni in cui si presenta il campione (liquido, semisolido o solido)

dallo scopo per cui vengono predisposte le varie colture (conta,

isolamento, ecc.).


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per striscio, ogni componente del gruppo preleverà

dalla colonia selezionata (magari ognuno una colonia di tipologia diversa) una piccola porzione con l'ansa (sterilizzata su Bunsen) e provvederà

a strisciare la propria piastra in tre zone diverse con tutti gli accorgimenti già

descritti nelle pagine precedenti (pag. 93);

per spatolamento, Operare sotto una cappa sterile o accanto alla fiamma del Bunsen, prelevare con una pipetta di precisione 0,1 ml di acqua dal campione preparato prece-

dentemente e trasferirlo al centro di una piastra con agar nutrient. Distribuire con una spatola sterile l’inoculo sulla superficie dell’agar in tutte le direzioni. Rovesciare la pia-

stra e incubarla a 28°-32°

per 24-48h.


8-Esperienza di laboratorio. Le tecniche di sem

ina in terreno solido

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Per coltivare ed isolare i microrganismi anaerobi (microrganismi che si sviluppano in assenza di ossigeno) si utilizzano le giare o le cabine per anaerobiosi.Le giare comunque, difficilmente possono riprodurre condizioni atmosferiche adeguate e costanti tali da garantire un ambiente idoneo per la crescita degli anaerobi, per una serie di motivi oggettivi. Tra questi, è

da ricordare che, alcuni sottoprodotti del catabolismo degli anaerobi, quali gli acidi grassi volatili (VFA), che derivano dai processi di fermentazione acetica, propionica e butirrica, possono risultare dannosi per la sopravvivenza degli stessi microrganismi anaerobi in coltura. L’acido solfidrico (H2

S) si lega al catalizzatore presente nelle giare, danneggiandolo

in modo irreversibile. Inoltre l’acqua prodotta durante l’incubazione delle colture e che deriva prevalentemente dalla reazione di riduzione dell’ossigeno tende a danneggiare il catalizzatore, che risulta fondamentale per l’ottenimento delle condizioni anaerobiche, ossia l’assenza dell’ossigeno molecolare, condizione da raggiungere nel più

breve tempo possibile, altrimenti molti degli anaerobi, soprattutto i ceppi più

sensibili

all’ossigeno, non riuscirebbero a sopravvivere.Nelle giare, per quanto si vogliano limitare gli effetti negativi indicati, che ostacolano la sopravvivenza dei batteri anaerobi, non risulta possibile controllarli e neutralizzarli completamente. In aggiunta, non risulta possibile con le giare, eseguire le fasi di semina, le reazioni di identificazione o i test di sensibilità

agli antibiotici, in ambiente strettamente anaerobico.

Coltivazione degli anaerobi

Porre le piastre inoculate in una giara per anaerobiosi, con un catalizzatore attivo.Scegliere la bustina appropriata per anaerobiosi o per microaerofilia

di Gas Generating

Kit, a seconda del volume della giara. In base alla bustina leggere attentamente le istruzioni riportate sulla stessa e procedere ad effettuare le operazioni asetticamente. Porre la giara in un termostato e lasciare incubare alla temperatura idonea e per i tempi necessari allo sviluppo dei microrganismi.

Giara per anaerobiosi

Istruzioni

VII cap. fattori che influenzano la crescita


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Esercitazionen°10 Microrganismi anaerobi e influenza dell'ossigeno sulla crescita 11 Influenza del pH del terreno di coltura sulla crescita12 Influenza della temperatura sulla crescita

13 Valutazione dell’azione inibente di alcuni antibiotici

FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCETA VII cap. fattori che influenzano la crescita

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Verifichiamo i risultati: passaggio successivo alla semina e incubazione è

quello di esaminare

i

risultati, osservare le crescite in piastra a occhio nudo o con un contacolonie.

Si registrano tutti i dettagli sul proprio quaderno e per osservare la forma dei microrga-

nismi anaerobi e aerobi si procede ad allestire dei preparati microbici a fresco e fissati, colorati utilizzando la colorazione al blu di metilene e quella di Gram.

Domande e approfondimenti. 1-

Quali batteri anaerobi vivono nell'aria, nel terreno e nell'acqua? 2-

Che forma hanno?Cerca di rispondere a queste domande facendo delle ricerche nella rete internet e utilizzando anche il libro di teoria.Confronta i dati ottenuti sperimentalmente con quelli della ricerca e verifica la loro attendibilità.


10-Espe. di laboratorio. Microrganism

i anaerobi e aerobi e influenza dell'ossigeno sulla crescita

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- Assenza di crescita+ Crescita scarsa

++ Crescita normale+++ Crescita abbondante

Corretto il pH, dopo aver catalogato in modo preciso ogni provetta, si procede alla sterilizzazione. Nell'attesa prepariamo 4 piastre (classificare riportando il valore del pH) e il campione. Come campione in mancanza di colture pure e classificate si può utilizzare un campione disponibile nel laboratorio. Finita la sterilizzazione si piastra il terreno si attende la solidificazione e si procede alla semina: in caso di colture certe ogni coltura si semina per striscio in una porzione delle piastra. Se abbiamo

due colture, in metà

seminiamo una coltura e l'altra nella restante metà. In caso di campione invece si semi-

na (per striscio o spatolamento) l'intera piastra.Si trasferiscono le piastre in incubatore 36-37°C per 24-38 ore.Al termine del periodo di incubazione si valuta la crescita e si

registrano i risultati con i seguenti parametri:


La crescita dei microrganismi dipende dal pH?2-

Avere riferimenti sulla tipologia di microrganismo da ricercare

può essere utile per avviare l'attività

di laboratorio?Cerca di rispondere a queste domande facendo delle ricerche nella rete internet e utilizzando il libro di teoria.Dopo confrontali con dati che hai ottenuto dalla prova e valuta i tuoi risultati speri-

mentali in base ai dati trovati nella rete internet o sul libro di teoria.


11-Esperienza di laboratorio. Influenza del pH

del terreno di coltura sulla crescita

Alcuni risultati

In base ai valori di pH si otterranno crescite di diversa intensità.

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- Assenza di crescita+ Crescita scarsa

++ Crescita normale+++ Crescita abbondante

Osservazione della crescita:

le piastre devono essere osservate ogni giorno per circa 7 giorni. Tutti i dati riguardanti la crescita vanno registrati in

una tabella (2) e si consiglia di utilizzare la simbologia riporta nella tabella (1) per registrare la misura della crescita osservata.


La crescita dei microrganismi dipende dalla temperatura?2-

Secondo i dati ottenuti e i risultati delle colorazioni hai identificato qualche

microrganismo che è

cresciuto a tutte le temperature (ubiquitario)?


12-Esperienza di laboratorio. Influenza del pH

del terreno di coltura sulla crescitatabella (1)

Primo giorno Secondo giorno Terzo giorno

4°C 20°C 40°C 60°C 4°C 20°C 40°C 60°C 4°C 20°C 40°C 60°C

Osservazioni dei microrganismi:

per verificare la tipologia di microrganismi cresciuti alle vaie temperature è

necessario preparare alcuni vetrini. Preparare alcuni vetrini al blu di metilene e altri con la colorazione di Gram

delle colonie più

significative.

Categoria Temperatura minima Temperatura ottimale Temperatura massima

Ipertermofili >70 °C 85 -

100 °C 120 -

130 °C

Termofili 45 °C 65 °C 70 °C

Mesofili 15 °C 20 -

40 °C 45 °C

Psicotrofi 0 °C 20 °C -

30 °C 35 °C

Psicrofili 0 °C 15 °C 20 °C

Temperature caratteristiche

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TATO L'UTIL

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CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

114

Rischi e precauzioni. I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, autoclave).A.Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle

colture microbiche e l’equipaggiamento di protezione idoneo durante la fase di preparazione ed uso dello standard di Mc Farland.

Principio.

Il potere antibiotico di alcuni composti chimici può essere valutato indagando la loro capacità

di inibire la crescita di microrganismi. Il metodo utilizzato è

quello della diffusione in agar basato sull’uso di dischetti di carta da filtro sterili imbevuti del compo-

sto da saggiare. I dischetti, disposti sulla superficie del terreno agarizzato, seminato con un ceppo microbico standardizzato, permettono la diffusione del disinfettante nel terreno. Dopo incubazione si osserverà

intorno al dischetto un alone di inibizione della crescita che avrà

un diametro tanto più

grande quanto più

efficace sarà

il disinfettante.

Esperienza 13VII cap. fattori che influenzano la crescita

13-E

sper

ienz

a di

labo

rato

rio.

Val

utaz

ione

de

ll’az

ione

inib

ente

di a

lcun

i ant

ibio

tici

Valutazione dell’azione inibente di alcuni antibiotici

Materiale occorrenteAnsa di platinoBacchette di vetroBeute, becher, cilindriCarta assorbenteDischi di carta da filtro sterili con

diametro 6 mm, Piastre Petri steriliPinze, Portaprovette

16x100Provette Spatole steriliTamponi sterili

Terreni

di

colturaTSA, TSB, Muller Hinton agar

StrumentazioneAutoclaveBilanciaContacoloniePiastra scaldanteTermostato

Bunsen

CampioneCeppi di:Bacillus

subtilisEnterobacter

aerogenesE. coli

Obiettivo.

Quello che si va a determinare oggettivamente nel test di sensibilità

agli antibiotici è

la cosiddetta “MIC”

o minima concentrazione inibente (MCI

o CIM ). La MIC

è

definita come la minima concentrazione in un range di diluizione di antibiotico che inibisce la crescita visibile batterica.

FASE I1-

Preparare delle provette contenenti 5 ml di TSB, sterilizzarlo per gli inoculi dei ceppi batterici. 2-

Seminare i brodi prelevando circa 4-5 ansate di ogni ceppo batterico.3-

Incubare per 18 h a 37°

C.4-

Standardizzare l’inoculo confrontando la torbidità

della brodocoltura

con quella dello standard McFarland, (tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml); usare brodo sterile per eventuali diluizioni della brodocoltura.

Standard Mc Farland

0,5 ml di Bario cloruro 0,048M + 99,5 ml di Acido Solforico 0,35

N (0,99 ml/100ml di acido solforico, 0,117 g/10 ml di Bario Cloruro). Tale standard corrisponde circa a 108 batteri/ml). La soluzione è

stabile per circa 6 mesi. Agitare prima dell’uso.

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116

VALUTAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA

Determinare la quantità

di microrganismi presenti in campione è

fondamentale per

l'analisi microbiologica. Con le procedure proposte in questo capitolo acquisiremo la me-

todica da attuare nell'analisi microbiologica quantitativa.

VIII cap. valutazione della crescita microbica "analisi quantitativa"

VIII

cap

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resc

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mic

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117


Metodi di conta indiretti:i microrganismi vitali vengono contati sulla base di una manifestazione visibile

della crescita; è

il metodo che viene usato spesso nei laboratori didattici.a.

in tubo (metodo MPN): torbidità, sedimento, viraggio indicatori, etc.b.

su agar (formazione di colonie).

Metodi di conta diretti:Utilizzando dei microscopi e dei vetrini con delle apposite "camere di conta" vengono contate direttamente le cellule.

a. È

possibile valutare separatamente le cellule vive e cellule morte utilizzando dei coloranti. Colorando con la fluoresceina diacetato

si possono osservare le cellule vive con colore verde e quelle morte con colore rosso.b. Con sonde oligonucleotidiche

marcate con coloranti fluorescenti (FISH) è

possibile contare gruppi diversi di microrganismi

Metodi per la misurazione della biomassa–

metodi gravimetrici–

metodi spettrofotometrici–

metodi chimici

La valutazione della crescita microbica è

importante per valutare il nostro risultato analitico per poi poterlo confrontare con il dato riportato nelle norme. Un esempio può essere la valutazione delle UFC/L contenute nell'acqua che in base al campione (acqua potabile, piscina, balneabile, fiume ecc.) il dato analitico deve rispettare dei parametri stabiliti legalmente. Vi sono diversi metodi di valutazione della crescita microbica diretti, indiretti e strumentali che possiamo utilizzare per valutare in modo quantitativo la crescita microbica.

METODI E TECNICHE IMPIEGATEPER STABILIRE IL NUMERO DEI MICRORGANISMI

Conteggio mediantecontatori elettronici

Conta in piastra

Conta interreno liquido

Conteggiomicroscopico

Contaper filtrazionesu membrana


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Metodi di conta INDIRETTI

CONTA VITALE -

CONTA IN PIASTRA1-

Conta per inclusione•

Il campione viene diluito.•

Un’aliquota nota viene pipettata

in una piastra vuota, alla quale si aggiunge substrato agarizzato fuso e raffreddato.

•

Substrato e inoculo vengono omogeneizzati e, dopo la solidificazione il substra-

to viene incubato (in genere per non meno di 24 h) alla temperatura opportuna.•

Si contano le colonie: ogni colonia è

derivata da una cellula o da un aggregato di cellule immobilizzato nell’agar.

•

Il numero di colonie viene moltiplicato per il fattore di diluizione.Conta per inclusione: cause di errore•

Temperatura del terreno fuso, al momento del suo mescolamento con l’ino-

culo, troppo elevata. La temperatura è

certamente fra i fattori in grado di provo-

care stress nei microrganismi, fra i più

importanti. Un germe stressato può non riprodursi oppure chiedere un tempo eccessivamente lungo per farlo, per cui non si avrà

una colonia visibile al momento della lettura della prova.•

Errori di omogeneizzazione (riscaldamento eccessivo operato dall’apparecchio, omogeneizzazione imperfetta)

•

Cattiva distribuzione dell’inoculo•

Errori dell’operatore al momento della preparazione del campione•

Errori al momento della lettura dei risultati (presenza di frustoli, bollicine di gas, ecc., erroneamente valutate come colonie batteriche).

2. Conta per spatolamento•

Il campione viene diluito.•

Un’aliquota nota viene pipettata

sulla superficie del substrato agarizzato prece-

dentemente versato in piastra e solidificato.•

L’inoculo viene distribuito sul substrato che viene incubato (in genere per non meno di 24 h) alla temperatura opportuna.

•

Si contano le colonie: ogni colonia è

derivata da una cellula o da un aggregato di cellule immobilizzato nell’agar.

•

Il numero di colonie viene moltiplicato per il fattore di diluizione.Conta per spatolamento: vantaggi•

Utilizzazione di terreni anche non trasparenti.•

Permette lo studio morfologico delle colonie sviluppate.•

Evita gli stress sui microrganismi conseguenti all’utilizzazione di terreno a T°

elevata al momento della semina (gli psicrofili sono particolarmente sensibili alle temperature elevate).


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123


I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante,

autoclave).B. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle colture microbiche.

Obiettivo.

Determinare il numero complessivo di microrganismi presenti in un dato campione (carica microbica totale): analisi quantitativa. Conta

in piastra per inclusione e per spatolamento.

Principio.

Ogni cellula microbica viva, inoculata in piastra per inclusione

e incubata, si riproduce formando una colonia isolata. Contando le colonie sviluppatesi nel terreno si può risalire al numero di microrganismi presenti in un volume

noto del campione.

Esperienza

CONTA MICROBICA IN PIASTRA14

Terreni di coltura•Nutrient

agarStrumentazione•Autoclave • Bunsen• Piastra scaldante• Termostato• Contacolonie

Campione, sostanze e reattivi

Colture microbiche in brodo (da precedente esperienze), soluzione fisiologica sterile

(0.9% NaCl m/m in acqua dist. )

Materiale occorrente• Beute da 500 mL• Carta assorbente• Piastre Petri sterili (8+8)• Pipette sterili da 1 ml e da 10

ml o pipette di precisione• Portaprovette• Provette, provettoni• Spatole sterili

Procedimento operativo.

Preparare 250 mL

di terreno per gruppo e valutare con atten-

zione la necessità

dell'intera classe per evitare sprechi. Ogni gruppo deve avere la pos-

sibilità

di allestire almeno 8 piastre, 2 per ogni diluizione. I gruppi possono operare per poter effettuare una prova o per spatolamento o per inclusione per poi valutare i dati ot-

tenuti in comune. Se un gruppo opera per valutare la carica batterica totale per spatola-

mento l'altro opererà

per inclusione. Questo consente di lavorare in modo veloce e

preciso. Si può anche decidere di eseguire la medesima prova per tutti: inclusione in una o due lezioni e spatolomento in una o due lezioni . Preparare 4 provettoni

per gruppo, la soluzione fisiologica 100 0 250 mL

per gruppo e sterilizzare nel ciclo di sterilizzazione del terreno. Allestire la propria postazione di lavoro con tutto il necessario, accendere il Bunsen e operare massimo a 60 cm di distanza, se si operare sotto cappa a

flusso laminare prepa-

rare la cappa e alternarsi con i gruppi. Scegliere una sospensione batterica in brodo da precedente esperienza e cercare di mescolarla bene senza aprirla. Finita la sterilizzazione, metà

dei gruppi, prepareranno 8 piastre (per gruppo) per effet-

tuare la prova per spatolamento e sotto cappa a flusso laminare verseranno il terreno nelle piastre. Il terreno rimasto si deve mantenere a 45°, sarà

utilizzato dai restanti gruppi per


14-Esperienza di laboratorio. Conta m

icrobica in piastra

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127

1.

Individuare la diluizione limite: è

l’ultima diluizione, se esiste, con tutti i tubi

positivi; nell’esempio è

10-5.2.

Individuare il codice caratteristico: è

un numero a 3 cifre costituito dal numero di tubi positivi nella diluizione limite, dal numero di tubi positivi in quella successiva e poi ancora nella successiva: nell’esempio è

310.3.

Ricavare dalle tabelle MPN il numero più

probabile corrispondente al codice carat-

teristico: nell’esempio è 4,34.

Per ricavare il valore di MPN/mL

o g di campione non diluito, moltiplicare per il fattore di diluizione corrispondente alla diluizione limite (10-5 quindi 105) : 4,3x105.

Vantaggia.

È

un metodo sensibile (si possono usare anche 50 ml di inoculo).b. È

facile da usare con substrati selettivi.c.

Con particolari accorgimenti (substrati fluoroge-nici) è

possibile ottenere risultati in 4 . ore.

N. caratteristico MPN per gr o mL Categoria 0 0 0 < 0.3 -0 0 1 0.3 3 0 1 0 0.3 2 0 1 1 0.61 0 0 2 0 0.62 3 0 3 0 0.94 0 1 0 0 0.36 1 1 0 1 0.72 2 1 0 2 1.1 0 1 1 0 0.74 1 1 1 1 1.1 3 1 2 0 1.1 2 1 2 1 1.5 3 1 3 0 1.6 3 2 0 0 0.92 1 2 0 1 1.4 2 2 1 0 1.5 1 2 1 1 2.0 2 2 1 2 2.7 0 2 2 0 2.1 1

N. caratteristico MPN per gr o mL Categoria 2 2 1 2.8 3 2 0 2 2.0 0 2 2 2 3.5 0 2 3 0 2.9 3 2 3 1 3.6 0 3 0 0 2.3 1 3 0 1 3.8 1 3 0 2 6.4 3 3 1 0 4.3 1 3 1 1 7.5 1 3 1 2 12 3 3 1 3 16 0 3 2 0 9.3 1 3 2 1 15 1 3 2 2 21 2 3 2 3 29 3 3 3 0 24 1 3 3 1 46 1 3 3 2 110 1 3 3 3 > 110 -

Svantaggi•

È

molto meno preciso delle conte in piastra.

•

È

laborioso e può essere costoso

3 1 0

MPN tabelle di McCrady

Calcoli di una conta MPNConsideriamo di aver ottenuto i seguenti risultati:


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129

10 ml di Brodo lattosato

concentrazione doppia con campanella di Durham.


concentrazione normale con campanella di Durham.


concentrazione normale con campanella di Durham.

Campione

10 ml 1 ml 0,1 ml

Sterilizzare in autoclave le provette contenenti il terreno e nell'attesa preparare il cam-

pione da analizzare e tutto il necessario per procedere all'inoculo.Si osservi lo schema:

Questa semina

scalare permetterà

lo sviluppo sia dei

batteri presenti in numero esiguo nel campione (10 ml), sia la visibilità

se il numero dei batteri del campione fosse elevato (0,1ml).Incubare tutti

i tubi a 37°

per 24/48 ore.Leggere i risultati, considerando come positivi quei tubi dove si evidenzia intorbidamento e produzione di gas dato dalla risalita delle campanelle di Durham. Per determinare l’indice M.P.N

si contano i tubi positivi come nell'esem-

pio delle pagini precedenti o si può utilizzare la seguente tabella con numero caratteristico diviso in tre colonne.

Tubi positivi MPN/g Tubi positivi MPN/g0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.0010 0 0 <3.0 2 2 0 210 0 1 3.0 2 2 1 280 1 0 3.0 2 2 2 350 1 1 6.1 2 3 0 290 2 0 6.2 2 3 1 360 3 0 9.4 3 0 0 231 0 0 3.6 3 0 1 381 0 1 7.2 3 0 2 641 0 2 11 3 1 0 431 1 0 7.4 3 1 1 751 1 1 11 3 1 2 1201 2 0 11 3 1 3 1601 2 1 15 3 2 0 931 3 0 16 3 2 1 1502 0 0 9.2 3 2 2 2102 0 1 14 3 2 3 2902 0 2 20 3 3 0 2402 1 0 15 3 3 1 4602 1 1 20 3 3 2 11002 1 2 27 3 3 3 >1100

15-Esperienza di laboratorio. Conta vitale in

substrato liquido VIII cap. valutazione della crescita microbica "analisi quantitativa"

Prova di conferma.

La presenza dei coliformi può essere confermata seminando 0,1 mL

dai tubi positivi in Brodo lattosato

bile verde brillant. Incubare i tubi a 36±1°C per 24+24 ore. Alla fine del periodo di incubazione, la formazione di gas nelle campanelle costituisce una reazione positiva per i coliformi totali.

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CONTA VITALE SU MEMBRANA FILTRANTE1.

Rappresenta l’ulteriore evoluzione del metodo di conteggio delle colonie in piastra.

2.

L’aliquota del campione viene filtrata attraverso una membrana (general-

mente con porosità

nominale di 0,45 μm), successivamente posta sul terreno di coltura agarizzato in capsula di Petri.

3.

Dopo l’incubazione si svilupperanno colonie sulla superficie della membrana, la cui quadrettatura semplifica la conta.

4.

La metodica della filtrazione si adatta bene per valutazioni microbiologiche a tutti i tipi di acqua, tranne che a quelle particolarmente torbide, per le quali è

necessario una prefiltrazione.5.

Consente di ottenere risultati in tempi più

brevi (24-48 ore).6.

Permette di esaminare anche grandi volumi di campione.


Fasi operative


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133

recuperare l tracce di campione dal matraccio effettuando un lavaggio con pochi mL

di acqua sterile, deponiamo le membrane nelle piastre, dopo laviamo con acqua

distillata sterile l'imbuto. Si procede a filtrare il campione non diluito. Si osservino le immagini che illustrano le fasi operative.

Incubare a 37°C per 48 ore.Riflessioni e osservazioni dei risultati.

Questa esperienza è

servita soltando per far acquisire il metodo, in genere la tecnica delle membrane filtranti viene eseguita diret-

tamente con terreni selettivi per specifiche determinazioni analitiche che vedremo più

avanti (osservare l'esperienza di pag. sez. microbiologia ambientale). Calcola lUFC/mL

e confrontalo con i risultati precedentemente ottenuti con il metodo a inclusione e spatolamento.

2

1

3

4

5

6


16-Esperienza di laboratorio Conta su

mem

brana per filtrazione

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CONTA TOTALE CONTA DIRETTA: CAMERE DI

CONTA

superficie quadrettata:• quadrato di 1 mm di lato• ogni lato è

diviso in 20 parti• ogni quadratino ha una superficie

di 1/400 mm2

= 0.0025 mm2

zona con incavo delimitata da un vetrino a facce perfettamente piane e parallele0,1 mm = Thoma0,02 mm = Petroff-Hausser

cellule di lievito, in-

grandimento 100x

Camera di Thoma

1.

Ci sono 70 cellule in 50 quadratini: N = 1,4 cellule/ quadratino

2.

Ogni quadratino corrisponde ad un volume 0.00025 mm3

(1/4000)3.

Il numero di cellule per

cm3

o ml è

dato da:D*4000*1000*Ndove D è

il fattore di

diluizione e 1000 il fattore per convertire mm3

in cm3

Risultato

(se D=1): 5,6x106

cellule/ml


Le camere di conta sono particolari vetrini che hanno un incavo quadrato che contiene una precisa quantità

di campione analizzato. Osserviamo le varie camere che si

utilizzano:


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137

Esempio di calcolo: 1.10 ml di coltura (B) vengono prelevati e filtrati su un filtro essiccato e pesato (P0

=0,9000 g)2.dopo la filtrazione, i lavaggi e l’essiccazione il filtro con la biomassa viene pesato (P1

=1,1000 g)3.la concentrazione di biomassa secca (g/l) è:

X = (P1

-P0

)/(B/1000) = 20 g/l

fonte luminosa(lampada al tungsteno)

fotocellula(luce trasmessa: T%

o A)

fotocellula(luce diffusa: NTU)

luce bianca

monocromatore(filtro, prisma,

reticolo)

luce monocromatica

tubo contenente la coltura

La lampada emette luce con intensità

I0

. A causa della diffusione, della rifrazione e dell’assorbimento arriva alla fotocellula per luce trasmessa un’intensità

I. La trasmittanza

(T) si ricava:

L’assorbanza (A) si ricava:varia in genere fra 0 e 3. Per un intervallo limitato (0-0,6) esiste una relazione lineare fra assorbanza e numero di cellule o biomassa.

100 ;0

%0

×==IIT

IIT Generalmente la trasmittanza

è

espressa come valore percentuale (0-100%).

II

TA 0

1010 log1log ==

VALUTAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICAVIII cap. valutazione della crescita microbica "analisi quantitativa"

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138

ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE

Riconoscere e identificare la tipologia di microrganismi presenti in campione è

fonda-

mentale per l'analisi microbiologica. Con le procedure proposte in questo capitolo a-

cquisiremo la metodica da attuare nell'analisi microbiologica qualitativa.

IX cap. isolamento e identificazione "analisi qualitativa"

IX c

ap. i

sola

men

to e

iden

tific

azio

ne "

anal

isi

qual

itativ

a"

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139

Isolare, significa “separare”; questa condizione nella pratica microbiologica rappre-

senta l’operazione preliminare necessaria per poter effettuare un’identificazione cor-

retta delle specie microbiche presenti in un dato campione.In effetti la quasi totalità

dei campioni reali presenta una flora polimicrobica e solo in casi estremamente particolari è

possibile riscontrare batteri appartenenti a un’unica specie.L’isolamento in coltura pura permette di ottenere colonie singole in terreno solido in piastra, utilizzando diverse tecniche:

per striscioper spandimentoper inclusioneper diluizione all’estinzione.

L’isolamento in piastra può avvenire:


direttamente dal campione da coltura di arricchimento

da colonie su terreno


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Incubare

tutte

le piastre

seminate

per striscio

a 37°c per 24 ore

L’isolamento diretto, che avviene generalmente impiegando terreni selettivi e differen-

ziali, si effettua strisciando il campione direttamente sulla superficie del terreno solido in piastra (i batteri sono immobilizzati, cosicché

le cellule derivate da ciascuna delle cellule madri originariamente presenti nel campione seminato non

sono in grado di allontanarsene, ma rimangono in stretto contatto le une con le altre organizzandosi in una struttura visibile ad occhio nudo, la colonia batterica).Viene impiegato quando si suppone che il campione contenga un’unica specie o più

specie tutte in grado di svilupparsi nelle condizioni di lavoro individuate.Quando il campione è

costituito da una popolazione mista e ancor più, quando la spe-

cie che interessa isolare è

presente in piccola quantità, conviene far precedere l’iso-

lamento vero e proprio da una coltura di arricchimento (in terreno liquido).Un tipico esempio di isolamento per arricchimento si incontra nel protocollo per l’i-

dentificazione delle salmonelle.

Metodi di isolamento.

– Isolamento per striscio su piastra.– Isolamento per spandimento e per inclusione in agar.– Isolamento per diluizione all’estinzione.

ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONEIX cap. isolamento e identificazione "analisi qualitativa"

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ISOLAMENTO PER STRISCIO SU PIASTRAPrima di procedere è

necessario avere qualche riferimento sulle colonie da isolare e

quindi sce-

gliere un terreno appropriato.

Principio del metodo: l’inoculo liquido (prelevato da una brodocoltura) o solido (cellule prelevate da uno slant

o da una colonia) viene strisciato usando un’ansa sulla superficie di un substrato idoneo. Le cellule vengono distribuite su un percorso sempre più

lungo cosicchè

alla fine dovrebbero risultare colonie ben isolate che probabilmente derivano da una sola cellula.


ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO E PER INCLUSIONE

Principio del metodo: l’inoculo, liquido o solido, opportunamente diluito, viene inoculato in substrati agariz-

zati

per inclusione o per spandimento, analogamente a quanto descritto per le conte su piastra. Dopo l’incubazione dovrebbero apparire colonie ben isolate che, però, raramente sono pure. E’

possibile prelevare una colonia e ripurificarla

per striscio.


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4.1 Reazioni biochimiche: metodi rapidi

Nella pratica si utilizzano test significativi rapidi e semplici che forniscono dati costanti e riproducibili.Il sistema Biolog1.

Il sistema è

fondato sulla caratterizzazione funzionale dei microorganismi, cioè

sulla capacità

di attaccare specifici substrati.2.

Questa tecnica consente di monitorare contemporaneamente fino a 96 reazioni

biochi-

miche diverse.3. I ceppi vengono inoculati in piastre con 96 pozzetti contenenti

fonti di C o N diverse.4. La crescita determina una variazione di colore di un indicatore

redox.5. Le piastre vengono lette da sistemi automatici.6.

Il risultato è

un pattern biochimico caratteristico che consente di confrontare comunità

microbiche diverse, facendo emergere differenze non facilmente evidenziabili

con altri metodi, come quelli conseguenti a modificazioni nei rapporti quantitativi delle specie che compongono una popolazione, o tra i ceppi appartenenti alla medesima specie.

EnterotubeL’Enterotube è

un sistema pronto all’impiego per l’identificazione rapida

degli Entero-

batteri (batteri aerobi, anaerobi facoltativi, Gram-, ossidasi-negativi).Gli speciali terreni di coltura dei diversi scomparti del contenitore consentono l’esame simultaneo di 15 differenti caratteristiche biochimiche dei batteri.Tutti gli scomparti vengono inoculati simultaneamente

con un’unica operazione, a partire da colonie pure

e, consentono la lettura dei risultati dopo 24 h di incubazione.


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Gallerie API

Bacilli Gram

negativi: EnterobacteriaceaePer identificare le varie specie all’interno della famiglia si ricorre al sistema API 20E.Questo sistema è

dotato di 20 cellette, per cui saggia 20 attività

metaboliche. Dopo 18-24 ore di incubazione a 37°C è

possibile leggere il risultato.

Prove biochimiche

Lettura dei risultati: esito negativo

Se il microrganismo non possiede gli enzimi capaci di degradare il substrato, la molecola rimane integra e le condizioni chimico-fisiche della miscela al termine dell’incubazione rimangono identiche a quelle esistenti all’inizio del periodo di incubazione.

Lettura dei risultati: esito positivo

Se il microrganismo è

attivo nei confronti del substrato, la molecola viene scissa in

composti semplici più

acidi o più

alcalini del substrato di partenza. Lo stato chimico-

fisico della miscela dopo l’incubazione differisce da quello iniziale.Un adatto indicatore di pH testimonia con la variazione del proprio colore il

cambiamento della miscela.

Metodi di identificazione

La scelta delle prove da effettuare e l’interpretazione dei risultati ai fini del ricono-

scimento dei microrganismi, può essere semplificata ricorrendo a due diversi sistemi di identificazione:-

le chiavi dicotomiche;-

le tavole diagnostiche.


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Tecniche di amplificazione in vitroL’uso dell’amplificazione genica mediante Polymerase

Chain

Reaction

(PCR-

reazione a catena della polimerasi) consente di ottenere grandi quantità

di DNA a partire da poche molecole.La presenza in un campione di un numero anche estremamente basso

(teoricamente basta 1 sola copia) di specifiche sequenze di acidi nucleici appartenenti ad un microrganismo patogeno può essere facilmente evidenziata amplificandole fino a

1 miliardo di volte in provetta.

PCR fase per fase

La reazione a catena della polimerasi (PCR) si basa sul principio naturale della repli-

cazione del DNA.Nella replicazione del DNA all’interno della cellula, i due filamenti di una doppia elica si svolgono e si separano per permettere la sintesi di nuove catene.Ogni filamento originario agisce da stampo per la formazione di un nuovo filamento complementare. In questo modo, la replicazione del DNA è

semiconservativa ed ogni molecola figlia riceve un filamento dalla molecola madre. La replicazione del DNA è

un processo complesso in cui sono coinvolte molte proteine, tra cui

le DNA polimerasi. Queste sono enzimi responsabili del processo di lettura della sequenza del filamento origine di DNA e della sintesi del nuovo filamento appaiato o complementare, ottenuta trovando i giusti componenti, o basi, ed integrandoli nel nuovo filamento di DNA.La PCR permette di simulare la replicazione “generazionale”

di DNA per le sequenze geniche scelte. Come il processo di replicazione naturale, il processo PCR crea copie multiple della sequenza scelta.


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PCR fase per fase

Un ciclo PCR è

composto dalle seguenti fasi:1. Denaturazione2. Ibridazione3. EstensioneQuesto processo ha luogo nel thermal

cycler, uno strumento che controlla

automaticamente ed alterna le temperature, per periodi di tempo programmati e per il numero di cicli di PCR adeguati.Per permettere la replicazione del DNA nel processo di amplificazione, è

necessario aggiungere alla miscela di reazione: il DNA bersaglio, una DNA polimerasi, i primer, i dNTP, i sali e i tamponi.

DNA ed RNA polimerasi

Questi possono essere trovati in tutti i tipi di cellule e, rispetto agli altri enzimi, hanno una caratteristica fondamentale: la scelta del substrato è

determinata da uno stampo, il filamento di DNA o RNA.Ci sono diverse DNA ed RNA polimerasi coinvolte nel processo di replicazione e trascrizione. È

stato dimostrato che alcune di esse potevano funzionare in sistemi in vitro e da quel momento sono state utilizzate nel processo di amplificazione PCR.Le DNA polimerasi utilizzate nel processo PCR devono essere termostabili per

funzionare alle alte temperature dei cicli della PCR. Le DNA polimerasi che non sono disattivate dalle alte temperature possono essere trovate nei batteri che vivono nelle sorgenti di acqua calda, quali il Thermus aquaticus (Taq polimerasi) o essere progettate specificamente per questo scopo (ad es. ZO5).

Primer

Nella PCR, il primo obiettivo è

selezionare una sequenza conservata di lunghezza definita che, per quell’organismo, risulti unica. Per raggiungere questo scopo, sono disegnati dei primer

(piccoli oligonucleotidi

di circa 20 basi), specifici per la sequenza bersaglio, che ibridizzano

con entrambe le estremità

della regione da amplificare. Due primer

sono inclusi nella miscela di reazione, uno per ogni singolo filamento di DNA complementare prodotto durante la denaturazione. Solitamente, i primer

si

legano al filamento bersaglio a temperature comprese tra 50ºC e 65ºC, in relazione alla lunghezza ed alla composizione in basi dei primer

stessi. Ciò fa si che i primer

ibridizzino

con la sequenza bersaglio in modo altamente specifico in quanto, a queste temperature, essi non resterebbero

associati con sequenze bersaglio errate.


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Esercitazione n° Titolo

Analisiqualitativa

Isolamento, caratteristiche metaboliche e identificazione

Saggi preliminari: catalisi e ossidazione18 Utilizzazione dell’amido 19 Utilizzazione di carboidrati 20 Ossidazione e fermentazione 21 Utilizzazione di aminoacidi 22 Enterotube 23 Gallerie Api24 Tecniche di biologia molecolare

17 Isolamento in coltura pura dei fermenti lattici nello yogurt


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zione

delle colonie e si registra ogni dettaglio sul proprio quaderno. Si scelgono le colonie da osser-

vare al microscopio e si procede con la colorazione di Gram.

Lactobacillus

bulgaricus:Aspetto colturale: microrganismi formanti colonie lenticolari spesso a forma di stella, da 1 a 3 mm di diametro, su terreno acidificato MRS.Aspetto microscopico: bastoncini generalmente corti, sono non sporigeni, Gram-positivi, non mobili, catalasi-negativi.

Streptococcus

thermophilus:Aspetto colturale: microrganismi formanti colonie lenticolari, da 1 a 2 mm di diametro, su terreno M17.Aspetto microscopico: cellule sferiche o ovoidali, a paia o in catene lunghe, sono Gram-positivi, catalasi-negativi.


I tuoi risultati sperimentali sono vicini a quelli attesi? (controlla le descrizioni prece-

denti)Cerca di rispondere alla domanda evidenziando ogni dettaglio che

conferma un buon risultato o un errore. Se i risultati risultano poco attendibili

cerca delle risposte sul libro di teoria, nella rete internet o nell'espansione online del testo.


17-E

sper

ienz

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Isol

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Lactobacillus bulgaricus microscopio

Lactobacillus bulgaricus colonie

Streptococcus thermophilus microsopio

Streptococcus thermophilu colonie:

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Fasi preliminari per l’identificazione dei batteri

Saggio della catalasiÈ

una prova biochimica che permette di differenziare gli streptococchi (catalsi

negativi) dai stafilococchi (catalasi

positivi). Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti. Depositare sul vetrino una goccia di H2

O2

al 3%. Stemperare il materiale microbico nella goccia di H2

O2

. Positività

del saggio: formazione di effervescenza (schiumetta bianca) dovuta alla liberazione di ossigeno che indica la presenza della catalisi nella coltura saggiata.

Le reazioni (presunte)

2 H2

O2

O2

+ 2 H2

OH2

O2

+ Fe(III)-Enz. H2

O + O=Fe(IV)-Enz. H2

O2

+ O=Fe(IV)-Enz. H2

O + Fe(III)-Enz

+ O2

Saggio dell’ossidasiQuesto saggio consente di identificare i batteri che posseggono l'enzima citocromo ossidasi. Questo test è

particolarmente indicato per la caratterizzazione dei batteri Gram

negativi.Per effettuare questo saggio utilizzeremo un BIOS DISC O disponibili presso le ditte produttrici. Come funziona: i batteri ossidano il reattivo contenuto nel disco

(N;N;N',N'-Trimetil-p-fenilendiammina

dicloroidrato) formando un colore caratteri-

stico, una colorazione grigio-blu conferma la presenza di organismi ossidasi positivi.

Prova. È

necessario operare in condizioni di asepsi e di protezione da agenti patogeni. Deponiamo su un disco due o tre gocce di acqua distillata, con un'ansa preleviamo il materiale batterico da esaminare, lo strisciamo sul disco e attendiamo 30 secondi. Se nei trenta secondi si forma una colorazione grigio-blu la prova eè

positiva, se non si ha nessuna colorazione l'ossidasi è

negativa.Accorgimenti: è

necessario prolungare l'osservazione oltre i 30 secondi perché

alcuni ceppi reagiscono in modo molto lento e addirittura ceppi con reazione molto lenta possono apparire negativi.È

preferibile utilizzare colonie pure da terreni non colorati; è

necessario mantenere i dischi in uno stato di conservazione ottimale come riportato nelle indicazioni.


Esperienza di laboratorio. Ossidasi e catalisi

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Osservare la reazione cromatica e registrare i dettagli sul proprio quaderno. Se si sono utilizzate colture ignote, per registrare la forma e altre caratteristiche dei batteri si proceda a preparare due vetrini uno a fresco con la colorazione al blu di metilene e l'altro con la colorazione di Gram.


Descrivi come avviene l'utilizzo dell'amido evidenziando la formazione dei com-

posti della fermentazione. Cerca di rispondere alla domanda effettuando ricerche nel web, espansione online e utilizzando il libro di teoria.


18-Esperienza di laboratorio. Utilizzazione

dell'amido

La colorazione chiara nel settore della

piastra in alto denota che l’amido è

stato uti-

lizzato.

La colorazione blu in entrambi i settori

dopo aggiunta di Lugol, evidenzia la pre-

senza ancora di amido.

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MICRORGANISMO Utilizzazione zuccheri Altri indicatori

Glucosio Saccarosio Lattosio Produzione gas pH

Escherichia

coli

Alcaligenes

faecalis

rispettivi microrganismi. Incubare a 37°C e procedere all'osservazione: la prima dopo 4h fare; la seconda dopo 24h. Riportare ogni dettaglio su proprio qua-

derno e registrare i risultati seguendo l'esempio riportato (tabella).

Il terreno di coltura Phenol

red

broth

base contiene un indicatore di pH, il rosso fe-

nolo, che è

rosso in ambiente alcalino, arancio in ambiente neutro e giallo

in ambiente acido. Dalla variazione dei colori, confrontando con il bianco, possiamo leggere l'e-

ventuale variazione di pH.La produzione di gas può essere rilevata con le campanelle di Durham.


Descrivi come avviene l'utilizzo dei carboidrati effettuando degli approfondimenti sul libro di teoria, nel web o con l'espansione online.


19-Esperienza di laboratorio. Utilizzazione dei

carboidrati

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MICRORGANISMO

INDICATORI

Reazione acida Reazione acida eProduzione di gas

Nessuna reazione

Escherichia

coli

Alcaligenes

faecalis

A = reazione acida; AG = reazione acida e produzione di gas; segno -

= nessuna rea-

zione o reazione alcalina

seminare. Seminare con ago per infissione due provette per ogni

carboidrato (2-gluco-

sio, 2-lattosio e 2-saccarosio). Prepariamo un po' di cera fusa con una candela bianca cercando di fonderla direttamente sulla fiamma del Bunsen in modo da effettuare anche una sterilizzazione, la si mantiene fusa in un becher piccolo e poi si procede ad aggiungerne un piccolo strato su una provetta per ogni carboidrato in modo da avere le due condizioni aerobiosi e anaerobiosi.Incubare per 48 ore a temperatura di circa 33°C e controllare ogni 24 ore l'andamento delle prove. Registrare i dati utilizzando una tabella ecco un esempio:

La produzione di gas, nelle provette coperta dalla cera, si evidenzia con il distacco dal terreno e lo spostamento verso l’alto della cera.Osservare il viraggio del terreno in base alla reazione: acida =

giallo; alcalina = blu


Descrivi nei vari casi se l'utilizzo dei carboidrati è

avvenuto in modo fermentativo o ossidativo. Effettuando degli approfondimenti cerca di illustrare e descrivere i vari passaggi delle trasformazione nei due casi.


20-Esperienza di laboratorio. O

ssidazione e ferm

entazione

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Finita l'incubazione si aggiunge a ogni provetta qualche goccia di reattivo di Kovacs e si osserva la reazione

Il test con il reattivo di Kovacs può essere effettuato anche con dischetti di carta pronti per l'uso e disponibili in

commercio. In questo caso bisogna prelevare con l'ansa i batteri e strisciarli sul dischetto.Registrare ogni dettaglio sul proprio quaderno e procedere ad una colorazione al blu di metilene e una di Gram

(provette positive).Osservare la forma dei batteri e registrare e registrare ogni dettaglio sul proprio quaderno.


Descrivi l'utilizzo degli amminoacidi cercando di evidenziare le varie trasfor-

mazioni.


La formazione di indolo con il reattivo di Kovacs (l'indolo reagisce con il gruppo aldeidico della pdimetilaminobenzaldeide con la formazione di un complesso rosso), conferma che i batteri posseggono l’enzima triptofanasi

e che sono capaci di utilizzare il triptofano.

21-Esperienza di laboratorio. U

tilizzazione di am

minoacidi

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Svitare i tappi e prelevare i batteri da una colonia selezionata

Tirare e girare l'ago, piegarlo e forare la parte aerobiosi .

Riavvitare i tappi. Incubare a 37°C per 20-24 ore in posizione verticale su un portapro-

vette

con lo scomparto del destrosio (anaerobiosi) rivolto verso l’alto.


22-Esperienza di laboratorio. Entrotube

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Rischi e precauzioni.

I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (Bun-

sen). Osservare tutte le norme di sicurezza riportate sulle etichette dei terreni, evitare la dispersione e l'inalazione delle polveri. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella mani-

polazione delle colture microbiche.

Identificazione batterica mediante sistemi miniaturizzatiLa necessità

di giungere rapidamente all’identificazione di gruppi importanti di microrganismi in matrici

di diversa origine ha portato allo sviluppo di sistemi miniaturizzati, basati su gallerie di test standardiz-

zati.Con questi sistemi si ricerca nel ceppo in esame, una ben definita attività

metabolica che permette al microrganismo di utilizzare, per fini plastici o energetici, un determinato substrato; si mettono, quindi, in contatto le sospensioni batteriche con il substrato in esame. Dopo un idoneo periodo di incubazione a 37°C, per permettere agli enzimi batterici di attaccare il substrato, si esamina la miscela substrato-

batterio:-

Risultato negativo: se il batterio non possiede gli enzimi capaci di degradare il substrato, la molecola resta integra e le condizioni chimico-fisiche della miscela restano inalterate al termine dell’incubazione;-

Risultato positivo: se il microrganismo è

attivo nei confronti del substrato, la molecola viene scissa in

composti semplici, acidi o alcalini del composto di partenza: lo

stato chimico-fisico della miscela è

alterato. Un adatto indicatore di pH, tramite viraggio del proprio colore, indica l’avvenuto cambiamento. Poiché

i microrganismi differiscono tra loro per la diversa capacità

ad utilizzare o produrre determinate sostanze, è

possibile identificarli tramite il rilievo dei prodotti finali o intermedi delle loro reazioni biochimiche. Le prove biochimiche includono il rilievo dei prodotti di demolizione di diversi zuccheri o di altri metaboliti quali acidi, gas, alcoli, oppure la valutazione della

capacità

di crescere in presenza di determinate fonti di carbonio e di energia. Pertanto, una serie di prove biochimiche, condotte sul batterio in esame, può fornire una specie di impronta digitale, che lo identifica con precisione. Attualmente sono disponibili kits

miniaturizzati, costituiti da decine di terreni diversi e opportuni indicatori cromogeni, mantenuti separati in cellette di plastica. E’

così

possibile rilevare contemporaneamente le capacità

o meno del batterio a metabolizzare zuccheri diversi, a utilizzare

citrati, a ridurre nitrati, a decarbossilare alcuni amminoacidi, a produrre idrogeno solforato ecc. Uno dei sistemi miniaturizzari

utilizzato frequentemente nei laboratori di microbiologia diagnostica è

rappresentato dall’API-system. Il sistema API è

un sistema biochimico prodotto industrialmente, dove le reazioni tra miscela di cellule batteriche e substrato avvengono dentro delle microprovette. Questo permette di poter studiare più

attività

enzimatiche (fino a 20) in poco spazio e contemporaneamente. Esistono vari sistemi API, a seconda dell’attività

metabolica che si vuole testare e quindi del batterio che si vuole identificare..

23Analisiper il

secondo

biennioIdentificazione (con sistema API-Test) di E. Coli

in matrici alimentari

Materiale occorrente•

Sacchetti sterili per Stomacher• Provettoni

sterili•

Pipette graduate sterili monouso• Piastre Petri sterili• Anse calibrate

Terreni

di

coltura

e sostanze•

Soluzione

sterile di

Ringer diluita

1:4 o soluzione

fisiologica

peptonata

sterile (sodio

cloruro

0,85% + pep-

tone 0,1%)•

Terreno

Violet Bile Agar (VRBA) + MUG (supplemento) Terreno

fluo-

rogenico•Terreno

Kliger

Iron Agar•API 20E

CampioneProdotti a base di carne, uova, gelato, burro,

pasta fresca artigianale,

frutta e verdura

Obiettivo. Identificazione di E. coli in prodotti alimentari mediante sistema Api -

Test

Strumenti• Stomacher•

Bunsen, cappa a flusso laminare • incubatore


23-Identificazione (con sistem

a API-Test) di E. C

oli in matrici alim

entari

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2^ Fase: Identificazione con sistema API 20EL’API 20E è

costituito da una base e da un coper-

chio in plastica.Riempire con acqua distillata le capsule presenti nella base, per mantenere umido l’API 20E.Inoculare i singoli pozzetti della Galleria API con

una piccola quantità

della sospensione microbica da identificare (seguire attentamente le indicazioni riportate sul foglio di istruzione annesso al kit per svolgere correttamente la procedura).Incubare la galleria a 37°C e dopo 18-24h leggere

i risultati.Trascrivere sulla scheda annessa al kit tutte le

variazioni che si osservano rispetto alla situazione iniziale (le reazioni prodotte durante il periodo di incubazione determinano viraggi colorati spontanei o conseguenti all’aggiunta di specifici reattivi).

Il codice numerico che si ricava dalla lettura delle reazioni positive (cambiamento di colore del contenuto del pozzetto) rimanda al microrganismo identificato.

23-Identificazione (con sistem

a API-Test) di E. C

oli in matrici alim

entari

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176

Alcune nuove tecnologie, come l’amplificazione degli acidi nucleici hanno migliorato signi-

ficativamente la specificità

e la sensibilità

dei test diagnostici, riducendo in modo significativo il tempo necessario per il rilevamento di patogeni microbici.Per il rilevamento di microrganismi in matrici alimentari e ambientali sono disponibili due principali metodiche, tra cui molto usata è

la Polimerase

Chain

Reaction

(PCR) e sue varianti.

Breve introduzione teoricaIl metodo della PCR usa una DNA polimerasi termostabile (per esempio l’enzima Taq) per sintetizzare copie multiple di un DNA bersaglio. Il processo può

essere diviso in tre passaggi che costituiscono un ciclo della reazione; la reazione di sintesi può essere condotta ripetendo il ciclo per molte volte. Nel primo dei tre passaggi, condotto a temperature superiori a 90°C, si ha la denaturazione del DNA, nel secondo avviene l’appaiamento (annealing) dei primers

con il filamento complementare del DNA bersaglio, generalmente a temperature comprese tra 50-

60°C ed infine si ha l’estensione ottimale del primer

a 68-72°C.La PCR offre molti vantaggi rispetto ai metodi basati sulle colture ed altri metodi standard per il rilevamento di patogeni. I principali vantaggi sono specificità, sensibilità, rapidità, accura-

tezza e capacità

di rilevare piccole quantità

di un acido nucleico bersaglio in un campione complesso. Poiché

la PCR amplifica l’acido nucleico di un organismo, questo permette nel caso di patogeni batterici di superare il problema di rilevare cellule vitali ma non coltivabili.La PCR viene utilizzata non solo per il rilevamento e l’identificazione di patogeni, ma anche per la ricerca di microrganismi in grado di produrre composti di

interesse.Un saggio di PCR deve essere effettuato riducendo al minimo i rischi di contaminazione. Tale rischio, può essere minimizzato utilizzando aree di lavoro separate per le diverse fasi dell’analisi (pre-PCR, PCR e post-PCR), utilizzando puntali con filtro.

Genere Pseudomonas: alcune informazioniIl genere Pseudomonas, genere tipo della famiglia delle Pseudomonadaceae

include batteri GRAM-

aerobi, eterotrofi, con elevate capacità

di adattamento, grande versatilità

metabolica e capacità

di colonizzare vari ambienti naturali.Le specie di Pseudomonas sono note per la loro capacità

di degradare composti che sono altamente refrattari ad altri microrganismi, inclusi idrocarburi

alifatici ed aromatici, acidi grassi, insetticidi ed altri inquinanti ambientali. I soli composti organici che i Pseudomonas non sono in grado di degradare sono teflon e composti organici ad un atomo di carbonio come metano, metanolo, formaldeide ecc. Questa proprietà

li rende dei candidati ottimali per l’utilizzo nel biorisanamento. Alcune specie di Pseudomonas hanno azione antagonista nei confronti di patogeni vegetali, producono composti che stimolano

la crescita delle piante, promuovono la simbiosi nelle micorrize e svolgono un ruolo importante nel ciclo del carbonio e dell’azoto. Altre specie possono essere patogeni opportunistici di piante, funghi, pesci, animali ed esseri umani.Alcune forme di Pseudomonas hanno la capacità

di formare biofilm

e risultano spesso resistenti o refrattarie ad antibiotici ad ampio spettro, il che

rappresenta un rischio per la salute umana soprattutto in ambienti nosocomiali. Molti materiali utilizzati nella pratica medica possono essere contaminati da Pseudomonas; questi includono soluzioni di antisettici e disinfettanti, ma più

comunemente acqua, soluzione salina, utensili e strumenti medici. Contaminazione da Pseudomonas è

stata anche riscontrata in cosmetici, prodotti farmaceutici e in preparazioni a base di estratti vegetali.

24Analisiper il

V annoCaratterizzazione di Pseudomonas: tecniche di

biologia molecolare


24-C

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178

Prima fase: Isolamento di ceppi di PseudomonasL’isolamento dei ceppi viene effettuato sul terreno selettivo e differenziale Pseudomonas

Agar Base (PAB) addizionato con CFC Pseudomonas

Supplement. In questo terreno vi sono idrolizzato di caseina e peptone di gelatina come fonti carboniose e sali come cloruro di magnesio e solfato di potassio che promuovono la formazione del pigmento piocianina

che porta alla colorazione verde-blu attorno alle colonie. Va ricordato che è

presente anche glicerolo che costituisce una fonte di energia importante anche per la produzione del pigmento. Grazie al supplemento CFC (cetramide, fucidina

e cefaloridina) viene inibita la crescita di microrganismi Gram

positivi e Gram

negativi,eccetto quelli del genere Pseudomonas.In seguito, sotto cappa microbiologica a flusso laminare orizzontale, si procede al

riconoscimento delle colonie di Pseudomonas

con l’ausilio di una lampada UV. Pseudomonas

infatti produce dei siderofori

che emettono una fluorescenza gialloverde, ben visibile esponendo le colonie ai raggi UV.

Seconda fase: Amplificazione della regione 16S dei ceppi isolati

mediante metodica PCR

La tecnica di PCR (Polymerase

Chain

Reaction), ideata da Mullis

nel 1985, viene utilizzata per ricostruire in vitro il fenomeno di replicazione del DNA, utilizzando i seguenti reagenti:•

Una coppia di primer

(forward

per l’estremità

5’

e reverse per l’estremità

3’);•

La Taq

polimerasi, ottenuta dal batterio termale Thermus

aquaticus, che catalizza la reazione di polimerizzazione delle molecole di DNA ex novo ed è

in grado di resistere alle elevate temperature di denaturazione del DNA (95°C);•

Nucleotidi (dNTPs

o deossiribonucleotidi

trifosfati);•

Ione Mg2+ per stabilizzare l’attività

della Taq

polimerasi;•

Un tampone di reazione per il mantenimento delle condizioni ottimali di pH e forza ionica di reazione.


24-C

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180

1.

QUADRO NORMATIVO

2.

METODI DI

ANALISI

3.

ANALISI MICROBIOLOGICHE

4.

METODI INTEGRATI DI

CONTROLLO DELLA QUALITÀ

Le acqueProcedimenti analitici

X ca

p. m

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biol

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tale

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cque X cap. microbiologia ambientale: le acque

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181

1.

QUADRO NORMATIVO

Il settore delle acque, di per sé

complesso per le implicazioni che questa “risorsa”

comporta, è

oggetto di un continuo intervento normativo a livello comunitario diretto all’armonizzazione delle legislazioni dei paesi membri per un corretto e razionale uso ai fini produttivi, irrigui, industriali e civili.

Si riportano a mero titolo informativo alcune tra le più

significative disposizioni nor-

mative in vigore.

Acque destinate al consumo umano

Le caratteristiche qualitative delle acque destinate al consumo umano (vale a dire i limiti massimi di concentrazione dei diversi composti) sono stabilite da una direttiva dell’Unione Europea che i Paesi membri sono tenuti a recepire nel proprio ordina-

mento normativo. Pertanto lo standard di qualità

che deve rispettare un’acqua destinata al consumo umano è

lo stesso a Roma come a Parigi, a Madrid come a Berlino.La norma con la quale l’Italia ha recepito la direttiva UE sulle acque potabili è

il De-

creto Legislativo 2 febbraio 2001, n°31, pubblicato sul Supplemento Ordinario alla Gazzetta Ufficiale n. 52 del 3 marzo 2001, intitolato “Attuazione della direttiva

98/83/CE relativa alla qualità

delle acque destinate al consumo umano”. Questo decreto che sostituisce il precedente D.P.R. 236 del 24 maggio 1988, con

cui l’Italia aveva recepito una altrettanto precedente direttiva CEE, stabilisce i requisiti di qualità

delle acque destinate al consumo umano, definisce responsabilità

e compe-

tenze dei soggetti fornitori di tali acque e degli organi di controllo, e disciplina i vari aspetti dell’attività

di vigilanza, quali controlli, deroghe, provvedimenti e sanzioni.

Per “acqua destinata al consumo umano”

si intende, come definito nel D.Lgs.

31/2001 e successive modificazioni:1)

le acque trattate o non trattate, destinate ad uso potabile, per la preparazione di cibi e bevande, o per altri usi domestici, a prescindere dalla loro origine, siano esse fornite tramite una rete di distribuzione, mediante cisterne, in bottiglie o in contenitori;2)

le acque utilizzate in un’impresa alimentare per la fabbricazione, il trattamento, la conservazione o l’immissione sul mercato di prodotti o di sostanze destinate al consu-

mo umano, escluse quelle, individuate ai sensi dell’articolo 11, comma 1, lettera e), la cui qualità

non può avere conseguenze sulla salubrità

del prodotto alimentare finale.

Nel decreto i parametri in base ai quali viene definita la qualità

delle acque sono distinti in due categorie: una che contiene composti per i quali

un eventuale

superamento del valore limite di concentrazione comporta in ogni

caso un giudizio di

X cap. microbiologia am

bientale le acque1-Q

uadro normativo

X cap. microbiologia ambientale: le acque

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185

2.

METODI DI

ANALISI

Tutte le determinazioni da eseguire nell’analisi microbiologica delle acque sono legate a un metodo; in alcuni casi, i metodi sono specificati in norme tecniche di applicazione della legislazione nazionale, o è

la stessa normativa che indica l’ente che deve fornirli, in quei casi si considerano metodi ufficiali nazionali. Metodi standardizzati sono anche disponibili presso diverse organizzazioni internazionali quali: ISO (International Stan- dards Organization), CEN (Comité Européen de Normalisation), IDF (International Dairy Federation), AOAC (Association of Official Analytical Chemists) o presso

sin-

goli enti di standardizzazione nazionali.Negli ultimi anni, c’è

stata la tendenza, da parte delle normative internazionali ed europee in particolare, all’unificazione delle procedure analitiche per ogni diversa tipologia di acqua. L’obbligo è

quello di utilizzare metodi uguali o almeno equivalenti a quelli proposti, per ottenere risultati confrontabili e determinare, in maniera uniforme la qualità

delle acque.È

noto che non tutti i metodi microbiologici sono idonei all’analisi di tutti i tipi di matrici ambientali.

La stessa analisi di acque con caratteristiche di qualità

diverse (acque superficiali dolci e marine, acque sotterranee, acque reflue e ad uso irriguo, acque sottoposte a trattamenti di potabilizzazione e acque disinfettate) comporta l’uso di metodi diversi che tengano conto delle marcate differenze di natura chimica, chimico-fisica e biolo-

gica.In generale, due procedure analitiche che differiscono per singoli dettagli dovrebbero

essere considerate come metodi differenti. Tuttavia, in microbiologia, differenze, per esempio, nelle diluizioni usate non sono solitamente considerate

motivi sufficienti per definire che si tratta di metodi differenti. Invece, differenze nella formulazione del terreno di coltura, nel principio del metodo e le differenze nei

tempi/temperature di incubazione vanno sicuramente a definire metodi di analisi diversi.

Non esiste, comunque, nessun criterio obiettivo che permetta di stabilire quale

metodo dia risultati migliori, in quanto il risultato dipende anche dagli scopi

dell’analisi.

METODI TRADIZIONALI

-

Tecnica del numero più

probabile (MPN) -

Il metodo dei tubi multipli fornisce una stima statistica della densità

batterica del campione analizzato.

Si basa infatti sulla combinazione dei tubi positivi e negativi ottenuti inoculando aliquote del campione in terreno colturale liquido.

X cap. microbiologia ambientale: le acque X cap. microbiologia am

bientale le acque2-M

etodi di analisi

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191

3.


Modalità

di campionamento

La fase pre-analitica

(raccolta del campione, trasporto e sua conservazione), rappre-

senta un punto di criticità

dell’intero procedimento analitico, in quanto può incidere in misura non trascurabile sull’incertezza totale del risultato dell’analisi; diventa quindi strumento indispensabile per ottenere risultati analitici attendibili e affidabili.

Infatti, i risultati di una indagine microbiologica, devono permettere di stabilire le caratteristiche della matrice analizzata nelle condizioni in cui

essa si trova nel momen-

to in cui viene effettuato il prelievo.La matrice acqua costituisce un elemento di relativa facile manipolazione a livello

analitico, ma le sue caratteristiche chimico-fisiche-microbiologiche, specifiche per ogni tipologia, possono costituire fonte di instabilità

quali-quantitativa

dei suoi costitu-

enti.Per individuare le caratteristiche di qualità

di un’acqua e per seguire le sue variazioni temporali è

innanzitutto necessario che i campioni da analizzare siano il più

possibile rappresentativi delle reali condizioni qualitative e quantitative esistenti nella matrice. Campioni rappresentativi possono essere ricavati solo sulla base

di piani di campio-

namento

che prevedano: obiettivi del prelievo, individuazione delle stazioni di pre-

lievo, tempi e frequenze con cui debbono essere raccolti i campioni, come anche lemodalità

di manipolazione e conservazione dei campioni, gli eventuali parametri da determinare in situ e i criteri di valutazione e gestione dei dati.

Prelievo dei campioniIl campionamento si svolge secondo una se-

rie di procedure che permettono di raccogli-

ere un’aliquota ridotta dell’acqua da sot-

toporre ad analisi. L’esecuzione dell’esame microbiologico

delle acque destinate al consumo umano prevede che il prelievo dell’acqua da esami-

nare venga effettuato mediante un “campio-

namento istantaneo”

che consiste nella rac-

colta di un unico campione in un’unica so-

luzione, in punti rappresentativi e in un

tempo breve.

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bientale le acque3-Analisi m

icrobiologicheX cap. microbiologia ambientale: le acque

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Al momento del campionamento è

necessario considerare con attenzione i volumi di acqua da prelevare. Essi vanno definiti in funzione dei parametri da determinare e comunque devono essere superiori al minimo necessario per procedere allo svol-

gimento degli esami richiesti.Il prelievo dei campioni microbiologici deve essere effettuato con recipienti sterili, a

perfetta tenuta, di materiale idoneo e utilizzati solo a questo scopo. In genere, contenitori di capacità

di 500 ml sono sufficienti per l’analisi dei parametri indicatori.

Di utilità

sono le bottiglie di vetro borosilicato e di materiale plastico.

Le bottiglie monouso in materiale plastico, generalmente polietilene, già

sterili,

disponibili in commercio, hanno il vantaggio di essere leggere, resistenti alle variazioni ter-miche.

È

di fondamentale importanza che durante le procedure di campionamento sia evitata qualsiasi contaminazione e alterazione della qualità

del campione da esaminare.Le acque destinate al consumo umano sono spesso disinfettate e contengono quindi

tracce di cloro.Bottiglie/contenitori per i prelievi devono quindi contenere sodio tiosolfato in con-

centrazione idonea ad inibire l’azione del disinfettante. Ai valori di pH normalmente rilevabili delle acque potabili e con le concentrazioni di cloro

generalmente in uso è

sufficiente aggiungere una soluzione al 10% di sodio tiosolfato nella quantità

di 0,1 ml per ogni 100 ml di capacità

della bottiglia in grado di neutralizzare fino a 5 mg/l di cloro residuo libero e combinato.

In commercio sono comunque disponibili bottiglie sterili già

contenenti il sodio tio-

solfato in concentrazione idonea.


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3.


Determ

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a 22°

C e a 3

7°C

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Determinazione di Pseudomonas

AeruginosaDeterminazione di

Clostridium

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1 m

Conteggio

delle

colonie

a 22°C e a 37°C

Generalità

Il Conteggio delle colonie su agar è

un parametro che permette di rilevare un gruppo eterogeneo di microrganismi aerobi che hanno differenti capacità

metaboliche e richie-

ste nutrizionali. L’uso di temperature diverse permette di mettere in evidenza micror-

ganismi mesofili

(a 37 °C) e psicrofili (a 22 °C). Molti di essi possono appartenere alla microflora ambientale autoctona delle acque,

presente indipendentemente da qualsiasi contaminazione.Nella Direttiva Europea 98/83/CE sulle acque destinate al consumo umano e nel

conseguente DL.vo

n. 31 del 2001, il parametro è

riportato nella Parte A e nella Parte C (parametri indicatori) dell’Allegato I.

Se per le acque imbottigliate (Parte A) sono stabiliti valori

di parametro (Conteggio a 22 °C: 100/ml; Conteggio a 37 °C: 20/ml), alla concentrazione degli eterotrofi rileva-

bili nelle acque in distribuzione (Parte C) non è

stato assegnato alcun valore limite. La normativa stabilisce infatti che i valori del conteggio delle colonie a 22 °C nelle acque in rete debbano presentarsi “senza variazioni anomale”, accettando quindi la possibilità

che ogni tipo di acqua abbia comunque intrinseche caratteristiche di qualità

e una flora microbica naturale. Tuttavia, il superamento delle concentrazioni “storicamente”

rile-

vate nell’acqua in distribuzione può segnalare la potenziale esistenza di condizioni di ricrescita batterica in rete e modifiche della qualità

dell’acqua. Il parametro va consi-

derato indicatore di qualità

e di efficienza di trattamento.Variazioni di concentrazione sono tollerate fermo restando quanto stabilito nell’art.

14 del decreto e possono, in questo caso, essere segnalate come “inosservanza”

del valore di parametro (APAT-IRSA-CNR Man 29/2003).

Principio

La procedura si basa sul fatto che ogni microrganismo vitale presente nel campione in esame, posto in un adatto substrato di crescita agarizzato e alla temperatura ottimale di sviluppo (22°C per i generi tellurici e 37°C per i generi di derivazione animale), dopo il periodo di incubazione (48 h e 24 h) dà

origine a formazione di colonie visibili ad occhio nudo.

Le colonie microbiche vengono valutate su terreno agarizzato Yeast

Extract

Agar (YEA) che contiene digerito pancreatico di caseina come sorgente di azoto, estratto di lievito

come sostanza di arricchimento, utilizzando la tecnica di inclusione in agar.


25-C

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C e

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Analisi

25 Conteggio delle colonie a 22°C e a 37°C

Rischi e precauzioni:

A. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.B.

Usare dispositivi di sicurezza (guanti, cappa) durante le fasi di: preparazione dei terreni di coltura, campionamento, analisi.C.Il terreno di coltura non contiene composti classificati come pericolosi ai sensi della legislazione vigente. Come per tutti i terreni in polvere la manipolazione deve essere

effettuata con una adeguata protezione delle vie aeree.D.Prima dell’eliminazione, sterilizzare tutti i materiali potenzialmente pericolosi.

Materiale occorrente• Capsule Petri• Carta assorbente• Flaconi in vetro con tappo per preparazione terreni• Pipette sterili da 1 ml e 10 ml• Spruzzetta• Vetreria di uso comune___________________________________________________________Terreni di coltura•Yeast

Extract

Agar (YEA)___________________________________________________________Strumentazione

Campione• Agitatore tipo vortex

Acqua • Autoclave• Bagnomaria• Cappa a flusso laminare• Piastra scaldante• Termostato


25-C

onteggio delle colonie a 22°C e a 37°C

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1 m

Determinazione

dei

Batteri

Coliformi

a 37°CUNI EN ISO 9308-1:2002(Metodo

della

filtrazione

su

membrana)


A. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.B. Usare dispositivi di sicurezza (guanti, cappa aspirante, mascherina) durante le fasi di:

preparazione dei terreni di coltura, campionamento, analisi, smaltimento.A. Prima dell’eliminazione, sterilizzare tutti i materiali potenzialmente pericolosi.

Materiale occorrente• Capsule Petri di diametro 47 mm• Carta assorbente• Flaconi in vetro con tappo per preparazione terreni• Membrane sterili per filtrazione• Pinzetta• Sistema filtrante • Spruzzetta• Vetreria di uso comune___________________________________________________________Terreni di coltura• TTC Tergitol

Agar• Tryptic

Soy

Agar (TSA)• Tryptophan

Broth

(TB)___________________________________________________________Strumentazione

Campione• Autoclave

Acqua • Bagnomaria• Bunsen• Cappa a flusso laminare• Piastra scaldante• Pompa aspirante• Termostato

Analisi

26


25-D

eter

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azio

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37

°C

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207

1 m

Ricerca

dei

Coliformi

Metodi rapidi

La ricerca dei Coliformi può essere effettuata anche mediante l’uso di metodi più

rapidi di indagine, che impiegano biosensori evidenziabili colorimetricamente

nel visi-

bile e nell’ultravioletto.In ambito microbiologico, tali biosensori possono essere prodotti con quattro gruppi di cromofluorocomposti:

i coloranti fluorogenici (come l’arancio di acridina) che si intercala nel DNA;gli indicatori fluorescenti (come i composti della idrossicumarina) che mettono in

evidenza le variazioni di pH;gli indicatori di Eh (potenziale redox) come il blu di metilene, il carminio indaco, i

cui composti ridotti sono tutti colorati;i composti cromogenici (fluorogenici e fluorocromogenici), utilizzati per produrre

molecole coniugate per lo studio di specifici enzimi. Appartengono a questo gruppo ni-trofenoli, nitroaniline, cumarine (il più noto è il metilumbelliferone o MU).

I cromogeni

sono molecole sintetiche composte da un cromoforo (molecola colorata) legato ad uno specifico metabolita (ad esempio lattosio) con formazione di un’unica molecola incolore. Il microrganismo assume quindi con il lattosio anche il cromogeno.All’interno della cellula batterica l’enzima target rompe il legame e le due molecole si separano. Tanto determina che: - il cromoforo diventa colorato;- il cromoforo insolubile non si diffonde nell’agar circostante;- il cromoforo si accumula all’interno delle cellule batteriche che formano la colonia.La presenza di attività

enzimatica nelle cellule batteriche è

così

segnalata in modo chiaro e inequivocabile. Per la ricerca di E. coli sono disponibili fluorocromi

coniugati con metaboliti per evi-

denziare una β-D-glucuronidasi

(β-D-GUD), enzima che catalizza l’idrolisi dei β-D-

acidi

glucopiranossiduronici

nei corrispondenti agliconi e acido D-glucoronico.L’enzima è

tipico del 97% dei ceppi di E. coli. Il MUG (4-metil-umbelliferil-β-D-

glucoronide) è

il fluoroconiugato

più

utilizzato per evidenziare la β-D-GUD nella colimetria. In sua presenza la β-D-GUD, rilascia dal fluoro composto MU che è

fluo-

rescente a luce UV (lampada di Wood da 254-366 nm).

La determinazione con il metodo MPN è

proposta da pag. 126 a pag. 129


26-D

eterminazione dei Batteri C

oliformi a

37°C

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IZZO IN

CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

211

1 m

Determinazione

degli

Enterococchi(Metodo

della

filtrazione

su

membrana)


A. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.B.

Il terreno Slanetz

e Bartley

è

classificato come Xn-Nocivo. La scheda di sicurezza informa che l’azide sodica presente nel terreno può avere effetti irritanti per gli occhi e per la pelle. Durante la manipolazione è

necessario adottare particolari precauzioni: protezione respira-

toria (mascherina antipolvere o uso di cappa aspirante), protezione delle mani (guanti), prote-

zione della pelle (indumenti protettivi). C. Prima dell’eliminazione, sterilizzare tutti i materiali potenzialmente pericolosi.

Materiale occorrente• Capsule Petri di diametro 47 mm• Carta assorbente• Flaconi in vetro con tappo per preparazione terreni• Membrane sterili per filtrazione• Pinzetta• Sistema filtrante • Spruzzetta• Vetreria di uso comune___________________________________________________________Terreni di coltura• Slanetz

e Bartley• Esculina

bile azide Agar• Agar soia triptone___________________________________________________________Strumentazione


Acqua • Bunsen• Cappa a flusso laminare• Piastra scaldante• Pompa aspirante• Termostato

Analisi

27


27-D

eterminazione degli Enterococchi su

mem

brana

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CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

214

1 m

Determinazione

di

Clostridium perfringens(Metodo

della

filtrazione

su

membrana)


A. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.B. Operare con metodi approvati di asepsi e di sicurezza nei confronti degli agenti patogeni.C.Prima dell’eliminazione, sterilizzare tutti i materiali potenzialmente pericolosi.

Materiale occorrente• Capsule Petri di diametro 47 mm• Carta assorbente• Flaconi in vetro con tappo per preparazione terreni• Membrane sterili per filtrazione• Pinzetta• Sistema filtrante • Spruzzetta• Vetreria di uso comune___________________________________________________________Terreni di coltura e Reagenti• m-CP

Agar• Soluzione di idrossido di ammonio___________________________________________________________Strumentazione


Acqua • Bunsen• Cappa a flusso laminare• Piastra scaldante• Pompa aspirante• Termostato

Analisi

28


28-D

eterminazione di C

lostridiumperfringens

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ENTE ADOTTATO.

217

m-CP AgarDopo esposizione a vapori di idrossido di ammonio le colonie di Cl. Perfringens

diventano rosa o rosse.

Fase di confermaEsposizione del terreno per (20÷30) secondi a vapori di idrossido di ammonio.


28-D

eterminazione di C

lostridiumperfringens

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NE SE IL TESTO N

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ENTE ADOTTATO.

221

1 m

Analisi

29 Determinazione

di

Pseudomonas aeruginosa(Metodo

della

filtrazione

su

membrana)


A. Manipolare

con attenzione

la vetreria, che

se si

rompe

diventa

tagliente.B. Operare con metodi approvati di asepsi e di sicurezza nei confronti degli agenti patogeni.C.

Alcuni componenti dei terreni e reagenti utilizzati risultano tossici. Il loro utilizzo richiede da parte degli operatori, particolari precauzioni durante la manipolazione e lo smaltimento.D. Prima dell’eliminazione, sterilizzare

tutti

i materiali

potenzialmente

pericolosi.

Materiale

occorrente• Capsule Petri di

diametro

47 mm• Carta

assorbente• Flaconi

in vetro

con tappo

per preparazione

terreni• Membrane sterili

per filtrazione• Pinzetta• Sistema

filtrante• Spruzzetta• Vetreria

di

uso

comune___________________________________________________________Terreni

di

coltura

e Reagenti• CHROM Agar Pseudomonas• Pseudomonas agar/CN• Terreno

B completo

di

King• Brodo

all’acetamide• Agar nutritivo• Reattivo

di

Nessler___________________________________________________________Strumentazione


Acqua• Bunsen• Cappa

a flusso

laminare• Lampada

di

Wood• Piastra

scaldante• Pompa

aspirante• Termostato

X cap. microbiologia ambientale: le acque 29-D

eterminazione di Pseudom

onasaeruginosa

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ENTE ADOTTATO.

224

4.

METODI INTEGRATI DI

CONTROLLO DELLA QUALITÀ

Uso di Indicatori biologici

Sebbene le tecniche di rilevamento tradizionali, di tipo chimico, fisico e microbiologico, siano fondamentali per una corretta analisi delle alterazioni dell'ambiente, è

ormai opinio-

ne diffusa che queste, da sole, non siano in grado di risolvere il problema del controllo ambientale.Proprio per questo, si va diffondendo sempre più

un nuovo approccio in questo campo di indagine fondato su parametri di tipo biologico.

Il rilevamento delle alterazioni ambientali mediante parametri biologici prende il nome di biomonitoraggio

e si basa essenzialmente sullo studio e l'interpretazione degli

effetti prodotti dai cambiamenti ambientali sugli organismi e sulle loro

comunità.Come ben si sa, ogni organismo vivente ha il suo habitat, nel quale si svolge la sua attivi-

tà

biologica. Con l’inquinamento idrico vengono introdotte nelle acque sostanze estranee (fertilizzanti, pesticidi, detersivi, ecc.)

capaci di alterare gli habitat naturali e formarne dei nuovi in cui si svilupperanno nuove comunità

viventi capaci di adattarsi alle mutate con-

dizioni ambientali.A progressive forme di degrado corrisponderanno alterazioni più

accentuate di habitat e sviluppo di comunità

(aumento di individui delle specie più

tolleranti che possono così

diventare predominanti a discapito delle specie più

sensibili) che possono essere assunte come indicatrici delle alterazioni sviluppatesi. Quindi riconoscendo gli organismi che popolano un ecosistema acquatico è

possibile stabilire il grado e il livello di qualità

delle acque. Occorre, però, mettere in evidenza che un ecosistema non è

mai uguale ad un altro (acque stagnanti, acque salmastre, acque con forti correnti, rappresentano habitat diversi), di conseguenza, non sempre gli indicatori biologici utilizzati in un caso sono validi in tutti i casi. Per valutare la qualità

delle acque, molto utilizzate sono le comunità

di mone-

re

protisti

e macroinvertebrati. In tali popolazioni, costituite da varie specie di batteri, alghe azzurre, protozoi, insetti, crostacei

molluschi, nematodi, platelminti, anellidi

si è

evidenziata un'ampia gamma di risposte alla presenza di contaminanti o di alterazioni fisiche nell'ambiente di vita.

Asellus

acquaticus: È molto resistente alle fluttuazioni di temperatura.

Chaetonotus Cyclops


X ca

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NE SE IL TESTO N

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ENTE ADOTTATO.

232

Qualità

dell’aria

È

definita oggettivamente confrontando le concentrazioni misurate

di alcuni inquinanti in atmosfera con valori di concentrazione riferiti a un particolare intervallo temporale.

La normativa nazionale presenta cinque tipologie di valori:i valori limite, che indicano le concentrazioni al di sopra delle quali la salvaguardia

della salute della popolazione può risultare compromessa;i valori guida, che sono il riferimento di lungo termine per la protezione della salute

e degli ecosistemi e possono riguardare zone cui si voglia imporre un regime partico-lare;

i livelli di attenzione e livelli di allarme, che si utilizzano nelle aree urbane e riguardano l’esposizione della popolazione;

gli obiettivi di qualità, che sono rivolti alla protezione a lungo termine della salute nelle aree urbane.Per valutare la qualità

dell’aria di un qualsiasi tipo di ambiente è

necessario:

stabilire quale sia la concentrazione della flora microbica normale di fondo;

definire la tecnica di campionamento più adatta per ottenere valori quantitativi più vicini alle condizioni reali.

Il campionamento dell’aria per determinare il suo contenuto microbico, richiede l’uso di speciali dispositivi chiamati impinger a solido e impinger a liquido.

Negli impinger a solido, i microrganismi vengono fatti urtare violentemente (impinger o impingement devise con cui si indicano questi apparecchi) contro la superficie solida di un terreno agarizzato o di un disco filtrante su cui si raccolgono.La successiva incubazione del campione fa sì

che si sviluppino colonie dove i microrganismi sono stati captati.

Negli impinger a liquido, il campione d’aria, sotto forma di uno spray sottile, è

fatto passare attraverso un brodo si coltura o un altro liquido in cui

gli organismi vengono captati.Aliquote del liquido vengono quindi distribuite su terreni specifici per determinare il contenuto microbico. Sono particolarmente utili per il campionamento di particelle vitali e germinabili

e per il recupero di sostanze solubili

(micotossine, endotossine, antigeni) e per il campionamento di batteri e virus.

XI cap. microbiologia ambientale: l'aria

XI c

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ENTE ADOTTATO.

233

SISTEMI DI

CAMPIONAMENTO

Il campionamento dell’aria da sottoporre ad accertamenti microbiologici presenta una serie di problemi legati:

1 m

a)

al prelievo di volumi statisticamente significativi;b)

a fattori di “stress”

per le cellule in essa presenti;c)

a fattori di variabilità

ambientale (densità, dimensioni del pulviscolo atmo-

sferico, condizioni di temperatura e umidità);d)

riproducibilità

dei dati analitici, ecc.

L’obiettivo primario del campionamento dell’aria è

l’identificazione della sorgente

da cui originano i microrganismi contaminanti, in modo tale da mettere in atto le necessarie misure correttive.Il campionamento delle particelle di origine biologica aerodisperse, costituisce un pro-

blema particolarmente complesso a causa della considerevole ampiezza del loro intervallo dimensionale

e della loro enorme eterogeneità

qualitativa.Per quanto attiene la valutazione del rischio legato all’esposizione a “bioaerosol

conta-

minanti”, sarebbe necessario avere come riferimento specifici protocolli

che stabilis-

sero quale tipo di campionamento sia più

idoneo per ciascun genere di microrganismo da ricercare e come dovrebbero essere interpretati i risultati.I sistemi di campionamento disponibili possono essere suddivisi in tre principali cate-

gorie:

•

CAMPIONATORI GRAVITAZIONALI

•

IMPATTORI INERZIALI

•

SISTEMI DI

FILTRAZIONE

CAMPIONATORI GRAVITAZIONALI

Il sistema gravitazionale si basa sia sull’effetto di caduta per gravità

del particolato aerodisperso, sia su effetti inerziali.Le particelle aeree vengono in tal caso lasciate depositare su determinate superfici di raccolta. Poiché

l’aria per sua natura non è

mai ferma, la gravità

in realtà

ha un ruolo poco significativo in questo tipo di campionamento.In effetti, questo sistema può essere considerato come campionatore inerziale con una componente gravitazionale che varia in maniera inversamente proporzionale con la velocità

dell’aria e la sua turbolenza. Questo tipo di campionamento ha il vantaggio di poter eseguire prelievi in più

punti contemporaneamente.


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237

CAMPIONAMENTO DELL’ARIA

Fasi del campionamento dell'aria con impattatore monostatico SAS


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249

Analisi

30 Protocollo

per il

controllo

microbiologico

dell’aria

Determinazione

Fungina

Rischi e precauzioni.A. Manipolare con attenzione la vetreria che, se si rompe, diventa

tagliente.B.

Usare dispositivi di sicurezza (guanti, cappa) durante le fasi di: preparazione dei terreni di coltura, campionamento, analisi.

ObiettivoTenere sotto controllo, al fine di ridurre i rischi di infezioni

causate da microrganismi presenti nell’aria, la qualità

microbiologica dei locali ad alta densità

di popolazione, con un piano di campionamento ragionato.

Materiale

occorrente• Piastra

Petri• Carta


in vetro

con tappo

per preparazione

terreni• Piastre

contact-plate• Pipette Pasteur monouso• Spruzzetta___________________________________________________________Terreni

di

coltura•Agar Rosa Bengala

antibiotato

con cloramfenicolo•Chloramphenicol

Glucose Yeast Extract Agar• Sabouraud

Dextrose Agar modificato___________________________________________________________Strumentazione


Aria indoor• Campionatore

d’aria

SAS• Cappa

a flusso

laminare• Piastra

scaldante• Termostato


Fasi operative con il sistema SAS1.

Riempire le piastre contact-plate

con ciascuno dei terreni di coltura preparati e opportunamente sterilizzati, in riferimento al tipo di ricerca da effettuare.

2.

Lasciare solidificare il terreno sotto cappa per circa 15 minuti.3.

Accertarsi che la superficie del terreno sia perfettamente asciutta (lasciare le piastre a 37°C per 4-5 ore).

4.

Sterilizzare la testata del SAS in autoclave in contenitore ermetico per 15’

a 121°C.

30-Protocollo per il controllo m

icrobiologico dell’aria D

eterminazione Fungina

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256

1 m

Analisi

31 Ricerca

nell’aria

e nel

bioaerosol

di

Legionella.

Rischi e precauzioni.A. Manipolare con attenzione la vetreria che, se si rompe, diventa

tagliente.B.

Usare dispositivi di sicurezza (guanti, cappa) durante le fasi di: preparazione dei terreni di coltura, campionamento, analisi.

Materiale occorrente• Piastre Petri• Carta assorbente• Flaconi in vetro con tappo per preparazione terreni• Piastre contact-plate• Pipette Pasteur monouso• Spruzzetta• Vetreria di uso comune___________________________________________________________Terreni di coltura•Agar Estratto di Lievito tamponato con carbone e addizionato con

L-

Cisteina (BCYE)• TSA Agar sangue___________________________________________________________Strumentazione


Aria indoor• Bagnomaria• Campionatore d’aria SAS• Cappa a flusso laminare• Giara per anaerobiosi• Piastra scaldante• Termostato

PrincipioLe particelle che trasportano i microrganismi sono aspirate tramite un campionatore tipo SAS, attraverso una apposita testata. Per effetto dell’aumento della velocità

im-

pattano e rimangono “intrappolate”

sulla superficie di un terreno nutritivo agarizzato.La piastra a contatto con il terreno nutritivo viene poi trasferita in incubatore a temperatura opportuna per dar modo ai microrganismi di moltiplicarsi producendo le UFC di Legionella.


31-R

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260

buonaaccettabile

scadente

pessima


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261

IL POETA DICE . . .

…il

lichene prospera dalla regione delle nubi agli spruzzati dal mare. Scala le vette

dove nessun altro vegetale attecchisce. Non lo scoraggia il deserto, non lo sfratta il

ghiacciaio, non i tropici o il circolo polare. Sfida il buio delle caverne e si arricchisce

nel cratere del vulcano. Teme solo la vicinanza dell’uomo…

Camillo Sbarbaro


INTRODUZIONEI licheni si sono adattati a condizioni ambientali estremamente dure, ma questo non significa che siano insensibili a tutto, al contrario, essi sono

sensibili a determinate variazioni delle loro condizioni di vita, come ad esempio la diminuzione dell'umidità

atmosferica necessaria alla vita del lichene.Ancora più

devastante per il loro organismo è

l'effetto dell'inquinamento atmosferico, in particolare da anidride solforosa (SO2), alla quale quasi tutti i licheni sono sensibili.

I LICHENI

I licheni sono organismi simbionti

costituiti da funghi e alghe o cianobatteri.

Da questa unione ambedue gli organismi traggono elevati benefici per la loro sopravvivenza, riuscendo ad adattarsi in maniera ottimale all'ambiente.

Infatti, mentre il fungo (micobionte) eterotrofo

provvede alla protezione

dell'alga dalla luce intensa e dall'essiccamento, fornendole un supporto su cui vivere, l'alga (fotoobionte) autotrofa,

operando la

fotosintesi clorofilliana, produce composti organici

che sono fonte di nutrimento per sé

stessa e per il fungo.

Tra i generi più sfruttati per le indagini sullo stato dell’inquinamento dell’aria bisogna ricordare i generi Parmelia,

di tipo foglioso, e la specie Xanthoria

parietina

dal tallo giallo arancio.

Il corpo del lichene consiste:-

in un tallo fungino, che è

formato dall’intreccio di strutture allungate chiamate ife-

da cellule algali

raccolte in uno strato oppure disperse a seconda della specie lichenica

considerata.La classe di funghi che si ritrova generalmente è

quella degli Ascomiceti, mentre i tipi di alghe sono quelle verdi e quelle azzurre (cianobatteri).

Cortex

Strato superiore fungino

Strato algale

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274

CALCOLO DELL’

I.A.P. (Indice

di

Purezza

Atmosferica)

Il grado di qualità

dell'aria è

determinato dal valore di I.A.P.

che si ricava dalla frequenza delle specie licheniche

riscontrate in un apposito reticolo di rilevamento. Questo strumento è

costituito da una griglia di 10 rettangoli (di dimensione 10x15

cm ciascuno) delle dimensioni totali di 30x50 cm (0,15 m2

di superficie).

Tale griglia viene posta sul tronco ad una altezza compresa tra i 120 ed i 200 cm, nella zona di massima densità

lichenica.

Vengono annotate le singole specie licheniche

e la loro frequenza intesa come numero di rettangoli in cui ogni specie è

presente (max. 10 per specie).

Si calcola la somma delle frequenze di tutte le specie presenti entro la griglia ottenendo la frequenza (fi

) del rilievo. L'indice I.A.P.

relativo ad una stazione è

dato dalla media delle frequenze degli n rilievi effettuati nella stessa stazione.

Valori elevati indicano una buona qualità

dell'aria, mentre valori bassi segnalano

situazioni di degrado ambientale.

Classi

di

qualitàGiudizio

di

qualità

dell'ariaColore Valori

di

I.P.A.

1 Molto scadente Rosso 0 - 5 2 Scadente Arancione 5 - 10 3 Bassa Giallo 10 - 15 4 Mediocre Verde scuro 15 - 20 5 Media Verde chiaro 20 - 25

6 Discreta Azzurro 25 - 35 7 Buona Blu > 35


32-S

tazi

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275

1.

CAMPIONAMENTO, PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE

2.

VALUTAZIONE DELLE CARICHE MICROBICHE

3.

GRUPPI GENERICI DI

MICRORGANISMI

4.

GRUPPI FISIOLOGICI DI

MICRORGANISMI

Il suoloProcedimenti analitici

XII cap. microbiologia ambientale: il suolo XII cap. microbiologia am

bientale: il suolo

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ENTE ADOTTATO.

276

1.

CAMPIONAMENTO

Uno degli ostacoli principali che si incontrano nell’applicazione dei metodi di analisi microbiologiche del suolo riguarda le tecniche di campionamento,

manipolazione e conservazione del campione da analizzare.Poiché

il campione di terreno deve contenere tutte le informazioni sul

suolo d’origine, la sua rappresentatività

è

una condizione fondamentale, deve cioè

rispecchiare, quanto più

possibile, le proprietà

dell’area a cui si riferisce; ne consegue che il

campionamento è

una operazione estremamente delicata ed una sua esecuzione non corretta può essere fonte di errori assai più

consistenti di quelli imputabili alle determinazioni analitiche. Qualora non sia possibile effettuare l’analisi direttamente in campo, risulta necessario operare rispettando le condizioni più

vicine a quelle in cui il suolo si trova prima di venire campionato, tenendo presente che i microrganismi rinvenibili in tale habitat rispondono tempestivamente anche a piccole variazioni di temperatura ed umidità.Normalmente, per le analisi di tipo microbiologico, si consiglia

di utilizzare un campione di suolo fresco e poco manipolato, in cui la struttura e le proprietà

metaboliche delle comunità

microbiche presenti siano poco alterate. A tal fine il

materiale da sottoporre ad analisi dovrebbe pervenire in laboratorio in tempi brevi, rispetto al momento del prelievo. Spesso tale situazione non è

facile da realizzare per cui, affinchè

i metodi utilizzati risultino di diffusa applicabilità, è

importante disporre di metodi standard di prelievo, trattamento e conservazione dei campioni. Si tratta questo di un approccio fondamentale per l’applicazione dei metodi microbiologici nella definizione e nel controllo della qualità

dei suoli.

-

Metodologie

Una corretta procedura di campionamento deve assicurare che il campione da

sottoporre ad analisi sia quanto più

possibile “rappresentativo”

del sistema oggetto di studio.E’

da tenere presente che, raramente i suoli sono omogenei, anzi presentano

un’estrema variabilità

sia in superficie che in profondità

e talvolta ciò lo si riscontra in spazi ristretti; suoli apparentemente omogenei possono essere caratterizzati da una notevole variabilità

nella tessitura, nel tipo di struttura o nel contenuto di sostanza organica e dei diversi nutrienti.In presenza di una condizione di disomogeneità

è

preferibile analizzare singolarmente i diversi prelievi, evitando i “campioni medi”.Per ottenere un campione medio, effettivamente rappresentativo di un appezzamento di terreno, la procedura più

corretta prevede una scelta puramente casuale dei diversi punti di prelievo.

XII cap. microbiologia ambientale: il suolo

XII c

ap. m

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1-C

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File utili

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consu

ltazio

ne. VIE

TATO L'UTIL

IZZO IN

CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

284

2.

VALUTAZIONE CARICHE MICROBICHE

La carica microbica rappresenta il numero di microrganismi appartenenti ad un gruppo fisio-tassonomico

(lieviti, protozoi, batteri filamentosi e non) oppure ad uno specifico gruppo funzionale, presenti in una quantità

unitaria della matrice analizzata che, nel caso del suolo, è

normalmente pari ad un grammo di peso secco.Le vie che possono essere utilizzate per risalire a determinare tali cariche sono:

via diretta (microscopica),via indiretta (colturale).

Nel primo caso, le cellule microbiche presenti in un volume esattamente misurato di una sospensione in liquido del suolo, possono venire direttamente contate a seguito di un opportuno ingrandimento. Rapportando il numero riscontrato al

volume osservato ed alla diluizione effettuata si ottiene la carica.Il limite delle conte dirette applicate ad un sistema complesso,

quale il suolo, risiede nella difficoltà

di distinguere visivamente le cellule microbiche nella loro varietà

di forme da altre particelle, nonché

le cellule vive da quelle morte (che non contribui-

scono all’attività

biologica).


XII c

ap. m

icro

biol

ogia

am

bien

tale

: il s

uolo

2-Va

luta

zion

e ca

rich

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File utili

zzabile

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ltazio

ne. VIE

TATO L'UTIL

IZZO IN

CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

287

3.

GRUPPI GENERICI DI

MICRORGANISMI

Il suolo ospita un’enorme varietà

di specie microbiche (molte delle quali ancora sconosciute) che includono batteri, funghi, attinomiceti e microalghe. Il ruolo fondamentale svolto dalla componente microbica del suolo per il funzio-

namento degli ecosistemi terrestri è

garantito dalla sua diversificazione. La conoscenza dei fattori che influenzano la diversità

della microflora edafica è

quindi di grande importanza ai fini della realizzazione di adeguati modelli di gestione degli ecosistemi.I batteri

sono gli organismi più

numerosi del suolo, infatti un grammo di suolo può contenere fino a miliardi di batteri.I funghi

sono, dopo i batteri, gli organismi del suolo numericamente più

abbondanti e costituiscono spesso i microrganismi dominanti in termini di biomassa, infatti possonocostituire ben il 70-80 % del peso dell’intera biomassa microbica.Le alghe

del suolo formano un gruppo piuttosto eterogeneo di organismi eucariotici

unicellulari e pluricellulari, mobili ed immobili, che comprende

diverse centinaia di taxa

differenti e vivono soprattutto nello strato più

superficiale del suolo.


bientale: il suolo3-G

ruppi generici di microrganism

i

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IZZO IN

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NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

291

1 m

Tecniche

molecolariEstrazione acidi nucleiciÈ

il primo passo nelle applicazioni di biologia

molecolare. Diversi sono i metodi che si possono utilizzare. La scelta si effettua in base a:

tipo di acido nucleico (ssDNA, dsDNA, RNA totale, mRNA, etc.);

fonte (tessuti animali o vegetali, eucarioti, proca-rioti, virus);

materiale di partenza (organo intero, tessuto, coltura cellulare, sangue, etc.)

risultato desiderato (quantità, purezza, tempo ri-chiesto);

applicazione prevista post-estrazione (PCR, clo-ning, marcatura, restrizione enzimatica, southernblotting, RT-PCR, sintesi di cDNA, etc.

Differenti tipi di acido nucleico adsorbono più

o

meno bene alla matrice di silice, a seconda della forza ionica e del pH della soluzione. In ogni caso, l’acqua distillata o un tampone a bassa concentrazione salina (TE 10/1 mM) sono in grado di eluire l’acido nucleico dalle particelle di silice.

Con tre semplici step

-

adsorbimento sulla silice in presenza di GuSCn, lavaggi successivi con etanolo e con acetone, eluizione in TE o acqua, si può quindi ottenere DNA o RNA sufficiente e adeguato per le più

frequenti manipolazioni successive, comprese le reazioni enzimatiche.

Poiché

la silice non lega molte sostanze contami-

nanti presenti nelle preparazioni o nei campioni di partenza -

proteine, enzimi, fenolo, cloroformio, bromuro di etidio

-

la procedura di estrazione si

associa ad una purificazione.

Tracce di silice non inibiscono le eventuali reazioni enzimatiche a valle (es

PCR o RT-PCR).


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NE SE IL TESTO N

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ENTE ADOTTATO.

292

1 m

Elettroforesi

del DNAÈ il metodo standard utilizzato per separare, identificare e purificare frammenti di DNA.

Il sistema di costruzione di un gel di agarosio

è

costituito da tre parti: la piastra, il supporto e il pettine. Quest’ultimo serve a realizzare i pozzetti: si immerge nel gel “a denti in giù”, quando è

caldo e liquido e poi, quando l’agarosio

si sarà

solidificato, si estrae, lasciando gli spazi precedentemente

occupati dai denti.

L’agarosio

è

un polimero di

carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e

gelificato, forma una matrice, la cui porosità

dipende dalla concentrazione dell’agarosio.

Il gel viene quindi sistemato nella camera di elettroforesi e sommerso completamente con il

tampone di elettroforesi, in modo che l’intero gel sia soggetto a uguale corrente elettrica.

TAE

e TBE

sono i tamponi più

comunemente usati per l’elettroforesi. T sta per Tris, che consente il mantenimento di un valore costante di pH della

soluzione; E sta per EDTA, che chela i cationi bivalenti, come il magnesio. Questo è

importante, perché

la maggior parte delle nucleasi richiede

cationi bivalenti per funzionare. A o B sta per acido Borico o Acetico che forniscono l’appropriata forza ionica al tampone.

Per monitorare la migrazione del DNA nel gel, si aggiungono anche molecole cariche “coloranti”, di differenti colori e dimensioni ( uno è

il blu di

bromofenolo).


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ne. VIE

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IZZO IN

CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

293

1 m

Analisi

33

Pericoli

e precauzioni:

A. Manipolare

con attenzione

la vetreria

che, se si

rompe, diventa

tagliente.B. Pericolo nell’esecuzione dell’esperienza possono risultare le fonti di calore. C. Prima dell’eliminazione, sterilizzare

tutti

i materiali

potenzialmente

pericolosi.

Materiale

occorrente• Piastre

Petri di

diametro

47 mm• Carta


in vetro

con tappo

per preparazione

terreni• Micropipetta

da

1 ml con puntali• Pipetta

monouso

da

10 ml• Portaprovette• Provette

da

10 ml• Spruzzetta• Vetreria

di

uso

comune___________________________________________________________Terreni

di

coltura• Terreno

colturale

all’estratto

di

suolo___________________________________________________________Strumentazione


Suolo

fresco • Bilancia

analitica• Bunsen• Cappa

a flusso

laminare• Piastra

scaldante•Termostato

Determinazione

di

Batteri

aerobi

e anaerobi(Metodo

di

conteggio

in piastra)

XII cap. microbiologia ambientale: il suolo 33-D

eterminazione di Batteri aerobi e

anaerobi (Metodo di conteggio in piastra)

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ENTE ADOTTATO.

297

1 m

Analisi

34 Conteggio

Attinomiceti(Metodo

di

conteggio

in piastra)

Pericoli

e precauzioni:A. Manipolare

con attenzione

la vetreria

che, se si

rompe, diventa

tagliente.B. Pericolose nell’esecuzione dell’esperienza possono risultare le fonti di calore. C.

Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali protettivi, mascherina), in quanto nella composizione dei terreni ci sono sostanze irritanti. D. Prima dell’eliminazione, sterilizzare

tutti

i materiali

potenzialmente

pericolosi.

Materiale

occorrente• Piastre

Petri di

diametro

47 mm• Carta


in vetro

con tappo

per preparazione

terreni• Micropipetta

da

100 μl e 1 ml con puntali• Pipetta

monouso

da

10 ml• Portaprovette• Provette

da

10 ml• Spatole

sterili• Spruzzetta• Vetreria

di

uso

comune___________________________________________________________Terreni

di

coltura

di

isolamento

preferenziali• Terreno

Agar Amido

Caseina• Terreno

Agar Chitina___________________________________________________________Strumentazione


Suolo

fresco • Bilancia


a flusso

laminare• Piastra

scaldante• Stufa•Termostato


34-C

onteggio Attinomiceti

(Metodo di conteggio in piastra)

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ENTE ADOTTATO.

301

4.

GRUPPI FISIOLOGICI DI

MICRORGANISMI

La differenza, tra valutazione delle cariche microbiche dei gruppi generici e valuta-

zione dei gruppi specifici, sta nel fatto che nel primo caso si ottiene una stima

quantitativa della ricchezza totale della microflora presente in

un suolo, nel secondo caso si indaga circa la composizione di tale microflora.E’

tipico della microflora ambientale, quindi anche del suolo, considerare non tanto i gruppi tassonomici (per es. Pseudomonas, Clostridium) quanto gruppi di microrgani-

smi accomunati dalla capacità

di effettuare una determinata trasformazione chimi-

co/enzimatica, che rappresenta un passaggio dei “cicli degli elementi”

in natura.Questo perché

nella microbiologia ambientale un particolare microrganismo interessa soprattutto per l’apporto che può dare alle funzionalità

generali di un ecosistema.Tali gruppi vengono definiti “fisiologici”

o “funzionali”

e, nel caso del suolo, sono evidentemente in relazione con la fertilità

naturale del suolo stesso.


bientale: il suolo4-G

ruppi fisiologici di microrganism

i

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308

1 m

Analisi

35

Pericoli


con attenzione

la vetreria

che, se si

rompe, diventa


Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali protettivi, mascherina) in quanto il reattivo di Nessler

risulta tossico per inalazione e contatto con la pelle. D.

Mantenere le abituali precauzioni nella manipolazione dei prodotti chimici. In particolare leggere attentamente la scheda di sicurezza dei sali di cobalto e cadmio. Si consiglia di proteggersi adeguatamente e di osservare la regola della captazione totale delle polveri (i residui vanno raccolti e stoccati come rifiuti tossici).E. Prima dell’eliminazione, sterilizzare

tutti

i materiali

potenzialmente

pericolosi.

Materiale

occorrente• Carta


in vetro

con tappo

per preparazione

terreni• Pipette sterili

da

1 ml• Pipette monouso

da

10 ml• Portaprovette• Spruzzetta• Tubi

da

20 mm di

diametro

con tappi• Vetreria

di

uso

comune___________________________________________________________Soluzioni, terreno

di

coltura, reattivi• Soluzione

di

oligoelementi• Terreno

colturale

per ammonificanti• Reattivo

di

Nessler___________________________________________________________Strumentazione


Suolo

fresco • Bilancia


a flusso

laminare•Termostato

Ciclo

dell’azoto

Batteri

Ammonificanti

-

PrincipioIl principio si basa sulla semina di sospensioni-diluizioni di terra campione in un terreno salino liquido, addizionato di asparagina come unica fonte di carbonio e di azoto e sulla ricerca della comparsa di ammoniaca con il reattivo di Nessler.


35-C

iclo

del

l’azo

toBa

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Am

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ifica

nti

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1 m

Analisi

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Pericoli


con attenzione

la vetreria

che, se si

rompe, diventa

tagliente.B. Pericolose nell’esecuzione dell’esperienza possono risultare le fonti di calore. C.Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali protettivi, mascherina) in quanto la difenilammina

risulta tossica per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione.D. Mantenere le abituali precauzioni nella manipolazione dei prodotti chimici.E. Prima dell’eliminazione, sterilizzare

tutti

i materiali

potenzialmente

pericolosi.

Materiale

occorrente• Carta


in vetro

con tappo

per preparazione


da

1 ml• Provette

da

sierologia

con tappi• Spruzzetta• Vetreria

di

uso


di


di

Winogradsky• Terreno

colturale

per Nitrosanti• Reattivo

alla

difenilammina___________________________________________________________Strumentazione


Suolo

fresco • Bilancia


a flusso


Ciclo

dell’azoto

Batteri

Nitrosanti

-

PrincipioPer la ricerca dei Nitrosanti

l’azoto viene fornito sotto forma di solfato di ammonio. Dopo incubazione ogni prova viene diluita e addizionata del reattivo alla difenilam-

mina

solforica che rivelerà

la presenza nel terreno di nitriti o nitrati.


36-C

iclo dell’azotoBatteri N

itrosanti

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1 m

Analisi

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Pericoli


con attenzione

la vetreria

che, se si

rompe, diventa


Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali protettivi, mascherina) in quanto la difenilammina

risulta tossica per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione.D.Mantenere le abituali precauzioni nella manipolazione dei prodotti chimici.E.Prima dell’eliminazione, sterilizzare

tutti

i materiali

potenzialmente

pericolosi.

Materiale

occorrente• Carta


in vetro

con tappo

per preparazione


da

1 ml• Provette

da

sierologia

con tappi• Spruzzetta• Vetreria

di

uso


di


di


colturale

per Nitrificanti• Reattivo

alla

difenilammina___________________________________________________________Strumentazione


Suolo

fresco • Bilancia


a flusso


Ciclo

dell’azoto

Batteri

Nitrificanti

-

PrincipioPer la ricerca dei Nitrificanti l’azoto viene fornito sotto forma di nitrito di sodio e si legge, dopo incubazione, la diluizione limite contenente dei nitrati con lo stesso reattivo alla difenilammina

solforica, ma dopo eliminazione dei nitriti.


37-C

iclo

del

l’azo

toBa

tteri

Nitr

ifica

nti

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317

1 m

Analisi

38

Pericoli


con attenzione

la vetreria

che, se si

rompe, diventa


Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali protettivi, mascherina) in quanto il reattivo di Bray

risulta nocivo per inalazione, contatto con la pelle, per ingestione e facilmente infiammabile.D. Mantenere le abituali precauzioni nella manipolazione dei prodotti chimici.E. Prima dell’eliminazione, sterilizzare

tutti

i materiali

potenzialmente

pericolosi.

Materiale

occorrente• Carta


in vetro

con tappo

per preparazione

terreni• Giara

per anaerobiosi• Pipette sterili

da

1 ml• Provette

per batteriologia

16x160 mm• Spruzzetta• Vetreria

di

uso


di


di


colturale

per Denitrificanti• Reattivo

di

Bray___________________________________________________________Strumentazione


Suolo

fresco • Bilancia


a flusso


Ciclo

dell’azoto

Batteri

Denitrificanti

-

PrincipioIl principio si basa sulla semina di sospensioni-diluizioni di terra in terreno liquido dove l’azoto è

fornito sotto forma di nitrato; si ricercherà

quindi la scomparsa di questi nitrati in funzione del tempo e delle diluizioni, con il reattivo della difenilammina. A questi batteri bisogna fornire sostanza organica in quanto sono eterotrofi.


38-C

iclo dell’azotoBatteri D

enitrificanti

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ENTE ADOTTATO.

320

CARATTERISTICHE DEGLI ALIMENTI

Gli alimenti per essere considerati tali, devono possedere alcune qualità

fondamentali, vale a dire devono essere:

INNOCUI - cioè non contenere sostanze tossiche o nocive;

COMMESTIBILI - cioè facilmente masticabili da crudi o da cotti;

GRADEVOLI - o per lo meno accettabili dal punto di vista organolettico;

DIGERIBILI E ASSIMILABILI.

Oggi, la produzione degli alimenti, si discosta sempre più

dalle possibilità

di riconoscimento del cibo che l’organismo umano ha appreso a distinguere

biologicamente nel corso di milioni di anni di evoluzione della specie.

La tecnologia delle industrie alimentari riesce a creare cibi perfetti, senza il minimo difetto: MA COSA C’E’

DENTRO?

GLI ALLARMI ALIMENTARI SONO SEMPRE PIU’

NUMEROSI

Verdura con pesticidi Pollo alla diossina Carne "pazza"

Il consumatore, che deve ingegnarsi a superare indenne il rito quotidiano della spesa, non sa più

di chi fidarsi.

Se i cibi avessero scritto in fronte buona o cattiva, sapremmo cosa scegliere e

mangiare.

Invece, non è

così

XIII

cap

. mic

robi

olog

ia d

egli

alim

enti

XIII cap. microbiologia degli alimenti

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ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

328

Esercitaz.

n° Titolo

39 Numerazione della flora aerobica a 32°C nei gelati40 Determinazione della carica microbica a 21°C nel latte pastorizzato41 Ricerca dei lieviti nello yogurt42 Numerazione di Streptococcus

thermophilus

nello yogurt43 Determinazione dei Coliformi totali e termoresistenti nel burro44 Determinazione dei Coliformi totali nel latte –

Metodo MPN 45 Numerazione di Escherichia

coli su terreno cromogenico46 Ricerca di E. coli in campione di mozzarella47 Numerazione di Stafilococchi coagulasi-positivi48 Ricerca di Salmonella nelle uova fresche49 Numerazione di Clostridium

Perfringens

in alimenti50 Numerazione di Bacillus

cereus51 Ricerca di Listeria monocytogenes52 Ricerca di Streptococchi fecali nell’acqua (metodo MF)53 Ricerca di Campylobacter

termotollerante54 Ricerca di Yersinia

enterocolitica

METODI DI ANALISI DEGLI ALIMENTI


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ENTE ADOTTATO.

329

Pericoli e precauzioni:A.

I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, auto-

clave).B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione dei

campioni.

Analisi39 Numerazione della flora aerobica a 32°C nei gelati

Materiale occorrente• Ansa • Beute• Carta assorbente• Piastre Petri sterili• Pipette da 1e 10 ml• Pipette Pasteur• Portaprovette• Provette da 10 ml con tappo a vite• Sacchetti Stomacher• Spatole________________________________________________________________Terreni di coltura e diluenti• Terreno al Gelisato• Acqua triptonata 1%0

________________________________________________________________Strumentazione


Gelato• Bilancia tecnica• Omogeneizzatore Stomacher• Piastra scaldante• Termostato

Principio:Semina in terreno al Gelisato

del campione omogeneizzato in Acqua Triptonata 1%0 e successivo conteggio dopo incubazione.


39-N

umerazione della flora aerobica a 32°C

nei gelati

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ENTE ADOTTATO.

331

Analisi40 Determinazione della carica microbica a 21°C nel latte

pastorizzato

Materiale

occorrente• Carta

assorbente• Piastre

Petri sterili• Pipette da

1 e 10 ml sterili• Portaprovette• Provette

da

10 ml con tappo

a vite________________________________________________________________Terreni

di

coltura

e diluenti• Milk agar • Soluzione

salina/peptone________________________________________________________________Strumentazione


Latte pastorizzato• Termostato• Vortex

Principio:Pre-incubazione

del campione a 6°C, semina di un volume prestabilito di esso in terreno di coltura specifico e conteggio delle colonie dopo incubazione a 21°C per 25 ore.



autoclave).B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione dei campioni.

PreparazioneSoluzione salina/peptone

- Peptone 1 g- Cloruro di sodio 8,5 g-

Acqua 1,0 lSciogliere gli ingredienti in 1 lt. di acqua distillata e riscal-

dare mescolando fino a completa soluzione. Aggiustare se necessario il pH con HCl o NaOH 0,1 moli/lt. Sterilizzare a 121°C per 15 minuti.


40-D

eterminazione della carica m

icrobica a 21°C

nel latte pastorizzato

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332

Metodica

1.

Mescolare per inversione (almeno 25 volte) il campione di latte,

prelevare con una pipetta sterile 1 ml del campione e trasferirlo in una provetta contenente 9 ml di diluente in modo da ottenere una prima diluizione di 1:10.

2.

Allestire a partire dalla diluizione 1:10 altre diluizioni decimali (1:100, 1:1.000, 1:10.000) sempre con lo stesso diluente.

FASE I –

Diluizione

del latte pastorizzato

3.

Prelevare con una pipetta sterile 1 ml di ciascuna delle diluizioni di riferimento e trasferirlo in una piastra Petri sterile (inoculare due piastre per ognuna delle diluizioni).

4.

Versare in ogni piastra inoculata 15-20 ml di terreno mantenuto fluido a 48°C.5.

Agitare le piastre con movimenti circolari orizzontali per mescolare bene il terreno con il campione e lasciare solidificare per almeno 10 minuti.

6.

Incubare le piastre capovolte a 21°C per 25 ore.

FASE II –

Semina

Contare le colonie nelle coppie di piastre (per ciascuna delle diluizioni) nelle quali si sono sviluppate un numero di colonie compreso tra 30 e 300.Calcolare la media dei due conteggi e moltiplicare per il reciproco della diluizione, fare la media dei risultati ottenuti dalle varie diluizioni.Il risultato è

espresso come UFC in 1 ml di campione.

Lettura

dei

risultati

Esempio

di

calcolo

Piastra 1(n°

colonie)Piastra 2

(n°

colonie)Media della diluizione 1:100

(250+270)/2= 260260 x 100

= 26.000 UFC/ml250 270

Media della diluizione 1:1000(32+34)/2= 33

33 x 1.000

= 33.000 UFC/ml32 34

Media dei risultati ottenuti:(26.000 + 33.000)/2 = 29.500 UFC per ml di campione


40-D

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TATO L'UTIL

IZZO IN

CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

333

Analisi41 Ricerca dei lieviti nello yogurt

Materiale occorrente• Anse• Beute• Carta assorbente• Piastre Petri sterili• Pipette da 1 e 10 ml sterili• Pipette Pasteur• Portaprovette• Provette da 10 ml con tappo a vite• Sacchetti Stomacher• Spatole________________________________________________________________Terreni di coltura, diluenti e materiali chimici• Sabouraud

CAF Broth• OGYE Agar (Oxitetracycline

Glucose

Yeast

extract)• Acqua peptonata

0,1%• Soluzione di violetto di genziana, fuxina

fenicata, Lugol

e alcol assoluto________________________________________________________________Strumentazione


Yogurt• Bilancia tecnica• Piastra scaldante• Termostato• Vortex

Principio:Semina del campione in brodo di arricchimento selettivo Sabouraud

CAF, successivo isolamento in OGYE Agar, conferma e/o identificazione mediante colorazione di

GRAM e studio microscopico della morfologia.



autoclave).B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.

Utilizzare le precauzioni di sicurezza (guanti, mascherina) nella manipolazione delle soluzioni per la colorazione di GRAM.

XIII cap. microbiologia degli alimenti 41-Ricerca dei Lieviti nello yogurt

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NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

335

Analisi42 Numerazione di Streptococcus

thermophilus

nello yogurt

Materiale occorrente• Anse• Beute• Carta assorbente• Piastre Petri sterili• Pipette da 1 e 10 ml sterili• Pipette Pasteur• Portaprovette• Tubi con tappo• Spatole ad “L”

sterili________________________________________________________________Terreni di coltura e diluenti• M 17 Agar• Acqua peptonata

0,1%• Soluzione di violetto di genziana, fuxina

fenicata, Lugol

e alcol assoluto________________________________________________________________Strumentazione

Campione• Autoclave Yogurt• Bagnotermostatico• Bilancia tecnica• Piastra scaldante• Termostato

Principio:Semina del campione diluito in Acqua peptonata

0,1% in terreno M17 Agar e suc-

cessiva conferma attraverso prove biochimiche e osservazioni morfologiche, previo isolamento delle colonie in M 17 Agar.




Utilizzare le precauzioni di sicurezza (guanti, mascherina) nella manipolazione delle soluzioni per la colorazione di GRAM.


42-N

umerazione di Streptococcustherm

ophilusnello yogurt

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NE SE IL TESTO N

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ENTE ADOTTATO.

337

Analisi43 Determinazione dei Coliformi totali e termoresistenti

nel burro

Materiale occorrente• Anse• Beuta• Carta assorbente• Piastre Petri sterili• Pipette da 1 e 10 ml sterili• Pipette Pasteur• Portaprovette• Tubi con tappo a vite• Sacchetti Stomacher• Spatola________________________________________________________________Terreni di coltura e diluenti• VRBL Agar (Violet

Red Bile Lactose)• Acqua peptonata

0,1%________________________________________________________________Strumentazione


Burro• Bilancia tecnica• Piastra scaldante• Stomacher• Termostato• Vortex

Principio:Semina in doppia serie (due piastre per ogni diluizione) di un volume definito di cam-

pione e/o delle sue diluizioni, per inclusione in VRBL Agar e successiva lettura dopo incubazione di una serie a 32°C per 24 ore (Coliformi totali), e a 44°

per 24 ore (Coliformi termoresistenti) della seconda serie.

Pericoli e precauzioni:I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, autoclave).A. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.B.

Come per tutti i terreni in polvere anche la manipolazione del VRBL Agar deve essere effettuata con una adeguata protezione delle vie respiratorie e utilizzando altri dispositivi di sicurezza (guanti), in quanto contiene sali biliari classificabili come Xi

irritanti a una concen-

trazione > 1%.


43-D

eterminazione dei C

oliformi totali e

termoresistenti nel burro

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NE SE IL TESTO N

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ENTE ADOTTATO.

339

Analisi44 Determinazione dei Coliformi totali nel latte -

Metodo MPN (Most

Probable

Number)

Materiale occorrente• Anse• Beute• Campanelle di Durham• Carta assorbente• Matracci• Pipette • Pipette Pasteur• Portaprovette• Tubi con tappo a vite________________________________________________________________Terreni di coltura e diluenti• Brodo Lattosio Bile Verde Brillante • Plate

Count

Agar (PCA)• Violet

Red Bile Lactose

Agar (VRBL Agar)• Levine

EMB Agar• Soluzione salina/peptone________________________________________________________________Strumentazione


Latte• Bilancia tecnica• Piastra scaldante• Termostato

Principio:Semina delle diluizioni del campione di latte in tre serie da tre tubi contenenti brodo Bile Verde Brillante con campanella di Durham, incubazione a 32°C per 24 ore e successiva lettura dei risultati dopo le prove di conferma sui tubi positivi.



clave).B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione dei campioni.D.

Alcuni terreni usati anche se non classificati come pericolosi ai sensi della legislazione vigente, devono essere manipolati utilizzando dispositivi di protezione (guanti, mascherina) in quanto contenenti sostanze irritanti.


44-D

eterminazione dei C

oliformi totali nel

latte Metodo M

PN (M

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umber)

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ENTE ADOTTATO.

342

Pericoli e precauzioni:A.I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante,

autoclave).B.Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle

colture microbiche.D.Il terreno di riferimento anche se non è

classificato come pericoloso ai sensi della legislazione vigente, deve essere manipolato con attenzione da personale qualificato.

Analisi45 Numerazione di E. coli su terreno cromogenico

Materiale occorrente• Anse• Beute• Carta assorbente• Flaconi con tappo a vite • Piastre Petri sterili• Pipette da 1 e 10 ml sterili• Portaprovette• Spatole sterili• Tubi ________________________________________________________________Terreni di coltura e materiali chimici• TBX Agar (Triptone

Bile X-Glucuronide) ISO 16649-2• Acqua peptonata________________________________________________________________Strumentazione


Colture microbiche:• Bilancia tecnica

Escherichia

coli• Piastra scaldante• Termostato

Principio:Semina del campione in terreno cromogenico (contiene come cromogeno il 5-bromo-

4-cloro-3indolil-β-D-glucuronide), incubazione a 44°C per 18-24 ore e successiva nu-

merazione delle colonie tipiche blu/verde (il cromogeno per azione dell’enzima β-

glucuronidasi, libera 5-bromo-4-cloro-3-indolo il quale è

assorbito dalle cellule micro-

biche le cui colonie sul substrato assumono una colorazione tipica).


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344




Utilizzare le precauzioni di sicurezza (guanti, mascherina) nella manipolazione del reattivo di Kovacs in quanto nocivo per inalazione, irritante per gli occhi, vie respiratorie e la pelle.

Analisi46 Ricerca di E. coli in campione di mozzarella

Materiale occorrente• Anse• Beute• Carta assorbente• Forbici• Pinze• Pipette da 1 e 10 ml sterili• Portaprovette• Sacchetti Stomacher• Tubi con tappo a vite________________________________________________________________Terreni di coltura e diluenti• BBVB (Brodo Bile Verde brillante)• Acqua triptonata• Acqua peptonata

0,1%• Reattivo di Kovacs________________________________________________________________Strumentazione


Mozzarelle• Bilancia tecnica• Piastra scaldante• Stomacher• Termostato

Principio:Semina delle diluizioni del campione di mozzarella in tre serie da tre tubi contenenti brodo Bile Verde Brillante con campanella di Durham, incubazione

prima a 32°C per 48 ore (prova presuntiva) e successivamente a 44°C per 48 ore (prova di conferma); semina in acqua triptonata di brodocolture positive e incubazione a 44°C per eviden-

ziare la produzione di indolo.


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348

Esperienza48 Ricerca di Salmonella nelle uova fresche

Materiale occorrente• Anse ad ago e circolari

Beute• Carta assorbente

Flaconi da batteriologia• Piastre Petri sterili

Pipette sterili graduate• Portaprovette

Sacchetti sterili Stomacher• Spatole

Tubi con tappo a vite________________________________________________________________Terreni di coltura e diluenti• Acqua Peptonata

Tamponata (BPW)

Brodo Rappaport

Vassiliadis

(RV)• Brodo Selenito

Cistina (SC)

Muller

Kauffmann

Brodo completo• Agar Verde Brillante (BGA)

Rambach

Agar (RA)• Agar TSI

Hektoen

Enteric

Agar (HA)• Agar Citrato Desossicolato

Lattosio

XLD________________________________________________________________Strumentazione


Uova fresche• Bilancia tecnica• Piastra scaldante• Stomacher• Termostato

Principio:Il principio del metodo si basa sulla capacità

di evidenziare, mediante l’utilizzo di appropriati test, la crescita e le caratteristiche morfologiche,

biochimiche e sierolo-

giche dei microrganismi del genere Salmonella. La ricerca di Salmonella spp. necessita di quattro fasi successive:1. Prearricchimento

in terreno liquido non selettivo2. Arricchimento in terreno liquido selettivo3. Isolamento e identificazione4. Conferma biochimica

Pericoli e precauzioni:I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, autoclave).A.Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.B.Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali

protettivi, mascherina) in quanto il terreno Rambach

contiene sostanze pericolose per la salute (il substrato è

classificato come tossico nocivo (Xn) e irritante (Xi) per la presenza di sodio desossicolato

e Tris(idrossimetil-aminometano).C.

Brodo Rappaport

contiene magnesio cloruro ed è

classificato come Xi

(irritante) ai sensi della legislazione vigente.


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ENTE ADOTTATO.

350

Metodica

FASE I –

Preparazione

del campione

e prearricchimento

FASE II –

Arricchimento

selettivo

Per quanto riguarda le uova fresche, l’analisi deve essere condotta separatamente sui gusci e sul tuorlo-albume. Ciò in quanto la contaminazione profonda assume un signi-

ficato più

rilevante, essendosi sicuramente verificata nell’ovaio dell’animale e non, come talvolta avviene per i gusci, dopo la deposizione.

-

GUSCISeparare in maniera asettica il guscio dal contenuto dell’uovo. Triturare i gusci in Stomacher

in acqua peptonata

tamponata nel rapporto di 1:10 e incubare a 37°C per 16-20 ore.- TUORLI E ALBUMISeparare in maniera asettica il contenuto dell’uovo dal guscio.Omogeneizzare insieme i tuorli e gli albumi in Stomacher, prelevare 50 g di omogeneizzato e aggiungere 450 ml di acqua peptonata

tamponata. Incubare a 37°C per 16-20 ore.- PRODOTTI D’UOVOAggiungere a 25 g di prodotto 225 ml di acqua peptonata

tamponata e incu-

bare a 37°C per 16-20 ore.

Dalle colture di prearricchimento

eseguire separatamente subcolture nel modo seguen-

te:-

GUSCI-

Trasferire 10 ml della sospensione di prearricchimento

in 100 ml di Muller

Kauffmann

(MK*);-

Trasferire 0,1 ml della sospensione di prearricchimento

in 10 ml

di Brodo Rappaport

Vassiliadis

(RV).Incubare a 42°C per 24 ore.

-

TUORLI E ALBUMI-

Trasferire 10 ml della sospensione di prearricchimento

in 100 ml di Muller

Kauffmann

(MK*);-

Trasferire 0,1 ml della sospensione di prearricchimento

in 10 ml

di Brodo Rappaport

Vassiliadis

(RV).Incubare a 42°C per 24 ore.


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352

Esperienza49 Numerazione di Clostridium

perfringens

in alimenti

Materiale occorrente• Ansa per batteriologia

Ago per batteriologia• Aspiratore automatico per pipette

Beute• Carta assorbente

Piastre Petri sterili• Pipette da 1 ml sterili

Portaprovette• Tubi con tappo a vite________________________________________________________________Terreni di coltura, diluenti e reagenti• Triptosio-solfito-cicloserina

agar base (SC Agar)• Supplemento solfito cicloserina

(TSC supplement)• Terreno tioglicolato

fluido• Terreno Brodo Lattosio solfito (LS) base• Soluzione ferro ammonio citrato• Soluzione disodio

bisolfite________________________________________________________________Strumentazione


Alimenti• Bagnomaria• Bilancia tecnica• Giara per anaerobiosi• Piastra scaldante• Termostato

Principio:Semina per inclusione nella massa di un terreno selettivo solido

di una quantità

definita di campione se il prodotto iniziale è

liquido, o una quantità

definita della sospensione iniziale in caso di altri prodotti, aggiungendo dopo

solidificazione un sottile strato dello stesso terreno. Incubazione delle piastre in anaerobiosi a 37°C per 20 ore. Calcolo del numero di colonie caratteristiche per ml o gr di campione ed esecuzione di test di conferma sulle colonie caratteristiche.


Nella manipolazione delle soluzioni di ferro ammonio citrato e di sodio bisolfito, osservare le generali prassi di protezione personale (occhiali di sicurezza, guanti) e usare aerazione generale per ridurre al minimo l’esposizione a nebulizzazione, vapori.B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.

I terreni di riferimento anche se non classificati come pericolosi ai sensi della legislazione vigente, devono essere manipolati con attenzione da personale qualificato e, come per tutti i terreni in polvere la manipolazione deve prevedere una adeguata protezione delle vie respiratorie.D. Sterilizzare le piastre dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto.


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355

Analisi50 Numerazione di Bacillus

cereus

Materiale

occorrente• Ago ed ansa

per uso

batteriologico

Beute• Bacchette

di

vetro

Carta


Petri sterili

Pipette da

1 ml sterili• Pipette Pasteur

Portaprovette• Tubi

muniti

di

tappo

a vite

Vaschetta

da

colorazione• Vetrini

portaoggetti

Buste

per Stomacher________________________________________________________________Terreni

di

coltura, diluenti

e reagenti• Peptone mannitolo

blu

di

bromotimolo

(PEMBA)• Mannitol

Egg Yolk Polymyxin

Agar (MYP)• Glucose Agar• Diluente

peptone-sale________________________________________________________________Strumentazione


Alimenti• Bilancia

tecnica• Cappa

a flusso

laminare• Conta

colonie• Piastra

scaldante, Stomacher• Termostato, Vortex

Principio:Il metodo si basa sulla semina in superficie di un terreno selettivo solido, di volumi definiti della diluizione 10-1

e, di appropriate diluizioni successive del campione. Incubazione delle piastre in aerobiosi a 30°C per 18-48 ore.Calcolo del numero di Bacillus

cereus

/g o /ml di campione, considerando le colonie caratteristiche sviluppatesi sul terreno alle diverse diluizioni

utilizzate che danno un risultato significativo e confermate con test specifici.



clave).B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.

I terreni di riferimento anche se non classificati come pericolosi ai sensi della legislazione vigente, devono essere manipolati con attenzione da personale qualificato e, come per tutti i terreni in polvere la manipolazione deve prevedere una adeguata protezione delle vie respi-

ratorie.D. Sterilizzare le piastre dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto.E. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle

colture microbiche.


50-N

umerazione di Bacilluscereus

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358

Analisi51 Ricerca di Listeria monocytogenes

Principio:La ricerca di Listeria monocytogenes

necessita di almeno tre fasi:- arricchimento primario selettivo a 30°C per 48 ore- arricchimento secondario selettivo a 37°C per 24-48 ore- isolamento selettivo a 37°C per 24-48 oreMateriale occorrente• Ago e ansa per uso batteriologico

Beute• Bacchette di vetro

Carta assorbente• Piastre Petri sterili

Pipette sterili graduate• Pipette Pasteur

Portaprovette• Tubi muniti di tappo a vite

Vaschetta da colorazione• Vetrini portaoggetti

Buste per Stomacher________________________________________________________________Terreni di coltura, diluenti e reagenti• Half

Fraser Broth

Fraser Broth• Oxford Agar

Palcam

Agar• Agar Triptone-soya-estratto

di lievito

Brodo Triptone-soya-estratto

l.• Columbia Blood

Agar

Terreno per la mobilità• Brodo per l’utilizzazione degli idrati di C

Acqua ossigenata• Test biochimici miniaturizzati

Terreno ALOA ________________________________________________________________Strumentazione


Alimenti• Bilancia tecnica• Cappa a flusso laminare• Piastra scaldante, Stomacher• Termostato, Vortex

Pericoli e precauzioni:A. I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, autoclave).B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.

I terreni di riferimento anche se non classificati come pericolosi ai sensi della legislazione vigente, devono essere manipolati con attenzione da personale qualificato

e, come per tutti i terreni in polvere la manipolazione deve prevedere una adeguata protezione delle vie respiratorie.D. Sterilizzare le piastre dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto.E. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle

colture microbiche.

1.

Introdurre 25 g di campione in un sacchetto per omogeneizzazione

e aggiungere 225 ml di Half

Fraser Broth

(rapporto 1:10). Nel caso in cui il campione disponibile abbia un peso inferiore a 25 g, usare la quantità

necessaria di terreno di arricchimento primario per arrivare alla diluizione di circa 1:10 (massa/volume).

2.

Omogeneizzare secondo i metodi usuali e incubare a 30°C

per 24-48 ore.

Metodica. FASE I –

Arricchimento

primario

selettivo


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ENTE ADOTTATO.

360

Esperienza52 Ricerca di Streptococchi fecali nell’acqua (metodo MF)

Materiale

occorrente• Beuta• Carta

assorbente• Cilindro

da

100 ml• Membrane• Piastre

Petri sterili

da

60 mm• Pinze

a punta

piatta• Pipette Pasteur________________________________________________________________Terreni

di

coltura, diluenti

e reagenti• m-Enterococcus

Agar (Slanetz-Bartley Agar)• KF Streptococcus Agar• Bile Esculina

Azide

Agar• Brain-Heart Infusion Agar ________________________________________________________________Strumentazione


Acqua• Bilancia

tecnica• Piastra

scaldante• Pompa da vuoto• Sistema

filtrante• Termostato

Principio:Filtrazione di 100 ml di acqua su membrana di acetato di cellulosa con pori da 0,45 μm e successiva coltura su terreno. Il metodo delle MF, permette di

effettuare un con-

teggio quantitativo diretto dei microrganismi ricercati.

Pericoli e precauzioni:A.I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, autoclave).B.Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali protettivi,

mascherina) in quanto il terreno Slanetz-Bartley

contiene sostanze pericolose per la salute (sodio azide, sodio fosfato bibasico).D. Sterilizzare le piastre dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto.E. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle

colture microbiche.

ComposizioneSlanetz-Bartley

Agar- Triptosio- Estratto di lievito- Destrosio- Sodio fosfato- Sodio azide- Trifeniltetrazolio

cloruro- Agar

Dopo dissoluzione degli ingredienti non sterilizzare ed evitare il surriscaldamento. È

un terreno selettivo indicato per l’isolamento e il conteggio degli enterococchi . La presenza di uno specifico agente selettivo inibisce lo sviluppo di tutti i germi contaminanti eventualmente

associati, mentre il cloruro di trifenilte-

trazolio

funge da indicatore: i microrganismi che lo riducono coltivano con colonie rosse.


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TATO L'UTIL

IZZO IN

CLASSE PER LA LEZIO

NE SE IL TESTO N

ON è REGOLARM

ENTE ADOTTATO.

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Esperienza53 Ricerca di Campylobacter

termotollerante

Materiale

occorrente• Ansa

e ago per uso

batteriologico

Beute• Buste

per uso

Stomacher

Carta


Petri sterili

Pipette graduate sterili• Vetrini

portaoggetti________________________________________________________________Terreni

di

coltura, diluenti

e reagenti• Preston Broth

Park Sanders Broth• Karmali

Agar

Skirrow

Agar• Butzler

Agar modificato

Preston Agar• Agar sangue

di

montone

TSI• Soluzione

al 3% di

perossido

di

idrogeno

Brucella

Broth________________________________________________________________Strumentazione

Campione• Aspiratore

automatico

per pipette Alimenti• Autoclave • Bilancia

tecnica• Cappa

a flusso

laminare• Giara

per microaerofilia• Microscopio

ottico• Piastra

scaldante• Termostato

Principio:La ricerca di Campylobacter

termotollerante

si articola nelle seguenti fasi:

- arricchimento in terreno liquido- isolamento e identificazione

Pericoli e precauzioni:A.I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, autoclave).B.Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali

protettivi, mascherina) in quanto alcuni terreni contengono sostanze pericolose per la salute (cicloeximide, vancomicina).D. Sterilizzare le piastre dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto.E. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle

colture microbiche.


53-R

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File utili

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365

Esperienza54 Ricerca di Yersinia

enterocolitica

Principio:La ricerca di Yersinia

enterocolitica

presumibilmente patogena richiede tre successive fasi:- arricchimento in terreno liquido selettivo- isolamento- conferma e identificazione

Materiale occorrente• Ansa e ago per uso batteriologico

Ancorette magnetiche• Buste per uso Stomacher

Beute• Piastre Petri sterili

Pipette graduate sterili• Tubi da batteriologia con tappo a vite Vetrini portaoggetti________________________________________________________________Terreni di coltura, diluenti e reagenti• Brodo PSB (peptone, sorbitolo, sali biliari) Brodo ITC• Agar CIN (cefsulotina, irgasan, novobiocina) Agar SSDC• Agar nutritivo

Agar Kliger

(KIA)• Terreno urea/triptofano

Terreno Citrato Simmons• Trypticase

soya

agar (TSA) Agar bile esculina________________________________________________________________Strumentazione

Campione• Aspiratore automatico per pipette Alimenti• Autoclave • Bilancia tecnica• Cappa a flusso laminare• Piastra scaldante• Stomacher• TermostatoPericoli e precauzioni:

A. I pericoli nell’esecuzione dell’esperienza sono le fonti di calore (piastra scaldante, autoclave).B. Manipolare con attenzione la vetreria, che se si rompe diventa tagliente.C.

Usare indumenti protettivi secondo le buone pratiche di laboratorio (guanti, occhiali protettivi,

mascherina) in quanto alcuni terreni contengono sostanze pericolose per la salute.D. Sterilizzare le piastre dopo il loro uso e prima dell’eliminazione come rifiuto.E. Utilizzare le precauzioni di sicurezza nella manipolazione delle

colture microbiche.

Metodica

FASE I –

Arricchimento

selettivo1.

Preparare la sospensione iniziale diluendo 10 g/ml di campione con 90 ml di Bro-do PSB, in modo

da

ottenere

un rapporto

campione/terreno

di

1:10

(massa/volume, volume/volume).

2.

Omogeneizzare la sospsensione

mediante Stomacher

per 2 minuti.3.

Incubare a 25°C per 5 giorni.4.

Preparare la seconda sospensione iniziale diluendo 1 g/ml di campione con 99 ml di Brodo

ITC, in modo

da

ottenere

un rapporto

campione/terreno

di

1:100.5.

Incubare

a 25°C per 48 ore.


54-Ricerca di Yersinia

enterocolitica

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368

In caso di positività

per Yersinia

enterocolitica

il Kligler

appare:SLANT Rosso (lattosio -)

FONDO Giallo (glucosio +) e

senza annerimento del terreno (H2

S -)

Agar Kligler

(KIA)

Ricerca della lisina decarbossilasiRicerca della ornitina decarbossilasiFermentazione del ramnosio e del saccarosioUtilizzazione del citrato

Possono

essere

utilizzati

per i test biochimici

di

conferma

le gallerie

biochimiche

in commercio.

Tests biochimici

Le colonie in esame sono confermate come Yersinia

enterocolitica

se hanno il seguente comportamento biochimico:

Lisina decarbossilasi negativoOrnitina

decarbossilasi positivoFermentazione del ramnosio negativoFermentazione del saccarosio positivoIdrolisi del citrato negativo


54-Ricerca di Yersinia

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Il presente volume sprovvisto del talloncino a fronte è

da consi-

derarsi copia di saggio campione gratuito, fuori commercio (vendita e altri atti di disposizione vietati art. 17, c. 2, l.

633/1941). Esente da iva (D.P.R. 26-10-1972, n 633, art 2, lett. d). Esente da bolla di accompagnamento (D.P.R. 6-10-1978, n 627, art 4, n. 6).

Michele Capurso e Federica

Coglitore

Laboratorio di microbiologia

unico con espansione online

Editore Mannarino

978-88-96708-53-8

Al pubblico

€

20,00IVA inclusa

Laboratorio di microbiologia. Le basi, le analisi ambientali e degli alimenti


• ISBN 978-88-96708-53-8Il volume comprende 13 capitoli: -

la sicurezza; -

materiale e strumenti; -

di-

sinfezione e sterilizzazione; -

indagine colturale; -

osservazione dei micror-

ganismi e la morfologia batterica; -

le tecniche di semina ; -

fattori che in-

fluenzano la crescita; -

valutazione della crescita microbica "analisi quan-

titativa"; -

isolamento e identificazione"analisi qualitativa"; -microbiologia ambientale: le acque -

microbiologia ambientale: l'aria; -

microbiologia am-

bientale: il suolo ; -

microbiologia degli alimenti;

ESPANSIONE ONLINE

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Disponibile l'edizione digitale di tipo C con espansione online

E-ISBN 978-88-96708-54-5 prezzo 13,99 euro EDIT

ORE MANNARIN

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